MXPA02008470A

MXPA02008470A - Identificacion y uso de efectores y moleculas alostericas para la alteracion de la expresion de genes.

Info

Publication number: MXPA02008470A
Application number: MXPA02008470A
Authority: MX
Inventors: William S Marshall
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2001-03-01
Publication date: 2002-12-13
Also published as: AU2001241900A1; JP2004504806A; WO2001064956A3; WO2001064956A2; EP1290154A2

Abstract

La presente invencion se refiere a la construccion de un modulo de control alosterico, en el cual un ARN catalitico forma una parte o se liga a un dominio de ARN de enlace al efector o aptamero. Estos constructos colocan la actividad del ARN catalitico bajo el control del efector y requieren la presencia de un efector apropiado para la activacion o inactivacion. La presente invencion proporciona medios para identificar moleculas efectoras utiles asi como su uso para desarrollar aptameros similares. La invencion involucra la evolucion de secuencias de ARN que se enlazan al efector, y un proceso de seleccion en el cual los modulos de control alostericos se identifican por su funcion catalitica en presencia o ausencia del efector. Los ARN cataliticos regulables resultantes, se pueden usar para alterar la expresion de una molecula de ARN objetivo en una forma controlada.

Description

IDENTIFICACIÓN Y USO DE EFECTORES Y MOLÉCULAS ALOSTERICAS PARA LA ALTERACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de efectores identificados para alterar la actividad catalítica de polinucleótidos, y a métodos de uso de estos componentes en la alteración de la expresión de genes. Antecedentes de la Invención La siguiente es una breve descripción de las moléculas enzimáticas de ácido nucleico. Este resumen no significa ser totalmente incluyente sino que se proporciona sólo para un mejor entendimiento de la invención que sigue. Este resumen no es una admisión de que todo el trabajo abajo descrito es arte previo para la invención reivindicada. Las moléculas enzimáticas de ácido nucleico (por ejemplo, ribozimas) son ácidos nucleicos capaces de catalizar una o más de una diversidad de reacciones, incluyendo la capacidad de desdoblar, ligar o empalmar, a si mismas u otras moléculas separadas de ácido nucleico en una forma especifica de una secuencia base de nucleótidos. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan al enlazarse primero a un ácido nucleico objetivo. Tal enlace sucede a través de una porción de enlace objetivo de la REF: 141640 molécula de ácido nucleico enzimática que está en cercana proximidad a la porción enzimática de la molécula que actúa por ejemplo para desdoblar el objetivo. Así, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y después se enlaza a un objetivo a través de un apareamiento de una base complementaria, y una vez enlazado al sitio correcto, actúa enzimáticamente sobre el objetivo. En un uso, la actividad enzimática puede involucrar una reacción de desdoblamiento. El desdoblamiento estratégico de un ARN objetivo por ejemplo, destruirá la capacidad del ARN para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de que se ha enlazado un ácido nucleico enzimático y desdobla a su objetivo, se libera de esa molécula para buscar otro objetivo, y se puede enlazar repetidamente y desdoblar nuevos objetivos. Si el ácido nucleico actúa en cis (por ejemplo, auto-desdoblamiento, auto- interacción, autolíticos) , entonces se elimina la actividad con la destrucción del ácido nucleico. Si el ácido nucleico actúa en trans (se desdobla o interactúa con otra molécula o secuencia nucleica) , entonces la actividad no necesita eliminarse con una reacción simple. El uso de ribozimas se ha propuesto para tratar enfermedades o padecimientos genéticos al desdoblar un ARN objetivo, tal como un ARN viral o un ARN mensajero transcrito de un gen que debe apagarse tal como en el cáncer. Estas técnicas se han descrito como una alternativa para el bloqueo de transcripto de ARN por el uso de secuencias antisentido. Debido a la naturaleza enzimática de ciertas ribozimas, se puede usar una molécula simple de ribozima para desdoblar muchas moléculas del AR? objeto, y por lo tanto, se alcanza la actividad terapéutica con concentraciones relativamente inferiores de material que las que se requieren en un tratamiento antisentido. Debido a su especificidad de secuencia, las moléculas de ácido nucleico enzimáticas de desdoblamiento en trans, se estudian y describen como agentes terapéuticos para tratar enfermedades humanas. Las moléculas enzimáticas de ácido nucleico se pueden diseñar o seleccionar para desdoblar objetivos nucleótidos de ARN dentro del soporte de ARN celular. Tal evento de desdoblamiento resulta en un AR?m no funcional y elimina la producción de proteínas de ese AR?. De esta forma, la síntesis de una proteína asociada con un estado de enfermedad se puede inhibir selectivamente. Aunque han existido diversas descripciones del uso de ribozimas como agentes terapéuticos (Cotton, TIBTECH, 8: 174-178, 1990; Usman & McS iggen, Ann. Rep. Med. Chem. 30:285-294, 1995; Couture and Stinchcomb, TIG, 12 (12) :510-515, 1996; Christoffersen y Marr, J. Med. Chem. 38, 2023-2037, 1995; Gibson y Shillitoe, Molecular Biotechnology, 7: 125-137, 1997; Persidis, Nature Biotechnology, 15: 921-922, 1997; y Jaeger, Current Opinión in Structural Biology, 7: 324-335, 1997) han habido relativamente pocos estudios para el uso de moléculas enzimáticas de ácido nucleico que actúan en trans o en cis para alterar la expresión de genes (Chuat and Galibert, Biochemical and Biophysical Research Communications, 162(3): 1025-1029, 1989; Innovir patente E.U.A. No. 5,741,679) o para controlar la expresión de genes por medio de la inhibición de la traducción usando interacciones de ARN de molécula pequeña ( erstuck and Green, Science, 282:296-298, 1998). Los investigadores han demostrado la diversidad notable de las funciones catalíticas que pueden llevar a cabo las moléculas de ARN además del desdoblamiento de otras moléculas de ARN. Ver por ejemplo, Robertson y Joyce, Nature 344:467, 1990; Ellington y Szostak, Nature 346:818, 1990; Piscirilli, et al., Science 256:1420, 1992; Noller, et al., Science 256:1416, 1992; Ellington y Szostak, Nature 355:850, 1992; Bock, et al., Nature 355:564, 1992; Beaudry y Joyce, Science 257:635, 1992; y Oliphent, et al., Mol. Cell. Biol. 9:2944, 1989. Las moléculas de ARN con una función dada, por ejemplo, de enlace catalítico o de ligando, se pueden seleccionar de una mezcla compleja de moléculas al azar en lo que se ha referido como "genética in vitro" (Szostak, TIBS 19:89, 1992) o "evolución in vitro". En resumen, un gran acumulado de moléculas ARN que soportan secuencias aleatorias y definidas, se sintetiza y esa mezcla compleja por ejemplo, de aproximadamente 1015 secuencias individuales, se somete a un proceso de selección o de enriquecimiento. Por ejemplo, para ciclos repetidos de cromatografía de afinidad y amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las moléculas enlazadas a un ligando en la columna de afinidad, Ellington y Szostak (1990) estimaron que 1 de cada 1010 molécula de AR? se pliegan en una forma tal para enlazarse a un ligando dado. Las moléculas de AD? con tal comportamiento de enlace al ligando se han aislado (Ellington y Szostak, 1992, supra; Bocket al., 1992, supra) . El control o regulación de la expresión de los genes es un objetivo altamente deseado en los campos de la producción de proteínas, diagnóstico, transgénicos, terapia de células y terapia de genes. Se han descrito una diversidad de sistemas de control de la expresión, como un medio para controlar transcripcionalmente la expresión de un transgen en una célula huésped receptora. Los medios de control o interruptores de genes incluyen pero no se limitan a los siguientes sistemas.

Se pueden usar rapálogos para dimerizar las proteínas quiméricas que contienen un dominio de enlace de molécula pequeño y un dominio capaz de iniciar un proceso biológico, tal como una proteína de enlace de ADN o una proteína de activación de la transcripción (como se describe en WO 9641835 (PCT/US96/099486) ; WO 9731898 (PCT/US97/03137) y WO 9731899 (PCT/US95/03157) ) . La dimerización de las proteínas se puede usar para iniciar la transcripción del transgen. Una tecnología de regulación alternativa, utiliza un método para almacenar proteínas, expresadas del gen de interés, dentro de la célula como un agregado o grupos. El gen de interés se expresa como una proteína de fusión que incluye un dominio de agregación condicional que resulta en la retención de la proteína agregada en el retículo endoplásmico. Las proteínas almacenadas son estables e inactivas dentro de las células. Se pueden liberas las proteínas sin embargo, al administrar un fármaco (por ejemplo, un ligando de moléculas pequeñas) que elimina al dominio de agregación condicional con lo cual separan específicamente los agregados o grupos de forma que las proteínas se pueden secretar en las células . Ver Science 287:816-817 y 826-830, 2000. La mifepristona (RU486) se usa como un antagonista de la progesterona. El enlace de un dominio de enlace al ligando del receptor de la progesterona modificado, con un antagonista de la progesterona activa la transcripción al formar un dímero de dos factores de transcripción que pasan después en el núcleo para enlazarse al ADN. El dominio de enlace de ligando se modifica para eliminar la capacidad del receptor para enlazar a un ligando natural. El sistema receptor de la hormona esteroide modificado se describe además en la patente de E.U.A. No. 5,364,791; WO 9640911 y WO 9710337. Todavía otro sistema de control utiliza la ecdisona (una hormona esteroide de la mosca de la fruta) que se enlaza a, y activa a un receptor de la ecdisona (receptor citoplásmico) . El receptor se translocaliza después al núcleo para enlazar un elemento de respuesta específico del ADN (promotor del gen de respuesta a la ecdisona) . El receptor de ecdisona incluye un dominio de transactivación/dominio de enlace de ADN/dominio de enlace al ligando para iniciar la transcripción. El sistema de ecdisona se describe además en la patente de E.U.A. No. 5,514,578; WO 9738117; WO 9637609 y WO 9303162. Otro medio de control utiliza un transactivador positivo que se controla por tetraciclina. Este sistema involucra un dominio de enlace de ADN de la proteína del represor tet mutado (los cambios de aminoácidos mutados tet R-4 que resultan en una proteína de transactivador inversa regulada por tetraciclina, esto es, se enlaza a un operador tet en la presencia de tretaciclina) ligado a un polipéptido que activa la transcripción. Tales sistemas se describen en las patentes de E.U.A No 5,464,758; 5,650,298 y 5,654,168. Los animales transgénicos y agénicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Swanson et al., Annu. Rep. Med. Chem., 29:265-274, 1994; Fassler et al., Int. Arch. Allery Immunol . , 106:323-334, 1995; Polites, H. G., Int. J. Exp. Pathol., 77 (6) : 257-262 , 1996; Harris y Foord, Pharmacogenomics, 1 (4) :433-443 , 2000. Un animal agénico se ha alterado genéticamente para romper la expresión de un gen dirigido, resultando en la eliminación del producto del gen objetivo. Los animales agénicos se usan ampliamente para demostrar la función de una proteína de interés. En particular, la eliminación de la expresión del gen objetivo en el animal agénico, puede indicar el efecto de inhibir el producto de proteínas del gen. Una limitación con la tecnología, es que la disrupción del gen objetivo puede provocar defectos en el desarrollo los cuales aunque no son indicadores del efecto de la inhibición del gen objetivo en un animal adulto, resultan en una letalidad embriónica. Así, no se pueden estudiar ciertas disrupciones de la función de los genes en un animal viable. Otra limitación de la tecnología actual de agénicos es el efecto de la compensación del desarrollo en la disrupción del gen objetivo. En el curso del desarrollo, otros productos de gen relacionados pueden compensar la pérdida de la función de un gen con disrupción y así, ocultan su función en el animal adulto. Estas limitaciones bien conocidas de la tecnología, pueden limitar significativamente la utilidad de la disrupción del gen objetivo en los animales agénicos. En el caso de los animales transgénicos, se introduce una copia adicional del gen interés en el organismo, y resulta en la sobreexpresión del producto del gen. La sobreexpresión de proteínas durante el desarrollo, puede provocar o conducir a la compensación o inhibición de la sobreexpresión. Estos problemas pueden ocultar los efectos de la sobreexpresión de transgenes y limitar la capacidad de interpretar los efectos biológicos de la sobreexpresión del gen objetivo. La capacidad de crear un animal agénico condicional, es particularmente importante y relevante para superar estas limitaciones . Las referencias antes citadas, son distintivas de la invención actualmente reivindicada, ya que no describen y/o contemplan la identificación de efectores y su uso en el control de la expresión de genes como se proporciona por la invención actual . Tampoco involucran módulos de control alostéricos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación en diagrama de la presente invención, que involucra un módulo de control alostérico que contiene un dominio de ARN autodesdoblado, la actividad del cual se inhibe al interactuar con un efector, con lo cual resulta en la traducción del ARNm. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el módulo de control alostérico se puede colocar 5' ó 3' del gen de interés . La figura 2 es una representación en diagrama de la presente invención, que involucra un módulo de control alostérico que contiene un dominio de ARN autodesdoblado, la actividad del cual se inhibe al interactuar con un efector. El desdoblamiento del módulo de control alostérico resulta en la degradación de AR?m y en la inhibición de la traducción. En ausencia del efector, sucede la traducción. La figura 3 es una representación en diagrama, que involucra un módulo de control alostérico que contiene un dominio de ARN de auto-empalme, la actividad del cual se inhibe al interactuar con un efector. En esta modalidad de la presente invención la presencia del efector proporciona la activación de un módulo de control alostérico tal que el empalme del ARN precursor sucede para resultar en la formación de un ARNm de traducción.

La figura 4 es una representación en diagrama que involucra un medio de control alostérico que contiene un dominio de ARN de auto empalme en un intrón preparado por ingeniería. En la modalidad detallada, la presencia del efector proporciona la activación del módulo de control alostérico tal que sucede el empalme del AR?m para resultar en la operación de una estructura de lectura abierta que se traduce . La figura 5, es una representación en diagrama de la presente invención que involucra un módulo de control alostérico que contiene un dominio de AR? de auto-empalme. En esta modalidad, la actividad del módulo de control alostérico se inhibe por la interacción con un efector. La figura 6 es una representación en diagrama de la presente invención, que involucra un módulo de control alostérico que contiene un dominio de AR? de auto-empalme insertado en una región de un intrón necesaria para el ensamble de espliceosomas (spliceosome) . En esta modalidad, la actividad del módulo de control alostérico se inhibe en presencia de un efector resultando en la expresión del gen de interés. La figura 7 detalla la estructura secundaria de la plantilla de AR? 1 que comprende una estructura en circuito de célula madre del aptámero de enlace de la teofilina que se conecta a través de una extensión contigua de nucleótidos aleatorizados a una ribozima de cabeza de martillo. La estructura molecular de la teofilina también se muestra (SEQ ID NO: 6) . La figura 8 detalla la estructura secundaria de la secuencia de ARN TA-50, seleccionada después de 7 ciclos. La figura 9 detalla la capacidad de auto-desdoblamiento del TA-50 en presencia de teofilina. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los medios para identificar una molécula efectora útil se describen como es el uso del efector identificado para desarrollar un aptámero de un similar. La construcción de un módulo de control alostérico se describe en la cual, un ARN catalítico forma parte de o se liga a un dominio de ARN de enlace del efector o aptámero, con lo cual se coloca la actividad del ARN catalítico bajo el control del efector y requiere la presencia del efector para la activación y/o inactivación. Las moléculas de AR? se construyen en las cuales, al menos una porción es capaz de enlazar a un efector y otra porción es un AR? catalítico. La presente invención involucra la evolución de secuencias de AR? que enlazan al efector y un proceso de selección en el cual los módulos de control alostérico se identifican por su función catalítica en presencia y ausencia del efector. De esta manera, los ARN regulables catalíticos se pueden seleccionar para usarse en el desdoblamiento, empalme o ligación de un ARN objetivo en presencia de un efector o en el desdoblamiento, empalme o ligación de un ARN objetivo en ausencia de un efector. Estos métodos de selección de efector y la construcción de módulos de control alostéricos, son útiles en alterar la expresión de una molécula de un ARN objetivo en una forma controlada. Es particularmente útil cuando la molécula del AR? objetivo se forma o se suministra a la célula en combinación con el módulo de control alostérico. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las desventajas asociadas con los constructos de control previamente conocidos y sus usos, incluyen toxicidades potenciales en el uso in vivo, incluyendo la activación transcripcional o la represión de los genes endógenos, la activación o inhibición de proteínas o procesos celulares que se regulan normalmente por la entidad de molécula pequeña, o la inducción de una respuesta inmune hacia los productos externos del gen proteináceo del sistema de control. Además, pueden haber limitaciones de tamaño en las secuencias codificadoras de control, que se pueden suministrar junto con el gen de interés por medio de ciertos vectores vírales y no vírales. Así, hay todavía una necesidad de desarrollar métodos alternativos y materiales, para la expresión controlada de un gen de interés. Adicionalmente, el desarrollo de un medio de control de la expresión de genes, en donde ese medio puede también variarse por los componentes individuales usados, contribuiría significativamente a cualquier estrategia de terapia de genes, así como a la producción de proteínas terapéuticas. La presente invención resuelve particularmente estos problemas . La expresión de un gen específico, se puede alterar en cualquier etapa en el proceso de producción de una proteína activa. La modulación de la actividad de la proteína total puede suceder por medio de mecanismos transcripcionales, de procesamiento del transcripto, traducciones o post-traduccionales. La transcripción se puede modular al alterar la tasa de inicio de la transcripción o el avance de la polimerasa de ARN . El procesamiento de transcripto puede estar influenciado por circunstancias tales como el patrón de empalme del AR?, la tasa de transporte del AR?m al citoplasma, o la estabilidad del ARNm. La presente invención se refiere principalmente a la identificación y uso de moléculas efectoras y a la creación de moléculas de módulo de control alostérico que actúan juntas para alterar la expresión de un gen objetivo (por ejemplo, alterar la concentración in vivo de una proteína objetivo al alterar el procesamiento del AR?) . La presente invención proporciona un proceso de identificación para efectores adecuados, para su uso en el control de la expresión de genes, cuyo proceso no ha sido previamente descrito. Las descripciones de diversas moléculas de ARN controladas por el efector están disponibles. Ver por ejemplo, Chuat y Galibert, Biochemical and Biophysical Research Communications, 162(3): 1025-1029, 1989; Ellington et al., Nature 355:850-852, 1992; Porta et al., Bio/Technology 13:161-164, 1995; y Soukup y Breaker, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96: 3584-3589, 1999. La identificación y los procesos de selección in vitro sin embargo, se han diseñado y dirigido al uso de ribozimas para controlar la expresión de genes perjudiciales (tales como HIV, HCV, CMV, VEGF y TNF) o para biosensores para detectar ligandos específicos. Los antibióticos de aminoglicósidos están entre las moléculas más estudiadas que reaccionan con los ARN (von Ahsen et al . , Nature 353:368-370, 1991; von Ahsen et al., J. Mol. Biol. 226:935-941, 1992; Murray y Arnold, Biochem. J. 317:855-860, 1996; Werstuck y Green, Science 282:296-298, 1998).

