MXPA02006168A

MXPA02006168A - Uso de las proteinas de transporte para el control de ciclo celular.

Info

Publication number: MXPA02006168A
Application number: MXPA02006168A
Authority: MX
Inventors: Peter Francis Joseph O'hare
Original assignee: Phogen Ltd
Priority date: 1999-12-24
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2003-01-28
Also published as: WO2001047960A1; AU2207901A; US6734167B2; US20020155988A1; EP1240190A1; US20040142900A1; AU776817B2; JP2003519159A; CA2395575A1; GB9930519D0

Abstract

Esta invencion se refiere a los usos de las proteinas activas de transporte, particularmente de las proteinas y los polipeptidos de fusion con la funcion de VP22, para controlar el ciclo celular, particularmente en la reduccion de la actividad proliferante de las celulas proliferantes.

Description

USOS DE LAS PROTEINAS DE TRANSPORTE PARA EL CONTROL DEL CICLO CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a los usos de las proteínas activas en transporte, particularmente de las proteínas y los polipéptidos de fusión con la función de VP22, para el control del ciclo celular, particularmente en la reducción de la actividad de proliferación de las células proliferantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Y LA TÉCNICA ANTERIOR Las propiedades de transporte de VP22 y los homólogos de la misma se describen en el documento WO 97/05265 (P O'Hare and G. Elliott) . WO 98/32866 (P O'Hare y colaboradores) discuten los polipéptidos acoplados y los polipéptidos de fusión para el transporte intracelular, y su preparación y uso. El tráfico intercelular y la distribución de proteínas por una proteína estructural del herpes virus se describe en Cell (1997), Vol . 88, pp223-233 (G. Elliott and P O'Hare) . La técnica anterior incluye en general una variedad de proteínas de control del ciclo celular, especialmente en las formas de secuencias de proteínas y REF: 139826 polinucleótidos que hacen posible la manipulación genética mediante técnicas estándares. Por ejemplo, entre las proteínas de control del ciclo celular, la proteína P53 es conocida como un supresor de tumores. p53 es una fosfoproteína nuclear de 53kDa. Las proteínas p53 de tipo silvestre y mutantes han sido expresadas por medio del virus recombinante de la vaccinia (Roñen y colaboradores, Nucleic Acids Research, 20, pp 3435-3441, 1992) .p53 funciona para regular la progresión del ciclo celular y bajo condiciones de daño al ADN puede inducir detención del ciclo celular o apoptosis a través de un mecanismo complejo de transducción de señal (Levine A. J. Cell, 88, pp323-331, 1997) . Otras proteínas que se sabe promueven la muerte celular incluyen la proteína bax, y los homólogos tales como la proteína Bak, incluyendo el dominio BH3 (EP Hollinger y colaboradores, 1999, J. Biol. Chem. , 274 (19), pp 13298-13304) .

SUMARIO Y DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a un aspecto de la invención se proporciona un método para reducir la proliferación celular, por ejemplo, un método para reducir la proliferación de las celular hiperproliferantes , por ejemplo, las células cancerosas, que comprende los pasos de : a) exponer dichas células proliferantes, por ejemplo, las células de hiperproliferación, a una composición que comprende al menos un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 herpes viral, el polipéptido que es acoplado al menos a una o una pluralidad de secuencias de aminoácidos funcionalmente activas, seleccionadas de las proteínas o péptidos que pueden regular la progresión del ciclo regular, por ejemplo las proteínas que pueden inducir la apoptosis, o las proteínas que pueden detener las células a partir del ciclo celular, por ejemplo en la fase GO del ciclo celular, o análogos funcionales de las mismas; o exponiendo dichas células a composiciones terapéuticas que comprenden el ácido nucleico que codifica para la o las proteínas, o los ácidos nucleicos la progresión del ciclo celular; y b) la exposición de dichas células al menos a un agente para estimular adicionalmente la muerte celular, siendo seleccionado dicho agente de: los fármacos que pueden inducir la detención del ciclo celular, los fármacos quimioterapéuticos citotóxicos comúnmente utilizados como parte de un tratamiento de enfermedad maligna, agentes que dañan el ADN, agentes que incrementan la sensibilidad celular al daño al ADN, y cantidades citotóxicas de radiación; y opcionalmente después del paso a) y/o del paso b) . c) la exposición adicional de las células al menos a un agente que puede prevenir la exportación desde la célula, de cualquiera de los agentes administrados en a) y/o b) , por ejemplo, una proteína Acf , o un inhibidor de la proteína de resistencia a fármacos múltiples (MDR, también denominada como la glucoproteína P) , por ejemplo una molécula antisentido. Las células proliferantes que pueden ser tratadas mediante el proceso de la invención pueden ser células tumorales, por ejemplo las células tumorales presentes en una masa de células tumorales. Alternativamente, las células en proli eración pueden ser células no malignas, por ejemplo células tumorales benignas tales como verrugas genitales, células