MXPA01011130A

MXPA01011130A - Uso de moleculas coestimuladoras solubles para incrementar las respuestas inmunes

Info

Publication number: MXPA01011130A
Application number: MXPA/A/2001/011130A
Authority: MX
Inventors: Knut Sturmhoefel; Stanley F Wolf; Toole Margot O
Original assignee: Genetics Institute Llc*
Priority date: 1999-05-06
Filing date: 2001-11-01
Publication date: 2002-06-05

Abstract

Se presentan métodos para incrementar las respuestas inmunes, a través de los cuales formas solubles de moléculas co- estimuladoras, por ejemplo, moléculas B7, se administran para incrementar las respuestas inmunes a antígenos, por ejemplo, a células tumorales y agentes infecciosos. Los métodos de 1a presente invención sonútiles tanto para la inmunización profiláctica como para la inmunización terapéutica de sujetos.

Description

USO DE MOLÉCULAS COESTIMULADORAS SOLUBLES PARA INCREMENTAR LAS RESPUESTAS INMUNES SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad sobre la Solicitud Norteamericana Provisional No. de Serie 60/132,944 presentada el dia 6 de Mayo de 1999, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad aqui por referencia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para que las células T respondan a proteínas foráneas se deben proporcionar dos señales a través de células de presentación de antigenos (APCs) a linfocitos T en reposo (Jenkins, M. y Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D.L., et al. (1990) J. Im unol. 144, 3701-3709). La primera señal, que proporciona especificidad a la respuesta inmune, es transducida través del receptor de célula T (TCR) después del reconocimiento de péptido antigénico foráneo presentado en el contexto del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) . La segunda señal, que se conoce como coestimulación, induce las células T a proliferar y volverse funcionales (Lenschow et al. 1996 Annu. Rev. Immunol. 14:233). La co-estimulación no es especifica para antigenos, ni restringida a MHC y se piensa que es proporcionada por una o varias moléculas de superficie celular distintas expresadas por APCs (Jenkins, M.K. et al. 1988 J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gi mi, C.D., et al., 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88_, 6575-6579; Young, J. ., et al. 1992 J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H., et al. 1992 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 8_9, 271-275; van-Seventer, G.A., et al. (Í990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M. et al. 1991 J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M.I., et al., 1989 J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J., et al. 1992 Nature 357, 80-82; Liu, Y., et al. 1992 J. Exp. Med. 175, 437-445) . Si las células T son solamente estimuladas a través del receptor de células T, sin recibir una señal co-esti uladora adicional, se vuelven no responsivas, anérgicas o mueren, lo que resulta en una modulación descendente de la respuesta inmune. Las proteínas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) , expresadas en APCs, son moléculas co-estimuladoras criticas (Freeman et al. 1991. J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. 1989 J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. 1993 Nature 366:76; Freeman et al. 1993. Science 262:909). B7-2 parece desempeñar una función predominante durante respuestas inmunes primarias, mientras que B7-1, cuando es regulada hacia arriba, después en el transcurso de una respuesta inmune, puede ser importante para prolongar las respuestas de células T primarias o bien para co-esti ular respuestas de células T secundarias (Bluestone. 1995. Immunity. 2:555). Un ligando al cual se une B7-1 y B7-2, CD28, es expresado constitutivamente en células T en reposo e incrementa su expresión después de activación. Después de señalización a través del receptor de células T, la ligación de CD28 y la transducción de una señal co-e'stimuladora induce las células T a proliferar y a secretar IL-2 (Linsley, P.S., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al. 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88_, 6575-6579; June, C.H., et al. 1990 Innaunol. Today. ? , 211-6; Harding, F.A., et al. 1992 Nature. 356, 607-609) . Un segundo ligando, conocido como CTLA4 (CD152) es homólogo a CD28 pero no es expresado en las células T en reposo y aparece después de la activación de las células T (Brunet, J.F., et al., 1987 Nature 328, 267-270). En contraste con CD28, CTLA4 parece ser critico en la regulación negativa de respuestas de células T (Waterhouse et al. 1995. Science 270:985). El bloqueo de CTLA4 provoca la remoción de señales de inhibición, mientras que la agregación de CTLA4 proporciona señales inhibidoras que regulan de manera descendente las respuestas de células T (Allison y Krummel. 1995. Science 270:932). Ha habido una necesidad desde hace mucho tiempo de desarroXlar métodos para incrementar las respuestas inmunes. Por ejemplo, la respuesta inmune a ciertos virus y a células tu orales ha sido a la fecha dificil de incrementar empleando métodos reconocidos en la técnica. Métodos para incrementar respuestas inmunes en general y en particular para incrementar respuestas a antigenos tumorales y agentes infecciosos (por ejemplo, antigenos virales, bacterianos, y/o parásitos) serian de gran provecho. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece métodos para incrementar las respuestas inmunes mediante la manipulación de la via co-estimuladora. Los métodos de la presente invención son especialmente efectivos para aumentar respuestas a antigenos tumorales y antigenos provenientes de agentes infecciosos. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento que formas solubles de moléculas co-estimuladoras pueden incrementar de manera profiláctica y terapéutica las respuestas inmunes. Este incremento se observa a pesar del hecho que las moléculas co-estimuladoras solubles de la invención no son administradas en una fase sólida (por ejemplo, no son administradas en una célula) y son administradas en ausencia de un agente de reticulación. Estos hallazgos son particularmente sorprendentes tomando en cuenta las enseñanzas que formas solubles de moléculas B7-1 y B7-2 no generan respuestas co-estimuladoras (Hayden et al. 1996. Tissue Antigens. 48:242; Patente Norteamericana 5,580,756) . Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención ofrece métodos para incrementar profilácticamente una respuesta inmune por un sujeto a una antigeno mediante la administración de una composición soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula co-estimuladora, cié tal manera que se incremente la respuesta inmune del sujeto al antigeno . En otro aspecto, la invención ofrece métodos para incrementar terapéuticamente una respuesta inmune por un sujeto a un antigeno mediante la administración de una composición soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula co-estimuladora de tal manera que se incremente la respuesta inmune del sujeto al antigeno. En una modalidad, la molécula co-estimuladora se selecciona dentro del grupo que consiste de B7-1 y B7-2. En otro aspecto, la invención ofrece un método para incrementar la respuesta de células T CD8+ a un antigeno restringido de clase I en un sujeto mediante la administración de un primer agente que comprende un antigeno restringido de clase Y o fragmento del mismo y una composición soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula B7, de tal manera que al administrase al sujeto la célula T CD8+ se incremente la respuesta a un antigeno restringido de clase I. En una modalidad, los métodos comprenden además la administración de un antigeno restringido de clase II al sujeto. En otra modalidad, los métodos comprenden además la administración de un adyuvante al sujeto. En una modalidad, la molécula B7 es una molécula B7-1. En otra modalidad, la molécula B7 es una molécula B7-2. En una modalidad, la molécula co-estimuladora es monoespecifica. En otra modalidad, la molécula co-estimuladora es dimérica y bivalente. En una modalidad, la molécula co-estimuladora soluble es monoespecifica y dimérica y bivalente. En otra modalidad de la invención, una porción extracelular de una molécula B7 es fusionada sobre una segunda proteina o polipéptido que comprende una porción de una molécula de inmunoglobulina. En una modalidad, la porción de la molécula de inmunoglobulina comprende las regiones de articulación, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina humana. En otra modalidad, la porción de la molécula de inmunoglobulina comprende las regiones de articulación, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la molécula de inmunoglobulina ha sido modificada para reducir la fijación de complemento y/o enlace de receptor Fc. En una modalidad, el antigeno es un antigeno de célula tumoral . En otra modalidad, el sujeto tiene un cáncer de un tipo seleccionado dentro del grupo que consiste de: cáncer de colón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de células renales, leucemia, linfoma, melanoma, mastocitoma, sarcoma, y carcinoma de la vejiga. En una modalidad, el antigeno es un antigeno seleccionado dentro del grupo que consiste de: un antigeno bacteriano, un antigeno viral, y un antigeno de parásito. En una modalidad, la respuesta inmune es una respuesta inmune celular. En otra modalidad, la respuesta inmune es una respuesta inmune humoral. LEYENDAS DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra respuesta proliferativa especifica para antigeno de células provenientes de ratones inmunizados con péptidos restringidos de clase II con o sin co-administración de B7-2Ig (100 µg) . La figura 2 muestra que células provenientes de ratones que han recibido un tratamiento único con B7-2Ig al momento de la inmunización primaria presentaron respuesta proliferativas mayores después de una segunda inmunización que células de ratones que nunca recibieron B7-2Ig. Los datos provienen de experimentos replicados. La figura 3 muestra que la co-administración de B7-2lg incrementa la respuesta de CTL a la inmunización con péptido restringido de clase I . La figura 4 muestra la respuesta de CTL de ratones inmunizados con péptido restringido de clase I en presencia o ausencia de péptido restringido de clase II y tratamiento con B7-2Ig.

La figura 5 muestra que B7-IgG proporciona una señal co-estimuladora para la proliferación in vitro y la secreción de linfocina en esplenocitos. La figura 6 muestra que B7Ig es efectiva como adyuvante en un modelo de vacuna profiláctica contra tumor. La figura 7 muestra que la vacuna terapéutica de ratones con células tumorales P815 irradiadas combinadas con B7-1- o B7-2-IgG induce la regresión del tumor y prolonga la supervivencia . La figura 8 muestra que la inmunización de ratones con B7-IgG como adyuvante para una vacuna de células tumorales irradiadas terapéutica es efectiva en varios modelos de tumores de ratones diferentes. La figura 9 muestra que el efecto antitumor de la administración terapéutica de B7-IgG sola en ratones es comparable a su efecto como adyuvante de vacuna. La figura 10 muestra que células T o B se requieren para la actividad antitumor mediada por B7-IgG. La figura 11 muestra que células T CD8+, pero no CD4+, se requieren para mediar la actividad antitumor B7-IgG. La figura 12 muestras que la terapia con B7-IgG de tumores establecidos es independiente de IFN-? de huésped. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece métodos mejorados para incrementar respuestas inmunes mediante la administración de moléculas co-estimuladoras solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de una molécula B7 o una proteina de fusión de B7) para incrementar de esta forma respuestas inmunes. Las moléculas co-estimuladoras solubles son administradas sin un agente de reticulación, sin embargo, sorprendentemente, estimulan respuestas de células T. De hecho, los solicitantes han encontrado que los métodos de la presente invención resultan en un nivel incrementado de co-estimulación en comparación con las moléculas co-estimuladoras presentadas en una superficie, por ejemplo, moléculas co-estimuladoras en la superficie de una célula. Antes de una descripción adicional de la presente invención, ciertos términos empleados en la especificación, ejemplos y reivindicaciones adjuntas se presentan a continuación para mayor comodidad. Definiciones Como se emplea aqui el término "profilácticamente" incluye la administración de una molécula co-estimuladora antes de exposición al antigeno o simultáneamente con la exposición al antigeno contra el cual la respuesta inmune debe desarrollarse, incrementarse, y/o realzarse. Como se emplea aqui, el término "terapéuticamente" incluye la administración de una molécula co-estimuladora para tratar una infección o enfermedad existente o en curso (por ejemplo, cáncer o infección viral o bacteriana) que podria beneficiarse del tratamiento con una molécula co-estimuladora. Para tratamiento terapéutico, una molécula co-estimuladora es administrada en un punto de tiempo después de la exposición al antigeno contra el cual se debe desarrollar, incrementar y/o realzar la respuesta inmune. Se entenderá que un tratamiento terapéutico con una molécula co-estimuladora puede tener otros efectos benéficos sobre la respuesta inmune de un sujeto, por ejemplo, que no son específicos para el antigeno particular. Como se emplea aqui, el término "célula inmune" incluye células que son de origen hematopoyético y desempeñan una función en una respuesta inmune. Las células inmunes incluyen linfocitos tales como células B y células T; células asesinas naturales; células de mieloide, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos, y granulocitos . Como se emplea aqui, el término "respuesta inmune" incluye respuestas de células T y/o células B, es decir, respuestas inmunes celulares y/o humorales. En una modalidad, los métodos reclamados pueden ser empleados para reducir las respuestas de células T auxiliares. En otra modalidad, los métodos reclamados pueden ser utilizados para reducir respuestas de células T citotóxicas. Los métodos reclamados pueden ser utilizados para reducir respuestas inmunes primarias y secundarias. La respuesta inmune de un sujeto puede ser determinada, por ejemplo, mediante el hecho de ensayar la producción de anticuerpos, proliferación de células inmunes, liberación de citocinas, expresión de marcadores superficiales celulares, citotoxicidad, etc. Como se emplea aqui, el término "co-estimulan" con referencia a células inmunes activadas, incluye la capacidad de una molécula co-estimuladora para proporcionar una segunda señal mediada por receptor no activante (una "señal co-estimuladora") que induce la proliferación o la función efectora. Por ejemplo, una señal co-estimuladora puede resultar en la secreción de citocinas, por ejemplo, en una célula T que ha recibido una señal mediada por receptor de células T, Como se emplea aqui, el término "molécula co-estimuladora" incluye moléculas presentes en células de presentación de antigeno (por ejemplo, B7-1, B7-2, B7RP-1 (Yoshinaga et al. 1999, Nature 402:827), B7h (Swallow et al. 1999. Immunity. 11:423) y/o moléculas relacionadas (por ejemplo homólogos) ) que se unen con receptores co-estimuladores (por ejemplo, CD28, CTLA4, ICOS (Hutloff et al. 1999. Nature 397:263), ligando B7h (Swallow et al. 1999. Immunity. 11:423) y/o moléculas relacionados) en células T. Estas moléculas se conocen también colectivamente aqui como "moléculas B7". Como se emplea aqui, la expresión "B7" o "molécula B7" incluye moléculas B7-1, moléculas B7-2, moléculas B7RP-1 (Yoshinaga et al. 1999. Nature 402:827), moléculas B7h (Swallow et al. 1999. Immunity. 11:423), que ocurren naturalmente, moléculas estructuralmente relacionadas, fragmentos de tales moléculas, y/o equivalentes funcionales de las mismas. El término "equivalente" abarca secuencias de aminoácidos que codifican moléculas co-estimuladores funcionalmente equivalentes que tienen una actividad de una molécula B7, por ejemplo, la capacidad de unirse con el (los) ligando (s) natural (es) de B7 en células inmunes, como por ejemplo, CTLA4, ICOS y/o CD28 en células T, y/o la capacidad de modular la co-esti ulación de células inmunes. Como se emplea aqui, el término "polipéptido (s) " se refiere a cualquier péptido o proteina que comprende dos o más aminoácidos unidos entre ellos por enlaces de péptido o bien enlaces de péptido modificados. El término "polipéptido (s) " se refiere tanto a cadenas cortas, que se conocen habitualmente como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, como a cadenas largas que se conocen generalmente como proteínas . Los polipéptidos pueden contener aminoácidos otros que los 20 aminoácidos codificados en los genes. Los "polipéptido (s) " incluyen los modificados ya sea por procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones post-translacionales, pero también por técnicas de modificación química. Tales modificaciones son descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, asi como en una literatura de investigación amplia, y son bien conocidas de los expertos en la materia. Se observará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en un grado diferente en varios sitios en un polipéptido dado. Asi mismo, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo la estructura de polipéptido, las cadenas laterales de aminoácido y las terminales amino o carboxi. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de una porción hemo, fijación covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, fijación covalente de un lipido o derivado de lipido, fijación covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPl, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, fijación de lipidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, selenoilación, sulfatación, adición mediada por transferencia de ARN de aminoácidos a proteínas, como por ejemplo arginilación, y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, Proteins-Structure And Molecular Properties, (proteinas-estructura y propiedades moleculares) 2da. edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993) y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, (modificaciones proteinicas post-translacionales : perspectivas y pronósticos) páginas 1-12 en Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, (modificación covalente post-translacional de proteínas) B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, (síntesis de proteina: modificaciones post-translacionales y envejecimiento) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992). Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y circulares ramificados pueden resultar de procesos naturales post-translacionales y pueden efectuarse por métodos totalmente sintéticos también. Como se emplea aqui, un "polipéptido aislado" o "proteina aislada" se refiere a un polipéptido o una proteina sustancialmente libre de otros polipéptidos, proteínas, material celular y medio de cultivo cuando se aisla de células o se produce por técnicas de ADN recombinante, o bien precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o una porción biológicamente activa del mismo es sustancialmente libre de material celular u otros polipéptidos contaminantes de la fuente tisular o celular a partir de la cual se deriva el polipéptido B7, o bien sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido B7 en donde el polipéptido es separado de los componentes celulares de las células a partir de las cuales es aislado o producido de manera recombinante. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido B7 que tienen menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de polipéptido no B7 (se conoce también aqui como "polipéptido contaminante' con mayor preferencia menos que aproximadamente 20% de polipéptido no B7, con preferencia todavía mayor, menos que aproximadamente 10% de polipéptido no B7, y especialmente menos que aproximadamente 5% de polipéptido no B7. Cuando el polipéptido B7 o una porción biológicamente activa del mismo es producido de manera recombinante, es también de preferencia sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos que aproximadamente 20%, de preferencia menos que aproximadamente 10%, y con mayor preferencia menos que aproximadamente 5% del volumen de la preparación de polipéptido. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos" incluye preparaciones de polipéptido B7 en donde el polipéptido es separado de los precursores químicos u otros agentes químicos involucrados en la síntesis del péptido. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos incluye preparaciones de polipéptido B7 que tienen menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o agentes químicos no B7, con mayor preferencia menos que aproximadamente 20% de precursores químicos o agentes químicos no B7, con preferencia todavía mayor menos que aproximadamente 10% de precursores químicos o agentes químicos no B7, y especialmente menos que aproximadamente 5% de precursores químicos o agentes químicos no B7. Moléculas preferidas de ácido nucleico B7 y polipéptidos están "ocurriendo naturalmente". Como se emplea aqui, una molécula "que ocurre naturalmente" se refiere a una molécula B7 que tiene una secuencia de nucleótidos que ocurre en la naturaleza (es decir, codifica un polipéptido B7 natural) . Además, variantes que ocurren naturalmente o no naturalmente de estos polipéptidos y moléculas de ácido nucleico que conservan la misma actividad funcional, por ejemplo, la capacidad de modular la adaptación al estrés y/o virulencia en un microbio. Tales variantes pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por mutación empleando técnicas conocidas. Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente variantes. Como se emplea aqui, el término "variante (s) " incluye moléculas de ácido nucleico o polipéptidos que difieren en cuanto a secuencia de una molécula de ácido nucleico de referencia o de un polipéptido de referencia, pero conserva sus propiedades esenciales. Cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia. Cambios de nucleótidos pueden resultar en sustituciones, adiciones, remociones, fusiones y truncados de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se comenta más adelante. Una variante tipica de un polipéptido difiere en cuanto a la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. En general, las diferencias son limitadas de tal manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son globalmente muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en cuanto a secuencia de aminoácidos por una o varias sustituciones, adiciones y/o remociones en cualquier combinación. Una variante de una molécula de ácido nucleico o polipéptido puede ocurrir naturalmente, como por ejemplo una variante alélica, o bien puede ser una variante de la cual no se sabe que ocurre naturalmente. Las variantes que no ocurren naturalmente de las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos pueden lograrse mediante técnicas de mutagenesis, por síntesis directa, y por otros métodos recombinantes conocidos por parte de los expertos en la materia. Por ejemplo, se entenderá que los polipéptidos B7 descritos aqui se refieren también a equivalentes de los mismos. Tales variantes pueden efectuarse, por ejemplo, por mutación utilizando técnicas conocidas. Alternativamente, variantes pueden ser sintetizadas químicamente. Por ejemplo, formas mutantes de polipéptidos B7 que son equivalentes funcionalmente, (por ejemplo, que tienen la capacidad de enlazarse con CTLA4 y/o CD28) pueden formarse utilizando técnicas bien conocidas. Las mutaciones pueden incluir, por ejemplo, por lo menos una de una mutación de punto discreto que puede provocar una sustitución, o bien a través de por lo menos una remoción o inserción. Por ejemplo, se puede utilizar una mutagenesis aleatoria. Se pueden efectuar también mutaciones por mutagenesis aleatoria o bien usando mutagenesis de cassette. En el primer caso, la región codificadora entera de una molécula es sometida a mutagenesis por uno de varios métodos (síntesis química, Reacción en Cadena de Polimerasa, síntesis de oligonucleótidos dopados) , y esta colección de moléculas mutadas aleatoriamente es sometida a procedimientos de selección y tamizado. En el último caso, regiones discretas de un polipéptido, que corresponden ya sea a determinantes estructurales o funcionales definidos son sometidas a mutagenesis de saturación o semi-aleatoria y estos cassettes sometidos a mutagenesis son reintroducidos en el contexto del alelo por otra parte de tipo silvestre. En una modalidad, se puede emplear mutagenesis por reacción en cadena de polimerasa. Por ejemplo, se puede emplear Megaprimer PCR (O. H. Landt, 1990. Gene 96:125-128) . Como se emplea aqui, el término "incremento a una respuesta inmune" incluye el incremento de respuestas de células T y/o B, es decir, respuestas inmunes celulares y/o humorales, mediante el tratamiento de un sujeto utilizando los métodos reclamados. En una modalidad, los métodos reclamados pueden ser utilizados para incrementar las respuestas de células T auxiliares. En otra modalidad, los métodos reclamados pueden ser utilizados para incrementar respuestas de células T citotóxicas. Los métodos reclamados pueden ser utilizados para incrementar tanto respuestas inmunes primarias como secundarias. De preferencia, los métodos reclamados incrementan la respuesta inmune de un sujeto cuando se compara con la respuesta inmune de un sujeto no tratado o un sujeto no tratado utilizando los métodos reclamados. Un incremento de una respuesta inmune puede observarse, por ejemplo, a través de una respuesta incrementada de células inmunes del sujeto al antigeno después de tratamiento con los métodos reclamados. La respuesta inmune de un sujeto puede ser determinado utilizando varias mediciones in vitro o in vivo de la activación de células inmunes, por ejemplo, ensayo de producción de anticuerpos, proliferación de células inmunes, liberación de citocinas, expresión de marcadores superficiales celulares, citotoxicidad, etc. Co o se emplea aqui, el término "soluble" incluye moléculas como por ejemplo, moléculas co-estimuladoras, que no están asociadas a células. Moléculas co-estimuladoras solubles conservan la función de las moléculas asociadas con células a partir de las cuales se derivan, es decir, son capaces de unirse con sus ligandos correspondientes en células T y mediar una transducción de señales a través de una molécula CD28 y/o CTLA4 en una célula T, sin embargo, están en forma soluble, es decir, no están unidas a membrana. De preferencia, las composiciones solubles comprenden un dominio extracelular de una molécula B7. Como se emplea aqui, el término "dominio extracelular de una molécula co-estimuladora" incluye una porción de una molécula co-estimuladora que, en la forma asociada con célula de la ' molécula co-estimuladora, es extracelular. De preferencia, el dominio extracelular de una molécula co-estimuladora comprende un dominio extracelular de una molécula B7. Un dominio extracelular de una molécula B7 incluye la porción de una molécula co-estimuladora que media la unión con CD28 y/o CTLA4. Por ejemplo, el dominio extracelular de B7-1 de ser humano comprende aproximadamente desde el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 208 de la forma madura de B7-1 (SEQ ID NO: 1) y el dominio extracelular de B7-2 de ser humano comprende desde aproximadamente el aminoácido 24 hasta aproximadamente el aminoácido 245 de la forma madura de B7-2 (SEQ ID NO: 2) . En una modalidad, una molécula co-estimuladora soluble comprende un dominio extracelular de una molécula B7 y comprende además una secuencia de señal. Como se emplea aqui, el término "antigeno restringido de clase I" incluye antigenos que se unen con la ranura de clase I de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y que son presentados a las células T en el contexto de moléculas de clase I de MHC. Los antigenos restringidos a clase I estimulan primariamente las células T CD8+. Como se emplea aqui, el término "antigeno restringido a clase II" incluye antigenos que se unen con la ranura de clase II de MHC y son presentados a células T en el contexto de moléculas de clase II de MHC. Antigenos restringidos a clase II estimulan primariamente las células T CD4+. Como se emplea aqui, el término "adyuvante" incluye agentes que potencian la respuesta inmune a un antigeno. Los adyuvantes pueden ser administrados en combinación con moléculas co-estimuladoras para incrementar adicionalmente la respuesta inmune. Como se emplea aqui, el término "monoespecifico" incluye moléculas co-estimuladoras solubles que tienen solamente una especificidad, es decir, que se unen específicamente a sus ligandos correspondientes, por ejemplo, CD28 o CTLA4 en células T. Tales agentes monoespecificos no han sido manipulados para incluir especificidades adicionales y por consiguiente no se unen de manera enfocada a otras moléculas de la superficie celular. Como se emplea aqui, el término "oligoespecificas" incluye moléculas co-estimuladoras solubles que tienen más que una especificidad, por ejemplo, que tienen una especificidad adicional para una molécula otra que un ligando B7, por ejemplo, una especificidad para una molécula de superficie celular, como por ejemplo un antigeno de célula tumoral o un receptor de célula T. Como se emplea aqui, el término "bivalente" incluye moléculas co-estimuladoras solubles que tienen dos sitios de enlace para interacción con su ligando correspondiente, por ejemplo, CD28 y/o CTLA4 por molécula co-estimuladora soluble. Como se emplea aqui, el término "dimérico" incluye formas solubles que están presentes como homodimeros, es decir, como una unidad que consiste de dos subunidades idénticas unidas entre ellas, por ejemplo, por enlaces disulfuro. Como se emplea aqui, el término "multimérico" incluye formas solubles que tienen más que dos subunidades. II. Moléculas co-estimuladoras solubles Los antigenos B7 son una familia de moléculas co-estimuladoras encontradas en la superficie de linfocitos B, células profesionales de presentación de antigenos (por ejemplo, monocitos, células dendriticas, células de Langerhans) y células que presentan antigeno a células inmunes (por ejemplo, queratinocitos, células endoteliales, astrositos, fibroblastos, oligodendrocitos) . Estas células co-estimuladoras unen ya sea CTLA4, CD28, y/o ICOS en la superficie de células T o bien otros receptores conocidos o todavía indefinidos en células inmunes. Los miembros de esta familia de moléculas co-estimuladoras pueden proporcionar co-estimulación a células T activadas para inducir de esta forma la proliferación de células T y/o secreción de citocinas. Técnicas de purificación para moléculas B7 han sido establecidas y, además, genes de B7 (ADNc) han sido clonados a partir de numerosas especies, incluyendo ser humano y ratón (véase, por ejemplo, Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262 : 909-911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366: 76-79; Freeman, G.J et al. (1993) J. Exp. Med. 178_: 2185-2192) . Secuencias de nucleótidos de moléculas co-estimuladoras se conocen en la técnica y pueden encontrarse en la literatura o bien en una base de datos como por ejemplo GenBank. Véase, por ejemplo, B7-2 (Freeman et al. 1993 Science. 262:909 o bien números de Acceso GenBank P42081 o A48754); B7-1 (Freeman et al. J. Exp. Med. 1991. 174:625 o números de Acceso GenBank P33681 o A45803) ; CTLA4 (véase por ejemplo Ginsberg et al. 1985. Science. 228:1401; o números de Acceso GenBank P16410 o 291929); y CD28 (Aruffo y Seed. Proc Nati.

