MXPA02006058A - Gen vegetal. - Google Patents

Abstract

Se describe acidos nucleicos de gDNA y cDNA que codifican a beta-amirina sintasa aislada. Los genes estan involucrados en la sintesis de saponina. Una modalidad preferida es la secuencia de nucleotidos que codifica al polipeptido del Anexo II. Tambien se proporcionan secuencias variantes (por ejemplo, alelos, derivados) y secuencias complementarias, ademas vectores, celulas huespedes, plantas polipeptidos y procesos de produccion y metodos de uso asociados, por ejemplo para influenciar o afectar la sintesis triterpenoide, y por lo tanto la resistencia a un hongo patogeno, sabor, apetibilidad o valor nutricional de la planta. Tambien se proporciona la secuencia promotora de beta-amirina sintasa y variantes y uso de la misma.

Description

GEN VEGETAL La presente invención concierne a métodos y materiales, particularmente ácidos nucleicos, para manipular los niveles de terpenoides en plantas. Concierne adicionalmente a plantas que han sido modificadas utilizando dichos métodos y materiales . ARTE PREVIO Los triterpenoides son de relevancia para una variedad de características vegetales, que incluyen apetibilidad para animales, y resistencia a patógenos y predadores. Los triterpenos son almacenados en su mayoría en las raíces de las plantas como sus glicósidos, saponinas (ver Price y colaboradores, 1987 CRC Crit Rev Food Sci Nutr 26, 27-133) . Así, por ejemplo, imitantes de especies de avena diploide, Avena strigosa que carece de la principal saponina de la raíz de la avena, avenacina A-l (denominadas mutantes deficiente de saponina o ysad' ) , se ha mostrado que se avienen con la resistencia a la enfermedad (Papadopoulu y colaboradores, 1999 Proc Nati Acad Sci 96, 12923- 12928) . Estos mutantes tienen susceptibilidad incrementada para un número de diferentes hongos que infectan la raíz, que incluyen Gaeumannomyces graminis var. trítici, que es normalmente no patógena para la avena. El análisis genético sugiere que la susceptibilidad a la enfermedad incrementada y el contenido de avenacina reducido están relacionados REF. 139474 causalmente. Además, un mutante sad que produce niveles reducidos de avenacina (alrededor de 15 % de la del tipo silvestre) da solamente síntomas de enfermedad limitados cuando se inoculan con G. graminis var. tritici en comparación con otros mutantes que carecen completamente de avenacina, proporciona un vínculo adicional entre el contenido de avenacina y la resistencia a la enfermedad. La ß-amírina es el tipo más popular de triterpeno encontrado en plantas superiores. Dos de las mutantes de Avena strigosa, designadas 610 y 109, representan diferentes alelos mutantes en el locus Sadl . Ambos de estos mutantes carecen de niveles detectables de 2, 3-oxidoescualeno ß-amirina ciclasa (en lo sucesivo denominada ß-amirina sintasa) la cual es una oxidoescualeno ciclasa y es la primera enzima que interviene en la ruta triterpenoide (ver Advances in Lipid Research, 458- 461, J. Sánchez, E. Cerda-Oledo y E. Martínez-Force (eds.), 1998). La preparación de raíces de estas dos mutantes también acumula 1 C-2, 3-oxidoescualeno y no produce niveles detectables de 14C-p-amirina cuando se alimenta con el precursor radioactivo ácido R-[2-1 C] mevalónico, indicando otra vez que la etapa que involucra la ciclización de 2,3-oxidoescualeno a ß-amirina es bloqueada. Por consiguiente parece que la ß-amirina sintasa puede desempeñar un papel significativo en la modificación de los rasgos tales como la resistencia a enfermedades en plantas. La ß-amirina sintasa ha sido clonada desde la raíz velluda de Panax ginseng por Kushiro y colaboradores (1998) Eur J Biochem 256: 238- 244. Estos investigadores usaron cebadores oligonucleótidos degenerados basados en oxidoescualeno sintasas conocidas. La planta fue seleccionada porque es una fuente de preparaciones de fármacos crudos. Una EST de soya (No. de acceso a GenBank AI900929) ha sido también identificado, el cual comparte la homología con la secuencia de ginseng. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente han tenido éxito al aislar y caracterizar un cDNA que codifica a una oxidoescualeno ciclasa de avena (A. strigosa) Esta tiene las características de ß-amirina sintasa y ha sido designada como tal en la presente. Un procedimiento inicial para clonar el gen de avena utilizando cebadores basados en la secuencia de ginseng no tuvo éxito, produjo en vez del gen que codifica el homólogo en alto grado, pero funcionalmente distinto, cicloartenol sintasa. La clonación de ß-amirina sintasa, se logró eventualmente utilizando un procedimiento de biblioteca de cDNA substractivo más complicado, basado en la expresión diferencial del . gen en diferentes partes de la raíz.

Así, en un primer aspecto de la presente invención se describe una molécula de ácido nucleico que codifica a la oxidoescualeno ciclasa de avena la cual tiene las características de ß-amirina sintasa. Las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la presente invención pueden ser proporcionadas aisladas y/ o purificadas desde su ambiente natural, en forma substancialmente pura u homogénea, o libre o substancialmente libre de otros ácidos nucleicos de las especies de origen. En donde se usa en la presente, el término "aislado" abarca todas estas posibilidades. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser integral o parcialmente sintéticas. En particular pueden ser recombinantes en cuanto a secuencias de ácido nucleico, las cuales no se encuentran juntas en la naturaleza (no evolucionan contiguamente) , han sido ligadas o de otra manera combinadas artificialmente. Alternativamente pueden haber sido sintetizadas directamente por ejemplo, usando un sintetizador automático. Pueden consistir esencialmente del gen en cuestión. El ácido nucleico conforme a la presente invención puede incluir cDNA, RNA, DNA genómico y ácidos nucleicos modificados o análogos de ácido nucleico. Se abarca, en donde una secuencia de DNA está especificada, por ejemplo con referencia a una figura, a menos que el contexto lo requiera de otra manera el RNA equivalente, con U substituida por T en donde se encuentre. En donde un ácido nucleico de la invención es mencionado en la presente, el complemento del ácido nucleico estará también comprendido en la invención. En donde se describen las secuencias de ácido nucleico genómico de la invención, están también comprendidos los ácidos nucleicos que comprenden uno o más intrones o exones de cualquiera de aquellas secuencias.

En donde un ácido nucleico (o secuencia de nucleótidos) de la invención es mencionada en la presente, el complemento de ese ácido nucleico (o secuencia de nucleótidos) estará también comprendido por la invención. El "complemento" en cada caso es de la misma extensión que la referencia, pero es 100 % complementaria de la misma por lo que en cada nucleótido es capaz de formar un par base con su contraparte. Es decir G a C y A a T o U. Las "características de la ß-amirina sintasa" significa que el polipéptido codificado tiene una actividad de ß-amirina sintasa es decir, la capacidad de catalizar la conversión de 2 , 3-oxidoescualeno en ß-amirina (ver la discusión en Kushiro y colaboradores, 1998, supra, particularmente la figura 1 del mismo) . La función ß-amirina sintasa puede ser evaluada como se expone en los Ejemplos posteriores, por ejemplo utilizando la expresión en levaduras seguida por TLC de productos biosintéticos, o por complementacion en mutantes de sad. Los ácidos nucleicos del primer aspecto pueden ser venta osamente utilizados en plantas para mejorar la resistencia contra patógenos. Por ejemplo, haciendo referencia a Papadopoulou y colaboradores (1999) supra, las enzimas que modifican los niveles de saponina tales como ß-amirina parecen desempeñar un papel en la resistencia contra hongos, típicamente las ascomicetos que tienen moléculas de esterol en sus membranas. Los oomicetos no serán patógenos objetivo para tal resistencia, pero pueden incluirse Gaeumannomyces graminis vars tritici y avenae; Fusarium culmorum; Fusarium avaceum; Stagonospora nodorum; Stagonospora avenae. Otros Ejemplos pueden ser aquellos que se exponen en "The plant Pathologists Pocket Book" 2a. Ed. compilada por Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey y publicado por Commonwealth Agricultural Bureaux, England ISBN 0851985173, particularmente en las páginas 102- 103 (que afecta a la cebada, haba, remolacha azucarera, Brassicas) ; páginas 110-113 (que afectan a la lechuga, el maíz y la avena) ; páginas 116- 121 (que afectan la papa; el arroz; centeno; sorgo; soya; abeto;fresa; caña de azúcar; girasol; tomate; trigo). Las plantas que sobre expresan a la enzima pueden ser también fuentes útiles de saponinas de triterpenos tipo oleanana para las industrias química o farmacéutica por ejemplo para uso en la preparación de fitoprotectores antimicrobianos, o fármacos. Las plantas que tienen niveles modificados de saponinas pueden también tener sabor y/ o valor nutricional modificados. Las plantas en las cuales puede ser deseable en principio ser deseable expresar, o sobre expresar, ácidos nucleicos de la presente invención pueden incluir cualquiera de las anteriormente discutidas. Pueden ser particularmente preferidas, la cebada, el frijol (phaseolus) , chícharo, remolacha azucarera, maíz; avena; solanum (por ejemplo papa) ; allium (por ejemplo ajo, cebolla y puerro) ; espárrago; té; cacahuate; espinaca; cucurbitáceas; camote; arroz, centeno; sorgo; soya; abeto; fresa; caña de azúcar; girasol; tomate; trigo (ver también Price y colaboradores, supra) . Más preferiblemente la invención es empleada utilizando arroz, trigo, maíz o cebada. Así en la modalidad de este aspecto de la invención, se describe un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleótida de la OAT ß-amirina sintasa, mostrada en el Anexo (I) o una secuencia que es degenerativamente equivalente a ésta . Esta modalidad comprende cualquier ácido nucleico aislado que codifica a la secuencia de aminoácidos de la OAT ß-aitiirina sintasa mostrada en Anexo (II) . Claramente, un ácido nucleico tal puede comprender la secuencia codificadora en el Anexo (I), o el Anexo (VIII). En un aspecto adicional de la presente invención hay ácidos nucleicos descritos que son variantes de las secuencias del primer aspecto. Una molécula de ácido nucleico variante, comparte homología con, o es idéntica a, toda o parte de la secuencia discutida anteriormente. Generalmente, las variantes pueden codificar, o ser usadas para aislar o amplificar ácidos nucleicos que codifican, polipéptidos que son capaces de modificar la síntesis terpenoide, (particularmente de triterpenoides, más particularmente la saponina) en una planta, y por lo tanto, alterar la resistencia a patógenos de esa planta, y/ o la cual específicamente enlazará a un anticuerpo cultivado contra el polipéptido de Anexo (II) . La función del triterpenoide sintético, particularmente la función ß-amirina sintasa, puede ser evaluada como se expone en los Ejemplos posteriores. Las variantes de la presente invención pueden ser ácidos nucleicos artificiales (es decir que contengan secuencias que no sean de origen natural) las cuales pueden ser preparadas por el experto en la materia a la vista de la presente descripción. Alternativamente, pueden ser nuevos, como se encuentran naturalmente, ácidos nucleicos, los : ¦ . .'¿sur?- ' éuales pueden ser aislables utilizando secuencias de la presente invención. Asi, una variante puede ser una parte o fragmento distintivo (no obstante producidos) , que corresponden a una 5 porción de la secuencia proporcionada. Los fragmentos pueden codificar partes funcionales particulares del polipéptido. Igualmente, los fragmentos pueden tener utilidad en sondear para, o amplificar, la secuencia proporcionada o unas estrechamente relacionadas. Extensiones de fragmentos, 10 y condiciones adecuadas, para tales procesos son discutidas con más detalle posteriormente. Están también incluidos ácidos nucleicos que han sido extendidos hasta el extremo 3' o 5' . Las variantes de secuencias que se encuentran 15 naturalmente pueden incluir alelos u otros homólogos (los cuales pueden incluir polimorfismos o mutaciones en una o más bases) . Las variantes artificiales (derivadas) pueden ser preparadas por los expertos en la materia, por ejemplo por mutagénesis en sitio dirigido o aleatoria, o por síntesis directa. Preferiblemente el ácido nucleico variante es generado ya sea directa o indirectamente (por ejemplo vía una o varias etapas de amplificación o de replícación) desde un ácido nucleico original que tenga todas o parte de las secuencias del primer aspecto. Preferiblemente la codifica lina ß-amirina sintasa. El término ácido nucleico "variante" como se usa en la presente abarca todas estas posibilidades. Cuando se usa en el contexto de polipéptidos o proteínas indica el producto de expresión codificado del ácido nucleico variante. Algunos de los aspectos de la presente invención conciernen a variantes que se discutirán ahora con más detalle . Homología (es decir similaridad o identidad) puede ser como se definió utilizando comparaciones de secuencias que son hechas utilizando FASTA y FASTP (ver Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63- 98). Los parámetros son preferiblemente ajustados, utilizando la matriz defectuosa, como sigue: "Gapopen", (desventaja por el primer residuo en un espacio) : -12 para proteínas / -16 para DNA "Gapext", (desventaja por residuos adicionales en un espacio) : -2 para proteínas / -4 para DNA extensión de la palabra KTUP: 2 para proteínas / 6 para DNA. La homología puede estar en una secuencia de nucleótidos y / o en el nivel de la secuencia de aminoácidos codificada. Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos y/ o de aminoácidos comparten al menos 60 %, o 70 %, o 80 % de homología, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología con la ß-amirina sintasa de avena. Así un polipéptido variante de conformidad con la presente invención puede incluir en la secuencia mostrada en el Anexo V un solo aminoácido o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 cambios, aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40 o 50 cambios, o más de aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 cambios. Además de uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos mostrada, un polipéptido variante puede incluir aminoácidos adicionales en el extremo-C y/ o extremo-N. Naturalmente, en lo que concierne a las variantes de ácido nucleico, los cambios en el ácido nucleico que no hacen diferencia en el polipéptido codificado (es decir "equivalente degenerativamente") se incluyen en el alcance de la presente invención. Así, en un aspecto adicional de la invención se describe un método de producir un ácido nucleico derivado que comprende la etapa de modificar la secuencia codificadora de un ácido nucleico del Anexo I. Los cambios en una secuencia para producir un derivado, pueden ser por uno o más de adición, inserción, eliminación o substitución de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, que conducen a la adición, inserción, eliminación o substitución de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado.

Los cambios pueden ser deseables por un número de razones, que incluyen introducir o remover las siguientes características: secuencias de endonucleasa de restricción; uso de codón, otros sitios que sean requeridos para modificación post traslación; sitios de fragmentación en el polipéptido codificado; motivos en el polipeptido codificado (por ejemplo sitios de enlace) . Secuencias líder u otras objetivo (por ejemplo, regiones de anclaje hidrofóbicas) pueden añadirse o removerse de la proteína expresada para determinar su localización después de la expresión. Todas estas pueden auxiliar en clonar y expresar eficientemente un polipéptido activo en forma recombinante (como se describe a continuación) . Otra mutación deseable puede ser mutagénesis en sitio dirigido o aleatoria a fin de alterar la actividad (por ejemplo especificidad) o estabilidad del polipéptido codificado . Los cambios pueden ser a modo de variación conservadora, es decir substitución de un residuo idrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la substitución de un residuo polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por aspargina. Como es bien sabido por los expertos en la materia, alterar la estructura primaria de un polipéptido por medio de una substitución conservadora no puede alterar significativamente la actividad de ese péptido porque la cadena lateral del aminoácido que es insertado en la secuencia puede ser capaz de formar enlaces y contactos similares como la cadena lateral del aminoácido que ha sido substituido. Esto es asi igualmente cuando la substitución es en una región que es critica para determinar la conformación de péptidos. También están incluidas variantes que tienen substituciones no conservadoras. Como es bien sabido por los expertos en la materia, substituciones en regiones de un péptido que no son criticas para determinar su conformación no pueden afectar mayormente su actividad porque no alteran mayormente la estructura tridimensional del péptido. En regiones que son criticas para determinar la conformación o actividad de los péptidos, tales cambios pueden conferir propiedades ventajosas al polipéptido. Verdaderamente, cambios tales como los descritos anteriormente pueden conferir propiedades ligeramente ventajosas al péptido, por ejemplo, estabilidad o especificidad alterada. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método de identificar y/ o clonar una variante de ácido nucleico desde una planta cuyo método emplea una sonda o cebador de la presente invención. Plantas objetivo incluyen (pero no se limitan a) arroz, maíz, trigo, cebada, alfalfa, garbanzo, frijol y chícharo. Un oligonucleótido para uso en reacciones de sondeo o amplificación comprende o consiste de aproximadamente 48, 36 o menos nucleótidos de extensión (por ejemplo 18, 21 o 24) . Generalmente cebadores específicos ascienden a más de 14 nucleótidos de extensión. Para especificidad óptima y efectividad de costo, pueden preferirse los cebadores de 16-30 nucleótidos de extensión. Los expertos en la materia son también versados en el diseño de cebadores, para uso en procesos tales como PCR. Si se requiere, el sondeo puede hacerse con fragmentos de restricción del gen completo descrito en la presente que puede ser de 100 o igualmente 2000 o más nucleótidos de extensión. Generalmente hablando, dos clases de sonda/ cebador forman parte de la presente invención. Por ejemplo, una clase de cebador, tipificado por lo mostrado en la Tabla 1, es distintivo en el sentido de que está basado en cualquier región presente en la secuencia de ß-amirina sintasa descrita en la presente, pero no en cualquier región de las secuencias no relacionadas estrechamente del arte previo (por ejemplo las secuencias de soya o de ginseng discutidas en supra) . "Basada en" en este sentido puede significar que el cebador es encontrado en o es degenerativamente equivalente a la región de la ß-amirina sintasa, o su complemento. Se muestran ejemplos en la Tabla í. Tales cebadores tendrán utilidad no solamente en la manipulación de la secuencia ß-amirina sintasa de avena, sino también en aquellas en las que se espera estén más estrechamente relacionadas a, por ejemplo genes de ß-amirina sintasa de monocotiledóneas, tales como aquellos de arroz, maíz, trigo, cebada, etc. Una segunda clase de cebador, tipificado por lo mostrado en la Tabla 2, es genérico en el sentido de que está basado en regiones de genes de ß-amirina sintasa (o genes relacionados) que parecen ser conservados entre por ejemplo las secuencias de soya/ ginseng y la secuencia de avena. Tales cebadores, desarrollados sobre la base del gen de ß-amirina sintasa de avena, tendrá utilidad para manipular las secuencias de amirina sintasa y las secuencias relacionadas en general. Tales cebadores también incluyen cualquiera que esté basado en el motivo DCTAE conservado presente en las secuencias de aminoácidos predichas de varias enzimas biosintéticas de triterpeno de diferentes especies (ver anexo VI) . Una clase adicional de cebadores es mostrada en la Tabla 3, que fue usada en los ejemplos sucesivos para amplificar regiones de la secuencia genómica del gen de ß-amirina sintasa de avena. Otros cebadores, mostrados en los Ejemplos siguientes, y usados para identificar la secuencia genómica, estuvieron basados en la secuencia de cDNA (AMYstaF5 basada en el codón de iniciación, y AMYendR5 basada en la región de UTR 3' ) . Algunos otros cebadores de la invención son designados ASEQl-4 en los Ejemplos posteriores. En una modalidad, la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente puede ser usada en una base de datos (por ejemplo de marcas de la secuencia expresada, o sitios marcados de la secuencia) buscando encontrar secuencias homologas, tales como las que pueden ponerse a disposición en la ruta, y productos de expresión debidos de los cuales pueden ser probados para actividad como se describe posteriormente. En una modalidad adicional, una variante de conformidad con la presente invención es también obtenible por medio de un método que incluye: (a) proporcionar una preparación de ácido nucleico por ejemplo de células vegetales, (b) proporcionar una molécula de ácido nucleico, la cual es una sonda como se describió anteriormente, (c) poner en contacto el ácido nucleico en la preparación con la molécula de ácido nucleico bajo condiciones para hibridización de la molécula de ácido nucleico para cualquier gen u homólogo en la preparación, e identificar el gen u homólogo si están presentes por medio de su hibridización con la molécula de ácido nucleico.