Tales moléculas previamente descritas sin embargo, reaccionan directamente con ribozimas que se presentan naturalmente. La presente invención describe la C identificación novedosa de efectores que se usan para involucrar aptámeros para su uso en constructos de regulación de la expresión. Alternativamente, Werstuck y Green (Science, 282:296-298, 1998) describen el uso de efectores y aptámeros para regular la traducción. En esa investigación describen el uso de aptámeros múltiples y colorantes como efectores para suprimir la traducción de un gen reportero. El método no involucró el uso de un ARN catalítico o un módulo de control alostérico de la presente invención. Aunque otras descripciones se refieren al uso de la expresión regulada de genes usando un ligando, secuencia de enlace de ligando y ARN catalítico (Innovir Laboratories INC . ; sistemas de control de la expresión y constructos de ácido nucleico se describen en la patente E.U.A. ?o . 5,741,679 y patente E.U.A. ?o. 5,834,186), no se han incluido las descripciones de un proceso para la selección de los efectores adecuados . Los inventores actuales no están conscientes de ningún reporte previo de un proceso sistemático para la identificación de efectores, su uso para seleccionar y desarrollan aptámeros que se presentan no naturalmente para la construcción de módulos de control alostéricos, y el uso combinado del efector y el módulo de control alostérico para la alteración de la expresión genes. Tal proceso es un objeto de la presente invención. Los procedimientos aquí descritos, también sirven para producir moléculas que no se vislumbran previamente en la regulación de la expresión de genes. La presente invención proporciona un medio para determinar si una molécula "no terapéutica" puede modular específicamente la expresión de un gen de interés, y finalmente si el uso clínico de tal molécula efectora proporciona una ventaja sobre el uso de productos biológicos previos o fármacos que tienen una función terapéutica. Los métodos y composiciones se describen para la expresión controlada de moléculas de ARN objetivo por medio de un módulo de control alostérico. La actividad del módulo de control alostérico, se altera a través de la presencia, ausencia o cantidad de un efector preidentificado. En una modalidad, el módulo de control alostérico es activo en presencia de un efector, en otra modalidad, el módulo de control alostérico es inactivo en presencia de un efector. Las siguientes definiciones se usan en la descripción de la presente invención. Un "módulo de control alostérico" como se usa en la presente, se refiere a un ARN que no se presenta naturalmente, compuesto de al menos dos dominios, un receptor para un ligando preidentificado y el otro un dominio catalítico. El dominio del receptor o el dominio de enlace al receptor también se puede referir como un aptámero, y el ligando al cual se enlaza se refiere como un efector. El dominio catalítico es un ARN que es capaz de interactuar con un ARN objetivo. Tal actividad puede incluir el desdoblamiento, empalme o ligación del ARN objetivo. La regulación alostérica de la expresión de genes se refiere a la alteración de la expresión de un gen, preferiblemente un transgen en terapia de genes, por medio de la interacción del efector y un módulo de control alostérico. Los efectores de la presente invención se enlazan a un dominio de un módulo de control alostérico y alteran la actividad del dominio catalítico del módulo. Sin apegarse a alguna teoría en particular, se cree que la influencia del efector en la actividad del dominio catalítico, se genera por un cambio en la conformación del módulo cuyo cambio se induce por el enlace del efector y el dominio de enlace del efector o aptámero. La combinación del aptámero y el dominio de ARN catalítico se seleccionan de manera tal que el cambio conformacional puede excluir la formación de un dominio catalítico activo o inducir la formación de un dominio catalítico activo. Por ejemplo, el cambio conformacional inducido por el efector, se puede seleccionar para provocar la inhibición de o una reducción en la actividad del dominio catalítico, debido a la interferencia estérica entre el aptámero y las estructuras terciarias del dominio catalítico. Alternativamente, el cambio conformacional inducido por el efector se puede seleccionar para provocar el inicio de, o un incremento en, la actividad del dominio catalítico. Por lo tanto, el término "activación" o "activado" se usa en la presente para referirse al inicio de, o un incremento en, o aumento, de la actividad catalítica. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que los dominios del módulo de control alostérico, pueden ser sin translape o parcialmente con translape de manera tal que uno o más dominios se codifican en parte por el mismo polinucleótido. Así, los dominios se distinguen principalmente por su función más que por su secuencia. Además, los dominios pueden prepararse separadamente y unirse después para formar el módulo de control alostérico, o el módulo de control alostérico se puede preparar como un polinucleótido simple que tiene los dominios catalíticos y de aptámero. En contraste con las ribozimas previamente descritas, y las moléculas de tipo ribozima, el módulo de control alostérico de la presente invención no tiene una actividad "enzimática" verdadera. En una construcción preferida del ADN de la presente invención, el módulo de control alostérico actúa en una base intramolecular y se requiere solamente para proporcionar una reacción, más que reacciones múltiples con moléculas múltiples de ADN o de ARN. Además, la regulación alostérica de la función catalítica difiere de aquella de los inhibidores que bloquean los sitios catalíticos de las estructuras tales como una ribozima. En la presente invención, el efector se enlaza a un aptámero que es un sitio localizado alejado del sitio activo y su influencia en la actividad del polinucleótido, se piensa que se genera por cambios en la conformación del polinucleótido, que resultan de la interacción del aptámero y del efector. Se apreciará también que la posición del módulo de control alostérico en los constructos de ADN de la presente invención puede variar. Todo lo que se requiere es que el módulo de control alostérico se coloquen de manera tal que la alteración de la actividad del módulo de control alostérico por medio de un efector, resultará en la alteración de la expresión del gen de interés. "Alostérico" o "Alosteria" como se usa en la presente, se refiere a la alteración de la actividad de una molécula por la interacción de un efector con esa molécula. El efector interactúa en un dominio diferente del dominio catalítico de la molécula y esa interacción provoca un cambio en la actividad de la molécula. La actividad típica involucrada en los constructos de la presente invención, se puede referir como una actividad catalítica, que se describe además en la presente. Un "aptámero" o "dominio de enlace del efector" como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido que se enlaza a un efector. El polinucleótido comprende típicamente al menos 20 nucleótidos y puede comprender al menos 300 nucleótidos. Los aptámeros de la presente invención, pueden comprender polinucleótidos que se presentan naturalmente, que no son químicamente modificados. Preferiblemente, el aptámero comprende un polínucleótido sintético o que no se presenta naturalmente. Además, el aptámero es preferiblemente un ácido ribonucleico (ARN) seleccionado por evolución in vitro para interactuar con un efector previamente descrito. La evolución in vitro de los aptámeros comienza con un acumulado de moléculas de ARN creadas por síntesis química y/o enzimática. Típicamente, el aptámero deseado se selecciona con base en su capacidad para interactuar (por ejemplo, reconocer y enlazar) a un efector. Así, en una modalidad preferida, el efector es una molécula predeterminada que se usa para seleccionar y desarrollar además un aptámero adecuado. Alternativamente, el aptámero se puede construir y las colecciones de moléculas separarse por exclusión para identificar y seleccionar un efector adecuado.

Para su uso en el control de la expresión de genes en técnicas de terapias de genes, el aptámero no es una entidad química aislada y purificada. En su lugar, un aptámero es codificado por el ADN que se suministra a una célula, y el aptámero se vuelve una porción del ARNm transcrito del AD? de la célula huésped. Además, los efectores de la presente invención no modifican una actividad biológica de un aptámero, debido a que los aptámeros de la presente invención no tienen una actividad fisiológica inherente en la célula receptora. No hay un número fijo de bases requeridas para la interacción (por ejemplo, hibridación o enlace) de un aptámero a un efector. En general el aptámero contendrá de 20 a 300 nucleótidos, seleccionados como se describen en la presente para enlazarse a un efector específico. El tamaño particular de la molécula (típicamente 200 nucleótidos o menos, preferiblemente entre 20-30 nucleótidos de longitud) es ventajoso para el suministro de la célula en comparación con los constructos de regulación de la expresión convencionales que son mucho mayores en tamaño. Aunque se refiere en la presente como una secuencia "aleatoria", se entiende que un AR? es aleatorio solamente como se usa originalmente en el proceso de evolución. El producto del proceso de evolución, esto es, el aptámero, no es una secuencia aleatoria. Es una secuencia específica que se enlaza con un alto grado de afinidad y especificidad a un efector definido. Los aptámeros nucleótidos de los módulos de control alostéricos descritos en la presente no son limitativos en la invención. Aquellos expertos en la técnica, reconocerán que todo lo que es importante en un aptámero de la presente invención, es que interactúe selectiva y específicamente con un efector adecuado, y que tenga la capacidad de alterar la actividad catalítica del módulo de control alostérico cuando el aptámero ha interactuado con el efector. Los aptámeros múltiples (así como los módulos múltiples de control alostéricos) se pueden también usar de manera que los efectores múltiples y aun los efectores diferentes múltiples se puedan usar para reaccionar con los módulos de control alostéricos, y con lo cual se altera la expresión de genes al alterar el ARNm precursor.

El término "dominio" como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido que proporciona una actividad selecta o función para los módulos de control alostéricos de la presente invención. Un "efector" como se usa en la presente, se refiere a una molécula que interactúa con un aptámero. El enlace puede ser el resultado de la interacción y puede incluir pero no se limita a enlace de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, intercolaciones, etc. Las moléculas adecuadas para su uso como efectores de la presente invención, incluyen pero no se limitan a moléculas orgánicas o inorgánicas, péptidos, polipéptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, metabolitos que se presentan naturalmente y efectores biológicos, lípidos, carbohidratos (polisacáridos, azúcar), ácidos grasos y polímeros. Las moléculas efectoras referidas de la presente invención, se distinguen de aquellas descritas en la técnica en que los efectores actuales no tienen efecto farmacológico o se usan a concentraciones en donde un efecto farmacológico no se observa o es despreciable. La "conveniencia" del efector para su uso con el módulo de control alostérico puede incluir las siguientes características. (1) el efector tiene poco o ningún efecto farmacológico en el rango de dosis usado al alterar la expresión de genes, o tiene un efecto farmacológico despreciable. Esto se refiere a la carencia de alguna alteración en la función de la estructura o proceso de una célula en la cual actúa el efector (diferente al módulo de control alostérico) o la presencia de una alteración insignificante en la función de la estructura o proceso de una célula, en la cual actúa el efector (diferente al módulo de control alostérico) . En otras palabras, si se puede usar el efector como un agente farmacéutico que tenga un efecto en una estructura o proceso diferente al módulo de control alostérico, entonces ese efecto no provoca ningún daño al paciente que no necesite de tratamiento por el agente farmacéutico. (2) el efector se someterá a una biodistribución en esa célula o tejido que contendrá el módulo de control alostérico. (3) el efector tiene la capacidad de pasar a las estructuras subcelulares, esto es, al módulo de control alostérico en el núcleo de células transformadas para la expresión regulada de genes. Esto puede ser por medio de la difusión o transporte intracelular, y más preferiblemente por la difusión o transporte intranuclear . (4) el efector tiene la capacidad de interactuar con un aptámero en donde la interacción sucede con alta especificidad y alta afinidad.

Las consideraciones adicionales para la identificación de un efector adecuado pueden incluir además las siguientes. (1) si el efector es una molécula que tienen una relación de efecto en la dosis, entonces la molécula se usa típicamente a una dosis diaria máxima que es menor que la dosis diaria mínima usual de la molécula, cuando se usa para una indicación aprobada. Preferiblemente, se usa tal efector a un nivel de dosis que está debajo del 25% de la dosis efectiva (ED25) de la molécula cuando se usa como un agente farmacéutico. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica sin embargo, que tal preferencia se basa en una evaluación caso por caso del agente. Por ejemplo, en el caso de un efector que es un agente antiviral, el efector se puede usar en cualquier rango de dosis en ausencia del virus. Más preferiblemente, el nivel de dosis está debajo de ED10 para la molécula. Más preferiblemente, si el efector es una molécula que tiene una relación de efecto en la dosis, entonces se usa la molécula como un efector a una dosis que está_ debajo de la dosis efectiva más baja (dosis de umbral) de la molécula cuando se usa como un agente farmacéutico. (2) el uso de un agente farmacéutico relacionado con el efector, no está contraindicado en pacientes que tienen la condición a tratarse por el gen regulado. (3) No hay efectos laterales importantes o reacciones adversas producidas por el efector en sí mismo, y no hay una reacción adversa importante debida a una sobredosis del efector mismo. Típicamente, los efectos no importantes incluirían por ejemplo, eventos tales como dolor de cabeza, mareo, aturdimiento, sedación, nausea, vómito, erupciones, constipación, diarrea, dolor abdominal, euforia, disforia, fatiga, artralgia que se puede controlar por el ajuste de la dosis o por otra intervención común, o que sucede en menos de un 5% de la población que recibe el efector. (4) ?o hay contraindicaciones conocidas en embarazo, enfermedad del corazón o hipersensibilidad a agentes relacionados. En ciertas modalidades preferidas de la presente invención, el efector es una molécula pequeña. La naturaleza del efector se puede escoger para suministrase de forma exógena, tal como alguna molécula no tóxica o fármaco que entra fácilmente al menos a las células que contienen el ARN objetivo. Alternativamente, un sistema completamente endógeno se puede usar en el cual el efector controlador es algún metabolito endógeno o macromolécula, que se relaciona directa o indirectamente a la patología a corregirse o el gen a expresarse o la molécula a producirse. Por ejemplo, una proteína codificada por el ARN objetivo puede ser el efector. El constructo se puede diseñar de manera tal que la actividad del módulo de control alostérico depende del enlace de la proteína expresada y cuando se incrementa el nivel de proteína la actividad del módulo se incrementa para provocar una distribución en la expresión. Cuando cae el nivel del AR? objetivo debido a la alteración (por ejemplo, desdoblamiento) por el módulo de control alostérico, también cae la concentración de la proteína (como ligando o efector) . Cuando la concentración cae debajo de aquella a la cual están todas ocupadas las moléculas regulables de ARN, la tasa de alteración comenzará a caer. Al seleccionar afinidades que difieren del efector-aptámero, se puede alcanzar el nivel apropiado de regulación de la destrucción mediada alostérica del ARN objetivo para cualquier situación dada. La "actividad farmacológica" de una molécula se usa para referirse a la actividad de esa molécula como un fármaco o medicación. Una "base de datos" como se usa en la presente, se refiere a cualquier compilación de información sobre los efectores potenciales, tal como moléculas pequeñas que contienen información referente a la conveniencia del efector para su uso en el control de la expresión de genes . La "actividad catalítica" del módulo de control alostérico se refiere a la actividad de "dominio catalítico" o "secuencia catalítica" que es un ácido nucleico que actúa en el ácido nucleico objetivo en una forma deseable. Los ejemplos de las acciones posibles incluyen pero no se limitan al enlace del objetivo, reaccionar con el objetivo en una forma que modifique/altere el objetivo como un desboblamiento, empalme o ligación o la actividad funcional del objetivo, o facilitar la reacción entre el objetivo y otra molécula. En modalidades preferidas de la presente invención, la actividad catalítica es una actividad de auto- desdoblamiento, una actividad de ligasa o una actividad de empalme. Tales actividades se asocian a menudo con la ribozimas. Las ribozimas incluyendo las moléculas de tipo ribozima y porciones de tales moléculas se pueden usar para formar el dominio catalítico de un módulo de control alostérico de la presente invención. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que es principalmente la porción catalíticamente activa de la ribozima que se presenta naturalmente o moléculas de tipo ribozima que no se presentan naturalmente que se usan en los módulos de control alostéricos de la presente invención, pero que se pueden usar dominios adicionales. Por ejemplo, si el módulo de control alostérico es de auto-desdoblamiento, , entonces además de un aptámero y de un dominio catalítico, el módulo incluirá además un dominio de sustrato . También se apreciará que para los propósitos de la presente invención, la "actividad catalítica" del módulo de control alostérico se refiere meramente a la alteración o modificación de una alteración con un ARN objetivo. El dominio catalítico se puede diseñar de manera tal que pueda o no consumirse en el proceso y por lo tanto, el dominio no se requiere que sea un catalizador verdadero. Las ribozimas que pueden ser útiles para la presente invención en la preparación de los dominios catalíticos incluyen pero no se limitan a, moléculas en clases de cabeza de martillo, cabeza de hacha, horquilla, virus delta de hepatitis, neuroespora, intrones de autoenpalme (grupo I ó grupo II), ligasas, fosfatasas, y polimerasas. Cada tipo de ribozimas se desdobla de una secuencia diferente de nucleótidos usando mecanismos diferentes de acción. Adicionalmente, cada clase se distingue además con base en cuantas bases de nucleótidos son esenciales para la actividad catalítica, y al grado del que la secuencia objetivo pretendida y la ribozima se puedan manipular para alterar la especificidad. Así, las ribozimas que se presentan naturalmente, se pueden usar como una base para crear estructuras de tipo ribozima que no se presentan naturalmente (totalmente únicas y modificadas) . Por simplicidad, el término ribozimas se puede usar en lugar de un dominio catalítico en la presente invención, pero se apreciará que el dominio catalítico no necesita contener toda la estructura de ribozimas que se presentan naturalmente para usarse en la presente invención, y puede involucrar una estructura sintética de tipo ribozima. El término "ligasa de ARN" o "dominio de ligasa" como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido capaz de catalizar (alterar la ocurrencia, velocidad y/o tasa de) de una reacción de ligación (la unión conjunta de dos polinucleótidos) en una forma específica de la secuencia base de polinucleótidos. Como con otros dominios catalíticos, el dominio de ligasa puede actuar en un cis, esto es, como una reacción intramolecular o en trans, esto es, como una reacción intermolecular cuando el gen de interés, la expresión del cual se va a regular, se proporciona para la célula como un constructo separado de ADN. La ligasa de ARN, puede tener complementariedad en una región de enlace de substrato para un polinucleótido objetivo especificado, y también tienen una actividad catalítica para unirse específicamente al AR? en ese objetivo. Por "complementariedad" significa un ácido nucleico que puede formar pares base (por ejemplo, formar enlaces de hidrógeno con otros AR? por Watson-Crick tradicional u otro tipos no tradicionales (por ejemplo del tipo, Hoogsteen) de interacciones con pares base. Esta complementariedad funciona para proporcionar una hibridación suficiente del dominio de ligasa al AR? objetivo para permitir que suceda la reacción. Se prefiere una complementariedad de 100%, pero también puede ser útil una complementariedad tan baja como 50-75%. Se pueden modificar los ácido nucleicos en la base, azúcar, y/o grupos fosfatos. Los dominios específicos de ligasa de los polinucleótidos alostéricos de ligasa de ARN no son limitativos de la invención, y aquellos expertos en la técnica reconocerán que todo lo que es importante en un dominio de ligasa de esta invención, es que tenga un sitio de enlace específico del substrato que sea complementario con una o más de las regiones objetivo de polinucleótidos, y que incluya un sitio dentro o alrededor de un sitio de enlace del sustrato que imparta una actividad de ligasa con el dominio de ligasas. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que los dominios catalíticos que tienen actividades de empalme o de desdoblamiento pueden también involucrar la complementariedad en un dominio de enlace de sustrato con un polinucleótido específico objetivo con objeto de interactuar específicamente con el ARN catalítico y el objetivo deseado. El término "gen de interés" o "gen deseado" como se usa en la presente, se refiere a un gen que proporciona un beneficio fisiológicamente relevante a la célula u organismo, tal que codifica una molécula terapéuticamente relevante para la cual se controla la expresión por medio del módulo de control alostérico y el efector. Por ejemplo, un gen terapéutico de interés, es un gen que corrige o compensa una deficiencia subyacente de proteína o alternativamente, que es capaz de subregular un gen particular. Además, un gen de interés, puede ser un gen que media el exterminio de células por ejemplo, en terapia de genes para el tratamiento del cáncer. El término "transgen" como se usa en la presente, se refiere a un gen tal como el gen de interés que se transfiere a una célula.

El término "ARN mensajero" (ARNm) se usa para referirse a un polinucleótido que transfiere información del AD? al sistema formador de proteínas de célula. El término "ARNm precursor" o "pre-ARNm" se usa para referirse a un polinucleótido que se transcribe directamente de la hebra codificadora del ADN, puede contener un intrón o intrones y puede o no truncarse con un nucleótido de guanosina metilada invertido. El término polinucleótido "no natural" como se usa en la presente, se refiere a una secuencia o constructo de polinucleótido que no se presenta en la naturaleza. Los polinucleótidos alostéricos preferidos de la presente invención no se presentan en la naturaleza. El término "polinucleótido aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que está libre de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual se asocia naturalmente, y preferiblemente está substancialmente libre de cualesquiera otras moléculas contaminantes de ácidos nucleicos de mamíferos, que interferirían con su uso en la interacción de proteínas o su uso terapéutico o diagnóstico. El término "región de reconocimiento del empalme" como se usa en la presente, se refiere a una secuencia en el ARN precursor que sirve como un donador de empalme, aceptor de empalme o sitio de enlace del o espliceosoma.

El donador de empalme es típicamente un sitio en la terminación 3' del exon (localizado en la terminación 5' del intrón a separase) , y el aceptor de empalme se refiere a un sitio en la terminación 5' del exon adyacente al ligarse (la terminación 3' del intrón a separarse). "Espliceosoma" se refiere a un complejo multicomponente grande de proteínas celulares y el ARN que se enlaza y dirige el procesamiento del pre-ARN en el ARNm por desdoblamiento, la separación de intrones y ligación de exones. El término "intrón" , se usa para referirse a una sección del AR? que se presenta en una porción transcrita de un gen, que se incluye en un ARNm precursor pero que se extirpa durante el procesamiento del AR? transcripto antes de que ocurra la traducción. Por lo tanto, las secuencias de intrón no se encuentran en el AR?m ni se traducen en proteínas . El término "exon" se usa para referirse a un porción de un gen que representa el transcripto del gen y que sobrevive a procesamientos de AD? en la célula para ser parte del ARNm. Los exones codifican generalmente tres regiones funcionales distintas del transcripto de ARN. La primera región, localizada en la terminación 5' que no se traduce en proteína, se denomina la región no traducida 5' (5' -UTR). La 5' -UTR, señala el comienzo de la transcripción del ARN y contiene secuencias que dirigen el ARNm a los ribosomas y provocan que el ARNm se enlace por ribosomas de manera que puede suceder la síntesis de proteínas . La segunda región se conoce como una estructura de lectura abierta y contiene la información que se puede traducir en la secuencia de aminoácidos de la proteína o funcionar como un ARN bioactivo. La tercera región, localizada en la terminación 3', contiene las señales para la terminación de la traducción y para la adición de un extremo de poliadenilación (poli (A) ) y no se traduce en proteínas (esto es, la 3 ' -UTR) . En particular, la 3 ' -UTR puede proporcionar estabilidad de AR?m. La frontera intrón/exon será esa porción en un gen particular en donde una sección de intrón se conecta con una sección de exon. Los términos "recuadro TATA" y "sitio CAP" se usan como se reconocen en la técnica. El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, virus, molécula pequeña, liposoma, molécula portadora, etc.) que se usa para transferir la información de codificación a una célula huésped. Los términos "secuencias de control" y "elementos de control" se usan para referirse colectivamente a secuencias regulatorias no codificadoras incluyendo pero no limitados a promotores, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios regulatorios en la dirección ascendente, orígenes de replicacion, sitios de entrada internos de ribosomas, aumentadores y similares, que se ligan operativamente al ADN que codifica un gen de interés para proporcionar la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora en una célula receptora. No todos estos elementos de control necesitan siempre estar presentes con tal de que la secuencia que codifique el gen de interés, sea capaz de transcribirse y traducirse en una célula huésped adecuada de conformidad con los medios de expresión regulatorios de la presente invención. Un "promotor" se usa para referirse a una secuencia de ADN que dirige el enlace de la polimerasa de ARN con lo que promueve la síntesis del ARN. Un "origen de replicación" es una secuencia en un vector o en un cromosoma de células huésped, que produce elementos extragenómicos (por ejemplo, virus o plásmidos) que pueden replicarse independientemente del genoma de la célula huésped. Los "aumentadores" son elementos que actúan en cis del AD?, que estimulan o inhiben la transcripción de los genes adyacentes . Un aumentador que inhibe la transcripción también se denomina un "silenciador" . Los aumentadores difieren de los sitios de enlace de ADN por las proteínas de enlace de AD? específicas de la secuencia, que se encuentran solamente en el promotor (que también se denominan "elementos promotores") en que los aumentadores pueden funcionar en cualquier orientación, y sobre distancias de hasta varios pares de kilo bases, aun desde una posición en la dirección descendente de la región transcrita. El término "ligado operativamente" se usa para referirse a una configuración de elementos, en donde los elementos así descritos se configuran o ensamblan de manera de llevar a cabo su función usual. Así, una secuencia de control ligada operativamente a una secuencia de codificación, es capaz de efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia de codificación. Por ejemplo, una secuencia de codificación se liga operativamente a un promotor cuando el promotor es capaz de dirigir la transcripción de esa secuencia de codificación. La secuencia de control no necesita ser contigua con la secuencia de codificación con tal de que funcione correctamente. Así por ejemplo, al intervenir secuencias no traducidas aunque transcritas pueden estar presentes entre una secuencia de promotor y la secuencia de codificación y la secuencia del promotor todavía se puede considerar "ligada operativamente" a la secuencia de codificación.