Acad. Sci. 84:8573; o número de Acceso GenBank 180091), ICOS (Hutloff et al. 1999. Nature. 397:263; WO 98/38216) y secuencias relacionadas. Además de formas que ocurren naturalmente de moléculas co-estimuladoras, el término "molécula co-estimuladora" incluye también formas que no ocurren naturalmente, por ejemplo, variantes o formas mutantes de moléculas co-estimuladoras que conservan la función de una molécula co-estimuladora, por ejemplo, la capacidad de unirse con un contrareceptor correspondiente. Por ejemplo, secuencias de ADN capaces de hibridarse con ADN que codifica una molécula B7, en condiciones que evitan la hibridación con genes de moléculas no co-estimuladoras, (por ejemplo, en condiciones equivalentes a 65° C en 5 X SSC (1 X SSC = 150 mM NaCl/citrato de Na 0.15 M) ) pueden emplearse para elaborar anticuerpos antiB7. Alternativamente, secuencias de ADN que conservan identidad de secuencia en regiones de la molécula de ácido nucleico que codifica dominios de proteina que son importantes en función de molécula co-estimuladora, por ejemplo, enlace con otras moléculas co-estimuladoras, pueden emplearse para producir proteínas co-estimuladoras que pueden emplearse como inmunógenos. De preferencia, moléculas co-estimuladoras que no ocurren naturalmente tienen una identidad de aminoácidos significativa (por ejemplo, mayor que 70%, de preferencia mayor que 80%, y especialmente mayor que 90-95%) con una secuencia de aminoácidos que ocurre naturalmente de un dominio extracelular de molécula co-estimuladora . Para determinar residuos de aminoácidos de una molécula co-estimuladora que. son probablemente importantes en el enlace de una molécula co-estimuladora sobre su contrareceptor, secuencias de aminoácidos que comprenden dominios extraceluiares de moléculas co-estimuladoras de especies diferentes, por ejemplo, ratón y ser humano, pueden ser residuos alineados y conservados (por ejemplo, idénticos) notados. Esto puede efectuarse como por ejemplo, utilizando cualquier programa de alineación estándar como por ejemplo MegAlign (DNA STAR) . Dichos programas de alineación se describen con mayores detalles abajo. Tales residuos conservados o idénticos son probablemente necesarios para un enlace apropiado de moléculas co-estimuladoras sobre sus receptores y por consiguiente no es probable que puedan ser alterados . Por ejemplo, las regiones de la molécula de B7-1 que son importantes para mediar la interacción funcional con CD28 y • CTLA4 han sido identificadas por mutación. Dos residuos hidrofóbicos en el dominio de tipo V de B7-1, incluyendo el residuo Y87, que es conservado en todas las moléculas B7-1 y B7-2 clonadas de varias especies, fueron encontrados críticos (Fargeas et al. 1995, J. Exp. Med. 182:667). Utilizando estas técnicas o técnicas similares, residuos de aminoácidos de dominios extraceluiares de moléculas co-estimuladoras que son críticos y por consiguiente que no se prestan a alteración pueden determinarse. Utilizando moléculas de ADNc de B7, péptidos que tienen una actividad de B7 pueden ser producidos empleando técnicas estándares. Células huéspedes transfectadas para expresar péptidos pueden ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un péptido que tiene una actividad B7 puede ser expresado en células bacterianas como por ejemplo E. coli, células de insecto (baculovirus), levadura o bien células de mamíferos, como por ejemplo células de ovario de hámster Chino (CHO) y células NSO. Otras células huéspedes adecuadas y vectores de expresión adecuados pueden encontrarse en Goeddel (1990) supra o bien son conocidos de los expertos en la materia. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari. et al./ (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (células SF 9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow, V.A. y Su mers, M.D., (1989) Virology 170: 31-39). En general, células COS (Gluzman, Y., (1981) Cell 23: 175-182) se utilizan en combinación con tales vectores como pCDM8 (See'd, B., (1987) Nature 329: 840) para amplificación/expresión pasajera en células de mamíferos, mientras que células CHO ídhfr" Chinese Hámster Ovary) se utilizan con vectores tales como pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195) para amplificación/expresión estable en células de mamíferos. Una linea de células preferida para la producción de proteina recombinante es la linea de células de mieloma NSO disponible en ECACC (número de catálogo 85110503) y descrita en Galfre, G. y Milstein, C. ((1981) Methods in Enzymology (métodos en enzimologia) 73.(13) : 3-46; and Preparation of Monoclonal Sntibodies: Strategies and Procedures, (preparación de anticuerpos monoclonales: estrategias y procedimientos), Scademic Press, N.Y., N.Y.). ADN de vector puede ser introducido en células de mamíferos a través de técnicas convencionales tales como co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofectina o bien electroporación. Métodos adecuados para transformar células huéspedes pueden encontrarse en Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio), 2da. edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros textos de laboratorio. ' Cuando se emplea en células de mamíferos, las funciones de control de vector de expresión son proporcionadas frecuentemente por material viral. Por ejemplo, promotores comúnmente empleados son derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, y más frecuentemente virus de simio 40. Péptidos que tienen una actividad de B7 expresada en células de mamíferos o de otra forma pueden ser purificados de conformidad con procedimientos estándares en la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de columna de fraccionamiento (por ejemplo, intercambio de iones, filtración en gel, electroforesis, cromatografía por afinidad, etc.) y finalmente, cristalización (véase, en general, "Enzyme Purification and Related Techniques" (Purificación Enzimática y Técnicas Relacionadas) , Methods in Enzymology (métodos en enzimologia) , 22:233-577 (1971)). Las moléculas B7 para elaborar las moléculas B7 solubles para su uso en los métodos de la presente invención pueden derivarse de cualquier especie de mamífero, y de preferencia son de origen humano. La secuencia de nucleótidos de moléculas B7 de varias fuentes se conocen en la técnica. La secuencia de ADN completa de B7-1 de ser humano (CD80) tiene el número de acceso de GenBank M27533 y fue publicado por Freeman et al en 1989 en J. Immunol. 143:2714. La secuencia completa de ADNc de B7-2 de ser humano (CD86) tiene el número de acceso de GenBank L25259 y fue publicado por Freeman et al en Science en 1993, 262; 9090 o Azuma et al. Nature. 1993. 366:76. (Véase también el documento WO 96/40915 para la secuencia de B7-1 y de B7-2) . La secuencia de nucleótidos de B7-1 de ser humano y B7-2 de ser humano se muestran también en SEQ ID NOs: 1 y 2 (B7-1) y SEQ ID NOs: 3 y 4 (B7-2). Alternativamente, dicha secuencia puede ser determinada mediante el aislamiento de una molécula de ácido nucleico de B7 a partir de una fuente deseada con base en la capacidad de la secuencia para hibridarse con las secuencias B7 conocidas,, por ejemplo, de ser humano. Por ejemplo, las moléculas B7 pueden ser detectadas por su capacidad de hibridarse en condiciones altamente estrictas o con bajo nivel de estrictez con una molécula de ácido nucleico conocida que codifica un péptido que tiene una actividad B7. Condiciones de estrictez apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6.0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45° C, seguido por un lavado de 2.0 x SCCC a 50° C son conocidas por parte de los expertos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede seleccionarse desde un bajo nivel de estrictez de 2.0 x SSC a 50° C hasta un alto nivel de estrictez de aproximadamente 0.2 x SSC a 50° C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede ser incrementada desde condiciones de bajo nivel de estrictez a temperatura ambiente, aproximadamente 22° C, a condiciones de alto nivel de estrictez a temperatura de aproximadamente 65° C. En modalidades preferidas, las moléculas B7 son moléculas B7 de ser humano . En una modalidad, la molécula co-estimuladora soluble es derivada de una molécula BB7-1 o B7-2 que ocurre naturalmente. Polipéptidos que tienen una actividad de una molécula B7 de conformidad con lo descrito aqui, y que tienen una secuencia que difiere de una molécula B7 que ocurre naturalmente debido a la degeneración en el código genético pueden también ser expresados en forma soluble y se encuentran también dentro del alcance de la invención. Tales ácidos nucleicos codifican polipéptidos que son funcionalmente equivalentes a B7, (por ejemplo, un polipéptido que tiene una actividad B7), pero difieren en secuencia de la secuencia de B7-1 o B7-2 conocida en la técnica. Por ejemplo, numerosos aminoácidos son designados por más que un triplete. Codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo CAU y CAC son sinónimos para histidina) pueden ocurrir debido a la degeneración del código genético. En un ejemplo, polimorfismos de secuencia de ADN dentro de la secuencia de nucleótidos de una molécula B7 (especialmente los polimorfismos dentro de la tercera base de un codón) pueden resultar en mutaciones "silenciosas" en el ADN que no afectan el aminoácido codificado. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de secuencias de ADN que no provocan cambios en las secuencias de aminoácidos del antigeno de B7 existirán dentro de una población. Se observará por parte de un experto en la materia que estas variaciones en uno o varios nucleótidos (hasta aproximadamente 3-4% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen la actividad de un antigeno de linfocito B novedoso pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos resultantes de aminoácidos se encuentran también dentro del alcance de la presente invención. Además, pueden existir una o varias isoformas o bien moléculas B7 de reacción cruzada relacionadas. Además de las variantes alélicas que ocurren naturalmente, moléculas B7 dentro del alcance de la presente invención pueden elaborarse utilizando técnicas conocidas. En otra modalidad, una molécula co-estimuladora soluble es una forma modificada de B7-1 o B7-2 que conserva la función de una molécula co-estimuladora B7, es decir, es funcionalmente idéntica. La secuencia de ADN de una antigeno de iinfocito B puede ser modificada por técnicas genéticas para producir proteínas o polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Tales secuencias se consideran dentro del alcance de la presente invención, en donde el polipéptido expresado es capaz de unirse con CTLA4 y/o CD28 y modular respuestas inmunes mediadas por células T asi como función inmune. Por ejemplo, en una modalidad, mutaciones pueden ser introducidas en una molécula de ADN a través de cualesquiera de numerosos métodos, incluyendo los métodos para la producción de remociones o inserciones simples, remociones, inserciones, o sustituciones sistemáticas de grupos de bases o sustituciones de bases únicas, para generar variantes o equivalentes modificados de ADN de antigeno de linfocito B. Por ejemplo, cambios en secuencias de ADNc de B7-1 o B7-2, tales como sustituciones o remociones de aminoácidos, se obtienen de preferencia por mutagenesis dirigida hacia sitio. Sistemas de mutagenesis dirigidos hacia sitio son bien conocidos en la técnica. Protocolos y reactivos pueden ser obtenidos comercialmente en Amersham International PLC, Amersham, Reino Unido. Polipéptidos modificados que tienen una actividad de una molécula B7, es decir, la capacidad de unirse al (a los) ligando (s) natural (es) de una molécula BB7 y modular respuesta inmunes mediadas por células T, como se evidencia por ejemplo a través de producción de citocina y proliferación de células T por células T que han recibido una señal de activación primaria se consideran dentro del alcance de la presente invención. Otro ejemplo de modificación de un péptido que tiene la actividad de una molécula B7 es la sustitución de residuos de cisteina, de preferencia con alanina, serina, treonina, leucina o residuos de ácido glutámico para minimizar la dimerización a través de enlaces bisulfuro. Además, cadenas laterales de aminoácido de un péptido que tiene una actividad B7 pueden ser químicamente modificadas. Otra modificación es la ciclización del péptido Con el objeto de incrementar la estabilidad y/o reactividad, polipéptidos que tienen actividad B7 pueden ser modificados para incorporar uno o varios polimorfismos en la secuencia de aminoácidos del antígeno resultante de cualquier variación alélica natural. Además, D-aminoácidos, no naturales, o bien análogos que no son aminoácidos pueden ser sustituidos o agregados para producir una proteina modificada dentro del alcance de la presente invención. Además, los péptidos pueden ser modificados empleando polietilenglicol (PEG) de conformidad con el método de A. Sehon y colegas (Wie et al., supra) para producir un péptido conjugado con PEG. Además, se puede agregar PEG durante la síntesis química del péptido. Otras modificaciones de los péptidos incluyen reducción/alquilación (Tarr en: Methods of Protein Microcharacterization (Métodos de Microcaracterización de Proteínas), J.E. Silver ed., Humana Press, Clifton NJ 155-194 (1986) ) ; acilación (Tarr, supra) ; acoplamiento químico sobre un vehículo apropiado (Mishell y Shiigi, eds. Selected Methods in Cellular Immunology (Métodos seleccionados en Inmunología celular), WH Freeman, San Francisco, CA (1980), Patente Norteamericana 4,939,239; o bien tratamiento suave con formalina (Marsh (1971), Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol. 41:199-215) . Polipéptidos de B7 preferidos tiene una actividad b7 y por lo menos aproximadamente una identidad del 60%, de preferencia por lo menos una identidad de aproximadamente el 70%, y con mayor preferencia una identidad de por lo menos aproximadamente el 80% con una secuencia de aminoácidos de B7 que ocurre naturalmente. Polipéptidos que tienen una actividad B7 y una identidad de por lo menos aproximadamente el 90%, de preferencia por lo menos aproximadamente el 95%, y con mayor preferencia una identidad de por lo menos aproximadamente 98-99% con una molécula BB7 que ocurre naturalmente se encuentran también dentro del alcance de la presente invención. El término "identidad" de aminoácido en una posición dada se refiere a dos péptidos que tienen los mismos aminoácidos en posiciones correspondientes cuando las secuencias de aminoácidos de los péptidos están alineadas. Cuando una posición en las secuencias comparadas es ocupada por el mismo aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. Un grado (porcentaje) de identidad entre las secuencias depende del número de posiciones correspondientes o idénticas compartidas por las secuencias. Una persona con conocimientos normales en la materia puede fácilmente alinear dos secuencias de aminoácidos para proporcionar una alineación biológicamente significativa. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dios secuencias pueden también lograrse utilizando un algoritmo matemático. En una modalidad, el porcentaje de identidad entre os secuencias de aminoácidos es determinado utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J.

Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea la matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, 5, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos es determinado empleando el programa GAP en el paqueta de programática GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos es determinado empleando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2) utilizando una tabla de residuos de pesos de PAM 12, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Las secuencias de ácido nucleico y de proteína de la presente invención pueden utilizarse además como una "secuencia de búsquedas" para efectuar una búsqueda contra bases de datos públicas por ejemplo para identificar otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden efectuarse empleando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Búsquedas de nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas con moléculas de ácido nucleico de la invención. Búsquedas de proteína BLAST pueden efectuarse con el programa XBLAST, resultado = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de proteína B7 de la invención. Para obtener unas alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST de conformidad con lo descrito en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utiliza los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden emplearse. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. "Por lo menos una porción de un dominio extracelular de una molécula B72 se define como una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de dominio extracelular entera de B7 o una porción de la misma que codifica un polipéptido que tiene una actividad (es decir, la capacidad de enlace con el (los) ligando (s) natural (es) de B7 en células inmunes, como por ejemplo enlace con CTLA4 y/o CD28 en células T) . Un péptido que tiene una actividad B7 se enlaza con CTLA4 y/o CD28" y modula una respuesta inmune mediada por una célula T, de conformidad con lo evidenciado, por ejemplo, por el enlace con estos ligandos o mediante la inducción de producción de citocina y/o proliferación por células T que han recibido una señal de activación primaria como se muestra en los Ejemplos adjuntos. En una modalidad preferida "por lo menos una porción de un dominio extracelular de una molécula B7" incluye un polipéptido que comprende la porción extracelular entera de un antigeno de B7 de ser humano (por ejemplo, aproximadamente los residuos de aminoácidos 1-208 de la secuencia de B7-1 o aproximadamente los aminoácidos 24-245 de la secuencia de B7-2) que pueden utilizarse para unirse con CTLA4 y/o CD28. Además de polipéptidos de B7 que comprenden solamente aminoácidos que ocurren naturalmente, se proporciona también peptidomiméticos de B7. Análogos de péptidos son frecuentemente utilizados en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las propiedades del templado de péptido. Estos tipos de compuestos que no son péptidos se conocen como "miméticos de péptidos" o bien "peptidomiméticos" (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug. Res. 15:29; Veber y Freidinger (1985) TINS página 392; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 1229, las cuales se incorporan aqui por referencia) y se desarrollan habitualmente con la ayuda de modelado molecular computarizado . Peptidomiméticos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) , como por ejemplo B7, pero tienen uno o varios enlaces de péptidos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado dentro del grupo que consiste de -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en las siguientes referencias: Spatola, A.F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins (Química y Bioquímica de Aminoácidos, Péptidos y Proteínas) , "B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, página 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Marzo de 1983), volumen 1, número 3 "Peptide Backbone Modifications (Modificaciones de Estructuras de Péptidos) (reseña general); Morley, J.S., Trends Pharm Sci (1980) páginas 463-468 (reseña general) ; Hudson D. et al., Int J Pept Prot Res (1979) 14:177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-) ; Spatola, A. F. et al., Life Sci (1986) 38:1243-1249 (-CH2-S) ; Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH, cis y trans); Almquist, R.G. et al., J Med Chem (1980) 23:1392-1398 (-COCH2); Jennings-White, C et al., Tetrahedron Lett (1982) 23:2533 (-C0CH2-) ; Szelke, M. et al., European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay, M.W. et al., Tetrahedron Lett (1983) 24:4401-4404 (-C (OH) CH2-) ; y Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31:189-199 (-CH2-S-) ; que se incorporan aquí por referencia. Un enlace no péptido particularmente preferido es -CH2NH- . Tales peptidomiméticos pueden tener ventajas significativas en comparación con modalidades de polipéptidos incluyendo, por ejemplo una producción más económica, una mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas incrementadas (vida media, absorción, potencia, eficacia,- etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y otros. El marcado de peptidomiméticos incluye habitualmente la fijación covalente de uno o varios marcadores, directamente o bien a través de un espaciador (por ejemplo un grupo amida) , en posición (es) que no interfiere (n) en el peptidomimético que se predicen por datos de actividad estructural cuantitativos y/o modelado molecular. Dichas posiciones que no interfieren generalmente son posiciones que no forman contactos directos con la(s) macromolécula (s) a la cual se une el peptidomimético para producir el efecto terapéutico. La derivatización (por ejemplo marcado) de peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético. Una sustitución sistemática de uno o varios aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de B7 con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede emplearse para generar péptidos más estables. Además, péptidos limitados que comprenden una secuencia de aminoácidos de B7 o una variación de secuencias sustancialmente idéntica pueden ser generados por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387, que se incorpora aqui por referencia); por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internas capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido.

Los expertos en la materia pueden, sin experimentación exagerada, producir polipéptidos que corresponden a las secuencias de péptido de B7 y variantes de secuencia. Tales polipéptidos pueden ser producidos en células huéspedes procarióticas o eucarióticas por expresión de polinucleótidos que codifican una secuencia de péptido B7, frecuentemente como parte de un polipéptido mayor. Alternativamente, tales péptidos pueden ser sintetizados por métodos químicos. Métodos para expresar polipéptidos heterólogos en huéspedes recombinantes, síntesis química de polipéptidos, asi como traslación in vitro son bien conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio) (1989) , 2a Edición, Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger y Ki mel, Methods in Enzimology (Métodos en Enzimología) , volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Guia de Técnicas de Clonación Molecular) (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S.B.H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:597; y Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins (Proteínas Semisintéticas) , Wiley Publishing, las cuales se incorporan aqui por referencia.

Se pueden producir péptidos por ejemplo mediante síntesis química directa. Los péptidos pueden ser producidos como péptidos modificados, con porciones no péptido fijadas por enlace covale?te sobre la terminal N y/o la terminal C. En ciertas modalidades preferidas, ya sea la terminal carboxi o bien la terminal amino, o bien ambas terminales, presentan modificaciones químicas. Las modificaciones más comunes de los grupos amino y carboxilo terminales son la acetilación y la amidación, respectivamente. Modificaciones de la terminal amino tales como acilación (por ejemplo, acetilación) o alquilación (por ejemplo, metilación) y modificaciones de terminal carboxi tales como amidación, asi como otras modificaciones de terminales, incluyendo la ciclización, pueden incorporarse en varias modalidades de la invención. Ciertas modificaciones de terminal amino y/o terminal carboxi y/o extensiones de péptido en la secuencia de núcleo pueden proporcionar propiedades físicas, químicas, bioquímicas y farmacológicas provechosas, como por ejemplo: mayor estabilidad, potencia y/o eficacia incrementada, resistencia a proteasas séricas, propiedades farmacocinéticas deseables, y otras. La invención proporciona también polipéptidos B7 quiméricos o de fusión. Como se emplea aqui, un "polipéptido quimérico" o "polipéptido de fusión" B7 comprende un polipéptido B7 operativamente enlazado a un polipéptido no B7. Un "polipéptido B7" se refiere a u polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde al polipéptido B7, mientras que un "polipéptido no B7" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un polipéptido que no es sustancialmente homólogo al polipéptido B7, por ejemplo, un polipéptido que difiere del polipéptido B7 y que se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de un polipéptido de fusión B7, el polipéptido B7 puede corresponder a la totalidad o una parte de un polipéptido B7. En una modalidad preferida, un polipéptido de fusión B7 comprende por lo menos una porción biológicamente activa de un polipéptido B7. Dentro del polipéptido de fusión, el término "enlazado operativamente" tiene el propósito de indicar que el polipéptido B7 y el polipéptido no B7 están fusionados en cuadro entre ellos. El polipéptido no B7 puede estar fusionado con la terminal N o la terminal C del polipéptido B7. Fragmentos de ácido nucleico preferidos codifican los polipéptidos B7 de por lo menos aproximadamente 40 residuos de aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos aproximadamente 80 residuos de aminoácidos de longitud y con mayor preferencia de por lo menos aproximadamente 120 residuos de aminoácidos de longitud. Fragmentos particularmente preferidos tienen por lo menos aproximadamente 220 aminoácidos de longitud, por ejemplo, comprenden un dominio extracelular entero de una molécula B7. Numerosos procesos pueden ser empleados para generar fragmentos de una secuencia de ADN aislada. Pequeñas subregiones o fragmentos del ácido nucleico que codifica las proteínas B7-1 o B7-2, por ejemplo, de una longitud de 1 a 30 bases, pueden ser preparados por medios químicos orgánicos sintéticos estándares. La técnica es también útil para preparación de iniciadores para su uso en la generación de fragmentos sintéticos más grandes de ADN de B7. Subregiones más grandes o fragmentos mayores de los genes que codifican antigenos de linfocito B pueden ser expresados como péptidos mediante la síntesis de la parte relevante de ADN empleando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 2 Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Clonación Molecular 2; Un Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)), y ligando el ADN obtenido de esta forma en un vector de expresión apropiado. Empleando una reacción en cadena de polimerasa, se generan secuencias específicas del ADN de doble cadena clonado, el cual es clonado en un vector de expresión, y después ensayado para actividad de enlace CTLA4/CD28. Por ejemplo, para expresar una forma secretada (soluble) de la proteína B7-1 o B7-2 de ser humano empleando reacción en cadena de polimerasa, un ADN puede ser sintetizado el cual no codifica la transmembrana ni las regiones citoplásmicas de la proteína. Esta molécula de ADN puede ser ligada en un vector de expresión apropiado e introducida en una célula huésped como por ejemplo CHO, en donde el fragmento de proteína B7 es sintetizado y secretado. El fragmento de proteína B7 puede ser fácilmente obtenido a partir de los medios de cultivo. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos una parte de una molécula B7, como por ejemplo una porción de dominio extracelular que no tiene la porción de transmembrana de la molécula se coloca en un vector de expresión y es expresada por una célula huésped de tal manera que la molécula B7 no sea expresada en la superficie de la célula. Por ejemplo, el ADNc que codifica un dominio extracelular de una molécula B7 puede ser sintetizado empleando la ' reacción en cadena de polimerasa (Patente Norteamericana 4,683,202) empleando iniciadores derivados de la secuencia publicada de B7-1 o B7-2 (véase Freeman et al., J. Immunol. 1989. 143:2714 o Science. 1993. 262:9090). Las secuencias de ADNc resultantes pueden ser ensambladas después en un vector de expresión eucariótico o procariótico y el vector puede ser empleado para dirigir la síntesis de un dominio extracelular de B7 por células huéspedes apropiadas, por ejemplo, células COS o CHO. En otra modalidad, el vector de expresión incluye un ADN que codifica un péptido que tiene una actividad de un antigeno B7 y un ADN que codifica un segundo péptido. El segundo péptido de preferencia no es derivado de una molécula co-estimuladora. De preferencia, una proteína de fusión o quimérica B7 de la invención es producida por técnicas de ADN recombinante estándares. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las secuencias de polipéptido diferentes son ligados juntos en cuadro de conformidad con técnicas convencionales, por ejemplo empleando terminales de extremo romo o de extremo escalonado para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar las terminales apropiadas, relleno de extremos cohesivos según lo apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, se puede efectuar una amplificación por reacción en cadena de polimerasa de fragmentos de genes empleando iniciadores de ancla que provocan la formación de salientes complementarias entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden ser subsecuentemente fusionadas y reamplificadas para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , edición, Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión pueden conseguirse en el comercio los cuales ya codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Una molécula de ácido nucleico que codifica B7 puede ser clonada en un vector de expresión de este tipo, de tal manera que la porción de fusión esté unida en cuadro con la proteina B7. Por ejemplo, se puede agregar hexa-histidina al péptido para purificación por cromatografía de afinación de ion metal inmovilizado (Hochuli, E. et al. , (1988) Bio/Technology 6 : 1321-13259. Además, para facilitar el aislamiento de un antígeno de linfocito B exento de secuencias irrelevantes, se pueden introducir sitios de disociación de endoproteasa específicos entre las secuencias de una porción de fusión y el péptido. Puede ser necesario incrementar la solubilidad de un péptido mediante la adición de grupos funcionales la péptido, o bien mediante la omisión de regiones hidrofóbicas del péptido. En una modalidad, el ADN que codifica una molécula B7 o una porción de la misma es unida en cuadro al ADN que codifica un antígeno al cual se desea una respuesta inmune, por ejemplo, un antigeno viral o un antigeno de célula tumoral . En una modalidad, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos que corresponde a un dominio extracelular de una antígeno B7 está unida a ADN que codifica las secuencias de aminoácidos que corresponden a la región constante de una molécula de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana 5,580,756 o WO 97/28267). El segundo péptido puede incluir una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio C?l de ser humano o un dominio C?4 o Cµ o porción del mismo (por ejemplo, las regiones de articulación, CH2 y CH3 de IgC?l de ser humano o IgC?4 de ser humano, véase, por ejemplo, Capón et al. Patente Norteamericana 5,116,964, que se incorpora aqui por referencia) . Una proteína de fusión B7Ig resultante puede tener solubilidad, afinidad de enlace, estabilidad y/o valencia (es decir, el número de sitios de enlace disponibles por moléculas) alteradas y puede incrementar la eficiencia de purificación de proteína. En una modalidad preferida, los residuos de cisteína en la región constante de inmunoglobulina son conservados para permitir el enlace disulfuro y la formación de proteínas B7Ig diméricas solubles. En una modalidad, una porción de una molécula B7 es fusionada con la región constante de un anticuerpo IgM o porción del mismo para permitir la formación de formas multiméricas solubles de proteínas B7Ig. Proteínas de fusión B7Ig particularmente preferidas incluyen una porción de dominio extracelular o un dominio de tipo región variable de B7-1 o B7-2 de ser humano acoplado con una región constante de inmunoglobulina. La región constante de inmunoglobulina empleada en la molécula B7 soluble puede contener modificaciones genéticas que reducen o eliminan la actividad efectora inherente en la estructura de inmunoglobulina (por ejemplo, WO 97/28267) . Por ejemplo, un ADN que codifica una porción extracelular de B7-1 o B7-2, asi como ADN que codifica el dominio de tipo región variable de B7-1 o B7-2 o el dominio de tipo región constante de B7-1 o B7-2 pueden unirse a ADN que codifica las regiones de articulación, CH2 y CH3 de IgC?l y/o IgC?4 de ser humano modificada por mutagenesis enfocada a sitio . Si se emplea una región constante de inmunoglobulina no humana, de preferencia la región constante es humanizada. Técnicas para preparar anticuerpos quiméricos o humanizados son bien conocidas (véase, Morrison et al., Proc. Nati. Acad.