del músculo liso, tales como células del músculo liso vascular presentes en la restenosis, o éstas pueden ser células de piel proliferantes, por ejemplo células de piel con psoriasis o eczema, o células proliferantes del tejido de cicatrización. Entre las proteínas acopladas a VP22 útiles, en el paso a) del método, pueden estar las proteínas de fusión, o si se desea éstas pueden ser proteínas químicamente acopladas que comprendan una proteína VP22 o una proteína reguladora del ciclo celular. Los ácidos nucleicos útiles en el paso a) del método pueden ser ácidos nucleicos que codifican para la fusión VP22. Las proteínas que pueden ser acopladas a VP22 y las cuales pueden regular de manera útil la progresión del ciclo celular, de acuerdo al método de la invención incluyen, por ejemplo, inhibidores de las cinasas dependientes de la ciclina (CKls) . Tales inhibidores adecuados incluyen proteínas que pueden detener las células en los límites celulares Gl/S o G2/M del ciclo celular, por ejemplo las proteínas . p27-kipl, p21- afl/cipl, pl5-ink4b, pl6-ink4a, p57-kip2 y pl9-ARF. p27 es descrita por ejemplo por K. Polyak y colaboradores en Cell (1994), 78, pp 59-66, y por J. A. Pietenpol y colaboradores en Cáncer Research (1995) , 55 (6) , pp 1206-1210. De este modo, un aspecto de la invención incluye una preparación farmacéutica de un producto de acoplamiento entre una proteína con la función de transporte de VP22 y una proteína con la función de regulación de la progresión del ciclo celular, por ejemplo, mediante la inducción de la apoptosis celular o la detención de las células del ciclo celular. Un aspecto adicional de la invención comprende el uso de la preparación para poner en contacto las células proliferantes para reducir su actividad proliferativa .

Otras proteínas que pueden ser útilmente acopladas a VP22 de acuerdo a las modalidades adicionales de la invención, y las cuales pueden regular la progresión del ciclo celular pueden ser, por ejemplo, las proteínas que bajo condiciones de daño al ADN inducen la apoptosis celular, por ejemplo p53, o proteínas que bajo condiciones de daño al ADN tienen el desarrollo celular, por ejemplo un producto proteico de la familia de genes GADD, por ejemplo el producto de GADD45 o GADD153. El documento VJO 98/32866 ( arie Curie Cáncer Care: P'O Haré y colaboradores) describe además las proteínas que pueden ser útilmente acopladas a VP22, por ejemplo p53, y también los vectores que expresan tales polipéptidos acoplados. Los ejemplos adicionales de proteínas que pueden ser acopladas a VP22 y que pueden inducir la apoptosis celular incluyen las siguientes: citocromo c, miembros de la familia de proteínas de la proteasa caspasa, la proteína apoptina, la proteína bak y también la proteína bax, y cualesquiera fragmentos homólogos o funcionales de las mismas, particularmente el dominio funcional de 19 aminoácidos de las proteínas bak y bax, denominado el dominio BH3 , y los homólogos funcionales de las mismas. Las cantidades de VP22 acopladas a una proteína reguladora del ciclo celular (o polinucleótido de codificación) que pueden ser útilmente administradas a un paciente en un método de acuerdo a la invención está en el intervalo de aproximadamente 0.001 microgramos por kg (peso de un sujeto que va a ser tratado) hasta aproximadamente 100 miligramos por kg. Los ejemplos de fármacos que pueden ser utilizados para inducir la detención del ciclo celular en los ejemplos de métodos de la invención, incluyen flavopiridol , taxol y nocodazol . Las dosis de taxol que pueden ser administradas en un método de la invención pueden ser por ejemplo, aproximadamente de 135 aproximadamente a 175 miligramos por metro cuadrado (área corporal de un sujeto que va a ser tratado) , y puede ser administrada como una infusión a través de un filtro en linea en un periodo de tiempo de horas, por ejemplo 24 horas. El taxol puede ser utilizado en combinación con el cisplatino, que puede ser administrado a una dosis de, por ejemplo 70-80 miligramos por m2, después de la administración del taxol. El tratamiento en combinación con taxol, seguido por cisplatino, es especialmente útil como parte de una terapia para el carcinoma de ovario. Los fármacos quimioterapéuticos que pueden ser utilizados para tratar las células proliferantes en los ejemplos de métodos de la invención, pueden ser por ejemplo, doxorrubicina, etopósido, felomicina D, paclitaxel, curcumina, o camptotecina . Las dosis estándares de fármacos quimioterapéuticos pueden ser administrados útilmente a un paciente que va a ser tratado. Por ejemplo, para la doxorrubicina la dosis es usualmente calculada con base en el área corporal, y las dosis que pueden ser útilmente administradas como parte del método de la invención son 60-70 mg por m2, por ejemplo 30-40 mg por m2, esto puede ser administrado como una dosis simple, como por ejemplo en administración intravenosa, por ejemplo cada tres semanas. Los agentes que dañan el ADN que pueden ser utilizados para tratar las células proliferantes en los ejemplos de métodos de la invención, pueden ser por ejemplo, agentes quelantes del ADN, tales como cisplatino. Este