MXPA01007154A - Modulacion de trafico de celulas t de memoria sistemica. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para modular específicamente el tráfico de células T de memoria sistémica, en particular células T CD4+ sin afectar a las células T cándidas o a las células T de memoria intestinal. Se demuestra que las células T de memoria sistémica, que se caracterizan como CD45RA-, e integrina a4ß7-, expresan altos de niveles de CCR4. Los ligandos de CCR4, tales como TARC o MDC, actúan como un desencadenador de adhesión, en donde, después del enlace de CCR4, estas células sufren paro dependiente de integrina en los receptores vasculares apropiados. Este paro actúa para localizar las células en el sitio objetivo. Los métodos de la invención manipulan este desencadenamiento, y la quimiotaxis mediada por CCR4, para afectar la localización de las células T en los tejidos objetivo. En una modalidad de la invención, el agente activo es un agonista de CCR4, que actúa para mejorar la localización de las células T. En una modalidad alternativa, el agente es un antagonista que bloquea la actividad biológica de CCR4. Una ventaja de la invención es la selectividad para las células T de memoria sistémica, sin afectar a las células T nativas o a las células T de memoria intestin

Description

MODULACION DE TRAFICO DE CELULAS T DE MEMORIA SISTEMICA APOYO DEL GOBIERNO Este trabajo fue apoyado cuando menos en parte por concesiones del N.I.H GM37734; y el NIH Individual National Research Service Award (Concesión de Servicio de Investigación Nacional Individual de NIH) 1F32AI08930, y se llevó a cabo en parte en las instalaciones del Departamento de Asuntos de Veteranos. El gobierno puede tener ciertos derechos en esta invención.

INTRODUCCION Antecedentes Durante la inflamación y las respuestas inmunes, los leucocitos salen de la sangre y se acumulan en el sitio de la agresión. Una familia de citocinas denominadas quimiocinas, reclutan subconjuntos de leucocitos, y también están involucradas en los procesos inflamatorios agudos y crónicos, asi como en la hematopoiesis . Las quimiocinas son una subclase de citocinas que tienen características estructurales y efectos biológicos distintos. Su actividad primaria es sobre la quimiotaxis de los leucocitos, pero también se reporta que tienen efectos angiogénicos y angiostáticos . Todas las quimiocinas se fijan a miembros de una superfamilia de receptores de serpentina acoplados con la proteína-G que extienden la membrana de superficie celular del leucocito 7 veces (7-TM) . Las quimiocinas alfa ó CXC se caracterizan por un solo aminoácido que separa las primeras dos cisteinas. La familia beta o CC de quimiocinas contienen dos cisteinas adyacentes. Los genes humanos para las quimiocinas forman racimos sobre el cromosoma 17qll-ql2. Las quimiocinas son criticas en la migración de leucocitos desde el sistema circulatorio hasta los tejidos, por ejemplo durante los procesos de inflamación. La mayoría de las quimiocinas poseen dos superficies de fijación principales: un sitio de alta afinidad responsable de las interacciones específicas de ligando/receptor, y un sitio de más baja afinidad, también denominado el dominio de enlace de heparina o de enlace de glicosaminoglicano, que se cree que es responsable del establecimiento y de la presentación de los gradientes de quimiocina sobre la superficie de las células endoteliales y dentro de la matriz extracelular . Los leucocitos son capaces de fijarse al gradiente de quimiocina a través del receptor de alta afinidad, que luego induce la remodelación del citoesqueleto del leucocito, permitiendo el aplanamiento y la polarización celular. Una vez fuera de la circulación, las quimiocinas también guían a los leucocitos hacia los tejidos blanco. El receptor de quimiocina CCR4 primeramente identificado por Power y colaboradores (1995) J. Biol. Chem. 270:19495-19500 (Genbank Número de Acceso X85740) . Originalmente se reportó que las quimiocinas CC MIP-1, MCP-1, y RANTES eran capaces de interactuar funcionalmente con CCR4. Sin embargo, los datos recientes han sugerido que este receptor es especifico para las quimiocinas TARC y MDC . El ARNm de CCR4 está presente en los basófilos, en las células T, y en los monocitos, lo cual es consistente con el descubrimiento de que las quimiocinas previamente han demostrado ejercer un rango diverso de actividades sobre estos tipos de células, incluyendo liberación de histamina, quimiotaxis, y movilización de Ca++ en los basófilos, y quimiotaxis en las células T y en los monocitos. Se ha reportado que la expresión de CCR4 en las células Th2 se incrementan transitoriamente enseguida del acoplamiento de TCR y CD28 (D'Ambrosio y colaboradores (1998) J. Immunol 161:5111-5) . Las células Thl activadas también aumentan la expresión de CCR4 y la responsividad funcional a la quimiocina regulada por el timo y por la activación. El análisis de subconjuntos polarizados de células T CD8+ revela un patrón similar de expresión de receptor de quimiocina y modulación de responsividad . La quimiocina TARC (quimiocina regulada por el timo y por la activación) fue primeramente clonada por Imai y colaboradores (1996) J. Biol. Chem. 271:21514-21521. La TARC se expresa transitoriamente en las células mononucleares de sangre periférica estimuladas por fitohemaglutinina, y de una manera constitutiva en el timo. La TARC recombinante radiomarcada se enlaza específicamente a las células T y a las células T periféricas, pero no a los monocitos o granulocitos, y es capaz de provocar una respuesta quimiotáctica . La expresión TARC se puede regular hacia arriba mediante la citocinas, que se sabe que son producidas por las células T tipo TH2. La quimiocina derivada de macrofagcs (MDC) es un miembro recientemente identificado de la familia de quimiocinas CC . La MDC no está estrechamente relacionada con otras quimiocinas, compartiendo más similitud con la TARC. El análisis Northern blot indica una alta expresión de MDC en los macrófagos y en las células dendríticas derivadas de monocitos, pero no en los monocitos, las células aniquiladoras naturales, o varias líneas celulares de origen epitelial, endotelial, o de fibroblastos. También hay altos niveles de expresión en el timo, y una expresión más baja en el pulmón y el bazo. ¦ Tanto la MDC como la TARC funcionan como quimioatrayentes para los transfectantes de CCR4. Debido a que la MDC y la TARC se expresan ambas en el timo, se ha sugerido que un papel para estas quimiocinas puede ser atraer a los timocitos que lleven CCR4 en el proceso de educación y diferenciación de células T (Imai y colaboradores (2998) J Biol Chem 273(3) ¡1764-1768) . Aunque las quimiocinas son claramente benéficas en el sanado de heridas, en la hematopoiesis , y en la liberación de organismos infecciosos, la expresión continua de quimiocinas está asociada con inflamación crónica. Por consiguiente, esta clase de citocinas y/o sus receptores son un objetivo atractivo para la creación de antagonistas que abroguen una o más funciones de quimiocina . Se prevé que estos antagonistas podría servir como una nueva clase de fármacos anti-inflamatorios.