Sci. U.S.A. 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., Patente Norteamericana No. 4,816,567; Boss et al., Patente Norteamericana No. 4,816,397; Tanaguchi et al., Publicación de Patente Europea EP171496; Publicación de Patente Europea 0173494; Patente del Reino Unido GB 2177096B, Teng et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, -4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol, 93:3-16 (1982); Publicación PCT WO92/06193 y EP 0239400) .

Las técnicas para ensamblar y expresar a ADN que codifica las secuencias de aminoácidos que corresponden al antigeno B7 y moléculas B7Ig solubles, por ejemplo, síntesis de oligonucleótidos, reacción en cadena de polimerasa, células transformantes, vectores de construcción, sistemas de expresión, y similares son bien establecidas. Proteínas de fusión B7 y polipéptidos producidos por técnicas recombinantes pueden ser secretados y aislados a partir de una mezcla de células y medio que contiene la proteina o el péptido. Alternativamente, la proteína o el péptido pueden ser conservados citoplásmicamente y las células cosechadas, Usadas y la proteína aislada. Un cultivo celular típico incluye células huéspedes, medios y otros ingredientes. Medios adecuados para cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Proteina y polipéptidos pueden ser aislados de medio de cultivo celular, células huéspedes o bien empleando ambas técnicas para purificar proteínas y péptidos. Técnicas para la transfección de células huéspedes y la purificación de proteínas y péptidos se describe con mayores detalles aquí . III Tamizado de Moléculas Co-estimuladoras Solubles Estructuralmente Relacionadas para determinar su Actividad El tamizado de moléculas B7 estructuralmente relacionadas para determinar las moléculas que conservan una actividad de antigeno de linfocito B característica de conformidad con lo descrito aquí puede lograrse empleando uno o varios ensayos diferentes. Por ejemplo, los péptidos pueden ser tamizados para determinar si conservan una reactividad específica con un anticuerpo monoclonal anti-B7 que se une a una molécula B7 que ocurre naturalmente. Específicamente, células apropiadas, tales como células COS, pueden ser transfectadas con un ADN que codifica una polipéptido a probar. La producción de formas secretadas de B7 puede ser evaluada empleando anticuerpo monoclonal anti-B7 o proteína de fusión CD28 o CTLA4Ig en un ensayo de inmunoprecipitación. La capacidad de células para expresar un péptido de interés para unión con CTLA4 o CD28 en placas fue también probada. Alternativamente, la capacidad de un péptido de prueba de competir con una molécula B7 que ocurre naturalmente para unión con CD28 o CTLA4 fue también probada. Otros ensayos más preferidos se establecen para determinar las características funcionales del antígeno de B7. Como se estableció previamente, la capacidad de células T para sintetizar citocinas depende no solamente de la ocupación o reticulación del receptor de célula T para antigeno (la "señal de activación primaria" proporcionada por ejemplo por anti-CD3 o bien éster de forbol para producir una "célula T activada") sino también de la inducción de una señal co-estimuladora, en este caso, por interacción con un antígeno de linfocito B, por ejemplo B7-1, o B7-2, con moléculas CD28 y/o CTLA4 en 1-a célula T. El enlace de moléculas B7 en su(s) ligando (s) natural (es) en células T que han recibido señal a través del receptor de célula T, tiene el efecto de transmitir una señal a la célula que induce la producción de niveles incrementados de citocirías, especialmente de interleucina-2, lo que estimula a su vez la proliferación de los linfocitos T. Otros ensayos para la función B7, por consiguiente, involucran el hecho de ensayar la síntesis de citocinas, como por ejemplo interleucina-2, interleucina-4, o bien otras citocinas y/o ensayar la proliferación de células T por células TCD28+ que han recibido una señal de activación primaria. In vitro, se pueden proporcionar células T con una primera señal de activación o señal de activación primaria mediante la puesta en contacto de dichas células con un anticuerpo monoclonal anti-T3 (por ejemplo, anti-CD3) o bien éster de forbol, o bien, con mayor preferencia por antígeno en asociación con moléculas MHC de clase I o de clase II. Las células T que han recibido una señal de activación primaria se conocen aquí como células T activadas. La función B7 es ensayada mediante la adición de una fuente de B7 (por ejemplo, células que expresan un péptido que tiene una actividad B7 o una forma secretada de B7) y una señal de activación primaria como por ejemplo antigeno en asociación con MHC de clase I o de clase II a un cultivo de células T y ensayando para determinar la presencia de un resultado funcional, por ejemplo, ensayando el sobrenadante de cultivo para determinar la presencia de interleucina-2, gamma inferieron, o bien otra citocina conocida o desconocida. Por ejemplo, cualesquiera de varios ensayos convencionales para interleucina-2 puede emplearse, como por ejemplo el ensayo descrito en Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:1333 (1989), cuyas porciones pertinentes se incorporan aquí por referencia. Un conjunto de elementos para ensayo para la producción de inferieron se encuentra también disponible en Genzyme Corporation (Cambridge, MA) . La proliferación de células T puede también medirse de conformidad con lo descrito en los ejemplos siguientes. Los péptidos que conservan las características del antigeno B7 de conformidad con lo descrito aquí pueden resultar en una producción incrementada de citocinas por célula, como por ejemplo IL-2, por células T y pueden también resultar en una proliferación incrementada de células T en comparación con un control negativo en donde no se encuentra una señal co-estimuladora. IV Métodos para Administrar Moléculas Co-estimuladoras Solubles Las composiciones y/o agentes de la presente invención descritos aquí se administran a sujetos en los cuales es deseable promover una respuesta inmune. En una modalidad, moléculas B7 solubles son administradas con un antígeno profilácticamente, por ejemplo, antes de la infección con un patógeno o bien a un sujeto que ?o presenta cáncer. En otra modalidad, las moléculas B7 solubles de la presente invención se administran terapéuticamente, por ejemplo, a sujetos que tienen una condición preexistente que podría beneficiarse de una co-estimulación incrementada, por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer o infectado con un patógeno. En una modalidad, las moléculas co-estimuladoras de la presente invención se co-administran con una preparación de antigeno. Un antigeno puede ser una proteína, un polisacárido, un lipopolisacárido, un lipopéptido o bien puede ser una combinación de cualesquiera de estos. Por ejemplo, el antigeno puede incluir una proteina nativa o bien un fragmento de proteina de una proteína sintética o un fragmento de proteina, o péptido; puede incluir glicoproteína, glicopéptido, lipoproteína, lipopéptido, nucleoproteína, nucleopéptido; puede incluir un conjugado péptido-péptido; o bien puede incluir un producto de expresión de ácido nucleico recombinante. En una modalidad, una preparación antigénica comprende una mezcla de antigenos por ejemplo, el antígeno es administrado en forma de células irradiadas (por ejemplo, células tumorales o bien células infectadas por virus) , partículas virales, o bien un homogenado crudo. En otra modalidad, una preparación purificada de un péptido antigénico o una forma recombinante de un péptido antigénico se administra al sujeto, por ejemplo, péptido viral o un antigeno asociado con tumor. En una modalidad, una preparación de antigeno comprende un péptido restringido MHC de clase I. En otra modalidad, una preparación de antigeno comprende un péptido restringido MHC de clase II. En otra modalidad, una preparación de antígeno comprende una combinación de un péptido restringido de clase I y un péptido restringido de clase II para administración al sujeto. En una modalidad, el antígeno se administra por "inmunización genética". En esta modalidad, un vector de expresión de ADN que codifica el péptido e interés es inyectado en el animal huésped, por ejemplo, en la piel o en músculo del sujeto. Los productos génicos son sintetizados correctamente (y glicosilados, doblados, y expresados por el sujeto. Empleando este método, se pueden administrar antigenos que son difíciles de obtener en cantidad suficiente o con un grado de pereza adecuado. En una modalidad, el ADN es inyectado en músculos o bien administrado a través de la piel aplicado en microparticulas de oro por un dispositivo de bombardeo de partículas, que se conoce como "pistola génica". Se ha determinado también que la inmunización genética induce respuestas humorales especificas y respuestas inmunes celulares (véase, por ejemplo, Mor et al. 1995. J. Irpmunol. 155:2039; Xu y Liew. 1995. Immunology. 84:173; Davis et al. 1994. Vaccine. 12:1503). El curso óptimo de administración de las moléculas B7 solubles puede variar según el sujeto a tratar. Por ejemplo, moléculas B7 solubles pueden ser administradas con un antígeno y/o pueden ser administrada solas antes de la administración de un antigeno, o bien pueden administrarse solas durante varios días después de la administración de un antígeno. En una modalidad, moléculas B7 solubles pueden ser administradas "genéticamente" mediante la administración de una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula B7 soluble o porción de la misma. En otra modalidad, una molécula B7 soluble y un antigeno se administran en forma de un conjugado. Regímenes de dosificación de administración de moléculas B7 solubles pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima para cada sujeto sin experimento excesivo. Por ejemplo, títulos de anticuerpo para un antigeno o bien respuestas inmunes celulares (por ejemplo, respuestas DTH (Puccetti et al. 1994 Eur. Immunol. 24:1446)) a un antígeno pueden medirse para determinar sí o no el sujeto esta desarrollando una respuesta inmune o esta manifestando una respuesta inmune incrementada a antígeno y el régimen de dosificación puede ser ajustado de manera correspondiente.

El agente activo o la composición puede también administrarse de manera parenteral o intraperitoneal. El agente puede ser administrado, por ejemplo, de manera intranasal, oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o mucosal. Dispersiones pueden también prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos . Composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones acuosas estériles (cuando están solubles en agua) o bien dispersiones de polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables y estériles. Una composición farmacéutica de la invención puede ser formulada de tal manera que sea adecuada para una vía particular de administración. Por ejemplo, en varias modalidades, una composición farmacéutica de la presente invención puede ser adecuada para inyección, inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o de la nariz) o bien para administración intranasal, mucosal, oral, bucal, parenteral, rectal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. El agente o composición debe ser estéril. Además, deben ser estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben ser protegidos contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un revestimiento como por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse a través de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación de composición activa o agente en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes de los mencionados arriba, según lo requerido, seguido por esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo (por ejemplo, la molécula co-estimuladora y/o el antígeno y cualquier agente adicional) en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos seleccionados entre los mencionados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos "de preparación son el secado en vacio y la íiofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo (por ejemplo, agente o composición) más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. El agente o composición puede ser administrado en una forma adecuada para su uso con un dispositivo de inyección sin agujas (dicho dispositivo se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, 5,383,851; 5,581,198; 5,846,233), por ejemplo, de conformidad con lo descrito en Mol Med 1998. 4:109. Cuando el agente activo o la composición es protegida adecuadamente, de conformidad con lo descrito arriba, la proteína puede ser administrada oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retardos de absorción e isotónicos, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que el medio convencional o el agente es incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados en las composiciones . Es especialmente provechoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. Una forma unitaria de dosificación, como se emplea aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención es regida y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos de dicho agente activo o composición para el tratamiento de individuos . Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye, por ejemplo, solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retardo de absorción y isotónicos, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Agentes complementarios pueden también incorporarse . Los agentes de la presente invención se administran a sujetos en forma biológicamente compatible adecuada para administración farmacéutica in vivo con el objeto de incrementar respuestas inmunes. Por "forma biológicamente compatible" adecuada para administración in vivo entendemos una forma de la proteína a administrar en la cual los efectos tóxicos son menores que los efectos terapéuticos del agente. Le término sujeto incluye organismos vivos en los cuales se puede provocar una respuesta inmune, por ejemplo, mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, ratones, ratas así como especies transgénicas de los mismos. La administración de un péptido que tiene la actividad de molécula B7 de conformidad con lo descrito aquí puede efectuarse en cualquier forma farmacológica que incluye una cantidad terapéuticamente activa de péptido B7 soluble solo, péptido B7 soluble en combinación con una antígeno, y un péptido B7 soluble en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente activa de las composiciones de la presente invención se define como una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. De preferencia, la administración de una molécula B7 soluble (con o sin antígenos resulta en una respuesta incrementada a un antígeno (por ejemplo, un antígeno de célula viral o tumoral) . La respuesta inmune a un antígeno por un sujeto (por ejemplo, una respuesta inmune celular y/o humoral) puede ser medida empleando técnicas reconocidas . Mediciones de respuestas inmunes a un antígeno pueden efectuarse in vivo o ensayarse in vitro. Por ejemplo, la radioactividad de célula inmune a una célula tumoral puede medirse mediante la realización de una biopsia y buscando infiltrados celulares la tinción de citosina in situ puede efectuarse en sitios de infección o bien cerca de sitios de un tumor o e.n nodos linfáticos de drenaje. El cultivo in vitro de células puede efectuarse para probar la reactividad celular a un antígeno (por ejemplo, la proliferación y/o producción de citocinas en presencia del antígeno y/o actividad citotóxica contra el antigeno) . Por ejemplo, una cantidad terapéutica o profilácticamente activa de un polipéptido que tiene una actividad B7 puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del péptido para provocar una respuesta deseada en el individuo. Regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica o profiláctica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden administrarse diariamente o bien la dosis puede ser reducida proporcionalmente de conformidad con lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. El compuesto activo puede ser administrado de manera conveniente como por ejemplo a través de inyección (subcutánea intravenosa) administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o bien administración rectal. Según la vía de administración, el compuesto activo puede ser revestido en un material para proteger el compuesto contra la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. La invención se refiere también el compuesto reactivo en forma de un fármaco para su uso en la terapia de conformidad con lo descrito aqui. El compuesto activo puede también emplearse en la fabricación de un fármaco para su uso en terapia. V. Administración de agentes adicionales El tratamiento del sujeto puede ser complementado con la administración de agentes adicionales para incrementar adicionalmente la respuesta inmune. Por ejemplo, adyuvantes y/o citocinas pueden ser administrados a un sujeto .