El término "co-elementos" como se usa en la presente, se refiere a un molécula separada o a un dominio separado en el ARNm de precursor que interactúa con o forma complejos con dominios catalíticos y/o aptámeros del módulo de control alostérico y/o el efector para producir un complejo catalítico. Por ejemplo, el co-elemento puede completar una porción faltante del módulo de control alostérico de manera que se vuelva catalíticamente activo. Tales co-elementos incluyen los componentes como se describen en WO 9808974. Los co-elementos alternativos pueden incluir los elementos de puenteo descritos por Soukup y Breaker (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 3584-3589, 1999) para construir ribozimas alostéricas de respuesta a ligando. El término "transferencia de genes" o "suministro de genes" se usa para referirse a métodos y/o sistemas para insertarse de forma confiable en polinucleótidos particulares (por ejemplo, ADN) en una célula objetivo. La transferencia de genes puede tener lugar in vivo (por ejemplo, terapia de genes con virus asociado al adeno) o ex vivo (por ejemplo, como con la modificación extracelular de células con un retrovirus seguida por la transferencia o implantación de las células transformadas en el huésped) . Tales métodos pueden resultar en la integración de material genético transferido en el genoma de las células objetivo o el material genético transferido puede funcionar directamente del genoma de la célula huésped. Los términos "reducción", "inactivación", "inhibición", "inicio" y "disminución" en la expresión como se usa en la presente significa que el nivel de traducción de ARNm objetivo se reduce debajo de aquel que se observa en ausencia de los medios de regulación de la presente invención. Así, la inhibición de la expresión de genes puede ir desde una disminución en la traducción del ARNm objetivo hasta la inactivación completa o incapacidad de transcripto para usarse para expresar el gen de interés . Los términos "aumento", "activación", "inducción" o "incremento" en la expresión como se usa en la presente, significa que el nivel traducción del ARNm se incrementa arriba de aquel observado en ausencia de los medios de regulación de la presente invención. Así, la inducción de la expresión puede ir desde el inicio de la traducción del ARNm objetivo a un incremento en la traducción del ARNm. La frase "que controla específicamente la expresión del gen de interés", como se usa en la presente significa alterar la expresión del gen de interés sin alterar la expresión de otros genes en la célula, en una forma que provocaría un efecto adverso en (a) un organismo que contiene la célula en el caso en donde la célula está dentro del organismo o (b) el crecimiento o el cultivo de la célula, en el caso en donde la célula crece o se cultiva para hacer un producto en donde la cantidad del producto producido se asocia con la expresión del gen de interés . Alteración de la Expresión de Genes La producción de una proteína o péptido recombinante, se puede afectar por la eficiencia con la cual el ADN (o un ácido nucleico episomal) se transcribe dentro del ARNm. Los sistemas de control convencionales, buscan afectar el evento de la transcripción. La producción de una proteína o péptido recombinante, sin embargo, también se puede afectar por el eficiencia con la cual se modifica el ARNm precursor para formar el ARNm que se traduce en la proteína. Los constructos novedosos y los métodos de la presente invención, proporcionan ventajosamente la expresión regulada de un gen de interés, tal como una proteína terapéutica, al alterar el proceso del procesamiento pre ARNm. Los módulos de control alostérico de la presente invención, contienen dominios de enlace del efector y catalítico, que se seleccionan específicamente de manera tal que la interacción del dominio de enlace de efector o el aptámero con un efector, altera la actividad de los módulos de control alostérico. Por ejemplo, la interacción del efector y el aptámero puede resultar en un cambio conformacional en el módulo de control alostérico. Dependiendo de la selección de los módulos de control alostéricos, el cambio conformacional puede resultar en un incremento o en una disminución en la actividad del dominio catalítico del módulo. Esto a su vez, afecta si el ARNm del precursor es o no adecuadamente modificado para formar un ARNm capaz de traducirse en la proteína de interés. Aunque no se limita a la presente invención, un cambio conformacional puede provocarse por la energía de enlace derivada de la interacción del aptámero efector que se usa para cambiar el balance termodinámico entre dos conformaciones posibles del modulo de control alostérico. Dependiendo del diseño del formato como se describe en mayor detalle en las diferentes modalidades, el módulo de control alostérico se activa o inactiva por el efector. La presente invención incluye un formato de regulación de la expresión que involucra un ARN de auto-desdoblamiento activado alostéricamente como el dominio catalítico del módulo de control alostérico. En un aspecto de esta modalidad el módulo de control alostérico se puede codificar en un AR?m con el gen de interés. Por ejemplo, la secuencia de AD? se diseña para codificar un sitio de auto-desdoblamiento que separa las secuencias de cierre y mensajes. Como se describe en mayor detalle en la presente, el aptámero y el dominio catalítico se pueden seleccionar de manera tal que en ausencia de un efector, el dominio catalítico sea activo y que la actividad resulte en un desdoblamiento del pre- ARNm ó ARNm. Así, el gen de interés no se expresa porque no se puede traducir el ARNm. En presencia del efector, el dominio catalítico se inhibe y así es inactivo o incapaz de actuar en el substrato de ARN. Como resultado, no se desdobla el AR?m. Así, el gen de interés se expresa por que el ARN se puede procesar y traducir adecuadamente. Una modalidad preferida de la presente invención, involucra constructos que proporcionan la expresión de genes en presencia del efector. En una modalidad alternativa que involucra un AR? de auto-desdoblamiento activado alostéricamente, se puede seleccionar el aptámero del dominio catalítico, de manera tal que en presencia de un efector, el dominio catalítico es activo y esa actividad resulta en el desdoblamiento del AR?m. Así, el gen de interés no se expresa por que no se puede traducir en AR?m. En ausencia del efector, el dominio catalítico está inactivo o es incapaz de actuar sobre el substrato de AR?. Como resultado, el AR?m no se desdobla y el gen de interés se expresa. Así, en ausencia del efector se expresa el gen.

Todavía en otra modalidad, el dominio catalítico puede incluir un intron preparado por ingeniería que contiene un sitio de auto-desdoblamiento. El aptámero y el efector se seleccionan de manera tal que el dominio no se desdobla si está ausente en el efector. Como resultado, el ARNm no se reconoce como una molécula activa y no se traduce . La presente invención también incluye un formato de regulación de la expresión que involucra un ácido nucleico de empalme, que se activa alostéricamente como el dominio catalítico que tiene actividad de ligasa y de desdoblamiento. En un aspecto de esta modalidad, el módulo de control alostérico se inserta en un exon del gen de interés. Esto resulta en la formación de un "intrón preparado por ingeniería" (el) como se detalla en la figura 3. En ausencia de un efector, el módulo de control alostérico está inactivo, dejando así al intrón preparado por ingeniería en su lugar y resultando en una estructura de lectura abierta alterada que conduce a la inhibición o reducción de la expresión de proteínas. En presencia del efector, del módulo de control alostérico está activo. Esta actividad resulta en la separación del intrón preparado por ingeniería y la ligación del exon para formar una estructura de lectura abierta productiva que conduce a la activación o incremento en la expresión de proteínas . La presencia del el en el pre-ARNm, puede resultar en la inhibición de la expresión de genes por una diversidad de mecanismos que pueden actuar individual o conjuntamente. Tales mecanismos incluyen pero no se limitan a l)el el se puede diseñar para contener diversos codones de detención que arrestarían la traducción; 2) el el puede codificar aminoácidos sin sentido que resultan en una proteína con mutaciones múltiples de inactivación; y 3) la presencia del el puede activar el sistema de vigilancia del ARNm natural a la célula, que secuestraría o destruiría el pre-AR?m alterado. Se apreciará además que el formato puede involucrar un intrón preparado por ingeniería diseñado de manera tal que en presencia del efector, el módulo de control alostérico está inactivo y en ausencia del efector el módulo está activo. La presente invención incluye además un formato de regulación de la expresión que involucra un intrón de auto-empalme alostérico que se puede inhibir. En esta modalidad, el módulo de control alostérico se inserta en un intrón en una región necesaria para el ensamble del espliceosoma tal que la acción del intrón de auto-empalme resulta en la separación de una secuencia de nucleótidos necesaria para el empalme normal. Esta modalidad se detalla en la figura 6. En ausencia del efector, el módulo de control alostérico está activo, conduciendo así a la separación del sitio de reconocimiento vital del empalme. La reparación del sitio de reconocimiento del empalme, resulta en una estructura alterada de lectura abierta que conduce a la inhibición o reducción de la expresión de proteínas. En presencia del efector, el módulo de control alostérico es inactivo y como resultado, sucede un empalme normal en los sitios de reconocimiento del empalme, se forma la estructura de lectura abierta correcta y se expresa la proteína. Selección del Efector Un aspecto fundamental de la presente invención, es la identificación de un efector para su uso con un módulo de control alostérico para alterar la expresión de un gen. Esta asociado con tal uso, el uso del efector para evolucionar un aptámero similar que formará parte del módulo de control alostérico. La presente invención, proporciona un método novedoso sistemático para identificar un efector y generar un aptámero interactivo (o aptámeros). El método involucra las siguientes etapas. Primero, se seleccionan las características deseadas del efector. Estas características deseadas se seleccionan de uno o más de los siguientes atributos que son útiles para identificar un efector potencial adecuado para su expresión de proteínas y en técnicas de terapia de genes : a) tiene al menos una biodisponiblidad del 1%; b) está biodistribuido para el tejido que contiene un módulo de control alostérico; c) tiene la capacidad de pasar al núcleo de la célula; d) no muestra interacciones con fármacos o interacciones manejables con fármacos ; e) no muestra toxicidad o una toxicidad aceptable en el rango de dosis usada; f) no muestra efectos laterales o efectos laterales aceptables en el rango de dosis usado; g) no muestra un efecto farmacológico en el rango de dosis usado al regular la expresión del transgen o un efecto farmacológico despreciable; h) posee propiedades físicas adecuadas para la evolución in vitro de un aptámero (propiedades físicas deseables, pueden incluir una molécula plana que tiene una estructura rígida.) Estas características indican que el efector es adecuado para la generación del aptámero, consumo humano y uso con un módulo de control alostérico para la regulación de la expresión genes . La información sobre estas características se puede obtener al tener acceso a una o más bases de datos que contienen datos sobre las características seleccionadas. Las bases de datos que contienen la información relevante incluyen pero no se limitan a bases de datos de fármacos de investigación (IDdb, Current Drugs; Current Drugs Ltd., Philadelphia, Pennsylvania) , Drug Data Report (MDDR, MDL Information Systems Inc., San Leandro, California; Prous Science Publishers, Barcelona, España) , World Drug Index (WDI, Derwent Information, Alexandria, Virginia) y archivo de fármacos Derwent, R & D Insight (Adis International Inc., Langhorne, Pennsylvania) , R & D Focus (IMS HEALTH, IMSworld Publications Ltd. , Londres, Inglaterra) , Pharmaprojects (PJB Publications, Surrey, Reino Unido), MEDLINE (The National Library of Medicine) y EMBASE (Elsevier Science, B.V.) . Se identifica después un conjunto de efectores que tenga las características seleccionadas . La "biodisponibilidad" como se usa en la presente, se refiere a la capacidad del efector para alcanzar su sitio pretendido de acción después de la administración. El efector tendrá una biodisponiblidad de al menos 1%. Preferiblemente, el efector tendrá una biodisponiblidad de al menos 5%, y más preferiblemente el bioefector tendrá una biodisponibilidad de al menos el 10%. Un efector preferido también estará biodisponible para la entrega oral, pero se apreciará que la vía de entrega no está limitada a la presente invención. El efector se puede administrar parenteralmente, por ejemplo, por inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratecal o subcutánea. El efector seleccionado se puede formular como una composición para la administración oral (incluyendo sublingual y bucal) , administración pulmonar (intranasal e inhalación), administración local, administración transdérmica, y administración rectal. La entrega puede involucrar un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiple. Al usar este método, se pueden identificar efectores adecuados de una diversidad de moléculas que incluyen pero no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, metabolitos que se presentan naturalmente y efectores biológicos, lípidos o carbohidratos (polisacáridos, azúcar) , ácido grasos y polímeros. En una modalidad preferida de la presente invención el efector es una molécula pequeña. Se apreciará que cualquier base de datos, o combinación de bases de datos, se puede usar en la ejecución de la presente invención. Las bases de datos adecuadas de los efectores potenciales incluirán moléculas tales como: a) fármacos comercializados con estereoselectividad para un isómero, que comprende el componente farmacéuticamente aceptable activo y otro isómero con poca o ninguna actividad farmacológica (el último siendo el efector posible de interés) . b) metabolitos de fármacos conocidos que tienen poca o ninguna actividad. c) moléculas dirigidas al receptor nuclear (por ejemplo, vitamina D, ácido retinoico esteroides) ; d) candidatos a fármacos que entran a ensayos clínicos, pero se descontinúan los ensayos debido a una carencia relativa de eficacia; e) fármacos que se retiran del mercado debido a una carencia de eficacia terapéutica. f) fármacos que son eficaces pero que no se comercializan debido a un beneficio relativo bajo. g) fármacos diseñados como antivirales/antiinfecciosos, para su uso en pacientes no afectados por el virus objetivo o el agente infeccioso. h) aditivos para alimentos bien caracterizados; i) fármacos genéricos con mecanismos bien conocidos de acción; y j) fármacos que son desplazados del mercado o ensayos clínicos por moléculas mejores en su clase.

Los efectores identificados pueden entonces usarse para generar y seleccionar aptámeros para los efectores en conjunto por medio de la solución in vitro. Las combinaciones de los efectores y los aptámeros, así como los efectores y los módulos de control alostéricos, se pueden después evaluar para identificar aquellas moléculas mejor preparadas para el control de la expresión de genes. Más allá del enlace del módulo de control alostérico, la eficacia y la penetración de células, los efectores de interés se someterán a una diversidad de pruebas adicionales como parte de la conveniencia del efector y el proceso de selección como parte del proceso de aprobación regulatoria. Tales pruebas incluyen aquellas pruebas que se llevan a cabo típicamente como parte de la aprobación regulatoria y del desarrollo de un producto farmacéutico, incluyendo evaluaciones de propiedades farmacocinéticas, y propiedades farmacodinámicas, propiedades f rmacéuticas, toxicología mutagenicidad, toxicidad reproductiva y similares . Las evaluaciones farmacocinéticas pueden incluir análisis de la absorción, distribución, metabolismo y perfiles de excreción del efector en sistemas de células in vitro, animales, modelos animales de enfermedades, humanos normales y pacientes. El perfil de absorción incluye la tasa de absorción, la concentración máxima de plasma alcanzada, el efecto de las modificaciones en la formulación, el efecto de formas diferentes de sal y cristal, el efecto de alimentos y otros medicamentos en la absorción y similares. El perfil de distribución incluye la determinación de la ubicación y la concentración del efector en diversos tejidos y fluidos del cuerpo, enlace de proteínas y similares. El perfil de metabolismo incluye la determinación de mecanismos por el cual se metaboliza el efector, tal como por enzimas del hígado o del riñon, una determinación de la estructura y actividad de los metabolitos producidos, el efecto del efector y los metabolitos en el metabolismo de otros fármacos, el efecto del alimento y de otros fármacos en el metabolismo del efector y similares. El perfil de excreción incluye la determinación del mecanismo y distribución de la excreción, tal como a través de la bilis o el riñon, la tasa de depuración, la vida media, (cantidad de tiempo necesario para depurar el 50% del nivel de plasma del efector administrado) , acumulación y los similares del efector y sus metabolitos. Las evaluaciones farmacodinámicas involucran un análisis de la actividad fisiológica del efector. Tal análisis puede incluir un evaluación de la duración de la actividad, régimen de dosis y efectos en la formulación sobre la actividad, umbral terapéutico, (concentración mínima de plasma del efector necesaria para la actividad) y efectos del modo de administración. Las evaluaciones farmacéuticas involucrarán un análisis de propiedades físicas del efector con respecto a la formulación del efector. Las propiedades físicas del efector de interés, incluyen solubilidad, estabilidad, química tal como el efecto de la temperatura, humedad y luz, en forma de cristal (sólida) , forma de sal (sólida o en solución) y similares, estabilidad de la solución, efecto en el pH de la solución, cristal vs . sólido amorfo vs. aceite vs . líquido, densidad de cristal, etc, También las propiedades de la formulación del efector se evalúan. Estas propiedades incluyen pero no se limitan a estabilidad efecto en la forma de cristal y tamaño de absorción, efecto de la forma de sal en la absorción, compresibilidad del sólido y maleabilidad, capacidad del flujo del sólido, uniformidad del tamaño de cristal, compatibilidad con otros ingredientes de la formulación, densidad de empaque, uniformidad de la mezcla y el contenido de cada formulación. La toxicología involucra determinar el perfil de los efectos tóxicos y otros efectos laterales del efector, sus metabolitos y su formulación, generalmente iniciando en animales y después en humanos para determinar los riesgos potenciales involucrados en la administración del efector.

Los análisis pueden incluir una evaluación de los efectos indeseables en el sistema nervioso central, sistema cardiovascular, sistema pulmonar, sistema gastrointestinal, sistema renal, sistema hepático, sistema genitourinario, sistema hematopoyético, sistema inmunológico y sistema dermal . Los análisis puede incluir determinar la dosis tóxica, dosis máxima tolerable, actividad agonista o antagonista contra otras enzimas, receptores, proteínas de enlace y similares, actividad cancerígena, inmunogenicidad, y similares. Los medios y métodos del análisis toxicológico son bien conocidos en la técnica. Las descripciones incluyen aquellas que se encuentran en Principies and Methods of Toxicology (Tercera Edición, 1994, Ed. A. Wallace Hayes, Raven Press, NY) y Toxicology: The Basic Science of Poisons (por Cassarett y Doull, Quinta Edición, 1996, Ed. Curtís D. Klaassen, McGraw-Hill, NY) . El desarrollo del efector puede también incluir el estudio y evaluación de uno o más de estos atributos en poblaciones especiales tales como pediátricas y geriátricas . Además, los análisis también puede requerir la evaluación de los efectos del género y la etnicidad. Como se mencionó arriba, la selección final de un efector adecuado incluirá pruebas similares a aquellas llevadas a cabo para- cualquier entidad molecular nueva (NME) propuesta para uso humano. Se puede usar una diversidad de estrategias de separación por exclusión. Hasta hace unos cuantos años, no era posible predecir las características de absorción y del metabolismo de los ?ME sin llevar a cabo estudios in vivo adecuados de animales completos. Sin embargo, los avances recientes en el entendimiento de la biología molecular y la especificidad funcional de las enzimas metabólicas y los mecanismos de absorción de transporte, han proporcionado una base mecánica para reunir datos de absorción metabolismo usando sistemas in vitro "humanizados" . El desarrollo y disponiblidad de estos sistemas in vitro humanizados acoplados con los avances en la instrumentación analítica, están acelerando el proceso de desarrollo. Es cada vez más posible llevar a cabo separaciones por exclusión farmacocinéticas de alta producción de nuevas moléculas. La siguiente descripción resaltará los métodos in vitro e in vivo y las técnicas que se aplican. Métodos in vitro Ensayos de absorción El candidato de fármaco ideal debe poseer buenas características de metabolismo y absorción. Una predicción temprana de la biodisponiblidad oral de una serie de compuestos, proporciona información invaluable con referencia a la relación de la actividad de estructura (SAR) . Una parte esencial de la selección de compuestos con una buena biodisponibilidad sistemática involucra una predicción precisa de la absorción a través del intestino. Una de las técnicas más exitosamente aplicadas para la predicción de la absorción en el hombre, es el modelo de 21 días Caco-2. La células Caco-2 son de origen humano, derivadas de células de cáncer de colon humano. Cuando se cultivan en membranas porosas. Estas células se diferencian espontáneamente en monocapas altamente funcionalizadas, que son similares en características a los enterocitos intestinales pequeños (Pinto et al., Biol. Cell 74:323-330, 1983; Hidalgo et al., Gastroenterology 96:736-749, 1989). Los datos reunidos durante los años, muestran que este modelo es un buen predictor en la absorción intestinal humana in vivo (Artursson et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 175: 880-885, 1991.). Aunque este modelo proporciona estimados razonables de la absorción in vivo, su uso como una herramienta de separación de alta producción ha sido desafiada por diversos investigadores. La naturaleza intensiva en mano de obra y consumidora de tiempo de los estudios efectuados con estas células, ha acelerado a algunos investigadores a buscar alternativas viables tales como células de riñon Madin-Darby de rápido crecimiento (MDCK) (Irvine et al., J. Pharm. Sci. 88(l):28-33, 1999) o el modelo de 3 días de cultivo Caco-2 (Chong et al., Pharm. Res: 14(12): 1835-1837, 1997) aunque otros han intentado automatizar la metodología de evaluación de absorción de Caco-2 (Garberg et al., Pharm. Res. 16(3)441-445,1999). Irvine et al, utilizan un gran número de compuestos para evaluar el uso de células MDCK como una alternativa a las células Caco-2 para estimar la permeabilidad de la membrana. En global, se observa una buena correlación (r2 = 0.79) para los valores de permeabilidad aparente (PapP) entre las células Caco-2 y MDCK. Con base en sus hallazgos estos autores sugieren que las células Papp sean una herramienta de separación por exclusión de la permeabilidad práctica para incrementar la producción en la fase temprana de descubrimiento. El modelo Caco-2 de 3 días para estudiar la permeabilidad de un compuesto también se ha investigado. Esto cultivos de 3 días proporcionan valores razonables • app para los compuestos transportados transcelulármente . Las monocapas de los cultivos de tres días sin embargo, tienen de 4 a 6 veces más escapes que las células tradicionales cultivadas por 21 días, y la naturaleza predictiva de estas células no es tan robusta para compuestos que se transportan paracelularmente o por la efusión y mecanismos mediados por el portador (Yee S, Day W: Applications of Caco-2 Cells in Drug Discovery and Development in Handbook of Drug Metabolism. Woolf, T (Eds), Marcel Dekker, Inc. New York: 508-519). Garberg y colaboradores desarrollaron una puesta en marcha automatizada para la evaluación de la permeabilidad in vitro para incrementar la capacidad de producción durante la fase de separación utilizando el modelo tradicional Caco-2. Esta automatización se llevó a cabo por la incorporación de un sistema de manejo de líquido que lleva a cabo todas la etapas necesarias de pipeteo durante el curso del experimento. Con base en los resultados obtenidos, estos autores sugieren que al utilizar un procesador de muestras automático se puede incrementar sustancialmente la capacidad de separación de la absorción in vitro. Otra estrategia para acelerar la producción de la separación de la absorción se ha investigado (Taylor et al., Pharm. Res. 14(5)572-577, 1997). Estos investigadores llevaron a cabo experimentos de absorción usando el modelo Caco-2 con mezcla de compuestos físicoquímicamente diversos y pudieron seleccionar exitosamente compuestos potenciales oralmente biodisponibles. La acumulación de las muestras obtenidas de los experimentos llevados a cabo con un compuesto simple o una mezcla de compuestos, también se ha investigado utilizando un espectrómetro de masas como la herramienta analítica (McCarthy et al., Pharm. Res. 13(9):S242, 1996).