El sondeo puede emplear la técnica estándar de manchado Southern. Por ejemplo el DNA puede ser extraído de las células y digerido con diferentes enzimas de restricción, Los fragmentos de restricción pueden entonces ser separados por electroforesis sobre gel de agarosa, antes de desnaturalización y de transferencia a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada puede ser hibridizada en los fragmentos de DNA sobre el filtro y enlace determinados. El DNA para sondeo puede ser preparado desde preparaciones de RNA de células. El ácido nucleico de prueba puede ser proporcionado desde una célula como DNA, cDNA o RNA genómico, o una mezcla de cualquiera de éstos, preferiblemente como una biblioteca en un vector adecuado. Si se usa el DNA genómico, la sonda puede usarse para identificar regiones no transcritas del gen (por ejemplo promotores etc.), tal como se describe posteriormente. El sondeo puede ser hecho opcionalmente por medio de los denominados "microelementos de ácido nucleico" (ver Marshall & Hodgson (1998) Nature Biotechnology 16: 27-31, para una revisión) . Pueden efectuarse experimentos preliminares por medio de hibridización bajo condiciones de baja severidad. Para sondeo, las condiciones preferidas son aquellas que son suficientemente severas para ser un simple patrón con un número pequeño de hibridizaciones identificadas como positivas, que pueden ser investigadas adicionalmente . Por ejemplo, la selección puede llevarse a cabo inicialmente bajo condiciones, que comprenden temperatura de aproximadamente 37 °C o menos, una . concentración de formamida de menos de aproximadamente 50 %, y una sal de baja a moderada concentración (por ejemplo, Citrato Salino Estándar ("SSC") = cloruro de sodio 0.15 M; citrato de sodio 0.15 M; pH 7) . Alternativamente, una temperatura de aproximadamente 50 °C o menos y una sal superior (por ejemplo "SSPE"= 0.180 M de cloruro de sodio; 9 mM de bifosfato disódico; 9 M de bifosfato sódico; 1 mM de EDTA sódico; pH 7. Preferiblemente la selección se lleva a cabo aproximadamente 37 °C, una concentración de formamida aproximadamente 20 o , y una concentración salina aproximadamente 5 X SSc, o una temperatura aproximadamente 50 °C y una concentración salina aproximadamente 2 X SSPE. Estas condiciones permitirán la identificación de secuencias que tengan un grado substancial de homología (similaridad, identidad) con la secuencia sonda, sin requerir la homología perfecta para la identificación de un híbrido estable. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo para detección de secuencias que son aproximadamente 80- 90 % idénticas, hibridización toda la noche a 42 °C en Na2HP04 0.25 M, H 7.2, SDS al 6.5 %, sulfato de dextrano al 10 % y un lavado final a 55 °C en 0.1 X SSC, SDS al 0.1 %. Para detección de secuencias que son más de 90 % idénticas, las condiciones adecuadas incluyen hibridización toda la noche a 65 °C en Na2HP04 0.25 M, pH 7.2, SDS al 6.5 %, sulfato de dextrano al 10 % y un lavado final a 60 °C en 0.1 SSC, SDS al 0.1 %. Es bien sabido en el arte incrementar la severidad de la hibridización gradualmente hasta que solamente queden unos cuantos clones positivos. Las condiciones adecuadas se lograrían cuando un gran número de fragmentos hibridizadores sean obtenidos mientras que la hibridización de fondo sea pobre. Utilizando estas condiciones pueden ser investigadas bibliotecas de ácido nucleico, por ejemplo bibliotecas de cDNA representativas de secuencias expresadas. Los expertos en la materia son bien capaces de emplear condiciones adecuadas de la severidad deseada para hibridización selectiva, tomando en cuenta factores tales como la extensión de oligonucleótidos y la composición base, temperatura y así sucesivamente. Una fórmula común para calcular las condiciones de severidad requeridas para lograr la hibridización entre moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia especificada es (Sambrook y colaboradores, 1989) : Tm= 81.5 °C + 16.6 Log [Na+] + 0.41 (% de G + C) ^ 0.63 (% de forraamida) - 600 / # bp en dupleto. Como una ilustración de la fórmula anterior, utilizando [Na+] = [0.368] y 50 - % de formamida, con contenido de GC de 42 % y un tamaño de sonda promedio de 200 bases, el Tm es 57 °C. La Tm de un DNA dupleto disminuye en 1 - 1.5 °C con cada disminución de 1 % de homología. Así, objetivos con más de aproximadamente 75 % de identidad de secuencia se observaría que usen una temperatura de hibridización de 42 °C. Una secuencia tal se consideraría substancialmente homóloga a la secuencia de ácido nucleico de la presente invención. El enlace de una sonda a un ácido nucleico objetivo (por ejemplo DNA) puede medirse utilizando cualquiera de una variedad de técnicas a la disposición del experto en la materia. Por ejemplo, las sondas pueden ser marcadas radioactivamente, fluorescentemente o enzimáticamente . Otros métodos que no incluyen el marcado de sondas incluyen amplificación utilizando PCR (ver posteriormente) o fragmentación de RN'asa. La identificación de hibridización exitosa es seguida por aislamiento del ácido nucleico que fue hibridizado, que puede involucrar una o más etapas de PCR o amplificación de un vector en un huésped adecuado. Así, una modalidad de este aspecto de la presente invención es el ácido nucleico que incluye o que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos hibridizable con cualquier cuencia codificadora proporcionada en la presente. Otra manera de buscar esto seria para el ácido nucleico de conformidad con este aspecto, ser hibridizable con una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia codificadora proporcionada en la presente. Por supuesto, el DNA es generalmente de doble hebra y las técnicas de manchado tales como hibridización Southern son efectuadas a menudo después de la separación de las hebras sin que se distinga entre cual de las hebras está la hibridizadora . Preferiblemente el ácido nucleico hibridizable o su complemento codifica a un producto capaz de influenciar una característica de resistencia de una planta, particularmente vía modificación de la síntesis triterpenoide . En una modalidad adicional, la hibridización de una molécula de ácido nucleico en una variante puede ser determinada o identificada indirectamente, por ejemplo utilizando una reacción de amplificación de ácido nucleico, particularmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . La PCR requiere el uso de dos cebadores para amplificar el ácido nucleico objetivo, así preferiblemente son usados dos cebadores como se describió anteriormente. Utilizando RACE PCR, puede usarse una "aleatorización" (ver "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis y colaboradores, Academic Press, New York, (1990) ) .

Así puede llevarse a cabo un método que involucre el uso de PCR para obtener el ácido nucleico de conformidad corla presente invención como se describe anteriormente, pero utilizando un par de cebadores de moléculas de ácido nucleico útiles en (por ejemplo adecuadas para) PCR, al menos uno de los cuales es un cebador de la presente invención como se describió anteriormente. En cada caso anterior, si es necesario, los clones o fragmentos identificados en la búsqueda pueden ser extendidos. Por ejemplo si se sospecha que están incompletos, la fuente de DNA original (por ejemplo biblioteca de clones, preparación de mRNA etc.) puede ser revisitada para aislar porciones olvidadas por ejemplo usar secuencias, sondas o cebadores basados en esa porción que ha sido ya obtenida para identificar otros clones que contengan secuencias sobrepuestas. Los métodos descritos anteriormente pueden también ser usados para determinar la presencia de una de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en el contexto genético de una planta individual, opcionalmente una planta transgénica, que puede ser producida como se describe con más detalle posteriormente. Esto puede ser útil en programas de reproducción vegetal por ejemplo, para seleccionar directamente plantas que contengan alelos que sean responsables de rasgos deseables en esa especie vegetal, ya sea en plantas progenitoras o en la progenie (por ejemplo híbridos, Fl, F2, etc.). Así, el uso de marcadores nuevos particulares definidos en los Ejemplos siguientes, o marcadores que puedan ser designados por los expertos en la materia con base en la información de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente, forman parte de la presente invención. Como se usa de aquí en adelante, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, el término "ácido nucleico de ß-amirina sintasa" se entiende que cubre cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención descritos anteriormente que incluyen variantes funcionales. En un aspecto de la presente invención, el ácido nucleico de la ß-amirina sintasa descrito anteriormente está en la forma de un vector recombinante y preferiblemente replicable . "Vector" está definido para incluir, ínter alia, cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario Agrobacterium en forma circular o lineal de doble o de una sola hebra que puede o no puede ser auto transmisible o movilizable, y que puede transformar huésped procariótico o eucariótico, ya sea por integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (por ejemplo plásmidos que se replican autónomamente con un origen de replicación) . Específicamente están incluidos vectores de doble éfecto por lo que se quiere decir un vehículo de DNA capaz, naturalmente o por diseño, de replicación en dos diferentes organismos huéspedes, los cuales pueden ser seleccionados de actinomicetos y especies relacionadas, bacterias y eucarióticas (por ejemplo células vegetales superiores, de mamíferos, de levaduras o de hongos) . Un vector que incluye un ácido nucleico conforme a la presente invención no necesita incluir una secuencia promotora u otra secuencia reguladora, particularmente si el vector es para ser usado para introducir el ácido nucleico en células para recombinación en el genoma. Preferiblemente el ácido nucleico en el vector está bajo el control de, y operablemente unido a, un promotor u otros elementos reguladores apropiados para transcripción en una célula huésped tal como un microbio, por ejemplo bacteria, o célula vegetal. El vector puede ser un vector de expresión bi-funcional que funciona en huéspedes múltiples. En el caso de DNA genómico, éste puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de cDNA éste puede estar bajo el control de un promotor apropiado o de otros elementos reguladores para expresión en la célula huésped. Por "promotor", se quiere decir una secuencia de nucleótidos desde la cual puede iniciarse la transcripción de DNA operablemente unido de 5' a 3' (es decir en la dirección de 3' en el sentido de la hebra de DNA de doble hebra) . "Operablemente unido" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente posicionado y orientado para transcripción para ser iniciada desde el promotor. El DNA operablemente unido a un promotor está "bajo regulación de iniciación transcripcional" del promotor . Así este aspecto de la invención proporciona una construcción genética, preferiblemente un vector replicable, que comprende un promotor operablemente unido a una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención, tal como la a-amirina sintasa o una variante de la misma. Generalmente hablando, los expertos en la materia son bien capaces de construir vectores y de diseñar protocolos para la expresión genética recombinante . Los vectores adecuados pueden ser seleccionados o construidos, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, que incluyan secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias que sean apropiadas. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a. Edición, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (o ediciones posteriores de este trabajo) . Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis (ver la discusión anterior con respecto a variantes), formación de secuencias, introducción de DNA en células y expresión genética, y análisis de proteínas, son descritas en detalle en Current Protocols in Molecular Blology, Segunda Edición, Ausubel y colaboradores, Eds., John Wiley & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook y colaboradores, y Ausubel y colaboradores se incorporan a la presente como referencia . En una modalidad de este aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción genética, preferiblemente un vector replicable, que comprende un promotor inducible operativamente unido a una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención. El término "inducible" cuando se aplica a un promotor se entiende bien por los expertos en la materia. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible es "iniciada" o incrementada en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles causan niveles bajos o no detectables de expresión (o ninguna expresión) en ausencia tíe los estímulos apropiados. Otros promotores inducibles causan expresión constitutiva detectable en ausencia del estimulo. Cualquiera que sea el nivel de expresión es en ausencia del estimulo, la expresión desde cualquier promotor inducible es aumentada en la presencia del estimulo correcto. Son de particular interés en el presente contexto construcciones de ácido nucleico que operan como vectores vegetales. Procedimientos y vectores específicos previamente usados con amplio éxito en plantas son descritos por Guerineau y Mullineaux (1993) (Plant transformation and expressión vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121- 148) . Los promotores adecuados que operan en plantas incluyen "Cauliflower Mosaic Virus 35S" (CaMV 35S) . Otros ejemplos son descritos en la página 120 de Lindsey & Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture" Pub. OU Press, Milton Keynes, Reino Unido. El promotor puede ser seleccionado para incluir uno o más elementos o motivos de secuencia que confieran desarrollo y/ o control regulador de expresión especifico de tejido. Los promotores vegetales inducibles incluyen el promotor inducido de etanol de Caddick y colaboradores (1998) Nature Biotechnology 16: 177- 180. Puede desearse usar un promotor constitutivo fuerte tal como el promotor de ubiquitina, particularmente en monoctiledóneos .

Si se desea, los marcadores genéticos seleccionados pueden ser incluidos en la construcción, tal como los que confieren fenotipos seleccionables, tales como resistencia a antibióticos o herbicidas (por ejemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato) . La presente invención también proporciona métodos que comprenden la introducción de una construcción tal en una célula huésped, particularmente una célula vegetal. En un aspecto adicional de la invención, se describe una célula huésped que contiene una construcción heteróloga de conformidad con la presente invención, especialmente una célula vegetal o microbiana. El término "heterólogo", es usado ampliamente en este aspecto para indicar que el gen/ secuencia de nucleótidos en cuestión (un gen de ß-amirina sintasa) ha sido introducido en dichas células de la planta o un ancestro de la misma, utilizando ingeniería genética, es decir por medio de la intervención humana. Un gen heterólogo puede reemplazar un gen equivalente endógeno, es decir uno que normalmente efectúa la misma o similar función, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endógeno u otra secuencia. Los heterólogos de ácidos nucleicos en una célula vegetal pueden no encontrarse de manera natural en células de ese tipo, variedad o especies. Así los ácidos nucleicos heterólogos pueden comprender una secuencia codificadora de o derivada de un tipo particular de célula vegetal o especies o variedades vegetales, colocadas en el contexto de una célula vegetal de un tipo o especies o variedades vegetales diferentes. Una posibilidad adicional es para una secuencia de ácido nucleico, ser colocada en una célula en la cual el o un homólogo se encuentra naturalmente, pero en donde la secuencia de ácido nucleico está unida o /y adyacente al ácido nucleico el cual no se encuentra naturalmente en la célula, o células de ese tipo o especie o variedad de planta, tal como unido operablemente a una o más secuencias reguladoras, tal como una secuencia promotora para control de expresión. La célula huésped (por ejemplo célula vegetal) es preferiblemente transformada por medio de la construcción, lo cual quiere decir que la construcción queda establecida en la célula, que altera una o más de las características de las células y por consiguiente el fenotipo por ejemplo con respecto a síntesis triterpenoide y/o resistencia a hongos patógenos. El ácido nucleico puede ser transformado en células vegetales utilizando cualquier tecnología, tal como un Ti-plásmido vector desactivado llevada a cabo por Agrobacterium que explota su capacidad de transferencia genética natural (EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12 (22) 8711 - 87215 1984), bombardeo de partícula o de microproyectil (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616) microinyección (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green y colaboradores (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press) , electroporación (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser) otras formas de captación directa de DNA (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), captación de DNA mediada por liposoma (por ejemplo Freeman y colaboradores Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984) ) , o el método por vórtice (por ejemplo, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d) Los métodos físicos para la transformación de células vegetales son revisados en Orad, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11. La transformación por Agrobacterium es usada ampliamente por los expertos en la materia para transformar especies dicotiledóneas. Recientemente, ha habido substancial progreso hacia la producción rutinaria de plantas transgénicas fértiles, estables en casi todas las plantas monocotiledóneas relevantes económicamente (ver por ejemplo, Hiei y colaboradores (1994) The Plant Journal 6, 271- 282) ) . El bombardeo de microproyectiles, electroporación y captación directa de DNA son preferidos en donde Agrobacterium sola es ineficiente o inefectiva. Alternativamente, puede emplearse una combinación de técnicas diferentes para mejorar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo bombardeo con micropartículas recubiertas de Agrobacterium (EP-A-486234 ) o bombardeo de microproyectiles para inducir lesión seguido por co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233) . Será obvio para los expertos en la materia que la selección particular de un sistema de transformación para introducir el ácido nucleico en células vegetales no es esencial para o una limitación de la invención, ni lo es la selección de la técnica para regeneración vegetal. Asi, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método de transformar una célula vegetal que involucra la introducción de una construcción como se describió anteriormente en una célula vegetal y ocasionar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma celular de la planta para introducir un ácido nucleico de conformidad con la presente invención en el genoma. La invención abarca adicionalmente una célula huésped transformada con ácido nucleico o un vector de conformidad con la presente invención (por ejemplo que comprenda la secuencia de ß-amirina sintasa de avena) especialmente una célula vegetal o microbiana. En la célula vegetal transgénica (es decir transgénica por el ácido nucleico en cuestión) el transgen puede estar en un vector extra genómico o incorporado, preferiblemente establemente, en el genoma. Puede haber más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por genoma haploide.