puede ser administrado mediante infusión en un periodo de horas, por ejemplo en dosis cada vez mayores desde 20 mg por m2 (área corporal de un sujeto que va a ser tratado) , por ejemplo 60-70 mg por m2, por ejemplo 30-40 mg por m2, administrados, por ejemplo, cada tres semanas. Los agentes que pueden sensibilizar una célula al daño de ADN en los ejemplos de métodos de la invención incluyen por ejemplo, los inhibidores de las proteínas que exportan los agentes que dañan el ADN, desde las células, por ejemplo inhibidores de la glucoproteína P (proteína DR) , por ejemplo MDR antisentido; y también inhibidores de las proteínas que están involucradas en el reconocimiento del daño al ADN, por ejemplo inhibidores de las proteínas seleccionadas de: la poli-ADP-ribosa- polimerasa (PARP) , ataxia-telangiectasia (ATM) y la proteina cinasa del ADN. El uso de un agente que daña el ADN, por ejemplo cisplatino, para tratar las células proliferantes en los ejemplos de métodos de la invención, es particularmente preferido cuando dichas células proliferantes van a ser expuestas a VP22 acoplado a una proteína que bajo condiciones de daño al ADN, induce la apoptosis celular, por ejemplo p53. Cuando las células proliferantes son expuestas a p53 éstas pueden también ser particularmente útiles para exponer adicionalmente las células a la proteina ARF, la cual previene la exportación desde la célula y la degradación subsiguiente de p53, o ácido nucleico que codifica para la proteína ARF. Cuando las células proliferantes son expuestas a un fármaco quimioterapéutico de acuerdo a un ejemplo de un método de la invención, éste puede también ser particularmente útil para exponer adicionalmente dichas células a un agente que puede prevenir la exportación del fármaco quimioterapéutico desde la célula, por ejemplo, un inhibidor de la proteína de resistencia a fármacos múltiples (MDR) , por ejemplo una molécula antisentido de la proteína MDR. De acuerdo a un aspecto de la invención, los polipéptidos acoplados a VP22 descritos en la presente, o los polinucleótidos correspondientes que los codifican, pueden ser distribuidos a las células en proliferación, por ejemplo mediante inyección directa dentro de las células objetivo, tal como una masa de células tumorales, o éstas pueden ser administradas sistémicamente . Las composiciones pueden también ser formuladas utilizando métodos conocidos per se para la administración tópica, por ejemplo para tratar la psoriasis, eczema o cáncer de piel. Alternativamente, éstas pueden ser encapsuladas en cápsulas de liberación lenta adecuadas para la administración oral, utilizando métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos acoplados a VP22 o los polinucleótidos que los codifican, correspondientes, pueden también ser asociados con otros sistemas de administración, por ejemplo éstos pueden ser acoplados a liposomas, tales como liposomas cationicos, o éstos pueden ser asociados con agentes de condensación, tales como agentes que condensan el ADN, por ejemplo polímeros hidrofílicos, por ejemplo sulfato de protamina, o por ejemplo lisina. Éstos pueden ser administrados por ejemplo mediante inyección directa dentro de las células diana, tales como las células tumorales, o alternativamente éstos pueden ser administrados sistémicamente, por ejemplo utilizando un procedimiento basado en catéter, o éstas pueden ser formuladas para la administración tópica o la administración oral . Para mejorar la administración a las células Diana, las composiciones terapéuticas descritas en la presente pueden también comprender de manera útil una molécula de dirección al objetivo, por ejemplo una molécula de dirección al tumor, tal como la transferrina o el folato. La molécula de dirección al objetivo puede ser, por ejemplo, acoplada mediante fusión a VP22. Alternativamente, de acuerdo a un aspecto adicional de la invención las células hiperproliferativas pueden ser expuestas a los polipéptidos de fusión de VP22 descritos en la presente, mediante la introducción de un vector de expresión que codifica para dicho polipéptido de fusión en la población objetivo de las células proliferantes, por ejemplo mediante inyección directa en el sitio objetivo. El vector de expresión puede ser por ejemplo un vector viral recombinante, tal como un vector adenoviral, un virus adeno-asociado , o un vector herpes-viral . Particularmente útiles en este contexto están los vectores herpes-virales defectuosos tales como aquellos descritos en las especificaciones: WO 92/05263 (Immunology Ltd: Inglis y colaboradores) , WO 96/26267 (Cantab Pharmaceuticals Research Ltd: Inglis y colaboradores) y WO 96/04395 (Lynxvale Ltd: Speck) y documentos citados en ésta. Cuando el vector es un herpes-virus éste puede ser útil para distribuir desde 1 x 103 hasta 1 x 108 ufp de virus, por ejemplo, desde 1 x 104 hasta 1 x 107 ufp. Cuando el vector es un adenovirus o un virus adenoasociado éste puede ser útil para distribuir desde 1 x 103 hasta 1 x 1013 ufp de virus . De acuerdo a otro aspecto más de la invención las células hiperproliferativas pueden ser expuestas a polipéptidos acoplados a VP22 descritos en la