También se están desarrollando nuevos métodos de producción superior para separar NME por las propiedades fisicoquímicas tales como solubilidad que pueden influenciar la absorción de NME (Tarbit et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:411-416, 1998.) Otros métodos se desarrollan para determinar si los NME son sustratos de diversos transportadores intestinales (por ejemplo, p-glicoproteína) . Los datos de permeabilidad, acoplados con los datos físicoquímicos y de transporte, deben aumentar la capacidad de predecir la absorción en el futuro y conducirán a una selección más rápida de los candidatos líderes con las características de absorción deseables. Ensayos de metabolismo El metabolismo del primer paso por el intestino o el hígado, es otro determinante principal de la biodisponibilidad oral in vivo. Las reacciones metabólicas pueden ampliamente clasificarse en reacciones de fase I y de fase II. Las reacciones de fase I crean un grupo funcional en la molécula de manera que se pueda conjugar además por las enzimas de fase II o excretarse con la modificación. La mayoría de las reacciones metabólicas oxidantes se llevan a cabo por el sistema de enzimas del citocromo P450 (CYP) , una superfamilia de enzimas que contienen heme que se encuentran predominantemente en el hígado. El metabolismo catalizado CYP puede tener efectos importantes en las características globales de disposición de una molécula que pueden resultar en una vida media corta, una baja biodisponibilidad, cinética no lineal, interacciones fármaco-fármaco, toxicidad, carencia de eficacia y variabilidad entre sujetos. Estos defectos por sí solos o en combinación son la causa principal de la falla de fármacos en el desarrollo o en algunos casos ha conducido al retiro de un producto comercializado. Para atender estas cuestiones se han instituido estudios de metabolismo a tiempo en el programa. Se han desarrollado métodos de separación por exclusión in vitro de alta producción, para predecir la estabilidad metabólica de un NME, y el potencial para las interacciones fármaco-fármaco . El tubo de ensayo tradicional y el método de incubación con baño de agua I para la prueba de estabilidad metabólica, se han sustituido con la técnica de placa de 96 pozos que es más compatible con la automatización. Las incubaciones se llevan a cabo típicamente usando microsomas de hígado animal o humano acumulado o la fracción S-9, y la reacción se lleva a cabo a 37°C en un bloque de reacción. Después de la determinación de la reacción, la placa se coloca directamente en el auto muestreador de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) acoplado a un espectrómetro de masas . El uso de hepatocitos humanos en el formato de 96 pozos también se ha propuesto (Li A., AAPS, New Orleans, LA, 1999.) El acumulado de muestras de un sistema de placas de 96 pozos junto con la espectrometría de masas de cromatografía líquida (LC/MS) para la separación y detección y la adquisición automatizada de datos, también se ha utilizado para incrementar la producción en la generación de datos de estabilidad metabólicos (Michelson et al., LC-MS Analysis of the Metabolic Stability of Human Liver Microsome Samples Prepared in a 96 well Format. AAPS Pharmsci. l(4):S-300, 1999.). Después de la adquisición de datos, se hace un estimado de la vida media in vitro (t %) o de la depuración aparente (Clapp) con base en la tasa de supresión del compuesto precursor (Obach et al., Journal of Pharmacol. Exp. Ther. 283 (1) .46-58, 1999). Se pueden también hacer predicciones de la biodisponibilidad in vivo usando el Clapp para la especie en cuestión. Se puede después llevar a cabo la ordenación por rangos de los compuestos separados con base en el Clapp la biodisponiblidad in vivo predicha. Estos resultados se pueden generar para un gran número de compuestos en una forma rápida de vuelta completa y proporcionar una visión de la relación de la actividad de la estructura para mejorar las características farmacocinéticas (PK) por medio de las modificaciones estructurales.

La predicción de las interacciones fármaco-fármaco también es una parte integral de los programas de desarrollo de fármacos. Tradicionalmente, los estudios de interacción fármaco-fármaco mediados por el citocromo P450 se han llevado a cabo utilizando microsomas de hígado humano, y el análisis de las muestras se efectúa usando técnicas de separación por HPLC con UV o detección por fluorescencia. La separación cromatográfica completa es bastante consumidora de tiempo e intensiva en mano de obra, y por lo tanto no se busca para su uso en un ambiente de separación de alta producción. Recientemente, Yin y colaboradores (ISSX Proceedings 15:87, 1999) describieron un método de producción rápida para la determinación de la actividad de la isoforma CYP para evaluar el potencial inhibidor de NME. Este método utiliza microsomas de hígado humano y se lleva a cabo en una plataforma de 96 pozos con extracción en fase sólida y acumulación de muestras para cromatografía líquida de alta presión acoplada con la cuantificación de espectrometría de masas (LC/MS/MS) . Crespi y colaboradores (Curr, Opin. Chem. Biol. 2 (1) : 15-19, 1999) también han descrito ensayos fluorométricos basados en placas de microtitulación para las actividades de CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4, las 5 principales enzimas humanas CYP que metabolizan fármacos. Los ensayos radiométricos para obtener datos de los estudios in vitro para diversas enzimas CYP también se han reportado (Rodrigues et al . , Drug Met. Dis. 24:126-136, 1996; Rodrigues et al., Anal. Biochem. 219: 309-320, 1994; y Riley RJ, Howbrook D: J. Pharmac. Toxicol. Meth. 38: 189-193, 1998). Moody et al. (Xenob'iotica, 9(l):53-75, 1999) reportó recientemente el desarrollo y aplicación de un método completamente automatizado, para el análisis de las actividades catalíticas de las enzimas principales CYP. Este procedimiento se basa en ensayos fluorométricos y radiométricos y se lleva a cabo por un procesador de muestras robótico. Los métodos antes descritos, pueden exitosamente proporcionar una estimación rápida de los valores IC50,y así una determinación inicial en la capacidad inhibidora de los NME. La caracterización adicional del potencial inhibidor de los NME, se puede seguir usando enfoques clásicos que utilizan los substratos de sondas específicas de isoformas CYP (Newton et al., Drug Met. Dis. 23(1): 154-158, 1995) . La identificación temprana de las interacciones fármaco-fármaco basadas en la inducción es otro asunto importante. Previamente, los ensayos de inducción requerían el uso de cultivos de hepatocitos humanos, que significan una fuerte confianza de tales estudios en la disponibilidad del tejido humano. El conocimiento reciente de la base molecular para la inducción de CYP3A4 por medio del receptor nuclear PXR, ha proporcionado nuevos medios para explorar las interacciones fármaco-fármaco basadas en la inducción, en una forma rápida y relativamente económica (Lehmann et al., J. Clin. Invest. 10285): 1016-1023, 1998. La separación de alta producción para la estabilidad metabólica y las interacciones fármaco-fármaco, generan datos valiosos que se pueden explotar para formar moléculas "ideales". Con objeto de maximizar el beneficio de la información existente, se deben organizar los datos en un formato que sea fácilmente de buscar y recuperable. Hasta este punto, están ahora comercialmente disponibles diversas bases de datos del metabolismo de fármacos (Erhardt P: Drug Metabolism Data: Past and Present Status, Med. Chem. Res. 8 (7/8) :400-421, 1998). Una base de datos "basada en el conocimiento" con la organización sistemática de reportes de literatura en las interacciones de fármacos, también se desarrolló por el grupo del profesor Rene Levy en la University of Washington, Seattle (Levy RH et al., Metabolic drug interactions, www. apptechsys . com/drug/ . ) Este diseño de base de datos orientado al objeto permite al usuario recuperar la formación referente al involucramiento de las isoformas particulares de CYP en el metabolismo de un fármaco y también incluye información sobre otros parámetros relevantes PK para permitir una correlación in vitro - in vivo. El uso paralelo de estas bases de datos junto con los datos generados de estudios de separación de alta producción, acelerará la nominación y el proceso de desarrollo de los candidatos líderes. Ensayos farmacocinéticos in vivo A pesar de los éxitos en el desarrollo de los ensayos de absorción y de metabolismo in vitro, los estudios PK in vivo juegan un papel importante en el desarrollo de fármacos (Smith DA, van de Waterbeemd H: Pharmacokinetics and metabolism in early discovery, Curr. Opin. Biol. 3:373-378, 1999). Para obtener los valores del parámetro PK de un NME, se dosifica el NME intravenosamente y oralmente a un animal, se muestrea la sangre en diversos puntos de tiempo y después se analiza por CLAP o cromatografía de gas (GC) para el compuesto de interés. Los parámetros PK (por ejemplo, depuración, volumen de distribución, vida media de eliminación, y biodisponibilidad oral) que describen la absorción y disposición del NME en un animal completo, se calculan de los perfiles de tiempo- concentración de suero. La retroalimentación sobre la relación de estructura-PK es importante para dirigir los esfuerzos de investigación y de síntesis y la información en las exposiciones in vivo, es útil para diseñar estudios de eficacia/farmacología in vivo. La separación PK in vivo también puede ser necesaria cuando los ensayos del metabolismo in vitro son pobremente predictores de la cinética in vivo (por ejemplo, cuando el compuesto se elimina predominantemente por mecanismos renales o biliares) . De manera creciente, los científicos farmacéuticos están generando datos PK in vivo para su uso en el desarrollo y validación de modelos, para predecir la cinética in vivo a partir de datos in vitro y para el uso en modulación in silico (Tarbit et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:411-416, 1998; Bayliss et al., Curr. Opin. Drug. Dis. Dev. 2(1), 20-25, 1999). En años recientes, los esfuerzos para incrementar la producción en la evaluación PK de los NME, se han focalizado en dosificación de mezclas y acumulación de muestras para minimizar la carga de trabajo bioanalitica. La CLAP con la detección espectrométrica de masas (LC/MS y LC/MS/MS) ha aumentado grandemente la capacidad de monitorear más de un compuesto de una matriz. Dosificación de mezclas La dosificación de mezcla (también referida como N-en-1, cassette, o dosificación de cóctel) involucra la administración simultánea de dos o más NME al mismo animal, y el ensayo de las muestras de plasma por LC/MS.

Los valores del parámetro PK se determinan de los perfiles resultantes de tiempo-concentración. Berman et al. (J. Med. Chem. 40 (6) : 827-829, 1997; and Olah et al., Rapid Commun. Mass Spectrom 11:17-23, 1997) reportan la aplicación exitosa del enfoque de dosificación de mezcla para acelerar la selección del candidato durante el descubrimiento del fármaco. Desde entonces, se han reportado diversas comunicaciones en el PK de 2 hasta 22 compuestos dosificados simultáneamente a ratones, ratas, perros y monos por vías intravenosas y orales (Bayliss et al., Curr. Opin. Drug. Dis. Dev. 2(1). 20-25, 1999; Alien et al., Pharm, Res. 15(1): 93-97, 1998; Frick et al., Pharm. Sci. Tech. Today. 1(1):12-18, 1998; y Gao et al., J. Chromatogr. A828 : 141-148 , 1998.). Los informes han demostrado un buen acuerdo entre los valores del parámetro PK obtenidos de la dosificación de mezcla, en comparación con aquellos obtenidos de enfoques tradicionales. La dosificación de mezcla ofrece ahorros importantes de costo y tiempo debido a que se estudian menos animales, se requieren menos compuestos, y se generan menos muestras en comparación con los métodos tradicionales. Una ventaja adicional de la dosificación de mezcla es la capacidad para examinar la distribución de tejidos (por ejemplo, relaciones cerebro- sangre) , patrones de excreción urinaria (Frick et al., Pharm. Sci. Tech. Today. 1(1): 12- 18, 1998) y ensayo de proteínas (Alien et al., Phar, . Res. 15(1): 93-97, 1998) de NME múltiples junto con los estudios PK. Las desventajas de la dosificación ?-en-1 incluyen dificultades para desarrollar formulaciones para dosificación, la posibilidad de eventos adversos crecientes en el animal, y cuestiones de desarrollo de métodos (por ejemplo, la necesidad de una sensibilidad creciente debido a dosis inferiores, evitando las redundancias de peso molecular entre metabolitos y analitos de interés) . Hay también una preocupación de que las interacciones fármaco-fármaco (por ejemplo, la inhibición del metabolismo o de otras vías de eliminación de un compuesto por el otro) puedan alterar los PK de los ?ME. Las interacciones compuesto-compuesto han sucedido durante la dosificación de la mezcla oral y durante la dosificación intravenosa y cuando se introduce un inhibidor potente del citocromo P450 en la mezcla (Olah et al., Rapid Commun. Mas Spectrom. 11: 17-23, 1997). Las interacciones se identificaron por la inclusión de un compuesto de referencia en todas las sesiones de dosificación de mezcla. Una lista de factores a considerar cuando se diseñan experimentos de dosificación de mezcla para minimizar la posibilidad de obtener datos falsos y un análisis estadístico que describe la probabilidad de que un ?ME puede experimentar una interacción compuesto- compuesto como una función de tamaño de mezcla, se proporciona en una revisión por Frick y colaboradores (Pharm. Sci. Tech. Today 1(1): 12-18, 1998). Los avances futuros en la dosificación de mezclas se enfocarán probablemente en la automatización de diversas etapas tales como la preparación de solución de dosis, sintonización MS y reducción de datos y en desarrollo de métodos de cromatografía flexible, robustos (Bayliss et al., Curr. Opin. Drug Dis. Dev. 2(1), 20-25, 1999; Gao et al., J. Chromatogr. A828: 141-148, 1998). El trabajo futuro también se debe focalizar en definir y minimizar los riesgos PK (por ejemplo, interacciones compuesto-compuesto) asociadas con el método y el uso de los datos PK para el desarrollo de relaciones PK- estructura (ver por ejemplo, Shaffer et al., J Pharm. Sci. 88(3): 313-318, 1999, que sugieren que las relaciones farmacocinéticas de estructura se pueden derivar para un conjunto de análogos químicos de los datos generados usando una técnica de dosificación de mezcla) . Acumulación de muestras de estudios farmacocinéticos para incrementar los resul tados bioanalí ticos Diversos laboratorios han utilizado exitosamente un enfoque de acumulación de plasma para incrementar los resultados bioanalíticos y de PK (Olah et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 17-23, 1997; y Hop et al., J.

Pharm. Sci. 87 (7) : 901-903 , 1998). En el enfoque de acumulado, se dosifican múltiples animales con NME individual y se acumulan y analizan las alícuotas de las muestras de los puntos de tiempos comunes por LC/MS. La ventaja del acumulado es que hay menos muestras que analizar y se elimina la posibilidad de las interacciones compuesto-compuesto in vivo. El acumulado de muestras sin embargo, puede consumir mucho tiempo y los límites de detección se pueden comprometer debido a la dilución de la muestra. Hop y colaboradores (J. Pharm. Sci. 87(7): 901-903, 1998) reavivaron una técnica de acumulado que ha sido usada para obtener parámetros PK en pacientes pediátricos. Para cada animal, se acumularon alícuotas de plasma de cada punto de tiempo en proporción al intervalo de tiempo que cubrían, para producir solamente una muestra que tenía una concentración proporcional al área bajo la curva (AUC) . La mayor ventaja de este enfoque es una reducción importante en el número de muestras y en la carga de trabajo bioanalítico. Las desventajas son que la información acerca del curso tiempo-concentración (Cmax, Tmax, vida media) ya no está disponible y el acumulado es muy tedioso. La porción no utilizada de la muestra de plasma para los compuestos prometedores, se puede siempre volver a analizar para obtener el perfil completo PK y la automatización facilitaría el acumulado. Los investigadores han aplicado esta técnica al análisis de NME para un programa de descubrimiento en donde AUC después de la dosis oral es la principal preocupación. La técnica también se puede usar para determinar la depuración y la biodisponiblidad de compuestos. Evolución in vitro Para los propósitos de la presente invención, las estrategias de evolución in vitro se usan típicamente para evolucionar un aptámero para un efector identificado. La reacción efector-aptámero específica y selecta es una herramienta útil para aplicaciones in vivo: por ejemplo, permite la ingeniería de constructos que no se encuentran naturalmente en la célula, y por lo tanto no se espera que afecte adversamente la función normal de la célula. Se han utilizado diversas estrategias de evolución in vitro (selección) (Orgel, Proc. R. Soc. London, B 205: 435, 1979) para desarrollar nuevos catalizadores de ácidos nucleicos capaces de catalizar una diversidad de reacciones, tales como el desdoblamiento y unión del ARN y el ADN (Joyce, Gene, 82: 83-87, 1989; Beaudry et al., Science 257: 635-641, 1992; Joyce, Scientific American, 267: 90-97, 1992; Breaker et al., TIBTECH 12: 268, 1994; Bartel et al., Science 261: 1411-1418, Szostak, TIBS 17: 89-93, 1993; Kaufmann et al, patente de E.U.A. No. ,814,476; Kumar et al., FASEB J. , 9:1183, 1995; Breaker, Curr. Op. Biotech., 7:442, 1996; y Berzal -Herranz et al., Genes & Develop. 6:129, 1992), y ácido nucleicos que actúan como aptámeros, tales como el aptámero ATP, el aptámero Rev del VIH, el aptámero Tat VIH y otros efectores que incluyen oligonucleótidos (ver Ellington y Szostak, Nature 346:818-822, 1990; Famulok y Szostak, Angew. Chem. Int. Ed. Ebgl . 31: 979-988, 1992; Ellington, Current Biology, 4 (5) :427-429, 1990; Porta y Lizardi, Bio/Technology 13:161-164, 1995; Tang y Breaker, Chemistry Sc Biology, 4(6): 453-459, 1997; Tang y Breaker, RNA, 3: 914-925, 1997; Wertuck y Green, Science, 282: 296-298, 1998; Tang y Breaker, Nucleic Acids Research 26(18): 4214-4221, 1998; Soukup y Breaker, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96 : 3584-3589, 1999; y Robertson y Ellington, Nature Biotechnology 17: 62-66, 1999). Además de estos, se proporcionan descripciones adicionales de procesos de evolución in vitro en Innovir patente de E.U.A. No. 5,741,679 y patente de E.U.A. No. 5,834,186, WO 9843993 (PCT/US98/06231, Yale University) ; WO 9827104 (PCT/US97/24158, Yale University) y patente de E.U.A. No. 5,817,785 (NeXstar Phamaceuticals) . En una forma básica, el proceso puede involucrar las siguientes etapas . 1) una mezcla candidato de ácidos nucleicos de secuencias diferentes se prepara. La mezcla candidato incluye típicamente ácido nucleicos que tienen regiones de secuencias fijas (esto es, cada uno de los miembros de la mezcla candidato contiene las mismas secuencias en la misma ubicación) y regiones de secuencias aleatorias. Las regiones de secuencias fijas se pueden usar por una diversidad de razones incluyendo: (a) ayudar en las etapas de amplificación abajo descritas, (b) imitar una secuencia conocida por enlazarse al efector, o (c) incrementar la concentración de una configuración estructural dada de los ácidos nucleicos en la mezcla candidato. Las secuencias aleatorizadas se pueden aleatorizar totalmente (esto es, la probabilidad de encontrar una base en alguna posición es de 1 a 4) o solamente aleatorizarse parcialmente (por ejemplo, la probabilidad de encontrar un base en cualquier ubicación se puede seleccionar en cualquier nivel entre 0 y 100%) . 2) La mezcla candidato hace contacto con el efector seleccionado bajo condiciones favorables para una interacción entre el efector y los ácidos nucleicos de la mezcla objetivo. Bajo estas circunstancias la interacción entre el efector y los ácidos nucleicos, se puede considerar como formadora de pares efector-aptámero entre el efector y aquellos ácidos nucleicos que tienen la afinidad más fuerte para el efector. 3) Los ácidos nucleicos con la mayor afinidad para el efector se dividen de aquellos ácidos nucleicos con una afinidad inferior para el efector. Debido a que solamente un número extremadamente pequeño de moléculas diferentes (y posiblemente solamente una molécula) corresponde a la secuencia de ácido nucleico de mayor afinidad que existe en la mezcla candidato, puede ser deseable establecer los criterios de división de manera que se conserve durante la división una cantidad importante de los ácidos nucleicos en la mezcla candidato inicial (aproximadamente 5-50%) . 4) Aquellos ácidos nucleicos seleccionados durante la división como que tienen una afinidad relativamente superior al efector, se amplifican después para crear una nueva mezcla candidato que se enriquece con ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente superior para el efector. 5) Al repetir esta etapa de división y amplificación, la mezcla candidato nuevamente formada contiene secuencias particulares cada vez menores y menores, y el grado promedio de afinidad de los ácidos nucleicos al efector generalmente se incrementará. Con ciclos repetidos el proceso produce una mezcla candidato que contiene uno o más ácidos nucleicos únicos que representan aquellos ácidos nucleicos de la mezcla candidato original que tienen la afinidad más elevada al efector. No existe un número conocido establecido de bases requeridas para la interacción de un aptámero y un receptor. Se sabe que existen una diversidad de estructuras primarias, secundarias y terciarias de ácido nucleico. Las estructuras o porciones que han demostrado más comúnmente involucrarse en interacciones del tipo que no es Watson-Crick, se refieren como circuitos de horquilla, pandeos simétricos y asimétricos, pseudonodos y combinaciones innumerables de los mismos. La investigación sugiere que se pueden formar en una secuencia de ácido nucleico con menos de 30 nucleótidos. Por esta razón, se prefiere a menudo que los procedimientos de evolución in vitro con segmentos contiguos aleatorizados se inicien con secuencias de ácido nucleico que contienen un segmento aleatorizado de alrededor de 20 hasta alrededor 50 nucleótidos. Así, el aptámero contendrá típicamente desde alrededor de 20 hasta alrededor 50 nucleótidos, o más preferiblemente alrededor de 20 hasta alrededor 30 nucleótidos, desarrollado para enlazarse a un efector específico. El tamaño pequeño de la molécula es ventajoso para el suministro de célula, en comparación con los constructos de regulación de la expresión convencionales, que son mucho mayores en tamaño.