Generalmente hablando, después de la transformación, una planta puede ser regenerada, por ejemplo desde células únicas, tejido calloso o discos de hoja, como es estándar en el arte. Casi cualquier planta puede ser completamente regenerada desde las células, tejidos y órganos de la planta. Las técnicas disponibles son revisadas en Vasil y colaboradores, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and IIIr Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weissbach y eissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989. La generación de plantas transgénicas fértiles se ha logrado en los cereales, arroz, maíz, trigo, avena, y cebada (revisada en Shimamoto, K. (1994) Current Opinión in Biotechnology 5, 158 - 162.; Vasil, y colaboradores (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain y colaboradores, 1995, Biotechnology Advances 13 (4) : 653 - 671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 página 702) . Se proporcionan también plantas que incluyen una célula vegetal de conformidad con la invención. Además de la planta regenerada, la presente invención comprende todos los siguientes: un clon de una planta tal , progenie híbrida o pura y descendientes (por ejemplo los descendientes Fl y F2) y cualquier parte de cualquiera de éstas. La invención también proporciona partes de tales plantas por ejemplo, cualquier parte que pueda ser usada en reproducción o propagación, sexual o asexual, incluye esqueje, semillas y asi sucesivamente, o que pueda ser un producto per se, por ejemplo grano. Una planta de conformidad con la presente invención puede ser una que no sea reproducida verdaderamente en una o más propiedades. Pueden excluirse variedades de plantas, particularmente variedades de plantas registrables de conformidad con Plant Breeders' Rights. La invención proporciona adicionalmente un método para influenciar o afectar la naturaleza o grado de la síntesis triterpenoide (por ejemplo ß- amirina) en una planta, y por lo tanto opcionalmente su resistencia a un hongo patógeno, el método que incluye la etapa de causar o permitir expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo como se discutió anteriormente en las células de la planta. Este aspecto involucra preferiblemente el uso de la secuencia del anexo I (o el polipéptido del anexo II) . Están comprendidos también métodos análogos para alterar el sabor, apetibilidad etc. de una planta. La etapa puede ser precedida por la etapa previa de introducción del ácido nucleico en una célula de la planta o un ancestro de ésta. La discusión precedente concierne generalmente a los usos de los ácidos nucleicos de la presente invención para producción de polipéptidos de ß-amirina sintasa funcionales en una planta, con lo cual aumenta su resistencia a patógenos. Sin embargo la información descrita en la presente puede también ser usada para reducir la actividad o niveles de tales polipéptidos en células en las cuales se desea hacerlo. La reducción de la síntesis triterpenoide y de metabolitos secundarios posterior. Los triterpenoides exhiben una amplia variedad de funciones en sistemas biológicos y en principio su sub-regulación puede ser deseable para modificar estas funciones. Por ejemplo la apetibilidad de una planta puede mejorarse reduciendo los niveles de estos compuestos. La información de la secuencia descrita en la presente puede usarse para la sub-regulación de la expresión de los genes por ejemplo utilizando tecnología anti-sentido (ver por ejemplo Bourque, (1995), Plant Science 105, 125- 149); la regulación en el sentido [co-supresión] (ver por ejemplo Zhang y colaboradores, (1992) The Plant Cell 4, 1575 -1588) . Opciones adicionales para sub regulación de expresión genética incluyen el uso de ribozimas, por ejemplo ribozimas martillo, que pueden catalizar la fragmentación en sitio específico de RNA, tal como mRNA (ver por ejemplo Jaeger (1997) "The new world of ribozymes" Curr Opin Struct Biol. 7: 324 - 335. Al usar secuencias genéticas parciales o de genes anti-sentido para subregular la expresión genética, una secuencia de nucleótidos es colocada bajo el control de un promotor en una "orientación inversa" de modo que la transcripción produzca RNA el cual es complementario al mRNA normal transcrito desde la hebra en el "sentido" del gen objetivo. Ver, por ejemplo, Rothstein y colaboradores, 1987; Smith y colaboradores, (1998) Nature 334, 724 - 726; Zhang y colaboradores, (1992) The Plant Cell 4, 1575 - 1588, English y colaboradores, (1996) The Plant Cell 8, 179 - 188. La tecnología antisentido es también revisada en Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490 - 3496. Una alternativa para anti-sentido es usar una copia de todo o parte del gen objetivo insertado en el sentido, esto es la misma orientación que el gen objetivo, para lograr la reducción de la expresión del gen objetivo por co-supresión. Ver por ejemplo, van der Krol y colaboradores, (1990) The Plant Cell 2, 291 - 299; Napoli y colaboradores, (1990) The Plant Cell 2, 279- 289 y US-A-5, 231 , 020. Refinamientos adicionales de la tecnología de co-supresión o del gen silenciador pueden encontrarse en WO 95/34668 (Biosource) ; Angelí Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16, 12: 3675 -3684; y Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: pag. 553. Las metodologías de ácido nucleico y las asociadas para llevar a cabo la sub-regulación (por ejemplo secuencias complementarias) forman parte de la presente invención. La presente invención también abarca el producto de expresión de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de la ß-amirina sintasa (particularmente de la ß-amirina sintasa funcional) descrita anteriormente, adicionalmente también métodos para elaborar el producto de expresión por expresión desde ácido nucleico codificador por lo tanto bajo condiciones adecuadas, que puede ser en células huéspedes adecuadas . Un polipéptido preferido incluye la secuencia de aminoácidos mostrada en el Anexo II. Sin embargo un polipéptido conforme a la presente invención puede ser una variante (alelo, fragmento, derivado, mutante u homólogo etc.) del polipéptido que se muestra en el anexo II. El alelo, variante, fragmento, derivado, mutante u homólogo puede tener substancialmente la función ß-amirina sintasa de la secuencia de aminoácidos mostrada en el Anexo II. También abarcados en la presente invención están polipéptidos que aunque claramente relacionados a un polipéptido de ß-amirina sintasa de avena funcional (por ejemplo, son inmunológicamente reactivos cruzadamente con el polipéptido de ß-amirina sintasa de avena, o tienen motivos de secuencia característicos en común con el polipéptido de ß-amirina sintasa) no tiene más extensión que la función ß-amirina sintasa. Después de la expresión, el producto recombinante puede, si se requiere, ser aislado del sistema de expresión.

Generalmente sin embargo los polipéptidos de la presente invención serán usados in vivo (en particular in planta) . La ß-amirina sintasa de avena purificada o la proteina variante, producida recombinantemente por expresión desde ácido nucleico codificador por lo tanto, puede ser usada para cultivar anticuerpos empleando técnicas que son estándares en el arte. Los métodos para producir anticuerpos incluyen inmunizar a un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o un fragmento de la misma. Los anticuerpos pueden obtenerse desde animales inmunizados utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el arte, y deben ser seleccionados, preferiblemente utilizando el enlace del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de manchado Western o de inmunoprecipitación (Armitage y colaboradores, 1992, Nature 357: 80 - 82). Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales . Como una alternativa o suplemento para inmunizar a un mamífero, los anticuerpos con especificidad de enlace apropiada pueden ser obtenidos desde una biblioteca producida recombinantemente de regiones variables de inmunoglobulina expresada, por ejemplo utilizando el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso que exhiben regiones de enlace de inmunoglobulina funcionales o sus superficies; por ejemplo Los anticuerpos cultivados en un polipéptido o péptido pueden usarse en la identificación y/ o aislamiento de polipéptidos homólogos, y entonces los genes codificadores. Asi, la presente invención proporciona un método de identificar o aislar un polipéptido con función ß-amirina sintasa (de conformidad con las modalidades descritas en la presente) , que incluye seleccionar péptidos o polipéptidos candidatos con un polipéptido que incluye la región de enlace antigénico de un anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo completo o un fragmento del mismo) que sea capaz de enlazar a un péptido, polipéptido o fragmento, variante de ß-amirina sintasa de avena o variante de la misma o preferiblemente tenga especificidad de enlace por dicho péptido o polipéptido, de modo que tenga una secuencia de aminoácido identificada en él. Los miembros de enlace especifico tales como anticuerpos y polipéptidos que incluyen regiones de enlace antigénico de anticuerpos que enlazan y son preferiblemente especificas para un péptido o polipéptido o imitante, variante de ß-amirina sintasa o derivados de la misma representan aspectos adicionales de la presente invención, asi como su uso y métodos que los emplean. Péptidos o polipéptidos candidatos para seleccionar pueden por ejemplo, ser los productos de una biblioteca de expresión creada utilizando derivados de cido nucleico desde una planta de interés, o puede ser el producto de un proceso de purificación desde una fuente natural. Además de las partes codificadoras del gen de ß-amirina sintasa de avena, y de los productos de expresión, también están comprendidas en la presente invención partes no transcritas del gen. Asi, un aspecto adicional de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada que codifica al promotor del gen de la ß-amirina sintasa de avena. Esto se muestra en los Anexos de secuencias posteriores. También están incluidas variantes de homólogos, o porciones, del promotor, que tengan "actividad promotora", es decir, la capacidad de iniciar la transcripción. El nivel de actividad promotora es cuantificable por ejemplo por evaluación de la cantidad de mRNA producida por transcripción desde el promotor o por evaluación de la cantidad de producto de proteina producido por translación de mRNA producido por transcripción desde el promotor. La cantidad de un mRNA especifico presente en un sistema de expresión puede determinarse por ejemplo utilizando oligonucleótidos específicos que sean capaces de hibridizar con el mRNA y que estén marcados o puedan ser usados en una reacción de amplificación específica tal como la reacción en cadena de la polimerasa. El uso de un gen indicador facilita la determinación de la actividad promotora con referencia a la producción de proteína. El gen indicador preferiblemente codifica a una enzima que cataliza una reacción que produce una señal detectable, preferiblemente una señal detectable visualmente, tal como un producto coloreado. Se conocen muchos ejemplos, que incluyen ß-galactosidasa y luciferasa. La presencia y/ o cantidad de producto genético que resulta de la expresión del gen indicador puede determinarse utilizando una molécula capaz de enlazar el producto, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo. La molécula de enlace puede ser marcada directa o indirectamente utilizando una técnica estándar. Los expertos en la materia tienen conciencia de una multitud de genes indicadores posibles y técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar actividad promotora. Cualquier indicador / ensayo puede ser usado y se apreciaría que ninguna selección, particular es esencial a o una limitación de la presente invención. Las variantes de homólogos pueden prepararse o identificarse de manera similar a la descrita anteriormente en relación a la secuencia codificadora. Para encontrar elementos mínimos o motivos responsables para actividad o regulación, enzima o nncleasaa de restricción pueden ser usadas para digerir una molécula de ácido nucleico, o puede emplearse mutagénesis, seguida por un ensayo apropiado (por ejemplo usar un gen indicador tal como luciferasa) para determinar la secuencia requerida. El ácido nucleico que comprende estos elementos o motivos forma parte de la presente invención. Ciertas regiones del promotor que se cree que enlazan a factores de transcripción (basado en análisis computacional) son identificadas en los anexos de secuencias posteriores. Tales fragmentos que incluyen una o más de estas regiones, y que tienen actividad promotora, pueden preferirse particularmente . En un aspecto adicional de la invención se proporciona una construcción de ácido nucleico, preferiblemente un vector de expresión, que incluye la región promotora del gen de la ß-amirina sintasa de avena o fragmento, mutante, derivado u otro homólogo o variante del mismo capaz de promover transcripción, operablemente unido a un gen heterólogo, por ejemplo una secuencia codificadora, que preferiblemente no sea la secuencia codificadora con la cual el promotor está operablemente unida en la naturaleza. La invención será ahora descrita adicionalmente con referencia a los siguientes Ejemplos y Anexos no limitativos. Los expertos en la materia encontrarán otras modalidades de la invención a la vista de los mismos. Anexos (I)- cDNA de OAT ß-amirina sintasa (secuencia de nucleótidos) (II) - cDNA de OAT ß-amirina sintasa (secuencia de aminoácidos ) (III) - ortls.pk001.cl4 (clon EST de oxidoescualeno ciclasa putativa desde Avena strigosa) (IV)- CLUSTAL W (1.8) alineación múltiple de secuencia de 6 clones que codifican el extremo 5' de una oxidoescualeno ciclasa desde A. Strigosa (V) - CLUSTAL W (1.8) alineación múltiple de secuencia de 6 clones que codifican el extremo 3' de una oxidoescualeno ciclasa desde A. Strigosa (VI) - Alineación del motivo DCTAE en las secuencias de aminoácidos predichas de enzimas biosintéticas de triterpenos de diferentes especies (VII) - Alineación de la ß-amirina sintasa con cicloartenol sintasa de A. Strigosa (VIII) - La secuencia genómica completa (desde el codón de inicio translacional (ATG) al codón de detención (TGA) de la ß-amirina sintasa desde Avena strigosa . Letras mayúsculas representan los exones y letras minúsculas representan los intrones . Los sitios de unión de empalme fueron predíchos de conformidad con la secuencia de cDNA y por utilización de la página web "localizador del gen BCM" del Baylor College of Medicine y la página web "Splice Site Prediction by Neural Network" de la University of California. El gen consiste de 18 exones y 17 intrones.