Literatura pertinente El papel de las quimiocinas en el tráfico de leucocitos es revisado por Baggiolini (1998) Nature 392:565-8, en donde se sugiere que las respuestas de migración en el complicado tráfico de linfocitos de diferentes tipos y grados de activación, serán mediada por las quimiocinas. El uso de pequeñas moléculas para bloquear las quimiocinas es revisado por Baggiolini y Moser (1997) J. Med. 186:1189-1191. Previamente se ha descrito el papel de diferentes quimiocinas específicas en el alojamiento de linfocitos. Por ejemplo, Campbell y colaboradores (1998) Science, demostraron que SDF-1 (también denominado PBSF) , C-6-cine (también denominado Exodus-2) , y MIP-3beta (también denominado ELC ó Exodus-3) inducían la adhesión de la mayoría de los linfocitos circulantes, incluyendo la mayoría de las células T CD4+; MIP-3alfa (también denominado LARC o Exodus-1) desencadenaban la adhesión de la memoria, pero no de las células T CD4 + Cándidas. Tangemann y colaboradores (1998) Immunol . 161:6330-7 dan a conocer el papel de la quimiocina de tejido linfoide secundaria (SLC) , una quimiocina asociada con vénula endotelial alta (HEV) , con el envío de los linfocitos hacia los órganos linfoides secundarios. Campbell (1998) J. Cell. Biol 141 ( ) : 1053-9 describen el receptor para SLC como CCR7 , y que su ligando SLC, puede desencadenar una detención rápida dependiente de integrina de los linfocitos que ruedan bajo un desgarre fisiológico. La expresión del antígeno del linfocito cutáneo (CLA) en la diferenciación de células T de memoria CD4+ humanas, y su regulación independiente con respecto a la síntesis de citocina, se discute en Teraki y Picker (1997) J. Immunol 159 ( 12 ) : 6018-29. La piel soporta tanto respuestas de dominantes Thl como Th2 en diferentes establecimientos; y la capacidad de envío a la piel de las células T de memoria humanas se correlacionan con, y parece depender de, la expresión del receptor de envío selectivo de la piel CLA. La identificación de CLA como una forma especializada de lingando-1 de glicoproteína de P-selectina se da a conocer en Fuhlbrigge y colaboradores (1997) Nature 389(6654) :978-81. CLA comprende un epítopo de carbohidrato que facilita la dirección de las células T hacia la piel inflamada, y se define tanto por su reactividad con un anticuerpo monoclonal único, HECA-452, como por su actividad como un ligando para la E-selectina (revisado por Butcher y Picker (1996)) . Se puede encontrar una revisión de la biología de las células T de memoria en Dutton y colaboradores (1998) Annu Rey Immunol 16:201-23. Las células de memoria expresan un patrón diferente de marcadores de superficie celular, y responden de varias maneras que son funcionalmente diferentes de aquéllas de las células Cándidas. Las células de memoria humanas son CD45RA", CD45RO+. En contraste con las células Cándidas, las células de memoria secretan un rango completo de citocinas de células T.

Compendio de la Invención Se proporcionan métodos para modular específicamente el tráfico de las células T de memoria sistémica, en particular las células de envío a la piel que expresan el antígeno de linfocito cutáneo, CLA. Las células T Cándidas y las células T de memoria intestinal no son afectadas por los presentes métodos. Las células T de memoria sistémica expresan altos niveles del receptor de quimiocina CCR4, y en respuesta a los agonistas de CCR , estas células sufren paro dependiente de integrina. En una modalidad de la invención, los ligandos CCR4 que se presentan naturalmente, los cuales incluyen las quimiocinas TARC (quimiocina regulada por el timo y por la activación) y MDC (quimiocina derivada de macrófagos) , se utilizan para atraer específicamente a las células T de memoria sistémica. Los agonistas alternativos para utilizarse como atrayentes incluyen anticuerpos y otros compuestos que tienen fracciones de enlace específico para CCR4. En otra modalidad de la invención, se impide el tráfico de las células T de memoria mediante la administración de agentes bloqueadores de CCR4; compuestos que de otra manera impiden el enlace de los ligandos de CCR4 naturales con CCR4; o compuestos que impiden la expresión de, o la señalización a través de, CCR4.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A a IE muestran que las células T de memoria de envío a la piel de preferencia son atraídas por TRC y DC. Se hace una comparación de linfocitos no fraccionados a partir de sangre periférica (Figura 1A) con linfocitos específicamente atraídos hacia diferentes quimiocinas (Figura IB a Figura 1E) . La Figura 2 muestra las compuertas de citometría de flujo utilizadas para calcular el porcentaje de migración de la Figura 3. La Figura 3 ilustra el porcentaje de migración de subpoblaciones de memoria de CLA (+) /a4ß7 (-) y CLA ( - ) /a4ß7 (+) hacia diferentes quimiocinas . La migración de linfocitos de sangre periférica humana a través de poros de 5 mieras, análisis FACs . La Figura 4 muestra la expresión diferencial de CCR4 en subconjuntos de células T de memoria CD4(*) definidos por la expresión del receptor de envió. Las Figuras 5A a 5C muestran la rápida adhesión inducida por TARC con ICAM-1 enriquecida en células CD4 de memoria a4ß7 (-) . Las Figuras 6? a 6C son gráficas de las células CD4 de memoria CLA(+) enriquecidas mediante el enlace con los transíectantes de E-selectina, y las células CD4 de memoria a4ß7(??) enriquecidas mediante el enlace con transíectantes MAdCAM-1. La Figura 7 es una gráfica que ilustra que la TARC desencadena la adhesión de las células T CD4 de memoria asociadas con la piel, pero no a4ß7(??) con ICAM-1. La Figura 8 es una gráfica que demuestra que la TARC desencadena una rápida adhesión (>1 segundo) de los linfocitos humanos que ruedan sobre E-selectina bajo desgarre fisiológico. Los linfocitos adherentes se acumulan sobre las paredes del tubo capilar con desgarre solamente cuando están presentes E-selectina, quimiocina, e ICAM-1. Las Figuras 9A y 9B demuestran que la adhesión de ICAM-1 inducida por TARC de los linfocitos que ruedan sobre E-selectina, es extremadamente rápida.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS Se proporcionan métodos para modular específicamente el tráfico de las células T de memoria sistémica, en particular las células T CD4+, sin afectar las células T Cándidas y las células T de memoria intestinal. Las células T de memoria sistémica expresan altos niveles del receptor de quimiocina CCR4, y en respuesta a los agonistas de CCR4 , estas células se desencadenan para sufrir paro dependiente de integrina en un sitio objetivo. Este paro actúa para localizar las células en el sitio objetivo. En algunas modalidades de la invención, este desencadenamiento es manipulado para modular la adhesión de estas células T a las células endoteliales . Los métodos de la invención también puede modular la quimiotaxis de estas células T, que también pueden controlar su tráfico y sus interacciones en los sitios sistémicos de inflamación . En los presentes métodos, se administran compuestos que modulan la actividad desencadenadora de CCR4 de una manera sistémica o local, para alterar el comportamiento de tráfico de las células T de memoria. El tráfico, o el envío, se utiliza en la presente para referirse a las actividades y trayectorias biológicas que controlan la localización de los leucocitos en un mamífero hospedero. Este tráfico puede estar asociado con enfermedad, por ejemplo inflación, reacciones alérgicas, etcétera, o puede ser parte de la homeostasis biológica normal. La administración local que proporciona una concentración localizada prolongada, que puede utilizar implantes de liberación sostenida u otra formulación tópica, es de un interés particular. En una modalidad de la invención, el compuesto modulador del desencadenamiento es un agonista de CCR4 , que actúa para mejorar el efecto de desencadenamiento. En una modalidad alternativa, el compuesto modulador de desencadenamiento bloquea la actividad de CCR4. Los usos in vivo del método son de interés para propósitos terapéuticos y de investigación. Los uso in vitro son de interés para el rastreo de fármacos, la determinación de las trayectorias fisiológicas, y similares. Los presentes métodos también proporcionan células de dirección desde la sangre hasta