Se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que las técnicas de evolución in vitro se pueden usar para crear e identificar aptámeros separados que pueden después usarse como unidades modulares, con estructuras catalíticas para la construcción de una diversidad de módulos de control alostérico diferentes. Alternativamente, los módulos de control alostérico se pueden desarrollar como una unidad sencilla con regiones o dominios separados que incluyen un aptámero o un dominio de enlace del efector, un dominio catalítico, y en algunas modalidades dominios adicionales que incluyen pero no se limitan a, un dominio de reconocimiento del ARN objetivo y un dominio de substrato. También se apreciará que para cualquier aptámero dado, se pueden evaluar colecciones de efectores grandes combinatorias (por ejemplo, compuestos orgánicos, péptidos, moléculas pequeñas, etc.) producidas por síntesis química para el enlace de aptámero. Las colecciones de despliegue de fagos se pueden también separar por exclusión para la presencia de un efector para enlazarse a un aptámero selecto. Así, en otra modalidad de la presente invención, el aptámero se puede identificar y el efector seleccionarse a través de un proceso de separación.

Dominio catalítico El otro componente principal del módulo de control alostérico es el dominio catalítico. Como se describe arriba, se pueden también usar la evolución in vitro para desarrollar nuevos catalizadores de ácido nucleico capaces de catalizar una diversidad de reacciones, tales como desdoblamiento, unión y empalme. Además, el dominio catalítico es un constructo altamente específico, con la especificidad de la actividad dependiendo no solamente del mecanismo de apareamiento de la base de enlace, sino también en el mecanismo por el cual la molécula afecta la expresión del ARN al cual se enlaza. Por ejemplo, si la inhibición se provoca por el desdoblamiento del ARN objetivo, la especificidad se define como la relación de la tasa de desdoblamiento del ARN objetivo sobre la tasa de desdoblamiento del AR? no objetivo. Genes de interés La presente invención contempla en una modalidad, la disposición de un gen deseado que codifica una proteína que es defectuosa o que falta en el genoma de la célula objetivo en un paciente. La presente invención también contempla un método para el tratamiento de un paciente que padece de un estado de enfermedad, al proporcionarle al paciente células humanas preparadas por ingeniería genética para codificar una proteína requerida. Todavía otra modalidad es el suministro de un gen para corregir un defecto genético. En cada una de estas modalidades de la presente invención, el gen de interés se administra a la célula receptora con un módulo de control alostérico, que se ha diseñado para alterar la expresión de un gen en respuesta a la presencia o ausencia de un efector identificado . Los usos ejemplares de los constructos de la presente invención, incluyen terapia de genes para enfermedades hereditarias. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a: hipercolesterolemia familiar o hiperlipidemia del tipo II (receptor LDL) , deficiencia familiar por la lipoproteína lipasa o hiperlipidemia de tipo I (lipoproteína lipasa) , fenilcetonuria (fenilalanina hidroxilasa) , deficiencia en el ciclo de urea (ornitina transcarbamilasas) , enfermedad de von Gierke (por ejemplo, enfermedad de almacenamiento de glicógeno, tipo I; glucosa-6-fosfatasas) , deficiencia en la alfa-1 antitripsina (alfa-1 antitripsina) , fibrosis cística (regulador conductor de la transmembrana de la fibrosis cística) , enfermedad de von Willebrand y hemofilia A (Factor VIII) , hemofilia B (Factor IX) , anemia de células escasas en glóbulos rojos (beta globina) , beta talasemias (beta globina) , alfa talasemias (alfa globina) , esperocitosis hereditaria (espectrina) , deficiencia inmune severa combinada (adenosina desaminasa) , distrofia muscular de Duchenne (distrofin minigen) , síndrome de Lesch-Nyhan (hipoxantina guanina fosforibosil transferasa) , enfermedad de Gaucher (beta-glucocerebrosidasa) , enfermedad de Nieman-Pick (esfingomielinasa) , enfermedad de Tay-Sachs (hexosaminidasa lisosomal) , y enfermedad de la orina del jarabe de maple (deshidrogenasa de cetoácido de cadena ramificada) . Los transgenes adecuados para su uso en la presente invención incluyen además pero no se limitan a, -aquellos que codifican proteínas tales como: factor de crecimiento de los nervios (NGF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , neurotrofina 3 y 4/5 (NT-3 y 4/5) , factor neurotrófico derivado de las células glial (GDNF) , factores de crecimiento transformantes (TGF) , y factor de crecimientos de fibroblastos ácido y básico (aFGF y bFGF) ; secuencias que codifican la tirosina hidroxilasa (TH) y descarboxilasa de aminoácidos aromáticos (AADC) ; las secuencias que codifican la superóxido dismutasa (SOD 1 o 2) , catalasa y glutation peroxidasa; secuencias que codifican interferones, linfocinas, citocinas y antagonistas de las mismas tales como el factor de necrosis de tumor (TNF) , anticuerpos específicos CD4 y receptores TNF o CD4 ; secuencias que codifican las isoformas del receptor GABA, la enzima sintetizadora GABA de la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) , canales de potasio dependientes del calcio o canales del potasio sensibles al ATP; y secuencias que codifican a la timidina cinasa, angiostatina, dopamina, factores de coagulación de la sangre, eritropoyetina, factores estimuladores de las colonias G- , GM- y M-CSF, activadores del plasminógeno de tejidos, hormonas del crecimiento humano o animal, IGF-1, insulina, KGF, leptina, MGDF, resistencia múltiple a fármacos, osteoprotegerina, VEGF, VEGF-ra, alfa interferón, beta interferón, , interferón de consenso, IFN-gama, IL-12, IL-lra, IL-2, IL-4, y TNFpb. Otros genes de interés contemplados por la invención codifican patógenos para su uso como vacuna. Los genes ejemplares incluyen pero no se limitan a aquellos que codifican los puntos VIH-1 y VIH-2 (secuencias diferentes a las secuencias rev y gpl60) ; virus linfotrópicos T humanos tipo I y II; virus sincitial respiratorio; virus de parainfluenza tipos 1-4; virus del sarampión; virus de paperas; virus de rubéola; virus de la polio; virus de la influenza; virus de influenza no humana (de las aves, equina, porcina) ; virus de la hepatitis tipo A, B, C, D y E; rotavirus; virus Norwalk; citomegalovirus; virus Epstein-Barr; virus del herpes simplex tipos 1 y 2 ; virus de la varicela zoster; virus del herpes humano tipo 6; hantavirus; adenovirus; virus de la hepatitis; rabia, virus de la enfermedad de los pies y la boca, chlamydia pneumoniae; chlamydia trachomatis; micoplasma pneumoniae; tuberculosis por micobacteria; micobacterias atípicas; virus de la leucemia de los felinos; virus de inmunodeficiencia en los felinos; virus de inmunodeficiencia en bovinos; virus de anemia infecciosa en equinos; virus de encefalitis artritis de caprinos; virus visna; mononucleosis infecciosa; roseóla; neumonía y síndrome de tensión respiratoria en adultos; infecciones del tracto respiratorio superior e inferior; conjuntivitis; infecciones del tracto respiratorio superior e inferior; infecciones del tracto genital; y neumonía y encefalitis en ovejas. Los vectores de vacunas se pueden usar para generar inmunidad intracelular si el producto de gen es citoplásmico (por ejemplo, si el producto de gen evita la integración o replicación de un virus) . Alternativamente, se puede generar la inmunidad sistémica/extracelular si el producto de gen se expresa en la superficie de la célula o se secreta. Un huésped (especialmente un huésped humano) se puede inmunizar contra un polipéptido de un organismo que provoca enfermedad, al administrar a un huésped una cantidad inductora de la inmunidad de un vector de la presente invención que codifica al polipéptido. La inmunización de un huésped humano con un vector de la invención, involucra típicamente la administración por inoculación por una dosis inductora de la inmunidad del virus de la vía parenteral (por ejemplo, por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea) , por escarificación de la superficie o por inoculación en una cavidad corporal. Típicamente, una o varias inoculaciones de entre alrededor de 1000 y alrededor de 10,000,000 de unidades infecciosas cada una, como se miden en líneas celulares de primates humanos o no humanos susceptibles, son suficientes para efectuar la inmunización de un huésped humano. Los usos adicionales de los materiales y métodos descritos en la presente incluyen pero no se limitan a: 1. Incrementar la expresión de anticuerpos monoclonales por células de hibridoma, esto es, líneas celulares que resultan de la fusión de los linfocitos B con líneas de células de mieloma. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir al hacer crecer el hibridoma en cultivo de tejidos o in vivo. 2. Incrementar los productos derivados de plantas como se usan en fragancias y perfumes, compuestos saborizantes o edulcorantes, por ejemplo, la proteína básica de Thaumatococcus danielli, insecticidas, compuestos anti-fúngales o pesticidas; 3. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad en la bioextracción de metales tales como uranio, cobre, plata, manganeso, etc. Por ejemplo, como se lleva a cabo por el organismo de especie Thiobacillus, algas u hongos; 4. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad en la eliminación de nitrógeno o fosfato o materiales de desechos tóxicos del agua, por ejemplo, como se lleva a cabo por las especies Nitrobacter o Acinetobacter; 5. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, al estimular la producción de metano de desechos biológicos, típicamente de arqueobacterias de microorganismos metanogénicos ; 6. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad en la biodegradación de derrames de crudo marinos (por ejemplo, hidrocarburos alifáticos, alifáticos halogenados, aromáticos halogenados). En un ejemplo, la biodegradación se efectúa por la conversión de productos de petróleo a ácidos grasos emulsificados. Las bacterias útiles en esta invención incluyen pero no se limitan a Archromobacter, Arthrobacter, Flavobacterium, Nocardia, Pseudomonas (por ejemplo Pseudomonas olevorans) y Cytophaga. La levadura útil en esta invención incluye pero no se limita a Candida (por ejemplo, Candida tropicalis) , Rhodotorula, y Trichosporon; 7. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad en la biodegradación de lignina; 8. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad en la biotransformación de esteroides y esteróles, por ejemplo por las especies Rhizopus, Saccharomyces, Corynebacterium; D sorbitol a L sorbosa por Acetobacter suboxydans; mezclas racémicas; substratos proquirales; terpenoides; compuestos alicíclicos y heteroalicíclicos; antibióticos; estructuras heterocíclicas y aromáticas incluyendo esteres del ácido ftálico, lignosulfonatos, tensoactivos y colorantes; naftiridinas por la especie Penicillium; hidrocarburos aromáticos polinucleares; hidrocarburos alifáticos; aminoácidos y péptidos; glucosa a fructuosa; glucosa a ácido glucónico; rafinosa a sacarosa; y galactosa; lactosa; y sacarosa. 9. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad en la producción de enzimas comercialmente importantes a partir de microorganismos, por ejemplo, lactasa de Aspergillus oryzae, Escherichia coli, Bacillus stearothermophilus ,- 10. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en el crecimiento del Saccharomyces en molasas; el crecimiento de candida en licor de sulfito gastado; el crecimiento de levadura en n-alcanos superiores; el crecimiento de bacterias en n-alcanos superiores; el crecimiento de bacterias o levaduras en el metano o metanol . 11. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la asimilación de nitrógeno atmosférico mediante por ejemplo especies Azotobacteria, Rhizobium, o cianobacterias; 12. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de insecticidas de la especie Bacillus, por ejemplo Bacillus thuringiensis; 13. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de insecticidas de hongos entomógenos tales como Deuteromycetes, por ejemplo, Verticillium lecanii e Hirsutella thompsonii; 14. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de etanol a partir de materiales celulósicos, cosechas de almidón, caña de azúcar, forrajes o molasas, mediante por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe o especie Kluyveromyces; 15. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de ácido acético del etanol por la especie Acetobacter o Gluconobacter, la etapa limitante de la velocidad en la producción del ácido láctico por la familia de Lactobaciláceos, la etapa limitante de la velocidad en la producción de ácido cítrico por las especies candida o Aspergillus usando por ejemplo, molasas o almidón, la etapa limitante de la velocidad en la producción de ácido glucónico mediante por ejemplo especies de Pseudomonas, Gluconobacter, y Acetobacter, o la etapa limitante de la velocidad en la producción de aminoácidos por bacterias u hongos . 16. Incrementar la expresión de una enzima en una célula, la enzima cataliza la resolución de mezclas racémicas de aminoácidos; 17. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de polisacáridos extracelulares por ejemplo por especies Corynebacterium, Pseudomonas, o Erwinia tahitica. Otros ejemplos incluyen la producción de escleroglicano de los hongos Sclerotium, pullulan de Aureobasidium pullulans, curdlan de Alcaligeans faecalis, y dextranos de especies Streptobacterium o Streptocucus . Otros ejemplos incluyen polisacáridos aniónicos de Arthrobacter, alginatos bacterianos de Azotobacter vinelandii, y xantana de Xanthomonas campestris; 18. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de un compuesto antifungal (por ejemplo, Griseofulvin) y penicilinas de la especie Penicillium; 19. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de antibióticos por hongos, por ejemplo antibióticos de poliéter, cloranfenicol, ansamicinas, tetraciclinas, macrólidos, aminoglicósidos, clávanos, cefalosporinas, cefamicinas de la especie Streptomyces; 20. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de substancias antitumorales por ejemplo actinomicina D, antraciclinas y bleomicina de la especie Streptomyces; 21. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de ácidos nucleicos, nucleótidos y compuestos relacionados, por ejemplo 5' inosinato (IMP) , 5' guanilato (GMP) , cAMP por ejemplo Brevibacterium ammoniagenes; 22. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de vitaminas, por ejemplo, vitamina B12 por Pseudomonas denitrificans, Propionibacterium shermanii, o Rhodopseudomonas protamicus; 23. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de riboflavina por Ashbya gossypii o Bacillus subtilis . ; 24. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de ergosterol por levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae; 25. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de alcaloides de ergot por la especie Claviceps; 26. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de metabolitos secundarios útiles para usos terapéuticos selectos en medicina humana, por ejemplo ciclosporina de Trichoderma polysporum; 27. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de productos secundarios de cultivos de células de plantas, por ejemplo, derivados del ácido cinámico en Coleus blume y shikoninas de Lithospermum erythrophizon; 28. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de vino y cerveza por especie Saccharomyces; 29. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la producción de yogurt o queso por especie Staphylococcus, Lactobacillus y Propionibacterium; 30. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante de la velocidad, en la fermentación de cocoa de Theobroma cacao por hongos y bacterias; y 31. Incrementar la expresión de un polipéptido que se asocia con la etapa limitante, en la fermentación de granos de café de la especie Coffea por hongos y bacterias . El gen de interés, cuya expresión se asocia con un efecto fisiológico o patológico definido dentro de un organismo multicelular, también puede ser un gen de plantas. El gen de plantas puede codificar una característica agronómicamente importante. Ejemplos de las características agronómicamente importantes pueden incluir pero no se limitan a, germinación, formación de retoños, floración, maduración de frutas, tolerancia a la sal, resistencia a herbicidas, resistencia a pesticidas, resistencia a fungicidas, resistencia a la temperatura y crecimiento . Adicionalmente, en la práctica de la invención el gen de interés puede ser un gen de protozoarios. Los ejemplos de protozoarios pueden incluir pero no se limitan a una selección del grupo que consiste de Tripanosoma, Plasmodium, Leishmania, Giardia, Entamoeba, Toxoplasma, Babesia, y Cryptosporidiosis . Además, el gen de interés cuya expresión se asocia con un efecto fisiológico o patológico definido dentro de un organismo multicelular, puede ser un gen helmíntico. Claramente, la presente invención tiene aplicaciones comerciales en el caso donde el polipéptido mismo es comercial o terapéuticamente importante, y en el caso en donde la expresión del polipéptido media la producción en una molécula que es comercial o terapéuticamente importante . Un uso adicional de los módulos de control alostéricos de la presente invención, es en la creación de animales transgénicos y agénicos condicionales. En los agénicos condicionales, el producto del gen objetivo se expresa normalmente en el animal genéticamente alterado, y la expresión se inhibe solamente en presencia de un efector. Al aplicar los efectores aquí descritos y los módulos de control alostéricos desarrollados por los métodos aguí descritos para agénicos condicionales, se desea desarrollar ARN alostéricos de auto-desdoblamiento, que se activen por un efector de molécula pequeña identificado por los métodos de la invención. En este caso, un constructo de ADN se crea que codifica el producto del gen de interés que se ha alterado para colocar un módulo de control alostérico activable de auto-desdoblamiento, que comprende un dominio catalítico en una modalidad preferida, una ribozima, en un intrón o región no traducida del gen. La elección del sitio de inserción se hace a través de investigación empírica, de forma que el producto de gen se expresa a niveles normales o casi normales en ausencia del efector, pero se inhibe completamente o casi completamente en presencia del efector. Así, la inserción de un módulo de control alostérico de la presente invención en lugar del gen nativo a través de métodos de recombinación genética específicos del sitio en células madre embriónicas (ES) y la microinyección posterior de las células ES alteradas en blastocistos, permite la creación de un organismo alterado, que expresa normalmente o casi normalmente al gen de interés durante el desarrollo de un organismo alterado genéticamente. Esto permite que el producto de gen esté presente durante el desarrollo, eliminando así problemas de letalidad embriónica o compensación del desarrollo. Posteriormente, se pueden tratar animales adultos con la molécula efectora que activa el dominio catalítico que actúa en cis, resultando en la degradación del ARN que codifica el producto de gen objetivo. Alternativamente, se puede desarrollar un intrón de auto-empalme que se inhibe, que se procesa por sí mismo normalmente en ausencia del efector. En presencia del efector, la actividad del intrón de auto-empalme se inhibiría y el intrón permanecería en el ARNm que resulta en la inhibición de la expresión del gen. En cualquier caso de activación o inhibición, la evaluación directa de los efectos biológicos de inhibir la expresión del producto del gen objetivo en el animal adulto se alcanza. En el caso de la sobreexpresión del transgen, se desea evolucionar una ribozima auto-desdoblable que se inhibe que actúa en cis, o intrón de auto-empalme activable en una forma muy similar a aquella descrita para la aplicación de RMST en un enfoque de terapia de genes para aplicaciones terapéuticas humanas. En esta aplicación en particular, la inserción del producto de gen alterado que contiene el módulo de control alostéricp auto-desdoblable que inhibe la acción en cis, o el intrón de auto empalme que se activa, se puede llevar a cabo a través de métodos estándar empleados para la creación de animales transgénicos. Swanson et al., Annu. Rep. Med. Chem., 29:265-274, 1994; Polites, Int. J. Exp. Pathol., 77 (6) :257-262, 1996. Alternativamente, el constructo de gen alterado se puede introducir a animales adultos por medio de métodos de transferencia de ADN viral o desnudo, afines con aquellos contemplados para aplicaciones de terapias de genes. En cualquier caso, la sobreexpresión del gen de interés, se inhibiría normalmente debido a la inserción de los módulos de control alostéricos deseados como se describen en la presente. La dosificación posterior del animal con el efector, resultaría entonces en la sobreexpresión del producto de gen para la evaluación de los resultados funcionales. La terapia de células o terapia de genes ex vivo, por ejemplo, implantación de células que contienen los constructos de AD? de la presente invención también se contempla. Esta modalidad involucraría implantar células que contienen los constructos de ADN, por lo cual se regula entonces la expresión del gen de interés. Con objeto de minimizar una reacción inmunológica potencial, se prefiere que las células sean de origen humano y produzcan un gen humano de interés. Se vislumbra sin embargo, que los vectores se pueden usar para modificar células donadoras heterólogas y células genogénicas, así como células autólogas para el suministro o implante. En algunos casos, los vectores se pueden suministrar a través del implante en los pacientes de ciertas células que se han preparado por ingeniería genética, usando métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar los polipéptidos, fragmentos, variantes o derivados. Tales células pueden ser células animales o humanas, y se pueden derivar del tejido propio del paciente (autólogas) o de otra fuente, ya sea humana (alogénica) o no humanas (genogénicas) . Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Con objeto de disminuir además la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células se pueden encapsular para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles, alojamientos o membranas poliméricas semipermeables que permiten la liberación del producto de proteína, pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes. Las técnicas para la encapsulación de células vivas se conocen en la técnica, y la preparación de células encapsuladas y su implante en pacientes se puede efectuar sin experimentación indebida. Por ejemplo, Baetge et al., (WO 9505452; PCT/US94/09299) describe cápsulas de membrana que contienen células preparadas por ingeniería genética, para el suministro efectivo de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son fácilmente recuperables. Las cápsulas encapsulan células transfectadas con moléculas recombinantes de ADN, que comprenden secuencias de ADN que codifican moléculas biológicamente activas, ligadas operativamente a promotores que no están sujetos a la subregulación in vivo con el implante en un huésped mamífero. Los dispositivos proporcionan el suministro de moléculas de células vivas a ciclos específicos dentro de un receptor. Además, ver las patentes de E.U.A números 4,892,538, 5,011,472, y 5,106,627. Un sistema para la encapsulación de células vivas se describe en la solicitud PCT de WO 9110425 de Aebischer et al., también ver la solicitud PCT WO 9110470 de Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol. 113:322-329, 1991, Aebischer et al., Exper. Neurol. 111:269-275, 1991; y Tresco et al., ASAIO 38:17-23, 1992. Promotor Aquellos expertos en la técnica apreciarán que también puede ser benéfico proporcionar un promotor dentro del gen de interés, así como una o más secuencias de control operativo adicionales. La elección del promotor u otras secuencias de control operativas sin embargo, no es limitante de la selección de efectores, la evolución de aptámeros o la construcción y uso de módulos de control alostéricos de la presente invención. Las regiones del promotor varían en longitud y secuencia, y pueden además abarcar uno o más sitios de enlace de ADN para las proteínas de enlace de ADN específicas de la secuencia, y/o un aumentador o silenciador. La presente invención puede emplear por ejemplo, un promotor CMV o un promotor P5. Tales promotores así como mutaciones de los mismos, son bien conocidos y se han descrito en la técnica (ver por ejemplo, Hennighausen et al., EMBO J. 5:1367-1371, 1986 Lehner et al., J. Clin. Microbiol. 29:2494-2502, 1991 Lang et al., Nucleic Acids Res. 20:3287-95, 1992 Srivastava et al., J. Virol. 45:555-564, 1983; y Green et al., J. Virol. 36:79-92, 1980). Otros promotores sin embargo se pueden también emplear tales como el promotor tardío principal Ad2 o Ad5 y el líder tripartita, la repetición en la terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV) y otros promotores constitutivos como se han descrito en la literatura. Por ejemplo, el promotor del herpes de la timidina cinasa (Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 78:144-145, 1981), las secuencias regulatorias del gen de la metalotionina (Brinster et al., Nature , 296:39-42, 1982) elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor de la alcohol deshidrogenasa, el promotor de la fosfoglicerol cinasa, y el promotor de la fosfatasa alcalina se pueden emplear. Similarmente, se pueden usar los promotores aislados del genoma de células de mamífero o de virus que crecen en estas células (por ejemplo, Ad, SV40, CMV, y similares) . Suministro Los constructos de ADN aquí descritos se pueden incorporar en una diversidad de vectores para su introducción en la célula. Los vectores adecuados incluyen pero no se limitan a ADN desnudo, vectores de ADN de plásmido, vectores de ADN viral (tal como adenovirus o vectores de virus asociados con adeno) , vectores de ARN viral (tal como vectores retrovirales o del alfa virus) (para una revisión ver Couture and Stinchcomb, 1996, supra) y vectores no virales (tales como el ADN que forma complejos con lípidos catiónicos o se empaca con liposomas) . Se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que un vector de expresión también incluirá a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; y c) secuencias de control de la expresión. También se apreciará que los constructos de ADN y los vectores se pueden producir al unir componentes producidos separadamente. Por ejemplo, el promotor, aptámero y el catalizador y el dominio catalítico, se puede fabricar separadamente por síntesis o tecnología recombinante de ADN/ARN y después unirse. Los vectores que contienen los constructos de ADN de la presente invención, se pueden administrar a células por una diversidad de métodos de administración de plásmidos y no virales, conocidos por aquellos familiares con la técnica incluyendo pero no limitado a transferencia mediada por liposomas o lipofección, por la incorporación dentro de otros vehículos de suministro, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas, administración de ADN desnudo (inyección directa o absorción directa) , transferencia mediada por el receptor (complejo ligando-ADN) , electroporación, transformación mediada por el fosfato de calcio, microinyección, choque osmótico, bombardeo de micropartículas (por ejemplo pistola de genes), materiales de biomicroplaquetas y combinaciones de los anteriores. Los materiales y métodos de administración pueden también involucrar el uso de componentes incluyendo pero no limitado a promotores de la inducción, promotores aumentadores específicos del tejido, secuencias de ADN diseñadas para la integración específica al sitio, secuencias de AD? capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula precursora, etiquetas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa (medidas de seguridad) , agentes de enlace específicos de la célula (para direccionamiento de células) , factores de interiorización específicos de las células, factores de transcripción para aumentar la expresión por un vector así como métodos de manufactura del vector. Tales métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia de genes, se describen en la patente de E.U.A número 4,970,154 técnicas de electroporación; ligandos nucleares WO 9640958; patente E.U.A número 5,679,559 que se refiere a un sistema que contiene lipoproteínas para la administración de genes; patente E.U.A número 5,676,954 que involucra portadores de liposomas; patente de E.U.A número 5,593,875 que se refiere a métodos para la transfección del fosfato de calcio y patente E.U.A número 4,945,050 en donde las partículas biológicamente activas son impulsadas a células a una velocidad por lo cual las partículas penetran la superficie de las células y se incorporan en el interior de las células. Un uso típico de los constructos de la presente invención, involucra la transferencia de un vector a una célula receptora. La célula receptora o célula huésped, es típicamente una célula procariótica en técnicas de producción de proteínas y es preferiblemente una célula eucariótica en técnicas de terapia de genes. La célula huésped eucariótica se puede modificar in vitro o in vivo. De conformidad con la invención, al "hacer contacto" de las células con los vectores de la presente invención, puede ser por cualquier medio por el cual los vectores se introduzcan en las células. En una modalidad preferida los vectores virales se introducirán por infección usando la capacidad natural del virus para entrar a las células (por ejemplo, la capacidad del adenovirus para entrar a la células por medio de endocitosis mediada por el receptor) . Los vectores plásmidos y virales sin embargo se pueden introducir por cualquier medio adecuado. Los vectores virales adecuados incluyen pero no se limitan a retrovirus, adenovirus, virus del herpes simplex, lentivirus, virus de la hepatitis, parvovirus papovavirus, virus de la viruela, alfavirus, coronavirus, rabdovirus, paramixovirus y vectores del virus del papiloma. La patente de E.U.A número 5,672,344 describe un sistema de transferencia de genes mediado viral in vivo que involucra un vector neurotrófico recombinante HSV-1. La patente de E.U.A número 5,399,346 proporciona ejemplos de un proceso para proporcionar a un paciente una proteína terapéutica para el suministro de células humanas que se han tratado in vitro para insertar un segmento de ADN que codifica una proteína terapéutica. Los métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia de genes se describen en la patente de E.U.A número 5,631,236 que involucra vectores adenovirales; patente E.U.A número 5,672,510 que involucra vectores retrovirales y patente E.U.A número 5,635,399 que involucra a vectores retrovirales que expresan citocinas . Preferiblemente, los vectores persisten en las células a las cuales se suministran. Alternativamente, algunos vectores se pueden usar para que proporcionen la expresión transitoria de los constructos de ADN. Tales vectores se pueden administrar repetidamente como sea necesario. Composiciones y Administración Las células huésped se pueden transforman con los vectores de la presente invención ya sea in vivo o in vitro. Si es in vitro, el tipo de célula objetivo deseado se puede separar del sujeto, modificarse recombinantemente por suministro del vector y reintroducirse al sujeto. Las células modificadas se pueden separar por exclusión de aquellas células que alojan al gen de interés, usando técnicas convencionales tales como manchado Southern o PCR. Tales células modificadas se pueden transplantar directamente en el sujeto o se pueden colocar en un dispositivo que se implante en el sujeto. También se vislumbra que las células modificadas ex vivo puedan incluir líneas de células humanas para el implante directo o indirecto. Si se suministran in vivo, el vector se puede formular en una composición farmacéutica. El vector se puede administrar parenteralmente, por ejemplo por inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratecal o subcutánea. Las formulaciones adicionales de vector adecuadas para otros modos de administración incluyen oral (incluyendo sublingual y bucal) y pulmonar (intranasal e inhalación) , formulaciones, formulaciones transdérmicas y tópicas y supositorios. El suministro puede involucrar un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiple. Por ejemplo, la inyección intramuscular de un vector de la presente invención, tales como partículas rAAV que contienen el constructo de ADN, pueden proporcionar la transducción eficiente de fibras de músculo postmitóticas y la expresión prolongada del transgen. De conformidad con la invención, esto se logra sin una inflamación importante o activación de la inmunidad al producto del transgen. El músculo también está particularmente bien adecuado para la producción de una proteína terapéutica secretada, tal como el factor IX o la apolipoproteína (Apo) entre otros genes de interés .