(IX) - La secuencia completa de los 1941 bp del promotor de la ß-amirina sintasa. La iniciación del codón de inicio de translación está dada en letras mayúsculas. La iniciación del sitio de inicio de transcripción está subrayada y fue predicha utilizando la página web "Promoter Prediction by Neural Network" de la University of California. La secuencia tatataa subrayada representa la señal TATA putativa predicha con el programa interactivo HCtata (Hamming-Clustering Method for TATA Signal Prediction in Eukaryotic Genes) en la página web "WEBGENE" del Institute of Advanced Biomedical Technologies (ITBA) . (X) - Análisis computacional de la región promotora utilizando el programa Matlnspector en la página web Genomatix de Alemania. Este reveló varios sitios de enlace del factor de transcripción putativo. Los parámetros usados para la búsqueda fueron: sección de plantas de la base de datos, similaridad de Núcleo 0.75 y similaridad de Matriz 0.85. Encima y en la parte inferior de la posición del sitio de enlace putativo se da el nombre, la dirección del sentido (+ ) o antisentido (-) , la secuencia consensus y la similaridad de matriz del factor de transcripción correspondiente . Tablas Tabla 1-Cebadores específicos para amplificar ß-amirina sintasa de A. Strigosa Tabla 2-Cebadores para amplificar ß-amirina sintasas Tabla 3- Cebadores para amplificar la secuencia genómica de ß-amirina sintasa. Los códigos de M = A o c R = A o G W = A o T S = C 0 G Y = C o T K = G o T V = A 0 C o G H = A o C o T G = A o G o T B = C o G o T N - A o C o G Búsqueda por Blast El Análisis BLAST que utiliza la secuencia de cDNA parcial (clon ortls.pk001.cl4) Búsqueda Blastx adicional que utiliza la secuencia de ß-amirina sintasa. EJEMPLOS Ejemplo 1 - construcción de bibliotecas de cDNA de raíz de avena Se construyeron y se secuenciaron dos bibliotecas de cDNA utilizando técnicas estándares. Estas bibliotecas de cDNA fueron todas derivadas de A. strigosa con número de acceso S75 (del Institute of Grasslands and Environmental Research, Aberystwyth, Gales, Reino Unido) . Las bibliotecas fueron las siguientes: 1. ortls: Una biblioteca sustractiva derivada de RNA de material de la punta de la raíz (terminal de 5 rom) de avena tipo silvestre (WT) sustraída, contra RNA del resto de la raíz. 2„ortlf: Una. biblioteca de cDNA de extensión total derivada de DNA de las puntas de la raíz de la línea de avena WT (sin. sustraer) ortls:. Una biblioteca austractiva de cDNA de La punta de la raíz WT (S75) vs. el resto de la raíz Las semillas de A. strigosa (WT). fueron esterilizadas en la superficie con hipoclorito de sodio al 5 % y se lavaron varias veces con agua desionizada estéril. Después de un tratamiento frío por 48 horas a 4 °C, las semillas fueron colocadas en placas que contenían, papel filtro húmedo y se dejaron germinar a 24 °C en la obscuridad. Las puntas de la raíz (terminal de 5 mm) y el resto de la raíz fueron colectadas desde siembras de 3 días. Se extrajo el RNA total desde ambos tejidos usando el Mini Equipo Rneasy Plant de Qiagen. Para el aislamiento de mRNA se usó el equipo de Purificación de mRNA Dynabeads de Dynal. La síntesis de DNA complementario desde ambas poblaciones de mRNA y la construcción de la biblioteca se efectuó con el Equipo de Síntesis de cDNA SMART PCR y el Equipo de Sustracción de cDNA PCR-Select de Clontech, de conformidad con las instrucciones del fabricante. El cDNA de la punta de la raíz se usó como "probador" y el cDNA derivado del resto de la raíz, se usó como "conductor". Los fragmentos de cDNA amplificado fueron purificados y se terminaron con (200 mM de ATP) de T q DNA palimerasa por 30 miautos a 70 °C. Cuatro reacciones idénticas de ligación se efectuaron utilizando 1 mi (60 ng) del cDNA terminado y 0.5 mi (25 ng) del pGEM-T vector (Promega) por 16 horas a 4 °C con 3 unidades de ligasa (Promega) . Las reacciones fueron conjuntadas y la mezcla se purificó utilizando el Equipo de Purificación por PCR de Qiagen. Se utilizó 1 mi (2 ng) de la mezcla de ligación purificada para transformar 10 mi de células competentes ELECTROMAX DH10B (Gibco BRL) por electroporación (Calvin NM, y colaboradores, J. Bacteriol. 170 (6), 2796 -2801, 1988) . Ortlf: Biblioteca de cDNA 1-ZAP especifico de la punta de la raíz de WT (S75) . La cosecha del material de la punta de la raíz, la extracción del RNA total y el asilamiento de mRNA se efectuaron como se describió previamente para la construcción de la biblioteca de ortls. Se sintetizó el DNA complementario con el Equipo de Síntesis de ZAP-cDNA de Stratagene y la biblioteca fue clonada en el Vector que Expresa ZAP de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se generaron clones de plásmidos desde cada placa de fago positiva por escisión in vivo , utilizando el fago auxiliar ExAssit y la cepa de E. coli SOLR, de conformidad con el manual del Equipo de Clonación de ZAP-cDNA Gigapack III Gold (Stratagene) . Ejemplo 2 - aislamiento de un cDNA parcial predicho para codificar ß-amirina sintasa de Avena strigosa utilizando una sonda de cDNA predicha para codificar una oxidoesqualeno ciclasa identificada por medio del análisis de la secuencia de DNA. de la biblioteca de cDNA ortls El análisis de la secuencia de DNA de la biblioteca de cDNA ostls identificó una secuencia de cDNA parcial (clon ortls .pkOOl . cl4 ) con homología a oxidoescualeno ciclasas (ver el anexo III) . Este clon fue usado como una sonda para seleccionar la bublioteca de cDNA de extensión completa ortlf de la raíz de avena. Aproximadamente 450,000 placas de fago fueron plaqueadas sobre 6 placas de NZY (5 g/1 de NaCl, 2 g/1 de MgS0 .7H20, 5 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de hidrolizado de proteína u 15 g/1 de agar, pH 7.5) conforme a procedimientos estándares (Sambrook J y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) y el levantamiento de la placa se efectuó sobre membranes de Hybond-N+ (Amersham) siguiendo las instrucciones del fabricante. El clon ortls.pk001.cl4 fue cortado con Kpnl/PstI y el inserto de 300 bp fue purificado con el Equipo de Extracción de Gel QIAquick de Qiagen. Se marcaron 5 mi (100 ng) del inserto con 32P por medio de "cebado aleatorio" que utiliza el Equipo de Oligomarcado de Pharmacia y se purificó utilizando la columna de Pharmacia Sephadex G-50 NICK. La hibridización se efectuó en regulador Church (500 mM de regulador de fosfato, SDS al 7 %, 1 mM de EDTA y BSA al 1%) por 16 horas a 65 °C. Los filtros se lavaron 3 veces por 15 minutos con 40 mM de regulador de fosfato, SDS al 5 % y 1 mM de EDTA a 65 °C, seguido por 3 lavados por 15 min con 40 mM de regulador de fosfato, SDS al 2 % y 1 mM de EDTA a 65 °C y tres lavados por 15 minutos a 60 °C con 40 mM de regulador de fosfato, SDS al 1 % y 1 mM de EDTA. Más de 300 clones de fagos positivos fueron identificados desde la primera selección. Una segunda y tercera selección se llevó a cabo con 12 clones hibridizadores (que dan diferente fuerza de señales de hibridización) siguiendo las mismas condiciones de hibridización y de lavado como las señaladas anteriormente. De estos 12 clones, 8 fueron confirmados como positivos después de las segunda y tercera rondas de selección. Se generaron clones de plásmidos desde cada placa de fago positiva por escisión in vivo, utilizando el fago auxiliar ExAssist y la cepa de E. coli SOLR, conforme al manual del Equipo de Clonación ZAP-cDNA Gigapack III Gold (Stratagene) . El análisis de la secuencia de DNA de los insertos correspondientes se efectuó con el Secuenciador de DNA ABI PRISM 377XL, que utiliza el Equipo Terminador BigDye (Perking Elmer) y los cebadores T3 y T7. El análisis de la secuencia de DNA de los extremos 5' y 3' de estos clones indicó que 6 de los 8 clones de fagos positivos contuvieron la secuencia de extensión total predicha de la oxidoescualeno ciclasa putativa desde A. strigosa, y esos clones compartieron identidad en los extremos 5' (388 bp) y 3' (328 bp) . Estos clones fueron denominados amy7AS amylOAs, amyllAs, amyl5As, amyl6As y amy23As (ver los Anexos IV y V) . A fin de obtener la secuencia completa de cDNA de la oxidoescualeno ciclasa de extensión total, se usaron 4 cebadores delanteros desde diferentes regiones del cDNA. ASEQ1 : GCATTGGCCTGGTGATTA, ASEQ2 : GCCCATGAGGTGGTCACA, ASEQ3 : GGCGCGTGATTATTGTGC, ASEQ4 : CATGAACTCGTGCGCCTT . Los cDNAs fueron también digeridos con diferentes enzimas de restricción. Los siguientes fragmentos de restricción fueron ligados individualmente en el vector pBluescript S + (Stratagene) : dos fragmentos EcoRI de 1100 bp y 200 bp respectivamente; un fragmento EcoRI/Xbal de 1300 bp; un fragmento HindIII/Xbal de 2300 bp y un fragmento HindIII/BamHI de 300 bp. Estos cinco subclones fueron usados también para determinar la secuencia completa de cDNA de la oxidoescualeno ciclasa putativa (Anexo I) junto con parte de las secuencias 3' y 5' sin trasladar. La iniciación y terminación de los puntos de traslación están sombreados. El análisis de la estructura primaria se llevó a cabo con el ProtParam Tool en el "Expert Protein Analysis System" (ExPASy) servidores proteómicos del Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) . La secuencia de aminoácidos deducida, reveló una proteina de 757 aminoácidos, un peso molecular predicho (MW) de 86860.8 daltones y un pl teórico de 5.99 (Anexo II) . El análisis computacional (ScanProsite Tool, ExPASy) reveló la existencia de 4 motivos QW conservados con la estructura consensus [K/R][G/A]X2-3[F/Y/ ][L/I/V]X3QX2-5GXW (Poralla y colaboradores TIBS 19, 157- 158, 1994), los cuales son característicos de las oxidoescualeno ciclasas. La secuencia consensus característica DCTAE (subrayada) del sitio de la enzima putativa activa, está también presente en una posición similar a la de triterpeno ciclasas de otra planta en el banco de datos (Abe I y Prestwich GD, Lipids 30, no. 3, 1995) . Los Anexos siguientes dan la secuencia de aminoácidos deducida completa de cDNA de la oxidoescualeno ciclasa de A. strigosa, la alineación del motivo DCTAE en las secuencias de aminoácidos predichas de enzimas biosintéticas de triterpeno predichas de diferentes especies, y la alineación de la oxidoescualeno ciclasa predicha con artenol sintasa de A. strigosa. Ejemplo 3 - evidencia adicional de que el cDNA codifica a ß-amirina sintasa 1) Expresión en levaduras El cDNA de oxidoescualeno sintasa se demostró que codifica a ß-amirina sintasa por expresión en levaduras {Saccharomyces cerevlslae) . Dos clones de cDNA completos (amylOAs y amylSAs) , que contenían diferentes extensiones de la secuencia líder sin trasladar 5' , fueron digeridas con BamHI/Xbal. Los insertos fueron purificados con el Equipo de Extracción de Gel QIAquick de Qiagen y ligados en el sitio BamHI/Xbal del vector de expresión pYES2 (Invítrogen) de 5' a 3' del promotor Gall. Estos clones fueron transformados en la cepa mutante de levadura GIL77 (Gollub EG y colaboradores J. Biol. Chem 252, 2846- 2854, 1977), por el método de acetato de litio (Rose MD y colaboradores Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 1990) . La cepa mutante GIL77 es un ergosterol auxotrofo y carece de la actividad sintasa del lanosterol. Por consiguiente acumula 2, 3- oxidoescualeno . La selección de los transformantes fue hecha sobre medio SC-U [1.7 g/1 de Base Nitrogenada de Levadura (Difco), 5 g/1 de (NH4)2S04 (SIGMA) , 20 g/1 de rafinosa (BDH) , 0.77 g/1 de "Uracil Drop Out Supplement" (Suplemento desprovisto de Uracilo) (Clontech) , 20 mg/ml de ergosterol (SIGMA) , 13 mg/ml de hemina (SIGMA) y 5 mg/ml de T een 80 (SIGMA)] a 30 °C. Los transformantes fueron desarrollados en 50 mi de medio líquido YPD completo (Clontech) suplementado con ergosterol (20 mg/ml) , hemina (13 mg/ml) y Tween 80 (5 mg/ml) a 30 °C por 60 h. Las células fueron centrifugadas y resuspendidas en 50 mi de medio líquido SC-U que contenía en vez de rafinosa, galactosa al 2 % (BDH) . El cultivo fue desarrollado por 24 horas a 30 °C con agitación (200 rpm) . Las células fueron colectadas por centrifugación y reflujadas con 3 mi de KOH al 50 %/ etanol al 50 % por 10 minutos a 95 °C. La solución fue extraída dos veces con hexano y el sobrenadante fue secado por congelación en un vacío por rotación. El comprimido fue resuspendido en 120 mi de metanol grado HPLC (BDH) y 20 mi fueron analizados sobre una placa de TLC de gel de sílice en fase normal (MERCK) la cual fue desarrollada con 1:1 de hexano/acetato de etilo (BDH) . La placa de TLC fue visualizada por medio de manchado con anisaldehído (ácido acético al 96 %, ácido sulfúrico al 2 % y p-anisaldehído al 2 %, SIGMA) después de incubar la placa por 5 minutos a 160 °C (Saponins, K.

Hostettmann y A. Marston (eds.), Cambridge University Press, 1995) . A fin de confirmar el valor de Rf de los productos, fueron cargados en el TLC 10 mg de estándares de ß-amirina y cicloartenol (Apin Chemicals Ltd) . Como un control positivo y negativo se usaron la construcción pYES2 que albergan cDNAs de la ß-amirina o el cicloartenol sintasa de Panax ginseng respectivamente (Kushiro y colaboradores Eur J Biochem 256, 238 - 244, 1998) . Ambos cDNAs de oxidoescualeno ciclasa putativa (amylOAs y amyl5As) fueron expresados exitosamente en levaduras y confirmados para codificar a ß-amirina sintasa de A. strigosa. 2) Expresión en mutantes de sad Se extrajo el R A total del tejido de la raíz de 9 mutantes de A. strigosa deficientes en saponina (números 610, 109, 1027, 791, 825, 616, 376, 1139 y 9; Proc Nati Acad Sci 96, 12923- 12928, 1999) utilizando el Mini Equipo Rneasy Plant de Qiagen. El RNA fue analizado sobre gel de agarosa con formaldehido al 1.2 % y se transfirió sobre membrana de Hybon-N+ (Amersham) con 20X SSC (NaCl 3 M, citrato de sodio 0.3 M, BDH) por procedimientos estándares (Sambrook J. y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) . El clon amylOAs fué cortado con BamHI/Xbal y el inserto se purificó con el Equipo de Extracción de Gel QIAquick de Qiagen. Se marcaron 4 mi del inserto con ¿P por "cebado aleatorio"" utilizando el Equipo de Oligomarcado de Pharmacia y se purificó utilizando una columna Sephadex G-50 NICK de Pharmacia. Se efectuó la hibridización en regulador Church (500 mM de regulador de fosfato, SDS al 7 %, 1 mM de EDTA y BSA al 1 %) por 16 horas a 65 °C. El filtro se lavó 3 veces por 15 minutos con 40 mM de regulador de fosfato, SDS al 5 % y 1 mM de EDTA a 65 °C, seguido por 3 lavados por 15 minutos con 40 mM de regulador de fosfato, SDS al 2 % y 1 M de EDTA a 65 °C y un lavado por 15 minutos con 40 mM de regulador de fosfato, SDS al 1 % y 1 mM de EDTA. Los mutantes 610 y 109 representan diferentes alelos mutantes en el locus Sadl, y, y ambos carecen de niveles detectables de ß-amirina sintasa. Los resultados del análisis por manchado northern mostraron que los niveles de mRNA de ß-amirina sintasa son substancialmente reducidos en mutantes sadl, pero no en los otros mutantes de sad (todos los cuales tienen actividad ß-amirina sintasa) . Ejemplo 4 - Aislamiento del clon genómico de la ß-amirina sintasa desde A. strigosa A fin de clonar la secuencia genómica total de la ß-amirina sintasa desde Avena strigosa se designó un par cebador con base en la secuencia de cDNA, el cebador AMYstaF5 (5'-CCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGG-3') que contenia el codón de iniciación de traslación desde el extremo 5' y, el cebador AMYenc (S'-TATTTCTCAZ^AGAAAATAACGCATGAATGCTC) desde el extremo 3' no trasladado, fueron usados. Aproximadamente 400 ng de DNA genómico de alto peso molecular fueron usados como molde en una reacción de 50 µ? con 350 µ? de dNTPs, 300 nM de cada cebador y 2.5 unidades de Expand™ Long Témplate polimerasa (Roche) . Las condiciones de reacción fueron 94 °C 2 minutos, 94 °C por 10 segundos, 65 °C por 30 segundos, 68 °C por 6 minutos para un total de 9 ciclos, siguiendo por 94 °C por 10 segundos, 65 °C por 30 segundos, 68 °C por 6 minutos + 20 segundos/ ciclo para un total de 19 ciclos y un ciclo final de 68 °C por 7 minutos. Una sola banda de aproximadamente 7.4 Kb fue excisada del gel y purificada con el Equipo de Extracción de Gel de Qiagen. En la banda purificada fue terminado el DNA por 30 minutos a 70 °C en una reacción de 50 µ? utilizando 200 µ? de dATP y 5 unidades de Taq DNA polimerasa (Gibco-BRL) . Para la reacción de ligación 2 µ? de la banda de DNA terminado fueron mezclados con 1 µ? de vector pGEM-T (Promega) en un volumen final de 10 µ?. La ligación se efectuó con 3 unidades de T4 DNA ligasa (Promega) O/N a 4 °C. La mezcla de ligación fue purificada con el Equipo de Purificación por PCR de Qiagen y 1 µ? se usó para transformar 10 µ? de células DH10B (Gibco-BRL) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se sometieron dos clones independientes a secuenciación automática utilizando el Secuenciador de DNA ABI PRISM 377XL y el Equipo Terminador Bi.gDye (Perking Elmer) . Los cebadores mostrados en la Tabla 3 fueron usados a fin de cubrir la secuencia genómica completa al menos dos veces. Ejemplo 5 - Aislamiento del promotor de ß-amirina sintasa desde A. strigosa A fin de aislar la secuencia de ß-amirina sintasa que regula la expresión genética, se usó un procedimiento modificado del "Extender PCR" (AJH Brown y colaboradores) y el protocolo modificado del "GenomeWalker" (Clontech) , Inicialmente un cebador delantero: ADPR-ApaF: 5'- TGCGAGTAAGGATCCTCACGCAAGGAATTCCGACCAGACAGGCC-3' y un cebador inverso ADPR-ApaR: 3'- H2N-CTGTCCGG-PO«-5' fueron designados a fin de generar un adaptador sintético. Aproximadamente 6 nmoles de cada cebador fueron mezclados con 10 µ? de regulador de ligación 10X (Roche) en un volumen de reacción final de 100 µ?. Los cebadores fueron templados en un Ciclizador Térmico PTC-200 (MJ-Research) , utilizando las siguientes condiciones: 95 °C por 3 minutos, 93.5 °C por 1 minuto -1.5 °C / ciclo por un total de 48 ciclos . A fin de generar las "bibliotecas" para la amplificación de PCR, 5-6 µg de DNA genómico de alto peso molecular desde A. strigosa, fueron digeridos con las enzimas de restricción Dral, EcoRV, PvuII, Seal y Stul (Roche) . Estas reacciones fueron efectuadas en un volumen final de 100 µ? con 80 unidades de cada enzima por 16 h a 37 °C. Después de digestión el DNA de cada "biblioteca" fue purificado utilizando el Equipo de purificación por PCR (Qiagen) y resuspendido en un volumen final de 28 µ? de Tris-HC1 pH 8.5. se mezclaron 4 µ? (600 ng) de DNA de cada biblioteca con 0.8 µ? (50 pmoles) del adaptador sintético en un volumen final de 8 µ?. Se efectuó la ligación toda la noche (16 horas) a 16 °C con 5 unidades de T4 DNA ligasa (Roche) . El DNA ligado con adaptador de cada biblioteca fue diluido con 72 µ? de H20 estéril y almacenado a -20 °C. La amplificación de la secuencia objetivo de cada "biblioteca" se llevó a cabo utilizando 10 ng de DNA molde ligado-adaptador, 20 pmoles de cebador adaptador: PR11F (5'-TGCGAGTAAGGATCCTCACGCAAG-3') combinado con un cebador especifico para ß-amirina: AMY8R (5'-TCAGCCACGGACCGCCGCCCTCACCTATT-3') , 200 µ? de dNTPs y 1 unidad de Expand High Fidelity DNA polimerasa (Roche) . Las condiciones de reacción fueron 94 °C por 3 minutos, 94 °C por 25 segundos, 72 °C por 3 minutos por un total de 7 ciclos seguidos por 94 °C por 25 segundos, 67 °C por 3 minutos por un total de 31 ciclos y un ciclo final de 67 °C por 7 minutos. Una dilución 1/50 de cada reacción de PCR se usó a fin de efectuar una segunda ronda de amplificación utilizando el cebador del adaptador incluido : PR22F (5'-CACGCAAGG¾ATTCCGACCAGACA-3') , y un segundo cebador especifico para ß-amirina, A Y9R (5*-TTAGCCTCCACATGGTGCGCACCAACAACG-3') . Las condiciones de reacción fueron 94 °C por 3 minutos, 94 °C por 25 segundos, 72 °C por 3 minutos por un total de 5 ciclos seguidos por 94 °C por 25 segundos, 67 °C por 3 minutos por un total de 20 ciclos y un ciclo final de 67 °C por 7 minutos. Todos los productos de PCR fueron subsecuentemente fraccionados de tamaño sobre gel de agarosa al 1 %. Tres bandas solas de 1.4 Kb, 1.0 Kb y 0.7 Kb fueron excisadas desde la "biblioteca de Dral, EcoRV y Stul respectivamente y purificadas con el Equipo de Extracción de Gel de Qiagen. Los fragmentos de DNA. fueron terminados por 30 minutos a 70 °C en una reacción de 50 µ? utilizando 200 µ? de dATP y 5 unidades de Taq DMA. polimerasa (Gibco-BRL) . Para la reacción de ligación 2 µ? de la banda de DNA terminado fueron mezclados con 1 µ? de vector pGEM-T (promega) en un volumen final de 10 µ? . La ligación se efectuó con 3 unidades de T4 DNA ligasa (Promega) por 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de ligación fue purificada con el Equipo de Purificación por PCR de Qiagen y se usó 1 µ? para transformar 10 µ? de células DH10B (Gibco-BRL) conforme a las instrucciones del fabricante. Dos clones independientes de cada banda fueron sometidos a secuenciación automática usando el Secuenciador de DNA ABI PRISM 377XL y elEquipo Termlnador BígDye (Perking Elmer) . Los 76 bp de secuencia directamente de 3' a 5' del sitio del cebador AMY9R especifico para ß-amirina fueron idénticos al predicho desde el extremo 5' de la secuencia de cDNA de ß-amirina de A. strígosa en los tres clones. Esta secuencia fue seguida por aproximadamente 1.25 kb de secuencia nueva en el fragmento Dral, 0.85 kb en el fragmento EcoRV y 0.55 kb en el fragmento Stul. Todos los fragmentos incluyeron una secuencia encuadrada TATA, 92 bp de 3' a 5' de la iniciación del codón de inicio de traslación (ATG) , que indica que esto fue probablemente la región promotora del gen. A fin de aislar más secuencias nuevas de la región reguladora del gen de la ß-amirina sintasa, un segundo camino de 3' a 5' fue llevado a cabo utilizando las mismas bibliotecas ligadas- adaptador. Los dos nuevos cebadores específicos para ß-amirina, AMYPROl0R (5'-GGACATCGAGGTGGTTGCATTTTAGTGGATC-3') y AMYPROllR {5'-GGTGCTCTTGCTTGTTCTATGGCCTCGTCTTT-3') fueron designadas con base en la secuencia promotora de 1.25 kb aislada. Para la primera y segunda amplificación se usaron, el cebador PR11F en combinación con el cebador AMYPROl0R y el cebador PR22F en combinación con el cebador AMYPROllR, respectivamente. Las condiciones de reacción fueron idénticas a las descritas anteriormente para el primer camino de 3' a 5' . Este generó un producto de aproximadamente 950 bp en una sola banda en la "biblioteca" EcoRV. La banda fue excisada del gel y purificada con el Equipo de Extracción de Gel de Qiagen. Después de la reacción de terminación de DNA estándar (descrita anteriormente) el fragmento fue ligado en el vector pGEM-T (Promega) . La mezcla de ligación fue purificada con el Equipo de Purificación por PCR de Qiagen y se usó 1 µ? para transformar 10 µ? de células DH10B (Gibco-BRL) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se sometieron dos clones independientes a secuenciación automática utilizando el Secuenciador de DNA ABI PRISM 377XL y el Equipo Terminador Big Dye (Perking Elmer) . Los 200 bp de secuencia directamente de 3' a 5' del sitio del cebador AMY11R especifico para ß-amirina fueron idénticos al del fragmento Dral de 1.25 kb aislado en el primer paso, seguido por 720 bp de secuencia nueva. Esto extendió el extremo 5' del gen por 0.7 kb adicionales para dar un total de aproximadamente 1.9 kb de secuencia de 3' a 5' del sitio de inicio transcripcional . El análisis computacional de la región promotora que utiliza el programa Matlnspector en la página web Genomatix en Alemania reveló varios sitios de enlace del factor de transcripción putativo (ver Anexo) . Los parámetros usados ?*':'J'*'^ir la búsqueda fueron: Sección dé plantas del banco de datos, símílaridad de Núcleo 0.75 y similaridad de Matriz 0.85. Los resultados estadísticos fueron: En 0 sec. 0 coincidencias en P$AG 01 (Agamous) 5 En 1 sec. 5 coincidencias en P$ATHB1_01 (proteína 1 encuadrada de Arabidopsis thaliana horneo ) En 1 sec. 19 coincidencias en P$DOF1_01 (factor de transcripción indicando solo zinc- Dofl/ MNBla En 1 sec. 8 coincidencias en P$GAMYB_01 (gen myb de 0 cebada regulado por GA) En 1 sec. .2 coincidencias en P$GBP_Q6 (proteínas de enlace del cuadro- G En 1 sec. 1 coincidencia en P$MYBPH3_01 (proteína de petunia híbrida similar a Myb) 5 En 0 sec. 0 coincidencias en P$O2_01 (Opaco-2) En 1 sec. 19 coincidencias en P$PBF_01 (PBF(MPBF)) En 1 sec. 4 coincidencias en P$P_01 (genes biosintéticos flavonoides del activador P de maíz) En 1 sec 5 coincidencias en P$SBF1_01 (SBF-1) 0 En 0 sec. 0 coincidencias en P$bZIP910_01 (factor de transcripción bZIP de Antirrhinum majus) REFERENCIAS Brown AJH, Perry, Saunders SE y Burke JF (1999) Extender PCR: A method for the isolation of sequences 5 regulating gene expression from genomic DNA. Biotechniques 26 (5) , 804- 806. Quandt ?, Frech ?, Karas ?, Wíngender ? y erner T (1995) Matlnd y Matlnspector - New fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data. Nucleic Acids Research 23, 4878 - 4884.