presente, mediante la introducción en las células de composiciones agregadas que comprenden la protelna VP22 no covalentemente asociada con oligonucleótidos o polinucleótidos . Tales composiciones no covalentemente asociadas pueden ser producidas mediante la mezcla de oligo- o polinucleótidos con la proteína VP22 a proporciones preferidas, por ejemplo de entre 2:1 y 1 ; 1 de proteína a nucleótido. Los oligo- o polinucleótidos adecuados para formar parte de los asociados pueden comprender preferentemente al menos aproximadamente 10 bases de longitud y pueden variar ampliamente en tamaño, éstos pueden ser de aproximadamente 10 kilobases de tamaño, o por ejemplo de aproximadamente 10-100 bases en tamaño, por ejemplo aproximadamente 20 bases. El oligo- o polinucleotido puede codificar para una proteína o péptido que se desea introducir a una célula, por ejemplo, una proteína de control del ciclo celular. Alternativamente, el oligo- o polinucleótido puede ser antisentido, por ejemplo antisentido para una proteína que inhibe la apoptosis, tal como la proteína Bel, o el oligo- o polinucleótido puede tener la función de corregir defectos de empalme. Los oligo- o polinucleótidos pueden también ser quimeroplastos útiles que pueden corregir mutaciones, o éstas pueden ser moléculas que pueden formar triples hélices y funcionan para subregular la expresión del gen. Los oligo- o polinucleótidos pueden también ser ribozimas que pueden ser utilizadas para inhibir la expresión del gen objetivo, por ejemplo éstos pueden ser la ribozima cabeza de martillo sintética, u homólogos o modificaciones funcionales de la misma, que puedan reconocer y escindir el A c-myb, con lo cual inhibe la proliferación celular (Jarvis y colaboradores, J. Biol ... Chem. , 1996, 271, 29107-29112) . Cuando los polipéptidos acoplados VP22 son distribuidos a las células proliferantes mediante la introducción en las células de dichas composiciones agregadas de la proteína VP22 y los oligonucleótidos o polinucleótidos, la composición agregada puede comprender opcionalmente además una molécula de fotosensibilización, por ejemplo fluoresceína, rodamina, o TRITC, que puede ser enlazada al extremo 5' ó 3' del nucleótido sintético. Esto puede facilitar la disociación del agregado en presencia de irradiación, por ejemplo durante la fototerapia, por ejemplo, como parte de un tratamiento para el cáncer de piel o la psoriasis. Éste ser especialmente preferido para utilizar el colorante BODIPY-630/650 (de Molecular Probes, Oregon, USA) como la molécula de fotosensibilización, durante la fototerapia ya que ésta absorbe luz a una longitud de onda más alta, por ejemplo aproximadamente 630 nm y ésta penetra los tejidos corporales mejor que la luz de más baja longitud de onda. La irradiación puede ser lograda, por ejemplo, al introducirle a un paciente que va a ser tratado, un endoscopio que comprende líneas ópticas de enlace para emitir radiación. La disociación de agregados puede también ser facilitada en ausencia de luz mediante la introducción de un sitio de escisión, tal como un sitio de proteasa, o un péptido fusogénico, por ejemplo el péptido de fusión FLU. Otros ejemplos de moléculas útiles que pueden promover la disociación de los agregados en presencia de irradiación, por ejemplo durante la fototerapia, incluyen cromóforos que contienen ftalocianina, por ejemplo ftalocianina de aluminio o de zinc. Tales moléculas pueden ser administradas como parte de una composición con los agregados, o éstas pueden ser administradas separadamente no formando parte de la composición, por ejemplo mediante inyección directa en el mismo locus de los agregados o en un locus estrechamente vecino. Éste puede ser especialmente útil para administrar ftalocianina de aluminio para promover la disociación de los agregados cuando las células proliferantes son células tumorales, ya que la ftalocianina de aluminio se sabe que es preferentemente absorbida por células tumorales . La ftalocianina de aluminio puede promover la disociación de los agregados mediante irradiación con luz de una longitud de onda de aproximadamente 675 nm. Alternativamente, pueden ser utilizadas las moléculas que pueden promover la disociación de los agregados en ausencia de luz, por ejemplo cloroquina y tamoxifeno. Éstas pueden ser particularmente útiles para administrar el tamoxifeno cuando las células proliferantes son células cancerosas, por ejemplo, células de cáncer de mama. Los agentes pueden ser útilmente administrados como parte de una composición con los agregados, o separadamente no formando parte de la composición, por ejemplo mediante inyección directa en el mismo locus que los agregados, o en un locus vecino cercano. Las células hiperproliferativas pueden ser expuestas a un agente de acuerdo al paso b) o al paso c) del método de la invención, ya sea mediante administración del agente solo, o alternativamente mediante la introducción del agente acoplado a una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22. Donde dicho agente es un polipéptido o proteína éste puede ser útil para distribuir el polinucleótido de codificación, por ejemplo como una composición agregada.