la piel y otros sitios sistémicos de inflamación, mediante la expresión de CCR4 en las células que se van a dirigir. Una ventaja de la presente invención es la selectividad para las células T de memoria sistémica. Las células T Cándidas no son afectadas, y por consiguiente, se mantiene mucha de la inmunidad celular normal. Otra ventaja es la selección para las células T de memoria sistémica contra intestinal. Existen muchas condiciones que se benefician de la modulación selectiva de las células T de memoria. Por ejemplo, muchas condiciones de inflamación crónica y autoinmunidad son mediadas por las células T de memoria, y se mejoran impidiendo que estas células T se acumulen en los sitios objetivo, mediante la administración de agentes que bloquean el desencadenamiento de CCR4. Este tratamiento puede ser profiláctico, por ejemplo para prevenir el establecimiento de la enfermedad, o se puede utilizar la enfermedad existente. Los datos presentas en la presente demuestran que las células T de memoria sistémica, que se caracterizan como CD45RA", e integrina a4ß7", expresan altos niveles de CCR4. Los ligandos de CCR4 , tales como TARC ó MDC, actúan como un desencadenador de adhesión. Después del enlace de CCR4 , estas células sufren paro dependiente de integrina hacia los receptores vasculares apropiados. Son de un interés particular las células T de memoria de envió a la piel, que expresan altos niveles de CLA. El enlace con CCR4 desencadena el paro de estas células, mediado por el enlace de CLA a su contra-receptor, E-selectina. Otras células T de memoria sistémica sufren adhesión de linfocito dependiente de LFA-1 con ICAM-1. Para mayor conveniencia, en la presente se proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos (SEQ ID N0S:1, 3, 5) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOS: 2, 4, 6) de las moléculas CCR4, TARC, y DC humanas nativas. A menos que se especifique de otra manera, las referencias a las moléculas hechas en la presente es a las moléculas correspondientes a estas secuencias . Los ácidos nucleicos que tienen estas secuencias se pueden utilizar para producir los polipéptidos codificados, por ejemplo para producir el antigeno para la inmunización, para estudios de enlace, para transfectar CCR4 en células T con el fin de mejorar el tráfico, etcétera. Las células T de memoria sistémica se caracterizan de acuerdo con la expresión en superficie celular de ciertos antigenos conocidos. Normalmente estas células son positivas para CD4, y carecen de expresión de CD45RA, y de integrina a4ß7. Además se caracterizan por la expresión de CCR4. Un subconjunto de células de interés son CLA+. Se puede realizar la verificación de la identidad de las células de interés mediante cualquier método conveniente, incluyendo teñido de anticuerpo, y análisis mediante detección de fluorescencia, ELISA, etcétera, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, amplificación de transcripción, e hibridación con microarreglos de ácidos nucleicos, etcétera. Se sabe que algunas células T de memoria asociadas con la piel expresan CLA, y estas células son de un interés particular para el tratamiento con los presentes métodos, en particular para modular el tráfico, o el envío de estas células hacia los tejidos cutáneos. Las condiciones de patrones asociados con inflamación o de reacción alérgica de la piel incluyen dermatitis atópica o eczema infantil; dermatitis por contacto, psoriasis, liquen plano; hipersensibilidad o respuestas destructivas a agentes infecciosos, etcétera. Estas enfermedades se benefician de la administración de agonistas de CCR4. El tratamiento reduce el número de células T de memoria sistémica en los sitios de inflamación . Otras células de memoria sistémica son desencadenadas para adherirse a la ICAM-1 endotelial, mediante enlace de LFA-1. Estas moléculas de adhesión están implicadas directamente en el rechazo de injerto, psoriasis, y artritis. El agente bloqueador de CCR4 que impide el desencadenamiento de la adhesión mediada por LFA-1 es útil en la inhibición del rechazo de injerto, impidiendo la acumulación de células T de memoria en el sitio de implantación del injerto; impidiendo la infiltración intra-islotes por las células T para inhibir el desarrollo de diabetes mellitus dependiente de insulina; bloqueando la infiltración de células T en el sistema nervioso central para tratar esclerosis múltiple y otras enfermedades desmielinantes ; bloqueando la acumulación de células T en las articulaciones sinoviales de los pacientes que sufren de artritis reumatoide; acumulando las células T de memoria para tener influencia sobre la responsividad inmune, y similares. Los agonistas de CCR4 son útiles para mejorar la reacción inmune en un sitio dirigido. Por ejemplo, en los pacientes de quemaduras, puede ser deseable incrementar profilácticamente la población de células T de memoria en los sitios de la quemadura. Otras infecciones, en particular las infecciones localizadas, se pueden tratar de esta manera, incluyendo, sin limitación, virus de herpes humano, incluyendo virus de herpes simplex (HSV) tipos 1 y 2, virus Epstein Barr (EBV) , citomegalovirus (CMV) , virus zoster de varicela (VZV) , y virus de herpes humano 6 (HHV-6), en particular infecciones de la boca y de los genitales, virus de hepatitis B (HBV) , y virus de hepatitis C (HCC) , infecciones del hígado, etcétera. Los agentes moduladores de CCR4 son moléculas que actúan específicamente como un agonista para mejorar la actividad biológica de CCR4 ; o que actúan como antagonistas que bloquean la actividad biológica de CCR4, por ejemplo la interacción entre CCR4 y sus ligandos. Con frecuencia, estos agentes interactúan con el dominio de enlace extracelular o con el dominio transmembrana de la proteina CCR4, y pueden activar la molécula a través del sitio de enlace del ligando, bloquear el sitio de enlace del ligando, alterar conforma-cionalmente el receptor, etcétera. Usualmente, la afinidad de enlace del agente bloqueador será cuando menos de aproximadamente ???µ?. De preferencia, el agente bloqueador será sustancialmente no reactivo con las moléculas relacionadas con CCR , tales como CCR1, CCR2 , CCR3 , CCR5 , etcétera, y otros miembros de la superfamilia de 7 dominios transmembrana. Los agentes bloqueadores no activan el desencadenamiento de adhesión de CCR . Los agonistas pueden activar la actividad desencadenadora, mejorar la actividad de quimiotaxis, o mejorar la actividad desencadenadora de otros ligandos. Será entendido por un experto en la materia que las siguientes discusiones de reactividad cruzada y competición entre las diferentes moléculas pretenden referirse a moléculas que tienen la misma especie de origen, por ejemplo la CCR4 humana se enlaza con la TARC y MDC humanas, etcétera. Los agentes modulares candidatos se rastrean para determinar su capacidad para satisfacer estos criterios. En a técnica se conocen ensayos para determinar la afinidad y la especificidad de enlace, incluyendo ensayos competitivos y no competitivos. Los ensayos de interés incluyen ELISA, RIA, citometria de flujo, etcétera. Los ensayos de enlace pueden utilizar la proteína CCR4 purificada o semi-purificada, o de una manera alternativa, pueden utilizar las células T de memoria nativas que expresen CCR4 , u otras células, por ejemplo las células transfectadas con una construcción de expresión para CCR4; membranas a partir de estas células etcétera. Como un ejemplo de un ensayo de enlace, la proteina CCR4 purificada se enlaza con un soporte insoluble, por ejemplo una placa de microtitulación, perlas magnéticas, etcétera. El agente modulador candidato y la TARC o MDC marcada soluble, se agregan a las células, y luego se deslavan los componentes no enlazados. La capacidad del agente modulador para competir con TARC y MDC por el enlace de CCR4 se determina mediante cuantificación de TARC o MDC marcada enlazada. La confirmación de que el agente bloqueador no reacciona cruzadamente con otros receptores de quimiocina, se puede realizar con un ensayo similar, sustituyendo con CCR1, CCR2, etcétera, en lugar de CCR4. Las moléculas adecuadas tendrán cuando menos aproximadamente 102 menos enlace con otros receptores de quimiocina que con CCR4 , más usualmente cuando menos aproximadamente 103 menos enlace.