Anexos - Secuencias & resultados de BLAST (I)-cDNA de OAT ß-amirina sintasa (secuencia de nucleótidos) 1 10 20 30 40 50 60 70 ATTGCTT6 TTTCCTCGCATACACTGCCCGTTGTTGGTGCGCACCATCTG6AGGCTAACAATAGGTGA6G6 CGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGCTTCCTTGGCCGCCAAGTGTGGGAGTACGACGCCGATGCCG GCACGCCGG GAGCGTGCCGAGGTTGAGAGGGTGCGTGCGGAATTCACJ^GAACAGG TCCAGAGGAAG GÁGTCACAGGACCTTCTTCTACGCTTGCAGTACGCLAAMGACAACCC CTTCCGGCGAATATTCCGACAGA AGCCAAGCTTGAAAAGAGTACAGAGGTCACTCACGAGACTATCTACGAATCATTGATGCGAGCTTTACATC AATATTCCTCTCTACAAGC-AGACGATGGGCATTGGCCTGGTGATTACAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCT ATCATTATATTCTCTTTATATGTTACTAGATCACTTGACACCTTTTTATCTCCGGAACATCGTCATGAGAT ATGTCGCTACATTTAC-AATCAACAGAATGAAGATGGTGGTTGGGGAFTAAATGGTTCTTGGCCCAAGTACCA TGTTTGGATCGTGTATGAATTATGCAACCTTAATGATTCTTGGCGAGAAGCGAAATGGTGATCATAAGGAT GCATTGGAAAAAGGGCGTTCTTGGATTTTATCTCATGGAACTGCAACTGCAATACCACAGTGGGGAAAAAT ATGGTTGTCGATAATTGGCGTTTACGAATGGTCAGGAAACAATCCTATTATACCTGAATTGTGGTTGGTTC CACATTTTC TCCGATTCACCCAGGTCGTTTTTGGTGTTTTACCCGGTTGATATACATGTCAATGGCATAT CTCTATGGTAAGAAATTTGTTGGGCCTATTAGTCCTACAATATTAGCTCTGCGACAAGACCTCTATAGTAT ACCTTACTGa¾ACATTAATTGGGACAAGGCGCGTGATTATTGTGCAAAGGAGGACCTTCATTACCCAC6CT CACGGGCACAAGATCTTATATCTGGTTGCCTAACGAAAATTGTGGAGCCAATTTTGAATTGGTGGCCA6CA AACAAGCTAAGAGATAGAGCTTTAACTAACCTCATGGAGC^^ TGTGGGCATTTGCCCTATTAACAAGGCATTGAACATGATTTGTTGTTGGGTAGAAAACCCAAATTCGCCTG AATTCCAACAACATCTTCCACGATTCCATGACTATTTGTGGATGGCGGAGGATGGAATGAAGGCACAGGTA TATGATGGATGTCATAGCTGGGAACTAGCGTTCATAATTCATGCCTATTGTTCCACGGATCTTACTAGCGA GTTTATCCCGACTCTAAAAAAGGCGCACGAGTTCATGAAGAACTCACAGGTTCTTTTQWCCACCCAAATC ATGAAAGCTATTATCGCC-ACAGATCAAAAGGCTCATG^ TCTGATTGTACTGCGGAAGCTGTTAAGGCATTGCTACTATTATCAAAGATATCCGCTGACCTTGTTGGCGA TCC¾ATAAAACAAGAC-AGGTTGTATGATGCCATTGATTGCATCCTATCTTTCATGAATACAGATGGAACAT TTTCTACCTACGAATGCAAACGGACATTCGCTTGGTTAGAGGTTCTCAACCCTTCTGAGAGTTTTCGGAAC ATTGTCGTGGACTATCCATCTGTTGAATGCACATCATCTGTGGTTGATGCTCTCATATTATTTAAAGAGAC GAATCCACGATATCGAAGAGCAGAGATAGATAAATGCATTGAAGAAGCTGTTGTATTTATTGAGAACAGTC AAAATAAGGATGGTTCATGGTATGGCTCATGGGGTATATGTTTCGCATATGGATGCATGTTTGCAGTAAGG GCGTTGGTTGCTACAGGAAAAACCTACGACAATTGTGCTTCTATC1AGGAAATCATGCAAATTTGTCTTATC AAAGCAACAAACAACAGGTGGATGGGGTGAAGACTATCTTTCTAGTGACAATGGGGAATATATTGATAGCG GTAGGCCTAATGCTGTGACCACCTCATGGG-AATGTTGGCTTTAATTTATGCTGGACAGGTTGAACGTGAC CCLA6TACC¾CTGTATAATGCTGOVAGACAGCTAATGAATATGCAGCTAGAAACAGGTGACTTCCCCCAACA GGAACACATGGGTTGCTTCAACTCCTCCTTGAACTTCAACTACGCCAACTACCGCAATCTATACCCGATTA TGGCTCTTGGGGAACTTCGCCGTCGACTTCTTGCGATTAAGAGCTGATATGGAAACAAACATGGATGTCTA GGCTGCGAGGAATAAGAACATTGCTCCCACGAGCATTCATGCGTTATTTTCTTTGAGAAATAAGTTCTCTT CCTACCGATGTCATCATGTAACTTTTCGGAATATTTTATGTGT (II)-cDNA de OAT ß-amirina sintasa (secuencia de aminoácidos) MVmLTIGEGGGPWLKSNNGFLGRQVWEYDADAGTPEER^ NIPTEAKl^STEOTHETIYBSLMJU^ IC YIYNQQtfóD GWGFMVL STMFGSC^YATIiMI-^^ IIGVYEWS<-M8PIIPELWLVPHFIiPIHPGR^ DKARDYC-AKEDIjaYPRSRAQDLlSGCLraiVEPIIJ^ MlCCWVENraSPBFiXJHLP Hl- rL ^ QVLFNHPNHESYYRHRS GSWTLSSVDNGWSVSDCTA^ TDGTFSTYECKRTFAWl^Vl^PSESFRNIVWYPSVECTSSVVDALILF^ QNKDGSVTYGSWGICFAYGCMFAVRALVATG TYNCA§IRKSCKFVLSKQQTTGGW A TTSVAMLAIJ^AGQVERDPVPL NAA QLMI^ RLLAIKS (III) - ortls.pk001.cl4 (clon EST de oxidoescualeno ciclasa putativa de Avena strigosa ACAGAGGTCACTCACGAGACTATCTACGAATCATTGATGCGAGCTTTACATCAATATTCCT CTCTACAAGCAGACGATGGGCATTGGCCTGGTGATTACAGTGGGATTCTCTTCATTATGCC TATCATTATATTCTCTTTATATGTTACTAGATCACTTGACACCTTTTTATCTCCGGAACAT CGTCATGAGATATGTCGCTA ATTTACAACC^ACAGAATGAAGATGGTGGTTGGGGAAAAA TGGTTCTTGGCCCAACGT (IV)CLUSTAL W (1.8) alineación de secuencias múltiple de 6 clones que codifican el extremo 5" de oxidoescualeno ciclasa putativa de A. strigosa amyl6As ACCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGGCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGC 60 amy23As ACCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGGCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGC 60 amy7As CCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGGCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGC 60 amyllAs ACCATGTGGAGGC AACAATAGGTGAGGGCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGC 60 amylOAs AGCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGNCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGC 60 amylSAs ACCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGGCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAACAATGGC 60 **************************** ******************************* amyl6 s TTCCTTGGCCGCCAAGTGTGGGAGTACGACGCCGATGCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCC 120 amy23As TTCCTTGGCCGCCAAGTGTGGGAGTACGACGCCGATNCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCC 120 amy7As TTCCTTGGCCGCCAAGTGTGGGAGTACGACGCCGATGCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCC 120 amyllAs TTCCTTGGCCGCCAAGTGTGGGAGTACGACGCCGATGCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCC 120 amy OAs TTCCTTGGCCGCCAAGTGTGG6AGTACGACGCCGATGCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCC 120 amyl5As TTCCTTGGCCGCCAAGTGTGGGAGTACGACGCCGATGCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCC 120 ************************************ *********************** amyl6As GAGGTTGAGAGGGTGCGTGCGGAATTCACAAAGAACAGGTTCCA-GA6GAAGGAGTCACA 179 amy23As GAGGWGAGAGGG GCGTGCGGAATTCACAAAGAACAGGTTCCA-GAGGAAGGAGTCACA 179 amy7As GAGGTTGAGAGGGTGCGTGCGGAATTCACAAAGAACAGGTTCCA-GAGGNAGGAGTCACA 179 amyllAs GAGG TGAGAGGGTGCGTGCGGAATTCACAAAGAACAGGTTCCA-GAGGAAGGAGTCACA 179 amylOAs GAGG GAGAGGGTGCGTGCGGAATTCACAAAGAACAGGTTCCA-GAGGAAGGAGTCACA 179 amylSAs GAGGTTGAGAGGGTGCGTGCGGAATTCACAAAGAACAGG TCCNAGAGGAAGGAGTCACA 180 ******************************************* **** ********** aroyl6As GGACC TCTTCTACGCTTGCAGTACGCAAAAGACAACCCTCTTCCGGCGAATATTCCGAC 239 any23As GGACCTTCTTCTACGCTTGCAGTACGCAAAAGACAACCCTC TCCGGCGAATATTCCGAC 239 aisy7As GGACCTTCTTCTACGCTTGCAGTACGCAAAAGACAACCCTCTTCCGGCGAATATTCCGAC 239 anyllAs GGACCT CTT ACGCTTGCAGTACGCAAAAGACAACCC C TCCGGCGAATATTCCGAC 239 an lOAs GGACC CTTC ACGC TGCAGTACGC¾AAAGACAACCCTCTTCCGGCGAATATTCCGAC 239 amylSAs GGACCTTCTT TACGCTTGCAGTACGCAAAAGACAACCCTCTTCCGGCGAATATTCCGAC 240 ********** ************************************************* am 6 s NGAAGCCAAGC TGAAAAGAGTACAGAGGTCAC CACGAGACTATCTACGAATCATTGAT 299 amy23As AGAAGCCAAGC TGAAAAGAGTACAGAGG CACTCACGAGACTATCTACGAATCATTGAT 299 amyl1 s AGAAGCCAAGCTTGAAAAGAGTACAGAGGTCACTCACGAGACTATCTACGAATCATTGAT 299 amylOAs AGAAGCCAAGCTTGAAAAGAGTACAGAGGTCAC CACGAGACTATCTACGAATCATTGAT 299 amyl5 s AGAAGCCAAGCTTGAAAAGAGTACAGAGGTCACTCACGAGACTATCTACGAATCATTGAT 300 *********************************************************** amyl6As "GO»GCTCTA(¾TC^TATTCCTCTTTAC^ 359 amy23As GCGl^C 7R AVCAMATIC C7TARAeCñl^CGRTSGGCAS7^CCTGGTGIi TA 359 amy7 s GCGAGCTCTAC-ATNAATATTCCTCT TACA^ 359 amyllAs GCGAGCTC ACATCAATATTCCTCITTACAAGCAGACGATGGGCATTGGCCT 359 amylOAs GCGAGCTCACANCAATATTCCTC TTACAAGCAGACGATGGGCAWGGCCTGGTGATTA 359 amylSAs GCGAGCTCTACATCAATAT C TCWTACAAGCAGACGATGGGCATTGGCCrGGTGAT^ 360 ************ ************************** ******************* _unyl6As "CAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCTATCA 388 am 23As CAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCTATCA 388 amy7As CAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCTATCA 388 amyllAs CAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCTATCA 388 amylOAs CAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCTATCA 388 amylSAs CAGTGGGATTCTCTTCATTATGCCTATCA 389 ********************·**,****** (V) - CLUSTAL (1.8) alineación de secuencia múltiple de 6 clones que codifican al extremo 3' de la oxidoescualeno ciclasa putativa de A. strigosa amyllAs ¾TAAAATATTCCGAAAAGTTACATGATGACATCGGTAGGAAGAGAACTTATTTCTCAAA 60 amyl5As CATAAAATATTCCGAAAAGWACATGATGA¾TCGGTAGGAAGAGAACTTATTTCTCAAA 60 amy23As CATAAAATATTCCGAAAAGTTACATGATGACATCGGTAGGAAGAGAACn^ATTTCT 60 amylOAs CATAAAATATTCCGAAAAGTTACATGATGACATCGNTAGGAAGAGAACTTATTTCTCAAA 60 amy7As CATAAAATATTCCGAAAAGTTACATGATGACATCGGTAGGAAGAGAACTTATTTCTCAAA 60 amyl€As (.ATAAAATATTCCGAAAAGTTACATGATGACATCGGTAGGAAGAGAACTTATTTC CAAA 60 *********************************** ************************ amyllAs 6AAAATAACGCATGAATGCTCGTGGGAGCAATG TCTTATTCCTCGCAG:CTA 120 amylSAs GAAAATAACGCATGAATGCTCGTGGGAGCAATGTTriTATTCCTCGCAGCCrrAGAC^TCC 120 am 23 s GAAAATAACGCATGAATGCTCGTGGGAGCAATGTTCTTATTCCTCGCAGCCTAGACATCC 120 amy OAs GAAAATAACCCATGAATGCT8TGGGAGCAATGTTCOTATTCCTCGCAGCCTAGACATCC 120 amy7As GAAAATAACGCATGAATGCTCGTGGGAGCAATGTTCTTATTCCTCGO^CCTAGACATCC 120 GaAAArMCGCATGAATGt-TCGTGGGAGCAATGTTCTTATTCCTCG^ 120 ************************************************************ amyllAs ATCTTTGTTTCCATATCAGCTCTTAATCGCAAGAAGHCGACGGCGAAGTTCCCCAAGNGC 180 amyl5As ATGTTTGTTTCCATATC-AGCTCTTAATCGCAAGAAGHCGACGGCGAAGTTCCCCAAGAGC 180 amy23As ATGTTTGTTTCCATATCAGCTCTTAATCGC^GAAGTCGACGGCGAAXSTTCCCCAAGAGC 180 amylOAs ATGTTTGTTTCCATATCAGCTCTTAATCGCAAGAAGTCGACGGCGAAGOTCCXX^GAGC 180 amy7As ATGTTTGTTTCCATATCAGCTCWAATCGC3-AGAAGTCGACGGCGAASTTCCN 180 aayl6As ATGTTTGTTTCCATATCAGCTCTTAATCGCAAGAAGTO¾CGGCGAAGTTCCX AAGAGC 180 ************************************ *************** **** ** aaylOAs CATAA-TCGGGTATAGATTGCGGTAGTTGGCGAGTrGAAG TCAAGGAGG-AGtTGAAG 238 amylAs CATAA-TCGGGTATAGATTGCGGTAGTTGGCGTAGTTGAAGTTCAAGGAGG-AGTTGAAG 238 amyl6As CATNA-TCGGGTATAGATTGCGG AGTTGGCGTAGTTGAAGTTCAAGGAHGGAGTTGAAG 239 *** ******************************************* * ******** amyllAs CAACCCATGTGT CC-TGTTGGGGGAAG CACCTGTT CTAGCTGCATATTCATTASCTG 29? amylSAs SACCCATGTGTTCC-TGTTGGGGGAAGTCAC T&rWCTAGCTGCATATTCATTAGCTG 297 am 23As CAACCCATG GTTNCCTGTTGGGGGAAGTCACCTGTTTCTAGCTGCATATTCATTAGGT6299 amylOAs CAACCCATGOTTCC-TGTTGGGGGAAGTCACC GTTTCTAG TGCATAT CATTAGC 297 aiuy7As CAACCCATGTGrrcC-TGTTGGGGGAAGTCACCTGTTTCTAGCTGCATATTCATTAGCTG 297 amyl6As CAACCCATGTGTTCC-TGTTGGGGGAAGTCACCTGTTrCTAGCTGCATATTCATrAGCTG 298 ********** ** * ******************************************** • amyllAs TCTTGCAGCATTATACAGGGGTACTGGGTCA 328 am l5As TCTTGCAGCATTATACAGGGGTACTGGG CA 328 amy23As TCTTGCAGCATTATACAGGGGTACTGGGTCA 330 amylOAs TCTTGCAGCATTATACAGGGGTACTGGGTCA 328 aroyTAs TCTTGCAGCATTATACAGGGGTACTGGGTCA 328 amyl6As TCTTGCAGCATTATACAGGGGTACTGGGTCA 329 ******************************* (VI) - alineación del motivo DCTAE en la secuencia de aminoácidos predicha, de enzimas biosintéticas de triterpeno de diferentes especies RAT OSC HKGGFPFSTLDGGWIVADDTAEALKAVLLL YEAST OSC 439 RKGAWGFST TQGYTVADCTAEAIKAIIMV ARAB OSC 466 SKGA PFSTADHGWPISDCTAEGLKAALLL OAT CYC 467 SKGAMPFSTADHGWPISDCTAEGLKAALLL PAAX CYC 466 SKG WPFSTADHGWPISDCTAEGFKAVLQL OAT AMY 467 SKGSWTLSSVDNGWSVSDCTAEAVKALLLL PANAX AMY 469 SKGSWTFSDQDHGWQVSDCTAEGL CCLIF (VII) - Alineación de la oxídoescualeno ciclase con cicloartenol sintasa de A. strigosa b-amyrin MW^TIGEGG -BWIJCSiraGFLGRaVKEYBADA^ 