Cuando se administran por inyección, se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que los vectores de la presente invención se suspenden típicamente en una solución biológicamente compatible, o un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Uno de tales vehículos adecuados y comunes es la solución salina estéril . Otras soluciones de inyección estéril isotónica acuosas y no acuosas, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, se pueden también emplear y son bien conocidas como portadores farmacéuticamente aceptables en la técnica. En una modalidad de la presente invención, los vectores contienen un gen que codifica una proteína terapéutica. Los vectores se administran en cantidades suficientes para proporcionar niveles suficientes de la expresión de la proteína seleccionada de manera que se puede obtener un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos y con efectos fisiológicos médicamente aceptables que se pueden determinar por aquellos expertos en las artes médicas. Las dosis del vector, dependerán principalmente de factores tales como la condición a tratarse, el transgen seleccionado, la edad, peso y salud del paciente y así puede variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente efectiva del vector de la presente invención, puede estar en el rango desde alrededor de 1 hasta alrededor de 50 ml de solución salina que contiene concentraciones desde alrededor de 1 x 108 a 1 x 1011 partículas/ml de viriones rAAV que contienen los constructos de ADN de la presente invención. Una dosis humana más preferida puede ser alrededor de 1-20 ml solución salina a las concentraciones anteriores. Los niveles de expresión del gen seleccionado se pueden observar para determinar la selección, ajuste o frecuencia de administración. La administración del vector puede después repetirse como se necesite. Cuando se practica in vivo, cualesquiera órganos o tej idos adecuados o células componentes se pueden dirigir para suministro de vectores. Preferiblemente, los órganos/tejidos/células empleados son del sistema circulatorio (esto es, corazón, vasos sanguíneos o sangre) , sistema respiratorio (esto es, nariz, faringe, laringe, tráquea, bronquios, bronquíolos, pulmones), sistema gastrointestinal (esto es, boca, faringe, esófago, estómago, intestinos, glándulas salivales, páncreas, hígado y vesícula biliar) , sistema urinario (esto es, ríñones, uréteres, vejiga urinaria, uretra), sistema nervioso (esto es, médula espinal y cerebro, y órganos especiales de los sentidos tales como el ojo) , y sistema integumentario (esto es la piel) . Aún más preferiblemente las células que se atacan se seleccionan del grupo que consiste de células del corazón, vasos sanguíneo, pulmón, hígado, vesícula biliar, vejiga urinaria y ojos. De esta manera, la presente invención también proporciona un método de obtención de una expresión de un gen estable en un huésped, o la modulación de la expresión del gen en un huésped, que comprende administrar los vectores de la presente invención usando cualquiera de las formulaciones antes mencionadas y vías de administración, o vías alternas conocidas por aquellos expertos en la técnica, y adecuadas para una aplicación en particular. La "cantidad efectiva" de un vector o de una composición farmacéutica es tal que produce el efecto deseado en un huésped que se puede observar usando diversos puntos finales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la transferencia efectiva de ácidos nucleicos a la célula huésped, se puede monitorear en términos del efecto terapéutico (por ejemplo, el alivio de algún síntoma asociado con la enfermedad o síndrome a tratarse) , o por una evidencia adicional del gen transferido o secuencia de codificación o su expresión dentro del huésped (por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa, hibridaciones Northern y Southern, ensayos de transcripción para detectar ensayos de transcripción para detectar el ácido nucleico en ^células huésped, o usando un análisis de inmunocoagulación, detección mediada por anticuerpos, o ensayos particularizados para detectar proteínas o polipéptidos codificados por el ácido nucleico transferido, o impactado en el nivel o función debido a tal transferencia) . Uno de tales ensayos particularizados incluye un ensayo para la expresión de un gen reportero o marcador . Aunque se apreciará que los constructos de la presente invención se pueden usar por cualquier sistema vector, un sistema preferido que involucra el uso de las partículas rAAV se describe como un sistema ejemplar para las siguientes descripciones de las composiciones farmacéuticas. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un producto de partícula rAAV en mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable tal como un portador farmacéuticamente aceptable. Un material portador ejemplar puede ser agua para inyección, preferiblemente complementada con otros materiales comunes en soluciones para administración a mamíferos. Típicamente, un compuesto terapéutico de partícula rAAV, se administrará en forma de una composición que comprende partículas en conjunto con uno o más agentes fisiológicamente aceptables. La solución salina amortiguada central, o la solución salina mezclada con albúmina de suero, son portadores apropiados ejemplares. Otros agentes estándar farmacéuticamente aceptables se pueden incluir como se desee. Por ejemplo, otras composiciones pueden comprender una solución amortiguadora o conservadora. Las composiciones farmacéuticas de partículas rAAV, incluyen típicamente una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de partículas rAAV en mezcla con uno o más agentes de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables, seleccionados por su conveniencia con el modo de administración. Los materiales de formulación adecuados o los agentes farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a antioxidantes, conservadores, agentes de dilución, agentes de suspensión, solventes, rellenos, agentes de volumen, soluciones amortiguadoras, vehículos de entrega y diluyentes. Por ejemplo, un vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica, o fluido cerebro espinal artificial, complementado posiblemente con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. La solución salina amortiguada neutral o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" como se usa en la presente, se refiere a un agente de formulación adecuado para llevar a cabo o aumentar el suministro de las partículas rAW como una composición farmacéutica. El solvente primario en una composición puede ser acuoso o no acuoso en naturaleza. Además, el vehículo puede contener otros materiales de formulación para modificar o mantener el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, tasa de disolución, u olor de la formulación. Similarmente, la composición puede contener materiales adicionales de formulación para modificar o mantener la velocidad de la liberación de las partículas rAW o para promover la absorción o penetración de las partículas rAW. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones terapéuticas para su uso en la invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones farmacéuticamente aceptables, con debida referencia al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está dentro de la experiencia de la técnica. Las formulaciones terapéuticas de composiciones de partículas rAW útiles para la práctica de la presente invención, se pueden preparar para el almacenamiento por mezclado de la composición selecta que tiene el grado deseado de pureza con estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18*. Edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990) . Los estabilizadores aceptables son preferiblemente no tóxicos a los receptores, y son preferiblemente inertes en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen preferiblemente soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; los antioxidantes tales como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como Tween, pluronics o polietilenglicol (PEG) . La formulación farmacéutica óptima, se determinará por alguien experto en la técnica, dependiendo de la vía pretendida de administración, formato de suministro y dosis deseada. Ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Mack Publishing Co . , Easton, PA 18042 paginas 1435-1712, 1990) .

Una cantidad efectiva de una composición de partículas rAW para emplearse terapéuticamente dependerá por ejemplo, de los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la cual se va usar el gen suministrado por la partícula rAW, la vía de administración y la condición del paciente. De esta manera, puede ser necesario para el terapista titular la dosis y modificar la vía de administración como se requiera para obtener el efecto óptimo terapéutico. Típicamente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosis del transgen que logre el efecto deseado. La composición puede por lo tanto administrarse como una dosis simple, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de partículas rAAV) durante el tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implante o un catéter. En la medida en que se lleven a cabo más estudios, aparecerá información referente a los niveles de dosis adecuados para el tratamiento de diversas condiciones en diversos pacientes, y el trabajador experto ordinario, considerando el contexto terapéutico, el tipo de trastorno bajo tratamiento, la edad y salud general del receptor, podrá determinar la dosificación adecuada. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral, es agua destilada estéril, en la cual la composición de la partícula rAW se formula como una solución isotónica, estéril adecuadamente conservada. Todavía otra preparación puede involucrar la formulación de partículas rAW con un agente, tales como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables o perlas, o liposomas, que proporcionan la liberación sostenida o controlada del producto, que se puede después suministrar como una inyección de deposito. Las preparaciones de la presente invención pueden incluir otros componentes, por ejemplo, conservadores parenteralmente aceptables, agentes de tonicidad, cosolventes, agentes humectantes, agentes formadores de complejos, agentes amortiguadores, antimicrobianos, antioxidantes, y tensoactivos como son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los agentes aumentadores de la tonicidad adecuados incluyen haluros de metal alcalino (preferiblemente cloruro de sodio o potasio), manitol, sorbitol y similares. Los conservadores adecuados incluyen pero no se limitan a cloruro de benzalconio, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparaben, propilparaben, clorhexidina, ácido sórbico y similares. También se puede usar el peróxido de hidrógeno como conservador. Los cosolventes adecuados son por ejemplo glicerina, propilenglicol y polietilenglicol. Los agentes formadores de complejos adecuados son por ejemplo cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil -beta-ciclodextrina. Los tensoactivos o agentes humectantes adecuados, incluyen esteres de sorbitan, polisorbatos tales como el polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal y similares. Las soluciones amortiguadoras pueden ser soluciones amortiguadoras convencionales tales como borato, citrato, fosfato, bicarbonato, o Tris-HCl. Los componentes de la formulación, están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, las soluciones amortiguadoras se usan para mantener la composición a un pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un rango de pH desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8. Una composición farmacéutica se puede formular para inhalación, por ejemplo, las partículas rAW se pueden formular como un polvo seco para inhalación. Alternativamente, las soluciones de inhalación de partículas rAW, se pueden formular en un propelente licuado para suministro en aerosol. Todavía en otra formulación, las soluciones se pueden nebulizar. Las formulaciones adicionales de partículas rAW serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que involucran partículas rAW en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos.

Las técnicas para formular una diversidad de otros medios de suministro sostenido o controlado, tal como portadores de liposomas, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Independiente de la forma de administración, la dosis específica se puede calcular por el suministro de un gen que produce un efecto terapéutico de conformidad con el peso corporal, área superficial del cuerpo o tamaño del órgano. Una afinación adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis adecuada para tratamiento, que involucra cada una de las formulaciones antes mencionadas se hace rutinariamente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas llevadas a cabo rutinariamente por ellos. Las dosis adecuadas se pueden determinar a través del uso de datos adecuados de respuesta de dosis. La vía de administración de la composición está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo inhalación inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o por sistemas de liberación sostenida que pueden involucrar opcionalmente el uso de un catéter.