Hay un número de ensayos de rastreo disponibles para los agentes bloqueadores . Los componentes de estos ensayos normalmente incluirán proteínas CCR4; y opcionalmente un agente activador de CCR4 , por ejemplo TARC, MDC, etcétera. La mezcla de ensayo también comprenderá un agente farmacológico candidato. En general, se pasan una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diferentes concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración cero o debajo del nivel de detección . De una manera conveniente, en estos ensayos se unirán una o más de las moléculas a una marca, en donde la marca puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable. Diferentes marcas incluyen radioisótopos, fluorescencias, quimiluminescencias , enzimas, moléculas de enlace especifico, partículas, por ejemplo partículas magnéticas, y similares. Las moléculas de enlace específico incluyen pares, tales como biotina y estreptavidina , digoxina y antidigoxina , etcétera. Para los miembros de enlace específico, el miembro complementario normalmente se marcaría con una molécula que proporcione la detección, de acuerdo con los procedimientos conocidos. Se pueden incluir una variedad de otros reactivos en el ensayo de rastreo. Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etcétera, que se pueden utilizar para facilitar el enlace óptimo de proteína-ADN, y/o para reducir las interacciones no específicas o de fondo. También se pueden utilizar reactivos que mejoren de otra manera la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etcétera. Se puede utilizar un ensayo funcional que detecte el desencadenamiento de la adhesión de células T para la confirmación. Por ejemplo, se puede utilizar una población de células T de memoria sistémica con TARC o DC, en la presencia o en ausencia del agente modulador candidato. Un agente que bloquee el desencadenamiento de CCR4 ocasionará una reducción en la adhesión de células T a la molécula de la célula endotelial apropiada, por ejemplo LFA-1 ó E-selectina, medida mediante los ensayos descritos en los ejemplos proporcionados el a presente, etcétera. Un agente que sea un agonista de CCR4 incrementará la adhesión de las células T a esa molécula de célula endotelial, ya sea en ausencia, o bien en la presencia de ligandos de CCR4. Los agentes moduladores de CCR4 son péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, peptidomiméticos , receptores de células T solubles, anticuerpos, o similares. Los anticuerpos son un agente modulador de ejemplo. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; intactos o truncados, por ejemplo F(ab')2, Fab, Fv; xenogeneicos , alogeneicos, singeneicos, o formas modificadas de los mismos, por ejemplo humanizados, quiméricos, etcétera. En muchos casos, el agente modulador será un oligopéptido, por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo, etcétera, pero también se pueden emplear otras moléculas que proporcionen una especificidad y afinidad relativamente altas. Las bibliotecas de combinación proporcionan compuestos diferentes de los oligopéptidos que tienen las características de enlace necesarias. En general, la afinidad será de cuando menos aproximadamente 10~6 más usualmente de aproximadamente 10"8 M, es decir, las afinidades de enlace normalmente observadas con los anticuerpos monoclonales específicos. Los agentes candidatos también abarcan numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, de preferencia compuestos orgánicos pequeños que tengan un peso molecular mayor de 50 y menor de aproximadamente 2,500 dáltones. Los agentes candidatos comprenden los grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las proteínas, en particular enlace de hidrógeno, y típicamente incluyen cuando menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo, sulfhidrilo, o carboxilo, de preferencia cuando menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos con frecuencia comprenden carbono cíclico o estructuras heterocíclicas , y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas , incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esferoides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales, o combinaciones de los mismos . Los agentes candidatos se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, existen numerosos medios disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas , incluyendo la expresión de los oligonucleótidos aleatorizados . De una manera alternativa, están disponibles o se pueden producir fácilmente las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, de plantas, y de animales. Adicionalmente , las bibliotecas y compuestos naturales o sintéticamente producidos se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos, y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, para producir análogos estructurales. Los anticuerpos adecuados para utilizarse como agentes bloqueadores se obtienen mediante la inmunización de un animal huésped con péptidos que comprendan toda o una porción de la proteína CCR4. Los animales huéspedes adecuados incluyen ratón, rata, oveja, cabra, hámster, conejo, etcétera. El origen del inmunógeno de proteína puede ser de ratón, humano, de rata, de mono, etcétera. El animal huésped en general será de una especie diferente de la del inmunógeno, por ejemplo se utiliza CCR4 de ratón para inmunizar hámster, CCR4 humana para inmunizar ratones, etcétera . El inmunógeno debe comprender la proteina completa, o fragmentos y derivados de la misma. Los inmunógenos preferidos comprenden todo o una parte del dominio extracelular de la CCR4 humana, en donde estos residuos contienen modificaciones posteriores a la traducción, tales como glicosilacicn, encontradas en la proteina nativa. Los inmunógenos que comprenden el dominio extracelular se producen en una variedad de maneras conocidas en este campo, por ejemplo expresión de los genes clonados utilizando métodos recombinantes convencionales, aislamiento a partir de células T, poblaciones celulares clasificadas que expresen altos niveles de CCR4, etcétera. Cuando se desee la expresión de una proteina recombinante o modificada, se utilizará un vector que modifique la porción deseada de CCR4. En general, se diseñará un vector de expresión de tal manera que el dominio extracelular de la molécula CCR4 quede sobre la superficie de una célula transíectada, o alternativamente, el dominio extracelular se secreta a partir de la célula. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante técnicas convencionales. En general, los nodos del bazo y/o de la linfa de un animal huésped inmunizado, proporcionan una fuente de células de plasma. Las células de plasma se inmortalizan mediante su fusión con células de mieloma para producir células de hibridoma. El sobrenadante de cultivo a partir de los hibridomas individuales se rastrea utilizando técnicas convencionales para identificar los que produzcan los anticuerpos con la especificidad deseada. Los animales adecuados para la producción de anticuerpos monoclonales para la proteina humana incluyen ratón, rata, hámster, etcétera. Para reproducir los anticuerpos contra la proteina de ratón, el animal en general será un hámster, conejillo de indias, conejo, etcétera. El anticuerpo se puede purificar a partir de los sobrenadantes de células de hibridoma o del fluido de ascitas mediante técnicas convencionales, por ejemplo, por ejemplo cromatografía por afinidad utilizando CCR4 enlazada a un soporte insoluble, proteína A-sefarosa, etcétera. El anticuerpo se puede producir como una sola cadena, en lugar de la estructura multimérica normal. Los anticuerpos de una sola cadena se describen en Jost y colaboradores, (1994) J:B:C: 269:26267-73, y otros. Las secuencias de ADN que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera, se ligan a un separador que codifique cuando menos aproximadamente 4 aminoácidos de los aminoácidos neutros pequeños, incluyendo glicina y/o serina. La proteína codificada por esta fusión permite el ensamble de una región variable funcional que retiene la especificidad y la afinidad del anticuerpo original. Para usarse in vivo, particularmente para inyectarse en seres humanos, es deseable reducir la antigenicidad del agente bloqueador. Una respuesta inmune de un receptor contra el agente bloqueador reducirá potencialmente el periodo de tiempo en que sea efectiva la terapia. Los métodos para humanizar anticuerpos son conocidos en la materia. El anticuerpo humanizado puede ser el producto de un animal que tenga genes de región constante de inmunoglobulina humana transgénica (ver, por ejemplo, las Solicitudes de Patentes Internacionales Números WO 90/10077 y WO 90/04036) . De una manera alternativa, el anticuerpo de interés se puede diseñar mediante técnicas de ADN recombinante , para sustituir los dominios CHl, CH2, CH3r de articulación, y/o el dominio de estructura, con la secuencia humana correspondiente (ver la Publicación Internacional Número WO 92/02190) . El uso de ADNc de Ig para la construcción de los genes de inmunoglobulina quimérica es conocido en la materia (Liu y colaboradores (1987) P.N.A.S 84:3439 y (1987) J. Immunol. 139:3521) . El ARNm se aisla a partir de un hibridoma u otra célula que produzca el anticuerpo, y se utiliza para producir el ADNc. El ADNc de interés se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa, utilizando cebadores específicos (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,683,195 y 4,683,202). De una manera alternativa, se hace una biblioteca, y se rastrea para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN que codifique la región variable del anticuerpo, se fusiona entonces con las secuencias de la región constante humana. Las secuencias de los genes de regiones constantes humanas se pueden encontrar en Kabat y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publicación número 91-3242. Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles a partir de los clones conocidos. La elección del isotipo será guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación de complemento, o actividad en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. Los isotipos preferidos son IgGl, IgG3, e IgG4. Se puede utilizar cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera humanas, kappa o lambda . Luego se expresa el anticuerpo humanizado quimérico mediante métodos convencionales . Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab' )2, Y Fab, se puede preparar mediante la disociación de la proteina intacta, por ejemplo mediante disociación con proteasa o química. De una manera alternativa, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifique una porción del fragmento F(ab')2 incluiría secuencias de ADN que codifiquen el dominio CH1 y la región de articulación de la cadena H, seguidas por un codón de paro de traducción, para producir la molécula truncada. Se pueden utilizar secuencias en consenso de las regiones H y L J para diseñar oligonucleótidos para utilizarse como cebadores con el fin de introducir sitios de restricción útiles en la región J para el subsecuente enlace de los segmentos de la región V con los segmentos de la región C humana. El ADNc de la región C se puede modificar mediante mutagénesis dirigida al sitio, para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. UN vector conveniente es uno que codifique una secuencia de inmunoglobulina CH ó CL humana funcionalmente completa, con los sitios de restricción apropiados diseñados de tal manera que se pueda insertar y expresar fácilmente cualquier secuencia VH o VL. En estos vectores, el empalme normalmente se presenta entre el sitio donador de empalme en la región J insertada, y el sitio aceptor de empalme precedente a la región C humana, y también en las regiones de empalme que se presentan dentro de los exones CH humanos. La poliadeni-lación y la terminación de transcripción ocurren en los sitios cromosómicos nativos corriente debajo de las regiones codificantes . El anticuerpo quimérico resultante se puede unir a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTRs retroviral, por ejemplo el promotor temprano SV-40 (Okayama y colaboradores, (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280), virus de sarcoma de Rous LTR (Gorman y colaboradores (1982) . N . A. S 79:6777), y virus de leucemia de murino Moloney LTR (Grosschedl y colaboradores (1985) Cell 41:885); promotores de Ig nativos, etcétera. La formulación del agente modulador de CCR4 se administra en una dosis efectiva para alterar la acumulación de las células T de memoria sistémica en el sitio objetivo, por ejemplo un sitio de inflamación, un tejido cutáneo, etcétera. La presente invención es útil en cualquier especie, tal como primates, particularmente seres humanos, animales domésticos, por ejemplo murino, bovino, equino, canino, felino, ovino, porcino, etcétera, y cualquiera de estas especies puede encontrar aplicación como una fuente de anticuerpos . Los anticuerpos u otras moléculas de enlace utilizadas en el método de la presente invención de preferencia se administran a los individuos de una manera que maximice la posibilidad del anticuerpo u otra molécula de enlace de epitopo que llegue a la célula objetivo, se enlace con ella, y de esta manera module la interacción de la quimiocina y el receptor. La dosis para individuos de diferentes especies y para diferentes enfermedades se determina midiendo el efecto del agente modulador sobre la reducción de los parámetros que son indicativos de que se está tratando la enfermedad. El agente modulador de CCR4 se puede dar mediante diferentes vías de administración convencionales, por ejemplo oral, rectal, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal , transdérmica, etcétera. Las formulaciones del agente modulador de CCR4 se administran a un huésped afectado por un desorden inmune caracterizado por números indeseables de células T de memoria sistémica en un sitio objetivo. Los agentes de bloqueo de la invención se administran en una dosificación que reduzca el número de células T de memoria sistémica en el sitio objetivo. Los agentes bloqueadores de la presente invención se administran en una dosificación que reduzca los números de células T de memoria, reduciendo de esta manera la activación inmune mediada por células T, en particular inflamación crónica, mientras que se minimizan cualesquiera efectos secundarios. Los agonistas de CCR4 mejoran la reactividad inmune, por ejemplo como profilaxis durante trauma a la piel, por ejemplo victimas de quemaduras y similares; como un tratamiento para infección; etcétera. Se contempla que la composición se obtendrá y se utilizará bajo la guia de un médico para uso in vivo. Se pueden emplear diferentes métodos para la administración. La formulación se puede dar oralmente, mediante inhalación, o se puede inyectar, por ejemplo intravascular , subcutánea, intraperitoneal , intramuscular, etcétera. La dosificación de la formulación terapéutica variará ampliamente, dependiendo de la naturaleza de la enfermedad, de la frecuencia de administración, de la manera de administración, de la liberación del agente desde el huésped, y similares. La dosis inicial puede ser más grande, seguida por dosis de mantenimiento más pequeñas. La dosis se puede administrar tan infrecuentemente como semanalmente o quincenalmente, o fraccionar en dosis más pequeñas y administrada diariamente, cada media semana, etcétera, para mantener un nivel de dosificación efectivo. Los agentes moduladores de CCR4 de la invención se pueden incorporar en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. De una manera más particular, los agentes se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante su combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados, y se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas, o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas , y aerosoles. Como tal, la administración de los agentes moduladores de CCR4 se puede lograr de diferentes maneras, incluyendo administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal , intradérmica , transdérmica , intratraqueal , etcétera. Los agentes pueden ser sistémicos después de la administración, o de preferencia se localizan mediante la utilización de un implante que actúe para retener la dosis activa en el sitio del implante. En las formas de dosificación farmacéutica, los agentes moduladores de CCR4 se pueden administrar en la forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también se pueden utilizar solos o en asociación apropiada, así como en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son meramente de ejemplo, y de ninguna manera son limitantes. Para las preparaciones orales, los agentes moduladores de CCR4 se pueden utilizar solos o en combinación con aditivos apropiados para hacer tabletas, polvos, gránulos, o cápsulas, por ejemplo con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz, o almidón de papa; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa acacia, almidón de maíz, o gelatinas; con desintegradores, tales como almidón de maíz, almidón de papa, o carboximetilcelulosa de sodio; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes reguladores del pH, agentes humectantes, conservadores, y agentes sabori zantes . Los complejos de agentes moduladores de CCR4 se pueden formar en preparaciones para inyecciones mediante su disolución, suspensión, o emulsionamiento en un solvente acuoso o no acuoso, tales como aceites vegetales y otros aceites similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol ; y si se desea, con aditivos convencionales, tales como solubilizantes , agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes, y conservadores . Los complejos de agentes moduladores de CCR4 se pueden utilizar en una formulación en aerosol para administrase mediante inhalación. Los compuestos de la presente invención se pueden formular en propelentes presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares . Adicionalmente , los complejos de agentes moduladores de CCR4 se pueden hacer en supositorios mediante su mezcla con una variedad de bases, tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Los agentes moduladores de CCR4 de la presente invención se pueden administrar rectalmente mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras, y polietilenglicoles, que se fundan a la temperatura corporal, y no obstante, sean sólidos a temperatura ambiente. Se pueden proporcionar formas de dosificación unitaria para administración oral o rectal, tales como jarabes, elíxires, y suspensiones, en donde cada unidad de dosificación, por ejemplo una cucharadita, una cucharada, tableta, o supositorio, contenga una cantidad previamente determinada de la composición que contenga uno o más compuestos de la presente invención. De una manera similar, las formas de dosificación unitaria para inyección o administración intravenosa pueden comprender al compuesto de la presente invención en una composición como una solución en agua estéril, suero normal, u otro vehículo farmacéuticamente aceptable . Los implantes para formulaciones de liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los implantes se formulan como microesferas , bloques, etcétera, con polímeros biodegradables o no biodegradables . Por ejemplo, los polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable que es bien tolerado por el huésped. El implante que contenga a los agentes moduladores de CCR4 se coloca en proximidad el sitio de acción, de tal manera que se incremente la concentración local del agente activo en relación con el resto del cuerpo. El término "forma de dosificación unitaria", como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad previamente determinada de agentes moduladores de CCR4 de la presente invención, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador, o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria novedosas de la presente invención dependen del complejo particular empleado y del efecto que se quiera lograr, y de la farmacodinámica asociada con cada complejo en el huésped. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores, o diluyentes, están fácilmente disponibles para el público. Más aun, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste y regulación del pH, agentes de ajuste de tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes, y similares, están fácilmente disponibles para el público. Las composiciones de la invención también pueden contener otros agentes terapéuticamente activos . Son de un interés particular las combinaciones con otros agentes capaces de tener un efecto aditivo o sinérgico al lograr un resultado terapéutico, por ejemplo, en donde se afecte una trayectoria diferente o complementaria mediante cada uno de los agentes activos. El uso combinado del agente modulador de CCR4 y otros agentes, tiene la ventaja de que las dosificaciones requeridas para los fármacos individuales pueden ser más bajas, y el establecimiento y duración del efecto de los diferentes fármacos son complementarios . En la terapia combinada, los diferentes agentes activos se pueden suministrar juntos o por separado, y simultáneamente o en diferentes tiempos en el día. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los niveles de dosificación pueden variar como una función del compuesto específico, la severidad de los síntomas, y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunos de los complejos específicos son más potentes que otros. Las dosificaciones preferidas para un agente pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la materia mediante una variedad de medios. Un medio preferido es medir la potencia fisiológica de un compuesto dado.