59 cycloart MWPiKIAEGGGDPWI^TKNAHVGRQVV¾FDPEAGDPEALAAV^ 60 b-amyrin DLLI_LQYAKDNPLPANIPTí-AKLEKSTEV HETXYESIMRALHQYSSLQADDGHWPGDY 119 cycloart DRLMRIQFEKENPI-KIJHIP-MKIÍEENEDV EEA 119 b-amyrin SGILFIMP-TNIFSLYVTRSLDTníSPEHRHEIC^YIYNQQNEDGGWGMVLGPSTMPGSC 179 cycloart GGPMFI^GLLITLYVTGSl^nVLSPEHQKEIPJlYLYNHQNEDGG GMIEGPSr ílSSA 179 b-amyrin MNYATLMIlX3EKRNGDHKDftJ-£KSRSW^ 239 cycloart LTYVSLRLI/-TOPES-GDGAMEKGRNWILDHGGATC^ 238 b-amyrin PEL»LVPHFXPIHPG¾FWCFTRLIYMSMAYLYGKKF^ 299 cycloart PEIWMLPYRLPIHPGPJWCHCRMVYLPMCYVYGKRFVGKITP 298 b-amyrin WDKARDYCAEDI-HYPRSPAQDLISeCLTKIVEM 359 cycloart WDSAPJILCAKEDLYYPHPLIQDILWATUJI^^ 358 b-amyrin ESTKYVGICPINKALNMICCWVENPNSPEFQQHLPRFHDYLWMAEDGMKAQVYDGCHSWE 419 cycloart EOTRYICIGPVNKVIJJMLTOTIEDPNSEAFI-HIPJIVHOY^ 418 "b-amyrin LAFI1HAYCSTDLTSEFIPTLKKAHEFMKNSQVLFHHP-NHES YRHRSKGSMTLSSVDN 478 cycloart TAFAVQAITATGLIDEFAPTLKIJtf-NrcKNSQVLDDCPGD^ 478 b-amyrin GWSVSDCTAEAVKALLLLSKISADI.VGDPIKQDRLYDAIDCILSFMNTDGTFSTYECKRT 538 cycloart G PISDCTAEG-JC^Ll^KISPEIVGEPVEVNPOiYDAVNCI-MSWMtWWGGFATYELTRS 538 b-amyrin FAWl-EVLNPSESFRNIVVDYPSVECTSSVVDALILFIffiTNPRYRRAEID CIEEAVVFIE 598 cycloart YAW1£L1NPAETFGDIVIDYTYVEC SAAI0ALTSFK LYPGHRRKDVDNCINKA¾NFIE 598 b-amyrin NSQtWDGSVTYGSWGICFAYGCMFAVPJU.VATGK YDNCASIRKSCKFVljSKQQTTGGWGE €58 cycloart SIQRSDGSWYGSWAVCFTYGTWFGVKALVAAGRTFKSSPAIRKACEFJ^SKELPFGGWG «58 b-^myrin DYIiSSDNGEYIDSG-—RPNAVTTSWAMLALIYAGQVERDFVPLYNAARQI^MQLETGDF 716 cycloart SYLSCQDQVYTNLEGKHAHAVNTGWAlttTLIDAGQAERDPTPLHRAAKVLINLQSEDGEF 718 b-amyrin PQQEHMGCi^SSLNFYANYRNLYPIMAIíGELRRRllAlKS 757 cycloart PQQEIMGVFNKNCWISYSQYRDIFPVWAIIGEYRCRVIJAAGK 759 (VIII) - Secuencia genómica de ß-amirina sintasa de Avena strigosa ATGTGGAGGGTi\ACAATAGGTGAGGGCGGCGGTCCGTGGCTGAAGTCGAAC3VATGGCTTCCTTGGCCGCCAA GTGTGGGAGTACGACGCCGATGCCGGCACGCCGGAAGAGCGTGCCGAGGTTGAGAGGGTGCGTGCGGAATTC ACAAAGAACAGGTTCCAGAGGAAGGAGTCACAGGACCTTCTTCTACGCTTGCAGgtacatgcgtcttCtttc ccctacttccatatacacccagtagtatatgttgccactgccgttagctctagctttaggactgagaaaagg gctctcagataatceatatctctctttagatggagggtttgcttttatttattattacatattgttcaatcc ttgctgtgtatatcatcaactgcagTACGCAAAAGACAACCCTCTTCCGGCGAATATTCCGACAGAAGCCAA GCTTGAAAAGAGTACAGAGGTCACTCACGAGACTATCTACGAATCATTGATGCGAGCTTTACATCARTATTC CTCTCTACAAGCAGACGATGGGCATTGGCCTGGTGATTACAGTGGGATTCTCTTCATTATSCCTATCATTgt aagtattttactattáttttatgatacagcaatttggcaattaatatatgcatacgagg ttcttatttcgt aaatactcaagacaatatagcatgtggaatcttataatttctataatgaatatgtaccgtcttgtgtgcgca atacgtatactatattattccgctatgcatatagtattacataccaatattgatagatgttcaaaccaatta tgaagagtttaactacaagatttaatatagtagtttctgttattctagcagcaagttacctccattaggttc cggaagttctactcttaccacctatatatatgtattattgcttatactaccttcgtctcaaag ttaagact tttttttaaagtcaatttatggaaagtttgaactaacttttataaaactatcaagaactatgatattatatt tgccatgtgaaaatatgttttattatgtatcaaagggtatggatttcgtaccgtaaatataatattgttgtc taaaatcttggttgaactttacttagtttgacttttggaaagtatataagccttaaaotttaaaatagacgt 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GTCGgtatgttaaataacacaagatatcaatgotcatatatgttctcttctgaac aacgttaaatcaacct actatttgataacatcatagATAATTGGCGTTTACGAATGGTCAGGAAACAATGCTATTATACCTGAATTGT GGTTGGTTCCACATTTTCTTCCGATTCACCCAGgtatttctatctagcttgcatatataacaaaattgttgt agaacgcatgcttagaccatcattctgtggaattattctgtgcaatttgttgcttgtggaagcaatttaacc atatatcaaacaaggaatattgaggcatggtacctgaaatagttttttgaaaaatacatgccgaaaaggaaa tcaatgtttcaattaggcatgtttgcacgtagattccacaagattctcttg atatgttttgatcttggaga tacatgtatatatttatgtatctttcatattatctcaaaaaaataacatgttactaccccctctatccataa taagtgtcggtcacttagtacaaactttatactagcttagtacaaaatggacgactcttattatggattgca gggagtactaaatattatgaagttgaaccttatcattcacaagtaatttattggaaaataatccttcatatg tagGTCGTTTTTGGTGTTTTACCCGGTTGATATACATGTCAATGGCATATCTCTATGGfAAGAAATTTGTTG GGCCTATTAGTCCTACAATATTAGCTCTGCGACAAGACCTCTATAGTATACCTTACTGCAACATTAATTGGG ACl^GGCeCGTGATTATTGTGCAAAGgttagttagttaatcaatcactatatatatgtattcagtttgttag aatatattaatttagcccatgtcactacataatattttcatggattcaagattaagaacatcacgtagaata atgaagtacatpatttcag 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catttctaaaaaaataaatctatattataataaataaggttttgcatgataccacatctatgtta ttttgcactatgaagatagtaacttagactagtaacatatacatgttactactctaagttactcc ccacaatgaccagcctaacaccttttgtactgttttgcacatttgcagtttactttttcttagg gaagagaaaacacaagacataattttaatatttcaacttcattacgtgctggtgcaaataatttt tacggtgcaattttcgacatgatttattgtatatttacagaaatttatgctccaaatttgtttgg taccttcagtattagtttctggacattgtacatattatgttgccgtataagctgagctagaagga tcattagr gtaattccatatatatctaaatgtacctgtggaatcacatttgaggaagttccaatg atgccetttttgccctgcacacgcatatataaqaaccctttgcccqcagcataqagctaqtacta gctacjtatcccattgcttgttttcctcgcatacactgcccgttgttggtgcgcaccATG (X) Sitios de enlace del factor de transcripción putativo de la región promotora 1 TCAAATAAAAATTACCTGATC GACATGATCACTCCTACCCCGAGXTT 51 CTACAAATATTTCTATAAGTAGTTTGTGGATTCCAATATATATACGGATT 101) +AWMWAAAGKHN{P$DOF1_01 {0.9S9) ) 101) +NWNMAAAGNGN(P$PBF_01 (0.915) ) 101 CCSTAAAGCTC TTACCcaTGGTATGACTTÍACTACTAACAAAATCATA 126) -NCNCTTTWm»N(P$PBr_01{0.939) ) 126) -NHNCTTTWNN {P$DOF1_0110.966) ) +ACCWACCNN(P$P_01 (0.856) ) +YAACSGMC(P$GA YB_01(0.893) ) GKWCGAGTGAAGATTGGCTACC¾ACTGTAATGTAAGATTGTTGCCAA -GKCSGTTR(P$GAJ«B_01(0.905) ) GATAAGATACTAAG TACAGATGCACTACTCTAATACTAAGAGTTATTG ATCTATATTACGCCTCCCGACCGTAGAGATATTGATCTACGTCACCT +WNAAAGHGN(P$PBF_01 (0.932) ) +ANNHAAAGNNN(PÍDOF1_01 (0.919)) +ACCWACCHHIP$P_01 (0.906)) TCTTAAAAGGAGATTCTTGTACAATCAAAACAAATGGGTCTAGCTACCTT +NWHWAAA5SG1)<P$PBF_01 <0.915) ) +AHNWAAAGNKH(P?DOF1_01 (0.931) ) +HNRCAATTATTHNN (P$ATHB1_01 (0.664) ) GGTCAATATGATTCTATCGGTATTAGrTATAAAGGAGAGGAATACAG -MKAATAATTGHNN (PSATHB1_01 (0.948) ) +NHHAAAGSGN (P$PBF_01(0.936) ) +ANKAAAGKHN(P$DOFl_01(0.941) ) AATAATTTTTTAACTCCAAGACCTCATGCTTCAGTATAAAGAGT 407) -NWWWrTAACNAYWM(P$SBFl_01<0.899> ) 43i> -smcr íw$oori ¡xi .aio) ) 431) -eCNCTTTHCTTO<PSPBr_01(0.906)) 451 TTGATGCACGGTTCTCTGTACTAATAAATGTTCTATTGTTGATTGATTCT , ( 496) -mnWTTAACNAYWM(PSSBF1^01 (0.882)) < 500) -NTAACSGTTTTNH (P$KYBPH3_01 (0.882) ) 501) +YAACSGMC(P$GAMYB_01(0.899)) 528) +ANtfflAAAGHNN(PSDOFl_01(0.931)) 528) +NWHAAACNGN(P$PBF_01 (0.929)) 501 TAACCGCATCCTATGCAATTTTAACCTCAAAAAAGTTTCACGGTACACCG 517) -NWWHTTAACHAYHM(P$SBF1_01 (0.961) ) 551 ACTTGCCTTACTAGCCCTACTGTTTTCTTGAGAAGGATGTTCAAACTTTG 593) " -TOIlICTTTWHHT(PSDOri_01(0.879)) 593) -KCNCTTTmWN(P$PBF_01(0.860)) 600) -NCMCTTTinnro (P$PBF_01 (0.938) ) 600) -mmcrmiinrr (P$DOFI_OI <o.9*3) > 637) +NNNCAATTATTNNN(P$ATHB1_01(0.869) ) 601 GGCTTTTGCATCTAAAATAAGACACACATCATT rTGGTTTATTATTCAA 659) +ANHWAAAGNNH(P$DOF1_01(0.925)) 659) +NWNWAAAGNGN(P$PBF_01 (0.922) ) 6 1) +YAACSGMC (P$GAMW_01 (0.90$)) 651 CAATGTGTGGGAAAAGCATACAACAATCAACTCGATATACCACCTTCGCG 739) +NVnmAAAGNGN(P$PBF_01 (0.924)) 739) +ANNHAAAGmni(P$DOFl_01 (0.965)) 701 GAGGGCCTCCTC TTAAATGTCTGGGAGTACTACACATATGTAAAGATGA 709) - CNCTTTiraHN(PSPBF_01 (0.957) ) 709) -NNNCTTTWNNT (P$DOF1_01 (0.971)) 758) +HHK ¾AAGNGH(PSPBF_01(0.901)) 758) +MTOHAAAGNNN(P$DOF1_01 (0.877)) 791) +ANOT)AAAGt)NN(P$DOFl_01(0.871)) 791) +KWKWAAAG CT (P$PBF_01 (0.896) ) 751 TG CCACTTACAAAGAACGAGGACACCACTTAAACCGGGTGTACAAAGTA ,809) +NTOTOAAAGNGH (PSPBF_01 (0.932) ) 809) +ANNWAAAGmn»(P$DOFl_01 (0.965)) 801 CACACATATGTAAAGACGAGGCCATAGAACAAGCAAGAGCACCAAGATA 867) +ACCMACCNN(P$P_01{0.852)) 869) +YAACSGMC(P$GAW»_01 (0.947)) 851 TTTAGATCCA TAAAATGCAACCACCTCGATGTCCATAAAAAATGATGG 907) +TAACSGMC (P$GAMYB_01 (0.897) ) 901 GACGCACAACAC CARCAAATATCGATAAAAATGATAGTGCCAG GC 9S1 ACATCTTCTAACATGTTGGTGTCTATTATGCACAAGTGGGCATGGAAGCA 1001 . AGTAAATATTG GTACTATAGCTACTGGTGACTCGAGTGTATCTCCAAGA 1051 C CGATAGCAAACCCGAAGCCTCT CAGCTTGCCACATATCArTGTGGA 1141) +NNHSACGTGNCM(Í,$GBP_Q6<0.949>) 1101 ATGTTCACTACGACTCGCCACGCCAAGCATAACCTGGATAAGCCACGTGG 1141) -KGNCACGTSNNN(PSGBP Q6(0.944>) 1151 GATATGAGAT TCCCGCAGCTTCCCTCTGAGTGAGGAGGCAGAACTATAC 1201 GCTCAACACGACGAGCCACCCCCTAAGGCTAGTCATAGGGGAGAACT 1251 TGGGTAGTAACATATTCCTACATATATTGCGAACTAAGCATTTAGATGAC 1251) -MNGGTWGGT(P$P 01(0.855)) 1338) +YAACSGMC(P$GMfB,.0l<0.857)) 1301 ATGACATGCAATTAAATGATGAGAGAGAGTCTTATGATAATAGCTAGT 1351 TACCATAACATCACACATTTCAAAAAAATAAATCTATATTATAATAAAT 1401 AAGGTTTTGCATGATACCACAT ATGTATTTTGCACTAGAAGATAG 1451 AACTTAGACTAGTAACATATACATGTTACTACCTAAGTACTCCCCACA 1501 ATGACCAGCCTAACACCTTTGTATGTT GCACATTGCAGTTTACT 1514) -KCHCTTTWHWB (?$??G_01 (0. 27) ) ( 1514) -.nmCTTratWJT(P$DOFlJ)l{0.933)) 1545) - CHCmwiWK(P$BBF_01(0.945) ) 1545) -»imcT rw)ST(pSDori_oi (0.90)·) 1579) +WRTHGTTAAWWH(PSSBn_01(0.854) ) 1551 TTTCTTAGGTGAAGAGAAAACACAAGACATAATTTTAATATTTCAACTTC 1581) -WnnraTAACNATWKPSSBFl^Ol(0.878)) 1613) + HNCAATTATTHHM(PSA,rHBl>_01(0.860)) 1601 ATTACCTGCTGGTGCAAATAATTTTTACGGTGCAATTTTCGACATG&TTT 1614) -HNAATAATTGHNH(P$ATHB1_01 (0.945)) 1651 A TGTATATTTACAGAAATTATGCTCCAAA GTTGGTACCTCAGT 1701 ATTAGTTrCTGGACATTGTACATATTATGTTGCCGTATAAGCTGAGCTAG 1751 AAGGATCA AGTGTAArtCCATATATATCTAAATGTACCTGTGGAATCA 1801 CATTTGAGGAAGTTCCAATGATGCCCTTTTTGCCCTGCACACGCATATAT ( 1823) -BNSCTTTWNNT (P$DOF1_01(0.913) ) ( 1823) -NCNCTTTWmBJ{P$PBFj01(0.943)) "1851 AAGAACCCTTTGCCCGCAGCATAGAGCTAGTACTAGCTAGTATCCCATTG 1855) -KCHCTTTVnWN(P$BBF_01 (0.880)) 1855) -NNNCTTTWNNT (P$DOF1_01(0.859) ) 1901 CTTGTTTTCCTCGCATACACTGCCCG GTTGGTGCGCACCATG 1922) -GKC3GTTR(PSGAMY8_01 (0.961) ) Tabla 1 - Cebadores específicos para amplificar ß-amirina sintasa de 5. strigosa Tabla 2 - Cebadores para amplificar ß-amirina sintasas Tabla 3 cebadores usados a fin de cubrir la secuencia genómica completa XLII. AMYstaFS : 5'- CCATGTGGAGGCTAACAATAGGTGAGGG -3' XLIII . AMYstaF6 : 5'- TTTCCTCGCATACACTGCCCGTTGTT -3 » XLIV. AMY01F: 5'- TATTCCGACAGAAGCCAA -3' XLV. AMY01R: 5'- TCTTTGTGAATTCCGCAC -3* XLVI . AMY02F: 5'- GTTGGGGAAAAATGGTTC -3' XLVII . AMY03F: 5'- TTTTCTTCCGATTCACCC -3* XLVIII. AMY04F: 5'- ATTGTGGAGCCAATTTTG -3* XLIX. A Y05F: 5'- TGGATGTCATAGCTGGGA -3' L. AMY06F: 5'- TATCCGCTGACCTTGTTG -3' LI. AMY07F: 5»- CGAATCCACGATATCGAA -3' LII. AMY08F: 5'- GTGGATGGGGTGAAGACT -3* LUI. AMY09F: 5'- TATGGCTCTTGGGGAACT -3' LIV. AMY10F: 5'-¦ GTATGGATTTCGTACCGTAAAT -3' LV. AMY11F: 5 • CCTGCGACAAGACCTCTATA -3' LVI. AMY12F: 5'-• CTCAACCCTTCTGAGAGTTTT -3' LVII. AMY13F: 5'-¦ CAGCTTGGTCTACAACTGTTAC -3* LVIII. AMY014F: 5'-• CAGAGGTAGTTAGAAAAATTATTGGACT -31 LIX. AMY015F: 5'- GGCGGAGGATGGAATGAAGGCA -3' LX. AMY016F: 5'- CAGTGGGATTCTCTTCATTATGC -3' LXI. AMY017R: 5'- AGCCTTTTGATCTGTGGCGATA -3' LXII. AMY018F: 5'- GTGGCTC¾TCACATTGATCACA -3' LXIII.- AMY019F: 5'- TGGGCAATGTTGGCTTTAATTT -3' LXIV. AMYendR3 : 5'- GCCTAGACATCCATGTTTGTTTCCATATCA -3' LXV. - AMYendR5 : 5·- TATTTCTCAAAGAA TAAGGCATGAATGCTC-3 ¦ Análisis por Blast Secuencia de cDNA parcial (clon ortls.pk001.cl4) La búsqueda por Blast en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) reveló homología con: La cicloartenol sintasa (AB025968) de Glycyrrhiza glabra. Puntuación = 109 (bits), Valor de E = 5e-24, Identidades = 45/86 (52 %) .