En una modalidad, citocinas tales como: factor de estimulación de colonias de granulocito-macrófago, factor de estimulación de colonias de macrófagos, factor de estimulación de colonias de granulocitos, interleucina 1, interleucina 2, interleucina 3, interleucina 4, interleucina 5, interleucina 6, interleucina 7, interleucina 10, y/o interleucina 12 pueden administrarse. Se puede administrar también interferón, por ejemplo, inferieron alfa, beta, y/o gamma. De preferencia, se administran citocinas tales como IL-12 que favorecen el desarrollo de las respuestas de células T auxiliares de tipo Thl y el desarrollo de la inmunidad celular. En otra modalidad, un agente adicional que modula una señal co-estimuladora, por ejemplo un anticuerpo anti-CD28 puede ser administrado al sujeto. En otra modalidad, agentes que son adyuvantes conocidos pueden ser administrados. En ese momento, el único adyuvante ampliamente utilizado en seres humanos ha sido alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) . Otros adyuvantes, por ejemplo, saponina y su complemento purificados Quil A., adyuvante complete de Freund, y otros adyuvantes utilizados en la investigación y en aplicaciones veterinarias tienen uso potencial en vacunas humanas. Sin embargo, nuevas preparaciones químicamente definidas tales como dipéptido de muramilo, monofosforillípido A, conjugados de fosfolípido, tales como los descritos por Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147:410-415 (1991), resorcinoles, surfactantes no iónicos tales como polioxietilenoleiléter y n-hexadecilpolietilenéter, inhibidores de enzimas incluyendo inhibidor de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol pueden también emplearse. En compuesto en los cuales se administra un antígeno, el antígeno puede estar encapsulado, por ejemplo con un proteoliposoma, de conformidad con lo descrito con Miller et al., J. Exp. Med 176:1739-1744 (1992) e incorporado aquí por referencia, o bien en vesículas de lípidos, tales costo vesículas de lípidos Novasome TM (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, N.H.), con el objeto de incrementar adicionalmente las respuestas inmunes. La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de la biológica celular, cultivo celular, biológica molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que se encuentran dentro del alcance de los conocimientos de los expertos en la materia, tales técnicas se explican cabalmente en la literatura. Véase, por ejemplo, Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual (Clonación Molecular: Manual de Laboratorio) segunda edición, editado por Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Short Protocols in Molecular Biology (Protocolos Cortos en Biología Molecular) , tercera edición, editado por Ausubel, F. et al (Wiley, N/ (1995)); DNA Cloning (Clonación de AND) Volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Síntesis de Oligonucleótidos) (M.J. Gait ed. (1984); Mullís et al. Patente Norteamericana número 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (Hibridación de Acido Nucleico) (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); el tratado, Methods In Enzymology (Métodos en Enzimología) (Academic Press Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Métodos Inmunoquímicos en Biología Celular y Molecular) (Mayer and Walker, eds. Academic Press, Londres (1987) ) ; Handbook Of Experimental Immunology (Manual de Inmunología Experimental), Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds. (1986)); y Miller, J. Experimente in Molecular Genetics (Experimentos en Genética Molecular) (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)). El contenido de todas las referencia, solicitudes de patentes pendientes y patentes publicadas, mencionadas en esta solicitud se incorporan expresamente por referencia, cada referencia divulgada aquí se incorpora en su totalidad por referencia. Cualquier solicitud de patente sobre la cual esta solicitud reclama prioridad se incorpora también por referencia aquí en su totalidad. La invención se ilustra adicionalmente a través de los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitativos de la invención. Ejemplos Ejemplo 1. Moléculas Co-estimuladores Solubles Incrementan las Respuestas de CTL Una activación de células T óptima requieren tanto de la señalización a través del receptor de las células T como de la co-estimulación B7-1 y B7-1 son dos moléculas co-estimuladoras potentes en la superficie de APCs. Los efectos de una forma soluble de una forma B7-2 sobre las respuestas de células T in vivo han sido examinados. La molécula soluble es una proteína quimérica que contiene el dominio extracelular de B7-2 fusionado sobre la región Fc de IgG2a de ratón. La administración de proteina de fusión B7-2 Ig al momento de la inmunización con péptidos restringidos de clase II incrementa significativamente la proliferación de células T específicas para antígeno y respuestas de citosina. La administración de B7-2Ig incrementa también la respuesta de CTL a la inmunización con un péptido restringido de tipo I. El incremento de la respuesta de CTL por B2-2Ig fue incrementada significativamente en presencia de una respuesta que células T auxiliares a péptidos restringidos de clase II. Estos hallazgos demuestran que la actividad estimuladora inmune de una forma de proteína soluble de moléculas co-estimuladores, por ejemplo B7-2 sobre varios parámetros de respuesta inmune de células T y demuestran que estas moléculas tienen una utilidad clínica en enfermedades infecciosas y vacunas. Materiales y métodos utilizados en el ejemplo 1: Ratones Ratones hembras BALB/c (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) de 7 a 10 semanas de edad fueron utilizados en todo este estudio. Preparación de inmunógenos de péptido. Todos los péptidos utilizados fueron epítopos inmunodominantes restringidos H-2d a partir de nucleoproteína (NP) de virus de influenza A/PR18/34. El péptido restringido de clase I, aa 147-155, TYQRTRALV, (Taylor P.M. et al., 1987, Immunogenetics 26:267) y los péptidos restringidos de clase II, aa 55-77, RLIQNSLTIERMVLSAFDERRNK-OH y aa 206-229, FWRGENGRKTRIAYERMCNILKGK, (Brett, S.J. et al., 1991, Journal Immunology 147-1647) fueron sintetizados en el sintetizador de péptidos PE Biosystems 430a utilizando química Fmoc/NMP estándar con activación de aminoácidos HOBT/DCC. Fueron analizados y purificados en un Beckman HPLC y se confirmó la masa utilizando un espectrómetro de masa Bruker MALDI . Preparación de linaje de virus AIPR18/34 El linaje de influenza AIPR/8/34 fue preparado y titulado mediante la inyección de virus de siembra en una dilución de 104 en huevos de gallina embrionados de 10 días. Después de 42 horas de incubación, los fluidos alantoicos de los huevos infectados fueron cosechados individualmente y la esterilidad fue confirmada en placas de agar de sangre. Los fluidos estériles fueron combinados, se prepararon alícuotas y se sometieron a congelamiento rápido con almacenamiento a una temperatura de -70°C. la titulación de placas (Bucher, D.J. et al. 1991, J. Clin Microbiol 29:2484) fue efectuada después de un descongelamiento rápido y dilución del virus (en fluido alantoico) . Proteína de fusión B7-2Ig La proteina de fusión B7-2Ig fue expresada y purificada de conformidad con lo descrito previamente (Fields, P.E. et al., 1998, J. Immunol 161:5268). En resumen, un plásmido de expresión pED fue construido a partir de ADNc que codifica la señal y dominios extraceluiares de B7-2 de murino unidos al ADN genómico que codifica las regiones de articulación, CH2 y CH3 de IgG2a de ratón. El vector de expresión fue transfectado en una linea de células CHO y amplificado por técnicas previamente descritas (Kaufman, R.J. et al., 1988. Journal of Biological Chemistry (Jornada de Química Biológica) 263:6352.). Sobrenadante de cultivo celular concentrado fue pasado en una columna rProtein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) . Se eluyó B7-2Ig con 20mM citrato pH 3.0, se neutralizó con Tris 1M (Sigma) pH 8.0, y se formuló en PBS pH 7.2 por intercambio de amortiguador. La concentración de proteína fue calculada utilizando una absorbencia a 280nm y un coeficiente de extinción de 1.33 cm/mg/ml. Los niveles de endotoxina fueron menores que 0.25 EU/mg de conformidad con lo determinado por ensayo de coagulación de gel (Capee Cod Asocciates) . El 'porcentaje de proteína como multímero fue inferior a 1% de conformidad con lo determinado por análisis utilizando una columna TSK 3000 SWXL (Toso Haas USA, Mogomeryville, PA) . La actividad co-estimuladora in vitro de B7-2Ig fue demostrada" (Fields, P.E-. et al. 1998, J. Immunol 161:5268). Experimentos presentados aqui han sido efectuados por lo menos 3 veces con resultados similares. Al menos una de las réplicas de cada-experimento fue efectuada utilizando IgG2a monoclonal de -ratón purificada dirigida contra una proteína humana irrelevante, GDF-9 (Genetics Institute, Cambridge MA) como control para el tratamiento de B7-2Ig. Inmunización de péptidos 100 µg del péptido indicado o de la mezcla de péptidos fueron mezclados 1:1 en volumen con IFA (Sigma) y emulsificados. Ratones fueron inmunizados subcutáneamente con una emulsión de antigeno/IFA den 100 µl en la base de la cola. Se administró B7-2Ig en 100 µl de manera subcutánea en un sitio próximo al sitio de inmunización de péptidos. En experimentos en donde células de nodo linfático fueron cosechadas, los ratones recibieron péptido y B7-2Ig de conformidad con lo descrito arriba, tanto en la base de la cola como en la parte posterior del cuello. Los grupos de tratamiento consistían de 5 ratones cada uno. Se administró B7-2Ig en hidróxido de aluminio al 0.1% (Rehydragel Rehies, Dublín, Irlanda) . Inmunización con virus vivo y reto Se administró Metafane (Mallinckrodt Veterinary, Mundelein, IL) por cono en una nariz hasta que los ratones perdieran la respuesta refleja. Virus vivo diluido en el PBS fue administrado de manera intranasal en un volumen final de 40 µl. La dosis de virus letal (4000 PFU/ratón) provocó una mortalidad del 100% en ratones no inmunizados. Una dosis de inmunización de 40PFU/ratón no provocó ninguna morbilidad y resultó en una protección completa contra reto letal. Ensayos de proliferación Los nodos linfáticos (excluyendo los nodos mesentéricos) y los bazos fueron recogidos en los dias indicados y se prepararon y cultivaron suspensiones de células individuales en placas de 96 pozos de fondo plano a 5 x 105 células/pozo en 200 µl en RPMI 1640 (Gibco/BRL) , complementado para contener 5 x 10~5 M 2ME, 2mM Lglutamina, 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (Gibco/BRL) . 10% FCS. Péptidos restringidos de clase II fueron agregados al inicio del cultivo en la concentración indicada. La proliferación fue medida por incorporación de 3H timidina después de un impulso de 18 horas (1 µC/pozo) con un lector de placas 1450 microbeta (Wallac) . La comparación de respuesta proliferativas de células de nodo linfático los días 3, 5, 7 y 9 después de una inmunización primaria se llevó a cabo.

Respuestas secundarias fueron evaluadas a partir de bazos cosechados tres días después de una inmunización secundaria. Ensayos de citocinas Células fueron cultivadas de conformidad con lo descrito arriba para ensayos de proliferación. Se cosecharon sobrenadantes los días 3 y se. determinaron los niveles de IFN-gamma, IL-5 e IL-13 por ELISA empleando conjuntos de elementos disponibles en el comercio (Genzyme, Cambridge MA para IFN-gamma, Endogen, Woburn MA para IL-5, y R&D Systems, Minneapolis, MN para IL-13) . Ensayo de CTL en muestras de células sanguíneas de ratón no fraccionadas individuales 2 o 3 semanas después de la inmunización primaria, muestras de sangre (250 µl a 200 µl cada una) fueron recogidas por sangrado retro-orbital de ratones anestesiados por Aerrane, (Ohmeda Caribe, Inc. Guayama, PR) las muestras fueron diluidas con 100 µl de PBS que contenía 50U de heparina. Una muestra de 40 µl fue removida para conteos de células sanguíneas blancas. Conteos diferenciales en muestras no fueron efectuados de manera rutinaria. El porcentaje de linfocitos en la fracción de células sanguíneas blancas fue de 69% +- 8% por conteo diferencial por 100 muestras tomadas en varios momentos durante el estudio. Las células fueron lavadas para remover la heparina. Un total de 8x1O5 células sanguíneas blancas/ratón fueron resuspendidas en 100 ml de medio que consistía de RPMI 1640 complementado de conformidad con lo descrito arriba, para el ensayo de proliferación y, además, con los siguientes complementos para generación de respuestas CTL primarias in vitro: 4 µg/ml anti-CD28 (PV 1.17) y 10 U/ml de IL-12 de murino recombinante (rmIL-12, Genetics Institute, Cambridge, MA) , 10 U/ml de IL-2 y 200 U/ml • de IL-6 (Genzyme, Cambridge, MA) , 0.1 pM de péptido restringido de clase I (TYQRTRALV, aa 147-155), y 1 x 106 /ml de células de bazo singeneicas irradiadas (2000 rads) tratadas con NH4CL 0.17 M amortiguado con Tris 0.017 M para usar las células sanguíneas rojas (Gajewski, T.F. 1996, J. Imunol 156-462) . Las células fueron colocadas en placas en placas Costar de fondo redondo de 96 pozos en un volumen de 100 µl para un total de 8 x 103 células sanguíneas blancas por pozo. Un total de 80 pozos fueron manejados en cada muestra de sangre. 16 pozos en cada placa recibieron solamente medio con células de bazo irradiadas. El día 7 del cultivo, los sobrenadantes fueron decantados por inversión de las placas y las pellas de células fueron suspendidas por agitación de placa. Los blancos positivos para antigeno (Ag positivos) fueron preparados por impulso durante la noche de células P815 con lOug/ml del péptido restringido de clase I. 1 x 103 blancos P817, marcados con 51Cr, Ag positivos fueron agregados en 10 µl del medio de cultivo a 50% de los pozos, y 1 x 10 blancos de control P815, marcados con 51Cr, Ag-negativos fueron agregados al 50% restantes de los pozos. De los 16 pozos por placa que no contenían células efectoras, 8 fueron designados para liberación espontánea y 8 pozos para mediciones de liberación máxima. La liberación total fue lograda mediante la adición de 20 µl de Tritón XlOO al 10%. Después de una incubación de 4 horas, se cosecharon 50 µl de sobrenadante/pozo en placas de 93 pozos Wallac (1450-401), se agregaron 125 µl de agente de centelleo (OptiPhase Super Mix, Wallac, Turku, Finlandia) , y las placas fueron contadas en un lector de placas Wallac Microbeta 1450. Cálculo de lisis específica media El porcentaje de lisis para cada pozo fue calculado de conformidad con la fórmula estándar Liberación experimental - liberación de medio X 100 liberación total - liberación de medio en donde la liberación total fue el cpm promedio de todos los pozos que recibieron blancos y tritón X-100 y la liberación de medio fue cpm promedio más desviación estándar de todos los pozos que recibieron blancos y medio solamente. La lisis porcentual especifica media por pozo fue calculada de conformidad con la fórmula: (S% de lisis de 40 pozos con blancos Ag+) - (S % de lisis de 40 pozos con blancos de control) 40 Los datos son expresados como la lisis especifica media +-desviación estándar de conformidad con lo calculado promediando los valores de lisis específica media por pozo obtenidos de cada uno de los cinco ratones dentro de un grupo. La significación estadística fue determinada empleando una prueba t de Student de dos colas. Resultados : B7-2Ig incrementa una respuesta proliferativa de células T CD4 + primaria a la inmunización con péptidos restringidos de clase II Para determinar si B7-2Ig podía incrementar o suprimir la respuesta de células T primaria a la inmunización con péptidos, ratones fueron inmunizados con péptidos en presencia o ausencia de administración de B7-2lg. Los péptidos restringidos de clase II aa 55-77 y aa 206-229 de NP de virus de influenza A/PR/8/34 fueron administrados subcutáneamente como una mezcla en IFA. Estos péptidos han demostrado ser epitopos de células Th de CD4+ inmunodominantes (Brett, S.J. et al., 1991, Journal Immunology 147:1647, Brett, S.J., and J. P. Tite. 1996). Tanto genes unidos a H-2 como genes no unidos a H-2 tienen una influencia sobre el reconocimiento de epítopo de nucleoproteína de influenza por células T CD4+ (Immunology 87:42). B7-2Ig ( en alumbre al 0.1%) fue administrado en un sitio próximo. En estudios preliminares, respuestas proliferativas específicas para péptidos fueron medias a partir de células de nodo linfático, los dias 3, 5, 7 y 9 después de la inmunización. Las características cinéticas de la respuesta no fueron afectadas por la administración de B7-2lg. Respuesta proliferativas óptimas fueron observadas tanto a partir de B7-2Ig como a partir de ratones tratados de control los dias 7 y 9 después de la inmunización. Como se muestra en la figura 1, el tratamiento con B7-2lg al momento de la inmunización de péptido resultó en unas respuesta proliferativas específicas para antígeno significativamente mayores de células de nodo linfático cosechadas 9 días después de la inmunización (p=0.014, para re-estimulación in vitro con 50 µg/ml de péptido) . En la figura 1, cinco ratones por grupo fueron inmunizados en dos sitios subcutáneos con emulsión IFA que contenía ya sea 100 µl por la inyección de cada uno de los dos péptidos restringidos de clase II o de PBS. 100 µg de B7-2IgG2a en alumbre al 0.1% o bien al alumbre al 0.1% solo fue administrado en sitios próximos a los sitios de inmunización. Células de nodo linfático de ratones inmunizados con los péptidos solos (-0-) tratadas con B7-2lg solo (-?-) , o bien inmunizadas con péptidos y tratadas con B7-2Ig (-"-) , fueron cosechadas 9 días después de la inmunización y reestimuladas in vitro con la concentración indica de cada uno de los dos péptidos utilizados para la inmunización. Los ratones inmunizados con péptido que no recibieron B7-2Ig recibieron alumbre como control. La proliferación fue evaluada por incorporación de 3H-timidina. Los datos son expresados como cpm promedio/pozo de 5 ratones por grupo + desviación estándar. Resultados similares fueron obtenidos cuando se utilizó como control IgG2amAb. Los datos provienen de uno de 3 experimentos representativos. La administración de B7-2Ig en ausencia de inmunización no resulten en respuestas proliferativas lo que demuestra la dependencia de antígeno de los efectos de B7-2Ig después de una inmunización primaria. Estos resultados demuestran que la administración in vivo de B7-2Ig incrementa la respuesta de células Th de CD4+ a la inmunización con péptidos. B7-2Ig incrementa la respuesta de recuerdo. Para probar si el incremento dependiente de B7-2Ig de una respuesta proliferativa específica para antígeno primaria provocaba una respuesta de recuerdo incrementado, ratones fueron inmunizados con péptidos en presencia o ausencia de tratamiento con B7-2lg, y recibieron un refuerzo 46 días después sin administración adicional de B7-2Ig. Células de bazo fueron recogidas 3 días después de la segunda inmunización y la respuesta proliferativa específica para péptido fue media. Como se muestra en la figura 2, ratones que habían recibido un tratamiento B7-2Ig único al momento de la inmunización primaria presentaron respuestas proliferativas más grandes después de una segunda inmunización que ratones que nunca recibieron B7-2Ig (p = 0.0006, para re-estimulación in vitro con 100 pg/ml de péptido) . Cinco ratones por grupo fueron inmunizados con péptidos solos (-0-) , tratados con B7-2Ig solo (-?-) o bien inmunizados con péptidos y tratados con B7-2Ig (-•-) . El día 46 después de la inmunización primaria, ambos grupos de ratones inmunizados con péptidos fueron re-inmunizados con péptidos en ausencia de coadministración de B7-2Ig. Ratones no inmunizados recibieron solamente IFA. 3 días después de la re-inmunización, las células de bazo fueron reestimuladas in vitro con la concentración indicada de cada uno de los dos péptidos utilizados para la inmunización. La proliferación fue evaluada por incorporación de 3H-timidina. Los datos son expresados como el cpm promedio/pozo de 5 ratones por grupo -+ desviación estándar. Los datos provienen de uno de dos experimentos replicados. Estos datos indican que B7-2Ig cuando se utiliza como adyuvante para una respuesta de célula T primaria, incrementa la respuesta de recuerdo. B7-2Ig incrementa las respuestas de citocinas primarias dependientes tanto de Thl como de Th2 Para determinar sin B7-2Ig como adyuvante inmune promovía de manera diferente el desarrollo de respuestas de Thl o Th2, respuestas de citocinas específicas para péptidos después de inmunización primaria fueron analizadas a partir de células de nodo linfático de ratones inmunizados 3, 5, 7 y 9 días después de la inmunización. Exactamente como en el caso de las respuestas proliferativas, respuestas óptimas de citocinas fueron observadas el dia 9. Como se muestra en la tabla I, la administración de B7-2Ig al momento de la inmunización con péptidos resultó en niveles significativamente mayores de producción de la citosina IFN-gamma (p=0.017) asociada con Thl, y las citocinas IL-5 (p=0.011), e IL-13 (p=0.002) asociadas con Th2. La producción de citocinas especificas para antigenos no se observó en cultivos provenientes de ratones no inmunizados tratados con B7-2Ig. Estos resultados indican que B7-2Ig incrementa una respuesta de células T primaria tanto de fenotipo Thl como de fenotipo Th2. B7-2Ig incrementa la respuesta de CTL a péptido restringido de clase I La interacción de B7 unida a membrana CD28 permite la inducción de respuestas de CTL in vitro en ausencia de células CD4+ (Harding, F.A. et al 1993, J. Exp Med 177:1791). Para probar el efecto de B7-2Ig sobre la respuesta CTL primaria, ratones fueron inmunizados con el péptido restringido de clase I inmunodominante en IFA con o sin administración concomitante de B7-2Ig. Respuestas CTL específicas para péptidos fueron medidas a partir de células de sangre periférica no fraccionada utilizando la pequeña muestra de sangre, ensayo CTL de conformidad con lo descrito en materiales y métodos. Este ensayo hace posible el análisis de grandes números de ratones dentro del marco de un solo experimento, hace también posible la evaluación de la significación estadística de diferencias entre grupos, ensayos CTL repetidos de ratones individuales durante el transcurso de una respuesta inmune e investigación de correlación entre respuestas CTL y resultados in vivo. Datos son expresados como un valor individual (lisis específica media) por ratón (figura 3) . El péptido (100 µg/ratón) fue administrado en IFA. Se coadministró subcutáneamente B7-2Ig (100 µg en alumbre al 0.1%/ratón). Se midieron CTL a partir de sangre no fraccionada recogida 3 semanas después de la inmunización. Los datos son expresados como lisis específica media ± desviación estándar. El valor para el grupo inmunizado con virus vivo es de un conjunto individual de dos ratones, y la lisis específica media promedio de este grupo fue de 52 ± 12 que se obtuvo a partir de 18 ratones probados en 9 experimentos separados. Estaban 5 ratones por grupo en todos los demás grupos. Los datos mostrados son de 1 de 3 experimentos replicados las respuestas al péptido restringido de clase I en IFA no fueron significativamente superiores al fondo. Este hallazgo es consiste con los resultados de Fayolle et al (1991 Journal Immunology 147:406) que mostraron que, en ausencia de la ayuda de células T, la respuesta de CTL a péptido restringido de clase I en IFA era cercana a los niveles de fondo. Cuando se administró B7-2Ig al momento de la inmunización con péptido restringido de clase I en IFA, se observó un incremento pequeño pero estadísticamente significativo (p=0.013) en la respuesta (figura 3). Sin embargo, la magnitud de la respuesta de CTL específica para el péptido de ratones inmunizados con péptido y que recibieron una coadministración de B7-2Ig fue pequeña en comparación con la respuesta especifica para péptido de ratones inmunizados con el virus vivo. Por consiguiente, la coadministración de una dosis de 100 µg de B7-2Ig no incrementó la respuesta a la inmunización con péptidos restringidos de clase I al nivel máximo logrado con el método de inmunización de virus vivo efectivo. El incremento óptimo por B7-2I de la respuesta CLT requiere de la ayuda de células T. Puesto que las respuestas CTL óptimas dependen de células Th (Fayolle, C. et al. 1991 Journal Immunology 147:4069; Keene, J.A. et al. 1982, J. Exp Med 155:768; von Herrath, M.G. et al. 1996 J. Virol 70:1072 y Ossendorp, F. et al. 1998, Journal Experimental Medicine 187:693), el efecto de B7-2Ig sobre las respuestas CTL fue estudiado en condiciones en las cuales los ratones fueron co-inmunizados con péptidos de los cuales se sabe que provocan respuestas de células Th. Ratones fueron inmunizados con una emulsión de IFA que contiene ya sea el péptido restringido de clase I solo o bien una mezcla del péptido restringido de clase I y los dos péptidos restringidos de clase II descritos para las figuras 1 y 2 y tabla 1 arriba. Las respuestas de CTL fueren medidas a partir de células de sangre periférica no fraccionada (figura 4) . La inmunización de péptido fue efectuada en forma de una emulsión única en IFA. Los ratones fueron inmunizados y tratados de conformidad con lo indicado. Tres semanas después, se midieron las respuestas CTL a partir de la sangre periférica. Los datos son expresados como la lisis especifica media ± desviación estándar. El grupo inmunizado con un virus vivo proviene de un conjunto único de dos ratones, y la lisis específica media promedio de este grupo fue de 52 ± 12 que se obtuvo a partir de 18 ratones probados en 9 experimentos. Estaban 5 ratones por grupo en todos los demás grupos . La lisis media específica de este grupo que recibió péptidos restringidos de clase II en IFA y Ig de control en el alumbre ha sido restada de grupos mostrados que recibieron Ig de control. La lisis específica media del grupo que recibió péptidos restringidos de clase II en IFA y B7-2Ig en alumbre ha sido restada de grupos mostrados que recibieron B7-2Ig.