EXPERIMENTAL Se debe entender que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, construcciones, y reactivos particulares descritos, debido a que todos éstos pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir solamente las modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, cuyo alcance será determinado por el lenguaje de las reivindicaciones. Se debe observar que, como se utilizan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", y "el", incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "un ratón" incluye una pluralidad de ratones, y la referencia a "la citocina" incluye la referencia a una o más citocinas, y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y asi sucesivamente . A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto ordinario en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos, dispositivos, y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, en la práctica o prueba de la invención, ahora se describen los métodos, dispositivos, y materiales preferidos. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precesión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etcétera), pero se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está grados centígrados; y la presión está en o casi la atmosférica. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan a la presente como referencia para todos propósitos pertinentes, por ejemplo, el propósito de describir y dar a conocer, por ejemplo las líneas celulares, construcciones, y metodologías que se describen en las publicaciones que se podrían utilizar en relación con la invención actualmente descrita. Las publicaciones discutidas anteriormente y a través de todo el texto se proporcionan exclusivamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en la presente debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteponer la fecha de dicha divulgación en virtud de la invención anterior.

Ejemplo 1 Para identificar los subconjuntos de linfocitos circulantes corresponden a los ligandos de CCR4 , el fenotipo del linfocitos de sangre periférica, (PBL) que migran hacia sus ligandos de quimiocina TARC y MDC se analizó en un ensayo de quimiotaxis de transcavidades estándar (Campbell y colaboradores (1996) J. Cell Biol. 134, 255-266; Campbell y colaboradores (1998), J. Cell Biol. 141, 1053-1059) . Se realizaron análisis citométricos de flujo para identificar las células aniquiladoras naturales (CD56+, CD16+, CD3~) , las células B (CD19+) , y las células T Cándidas (CD45RA+) y de memoria (CD45RA") CD4+ y CD8+. Debido al interés a determinación del papel de las quimiocinas en el tráfico regional de linfocitos, también se analizaron subpoblaciones de células T de memoria, definidas por la expresión de la integrina a4ß7, que es el receptor de linfocito para la molécula de adhesión celular adresina mucosa (MAdCAM-l) . Los linfocitos de memoria a4ß7¾1 se fijan a la MAdCAM-l vascular, trafican hacia los sitios intestinales, y llevan memoria para los antigenos intestinales; mientras que las células a4ß7~ incorporan memoria para las respuestas inmunes sistémicas ( Santamaria-Babi y colaboradores (1995) J. Exp . Med 181, 1035-1940) . Como se ilustra en la Figura 1, todos los subconjuntos de linfocitos, excepto las células aniquiladoras naturales, respondieron bien a ???3ß (un ligando para CCR7 ) , y todos los subconjuntos migraron hasta SDF-1 (un ligando para CXCR4 ) . En contraste, las células T CD4+ de memoria a4ß7~ (sistémicas, no intestinales) fueron la población predominante reclutada por TARC y por MDC; y las células CD8+ de fenotipo de memoria a4ß7~ también se enriquecieron entre los linfocitos que respondieron a estas quimiocinas. La migración de linfocitos de sangre periférica humana a través de poros de 5 mieras y el análisis FACs de células migradas, se realizaron como se describe (Campbell y colaboradores (1998), supra.) Los subconjuntos de linfocitos se definieron como sigue: Aniquiladora natural = CD56(+), CD16(+) , CD3(-); células B = CD19(+); células T CD8 (+) (Cándidas) = TCRo ( + ), CD8 (ni) , CD27(+), CD45RA(hi); células T CD8(+) (memoria a4ß7 (+) ) = CD8 (hi) , CD56(-), CD45RA(neg), 4ß7(+); células T CD8(+) (memoria a4ß7(-) ) = CD8(hi), CD56-(-), CD45RA(neg), 4ß7(-); células T CD4(+) (cándidas) = CD445RA(+); células T CD4(+) (memoria 4ß7(+)) = CD4(+), CD45RA(-), a4ß7(+); células T CD (+) (memoria a4ß7(-)) =CD4(+), CD45RA(-), a4ß7(-). Se muestra el promedio y la desviación estándar de 3 donadores sanos individuales, con 4 a 16 pozos replicados por quimiocina por donador (4 para SDF-l y ???-3ß; 16 para TARC y DC) , y 24 pozos para controlar la falta de quimiocinas. Para calcular la migración especifica, el número promedio de células/pozo que migraron hacia el fondo del pozo en ausencia de quimiocina (fondo) se sustrajo del número total de células/pozo que migraron hacia la quimiocina en los pozos paralelos. Para calcular el porcentaje de representación de cada subtipo de linfocito en la poblaciones migradas, el número de células específicamente migradas /pozo pertenecientes a cada subtipo, se dividió entre el número total de células específicamente migradas/pozo . La actividad selectiva de los ligandos de CCR4 sobre las células de memoria a4ß7~ circulantes, sugiere un papel en el reclutamiento de linfocitos selectivo del tejido a partir de la sangre. Para explorar esta posibilidad adicionalmente , se compararon las respuestas de los dos subconj untos de células T dirigidos al tejido antigénicamente definidos, mejor caracterizados. Estos subconjuntos fueron células CD4+ de memoria intestinal ( 4ß7111) , y células T CD4+ de memoria de envío a la piel, definidas por el antígeno de linfocito cutáneo, CLA. La Figura 2 muestra el perfil de linfocitos de sangre periférica a