FORMULACIONES LÍQUIDAS DE IFN-BETA
La presente invención se refiere a formulaciones liquidas de interferón ß (IFN-ß) estabilizadas con un poliol seleccionado entre manitol, sacarosa y glicina, un azúcar no reductor o un aminoácido. En particular, se refiere a formulaciones liquidas que contienen manitos, albúmina humana y una solución tampón de acetato. Los interferónes (a,ß, Y ) son glucoproteinas producidas en células de vertebrados siguiendo a una inducción. Los inductores más tradicionales son los virus, pero también otros agentes microbianos, otras sustancias naturales y compuestos sintéticos tienen el mismo comportamiento. El interferón ß es inducido en fibroblastos humanos, tiene una actividad antiviral, pero en la terapia de algunas formas tumorales pueden explotarse, junto con la actividad antiviral, otras actividades tales como la actividad antiproliferativa y la actividad inmunorreguladora . La producción a partir de cultivos de fibroblastos humanos y, específicamente, de técnicas de DNA recombinante permite ahora tener cantidades industriales de interferón ß. Es conocido que las proteínas en forma purificada son especialmente susceptibles a la degradación, incluso a la debida a la actividad normal de los agentes atmosféricos. Esta peculiaridad es más evidente para proteínas producidas de acuerdo con técnicas de DNA recombinante . Como consecuencia directa del hecho de que las proteínas altamente purificadas son muy sensibles a la desnaturalización, es deseable obtener formulaciones estables que aseguren la vida-ciclo más larga posible del producto. La estabilización de formulaciones que contienen ' proteínas altamente purificadas puede efectuarse añadiendo uno o más excipientes que inhiben o retrasan la degradación del producto activo. Son bien conocidas composiciones farmacéuticas que contienen interferón ß. La solicitud de patente europea EP 89 245 (INTER-YEDA Ltd.) describe una composición liofilizada de interferón ß que contiene manitol, albúmina humana y polivinilpirrolidona, siendo ésta última un agente estabilizador. También son conocidas otras composiciones farmacéuticas líquidas que contienen otros interferónes .
La solicitud de patente internacional WO 89/04177 (GENENTECH, prioridad 03/11/87) describe formulaciones farmacéuticas liquidas de interferón que comprenden una solución tampón que mantiene el pH dentro de la franja de 4,0-6,0, un azúcar polihidroxilico como estabilizador y un detergente no iónico . La solicitud de patente EP 270 799 describe composiciones farmacéuticas de IFN-ß en forma liquida o liofilizada que comprenden, como disolvente/estabilizador, uno o más detergentes polímeros no iónicos . Es muy deseable obtener tales formulaciones liquidas para evitar la reconstitución de preparaciones liofilizadas y permitir asi un uso fácil. Se ha encontrado ahora sorprendentemente que composiciones farmacéuticas liquidas que comprenden interferón ß, estabilizadas con un poliol seleccionado entre manitol, sacarosa y glicina, un azúcar no reductor o un aminoácido en una solución tampón adecuada son particularmente estables y mantienen actividad biológica durante un largo periodo de tiempo. El objetivo principal de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica liquida que comprende interferón ß y un poliol seleccionado entre manitol, sacarosa y glicina, un azúcar no reductor o un aminoácido como estabilizador. Preferiblemente, el estabilizador es manitol. Preferiblemente, la formulación farmacéutica líquida comprende una solución tampón con un pH entre 3 y 4; más preferiblemente, una solución tampón de acetato . Otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de tal formulación farmacéutica liquida, que comprende la etapa de dilución del IFN-ß con una solución de los excipientes . Aún es otro objetivo más de la presente invención proporcionar una forma de presentación de la formulación farmacéutica líquida que comprende la formulación previamente mencionada, cerrada herméticamente en condiciones estériles en un recipiente adecuado para almacenamiento antes del uso. Para estudiar la estabilidad de las formulaciones líquidas de IFN-ß, se prepararon varias formulaciones por dilución de IFN-ß en diferentes soluciones tampón a pH variable, dejando luego almacenadas las muestras a diferentes temperaturas y realizando ensayos inmunológicos a una serie de intervalos de tiempo. Una vez que se han seleccionado la solución tampón y el pH preferido con el que se obtiene la mayor estabilidad, se preparan las formulaciones estabilizadas de la invención por dilución de la solución madre de interferón con la solución tampón que también contiene los excipientes. La estabilidad de las varias formulaciones se determinó midiendo la actividad