Dichos agentes pueden ser distribuidos a las células diana utilizando métodos de distribución o administración previamente descritos, por ejemplo, mediante administración sistémica, administración tópica o mediante inyección directa dentro de las células diana, o alternativamente mediante el uso de sistemas de distribución, tales como liposomas. La composición terapéutica que comprende la proteína VP22 o el ácido nucleico que la codifica, puede ser acoplada o fusionada a más de una proteína no VP22 o un ácido nucleico, para formar una composición multivalente . Las composiciones multivalentes que pueden ser particularmente útiles para inducir la apoptosis celular, son composiciones que comprenden VP22 y las proteínas bax o bak y el citocrorao c, o los homólogos o fragmentos funcionalmente equivalentes de estas proteínas bax o Bak y el citocromo c, o los homólogos o fragmentos funcionalmente equivalentes de estas proteínas, particularmente por ejemplo, el dominio funcional de 19 aminoácidos de la proteína bax, denominado el dominio BH3 o los homólogos funcionales del mismo, o los ácidos nucleicos que la codifican. También particularmente útiles son las composiciones que comprenden VP22 y p53 y las proteínas acf, o los homólogos o fragmentos funcionalmente equivalentes de estas proteínas, o los ácidos nucleicos que las codifican. Otros ejemplos de composiciones multivalentes útiles son las composiciones que comprenden VP22 acoplado a más de una proteína de control del ciclo celular o el ácido nucleico que la codifica, por ejemplo, a las proteínas - que inducen la apoptosis p que detienen las células en el ciclo celular, por ejemplo en la etapa GO del ciclo celular, por ejemplo mediante el acoplamiento de VP22 a más de una proteína o fragmento peptídico funcionalmente activo o el ácido nucleico que lo codifica, seleccionado de: p27-kipl, p21-waf1/cipl , pl5-ink4b, pl6-ink4a, p57-kip2 y pl9-ARF, p53, pl8-iñk4c. Los ejemplos de fusiones especialmente preferidas ;son: una fusión que comprende la proteína VP22 y las proteínas p53 y p21-kipl y/o pl9-ARF, o los ácidos nucleicos que las codifican; y también una fusión que comprende VP22 y p53 y pl6-ink4a y/o p27-kipl, o los ácidos nucleicos que las . codifican. Puede también ser útil el acoplar VP22 a una o más proteínas para el control del ciclo .celular y adicionalmente a otras proteínas o péptidos, tales como las proteínas o péptidos que pueden funcionar como moléculas" de dirección a las células,^ por ejemplo, las cuales interactúan como receptores sobre la superficie de las células malignas. Por ejemplo, puede también ser útil acoplar VP22 al folato o la proteína transferrina .