partir de un donador sano típico. El teñido con CLA contra a4ß7 de linfocitos de memoria CD4 (+) /CD45RA (-) a partir de sangre periférica. Se dibujan compuertas alrededor de las subpoblaciones de memoria asociadas con la piel CLA (+) /a4ß7 (-) e intestinales CLA- (-) /a4ß7 (+) . CLA es un epitopo de células T dependiente de carbohidrato relacionado con sialil-Lewisxr que identifica las células de memoria cutánea y las funciones como un receptor de envió de células T para la piel. Como se muestra en la Figura 3, TARC y MDC atraen a estas células de memoria de envió a la piel extremadamente bien, mientras que las células T de memoria intestinal a p7hl responden pobremente. Las células T a4ß7~ CLA" también migraron de una manera significativa, aunque consistentemente menos bien que la población CLA+, sugiriendo que la responsividad de los linfocitos de memoria cutánea para los ligandos de CCR4 puede ser compartida con un subconjunto de otras células de memoria . El cálculo de células migradas y el cálculo del porcentaje de migración de la Figura 3, se realizaron como se describe en Campbell y colaboradores (1998), supra . Brevemente, se realizaron ensayos de migración en RPMI-1640 con BSA al 0.5 por ciento, utilizando insertos de cultivo de tejido de placa de 24 pozos (Costar Corp., Cambridge, MA) , con filtros de policarbonato con poros de 5 mieras. Se colocaron 5 x 105 células en la cámara superior en 100 microlitros, 600 microlitros de dilución de quimiocina en el pozo inferior; y se realizó la migración durante 90 minutos a 3 °C. Para calcular el porcentaje de migración, se determinó el número de células de cada subtipo para la población inicial de cada ensayo quimiotáctico . Enseguida, se determinó el número de células pertenecientes al mismo subtipo para la población migrada, y se determinó el porcentaje de migración a partir de estos dos números. Se muestra el promedio y la desviación estándar de seis experimentos individuales (pozos por experimento descritos en la Figura 1) . Se ha sustraído la migración de fondo promedio del 1.7 por ciento para las células CLA ( - ) /a4ß7 ( + ) y del 2.74 por ciento para las células CLA (+) /a4ß7 (-) . La diferencia en el porcentaje de migración entre CLA ( + ) /a4ß7 ( - ) y CLA- (-)/ 4ß7(+) es altamente significativa mediante la prueba de orden de rango de Mann-Whitney para TARC y MDC (p<0.01). Consistentemente con estas respuestas quimiotácticas , el teñido con inmunofluorescencia confirmó la expresión diferencial de CCR4 en las células de memoria asociadas con la piel contra intestinales. Como se ilustra en la Figura 4, la mayoría de las células CD4 de memoria CLA+ expresan muy altos niveles de CCR4 (>95 por ciento positivas; >70 por ciento sobre 100 unidades de fluorescencia promedio) , mientras que la mayoría de las células de memoria 4ß7¾1 son débiles o negativas (<30 por ciento positivas; 90 por ciento <100 unidades de fluorescencia promedio) . Estos datos demuestran que CCR4 y sus ligandos median el reclutamiento preferencial de las células T de memoria sistémica a4ß7~, especialmente la población de envió a la piel. En la Figura 4, se definieron subconjuntos de memoria CD4 (+) de sangre periférica, mediante cuatro citometrias de flujo de color como sigue: CLA+ (panel izquierdo) = CD4( + ), CLA(+), a4ß7(-); ??_?"/a4ß7~ (panel central) = CD4( + ), CLA) (-), a4 ß7 ( - ) ; a4ß7 (panel derecho) = CD4 ( + ) , CD45RA(-), a4 p7(hi) . La expresión de CCR4 se determinó mediante MAb 1G1 producido contra células Ll/2 de ratón transfectadas con CCR4 , esencialmente como se describe en Qin y colaboradores (1996) Eur. J. Immunol . 26:640-647 y se demostró que se tiñen específicamente las células Ll/2 que expresan CCR4 pero no los transfectantes de control que expresan otras quimiocinas y receptores huérfanos relacionados. El teñido paralelo con IgGl de control acoplada con el isotipo fue negativo para estos subconjuntos. Se muestra el teñido combinado de tres donadores sanos individuales. Reactivos: las quimiocinas se titularon y se utilizaron en las concentraciones óptimas para la quimiotaxis de linfocitos no fraccionados como sigue: TARC, MDC y SDF-loc = 100 mM, ???-3ß = 1 µ? . Se obtuvieron las TARC y SDF-?a humanas sintéticas en Gryphon Sciences (South San Francisco, CA) . La MDC humana recombinante se obtuvo en Amgen (Boulder CO) , y la ???-3ß se adquirió en Pepro Tech EC, Ltd (Rocky Hill, NJ) . Los anticuerpos directamente conjugados utilizados para el análisis FACs, se obtuvieron en PharMingen, Inc. (San Diego, CA) , a menos que se indique de otra manera. El anti-CD3 conjugado con FITC (clon UCHT1), CD45RA (clon HI100), CLA (clon HECA 452, preparado por el personal del laboratorio Butcher) ; anti-CD56 conjugado con PE (clon B159), CD19 (clon B43), CD27 (M-T271), a4ß7 (clon ACT-1, LeukoSite, Inc.); anti-CD45RA biotinilada (clon HI100), CD16 (clon 3G8), CD8 (clon RPA-T8); anti-CD4 conjugado con APC (clon RPA-T4), CD8 (clon RPA-T8), CD56 (clon B159), TCRaP (clon T10B9. 1A-31). El reactivo de la segunda etapa utilizado para todos los anticuerpos biotinilados fue PerCP conjugado con estreptavidina (Beckton Dickinson, San José, CA) . Las quimiocinas pueden controlar el tráfico de linfocitos no solamente a través del estimulo de la quimiotaxis, sino también mediante el desencadenamiento de una rápida adhesión dependiente de integrina, y el paro de los linfocitos sobre el endotelio (Butcher (1991) Cell 67:1033-1036; Butcher & Picker (1996) Sciences 272 : 60-66) . Consistentemente con esta hipótesis, ciertas quimiocinas pueden desencadenar un rápido paro de linfocitos bajo desgarre fisiológico; y está bien documentado que algunas quimiocinas pueden ser expresadas y/o presentadas por células endoteliales en los sitios de extravasación de linfocitos.