residual del IFN-ß a intervalos de tiempo fijos, después de almacenamiento de la solución a temperaturas de 50 °C, 37 °C y 25 °C. Para determinar tal actividad, las muestras se sometieron a ensayos inmunológicos y biológicos. Los ensayos inmunológicos se realizaron usando el equipo ORAY {ELISA Kit para IFN-ß humano, de ORAY INDUSTRIES, Inc) siguiendo la metodología que se indica en las instrucciones que se incluyen. La evaluación biológica se realizó como lo describe Armstrong, J.A. (1981), en "ensayo del efecto de inhibición citopática del interferón", en Methods in Enzymology 3, 381-387. Este método permite la medida de la actividad de IFN-ß explotando su capacidad antiviral. La medida de la actividad se expresa en Unidades Internacionales por mililitro de solución (IU/ml) o en Megaunidades Internacionales por mililitro de solución (MIU/ml) . (1 MIU/ml = 1.000.000 IU/ml) . Una unidad Internacional se calcula como se describe en la Research Reference Reagent Note n° . 35, publicada por el Nacional Institute of Health, Bethesda, Maryland, en relación al HulIFN-ß NIH Reference Reagent Gb 23-902-531, usado como patrón. La medida se expresa aquí como porcentaje de actividad residual de la muestra de Interferón-ß en las varias formulaciones, considerando que la actividad de la muestra al tiempo cero es igual a 100%. Las evaluaciones se hicieron por duplicado. Para ensayar el efecto del pH sobre la estabilidad del ingrediente activo, se prepararon diferentes combinaciones de IFN-ß recombinante que contenían 0.6 y 1 Mlü/ml con varias soluciones tampón, esto es, solución tampón de acetato, solución tampón de citrato, solución tampón de ascorbato, solución tampón de succinato. Las formulaciones que contenían IF -ß recombinante con las soluciones tampón se prepararon y almacenaron a temperaturas de 50°C, 37 °C y 25°C, y luego se sometieron al ensayo inmunológico a intervalos de tiempo fijados. Las formulaciones se prepararon de manera que tuvieran un pH entre 3,0 y 4,0 y entre 5,0 y 6,0, todas con una concentración de la solución tampón 0, 01M. Las tablas 1, 2 y 3 recogen resultados de ensayos efectuados a intervalos de tiempo fijados de 1 a .42 dias, a las diversas temperaturas. Los datos contenidos en las mencionadas tablas indican que las formulaciones con un pH entre 5,0 y 6,0 presentan una pérdida inmediata de titulo. Las formulaciones con un pH entre 3,0 y 4,0 tienen, sin embargo, una alta estabilidad, en especial en presencia de solución tampón de acetato. Para evaluar el efecto de los excipientes sobre la actividad del principio activo, se prepararon diversas formulaciones que contenían 1 MIU/ml de IFN-ß recombinante usando varios excipientes tales como manitol, sacarosa o un aminoácido tal como glicina, y albúmina humana parcialmente contenida ya en la solución madre de interferón ß. Las cantidades de manitol, sacarosa o glicina usadas eran las correspondientes a la obtención de soluciones isotonicas de IFN-ß. Los estudios de estabilidad en estas formulaciones se hicieron manteniendo las muestras a 50°C, 37°C, 25°C y 4°C y midiendo la actividad residual al cabo de los tiempos indicados en las Tablas 4 y 5. Los datos recogidos en las Tablas 4 y 5 revelan que la degradación de las formulaciones que contienen un poliol como el manitol es muy inferior a la de las formulaciones que contienen sacarosa o glicina . La formulación seleccionada para un estudio más a fondo era una que contenia manitol en solución tampón ?,??? de acetato a pH 3,5, que se sometió a más ensayos para evaluar el efecto sobre la estabilidad de la fuerza iónica y la albúmina . Se prepararon soluciones de IFN-ß en solución tampón ?,??? de acetato a pH 3,5 a diferentes valores de osmolalidad: 150, 300 y 400, y con diferentes constantes dieléctricas, con 5, 10 y 20% de propilenglicol, y las muestras se almacenaron y ensayaron luego a 50°C, 37°C y 25°C. El estudio revela que el aumento de osmolalidad y el contenido de propilenglicol disminuían la estabilidad de las formulaciones líquidas de IFN-ß. Puesto que el IFNH-ß madre contiene albúmina, se decidió proceder a un estudio para evaluar el efecto de la albúmina sobre la estabilidad de las formulaciones líquidas de interferón ß. Se añadieron muestras que contenían IFN-ß (1 MIU/ml) y la solución tampón de acetato a pH 3,5 a 1, 3, 6 y 9 mg/ml de albúmina humana y se ensayaron a temperaturas de 50°C, 37°C y 25°C. Los resultados revelan que, con el aumento de la albúmina, disminuía la estabilidad de las muestras. Se fijó el contenido de albúmina por muestra de manera que hubiera la mínima cantidad compatible con la contenida en las varias soluciones madre: en una formulación que contenía 1 MIU/ml de IFN-ß, se mantuvo un contenido uniforme de 0,5 mg/ml de albúmina.