En otro aspecto más de la invención, las composiciones multivalentes pueden comprender composiciones agregadas de la roteína VP22 no covalentemente asociada y los oligonucleótidos o polinucleótidos , en donde más de un oligo- o polinucleótido está presente. Opcionalmente, la proteína VP22 puede estar presente en dichos agregados como una proteína acoplada o de fusión, por ejemplo como una proteína de fusión VP22 multivalente. Una composición que puede ser útilmente administrada en el paso a) del método de la invención es una proteína de fusión que comprende VP22 acoplada al dominio BH3 de la proteína bak, que es un homólogo funcional del dominio BH3 de la proteína bak (EP Hollinger y colaboradores 1999, J. Biol .. Chem. , 274 (19), pp 13298-13304) y puede ser elaborada como sigue: La proteína "159-301"VP22 que consiste de los aminoácidos 159-301 de VP22 puede ser elaborada en un sistema de expresión pET de E. coli a partir de un plásmido que expresa los aminoácidos 159-301 de VP22 bajo el control de un promotor sensible a IPTG. Si es deseado un marcador his para fines de purificación, entonces éste es preferentemente colocado en el extremo C de la proteína . Un oligonucleótido de doble hebra con la siguiente secuencia correspondiente a BH3 puede ser elaborado y clonado dentro del sitio BamHI del plásmido de expresión de la proteina v 159-301 ' VP22 como se mencionó anteriormente, utilizando técnicas conocidas en la materia : ' GATCCTATGGGGCAGGTGGGACGGCAGCTCGCCATCATCGGGGACGA CATCAACCGACGCTATCGG 5' GATCCCGATAGCGTCGG TGATGTCGTCCCCGA GA GGCGAGCTGC CGTCCCACCTGCCCCATG Las hebras anteriores son complementarias tales que - la secuencia de la primera hebra desde el séptimo residuo (adenina) en la dirección 5' a 3' es complementaria con la secuencia de la segunda hebra desde el segundo residuo desde el final (timina) en la dirección 3' a 5' . Las células de E. coli BL21 pueden ser transformadas con el plásmido de expresión de la proteina BH3- ? 15.9-301 ' VP22 y un transformante de colonias simples utilizado para inocular 3.2 litros de un caldo nutritivo adecuado, tal como el caldo nutritivo L (Oxoid) y el cual también contiene kanamicina. Las bacterias recombinantes que expresan la proteina ,BH3- '159-301' VP22 pueden ser inducidas mediante adición de IPTG (1 mM) a un cultivo en.-fase logarítmica, y los concentrados se cosechan mediante centrifugación (6000 rpm, 4°C, 20 min) . Después de concentrar las células éstas pueden ser resuspendidas en 40 mi de amortiguador de lisis frió que contiene: fosfato de sodio 50 inM (pH 8.0), cloruro de sodio 300 mM, imidazol 5 mM (pH 8.0), beta- mercaptoetanol 5 mM, 1 Dg/ml de leupeptina, 1 Dg/ml de pepstatina y 1 mg/ml de lisozima. La mezcla de lisis es incubada por 30 minutos con agitación ocasional, y es luego sonicada sobre hielo tres veces por 15 segundos, seguido por la adición de 0.1 % de NP-40. La ADNasa y ARNasa son luego agregadas a 10 Dg/ml e incubada sobre hielo por 20 minutos con agitación ocasional. El lisado es luego extraído a través de una jeringa de calibre pequeño tres veces'... Esto es seguido por la centrifugación- del lisado a .,20, 000 rpm por .15 minutos a 4°C. El sobrenadante que contiene la proteina de fusión VP22-BH3 es retenido. La" proteína de fusión BH3- 159-301 ' VP22 puede ser purificada como sigue: ~ La proteína puede ser enriquecida mediante cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-sefarosa (Pharmacia) mediante el uso de un método en lotes, en ' presencia., del amortiguador de..lisis que comprende fosfato de sodio 50 mM (pH 8.0), cloruro de sodio 300 mM, imidazol 5 mM (pH 8.0) , beta-mercaptoetanol 5 mM, 0.1% de NP-40, y 1 Dg/ml de leupeptina. y. 1 Dg/ml de . pepstatina . El . eluido es luego posteriormente purificado sobre esferas de níquel-NTA en un método por lotes. La proteína es enlazada a las esferas a 4°C por 1 hora. Las esferas son luego lavadas tres veces por 30 minutos en amortiguador de lavado, que tiene la misma composición que el amortiguador de lisis, excepto que éste contiene 10% de glicerol, 0.1% de NP-40, imidazol 40 (pH 8.0). La proteína enlazada es luego eludía tres veces en 1 mi de amortiguador de elución cada vez. El amortiguador eluido tiene la misma composición que el amortiguador de lisis excepto que éste contiene 10% de glicerol, 0.1% de NP-40, imidazol 500 mM (pH 8.0). El amortiguador eluido puede ser luego intercambiado por la cromatografía en columna de Sephadex PD-10 en PBS, 10% de glicerol, ß-mercaptoetanol 5 mM. La proteína de fusión BH-3 ' 159-301 'VP22 puede ser luego utilizada en la preparación de una formulación farmacéutica estéril adecuada para la administración de un paciente, y preparada mediante la formulación de la proteína de fusión BH3- 159-301' VP22 con el material portador farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica estéril puede ser luego administrada a un paciente, por ejemplo, mediante inyección directa en una masa de células tumorales . Alternativamente, la proteína de fusión BED-'IBS-301'VP22 puede ser almacenada en PBS a -70°C, o ésta puede ser liofilizada antes del almacenamiento a -70 °C, y reconstituida antes del uso.

La proteína de fusión BH3- 1159-301' VP22 obtenida mediante el método descrito anteriormente puede también ser utilizada en la formación de composiciones agregadas que comprenden la BH3- * 159-301 'VP22 y oligo- o polinucleótidos, no covalentemente asociados. Tal composición puede ser elaborada como sigue: 22.5 µ? de la proteína BH3- ? 159-301' VP22 en PBS es agregada a 2.5 µ? de PBS y 0.5 µ? de un oligonucleótido 20 mer marcado con FITC (que parece ser una secuencia de base conveniente, disponible, complementaria a un segmento del AR m que codifica para la molécula de adhesión intracelular, o ICAM) con una secuencia como sigue: 51 CCC CCA CCA CTT CCC CTC TC 3 ' , y marcada en el extremo 5' con FITC.