A este respecto, la célula a transformarse dependerá del propósito de la transferencia de genes, por ejemplo, el estado de enfermedad a tratarse. Por ejemplo, la partícula rAAV se puede usar para suministrar secuencias selectas de nucleótidos dentro de cualquier célula nucleada incluyendo células madre, progenitoras y eritroides, así como cualquiera de las diversas células de glóbulos blancos tales como linfocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos; células específicas de tejido tales como aquellas derivadas del pulmón corazón, riñon, hígado, bazo, tejido pancreático, tejido conectivo, tejido del hueso, incluyendo osteocitos, gangliocitos, células epiteliales, y endoteliales, células ependimales, células retículo endoteliales, células neurales y dendríticas, músculo esquelético, músculo cardiaco y células del músculo liso y similares. Se vislumbra además que los constructos de la presente invención son útiles en el suministro de un gen de interés a células de tumor y a células infectadas con patógenos. Se ha reportado que el AAV infecta todas las líneas celulares establecidas hasta ahora examinadas . Se apreciará también que los mismos cálculos de dosis y las consideraciones de las vías de administración y las formulaciones farmacéuticas, son aplicables al efector usado para afectar la expresión del gen de interés.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitativos, ilustran además la identificación y métodos de selección, así como la síntesis y uso de constructos ejemplares de la presente invención. Aquellos de experiencia ordinaria, reconocerán que estos son ejemplos no limitativos, y que la presente invención describe un medio para proporcionar un amplio arreglo de otros efectores, módulos de control alostéricos y controles que se pueden usar como se describen en la presente para la regulación de la expresión de genes. Ejemplo 1 Identificación del efector Un método para identificar un efector para su uso en la evolución de los aptámeros y la alteración de la expresión de genes, involucra las siguientes etapas. La primera etapa es la selección de un conjunto de características deseadas para un efector, en donde las características deseadas incluyen una o más de las siguientes . a) al menos 1% de biodisponibilidad; b) biodistribución para el tejido que contiene un módulo de control alostérico; c) la capacidad de pasar al núcleo de la célula; d) no hay interacciones con fármacos o interacciones manejables con fármacos; e) no hay toxicidad o toxicidad aceptable en el rango de dosis usado; f) no hay efectos laterales o efectos laterales aceptables al rango de dosis usado; g) no hay efecto farmacológico en el rango de dosis usado al regular la expresión de transgenes o un efecto farmacológico despreciables; y h) propiedades físicas adecuadas para la evolución in vitro de un aptámero. Las características seleccionadas indican que el efector es adecuado para la generación del aptámero, consumo humano y uso con un módulo de control alostérico para la alteración de la expresión de genes. Segundo, una o más bases de datos que contienen información de las características del efector seleccionado, se acceden para evaluar estos atributos y se identifica un conjunto de efectores que tienen las características selectas. Los efectores se pueden después usar para generar aptámeros por medio de la evolución in vitro. Las propiedades físicas ayudarán además en la identificación de un efector adecuado para la evolución in vitro del aptámero, incluyendo pero no se limitan a los siguientes atributos . • Complejidad del grupo funcional y estructural suficiente para proporcionar sitios interactivos para la identificación de aptámeros de alta afinidad, preferiblemente las moléculas serán entidades planas, rígidas . • Solubilidad en una solución acuosa a un nivel que permite técnicas de evolución molecular para efectuarse . • Carga apropiada, esto es, carencia de un número excesivo de grupos ionizables que conduciría a interacciones desfavorables con los ligandos de ácido nucleico. Así, no se favorecen las moléculas lipofílicas altamente flexibles. Para los propósitos de la presente invención, las interacciones manejables fármaco-fármaco son interacciones que se pueden evitar al evitar el uso concomitante de los fármacos o reducirse a través de una combinación del monitoreo y ajuste de dosis. Para los propósitos de la presente invención, la toxicidad aceptable en el rango de dosis usado incluye el uso de un efector en una dosis que no es tóxica o que tiene una toxicidad reversible o es aceptable en vista del tratamiento _ deseado. Para los propósitos de la presente invención, los efectos laterales aceptables en el rango de dosis usado incluyen efectos laterales que abaten o terminan con el uso continuo y aquellos que se manejan por otros medios (por ejemplo, evitados o suprimidos por el uso de otros fármacos, dieta, etc. ) Con el uso de bases de datos, tales como aquellas antes descritas, se identificaron las siguientes moléculas para evaluación como efectores especiales: Estructura; Estructura : Nombre (s): Fandofloxacin, DW-116 HCl Estructura: Estado de desarrollo,- Dong Wa, fase II completa, desarrollo en marcha Criterio : Biodisponibilidad: Absorbido oralmente Biodistribución: Buena distribución en los órganos incluyendo el músculo Localización intracelular: Intracelular, intrabacteriana Toxicidad/interacciones con Bien tolerado, baja fármacos : fototoxicidad Otra actividad Anti-infeccioso, antifarmacológica : microbiano Funcionalidad para el Básico, hidrofóbico aptámero : Síntesis/escalamiento : Suficiente para la fase II en Europa y Corea Descripción adicional : U.S. 5,496,947 Nombre (s) : C02H Estructura: Estado de desarrollo: Bayer, fase II 1993, patente sobre el más potente Criterios análogos : Biodisponibilidad: Absorbido oralmente (Tmax 1.3 Hrs, vida media 11.4 Hrs Localización intracelular: Intracelular, intrabacteriana Toxicidad/interacciones con No hay hallazgos anormales fármacos : en humanos Otra actividad Antiinfeccioso, farmacológica : antimicrobiano Funcionalidad para el Básica hidrofóbica aptámero : Síntesis/escalamiento : Suministrado en la fase II Descripción adicional: EP 520240 Estructura Actualmente los efectos preferidos incluyen los inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos. Estos compuestos tienen una buena biodisponibilidad oral, no son tóxicos y no tienen una actividad conocida diferente contra el objetivo viral. Ejemplo 2 Evolución in vitro Una estrategia ejemplar de evolución in vitro se describe como sigue. Un acumulado al azar de ácidos nucleicos se sintetiza en donde cada miembro contiene dos porciones: a) una porción consiste de una región con una secuencia definida (conocida) de nucleótidos; b) la segunda porción consiste de una región con una secuencia degenerada (aleatoria) . Las secuencias conocidas de nucleótidos pueden proporcionar diversas ventajas/usos. Por ejemplo, una cierta secuencia de nucleótido se puede conocer o esperar que se enlace a un efector dado. Alternativamente, la secuencia conocida puede facilitar o proporcionar la síntesis complementaria de ADN (cAD?) y la amplificación por PCR de moléculas seleccionadas para su enlace del efector. Todavía en otro aspecto, las secuencias se pueden usar para introducir un sitio de una endonucleasa de restricción para el propósito de la clonación. La secuencia aleatoria se puede crear para ser completamente aleatoria (cada uno de los cuatro nucleótidos representados en cada posición dentro de la región aleatoria) o la degeneración puede ser parcial (Beaudry y Joyce, 1992 supra) e involucrar el uso del diseño racional . La variación de la secuencia en los ácidos nucleicos de pruebas, se puede introducir o incrementar por mutagénesis antes o durante las iteraciones de selección/amplificación. Esta colección aleatoria de ácidos nucleicos, se incuba bajo condiciones que aseguran el pliegue de los ácidos nucleicos, en conformaciones que facilitan la actividad deseada (por ejemplo, enlace del efector y catálisis) . Después de la incubación, los ácidos nucleicos se convierten en el ADN complementario (si el acumulado de partida de los ácidos nucleicos es ARN) . Los ácidos nucleicos con la característica deseada, se pueden separar o dividir del resto de la población de ácidos nucleicos por una diversidad de métodos. Por ejemplo, un ensayo de enlace de filtro se puede usar para separar la fracción que enlaza al efector deseado de aquellas que no lo hacen. La fracción de la población que se enlaza por el efector (por ejemplo) puede ser la población que se desee (acumulado activo) . Típicamente, el enlace del efector y del ARN se evalúa al aplicar el acumulado o mezcla de ARN a una matriz de afinidad que contiene el efector con el cual el aptámero se enlazará o reaccionaraá específicamente. Las especies que no se enlazan al ARN se separan o se lavan completamente y las especies de enlace específicas se eluyen del efector para un uso posterior en el proceso de evolución. Se puede introducir una nueva pieza de ADN (que contiene nuevos sitios de enlace del cebador oligonucleótido para PCR y sitios de restricción para clonación) a los términos de las moléculas en el acumulado activo (para reducir las posibilidades de contaminación de los ciclos previos de selección) para facilitar la amplificación por PCR y los ciclos posteriores (si es necesario) de evolución. La amplificación se lleva a cabo preferiblemente por medio de transcripción inversa de las especies eluidas en el AD?, seguida por una reacción en cadena de la polimerasa. El resultado del proceso de amplificación es la producción de un gran número de moléculas seleccionadas de AD? que codifican el AR?. El acumulado final de ácidos nucleicos con la característica deseada (esto es aptámeros que se enlazan al efector) se puede clonar en un vector plásmido y transformarse en huéspedes bacterianos. Los plásmidos recombinantes se pueden después aislar de las bacterias transformadas, y se puede determinar la identidad de los clones usando técnicas de formación de secuencias de ADN. Múltiples ciclos de selección y amplificación resultan en el aumento selectivo de especies de ARN que enlazan al efector herméticamente y efectivamente. Los ciclos de selección y amplificación se repiten hasta que se alcanza un punto deseado. Con las técnicas y materiales actuales, los ciclos se repiten típicamente cinco o más veces. En el caso más general, las etapas en evolución de selección y amplificación pueden continuarse hasta que no se realiza una mejora significante en la resistencia de enlace de ARN al efector durante la repetición de un ciclo. En algunos casos, sin embargo, no necesariamente es deseable repetir las etapas iterativas de la evolución in vitro hasta que se identifica un AR? sencillo. El AR? acumulado puede incluir una familia de estructuras o porciones de ácido nucleico que tienen un número de secuencias conservadas y un número de secuencias que pueden substituirse o agregarse sin efectuar significativamente la afinidad de las moléculas de ácido nucleico al efector. Terminando el proceso antes de la identificación de un aptámero sencillo, es posible determinar la secuencia de un número de AR? apropiados.

Para mejorar además la especificidad, también puede usarse un proceso de selección negativo. Un procedimiento de selección negativo puede emplearse antes, durante o después del proceso de evolución in vitro. La selección negativa proporciona la capacidad para discriminar entre efectores cercanamente relacionados pero diferentes. De esta manera, la selección negativa puede introducirse para identificar aptámeros que tienen una alta especificidad para un efector, pero no reconocen ninguno de los otros miembros de la familia del efector u otras moléculas estructuralmente similares. Por ejemplo, en la evolución de un aptámero para teofilina, puede usarse cafeína para contra-seleccionar y eliminar aquellos aptámeros que reaccionarían de forma cruzada con la cafeína de molécula estructuralmente similar. Un método posterior a la evolución sería realizar una selección negativa en un acumulado que ya ha sido desarrollado contra el efector deseado. El proceso involucraría el uso ya sea de un miembro de la familia del efector o una molécula estructuralmente similar al efector deseado como el objetivo de selección negativo. La población seleccionada se pasa sobre una columna de afinidad que contiene el objetivo de selección negativo y cuyos ácidos nucleicos que se enlazan al objetivo de selección negativo se remueven del acumulado seleccionado.

Alternativamente, la población seleccionada puede pasarse sobre una columna de afinidad que contiene el efector deseado, y el concentrado se somete después a una prueba inmunogénica por la adición de un objetivo de selección negativo. Preferiblemente, este proceso también involucraría el desempeño de dos hasta tres selecciones negativas que usan el objetivo de selección negativo y el acumulado altamente desarrollado de último ciclo, que se desarrolla con el uso del efector. El enlace de ciertas secuencias al objetivo de selección negativo se usaría para substraer aquellas secuencias del acumulado desarrollado. Este método permite que se eliminen rápidamente desde varios cientos hasta varios miles de secuencias de ácido nucleico que demuestran una alta afinidad para ambos de los efectores y moléculas que tienen características estructurales similares. Se apreciará que "separar" o "dividir" puede incluir cualquier proceso para separar los ARN selectivos del resto de la mezcla candidato de AR? no reactiva. La separación puede realizarse por varios métodos conocidos en la técnica. El enlazado por filtrado, separación de tamaño, cromatografía de afinidad, división líquido-líquido, filtración, cambio de gel, centrifugación en gradiente de densidad, son todos ejemplos de métodos de división apropiados. La separación también puede realizarse por medio de la presencia de un sitio de cebador PCR que permanece en el ARN catalíticamente inactivo. Los métodos de división de equilibrio también pueden usarse. Los métodos de división sencillos incluyen cualquier método para separar un sólido de un líquido, tal como centrifugación con y sin aceites, separaciones de membrana y lavado sencillo. Los ARN también pueden eluirse específicamente del efector con un anticuerpo o ligando específico. La elección del método de división dependerá de las propiedades del efector y el ARN puede usarse de conformidad con los principios y propiedades conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. El proceso de amplificación puede ser cualquier proceso o combinación de etapas de proceso que incrementen la cantidad o número de copias de una molécula o clase de moléculas. En modalidades preferidas, la amplificación ocurre después de que miembros de la mezcla de prueba se han dividido, y el que se amplifica es el ácido nucleico facilitador asociado con un producto deseable. Por ejemplo, la amplificación de moléculas de ARN puede llevarse a cabo por una secuencia de tres reacciones: el uso de transcripción inversa para hacer copias de cADN de los ARN seleccionados, el uso de la reacción de cadena de polimerasa para incrementar el número de copias de cada cADN, y la transcripción de las copias de cADN para obtener moléculas de ARN que tienen las mismas secuencias como los ARN seleccionados. Cualquier reacción o combinación de reacciones conocidas en la técnica, pueden usarse como sea apropiado, que incluye replicación directa de ADN, amplificación de ARN directa y similares, como se reconocerá por aquellos expertos en la técnica. El método de amplificación resultaría en las proporciones de la mezcla amplificada siendo esencialmente representativa de las proporciones de diferentes secuencias en la mezcla antes de la amplificación. Ejemplo 3 Módulo de Control Alostérico. El módulo de control alostérico contiene un dominio catalítico y un aptámero, envuelto como se describe arriba, que se selecciona de tal manera que la interacción del aptámero con el efector altera la actividad del módulo de control alostérico. La interacción del efector y el aptámero puede resultar en una alteración de la actividad catalítica del dominio catalítico. Dependiendo de la selección de los componentes, la alteración puede resultar en ya sea un incremento o una reducción en la actividad del dominio catalítico del módulo. Las ribozimas, moléculas tipo ribozima y porciones de tales moléculas se usan para formar los dominios catalíticos de la presente invención. Las ribozimas que son útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas en las clases de cabeza de martillo, cabeza de hacha, horquilla, virus delta de la hepatitis, neurospora, intrones auto-divididos (incluyendo el grupo I y el grupo II) , ribozimas de una especie de salamandra acuática (satellite) , ribozimas de Tetrahymena, ligasas, ligasas de péptido, fosfatasas y polimerasas. Los ácidos nucleicos de estas moléculas pueden usarse, o las moléculas pueden usarse como el punto de inicio para la producción de secuencias que no se presentan naturalmente, sintéticas, tipo ribozimas. El módulo de control alostérico puede incluir componentes adicionales o dominios que incluyen un dominio de substrato (por ejemplo, en el caso de dominios catalíticos auto-dividibles) o un dominio de reconocimiento (para ayudar en el reconocimiento del sitio en el cual la actividad catalítica es dirigirá) . El módulo de control alostérico también puede diseñarse de tal manera que el dominio catalítico y el aptámero se enlazan por una conexión estructural, en donde la interacción del aptámero y el efector resulta en una alteración de la conexión que resulta nuevamente en una alteración de la actividad catalítica del dominio catalítico (ver Soukup and Breaker, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96:3584-3589, 1999) .

El módulo de control alostérico se prueba después in vitro e/o in vivo. Los constructos óptimos en un sistema de control de expresión activado por el efector proporcionarán la inhibición máxima de expresión en ausencia del efector y el aumento máximo de expresión en presencia del efector. En un sistema de control de expresión inactivado por el efector, los constructos óptimos proporcionarán la inhibición máxima de expresión en presencia de un efector y el aumento máximo de expresión en ausencia del efector. Aunque no se limita a la presente invención, el dominio catalítico puede sintetizarse por procedimientos para síntesis química normal de ARN como se describe en Usman y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 109-7845, 1987; Scaringe y colaboradores, Nucleic Acids Res. 18:5433, 1990; y Wincott y colaboradores, ?ucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995. Los detalles no se repetirán aquí, pero tales procedimientos pueden involucrar el uso de grupos protectores y de acoplamiento de ácido nucleico comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. Además, la actividad catalítica de las moléculas puede optimizarse como se describe por Draper y colaboradores, PCT W093/23569, y Sullivan y colaboradores, PCT WO94/02595; Ohkawa y colaboradores, Nucleic Acids Symp. Ser. 27:15-6, 1992; Taira y colaboradores, Nucleic Acids Res. 19:5125-30, 1991; Ventura y colaboradores, Nucleic Acids Res. 21:3249-55, 1993; y Chowrira y colaboradores, J. Biol. Chem. 269-25856, 1994. Los detalles no se repetirán aquí, pero incluyen alterar la longitud de las extremidades de enlace de ribozima, o sintetizar químicamente ribozímas con modificaciones (base, azúcar y/o fosfato) que previenen su degradación por ribonucleasas de suero y/o aumentan su actividad enzimática (ver, por ejemplo, Eckstein y colaboradores, Publicación Internacional No. WO 92070165; Perrault y colaboradores, Nature 344, 565, 1990; Pieken y colaboradores, Science 253, 314, 1991; Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17, 334, 1992; Usman y colaboradores, Publicación Internacional No. WO 9315187; y Rossi y colaboradores, Publicación Internacional No. WO 9103162; y Sproat, Patente E.U.A. No. 5,334,711; todas estas describen varias modificaciones químicas que pueden hacerse en porciones base, fosfato y de azúcar de moléculas de ARN enzimático) . Las modificaciones que aumentan su eficacia en células, y la remoción de bases de las estructuras de circuito madre para acortar los tiempos de síntesis de ARN y reducir los requerimientos químicos que pueden usarse .

Ejemplo 4 Evolución y Selección de Aptámeros Una modalidad de la presente invención involucra la identificación del efector de conformidad con el Ejemplo 1, junto con una evolución y selección de un aptámero. La evolución del aptámero involucra primero preparar un acumulado o mezcla de ARN de hebra sencilla de secuencia aleatoria (ARNss) con regiones constantes que son necesarias para la transcripción inversa y amplificaciones PCR. Típicamente, los AR ss individuales contiene al menos 20 nucleótidos, pero pueden usarse menos nucleótidos. La mezcla de ARNss se pone en contacto después con un efector. A continuación los ARN que enlazan al efector se separan del resto de los ARN en el acumulado que no enlaza al efector. Aquellos ARN separados se amplifican para formar AD?, y el AD? amplificado se usa para formar una mezcla enriquecida de AR? que se enlaza al efector. Las etapas de reconocimiento del efector, división y amplificación se realizan por uno o más ciclos como sea necesario para identificar uno o más de los ARN como uno o más apatámeros que enlazan mejor el efector. El aptámero o aptámeros involucrados se usan después en un módulo de control alostérico. La selección del aptámero para usarse en el módulo de control alostérico se realiza enlazando primero el aptámero al ARN catalítico para formar un módulo de control alostérico; y después identificar aquellos módulos de control alostéricos en los cuales la interacción del efector y el aptámero altera la actividad del ARN catalítico. Este análisis puede realizarse in vivo o in vitro. Ej emplo 5 Evolución y Selección del Aptámero In Vitro para Teofilina Este ejemplo describe la evolución de una ribozima de cabeza de martillo regulable alostérica, que comprende un aptámero específico para teofilina. La teofilina se elige como un efector por la razón, entre otras, de que se ha aprobado para usarse por la FDA desde 1940 y sus perfiles de seguridad y toxicidad son aceptables y bien conocidos. Jenison y colaboradores caracterizan previamente un aptámero enlazado a la teofilina, Science 263:1425-1429, 1994, al cual Zimmerman y colaboradores asignan su estructura secundaria. Nature Struct. Biol. 4:644-649, 1997. Las dos hebras de ARN que conectan el dominio catalítico de cabeza de martillo al dominio aptámero de tiofilina, también llamado "módulo de comunicación", solo contiene seis nucleótidos y se aleatorizaron completamente. La complejidad de esta genoteca es de 1.7 x 10e de moléculas individuales. La selección se inicia con 2 nmoles de una Plantilla 1 de ADN de hebra sencilla sintética (SEQ ID NO: 1, Figura 1) que se hace en su forma de hebra doble por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Plantilla 1 de ADN 5' GGGAGAGGGA TCCAGCTGAC GANNNNNNAA TACCAGCCGA AAGGCCCTTG GCAGG???NN ?GAAAACGCCT TCGGCGTCCT GAT 3' Se llevaron a cabo cinco rondas de PCR en 500 µL de volumen de reacción que contiene KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9.0 a 25°C) , TritonX-100 al 0.01%, EDTA 2.5 mM, dT?P 0.25 mM de cada uno, y 2 nmoles de dos cebadores, Delantero T7-11: 5' GCTTAATACGACTCA CTATAGGGAGAGGGATCCAGC 3' (SEQ ID ?O: 2) e Inverso T7-11: 5' GAAGTTCTAATC CAGGACGCCGAAGGCGTTT 3' (SEQ ID ?O : 3) . Los parámetros para cada ciclo de PCR fueron 30 segundos a 93°C, 30 segundos a 55°C, y 1 minuto a 72°C. El ADN de hebra doble resultante que contiene un sitio cebador para la plantilla de polimerasa AR? T7 se concentró por precipitación de etanol . Se usó aproximadamente el 25% de AD? para la transcripción in vitro llevada a cabo a 37°C durante la noche en 500 µL de volumen de reacción que contiene Tris-HCl 40 mM (pH 8.0 a 25°C) , MgCl2 20 M, Spermidina 2 mM (Sigma, St . Louis, MO) , Tritón X-100 al 0.01%, DTT 5 mM, 400 U de cada uno de polimerasa de ARN T7 y ?TP 4 nM. La plantilla de AD? en la mezcla posterior a la transcripción se removió por un breve tratamiento de ADNsa I (20 U/500 µL) a 37°C durante 15 minutos. La genoteca de ribozimas que contiene la región de secuencia aleatoria en la Madre-II, se aisló al correr el ARN transcrito en un gel de poliacrilamida al 8% bajo condiciones desnaturalizadas (PAGE desnaturalizada) .