La cicloartenol sintasa (??033334) de Luffa cylíndrica. Puntuación = 109 (bits), Valor de E = 4e - 24, Identidades = 44/86 (51 %) . La cicloartenol sintasa (AF169966) de Oryza sativa. Puntuación = 107 (bits) , Valor de E = 2e-23, Identidades = 48/83 (57 %) . La oxido ciclasa (7AB025353) de Allium macrostemon, Puntuación = 104 (bits), Valor de E = le-22, Identidades = 47/83 (56 %) . La cicloartenol sintasa (AC005171) de Arabidopsis Ihaliana. Puntuación = 104 (bits), Valor de E = 2e-22, Identidades = 44/86 (51 %) La cicloartenol sintasa (AB009029) de Panax ginseng. Puntuación = 104 (bits), Valor de E = le-22, Identidades = 43/86 (50 %) . La cicloartenol sintasa (D89619) de Pisum sativum. Puntuación = 102 (bits), Valor de E = 6e-22, Identidades = 43/86 (50 %) . La beta-amirina sintasa (AB014057) de Panax ginseng. Puntuación = 98.7 (bits), Valor de E = 9e-21, Identidades = 4/84 (51 %) . Para la búsqueda se utilizaron las bases de datos de las traslaciones de GenBank CDS no redundantes, PDB, SwissProt, SPupdate y PIR con una BLOSUM62 Matrix y la Existencell, Extensionl Gap Penalties.