La concentración final de la proteína de fusión BH3- "159-301' VP22 es de 18 µg por mi en la concentración final del oligonucleótido es de 500 nM. La mezcla es luego mezclada y se deja a temperatura ambiente por al menos 10 minutos. Ésta puede ser luego utilizada en la preparación de una formulación farmacéutica estéril, adecuada para la administración a un paciente y preparada mediante la formulación con el material portador farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica estéril puede ser luego administrada a un paciente, por ejemplo mediante inyección directa en- una masa de células tumorales . Antes de, concurrentemente con, o después de la administración de la proteína BH3 - 159-301 'VP22 , el paciente puede también ser administrado con una infusión de un agente para estimular adicionalmente la detención del ciclo celular o la apoptosis celular, por ejemplo el taxol , por ejemplo 175 mg por m2 administrados a través de un filtro en línea en un periodo de 24 horas. Cuando la proteína BH3 - 1159-301 ' VP22 es administrada como una composición agregada como se describe anteriormente, puede ser particularmente útil someter adicionalmente al paciente a terapia fotodinámica después de la administración de la composición agregada. Esto puede ser logrado, por ejemplo, mediante la introducción a un paciente de un endoscopio que comprende líneas ópticas de láser para la irradiación local, y que emite luz en el intervalo de aproximadamente 350-850 nm en la región del sitio de inyección de los agregados. Una proteína de fusión p27- ' 159-301 'VP22 puede ser elaborada en un método análogo a aquel descrito para ¦ la elaboración de una proteína de fusión BH3- ' 159-301' VP22 excepto que un oligonucleótido con una secuencia correspondiente a la secuencia p27 (GenBank Número de Acceso U10906) es elaborada y clonada dentro de los sitios Ndel y BamHI del plásmido de expresión ? 159-301' VP22.

La proteína de fusión p27- ? 159-301 'VP22 puede ser luego utilizada en la preparación de una formulación farmacéutica estéril adecuada para la administración a un paciente, y preparada mediante la formulación de la proteína de fusión p27- ? 159-301' VP22 con el material portador farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica estéril puede ser luego administrada a un paciente, por ejemplo, mediante inyección directa dentro de una masa de células tumorales. Alternativamente, la proteína de fusión ?27-?59- 301'VP22 puede ser almacenada en PBS a -70°C, o ésta puede ser liofilizada antes del almacenamiento a -70 °C, y reconstituida antes del uso. La proteína de fusión p27- ? 159-301 'VP22 obtenida mediante el método descrito anteriormente, puede también ser utilizada en la formación de composiciones agregadas que comprenden la proteína p27 159-301 ' VP22 y los oligo-o polinucleótidos no covalentemente asociados. Tal composición puede ser elaborada como sigue: 37 µ? de la proteína p27- x 159-301 'VP22 en PBS se agregan a 463 µ? de PBS y 5 µ? de un oligonucleótido ICAM de 20 mer marcado con FITC, junto con una secuencia como sigue: 'CCC CCA CCA CTT CCC CTC TC 3' La concentración final de la proteína de fusión ?27- 159-301' VP22 es de 185 pg por mi y la concentración final del oligonucleótido es de 2.5 micromolar . La mezcla es luego mezclada y dejada a temperatura ambiente por al menos 10 minutos. Ésta puede ser luego utilizada en la preparación de una formulación farmacéutica estéril adecuada para la administración a un paciente, y preparada mediante la formulación con un material portador farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica estéril puede ser luego administrada a un paciente, por ejemplo, mediante inyección directa en una masa de células tumorales . Antes de, concurrentemente con o después de la administración de la proteína p27 - ? 159-301 ' VP22 , al paciente se le puede administrar una infusión de un agente para estimular adicionalmente la detención del ciclo celular o la apoptosis celular, por ejemplo taxol, por ejemplo, 175 mg por m2 administrados a través de un filtro en línea en un periodo de 24 horas. Este ejemplo concierne a la preparación de una composición agregada que comprende (i) un fragmento de VP22, designado en la presente proteína VP22 '159-301' ,-(ii) y un oligonucleótido el cual es una ribozima de 36 mer como se describe por Jarvis, y colaboradores, J. Biol . Chem. 1996, 271, 29107-29112, que puede reconocer y romper c-myb y también inhibir la proliferación celular, y que está marcada con fluoresceína en el extremo 5', y tiene la siguiente secuencia y puede ser obtenida de Cruachem Glasgow^ Reino Unido: ' GUUUUCCCUGAU GAGGCCGAAAGGCCGAAAUUCUCC 3', todos los nucleotidos son 2 ' -O-metil-nucleótidos con la excepción de los siguientes: U en la posición U5 (por ejemplo el quinto residuo U contando desde el extremo 5' de la secuencia) , G en las posiciones G2, G13 y G9, A en las posiciones Al y A8 son 2' -hidroxil- (ribo) nucleotidos . La U en la posición U5 indica 2'.