Los datos mostrados provienen de 1 de 4 experimentos replicado. La lisis especifica media de células provenientes de ratones inmunizados con la mezcla de péptidos restringidos de clase I y de clase II fue significativamente mayor que la lisis específica media de células provenientes de ratones inmunizados con péptido restringido de clase I solo (p=0.046 en el experimento mostrado y .004 en un experimento replicado) . La inmunización con la mezcla de péptidos restringidos de clase I y de clase II y tratamiento con 100 µg de B7-2Ig resultón en una lisis especifica media significativamente mayor que en el caso de ratones inmunizados con péptido que no recibieron B7-2 Ig (p=0.003, p=0.0001, p=0.045 y p= 0.0012 en cuatro experimentos replicados) esta respuesta no fue incrementada cuando se elevó la dosis de B7-2lg dos veces a 200 µg/ratón, lo que indica que la dosis de 100 µg indujo el incremento máximo dependiente de B7-2Ig. La combinación de inmunización con la mezcla de péptidos junto con el tratamiento con B7-2Ig resultó en respuestas de CTL especificas para péptidos similares en cuanto a su magnitud a las respuestas provocadas después de inmunización con virus vivo. Un valor de lisis específica media de 52+-12 fue obtenido cuando los valores obtenidos a partir de 18 ratones inmunizados con virus vivo en 9 experimentos separados fueron promediados, lo que demuestra la capacidad de reproducción del ensayo de CTL de pequeñas muestras de sangre periférica y la validez de la conclusión en el sentido que la inmunización con péptidos en presencia de auxilio de células T y B7-2lg provoca respuestas comparables a las respuestas obtenidas por el método de inmunización de virus vivo eficiente. La respuesta de CTL detectada a partir de células de sangre periférica llegó a su pico a las dos a tres semanas y se desvaneció en la quinta semana tanto en ratones inmunizados con virus vivo como en ratones inmunizados con péptidos y tratados con B7-2Ig, otra vez indicando similaridad de las respuestas. Como se comenta abajo, sin embargo, ratones inmunizados con la mezcla de péptidos y tratados con B7-2Ig no estuvieron protegidos contra un reto de virus letal . Los datos en las figuras 3 y 4 fueron generados con B7-2Ig formulada en alumbre al 0.1%, que en si es un adyuvante inmune clínicamente aprobado (Aprile, M.A. et al 1966, Can J Public Health 57:343). La administración de alumbre solo o Ig de control en alumbre no afectó la respuesta antipéptido, y no se requieren de formulación en alumbre para un incremento inmune dependiente de B7-2lg. Formulación en alumbre sin embargo potencian los efectos de B7-2Ig cuando el efecto de B7-2Ig en alumbre fueron comparados directamente con lo efectos de B7-2Ig en PBS, se observó un incremento mayor que la respuesta CTL cuando se administró B7-2Ig en alumbre (lisis específica media 72 ± 13 con alumbre en comparación con 28 ± 12 sin alumbre, p=0.007) . Una activación específica para antígeno óptima y regulación de células T requiere de la administración de una señal co-estimuladora a partir de moléculas B7 en la superficie de APC para CD28 y CTLA-4 en la superficie de la célula T (Boussiotis, V.A., et al. 1996, Immunol Rev 153:5; Lenschow, D.J. et al. 1996, Annual Review Immunology 14:233; Green, J. M. et al. 1994. Immunity 1:501; Tivol, E. A. et al. 1995, Immunity 3:541 y Waterhouse, P., 1995, Science 270:985). El trabajo en una amplia gama de modelos de ratón ha mostrado que respuestas inmunes fueron realzadas mediante una expresión incrementada en la superficie de la célula de B7. En estos estudios, los incrementos de la expresión de B7 han sido inducidos por transduccióh de células tumorales (Baskar, S. et al. 1993, Proc Nati Acad Sci USA 90:5687; Cavallo, F. et al.1995, Eur J. immunol 25:1154; Coughlin, C.M. et al. 1995, Cáncer Research 55:4980; Chen, L. Et al. 1992, Cell 71:1093; Chen L. Et al. 1994, Journal of Experimental Medicine 179:523; Gajewski, T. F. et al. 1996, J Immunol 8:2909; Yang, G. et al. 1995, Journal of Immunology 154:279 y Dumissi-Joannopoulos K. et al. 1996, Blood 87:2938) inyección de ADNc (Kim, J.J. et al. 1997, Nat Biotechnol 15:641; Kim, J. J. et al 1998, Vaccine Nov: 16:1828 y Horspool, J. H. E tal 1998, J. Immunol 160:2706), o bien infección con vector viral (Chamberlain R. S. et al. 1996, Cáncer Res 56:2831; Emtage, P.C. et al. 1998, J. Im unol 160:2531; Hodge, J. W. Et al. 1994, Cáncer Res 54:5552 y Putzer, B.M. et al, 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94:10889). Utilizando estrategia diferente para incrementar los niveles de B7 in vivo, una forma soluble de proteína de B7-2, B7-2Ig ha sido desarrollada, la cual consiste en el Fc de IgG2a de ratón fusionado con una porción extracelular de B7-2 y fijada sobre cada cadena de Ig. La administración in vivo B7-Ig incrementa las respuestas CTL y de células Th específicas para antígeno. Así la administración in viva de B7-2Ig presenta una alternativa sencilla a la transducción de B7 ex vivo de células tumorales o al uso de vectores virales o de ADN para optimizar la co-estimulación mediada por B7-2. Puesto que el resultado de las enfermedades infecciosas o autoinmunes puede ser afectado en gran medida por el patrón de citocinas producidas por las células Th que responden, a existido un interés para determinar si la via B7 podía ser utilizada para desviar la respuesta hacia respuestas de citocinas de Thl o Th2 (Kuchroo, V.K. et al. 1995, Cell 80:10; Lenschow; D.J. et al. 1995, J. Exp Med 181:1145; Corry, D.B. et al. 1994, J Immunol 153:4142; Freeman, G.J. et al. 1995, Immunity 2:523; Schweitzer, A.N. et al 1997, J. Im unol 2 158:713; Rulifson, I.C. et al, 1997, J. Immunol 158:658 y McAdam, A.J. et al. 1998 Immunol Rev 165:231). Numerosos sistemas experimentales indican que la diferenciación Th2 depende más de la co-estimulación de B7 que la diferenciación de Thl (Lenschow, D.J. et al. 1995, J. Exp Med 181:1145; Corry, D.B. et al. 1994, J. Immunol 153:4142; Freeman, G. J. et al. 1995, Immunity 2:523 y Rulifson, I. C, A. et al 1997, J. Immunol 158:658). mAb anti-B7 han sido exitosamente utilizados para manipular la diferenciación de células T in vivo. El pliego de B7-1 con mAb ha sido reportado como favoreciendo la diferenciación de Th2, mientras que el bloqueo de B7-2 favorece la diferenciación de Thl (Kuchroo, V.K. et al. 1995, Cell 80: Mar 10(5):; Lenschow, D.J. et al., 1995, J. Exp Med 181:1145; Corry D. B. et al. 1994, J. Immunol 153:4142, Freeman, G.J. et al. 1995, Immunity 2:523 y Rulifson, I. C. et al. 1997, J. Immunol 158:658) . En contraste, utilizando APC a partir de ratones noqueados para B7, Schweitzer et al. Encontraron que ni B7-1 ni B7-2 parecen regular de manera selectiva la diferenciación de Thl o Th2 in vitro (Schweitzer, A. N. et al 1997, J. Immunol 2 158:713). Los datos en este ejemplo muestran que la administración in vivo de B7-2Ig incrementa las respuestas de citocinas específicas para antígeno tanto de tipo Thl como de tipo Th2. Por consiguiente, el potencial terapéutico de B7-2Ig será probablemente mayor en situaciones en las cuales el objetivo es una elevación de la respuesta y no una desviación de la respuesta. Para probar los ef ctos de B7-2Ig sobre las respuestas de CTL, la respuesta CTL especifica para péptido provocada por un péptido proveniente de la NP de virus de influenza A/PR/8/34 fue comparada con la respuesta provocada por el mismo péptido proveniente de ratones inmunizados con virus vivo. El tratamiento con B7-2Ig indujo un incremento pequeño pero significativo a la respuesta de péptido restringido de clase I en IFA. Estos datos son consistentes con los datos que demuestran que en ausencia de auxiliara exógeno, las células tumorales transfectadas con B7 son suficientes para la generación de una respuesta CTL in vitro (Harding, F.A. et al., 1993, J. Exp Med 177:1791). La respuesta ' incrementada por B7-2Ig, sin embargo, fue significativamente menor que la respuesta de CTL al mismo péptido de ratones inmunizados con virus vivo. Estos datos muestran que los ratones pueden presentar una respuesta antipéptido mucho mayor que la respuesta provocada por inmunización con péptido restringido de clase I y coadministración de B7-2lg. En un intento para incrementar adicionalmente la respuesta al péptido restringido de clase I, se investigaron los efectos de la adición de antígenos de péptidos restringido de clase II, de células Th a la emulsión de IFA que contenía el antígeno de péptido de CTL restringido de clase I. se ha reportado previamente que respuestas de CTL óptimas dependen de las células Th (Fayolle, C. et al. 1991, Journal I munology 147:4069; Keene, J. A. et al. 1982, J Exp Med 155:768; von Herat, M. G. 1996, J Virol 70:1072 y Ossendorp, F. et al. 1998 Journal Experimental Medicine 187:693). Las respuestas de CTL fueron significativamente elevadas en ratones inmunizados tanto con péptidos restringidos de clase I como con péptidos restringidos de clase II. Estos datos indican que la ayuda para una respuesta de CTL contra un antígeno de péptido puede ser proporcionada por coinmunización con antígenos de células Th. Enlaces covalentes entre CTL y epítopos de péptidos Th no se requiere, lo que sugiere que cualquier proteína inmunogénica puede ser empleada como co-inmunógeno para proporcionar ayuda para las respuestas de CTL. Esta conclusión es apoyada adicionalmente a través de nuestro hallazgo en el sentido que la adición de KLH a una emulsión de IFA que contiene péptido restringido de clase I resulta en un incremento significativo de la respuesta de CTL específica para péptido. Aún cuando incrementada, la respuesta de CTL específica para el péptido de ratones inmunizados con péptidos restringidos de clase I y de clase II fue menor que la respuesta de ratones inmunizados con el virus vivo. La adición de B7-2lg al protocolo elevó la respuesta de CTL de ratones inmunizados con la mezcla de péptidos al nivel de ratones inmunizados con el virus vivo. Respuestas de estos dos grupos fueron comparables, pero el primero grupo no estuvo protegido contra un reto viral letal. Este resultado es consiste con los hallazgos de Lawson et al (Lawson, C.M. et al., 1994, Journal Virology 68:3505) quienes obtuvieron una respuesta de CTL vigorosa contra el mismo péptido utilizado en este estudio mediante la administración de un virus de vaccinia recombinantes que expresa el péptido. Como en la presente invención, una respuesta de CTL vigorosa a este péptido solo no fue suficientemente para proporcionar inmunidad protectora en ratones BALB/c. Aún cuando no se requiere para efectos inmunes incrementados de B7-2Ig, la formulación en alumbre resulta en un mayor incremento que la formulación en PBS. La administración de Ig de control en alumbre no afecta las respuestas, lo que indica que el alumbre solo no incrementa la respuesta. La infección con virus vivo es la via natural y efectiva de activación de respuestas restringidas de clase I (Zinkerna.gel, R.M. et al. 1979, Adv Immunol 27:51). Por consiguiente, los datos presentados aquí que muestran que respuestas péptidos comparables fueron obtenidas a partir de ratones inmunizados con virus vivo y ratones tratados con B7-2Ig inmunizados con una emulsión mixta de péptidos restringidos de clase I y de clase II establecen la efectividad del último protocolo de inmunización. Hoy en dia existe mucho interés en provocar respuestas de CTL a péptidos restringidos de clase I. Demostraciones en años recientes que CTL de ser humano puede, como CTL de ratón, reconocer péptidos asociados con tumores restringidos de clase I ha sugerido que las respuestas de CTL dirigidas contra estos péptidos pueden ser efectivas contra tumores humanos (van der Bruggen, P. Et al. 1991, Science 254:1643; Wolfel, T. Et al. 1993, Int. J Cáncer 55:237; Maeurer, M. J. 1996, Melanoma Res 6:11; Cormier, J. N. et al. 1997, Cáncer J Sci Am 3:37; Apostolopoulos, V. Et al. 1997, J. Immunology 159:5211; Rosenberg, S.A. 1998, Nature Medicine 4:321 y Nestle, F. O. Et al. 1998, Nature Medicine 4:328). Esta posibilidad ha incitado un esfuerzo intenso para diseñar protocolos de inmunización que optimizan las respuestas a vacunas de péptidos restringidos de clase I . Se ha reportado éxito con una gran variedad de estrategias incluyendo la inserción de minigen en virus y bacterias recombinantes, oligomerización de péptidos. Modificación de lípidos, inmunización de ADNc, uso de toxinas y citocinas como adyuvantes, así como células dendríticas impulsadas por antígeno (Allsopp, C. E. et al., 1996, European Journal of Immunology 26:1951; Rotzschke, 0 en tal. 1997, Proc. Nati Acad Sci USA 94:14642; Alving, C.A. et al. 1995, Immunological Reviews 145:1; Ciernik, I. F. et al . 1996, J Im unol 156:2369; Porgador, A. et al., 1997, Journal of Immunology 158:834; Noguchi, Y. et al. 1995, Proceedings of the National Academy of Science; USA 92:2219 y Takahashi, H. et al. 1992, International Immunology 5:849). La ventaja del método reportado aqui es que es aplicable de manera uniforme a cualquier péptido sin necesidad de modificación adicional y es efectivo tanto para respuestas restringidas de clase I como de clase II. La coadministración de B7-2Ig con inmunización de péptido incrementa una respuesta de péptido restringida de clase I relativamente limitada a un nivel comparable con el nivel obtenido a partir de la inmunización de virus vivo, lo que sugiere que una forma soluble de proteína B7-2 incrementaría también respuestas a otros inmunógenos limitados. Estos hallazgos muestran que las formas solubles de proteína de B7-2 pueden incrementar respuestas inmunes específicas para antígeno en la terapia del cáncer o de enfermedades infecciosas cuando el sistema inmune responde de manera inefectiva. Tabla I. Incremento dependiente de B7-2Ig de respuestas de citocinas Tha Expresión de citosina en re-estimulación in vitro Tratamiento in vivo IFN? IL-5 (pg/ml ± DE) (pg/ml ± DE) Inmunización de péptido b.db 54±44 Inmunización de péptido más 1720 ± 986 2479 ± 1104 B7-2Ig IFA más B7-2Ig b.db b.db Tratamiento in vivo IL-13 (pg/ml ± DE) Inmunización de péptido 136 ± 125 Inmunización de péptido más 5365 ± 1795 B7-2Ig IFA más B7-2Ig b.db aCinco ratones por grupo fueron inmunizados en dos sitios subcutáneos con una emulsión de IFA que contenía ya sea 100 µg por inyección de cada uno de los dos péptidos restringidos de clase II o PBS. 100 µg de B7-2IgG2a en alumbre al 0.1% o alumbre al 0.1% solo fueron administrados en sitios cercanos a los sitios de inmunización. 9 días después se cosecharon células de nodo linfático las cuales fueron reestimuladas en cultivo durante 3 días con 5 µg/ml de cada péptido. Los valores para cada ratón fueron obtenidos promediando los resultados de pozos por triplicado. Los datos son expresados como la contratación promedio de citosina de ratones dentro de un grupo ± desviación estándar. Los resultados son similares a los resultados obtenidos cuando 1 mAB de IgG2a de ratón de control fue utilizado como control. Los datos mostrados provienen de 1 de 3 experimentos replicados. b Debajo de los límites de detección del ensayo Ejemplo 2. Las proteínas de fusión B7-IgG incrementan respuestas inmunes antitumor e inducen la regresión de los tumores establecidos .