EJEMPLOS DE PRODUCCIÓN FARMACÉUTICA
Materiales : manitol (Merck) ; albúmina humana (Boehring) solución tampón de acetato 0,01M (Merck) , NaOH 1M (Merck) . Se usaron como recipientes botellas de vidrio DIN 2R (tipo del vidrio, vidrio de borosilicato I) con tapones de caucho Pharmagummi, mezcla butílica y anillo de aluminio. Ejemplo de preparación de solución de r-IFN-ß SOLUCIÓN A 1 MIU/ML Para la preparación de un lote de 1 1 de producto acabado se usaron las cantidades siguientes : interferón 1000 MIU mannitol 54,6 g albúmina humana 0,5 g-P sol. Tampón acetato 0,01M, pH 3,5 c. s . p . 11 cantidad de albúmina humana presente interferón madre B) SOLUCIÓN ? 12 MIU/ml Para la preparación de un lote de 1 1 de producto acabado se usaron las cantidades siguientes: r-interferón ß 12000 MIU mannitol 54,6 g albúmina humana 4,0 g-P sol. Tampón acetato ?,???, pH 3,5 c. s. p. 11 P = cantidad de albúmina humana presente en interferón madre C) SOLUCIÓN A 24 MIU/ml Para la preparación de un lote de 1 1 de producto acabado se usaron las cantidades siguientes: r-interferón ß 24000 MIU mannitol 54,6 g albúmina humana 8,0 g-P sol. Tampón acetato 0,01M, pH 3,5 c. s. p. 11 P = cantidad de albúmina humana presente en interferón madre
Método de preparación Se disuelve la cantidad requerida de manitol y albúmina humana (teniendo en cuenta' la albúmina presente en la solución madre) en aproximadamente 50 g de solución tampón de acetato 0, 01M de pp. 3,5. Se comprueba el pp. Y, si es necesario, se ajusta a un valor de 3,5+_ 0,2 con ácido acético diluido (1:2) o con Ano 1M. La solución se lleva a un peso final de 1 Kg . con solución tampón 0,01M de acetato, pp. 3,5. Se pesa en un vaso de precipitados la cantidad requerida de r-interferón ß y se lleva a un peso total de 500 g con la solución de excipientes . En otro vaso de precipitados se pesan 500 g de solución de excipientes. Los 500 g de solución que contienen interferón ß se filtran sobre una membrana estéril de 0,22 m. (DURAPORE) a una presión que no excede 1,5 ata. La solución estéril se recoge en un matraz Erlenmeyer de vidrio. Inmediatamente después se filtran los 500 g de solución de excipientes sobre la misma membrana a una presión de 1,5 ata y se recogen en el mismo matraz Erlenmeyer. La solución obtenida se mezcla lentamente .
TABLA 1
r-INTERFERÓN- ß
Formulación líquida: 1 MIU/biotella Resultados de la determinación biológica: Concentración, % Estabilidad en sol. Tampón de citrato ?,?? a diferentes valores de pH
D = día ND = no determinable IFN/3 = formulación en solución tampón de citrato, pH=3,0
IFN/4 = formulación en solución tampón de citrato, pH=4,0
IFN/5 = formulación en solución tampón de citrato, pH=5,0 IFN/6 = formulación en solución tampón de citrato, pH=6, 0 TABLA 2 r-INTERFERÓN- ß
Formulación liquida: 0,6 MIU/botella Resultados de la determinación biológica: Concentración, % Estabilidad en sol. Tampón de acetato 0,01 a Diferentes valores de pH
D = días ND = no determinable IFN/3 = formulación en solución tampón de acetato, pH=3, 0
IFN/4 = formulación en solución tampón de acetato, pH=4,0
IFN/5 = formulación en solución tampón de acetato, pH=5,0 IFN/ 6 = formulación en solución tampón de acetato, pH=6, 0 O
TABLA 3 r- INTERFEROH fl Formulación líquida: 1 MIU/Botella Resultados de la evaluación inmunológica: Concentración, % estabilidad en sol. tampón 0,01M de ascorbato y succinato, a pH 3,00 y 4,00
D - dfas ND - no determinable IFN/3/ASC - formulación en tampón de ascórbico, pH 3,0
I FN/4/ASC - formulación en tampón de ascórbico, pH 4,0 IFN/3/SUC - formulación en tampón de succinato, pH 3,0
I FN/4/SUC - formulación en tampón de succinato, pH 4,0
TABLA 4
r-INTERFERÓN ß
Formulación liquida: 1 MIU/botella Concentración, % Estabilidad en sol. Tampón de acetato ?,??? a pH 3,5 con diferentes excipientes
D = días M = meses ND = no determinable ACE/SAC/3,5 = formulación en solución tampón de acetato pH=3,5 + sacarosa
ACE/MAN/3,5 = formulación en solución tampón de acetato pH=3,5 + manitol
ACE/GLY/3,5 = formulación en solución tampón de acetato pH=3,5 + glicina O
TABLA 5
R-INTERFERON ß
Formulación líquida: 1 MIU/botella Resultados de la valoración inmunológica : Concentración, % Estabilidad usando diferentes excipientes en tampón de acetato ?,??? a pH 3,5
D = dias H = meses ACE/SAC/3,5 = formulación en solución tampón de acetato pH 3,5 + sacarosa ACE/MAN/3,5 = formulación en solución tampón de acetato pH 3,5 + manitol. ACE/GLY/3,5 = formulación en solución tampón de acetato pH 3,5 + glicina.