-0-alil-uridina, la ribozima descrita por Jarvis y colaboradores, tenia un enlace 2/ -C-alil-uridina en esta posición (siendo ésta la única diferencia entre la ribozima descrita aquí y aquella de Jarvis, y colaboradores) . Los enlaces 5-fosforotioato están presentes en el extremo 5' y 3'., otros enlaces son fosfodiéster.. Los agregados puede ser producidos mediante la adición del oligonucleótido 36 mer a la solución de proteínas 159-301 en PBS como se describió previamente en el ejemplo 1, de modo que las concentraciones finales en 50 µ? de solución son: 18 µg por mi (o al ternativamente 32 ]ig por mi) de proteína y oligonucleótido 500 nM. La formación de los agregados de la invención puede ser verificada _ periódicamente mediante el uso de microscopio, por ejemplo microscopio de contraste de fases o de fluorescencia, o mediante electroforesis en gel de agarosa de los agregados . La composición agregada producida puede ser luego utilizada como se mencionó previamente en la preparación de una formulación farmacéutica estéril, la cual puede ser administrada a un paciente, por ejemplo, mediante inyección directa en una masa de células tumorales. La presente invención y descripción se extiende a los métodos y composiciones y a los productos resultantes como se describen en la presente, y a las modificaciones y variaciones de los pasos y características mencionadas en la presente descripción, incluyendo todas las combinaciones y subcombinaciones de los pasos y características de la misma, incluyendo las variaciones en el orden y la selección de los pasos, y los documentos citados en ésta son incorporados por referencia en la presente, en su totalidad, para todos los propósitos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REI I DICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para reducir ...la proliferación de células,"" caracterizado porque comprende: a) la exposición de las células a una composición que comprende al menos un polipéptido : que incluye una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteina VP22 herpesviral, estando acoplado el polipéptido al menos a una de una pluralidad de secuencias de aminoácidos funcionalmente activas, seleccionadas de las proteínas o los péptidos que pueden regular la progresión del - ciclo celular, o análogos funcionales de los mismos; o exponiendo las células a composiciones terapéuticas que comprenden los ácidos nucleicos que codifican para dichas proteínas. b) la exposición de las células al menos a un agente para estimular adicionalmente la muerte celular, siendo seleccionado el agente de: los fármacos que pueden inducir la detención del ciclo celular, fármacos quimioterapéuticos citotóxicos comúnmente utilizados como parte de un tratamiento de enfermedad maligna, agentes que dañan el ADN, agentes que incrementan la sensibilidad celular al daño del ADN, y cantidades citotóxicas de radiación; y opcionalmente después del paso a) y/o del paso b) ; c) la exposición adicional de dichas células al menos a un agente que puede prevenir la exportación desde la célula, de cualquiera de los agentes administrados en a) y/o b) . 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células son células hiperproliferantes, por ejemplo células cancerosas.
3. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido acoplado puede inducir la apoptosis, o puede detener las células del ciclo celular, por ejemplo inhibidores de las cinasas dependientes de la ciclina.
4. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente que puede prevenir la exportación desde la célula de cualquiera de los agentes administrados en a) y/o b) , se selecciona de: una proteína Acf y un inhibidor ..de la proteína de resistencia a fármacos múltiples (MDR, también denominada la glicoproteína P) , por ejemplo una molécula antisentido.
5. Un método de. conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los polipéptidos acoplados a VP22 son composiciones agregadas -de VP22 no covalentemente asociada con los oligonucleótidos o los polinucleótidos .
6. Una preparación, caracterizada porque comprende (a) un producto de acoplamiento entre una proteína con la función de transporte o VP22, y una proteína que puede regular la progresión ., del ciclo celular, (b) al menos un agente para estimular adicionalmente la muerte celular, siendo seleccionado el agente de: fármacos que pueden inducir la detención del ciclo celular, fármacos quimioterapéuticos citotóxicos comúnmente utilizados como parte de., un tratamiento de enfermedades malignas, agentes que dañan el ADN, agentes que incrementan la sensibilidad celular al daño del ADN, y opcionalmente (c) al menos un agente que puede prevenir la exportación desde la célula de cualquiera de los agentes (a)' y/o (b) ; en combinación con un excipiente farmacéuticamente adecuado.
7. El uso de una preparación de conformidad con la reivindicación 6, en la fabricación de un medicamento para reducir la proliferación celular, por ejemplo la • proliferación de las células cancerosas.
8. El uso de una preparación de conformidad con la reivindicación 6, para tratar la proliferación celular, por ejemplo la proliferación de células cancerosas.