Proteínas de fusión entre una región extra celular ya sea de B7-1 o B7-2 e IgG.2a han sido evaluadas para determinar su capacidad de incrementar respuestas antitumor en cuatro modelos de tumor de murino diferentes, incluyendo el melanoma poco inmunogénico B16/F10. Una vacunación única con células tumorales irradiadas cuando se mezclan con B7-1 o B7-2-IgG protegió a los ratones contra un reto por tumor vivo. Más significativamente, tumores establecidos de 7 guías presentaron regresiones después de vacunación con células tumorales irradiadas mezcladas con B7-2-IgG. Aún la administración terapéutica de B7-IgG sola logró disminuciones similares de la carga tumoral. Animales que hablan rechazado un tumor establecidos fueron resistentes a un nuevo reto, lo que sugiere fuertemente que el efecto antitumor de B7-IgG es mediado por mecanismos inmunes específicos para tumor. Además, una vacunación única con células tumorales irradiadas mezcladas con B7-1 o B7-2-IgG generó respuestas de CD8 contra un antígeno asociado a tumor. Así, B7-lgG presenta una actividad adyuvante potente en combinación con antígenos endógenos y administrados de manera exógena. Estos hallazgos sugieren un valor químico para B7-lgG para incrementar respuestas antitumor y antivirales. Materiales y métodos empleados en el ejemplo 2 Los plásmidos de expresión para las proteínas de fusión B7-1-IgGIgG y B7-2-IgG2a de murino fueron construidos uniendo el ADN que codifica los dominios de señal y extraceluiares de B7-1 o B7-2 de murino con el ADN que codifica los dominios de articulación CH2-CH3 derivados de un anticuerpo de IgG2a de murina. Los residuos de cisteína dentro de la región de articulación de anticuerpo permanecieron conservados de manera que la mB7-l-IgGIgG2a o mB7-2-IgG2a producida es dimérica y bivalente. Proteínas de fusión fueron generadas en las cuales la región IgG2a es mutada con el objeto de evitar la unión por receptores Fc de alta afinidad y activación de complemento (se designa B7-IgG2mut) . Los residuos de aminoácidos siguientes en el dominio CH2 fueron reemplazados por alanina: leucina en la posición número 235, ácido glutámico en la posición número 318, lisina en la posición número 320, y lisina en la posición número 322. Para la producción de proteína B7-IgG, los plásmidos fueron expresados en líneas de células CHO y las proteínas fueron aisladas . P815 es una línea de células tumorales derivada de mastocitoma que' crece como tumor sólido después de la inyección intradérmica (i.d.) de 5 x 104 células en ratones DBA/2 (Jackson Laboratories) . El clon utilizado en estos experimentos forma metástasis de manera espontánea desde inyección i.d. y provoca la muerte de los ratones después de 25-35 dias. MethA, una línea de células tumorales derivada de un sarcoma en ratones Balb/c crece como tumor sólido después de inyección i.d. de 5x 105 células (ratones Balb/C de Taconic) . B16/F10, una línea de tumor no inmunogénico derivada de un melanoma en ratones C57BL/6 (Taconic) , crece como tumor sólido después de inyección i.d. de 1 x 105 células y provoca la muerte debido a metástasis después de 25-35 días. El carcinoma de vejiga MB49 es también derivado de ratones C57BL/6 y 1 x 105 células fueron inyectadas i.d., para establecer tumores sólidos después de 5-7 días en 100% de los ratones . Ensayo de co-estimulación in vitro 2 x 105 esplenocitos de murinos no vacunados fueron colocados por triplicado en placas de 96 pozos revestidas con concentraciones bajas de mAB anti-CD3 (0-500 mg-ml de -2C11, Pharmingen) . Para proporcionar las señales necesarias para la co-estimulación, las placas fueron o bien revestidas con mAb anti-CD28 (0-1 µg/ml) como control positivo o bien con B7-1-IgG o B7-2-IgG (0-9 µg/ml) . Se agregó también B7-IgG en forma soluble o bien se retículo a través de una Ab anti IgG2a de ratón secundario. Los esplenocitos fueron estimulados durante 72 horas. Una alícuota de sobrenadante fue removida para análisis de IFN-gamma y las células fueron impulsadas durante 8 horas con H3 - timidina. Un análisis de IFN-gamma fue efectuado en un ELISA estándar con captura de Ab R46A4 y XGM1.2 biotinilado como Ab de detección. Protocolos de vacunación En un modelo de vacuna de tumor profiláctico, ratones fueron vacunados el dia 0 al mismo tiempo que fueron retados con células tumorales. Los ratones fueron inmunizados con células tumorales irradiadas (lxlO7 células) en PBS, mezcladas con 75-100 µg de mB7-l-IgG, B7-2-IgG, IgG de murina, o nada. La inyección fue administrad en la pata (i.fp.) en ambas patas posteriores. La inyección de B7-IgG fue repetida una vez el día 3 y el día 5. El día 7, los animales fueron retados con una dosis definida de células tumorales vivas por inyección i.d. de 50 µl en el flanco derecho. El crecimiento del tumor primario y la supervivencia de los animales fueron monitoreados durante un período de 40-60 días. En un modelo de vacuna de tumor terapéutico, se estableció un tumor primario por inoculación i.d. con un número definido de células tumorales. El dia 5-7 (cuando los tumores fueron claramente palpables), los ratones fueron vacunados i.fp. con lxlO7 células tumorales irradiadas mezcladas con 100 µg de B7-l-IgG, B7-l-IgG, o nada. Se inyectó otra vez 100 µg de B7-IgG i.fp. tres días después. Este régimen de vacunación fue repetido durante 2 o 3 semanas . El crecimiento de tumor primario y la supervivencia de los ratones fueron monitoreados desde el día 7 hasta el día 40-70. En modelos de terapia, ratones que llevan tumores B7-IgG fueron tratados con proteína de fusión sola. 50-100 µg de B7-1-IgG o B7-2-IgG sola fueron inyectados i.fp. dos veces por semana durante 3 semanas. Se monitoreo durante 40 días el crecimiento tumoral y la supervivencia. Detección de respuestas de CTL especificas para PÍA: Bazos fueron recogidos de ratones DBA/2 10-14 días después de una inmunización única con células P815 irradiadas mezcladas con o sin B7-l-IgG o B7-2-IgG. Después de la lisis de los eritrocitos, se estimularon de nuevo 20 x 106 esplenocitos en frascos de T25 con 0.1 mg/ml de péptido PÍA y 5U/ml de IL-2 (Pharmingen) durante 6 dias. Después, se efectuó un ensayo de liberación de Cr51 5h estándar con células A20 como blancos impulsados con 10 micro/ml de péptido PÍA o no impulsados con péptido. El porcentaje de lisis específica para PlA-péptido es expresado como la diferencia entre la lisis porcentual de blancos impulsados con péptido y la lisis porcentual de blancos no impulsados. Resultados : B7-IgG inmovilizada o reticulada proporciona una señal co-estimuladora para esplenocitos de murino subóptimamente estimulados in vitro Análisis FACS® o Biocore® determinaron que las proteínas de fusión B7-IgG y B7-2-IgG se unen con CD28 y CTLA-4 de murino. Para determinar si las proteínas de fusión B7-lgG podían incrementar o suprimir la activación de células T, esplenocitos de murina fueron estimulados in vitro cultivándolos con mAb anti-CD3 unido a placa en combinación con B7-IgG inmovilizada en las placas. La co-estimulación con mAb anti-CD28 unido a placa sirvió como control positivo. B7-1-IgG y B7-2-IgG indujo de manera similar un incremento dependiente de la dosis en cuanto a la proliferación, y la secreción de IFN-gamma (figura 5) . 2x10° esplenocitos de animales no vacunados fueron estimulados por triplicado durante 72 horas con 50 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 y cantidades crecientes de anticuerpo anti-CD28 inmovilizado o bien B7-1 o B7-2 IgG. La respuesta proliferativa fue medida mediante la incorporación de 3H-timidina después de un impulso de 6 horas. Los paneles B y C muestran la cantidad de IFN-gamma o IL2, respectivamente, liberada después de estimulación de 72 horas con 50 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 e indican las cantidades de B7-2-IgG inmovilizada. Las citocinas fueron medidas por ELISA estándar. En ausencia de estimulación anti-CD3, B7-IgG no indujo la proliferación. La inmovilización o reticulación de las moléculas de B7-IgG con 1 mAB anti IgG de murino secundario fue esencial para la co-estimulación eficiente, puesto que las proteínas B7-IgG solubles no incrementaron la proliferación o producción de IFN-gamma. Las proteínas B7-IgG mutadas en su región de enlace Fc (B7-l-IgG y B7-2-IgGmut) fueron igualmente efectivas para co-estimular los esplenocitos cuando están inmovilizadas en la placa. Tanto B7-l-IgG B7-2-IgG incrementan la eficacia protectora de una vacuna de células tumorales irradiadas Las proteínas de fusión B7-IgG fueron evaluadas como adyuvantes en un modelo de vacuna de tumor profiláctico. La inoculación de 5x1O4 células tumorales P815 vivas genera un tumor sólido después de 5-7 dias en el 100% de los ratones DBA/2 no vacunados. 10 ratones DBA/2 por grupo fueron inmunizados i.fp. una vez con 1 x 107 células tumorales P815 irradiadas. La vacuna celular fue administrada sola o bien mezclada ya sea con 100 µg de B7-l-lgG, B7-2-IgG, o bien proteína mutada de B7-l-IgG, B7-2-IgG. La B7-IgG fue administrada otra vez el día 5. Como control, se administraron 100 µg de B7-l-IgG o B7-2-IgG sola i.fp. el día 0 y el día 5. Los ratones fueron retados con 5 x 104 células tumorales P815 vivas el día 7. La protección contra el reto fue determinada por la ausencia de tumor palpable después de 24 días. La figura 6 muestra los resultados de 1 de 5 experimentos representativos. La inmunización de ratones con células tumorales P815 irradiadas una semana antes del reto de tumor vivo no resultó en protección contra el crecimiento tumoral. Sin embargo, una inmunización única con células tumorales irradiadas mezcladas con B7-l-IgG o B7-2-IgG indujo una protección del 60-70% (tabla 6, tabla 2) . En contraste, una inmunización con B7-l-IgG o B7-2-IgG sola no proporcionó protección (figura 6) la protección fue evaluada por ausencia de tumor sólido después de 14-24 días y/o supervivencia de por los menos 60 días. Esto último indica la ausencia de enfermedad metastásica. Para evaluar la función del dominio de IgG para la función de las proteínas de fusión, ratones fueron inmunizados con células tumorales P815 irradiadas mezcladas con las proteínas de fusión mutadas, B7-IgGmut, que no se unen con receptores Fc ni activan el complemento. Las moléculas mutadas fueron menos efectivas que el tipo silvestre (figura 6, tabla 2), lo que sugiere una función para el enlace de Fc de las moléculas B7-IgG. La eficacia de células tumorales irradiadas mezcladas con B7-IgG se comparó también con la eficacia de células tumorales transfectadas con B7-1 o B7-2. La vacunación con los transfectantes de B7 indujo una inmunidad antitumor significativamente menor y ofreció protección a solamente aproximadamente el 30% de los ratones en comparación con el 65% después de la inmunización con células P815 de tipo silvestre irradiadas mezcladas con B7-IgG (tabla 2) . Estos hallazgos indican que B7-IgG pueden ser auxiliares efectivos para generar una producción antitumor y pueden ser más efectivas que células tumorales transfectadas por B7. La vacunación con células tumorales P815 irradiadas mezcladas con B7-l-IgG o B7-2-IgG curó ratones de tumor P815 establecidos.