Posteriormente se muestran los resultados de búsquedas adicionales en el National Center for Biotechnology Information (NCBI), que utiliza las bases de datos de las traslaciones GenBank CDC no redundantes, PDB, SwissProt, Spupdate y PIR con una BLOSUM62 Matrix, que mostraron homología en el cDNA de beta-amirina sintasa de Panax ginseng y en genes de cicloartenol sintasa de otras especies de plantas. 1. Cicloartenol sintasa (D89619) de Pisum sativum. Puntuación = (131), Valor de E = 4e-30, Identidades = 58/127 (45 %. 2. Cicloartenol sintasa (AC005171) de Arabidopsis thaliana. Puntuación =(131), Valor de E = 4e-30, Identidades = 57/127 (44 %) . 3. Cicloartenol sintasa (AF169966) de Oryza sativa.

Puntuación = (130), Valor de E = 5e-30, Identidades = 63/125 (50 %) 4. Cicloartenol sintasa (AB025968) de Glycyrrhiza glabra. Puntuación = (128), Valor de E = 2E-29, Identidades = 57/127 (44 %) . 5. Oxidoescualeno ciclasa (AB025353) de Allium macrostemon. Puntuación = (126), Valor de E = 9e-29, Identidades = 57/127 (44 %) . 6. Cicloartenol sintasa (AB009029) de Panax ginseng. Puntuación = (125), Valor de E = le-28, Identidades = 54/127 (42 %) . 7. Beta-amirina sintasa (AB014057) de Panax ginseng. Puntuación = (118), Valor de E = 3e-26, Identidades = 57/127. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Plant Bioscience Plant Limited Osbourn Anne Kosmas, Haralampidis <120> Gen Vegetal <130> SMK/LP5897715 <140> PCT/GBOO/04908 <141> 2000-12-20 <150> GB 9930394.3 <151> 1999-12-22 <150>GB 0020217.6 <151> 2000-08-16 <160> 219 <170>PatentIn versión 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 1 gcattggcct ggtgatta <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 2 gcccatgagg tggtcaca <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 3 ggcgcgtgat tattgtgc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 4 catgaactcg tgcgcctt <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 5 ccatgtggag gctaacaata ggtgaggg <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 6 tatttctcaa agaaaataac gcatgaatgc tc <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 7 tgcgagtaag gatcctcacg caaggaattc cgaccagaca ggcc . <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 8 tgcgagtaag gatcctcacg caag <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 9 tcagccacgg accgccgccc tcacctatt <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 10 cacgcaagga attccgacca gaca <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 11 ttagcctcca catggtgcgc accaacaacg <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 12 ggacatcgag gtggttgcat tttagtggat c <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 13 ggtgctcttg cttgttctat ggcctcgtct tt <210> 14 <211> 2457 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA de Avena strigosa <400> 14 attgcttgtt ttcctcgcat acactgcccg ttgttggtge gcaccatgtg gaggctaaca 60 at&ggtgagg geggcggtec gtggccgaag tcgaacaatg gcctccttgg ccgccaagtg 120 tgggagtacg acgccgatge cggcacgccg gaagagcgtg ccgaggttga cagggtgcgt 180 gcggtattea caaagaaeag gctccagagg aaggagtcac aggaccfcfcct tetacgct g 240 cag acgcaa aagacaaccc tctcccggcg aataetacga sagaagccaa gcttgaaaag A'QQ agtacagagg tcactcacga gactatctae gaatcattga tgcgegettt a.cateaatat if>Q tcctctctac aagcagaoga tgggcattgg cctggtgatt aeagtgggat etct catt. 420 aigcctatea tfcafcattctc tttatafcgtt actagatcac tfcgacacctt ttatctceg 480 gaacatcgtc atgagatatg tcgciacatt tacaatcaac agaatgaaga tggtggttgg 540 ggaaaaatgg tccttggecc aagtaccstg tttggstcgt gtatgaatta tgcaacctca S00 atgattcttg gcgagaagcg aaatggtgat cataaggatg ca.ttggaa.aa agggcgttct 650 tgga-tttat etcatggaae tgcaactgca ataccacagt ggggaaa&at atggttgtag 720 acaattggcg tttacgaatg gtcaggaaae aatcctatta tacccgaatt gtggttggtt 730 ccacattttc ttccgattca cccaggtcgt ttttgatgct fctsseeggtt gatatacacg 840 tcaatggcat atctctatgg taagaaattt gttgggccta ttagteetac aatattagct 900 ctgcgacaag acctctatag tatacottac tgcaacatta attgggacaa ggogcgtgat 960 tattgtgcaa ággaggacct tcattaccea cgctcacggg cacaagatc: catatctggt 1020 tgcctaacga aaattgtgga gccaattttg aattggtggc cagoaaacaa gctaagagat 10S0 agagctttaa ctaacctcat ggagcaratc cattatgacg acgaatcaac caaatatgtg 1140 ggeatttgec ctattaacaa ggcattgaac atgatttgtt gttgggtaga aaacccaaat 1200 tcgcctgaat tccaacaaca tcttccacga ttccatgact stttgtggat ggcggagcat 1260 ggaacgaagg c&caggtata tgatggatgt catagctggg aactagcgtt oataattcat 1320 gcctactgtt ccacggatet taotagcgag tfctaf.ceega ctctaaaaaa ggcgc&cgag 13SO ctcatgaaga c cacaggt tcttttcaac caeccaaatc atgaaagcta ttatcgcca 1440 agatcaaaag gctcatggac cctctcaagr gtaga aatg gttgqtctgt atctgattgt 1500 actgcggaag ctgttaaggc attgctacta ttatsaaaga tatccgctga ccttgttggc 1560 gatccaataa aacaagacag gttgtatgat gccattgact gcatcctatc tttcatgaat 1620 acagatggaa cattttctac ctacgaatgc aaacggacat tcgcttggtt agaggtcctc 1680 aaccctcctg agagttttcg gaacattgtc gcggactate eatctg-ctga atgcacafcca 1740 tccgtggttg atgctctcat, attatttaaa gagacgaate cacgatatcg aagagcagag 1800 atagataaat gcattgaaga agctgttgca tttatcgaga aeagtcaaaa taaggatggt 1860 tcatggtatg gctcatgggg cata gtttc gcatatggat gcatgtttgc agtaagggcg 1920 ttggttgcta caggaaaaac ctacgacaat tgtgcttcta tcagga&atc atgoaaattt 198Q gtcrt&ccaa agcaacaaac aaoaggtgga tggggtgaag actatctttc tagtgacaat 2040 ggggaatata ttgatagcgg taggcctaat gctgtgacca éctcatgggc aatgttggct 2100 ttaatttatg ctggacaggt tgaacgtgac ccagtaccac tgtataatgc tgcaagacag 2160 ctaatgaata tgcagctaga aacaggtgac ttcccccaac aggaacacat gggttgcttc 2220 aactcctcct tgaacttcaa ctacgccaac taccgcaatc tatacccgat tatggctctt 2280 ggggaacttc gccgtcgact tcttgcgatt aagagctgat atggaaacaa acatggatgt 2340 ctaggctgcg aggaataaga acattgctcc cacgagcatt catgcgttat tttctttgag 2400 aaataagttc tcttcctacc gatgtcatca tgtaactttt cggaatattt tatgtgt 2457 <210> 15 <211> 757 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 15 Met Trp Arg Leu Thr lie Gly Glu Gly Gly Gly Pro Trp Leu Lys Ser 1 5 10 15 Asn Asn Gly Phe Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu Tyr Asp Ala Asp Ala 20 25 30 Gly Thr Pro Glu Glu Arg Ala Glu Val Glu Arg Val Arg Ala Glu Phe 35 40 45 Thr Lys Asn Arg Phe Gln Arg Lys Glu Ser Gln Asp Leu Leu Leu Arg 50 55 60 Leu Gln Tyr Ala Lys Asp Asn Pro Leu Pro Ala Asn lie Pro Thr Glu 65 70 75 80 Ai* Lys L*u Glu Lye Ser Thr Glu Val Thr His Glu Thr lie Tyr Glu 85 90 93 3er Leu Het Arg Ala Leu His Gin Tyr Ser Ser Leu Gin Ala Asp Asp 100 105 110 Gly His Trp Pro Gly Asp Tyr Ser Gly He Leu Phe He Met Pro He 115 120 125 Asn lie Phe Ser Leu Tyr Val Thr Arg Ser Leu Asp Thr Phe Leu Ser 130 135 140 Pro Glu His Arg His Glu lie Cys Arg Tyr He Tyr Asn Gin Gin Asn 14S 150 155 160 Glu Asp Gly Gly Trp Gly Lys Met Val Leu Gly Pro Ser Thr Met Phe 165 170 175 Gly Ser Cys Met Asn Tyr Alá Thr Leu Met He Leu Gly Giu Lys Arg 180 185 190 Asn Gly Asp His Lys Asp Ala Leu Giu Lys Gly Arg Ser Trp He Leu 195 200 205 Ser His Gly Thr Ala Thr Ala He Pro Gin Trp Gly Lys He Trp Leu 210 215 220 Ser lie lie Gly Val Tyr Giu Trp Ser Gly Asn Asn Pro He He Pro 225 230 235 240 Glu Leu Trp Leu Val Pro His Phe Leu Pro He Hie Pro Gly Arg Phe 245 250 255 Trp Cys Phe Thr Arg Leu He Tyr Met Ser Met Ala Tyr Leu Tyr Gly 260 265 270 Lys Lya Phe Val Gly Pro He Ser Pro Thr He Leu Ala Leu Arg Gin 275 280 285 Asp Leu Tyr Ser lie Pro Tyr Cye Asn lie Asn Trp Asp Lys Ala Arg 290 295 300 Asp Tyr Cys Ala Lys Glu Asp Leu His Tyr Pro Arg Ser Arg Ala Gln 305 310 315 320 Asp Leu lie Ser Gly Cys Leu Thr Lys lie Val Glu Pro lie Leu Asn 325 330 335 Trp Trp Pro Ala Asn Lys Leu Arg Asp Arg Ala Leu Thr Asn Leu Met 340 345 350 Glu His lie His Tyr Asp Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Val Gly lie Cys 355 360 365 Pro lie Asn Lys Ala Leu Asn Met lie Cys Cys Trp Val Glu Asn Pro 370 375 380 Asn Ser Pro Glu Phe Gln Gln His Leu Pro Arg Phe His Asp Tyr Leu 385 390 395 400 Trp Met Ala Glu Asp Gly Met Lys Ala Gln Val Tyr Asp Gly Cys His 405 410 415 Ser Trp Glu Leu Ala Phe lie lie His Ala Tyr Cys Ser Thr Asp Leu 420 425 430 Thr Ser Glu Phe lie Pro Thr Leu Lys Lys Ala His Glu Phe Met Lys 435 440 445 Asn Ser Gln Val Leu Phe Asn His Pro Asn His Glu Ser Tyr Tyr Arg 450 455 460 His Arg Ser Lys Gly Ser Trp Thr Leu Ser Ser Val Asp Asn Gly Trp 465 470 475 480 Ser Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Val Lys 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strigosa <400> 59 Lys Arg Asn Gly Asp His Lys Asp Ala Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 60 Ser His Gly Thr Ala Thr Ala lie Pro Gln 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 61 lie lie Pro Glu Leu Trp Leu Val Pro His 1 5 10 <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 62 Arg Phe Trp Cys Phe Thr Arg Leu lie Tyr Met Ser Met Ala 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 63 Ala Leu Arg Gln Aep Leu Tyr Ser lie Pro Tyr Cys Asn 1 5 10 <210> 64 <2ll> 8 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 64 Trp Asp Lys Ala Arg Aep Tyr Cys 1 5 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 65 Arg Ser Arg Ala Gln Asp Leu lie Ser Gly Cys Leu Thr Lys 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 66 lie Leu Asn Trp Trp Pro Ala Asn Lys Leu Arg 1 5 10 ;.210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 67 Asp Arg Ala Leu Thr Asn Leu Met Glu His 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 68 Ser Thr Lys Tyr Val Gly lie Cys Pro lie 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Avena strigosa <.:400> 69 lie Cys Cys Trp Val Glu Asn Pro Asn Ser Pro Glu 1 5 10 210> 70 n> 9 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 70 Ala Gln Val Tyr Asp Gly Cys His Ser 1 5 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 71 Glu Leu Ala Phe lie lie His Ala Tyr Cye 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 72 Ser Thr Asp Leu Thr Ser Glu Phe lie 1 5 <210> 73 '211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 73 Leu Phe Asn His Pro Asn His Glu Ser Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 74 Leu Ser Ser .Val Asp Asn Gly Trp Ser 1 5 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 75 Lye lie Ser Ala Asp Leu Val Gly Aep Pro lie Lys Gln Asp 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 76 lie Asp Cys lie Leu Ser Phe Met Asn Thr Asp 1 5 10 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 77 Thr Phe Ser Thr Tyr Glu Cys Lys Arg Thr Phe Ala 1 5 10 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 78 Asn Pro Ser Glu Ser Phe Arg Asn <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 79 Val Val Asp Ala Leu lie Leu 1 S <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 80 Glu Thr Asn Pro Arg Tyr Arg Arg Ala 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 81 Asp Lye Cys lie Glu Glu Ala Val Val Phe 1 . 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 82 Cye Met Phe Ala Val Arg Ala Leu Val Ala Thr 1 5 10 <210> 83 <21l> 11 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 83 Asp Asn Cys Ala Ser lie Arg Lys Ser Cys Lys 1 5 10 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 84 Val Leu Ser Lys Gln Gln Thr Thr 1 5 <210> 85 <211> 26 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 85 Asp Tyr Leu Ser Ser Asp Asn Gly Glu Tyr lie Asp Ser Asp Tyr Leu 1 - 5 10 15 Ser Ser Asp Asn Gly Glu Tyr lie Asp Ser 20 25. <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 86 Gly Arg Pro Asn Ala Val Thr Thr Ser 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 87 Tyr Ala Gly Gln Val Glu Arg Asp Pro Val 1 5 10 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 88 Tyr Asn Ala Ala Arg Gln Leu Met Asn Met Gln Leu Glu Thr 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 89 Cye Phe Asn Ser Ser Leu Asn Phe Asn Tyr Ala Asn Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Avena strigosa <400> 90 lie Met Ala Leu Gly Glu Leu Arg Arg Arg Leu Leu Ala lie Lys 1 5 10 15 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 91 aagtcgaaca atggcttcct t <210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 92 gtgggagtac gacgccgatg ccggcacg <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 93 agggtgcgtg cggaattcac aaag <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 94 ccggcgaata ttccgacaga agcc <210> 95 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 95 aagagtacag aggtcactca cgagactatc tacgaatca <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 96 attatgccta tcaatatatt ctct <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 97 agagaatata ttgataggca taat <210> 98 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 98 aatcaacaga atgaagatgg tggttgggga aaaatggttc ttggccca <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 99 ggatcgtgta tgaattatgc aaccttaatg <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 100 aagcgaaatg gtgatcataa ggatgcattg gaaaaa <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 101 tctcatggaa ctgcaactgc aataccacag <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 102 attatacctg aattgtggtt ggttccacat 30 <210> 103 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 103 cgtttttggt gttttacccg gttgatatac atgtcaatgg ca 42 <210> 104 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 104 gctctgcgac aagacctcta tagtatacct tactgcaac <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 105 tgggacaagg cgcgtgatta ttgt <210> 106 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 106 cgctcacggg cacaagatct tatatctggt tgcctaacga aa <210> 107 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 107 attttgaatt ggtggccagc aaacaagcta aga <210> 108 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 108 gatagagctt taactaacct catggagcat <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 109 tcaaccaaat atgtgggcat ttgccctatt <210> 110 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 110 atttgttgtt gggtagaaaa cccaaattcg cctgaa <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 111 gcacaggtat atgatggatg tcatagc <210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 112 gaactagcgt tcataattca tgcctattgt <210> 113 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 113 tccacggatc ttactagcga gtttatc <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 114 cttttcaacc acccaaatca tgaaagctat <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 115 ctttcaagtg tagataatgg ttggtct <210> 116 <211> 42 <212> DNA <213> Artific <220> <223> Cebador <400> 116 aagatatccg ctgaccttgt tggcgatcca ataaaacaag <210> 117 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebado <400> 117 attgattgca tcctatcttt catgaataca gat 33 <210> 118 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 118 acattttcta cctacgaatg caaacggaca ttcgct <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 119 aacccttctg agagttttcg gaac <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 120 gtggttgatg ctctcatatt a <210> 121 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 121 gagacgaatc cacgatatcg aagagca <210> 122 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 122 gataaatgca ttgaagaagc tgttgtattt <210> 123 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 123 tgcatgtttg cagtaagggc gttggttgct <210> 124 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 124 gacaattgtg cttctatcag gaaatcatgc <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 125 gtcttatcaa agcaacaaac aaca <210> 126 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 126 gactatcttt ctagtgacaa tggggaatat attgatagc <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 127 ggtaggccta atgctgtgac cacctca <210> 128 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 128 tatgctggac aggttgaacg tgacccagta <210> 129 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 129 tataatgctg caagacagct aatgaatatg cagctagaaa ca <210> 130 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 130 tgcttcaact cctccttgaa cttcaactac gccaactac <210> 131 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 131 attatggctc ttggggaact tcgccgtcga cttcttgcga ttaagagctg a <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 132 aaggaagcca ttgttcgact <210> 133 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 133 cgtgccggca tcggcgtcgt actcccac <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 134 ctttgtgaat tccgcacgca ccct <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 135 ggcttctgtc ggaatattcg ccgg <210> 136 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 136 tgattcgtag atagtctcgt gagtgacctc tgtactctt <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 137 agagaatata ttgataggca <210> 138 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador attatgcc a tcaatatatt ctct <210> 139 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 139 tgggccaaga accatttttc cccaaccacc atcttcattc tgttgatt <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 140 cattaaggtt gcataattca tacacgatcc <210> 141 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 141 tttttccaat gcatccttat gatcaccatt tcgctt <210> 142 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 142 ctgtggtatt gcagttgcag ttccatgaga <210> 143 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 143 atgtggaacc aaccacaatt caggtataat 30 <210> 144 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 144 tgccattgac atgtatatca accgggtaaa acaccaaaaa cg 42 <210> 145 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> .145 gttgcagtaa ggtatactat agaggtcttg tcgcagagc <210> 146 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 146 acaataatca cgcgccttgt ccca <210> 147 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 147 tttcgttagg caaccagata taagatcttg tgcccgtgag cg <210> 148 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 148 tcttagcttg tttgctggcc accaattcaa aat <210> 149 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 149 atgctccatg aggttagtta aagctctatc <210> 150 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 150 aatagggcaa atgcccacat atttggttga <210> 151 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 151 ttcaggcgaa tttgggtttt ctacccaaca acaaat <210> 152 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 152 gctatgacat ccatcatata cctgtgc <210> 153 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 153 acaataggca tgaattatga acgctagttc <210> 154 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 154 gataaactcg ctag aagat ccgtgga <210> 155 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 155 atagctttca tgatttgggt ggttgaaaag <210> 156 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 156 agaccaacca ttatctacac ttgaaag <210> 157 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 157 gtcttgtttt attggatcgc caacaaggtc agcggatatc <210> 158 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 158 atctgtattc atgaaagata ggatgcaatc aat <210> 159 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 159 agcgaatgtc cgtttgcatt cgtaggtaga <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 160 gttccgaaaa ctctcagaag ggtt <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 161 taatatgaga gcatcaacca c <210> 162 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 162 tgctcttcga tatcgtggat tcgtctc <210> 163 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 163 aaatacaaca gcttcttcaa tgcatttatc <210> 164 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 164 tgtagcaacc aacgccctta ctgcaaacat gca <210> 165 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 165 tttgcatgat ttcctgatag aagcacaatt gtc <210> 166 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 166 tgttgtttgt tgctttgata agac <210> 167 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 167 gctatcaata tattccccat tgtcactaga aagatagtc <210> 168 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 168 tgaggtggtc acagcattag gcctacc <210> 169 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 169 tactgggtca cgttcaacct gtccagcata <210> 170 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador tgtttctagé tgcatattca ttagctgtct tgcagcatta ta 42 <210> 171 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 171 gtagttggcg tagttgaagt tcaaggagga gttgaagca <210> 172 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 172 tcagctctta atcgcaagaa gtcgacggcg aagttcccca agagccataa t 51 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 173 aswskammaa trryttyvtw <210> 174 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 174 wsrrakaacm ggtwycag <210> 175 <211> 19 <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 175 kytmtt wty mtkccdmyc <210> 176 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 176 kwcgctacat wtacwrtc <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador 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<220> <223> Cebador <400> 187 ga wgta at gtagcgwm <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 188 akgcatyett wwsaycacca <210> 189 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 189 drobaawytcr ybartdagat cm <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <220> <221> misc_feature <222> (11) .. () <223> n es a o c o <400> 190 tgtgrcgatr natrsyttt <210> 191 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 191 yrchgatgaw gtgcaytc <210> 192 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 192 arttgthgta kgtytttcc <210> 193 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 193 kwkttcctgt tggggraar <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 194 awygggtata kattscggta <210> 195 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 195 tttcctcgca tacactgccc gttgtt <210> 196 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 196 tattccgaca gaagccaa <210> 197 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 197 tctttgtgaa ttccgcac <210> 198 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 198 gttggggaaa aatggttc <210> 199 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 199 ttttcttccg attcaccc <210> 200 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 200 attg ggagc caattttg <210> 201 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 201 tggatgtcat agctggga <210> 202 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 202 tatccgctga ccttgttg <210> 203 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 203 cgaatccacg atatcgaa <210> 204 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 204 gtggatgggg tgaagact <210> 205 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 205 tatggctctt ggggaact <210> 206 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 206 gtatggattt cgtaccgtaa at <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 207 cctgcgacaa gacctctata <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 208 ctcaaccctt ctgagagttt t <210> 209 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 209 cagcttggtc tacaactgtt ac <210> 210 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 210 cagaggtagt tagaaaaatt attggact <210> 211 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 211 ggcggaggat ggaatgaagg ca <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 212 cagtgggatt ctcttcatta tgc <210> 213 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 213 agccttttga tctgtggcga ta <210> 214 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 214 gtggctcatc acattgatca ca <210> 215 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 215 tgggcaatgt tggctttaat tt <210> 216 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 216 gcctagacat ccatgtttgt ttccatatca <210> 217 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Estructura consensus <220> <221> SITIO <222 (1) .. (1) <223> Xaa es Lys/ Arg <220> <221> SITIO <222 (2).. (2) <223> Xaa es Gly/ Ala <220> <221> SITIO <222 (3) .. (4) <223> Xaa es incierto <220> <221> SITIO <222 (5).. (5) <223> Xaa es Phe/Tyr/Trp <220> <221> SITIO <222 (6) .. (6) <223> Xaa es Leu/Ile/Val <220> <221> VARIANTE <222 (3) .. (4) <220> <221> VARIANTE <222 (11) .. (12) <400> 217 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Gly Xaa Trp 1 5 10 15 <210> 218 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Estructura consensus <400> 218 Asp Cys Thr Ala Glu <213> Artificial <220> <223> Cebador <400> 219 gcgagtaagg atcctcacgc aaggaattcc gaccagacag gcc 43 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada incención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un ácido nucleico aislado obtenible desde una planta dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa que codifica a un polipéptido que tiene actividad de ß-amirina sintasa, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa codifica a la secuencia de aminoácidos OAT ß-amirina sintasa mostrada en el Anexo (II) .
2. 2. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa comprende: la secuencia de cDNA del Anexo I o la porción codificadora de la misma; la secuencia de gDNA del Anexo VIII o uno o más exones de la misma; una secuencia que es degenerativamente equivalente a cualquiera de estas.
3. 3. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia variante que es una variante homologa de una secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa de la reivindicación 2 y que comparte al menos aproximadamente 70 %, 80 % o 90 % de identidad con ésta, la secuencia variante es, ya sea: (i) una derivada de la secuencia de nucleótidos de ß- amirina sintasa de la reivindicación 2, o (ii) codifica a un alelo u homólogo de ß-amirina sintasa obtenible de unas especies de plantas.
4. 4. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia variante es una derivada que codifica a un polipétido, o fragmento de polipéptido, el cual difiere de la secuencia del Anexo II, por la manera de adición , eliminación o substitución de uno o más aminoácidos .
5. 5. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia variante es una homologa obtenible desde una planta monocotiledónea seleccionada de: arroz, maíz, trigo, cebada.
6. 6. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia variante codifica a un polipéptido que tiene las características de ß-amirina sintasa.
7. 7. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia , la cual es el complemento de la secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
8. 8. Un ácido nucleico aislado para uso como sonda o cebador, el ácido nucleico tiene una secuencia distintiva, de al menos aproximadamente 16- 24 nucleótidos de extensión, la secuencia está presente en ya sea una secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa de la reivindicación 2 o el complemento de la misma.
9. 9. Un ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 8, para uso como un cebador de amplificación caracterizado porque consiste de 48, 36 o menos nucleótidos de extensión.
10. 10. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es seleccionado del cebador mostrado en la Tabla 1, Tabla 2 o Tabla 3, en donde se usan los siguientes códigos de nucleótidos: M = A o C; R = A o G; W = A o T; S= C o G; Y = C o T; K = G o T; V = A o C o G; H = A o C o T; D = A o G o T; = C o G o T; N = A o C o G o T, o ASEQ1 : GCATTGGCCTGGTGATTA ASEQ2 : GCCCATGAGGTGGTCACA ASEQ3 : GGCGCGTGATTATTGTGC ASEQ4 : CATGAACTCGTGCGCCTT ADPRApaF: GCGAGTAAGGATCCTCACGCAAGGAATTCCGACCAGACCAGACAGGCC AMY8R : TCAGCCACGGACCGCCGCCCTCACCTATT AMY9R: TTAGCCTCCACATGGTGCGCACCAACAACG AMYPR010R : GGACATCGAGGTGGTTGCATTTTAGTGGATC AMYPR01 IR : GGTGCTCTTGCTTGTTCTATGGCCTCGTCTTT
11. 11. Un método para identificar, clonar, o determinar la presencia de un ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el método emplea un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 1 a 10.
12. 12. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar una preparación de ácido nucleico desde una célula vegetal; (b) proporcionar una molécula de ácido nucleico cuyo ácido nucleico sea de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 o 7 a 10. (c) poner en contacto un ácido nucleico en dicha preparación con la molécula de ácido nucleico bajo condiciones para hibridización, y, (d) identificar una variante de ácido nucleico si está presente su hibridización con dicha molécula de ácido nucleico .
13. 13. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar una preparación de ácido nucleico desde una célula vegetal; (b) proporcionar un par de cebadores de moléculas de ácido nucleico adecuados para PCR, al menos uno de dichos cebadores que sea un cebador de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10. (c) poner en contacto el ácido nucleico en dicha preparación con los cebadores bajo condiciones para que se efectúe la PCR, (d) efectuar la PCR y determinar la presencia o ausencia de un producto de PCR amplificado.
14. 14. Un vector recombinante caracterizado porque comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
15. 15. Un vector de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ácido nucleico está operablemente unido a un promotor para trascripción en una célula huésped, en donde el promotor es opcionalmente un promotor inducible.
16. 16. Un vector de conformidad con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, caracterizado porque es un vector vegetal.
17. 17. Un método caracterizado porque comprende la etapa de introducir el vector de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en una célula huésped, y opcionalmente ocasionar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de la célula huésped modo de transformar la célula huésped.
18. 18. Una célula huésped caracterizada porque contiene o es transformada por un ácido nucleico heterólogo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 a manera de alterar una o más de las características de las células con respecto respecto a la síntesis triterpenoide y/o resistencia a hongos patógenos.
19. 19. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 18 caracterizada porque es Saccharomyces cerevisiae.
20. 20. Una célula huésped de conformidad · con la reivindicación 18, caracterizada porque es una célula vegetal, opcionalmente presente en una planta.
21. 21. Un método para producir una planta transgénica, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) efectuar un método de conformidad con la reivindicación 17, (b) regenerar una planta desde la célula vegetal transformada .
22. 22. Una planta transgénica caracterizada porque es obtenible por el método de la reivindicación 21, o porque es un clon, o progenie híbrida o natural u otro descendiente de la planta transgénica, la cual en cada caso incluye la célula vegetal de la reivindicación 20.
23. 23. Una planta de conformidad con la reivindicación 22 caracterizada porque es seleccionada de la lista que consiste de: cebada, phaseolus, chícharo, remolacha azucarera, maíz; avena; solanum; allium; cucurbitáceas; camote; arroz, centeno; sorgo; soya; abeto; fresa; caña de azúcar; girasol, tomate; trigo.
24. 24. Una parte de propágulo desde una planta de conformidad con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, caracterizada porque en cada caso incluye la célula vegetal de la reivindicación 20.
25. 25. Un polipéptido aislado caracterizado porque es codificado por la secuencia de nucleótidos de ß-amirina sintasa o la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el polipéptido codificado por la variante tiene una o ambas de las propiedades siguientes: la actividad de ß-amirina sintasa de la secuencia de aminoácidos mostrada en el anexo II; reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido de ß-amirina sintasa de avena del anexo II.
26. 26. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos del anexo II.
27. 27. Un método de elaborar el polipéptido de la reivindicación 25 o la reivindicación 26, caracterizado porque comprende la etapa de ocasionar o permitir la expresión desde un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un célula huésped adecuada.
28. 28. Un polipéptido caracterizado porque comprende el sitio de enlace antigénico de un anticuerpo que tiene afinidad de enlace específica por el polipéptido de la reivindicación 26.
29. 29. Un método para influenciar o afectar la cantidad o la calidad de síntesis triterpenoide en una planta, caracterizado porque comprende la etapa de ocasionar o permitir la expresión de un ácido nucleico heterólogo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8 en las células de la planta, siguiendo a una etapa anterior de intoducir el ácido nucleico en una célula de la planta o un ancestro de ésta.
30. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 29 para alterar una o más de: resistencia a un hongo patógeno; sabor; apetibilidad; valor nutricional, de la planta.
31. 31. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el hongo patógeno es un ascomiceto que tiene una membrana que contiene esterol, opcionalmente seleccionado de: Gaeumannomyces graminis vars tritici y avenae; Fusarium culmorum; Fusaqrium avanaceum; Staganospora nodorum; Stagonospora avenae.
32. 32. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el triterpenoide es una saponina de triterpeno tipo oleanana, y el método comprende la etapa adicional de aislar ésta de la planta.
33. 33. Un método de conformidad con la reivindicación 30, para reducir el nivel de triterpenoides en la planta, caracterizado porque comprende cualquiera de las etapas siguientes: (i) ocasionar o permitir la transcripción desde un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 en la planta a manera de reducir la expresión de .amirina sintasa por medio de un mecanismo antisentido; (ii) ocasionar o permitir la transcripción desde un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una parte de las mismas, a manera de reducir la expresión de ß-amirina sintasa por medio de co-supresión; (iii) uso del ácido nucleico que codifica a una ribozima especifica para un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
34. 34. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica al promotor de un gen de ß-amirina sintasa de avena.
35. 35. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34 caracterizado porque el promotor tiene la secuencia mostrada en el anexo (IX) .
36. 36. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el promotor es una variante homologa de la secuencia mostrada en el anexo (IX) la cual comparte al menos aproximadamente 50 %,60 %, 70 .%, 80 % o 90 % de identidad con ésta o un fragmento de la misma, dicha secuencia variante tiene actividad promotora.
37. 37. Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende un promotor de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 34 a 36 operablemente unido a una secuencia codificadora heteróloga.