Las ribozimas que no se desdoblan en respuesta a la Teofilina, se remueven al incubar el ARN en una solución amortiguadora de desdoblamiento de ribozima (solución amortiguadora RZCL: Tris-HCl 50 M (pH 7.5 a 25 °C) y MgCl2 10 mM) a 25°C, acentuada a intervalos de 30 minutos para incubación a 85°C durante 30 segundos. Esta selección negativa se llevó a cabo durante 5 ciclos de acentuado térmico. La población de ARN resistente al auto-desdoblamiento independiente del ligando, se aisló por PAGE desnaturalizada. Una selección positiva de la población de ARN resistente al desdoblamiento independiente del ligando, se llevó a cabo al incubar este ARN en solución amortiguadora RZCL que contiene 200 µM de Teofilina a 25°C durante 5 minutos para facilitar el desdoblamiento dependiente de la teofilina de ribozimas . La población resultante de fragmentos 5' durante el auto-desdoblamiento, se aisló por PAGE desnaturalizado. La población de ARN de fragmento 5 ' se usó posteriormente como la plantilla para la transcripción inversa en 30 µL de volumen de reacción que contienen KCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8.0 a 25°C) , MgCl2 5 mM, DTT 5 mM, dNTP 1 mM cada uno, 10 U de transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis de aves, y 500 pmoles de cebador T7-11 Inverso a 42°C durante 30 minutos. El cADN resultante se usó como la plantilla para la PCR, para obtener la plantilla para generar el ARN para la siguiente ronda de la selección in vitro. Se llevaron a cabo siete ciclos de selecciones, durante los cuales, la concentración de Teofilina y MgCl2 en la etapa de selección positiva se redujo gradualmente desde 200- 20 mM y 10 - 2 mM, respectivamente. Después de siete ciclos, la población enriquecida exhibe una actividad de auto-desdoblamiento dependiente de la teofilina. Los productos de la PCR resultantes se purificaron por filtración en gel y precipitación en etanol. Los productos de la PCR purificados (0.1 pmoles) se clonaron en el Vector pT7Blue-3 (Novagen, Madison, Wl) en el sitio EcoRV con el Kit de Clonación Perfectly Blunt (Novagen) de conformidad con el protocolo suministrado por el fabricante. La mezcla de ligado se transformó en Células Competentes Sencillas NovaBlue (Novagen) con el uso de protocolos estándar. Los plásmidos en los transformantes se aislaron y se hicieron en secuencia con el cebador de base vector U 19 (SEQ ID NO: 4) (5' GTTTTCCCAGTCACGACGT 3') y se sometieron a análisis adicionales . Un ejemplo de una secuencia de ribozima individual, AT-50, que responde a la teofilina para desdoblar, se ilustra en la Figura 8 y tiene la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 5) : 5' GGGAGAGGGA UCCAGCUGAC GAGGUACUGAA UACCAGCCGA AAGGCCCUUGGCAGGUUUGG UGAAACGCCU UCGGCGUCCU GGAUUAGAAC UUC 3' La capacidad de auto-desdoblamiento de la ribozima TA-50 es fuertemente dependiente de la presencia de teofilina (Figura 9) . La actividad de desdoblamiento más alta de la ribozima TA-50 se observa con una concentración de teofilina entre 10-50 µM. Ya que esta concentración de teofilina está con el rango que se realiza terapéuticamente, es posible divisar una aplicación in vivo de la TA-50 u otra ribozima con características de desempeño similares para modular la expresión del gen en respuesta a la toma de teofilina. Ejemplo 6 Inactivación del Efector de un Módulo de Control Alostérico El siguiente procedimiento produce módulos de control alostéricos que tienen la actividad catalítica que se activa en presencia del efector identificado. La identificación del efector se lleva a cabo de conformidad con el Ejemplo 1, seguido por la evolución y selección de un aptámero que involucra las etapas de: a) preparar un acumulado de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) identificar aquellos ARN que tienen actividad catalítica; c) amplificar los ARN catalíticamente activos para formar moléculas codificadoras de AD?; d) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla enriquecida del AR? catalíticamente activo; e) hacer contacto de la mezcla con un efector; f) seleccionar aquellos AR? que se enlazan al efector pero que no conservan la actividad catalítica al enlazarse al efector; g) amplificar los AR? seleccionados para formar moléculas que codifican el AD?; h) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se inactiva o se inhibe en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se inactivan o inhiben por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes. En una modalidad alternativa, la evolución del módulo de control alostérico involucra las etapas de : a) preparar un acumulado de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) hacer contacto de la mezcla con un efector; c) seleccionar aquellos AR? que se enlazan al efector pero que no demuestran la actividad catalítica al enlazarse al efector; d) amplificar los AR? seleccionados para formar moléculas que codifican el AD?; e) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla de AR?; f) seleccionar aquellos ARN como uno o más módulos de control alostéricos que demuestran actividad catalítica en ausencia del efector; g) amplificar los ARN seleccionados; h) transcribir el ARN amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se inactiva o se inhibe en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se inactivan o inhiben por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes. En una modalidad la "actividad catalítica" es una actividad de auto-desdoblamiento y el módulo de control alostérico se usa en la formación para la inhibición o reducción de la expresión del gen de interés. En modalidades adicionales, la actividad catalítica involucra la actividad de ligasa o la actividad de empalme. Ejemplo 7 Activación del Efector de un Módulo de Control Alostérico El siguiente procedimiento produce módulos de control alostéricos que tienen la actividad catalítica que se activa en presencia del efector identificado. La identificación del efector se lleva a cabo de conformidad con el Ejemplo 1, seguido por la evolución y selección de un aptámero que involucra las etapas de: a) preparar una mezcla de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) identificar aquellos ARN que no demuestran actividad catalítica en ausencia del efector; c) amplificar los ARN identificados para formar moléculas codificadoras de ADN; d) transcribir el ADN amplificado para formar una mezcla enriquecida del ARN; e) hacer contacto de la mezcla con un efector; f) identificar aquellos ARN que se enlazan al efector y demuestran actividad catalítica al enlazarse al efector; g) amplificar los ARN seleccionados para formar moléculas que codifican el ADN; h) transcribir el ADN amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se activa en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se activan o enriquecen por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes . En una modalidad alternativa, la evolución del módulo de control alostérico involucra las etapas de : a) preparar un acumulado de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) hacer contacto del acumulado con un efector; c) identificar aquellos ARN que se enlazan al efector que demuestran la actividad catalítica al enlazarse al efector; d) amplificar los ARN identificados para formar moléculas que codifican el AD?; e) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla de AR? que tiene una actividad catalítica en presencia del efector; f) seleccionar aquellos ARN que son catalíticamente inactivos en ausencia del efector; g) amplificar los AR? seleccionados para formar las moléculas codificadoras de AD?; h) transcribir el ADN amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se activa en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se activan o enriquecen por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes. En una modalidad la "actividad catalítica" es una actividad de auto-desdoblamiento y el módulo de control alostérico resulta en la formación del ARNm funcional que codifica al gen de interés. En modalidades adicionales, la actividad catalítica involucra la actividad de ligasa o la actividad de empalme . Ejemplo 8 Procedimiento de Selección del Efector Alterno Un método alternativo para seleccionar un efector, involucra las etapas de: a) proporcionar un módulo de control alostérico adecuado para su uso en la modulación de la expresión de genes; b) hacer contacto del módulo de control alostérico con uno o más efectores; y c) determinar si la interacción del módulo de control alostérico y un efector resulta o no en una alteración de la actividad catalítica del módulo de control alostérico.

Otro método para determinar si una molécula que no es previamente conocida por ser un efector, se puede usar en combinación con un módulo de control alostérico para alterar específicamente la expresión de un gen de interés involucra las etapas de: (a) hacer contacto de la muestra que contiene un número predefinido de células eucarióticas con la molécula a probarse, cada célula comprende un constructo de ADN que codifica, i) un módulo de control alostérico, y ii) un gen reportero que produce una señal detectable, acoplado con, y bajo el control de un promotor, bajo condiciones en donde la molécula si es capaz de actuar como un modulador del gen de interés, provoca una señal detectable a producirse por el gen reportero; (b) determinar cuantitativamente la cantidad de la señal producida en (a) ; (c) comparar la cantidad de señal determinada en (b) con la cantidad de señal producida y detectada en ausencia de cualquier molécula a probarse o con la cantidad de señal producida y detectada al hacer contacto de la muestra en (a) con otras moléculas, con lo cual se identifica la molécula de prueba como un efector que provoca un cambio en la cantidad de la señal detectable producida por el gen reportero, con lo cual se determina si la molécula de prueba altera específicamente la expresión del gen de interés . Ejemplo 9 Expresión del Gen Inducible Las figuras son esquemáticas de diversas modalidades específicas de esta tecnología, para regularla expresión de genes. La utilidad del sistema se puede extender más allá de las aplicaciones médicas directas en aplicaciones de investigación más básica, aplicaciones de diagnóstico y aplicaciones de pruebas ambientales. En una modalidad, se puede seleccionar un módulo de control alostérico de respuesta al efector y un gen de interés, para introducirse en la célula por medio de un vector viral o no viral. En donde el módulo de control alostérico involucra un dominio catalítico de auto-desdoblamiento, la interacción del efector y el módulo de control alostérico, resulta en la expresión del gen de interés. En ausencia del efector, el ARNm no se traduce. Al eliminar el efector de un sistema, el módulo de control alostérico debe retornar a la conformación activa, y los niveles de expresión disminuyen debido a la presencia del ARNm que no se traduce . En una modalidad alternativa, se puede seleccionar un módulo de control alostérico de respuesta al efector y un gen de interés a introducirse en la célula por medio de un vector viral o no viral . En donde el módulo de control alostérico involucra un dominio catalítico de auto-desdoblamiento, la interacción del efector y el módulo de control alostérico se puede diseñar para resultar en la inactivación del ARNm, y la no expresión del gen de interés en presencia del efector. En ausencia del efector, el ARNm se traduce. En otra modalidad, se puede seleccionar un módulo de control alostérico de respuesta al efector y un gen de interés para introducirse en la célula por medio de un vector viral o no viral . En donde el módulo de control alostérico involucra un dominio catalítico de auto-empalme, la interacción del efector y el módulo de control alostérico, resulta en la expresión del gen de interés. En ausencia del efector, el ARNm no se traduce. En una modalidad alternativa, se puede seleccionar un módulo de control alostérico de respuesta al efector y un gen de interés para introducirse en la célula por medio de un vector viral o no viral. En donde el módulo de control alostérico involucra un dominio catalítico de auto-empalme, la interacción del efector y el módulo de control alostérico, puede diseñarse para resultar en la inactivación del ARNm y la no expresión del gen de interés. En ausencia del efector, el ARNm no se traduce. Se apreciará que los constructos de ADN pueden incluir un módulo de control alostérico regulable (por ejemplo, en formato de auto-desdoblamiento) colocado bajo el control de un promotor constitutivo. El mismo constructo puede incluir la región codificadora para el gen de interés, un codón de detención y una terminación poli (A) . La introducción del vector dentro de una célula resultará en la producción del ARNm que codifica el módulo de control alostérico y el gen. Si el módulo de control alostérico está activo en ausencia del efector, entonces el ARNm se desdoblará por el dominio catalítico para resultar en piezas disponibles para el ataque exonucleolítico; esto es, se inactivará el ARNm. Cuando el efector se administra y entra a las células, el módulo de control alostérico se hace inactivo y el ARNm se traducirá normalmente. Así, la expresión de genes será bajo el control de inducción del módulo de control alostérico. Todas las referencias aquí citadas, incluyendo patentes, solicitudes de patente y publicaciones, y por lo cual se incorporan en sus totalidades como referencia.

Aunque esta invención se ha descrito con un énfasis en las modalidades preferidas, será evidente para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, que se pueden preparar y usar variaciones en las modalidades preferidas, y que la invención se puede practicar de otra forma a la que se describe específicamente. La presente invención pretende incluir tales variaciones y prácticas alternativas. De esta manera, esta invención incluye todas las modificaciones abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para identificar un efector y generar un aptámero o aptámeros interactivos, el método caracterizado porque comprende las etapas de: a) seleccionar el conjunto de características deseadas para un efector, en donde las características deseadas se seleccionan del grupo que consiste de: (i) al menos un 1% de biodisponibilidad; (ii) biodistribución al tejido que contiene un módulo de control alostérico; (iii) la capacidad de pasar al núcleo de la célula; (iv) no hay interacciones de fármacos o interacciones manejables de fármacos; (v) no hay toxicidad o toxicidad aceptable en el rango de dosis usado; (vi) no hay efectos laterales o efectos laterales aceptables en el rango de dosis usado; (vii) no hay efecto farmacológico en el rango de dosis usado al regular la expresión del transgen o un efecto farmacológico despreciable; y (viii) propiedades físicas adecuadas para la evolución in vitro de un aptámero, en donde las características indican que el efector es adecuado para la generación del aptámero, consumo humano y uso con un módulo de control alostérico para la regulación de la expresión de transgenes; b) tener acceso a una o más bases de datos que contienen datos en las características seleccionadas del efector; c) identificar un conjunto de efectores que tengan las características seleccionadas; y d) generar y seleccionar aptámeros a los efectores en el conjunto por medio de la evolución in. vitro.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el efector se selecciona del grupo que consiste de moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, metabolitos que se presentan naturalmente y efectores biológicos, lípidos, carbohidratos (polisacáridos, azúcar) , ácidos grasos y polímeros .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la evolución y selección del aptámero comprende las etapas de : a) preparar un acumulado de un ARN de hebra sencilla (ARNss) de una secuencia aleatoria, que comprende al menos 20 nucleótidos con regiones constantes que son necesarias para la transcripción inversa y las amplificaciones por PCR; b) hacer contacto del acumulado de ARNss con un efector; c) separar los ARN que se enlazan al efector, del resto del acumulado que no se enlaza al efector; d) amplificar aquellos ARN separados que se enlazan al efector para formar AD?; e) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla enriquecida de ARN; f) llevar a cabo las etapas b) a la e) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más ARN como uno o más aptámeros que mejor se enlacen al efector; y g) seleccionar el aptámero o aptámeros identificados para su uso en un módulo de control alostérico.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ARN de hebra sencilla de secuencia aleatoria, comprende cada uno como máximo 200 nucleótidos con regiones constantes que son necesarias para la transcripción inversa y las amplificaciones PCR.
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porgue al seleccionar el aptámero para su uso en un módulo de control alostérico, comprende las etapas de: a) ligar el aptámero a un ARN catalítico para formar un módulo de control alostérico; y b) identificar aquellos módulos de control alostéricos en los cuales la interacción del efector y el aptámero altera la actividad del AR? catalítico in vivo.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la selección del módulo de control alostérico, en donde el método comprende las etapas de : a) preparar un acumulado de un AR?ss de una secuencia aleatoria, en donde cada AR?ss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) identificar aguellos ARN que tienen actividad catalítica; c) amplificar los ARN catalíticamente activos para formar moléculas codificadoras de ADN; d) transcribir el ADN amplificado para formar una mezcla enriquecida del AR? catalíticamente activo; e) hacer contacto de la mezcla con un efector; f) seleccionar aquellos AR? que se enlazan al efector pero que no conservan la actividad catalítica al enlazarse al efector; g) amplificar los ARN seleccionados para formar moléculas que codifican el ADN; h) transcribir el ADN amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se inactiva o se inhibe en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se inactívan o inhiben por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue comprende además la selección del módulo de control alostérico, en donde el método comprende las etapas de: a) preparar un acumulado de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) hacer contacto de la mezcla con un efector; c) seleccionar aquellos ARN que se enlazan al efector pero que no demuestran la actividad catalítica al enlazarse al efector; d) amplificar los ARN seleccionados para formar moléculas de AD?; e) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla de AR?; f) seleccionar aquellos AR? como uno o más módulos de control alostérico, que demuestran actividad catalítica en ausencia del efector; g) amplificar los ARN seleccionados; h) transcribir el ARN amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se inactiva o se inhibe en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se inactivan o inhiben por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes.
8. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la actividad catalítica es una actividad de auto-desdoblamiento, y en donde el módulo de control alostérico de auto-desdoblamiento se usa para la inhibición o reducción de la expresión de un gen de interés en ausencia del efector.
9. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el ARNss comprende al menos 20 nucleótidos .
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la selección del módulo de control alostérico, en donde el método comprende las etapas de: a) preparar un acumulado de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) identificar aquellos AR? que no demuestran actividad catalítica en ausencia del efector; c) amplificar los AR? identificados para formar moléculas codificadoras de AD?; d) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla enriquecida del AR?; e) hacer contacto de la mezcla con un efector; f) identificar aquellos AR? que se enlazan al efector y demuestran actividad catalítica al enlazarse al efector; g) amplificar los ARN seleccionados para formar moléculas que codifican el ADN; h) transcribir el ADN amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se ^activa en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector, y que se activan o enriquecen por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la selección del módulo de control alostérico, en donde el método comprende las etapas de: a) preparar un acumulado de un ARNss de una secuencia aleatoria, en donde cada ARNss comprende un aptámero, un dominio catalítico propuesto y una o más regiones constantes apropiadas para la transcripción inversa y la amplificación por PCR; b) hacer contacto del acumulado con un efector; c) identificar aquellos ARN que se enlazan al efector que demuestran la actividad catalítica al enlazarse al efector; d) amplificar los ARN identificados para formar moléculas que codifican el AD?; e) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla enriquecida de AR? que tiene una actividad catalítica en presencia del efector; f) seleccionar aquellos ARN que son catalíticamente inactivos en ausencia del efector; g) amplificar los AR? seleccionados para formar las moléculas codificadoras de AD?; h) transcribir el AD? amplificado para formar una mezcla enriquecida de módulos de control alostéricos que tienen una actividad catalítica que se activa en presencia del efector; y i) llevar a cabo las etapas b) a la h) para uno o más ciclos como se necesiten para identificar uno o más módulos de control alostéricos que reconocen, enlazan e interactúan con el efector y que se activan o enriquecen por el enlace del efector cuando el efector y el módulo de control alostérico seleccionado, se usan en la modulación de la expresión de genes.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el ARNss comprende al menos 20 nucleótidos .
13. El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la actividad catalítica es una actividad de auto-empalme, y en donde el auto-empalme del módulo de control alostérico resulta en la formación de un ARNm funcional que codifica el gen de interés.
14. Un método para seleccionar un efector, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar un módulo de control alostérico adecuado para su uso en la modulación de la expresión de genes ; b) hacer contacto del módulo de control alostérico con uno o más efectores; y c) determinar si la interacción del módulo de control alostérico resulta o no en una alteración de la actividad catalítica del módulo de control alostérico.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las bases de datos contienen datos seleccionados del grupo que consiste de: a) fármacos comercializados con estereoselectividad para un isómero, que comprende el componente farmacéuticamente aceptable activo y otro isómero con poca o ninguna actividad farmacológica. b) metabolitos de fármacos conocidos que tienen poca o ninguna actividad. c) moléculas dirigidas al receptor nuclear; d) candidatos a fármacos que entran a ensayos clínicos, pero se descontinúan los ensayos debido a una carencia relativa de eficacia; e) fármacos que se retiran del mercado debido a una carencia de eficacia terapéutica. f) fármacos que son eficaces pero que no se comercializan debido a un beneficio relativo bajo. g) fármacos diseñados como antivirales/antiinfecciosos, para su uso en pacientes no afectados por el virus objetivo o el agente infeccioso. h) aditivos para alimentos bien caracterizados; i) fármacos genéricos con mecanismos bien conocidos de acción; y j) fármacos que son desplazados del mercado o ensayos clínicos por moléculas mejores en su clase.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la base de datos se selecciona del grupo que consiste de una base de datos de Investigational Drugs datábase, Drug Data Report, World Drug Index, Derwent Drug File, R&D Insight, R&D Focus, Pharmaprojects, MEDLINE y EMBASE.
17. Un método para determinar si una molécula que no es previamente conocida por ser un efector, se puede usar en combinación con un módulo de control alostérico para alterar específicamente la expresión del gen de interés, caracterizado porque comprende: a) hacer contacto de una muestra que contiene un número predefinido de células eucarióticas con la molécula a probarse, cada célula comprende un constructo de ADN que codifica, i) un módulo de control alostérico, y ii) un gen reportero que produce una señal detectable, acoplada a, y bajo el control de un promotor, bajo condiciones en donde la molécula es capaz de actuar como un modulador del gen de interés, provoca una señal detectable a producirse por el gen reportero; b) determinar cuantitativamente la cantidad de la señal producida en (a) ; c) comparar la cantidad de la señal determinada en b) con la cantidad de la señal producida y detectada en ausencia de cualquier molécula a probarse, o con la cantidad de señal producida y detectada al hacer contacto de la muestra en a) con otras moléculas, con lo que se identifica la molécula de prueba como un efector que provoca un cambio en la cantidad de la señal detectable producida por el gen reportero, y con lo cual se determina si la molécula de prueba altera específicamente la expresión del gen de interés.
18. Un constructo de ADN, caracterizado porque comprende : (a) un ADN que codifica al promotor (b) un ADN que codifica el producto deseado; y © un ADN que codifica un módulo de control alostérico de la reivindicación 1, en donde la actividad catalítica del módulo de control alostérico se altera por el enlace de un efector al mismo.
19. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el constructo de ADN de la reivindicación 18.
20. Un ARN, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que codifica: (a) una región no traducida 5' (UTR) , uno o más intrones y una UTR 3'; (b) un producto deseado; y (c) un módulo de control alostérico de la reivindicación 1, en donde la actividad catalítica del módulo de control alostérico se altera por el enlace de un efector al mismo.
21. Un método para la modulación de la expresión in vivo de un producto deseado en una célula, caracterizado porque comprende : (a) suministrar la célula con un constructo de ADN de la reivindicación 18; (b) introducir en la célula un efector que altera la actividad catalítica del módulo de control alostérico.
22. Una línea celular de empaque para la producción de un vector viral recombinante, caracterizada porque la línea celular contiene un constructo de un vector viral que comprende un constructo de ADN de la reivindicación 18.
23. Un vector viral recombinante, caracterizado porque comprende un constructo de ADN de la reivindicación 18.
24. La molécula catalítica de ARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio catalítico comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de ácidos nucleicos de ribozimas de cabeza de martillo, ácidos nucleicos de ribozimas de cabeza de hacha, ácidos nucleicos de ribozimas de horquilla, ácidos nucleicos de ribozimas del virus delta de la hepatitis, ácidos nucleicos de ribozimas de una especie de salamandra acuática (satellite) , ácidos nucleicos de ribozimas de Tetrahymena, secuencias de guía externa para Rnasa P, intrones de auto-empalme, ligasas, fosfatasas, polimerasas, y ligasas de péptido.
25. La molécula catalítica de ARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el AR? catalítico es una secuencia de guía externa para la R?Asa P.
26. La molécula catalítica de ARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARN catalítico se inactiva cuando el efector se enlaza a un aptámero.
27. La molécula catalítica de ARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el AR? catalítico se activa cuando el efector se enlaza al aptámero.
28. La molécula catalítica de AR? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el efector se administra exógenamente a las células que contienen el módulo de control alostérico y un transgen.
29. Un proceso para la preparación de un módulo de control alostérico para la regulación de la expresión de genes, caracterizado porque comprende: (a) separar por exclusión una colección aleatoria de ácidos nucleicos para seleccionar un enlace de aptámero a una molécula selecta del efector; y (b) preparar un ácido nucleico que comprende una secuencia para el aptámero seleccionado y una secuencia que codifica una proteína de interés; en donde el gen que codifica a la proteína de interés no se expresa cuando la molécula del efector se enlaza a la secuencia para el aptámero seleccionado.
30. El proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende optimizar el aptámero seleccionado por evolución in vitro.