Para probar la actividad adyuvante de B7-IgG en un modelo de vacuna de tumor terapéutico, ratones DBA/2 fueron inyectados i.d. con células tumorales P815 en una dosis que generó un tumor sólido palpable después de 5 a 7 dias. Tumores P815 sólidos fueron establecidos el día 0 por inyección i.d. De 5 x 104 células P815. La vacunación empezó el dia 6 después del desarrollo de los tumores palpables. La figura 7 muestra los resultados de ratones inyectados de i.fp. Ya sea con PBS co o control (A, E) , o bien con células tumorales P815 irradiadas solas (B) o mezcladas con Ab de IgG2a de ratón irrelevante (F) , o bien con células P815 irradiadas mezcladas con B7-1 (C) - - B7-2-IgG (G) . La inmunización fue repetida los dias 7, 14, 21. Se administró otra vez tres días después PBS, Ab irrelevante o B7-IgG, respectivamente. El crecimiento tumoral fue monitoreado durante 40 días. Después de 25-30 días, los animales en los grupos de control empezaron a morir de metástasis espontáneas. Los paneles D y H muestran los tiempos de supervivencia de los diferentes grupos de tratamiento. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes. Las características cinéticas del crecimiento tumoral y la supervivencia después de vacunación aparecen en la figura 7, representativas de 4 experimentos independientes . Empezando aproximadamente después de la primera inmunización, se observó un crecimiento tumoral reducido en cuanto a la regresión de tumor en los grupos de ratones inmunizados con células tumorales mezcladas con B7-IgG. El crecimiento tumoral no fue reducido en grupos tratados con células tumorales irradiadas solas o mezcladas con Ab de IgG2a de ratón irrelevante. Después de tres ciclos de inmunización con células tumorales P815 irradiadas mezcladas con B7-IgG, el tumor primario había desaparecido en el 60-80% de los ratones. La regresión del tumor primario se correlacionó con la supervivencia de largo plazo de los ratones. La inmunización con células P815 irradiadas mezcladas ya sea con B7-l-IgG o bien B7-2-IgG incrementó la supervivencia de largo plazo a aproximadamente 80% (figura 7, D, H) , la mayoría de los ratones en los grupos de control no tratados o bien vacunados con tumor irradiado fallecieron generalmente entre el día 25 y el día 35, aparentemente debido a metástasis espontáneas formadas en el hígado, bazo, y nodos linfáticos. B7-IgGs como adyuvante de vacuna de tumor terapéutico en diferentes modelos de tumor Para determinar si los resultados con B7-lgG eran únicos para el tumor P815 o la cepa de ratón DBA/2, se probó la eficacia de B7lgGs como adyuvantes en tres modelos de tumor adicionales en 2 cepas diferentes de ratones. Resultados positivos similares fueron obtenidos en los cµatro modelos. Ratones BALB/c que llevaban sarcomas Me hA establecidos de 7 días fueron inmunizados con PBS, células MethA irradiadas solas, o bien células MethA irradiadas mezcladas ya sea con B7-l-IgG o B7-2-IgG. Tumores MethA o B16/F10 sólidos fueron establecidos en ratones Balb/c o C57BL/6, respectivamente. La figura 8 muestra que 10 ratones por grupo fueron inmunizados i.fp. ya sea con células tumorales irradiadas solas (B, E) , o bien mezcladas con 25 µg (C, D) o 100 µg (F, G) de B7-l-IgG o B7-2-IgG, respectivamente. Otra inyección de PBS o B7-l-IgG, B7-2-IgG, respectivamente, fue administrada 3-4 dias después. Un grupo fue tratado con PBS solo (A, no se muestra para B16/F10) . El crecimiento tumoral fue monitoreado durante 35 días. Ratones con tumores MethA fueron sometidos a eutanasia una vez que el tumor haya alcanzado un tamaño de 300 mm2. Ratones con el tumor B16/F10 fueron ya sea sometidos a eutanasia una vez que el tumor haya alcanzado un tamaño de 400 mm2, o bien lo animales fallecieron de metástasis espontáneas. El porcentaje de animales supervivientes se muestra en el panel H. Los experimentos son repetidos por lo menos 3 veces. Dos inmunizaciones con células MethA irradiadas mezcladas con B7-IgG curaron el 100% de los ratones, en comparación con 10-15% de curaciones espontáneas en los grupos de control (figura 8) . Resultados similares fueron observados en ratones C57BL/6 que llevan carcinoma de vejiga MB49. En ratones C57BL/6, la respuesta al melanoma B16/F10 poco inmunogénico y altamente metastásico se estudió también. Tres inmunizaciones con células tumorales B16 irradiadas mezcladas con cualesquiera de las proteínas B7-IgG redujeron el crecimiento tumoral y mejoraron en la supervivencia de largo plazo en comparación con los controles (figura 8) . Los animales en los grupos de control murieron todos dentro de un periodo de 35-40 dias, mientras que por lo menos el 40-80% de los ratones tratados con la vacuna de B7- IgG presentaron una supervivencia más larga que 60 dias (figura 8) . Los hallazgos soportan las observaciones efectuadas en el modelo de tumor P815 y demuestran una actividad potente de las B7-IgGs como adyuvantes para vacuna terapéutica del tumor. La administración terapéutica de B7-IgG sola induce las respuestas antitumorales De conformidad con lo descrito arriba, la inmunización profiláctica de ratones no vacunados con B7-IgGs en ausencia de células tumorales irradiadas no ofreció protección a los ratones contra un reto tumoral. Sin embargo, en los cuatro modelos de tumor terapéuticos, el tratamiento de ratones que llevan tumores con B7-l-IgG o B7-2-IgG sola redujo el crecimiento tumoral e incremento de la supervivencia (figura 9) . Ratones fueron inoculados con células tumorales P815 (A) , MethA (B) , MB49 (C) o bien C57BL/6 (D) vivas el días 0 la inmunización empezó los dias 6-8 de conformidad con lo descrito. Ratones fueron tratados ya sea PBS (D) células tumorales irradiadas solas (0) , células tumorales irradiadas mezcladas con B7-l-IgG (?) o bien B7-2-IgG (O) o bien con B7- 1-IgG (*) o bien B7-2-IgG {+) . El valor medio de tamaño tumoral para grupos de 7-10 ratones ha sido presentado de manera gráfica. Los ratones fueron sometidos a eutanasia una vez que su tumor haya alcanzado un tamaño de 400 mm2 o bien fueron asignados este valor si murieron de enfermedad metastásica. En todos los modelos probados, el tratamiento terapéutico de ratones que llevan tumores con B7-l-IgG sola volvió más lento el crecimiento tumoral, indujo una regresión del tumor y una mayor supervivencia. Sin embargo, datos provenientes de modelo de tumor de B16/F10 sugieren que la vacunación con células tumorales irradiadas más B7-IgG es un tratamiento antitumor más fuerte que la terapia con B7-IgG sola, por lo menos en el caso de tumores poco inmunogénicos. Estos resultados con B7-IgG solubles son sorprendentes debido a los resultados obtenidos empleando moléculas o estimuladores presentadas en la superficies de una célula {estimulación de fase sólida) . La vacunación terapéutica con células tumorales transfectadas con B7 en estos tres modelos fue evaluada y se observaron efectos modestos sobre el crecimiento tumoral y la supervivencia. El efecto mostrado aquí empleando vacunas de células tumorales irradiadas mezcladas con B7-IgG soluble es sorprendentemente mucho mayor. Aproximadamente 1016 moléculas B7 se proporcionan ' mediante la mezcla de 100 µg de B7-IgG con la vacuna, en comparación con un total de aproximadamente 1010~ 10u moléculas B7 en la superficie de 107 células tumorales transfectadas. Dicha diferencia cuantitativa puede explicar porque la vacunación con transfectantes B7 irradiados es mucho menos eficiente que con transfectantes B7 vivos en donde las células vivas pueden multiplicarse e incrementar el número de moléculas B7 disponibles. Otras explicaciones pueden involucrar la presencia extendida de moléculas B7-IgG, en comparación con moléculas B7 expresadas en la superficie de células tumorales irradiadas. Así mismo, las moléculas solubles pueden distribuirse de manera diferente en el cuerpo y alcanzar sitios más apropiados de estimulación inmune. La curación de tumor mediada por B7-IgG depende de Células CD8 T pero es independiente de IFN-gamma Para caracterizar adicionalmente la participación de la respuesta inmune adaptable en una estimulación inmune mediada por B7-IgG, se evaluó B7-IgG en ratones SCID que no tienen células T y células B madura. Tumores sólidos fueron establecidos en ratones SCID y fueron después tratados ya sea con B7-IgG sola o bien con una vacuna de célula irradiada más B7-IgG ningún tratamiento tuvo un efecto sobre el crecimiento tumoral, lo que demuestra la dependencia de respuestas tumorales mediadas por B7-IgG de las células T o B (Figura 10) . Ratones que llevan tumores fueron también tratados después del agotamiento de células CD8 o CD4T. El agotamiento de las células CD8 o CD4T por inyección de anticuerpo fue iniciado un día antes del principio de la terapia con B7-IgG. Un agotamiento exitoso fue verificado por análisis FACS de PBL, el día 28. En ratones que presentan agotamiento de CD4, B7-IgG indujo regresión tumoral y una curación que no podía distinguirse de ratones normales (figura 11), mientras que un agotamiento de CD8 canceló la actividad antitumor mediada por B7-IgG. Los tumores crecieron más lentamente que en ratones no tratados, con agotamiento de CD8, pero no se observó curación de tumor (figura 11) . A pesar del hecho que IFN-gamma desempeña la función importante en la vigilancia inmune antitumor y en respuestas antitumor, se determinó que B7-IgG podía curar tumores establecidos independientes de IFN-gamma. Tumores sólidos fueron establecidos en ratones noqueados para IFN-gamma y tratados con B7-IgG o bien una vacuna de célula tumoral irradiada mezclada con B7-IgG. Ambos tratamientos indujeron una regresión del tumor y curación aproximadamente el dia 28, lo que es comparable con ratones de tipo silvestre, lo que demuestra la independencia de IFN-gamma de una terapia tumoral B7-IgG. (figura 12) . Asi mismos tumores que no respondieron a IFN-gamma debido a mutaciones de su receptor IFN-gamma fueron todavía curados cuando fueron tratados con B7-IgG. Se determinó también que B7-IgG en una terapia antitumor o como adyuvante de vacuna es más potente que un anticuerpo de bloqueo para CTLA4. En tres modelos diferentes de tumor, el tratamiento con B7-IgG curó tumores o protegió contra reto por tumor mientras que un anticuerpo anti-CTL4 no tenía ningún efecto a pesar de su afinidad mucho más elevada para CTLA4 y reportes previos de su actividad de bloqueo. Estos datos demuestran que el mecanismo a través del cual B7-lgG incrementa la respuesta inmune no es solamente limitado al bloqueo de la señal negativa mediada por CTLA4 ni solamente dependiente de dicho bloqueo. Tabla 2: B7-IgG2a mezclada con células tumorales irradiadas proporciona una inmunidad protectora Inmunización Protección No. de animales No. de porcentual (no. de animales experi- ( edia +/- DE) protegidos/no. mentos total de animales retados) No inmunizado 8%. (11) 3/42 5 P815 irradiado 2% (4) 1/43 5 transfectante P815 23% (4) 3/13 2 irradiado-B7-l P815 irradiado+B7-l 65% (18) 29/45 IgG P815 irradiado+B7-2 60% (24] 23/37 IgG P815 irradiado+B7-l 28% (4) 5/18 2 IgG mutada P815 irradiado+B7-2 20% 2/10 1 IgG mutada P815 irradiado + 0% 0/10 1 anti-CD28 P815 irradiado + 40% 4/10 1 anti-CTLA-4 L1210-P1A irradiado 0%(0) 0/19 2 L1210-P1A irradiado + 10% (14) 2/20 2 B7-l-IgGIgG Equivalentes Los expertos en la materia reconocerán o bien podrán determinar empleando solamente experimentos de rutina muchos equivalentes a las modalidades específicas de la presente invención descrita aquí. Tales equivalentes están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Genetics Institute, Inc <120> USO DE MOLÉCULAS COESTIMULADORAS SOLUBLES PARA INCREMENTAR LAS RESPUESTAS INMUNES <160> 4 <170> Patentln 2.0 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (318) ... (1181) <220> <221> mat_peptide <222> (420) <220> <223> cuadro de lectura abierto desde la ubicación 318 a 1181 pares de bases <220> <223> señal de poliadenilación alternada desde la ubicación 1474 a 1479 pares de bases <440> 1 ccaaagaaaa agtgatttgt cattgcttta tagactgtaa gaagagaaca tctcagaagt 60 ggagtcttac cctgaaatca aaggatttaa agaaaaagtg gaatttttct tcagcaagct 120 gtgaaactaa atccacaacc tttggagacc caggaacacc ctccaatctc tgtgtgtttt 180 gtaaacatca ctggagggtc ttctacgtga gcaattggat tgtcatcagc cctgcctgtt 240 ttgcacctgg gaagtgccct ggtcttactt gggtccaaat tgttggcttt cacttttgac 300 cctaagcatc tgaagcc atg ggc cae acá cgg agg cag gga acá tea cea 350 Met Gly Hiß Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro -30 -25 tec aag tgt cea tac ctg aat ttc ttt cag etc ttg gtg ctg gct ggt 398 Ser Lys Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly -20 -15 -10 ctt tet cae ttc tgt tea ggt gtt ate cae gtg acc aag gaa gtg aaa 446 Leu Ser His Phe Cys Ser Gly Val He His Val Thr Lys Glu Val Lys -S -1 1 5 gaa gtg gca acg ctg tec tgt ggt cae aat gtt tet gtt gaa gag ctg 494 Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu 15 20 25 gca caá act cgc ate tac tgg ca aag gag aag aaa atg gtg ctg act 542 Ala Gln Thr Arg He Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr 30 35 40 atg atg tet ggg gac atg aat ata tgg ccc gag tac aag aac cgg acc 590 Met Met Ser Gly Asp Met Asn He Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr 45 50 55 ate ttt gat ate aet aat aac etc tec att gtg ate ctg gct ctg cgc 638 He Phe Asp He Thr Asn Asn Leu Ser He Val He Leu Ala Leu Arg €t 65 70 cea tet gac gag ggc ac tac gag tgt gtt gtt ctg aag tat gaa aaa 686 Pro Ser Aßp Glu Gly Thr Tyr Glu Cyß Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys 75 80 85 gac gct ttc aag cgg gaa cae ctg gct gaa gtg acg tta tea gtc aaa 734 Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys 90 95 100 105 gct gac ttc cct acá cct agt ata tet gac ttt gaa att cea act tet 782 Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser He Ser Asp Phe Glu He Pro Thr Ser 110 115 120 aat att aga agg ata att tgc tea acc tet gga ggt ttt cea gag cct 830 Aßn He Arg Arg He He Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro 125 130 . 135 cae etc tec tgg ttg gaa aat gga gaa gaa tta aat gcc ate aac ac 878 His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala He Asn Thr 140 145 150 ac gtt tec caá gat cct gaa act gag etc tat gct gtt age age aaa 926 Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys 155 160 165 ctg gat ttc aat atg ac acc aac cae age ttc atg tgt etc ate aag 974 Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu He Lys 170 175 180 185 tat gga cat tta aga gtg aat cag ace ttc aac tgg aat ac acc aag 1022 Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys 190 195 200 ca gag cat ttt cct gat aac ctg etc cea tec tgg gcc att acc tta 1070 Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala He Thr Leu 205 210 215 ate tea gta aat gga att ttt gtg ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt 1118 He Ser Val Asn Gly He Phe Val He Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe 220 225 230 gcc cea aga tgc aga gag aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa 1166 Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu 235 240 245 agt gta cgc cct gta taacagtgtc egeagaagea aggggctgaa aagatctgaa 1221 Ser Val Arg Pro Val 250 ggtagcctcc gtcatctctt ctgggataca tggategtgg ggatcatgag gcattcttcc 1281 cttaacáaat ttaagetgtt ttacccacta cctcaccttc ttaaaaacct ctttcagatt 1341 aagctgaaca gttacaagat ggctggcatc cctctccttt ctccccatat gcaatttget 1401 taatgtaacc tcttcttttg c?atgtttcc attctgccat cttgaattgt cttgtcagcc 1461 aatteattat ctattaaaca ctaatttgag 1491 <210> 2 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> secuencia de señal desde la ubicación -34 a -1: secuenciamiento de terminal amino de proteína soluble <220> <223> dominio extracelular desde la ubicación 1 a 208; similaridad con secuencia conocida <220> <223> dominio de transmembrana desde la ubicación 209 a 235; similaridad con secuencia conocida; <220> <223> dominio intracelular desde la ubicación 236 a 254; similaridad con secuencia conocida; <220> <223> glicosilación enlazada con N desde la ubicación 19-21, 55-7, 64-66, 152-154, 173-175, 177-179, 192-194, 198-200, similaridad con secuencia conocida <220> <223> dominio establecido Ig v desde la ubicación 1 a 104; similaridad con secuencia conocida <220> <223> dominio establecido Ig C desde la ubicación 105 a 202; similaridad con secuencia conocida <400> 2 Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cyß Pro Tyr -30 -25 -20 Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys -15 -10 -5 Ser Gly Val He His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu -1 1 5 10 Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg He 15 20 25 30 Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 35 40 45 "Met Asn lie Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg- Thr He Phe Asp He Thr 50 55 60 Asn Asn Leu Ser He Val He Leu Al» Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 65 70 75 Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lyß Tyr Glu Lyß Asp Ala Phe Lyß Arg SO 85 90 Glu Hiß Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lyß Ala Asp Phe Pro Thr 95 100 105 110 Pro Ser He Ser Asp Phe Glu He Pro Thr Ser Asn He Arg Arg He 115 120 125 He Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu 130 135 140 Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala He Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 145 150 155 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 160 165 170 Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cyß Leu He Lys Tyr Gly His Leu Arg 175 180 185 190 Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro 195 200 205 Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala He Thr Leu He Ser Val Asn Gly 210 215 220 He Phe Val He Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg 225 230 235 Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 240 245 250 <210> 3 <211> 1120 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> ( 107 ) . . . ( 1093 ) <400> 3 cacagggtga aagctttgct tctctgctgc tgtaacaggg actagcacag acacacggat 60 gagtggggtc atttccagat attaggtcac agcagaagca gccaaa atg gat ccc 115 Met Asp Pro 1 cag tgc act atg gga ctg agt aac att etc ttt gtg atg gcc ttc ctg 163 Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn He Leu Phe Val Met Ala Phe Leu 5 10 ?5 etc tet ggt gct gct cct ctg aag att caá gct tat ttc aat gag act 211 Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys He Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr 20 25 30 35 gca gac ctg cea tgc ca ttt gca aac tet caá aac ca age ctg agt 259 Ala ?sp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser 40 45 50 gag cta gta gta ttt tgg cag gac cag gaa aac ttg gtt ctg aat gag 307 Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu ?sn Glu 55 60 65 gta tac tta ggc aaa gag aaa ttt gac agt gtt cat tec aag tat atg 355 Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met 70 75 80 ggc cgc acá agt ttt gat tcg gac agt tgg acc ctg aga ctt cae aat 403 Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn 85 90 95 ctt cag ate aag gac aag ggc ttg tat caá tgt ate ate cat cae aaa 451 Leu Gln He Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys He He His His Lys 100 105 110 115 aag ccc acá gga atg att cgc ate cae cag atg aat tet gaa ctg tea 499 Lys Pro Thr Gly Met He Arg He Hiß Gln Met Aßn Ser Glu Leu Ser 120 125 130 gtg ctt gct aac ttc agt caá cct gaa ata gta cea att tet aat ata 547 Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu He Val Pro He Ser Asn He 13S 140 145 acá gaa aat gtg tac ata aat ttg acc tgc tea tet ata cae ggt tac 595 Thr Glu Asn Val Tyr He Asn Leu Thr Cyß Ser Ser He His Gly Tyr 150 155 160 cea gaa cct aag aag atg agt gtt ttg cta aga acc aag aat tea act 643 Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg T r Lys Asn Ser Thr 165 170 175 ate gag tat gat ggt att atg cag aaa tet caá gat aat gtc ac gaa 691 He Glu Tyr Asp Gly He Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu 180 185 190 195 ctg tac gac gtt tec ate age ttg tet gtt tea ttc cct gat gtt acg 739 Leu Tyr Asp Val Ser He Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr 200 205 210 age aat atg acc ate ttc tgt att ctg gaa act gac aag acg cgg ctt 787 Ser Asn Met Thr He Phe Cys He Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu 215 220 225 tta tet tea cct ttc tet ata gag ctt gag gac cct cag cct ccc cea 835 Leu Ser Ser Pro Phe Ser He Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro 230 235 240 gac cae att cct tgg att acá gct gta ctt cea ac gtt att ata tgt 883 Asp His He Pro Trp He Thr Ala Val Leu Pro Thr Val He He Cys 245 250 255 gtg atg gtt ttc tgt cta att cta tgg aaa tgg aag aag aag aag cgg 931 Val Met Val Phe Cyß Leu He Leu Trp Lyß Trp Lyß Lyß Lys Lys Arg 260 265 270 275 cct cgc aac tet tat aaa tgt gga acc aac acá atg gag agg gaa gag 979 Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu 280 285 290 agt gaa cag acc aag aaa aga gaa aaa ate cat ata cct gaa aga tet 1027 Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys He Hiß He Pro Glu Arg Ser 295 300 305 gat gaa gcc cag cgt gtt ttt aaa agt tcg aag acá tet tea tgc gac 1075 Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lyß Ser Ser Lyß Thr Ser Ser Cys Asp 310 315 320 taattaaaga gtaaagccca aaaaaaa 1120 325 <210> 4 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn He Leu Phe Val Met 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys He Gln Ala Tyr Phe 20 25 SO - Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln 35 40 45 Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val 50 55 60 Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg 85 90 95 Leu His Asn Leu Gln He Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys He He - 100 105 HO His His Lys Lys Pro Thr Gly Met He Arg He His Gln Met Asn Ser 115 120 125 Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu He Val Pro He 130 135 140 Ser Aßn He Thr Glu Asn Val Tyr He Asn Leu Thr Cys Ser Ser He 145 150 155 160 Hiß Gly Tyr Pro Glu Pro Lyß Lyß Mßt Ser Val Leu Leu Arg Thr Lyß 165 170 175 Asn Ser Thr He Glu Tyr Aßp Gly He Met Gln Ly» Ser Gln Asp Asn 180 185 190 Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser He Ser Leu Ser Val Ser Phß Pro 195 200 205 Aßp Val Thr Ser Aßn Met Thr He Phe Cyß He Leu Glu Thr Aßp Lyß 210 215 220 Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser He Glu Leu Glu Asp Pro Gln 225 230 235 240 Pro Pro Pro Asp Hiß He Pro Trp He Thr Ala Val Leu Pro Thr Val 245 250 255 He He Cyß Val Met Val Phe Cys Leu He Leu Trp Lys ,Trp Lys Lys 260 " 265 270 Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu 275 280 Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys He His He Pro 290 295 300 Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser ,1C 320 305 310 315 Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe 325

Claims

REIVINDICACIONES Un método para incrementar profilácticamente una respuesta inmune por un sujeto a un antígeno, gue comprende: administrar una composición soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula co-estimuladora, de tal manera que se realce la respuesta inmune del sujeto al antígeno.
Un método para incrementar terapéuticamente una respuesta inmune por un sujeto a un antígeno, que comprende: administrar una solución soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula co-estimuladora, de tal manera que la respuesta inmune del sujeto al antígeno sea incrementada.
El método de conformidad con la reivindicación 1 o de conformidad con la reivindicación 2, en donde la molécula co-estimuladora se selecciona dentro del grupo que consiste de B7-1 y B7-2.
Un método para incrementar la respuesta de células CD8+ T a un antígeno restringido de clase I en un sujeto, que comprende: administrar un primer agente que comprende un antígeno restringido de clase I o un fragmento del mismo y una composición soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula B7, de tal manera que al administrarse al sujeto, se incrementa la respuesta de célula CD8+ T a un antígeno restringido de clase I.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, que comprende además la administración de un antígeno restringido de clase II al sujeto.
6. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, que comprende además la administración de un adyuvante al sujeto.
7. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, en donde la molécula B7 es una molécula B7-1.
8. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, en donde la molécula B7 es una molécula B7-2.
9. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, en donde la molécula co-estimuladora es monoespecífica .
10. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, en donde la molécula co-estimuladora es dimérica y bivalente.
11. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, en donde la molécula co- estimuladora soluble es monoespecifica y dimérica y bivalente.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde una porción extracelular de una molécula B7 es fusionada sobre una segunda proteína o polipéptido que comprende una porción de una molécula de inmunoglobulina .
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la porción de la molécula de inmunoglobulina comprende residuos de cisteina.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la porción de la molécula de inmunoglobulina comprende las regiones de articulación, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina de ser humano.
15. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la porción de la molécula de inmunoglobulina comprende las regiones de articulación, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina humana.
16. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la molécula de inmunoglobulina ha sido modificada para reducir la fijación de complemento y/o unión con receptor Fc.
17. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, en donde el antigeno es un antígeno de célula tumoral .
18. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el sujeto tiene un cáncer de un tipo seleccionado dentro del grupo que consiste de: cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de células renales, leucemia, linfoma, melanoma, mastocitoma, sarcoma, y carcinoma de vejiga. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde el antigeno es un antígeno seleccionado dentro del grupo que consiste de: un antígeno bacteriano, un antígeno viral, y un antígeno de parásito. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde la respuesta inmune es una respuesta inmune celular. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde la respuesta inmune es una respuesta inmune humoral.