Hemos encontrado que TARC puede ser expresada por el endotelio activado. Se detectó fácilmente el mensaje de la TARC, pero no de la DC, mediante análisis Northern blot en RNA a partir de células endoteliales de la vena umbilical humana estimuladas con endotoxina y citocina; y se observó el mensaje de TARC en cultivos primarios de células HEV de amígdalas humanas enriquecidas. Por consiguiente, la TARC puede ser expresada por el endotelio, y por consiguiente, podría estar disponible para la regulación de las interacciones vasculares por parte de los linfocitos. La expresión diferencial de CCR4 podría contribuir al reconocimiento por parte del linfocito, del endotelio cutáneo, si la TARC fuera exhibida por las vénulas de la piel. Los análisis inmunohistológicos de biopsias de piel crónicamente inflamada de pacientes con una variedad de desórdenes dermatológicos, revelaron reactividad del anticuerpo monoclonal anti-TARC (MAb) con las vénulas asociadas con el reclutamiento de linfocitos, incluyendo (pero no limitándose a) la mayoría de las vénulas que expresan E-selectina. Se fijaron secciones congeladas durante 10 minutos a temperatura ambiente en paraformaldehído al 4 por ciento en suero regulado con fosfato (PBS) . Después de lavarse con suero regulado con fosfato, se realizó el teñido con inmunoperoxidasa estándar como es descrito por Picker y colaboradores (1991) Nature 349:796-800. Se produjo el MAb LS142-2D8 contra la TARC humana sintética mediante técnicas convencionales, y se seleccionó mediante ELISA para determinar su reactividad con TARC, pero no con MDC u otras quimiocinas . El MAb anti-TARC (LS 142-2D8) tiñe las células endoteliales que revisten las vénulas asociadas con la infiltración de linfocitos en un caso de psoriasis. Se tiñeron los vasos yuxta-epidérmicos con anti-TARC, per no con el MAb IgGl de control. Las vénulas en la dermis también fueron positivas. En contraste, el MAb anti-TARC no tiñó una vénula positiva para MAdCAM-1 en la lámina propria colónica. También se observó reactividad de TARC en la piel crónicamente inflamada en biopsias de liquen planus, dermatitis atópica, e inflamación crónica no especifica. Las vénulas en las áreas mínimamente inflamadas de la dermis fueron con frecuencia positivas también, aunque menos intensamente y consistentemente. También se observó reactividad en muchas vénulas endoteliales altas en las amígdalas inflamadas. Estos vasos, que se piensa que median el reclutamiento de subconjuntos de memoria así como de linfocitos Cándidos, pueden expresar varias quimiocinas para soportar las interacciones de diversos subconjuntos de células B y T. En contraste, las vénulas involucradas en el reclutamiento hacia la lámina propria gastrointestinal (identificadas por el teñido con MAdCAM-1 en biopsias de intestino delgado y grueso, estómago, y colon normal e inflamado) fuero normalmente negativas; y cuando se observó reactividad, fue focal y débil. Los estudios inmunohisto-lógicos paralelos de piel de macaco revelaron una reactividad anti-TARC constitutiva dispersada de las vénulas, pero con una reactividad más extensa en las reacciones de hipersensibilidad de tipo demorado experimentalmente inducidas, generadas como se describe en Silber y colaboradores (1994) J. Clin. Invest. 93:1554-1563. Los resultados sugieren que la TRC es expresada en una forma regionálmente selectiva por el endotelio activado, y está bien colocada para ayudar a controlar la adhesión vascular y el paro de los linfocitos CCR4+ circulantes en el endotelio inflamado de la piel. Luego se determinó si la TARC podría desencadenar una rápida activación de integrina y un paro dependiente de integrina de los linfocitos circulantes. En los ensayos iniciales de rápida adhesión de linfocitos dependiente de LFA-1 a la ICAM-1 inmovilizada in vitro, el ligando de CCR4, TARC, fracasó para inducir la adhesión de todos los linfocitos de sangre periférica que fue detectable sobre el fondo (Campbell y colaboradores (1998) Science 279:381-384) . Sin embargo, los linfocitos CD4+ exhibieron una respuesta significativa a la TARC; y los linfocitos CD4+ de memoria a4ß7~ aislados mostraron una adhesión robusta con hasta el 50 por ciento de células de entrada que se enlazaron firmemente a ICAM-1 dentro de 2 minutos después de la adhesión de quimiocina ( Figura 5 ) . Más aun, la TARC desencadenó diferencialmente la adhesión de células T de la piel contra intestinales. Las células de memoria CLA+ y a4ß7¾1 se enriquecieron mediante el enlace de células T CD4+ aisladas a los fibroblastos transfectados que expresaban el contra-receptor de CLA, E-selectina, o el receptor de a4ß7, MAdCAM-1, seguido por elución con regulador quelante de cationes, como se describió anteriormente. Como se ilustra en la Figura 5, aunque ambas poblaciones respondieron igualmente bien a SDF-1, la TARC indujo selectivamente la adhesión de la población CLA+ enriquecida con E-selectina a ICAM-1. Es interesante que, aunque un subconjunto de células T a4ß7?? expresan CCR4, y las células a4ß7?11 migran sobre el fondo hasta TARC (aunque muy pobremente), exhiben poca o ninguna adhesión rápida a ICAM-1: los bajos niveles de CCR4 en el subconjunto positivo de células de memoria intestinal (fluorescencia media aproximadamente 7 veces más baja que las células T CLA+) pueden ser insuficientes para generar una respuesta proadhesiva robusta, lo cual típicamente requiere del acoplamiento de grandes números de receptores. Los ensayos de adhesión rápida estática mostrados en la Figura 5 se realizaron como se describen Campbell y colaboradores (1998) Science 279:381-384. Brevemente, se permitió que los linfocitos humanos se asentaran en portaobjetos de múltiples pozos recubiertos con ICAM-1 hasta una densidad de aproximadamente 1000 sitios por miera cuadrada. Después del asentamiento de las células, se agregaron las quimiocinas indicadas hasta una concentración final de 1 µ?. Los portaobjetos se lavaron en los tiempos indicados para remover las células no adherentes, y luego se fijaron las células enlazadas. Se contaron las células adherentes en el campo microscópico proximal al sitio de la adición del quimioatrayente . Las barras de error indican el rango de pozos duplicados. Los resultados son representativos de los experimentos con dos donadores diferentes. Las células mononucleares de prueba se purificaron mediante separación por densidad sobre ficoll, y se agotaron de monocitos mediante incubación sobre plástico para uso directo como linfocitos no fraccionados (panel izquierdo) ; o seleccionaron positivamente para la expresión de CD4 (paneles central y derecho) . Las células CD4 (+) se purificaron a partir de linfocitos de sangre periférica con el uso de Dynabeads anti-CD4, y el sistema DETACH-a-BEAD (Dynal, Lake Success, NY) , y se utilizaron directamente (panel central); o se agotaron de células de memoria Cándidas y a4ß7 (+) (panel derecho) , mediante incubación con CD45RA de ratón anti-humano, y a4ß7 de ratón anti-humano (versiones no conjugadas de los mismos MAbs utilizados en la Figura 1), seguido por microperlas recubiertas con inmunoglobulina antiratón, y agotamiento magnético (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Una porción de cada población celular procesadas se tiñó con anticuerpos directamente conjugados, y se analizó mediante citometria de flujo para aseverar la pureza. La población CD4 (+) fue 99 por ciento pura, y la población CD4 (+) /CD45RA- (-)/a4ß7(-) fue del 98 por ciento de CD45RA(+) y el 22 por ciento de CLA (+) . La Figura 6 muestra los linfocitos T CD4 (+) purificados, gue se incubaron sobre MAdCAM-1 (células de ovario de hámster chino transíectadas con MAdCAM-1 de murino) o sobre E-selectina (células CHO-K transíectadas con E-selectina humana, PDL, Inc) en un T-175 a 37°C durante 30 minutos con agitación ocasional; las células no enlazadas se lavaron con medio completo caliente, y las células enlazadas se recuperaron mediante elución con HBSS exento de cationes divalentes para E-selectina, o EDTA 0.5 mM para MAdCAM-1. Aproximadamente el 70 por ciento de la población adherente a E-selectina fue CLA+, y solamente el 6 por ciento fue oc4P7hl (siendo el resto de células Cándidas y de memoria a4ß7~) ; en donde las células enriquecidas sobre MAdCAM-1 consistieron en aproximadamente el 60 por ciento de células a4ß7111, y solamente aproximadamente el 5 por ciento fue de células CLA+. Los datos presentados son representativos de dos experimentos individuales con diferentes donadores. Las poblaciones enriquecidas de lo anterior, se probaron para determinar la adhesión inducida por quimiocina a ICAM-1, como se muestra en la Figura 7. La adhesión se evaluó 2 minuto después de la adición de quimiocina. La adhesión de fondo del 11 por ciento de entrada para las células enriquecidas en E-selectina, y el 10 por ciento de entrada para las células enriquecidas en MAdCAM-1, se sustrajo. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos (con diferentes donadores), con dos pozos duplicados por cada punto de datos. Las barras de error indican el rango de duplicados . La adhesión desencadenada de los linfocitos al endotelio in vivo debe ocurrir dentro de segundos y bajo condiciones de fuerte tensión de esfuerzo cortante de la pared vascular. En la piel inflamada, se piensa que la E-selectina receptora de CLA vascular media el contacto inicial con la célula (amarre) y el rodamiento de soporte, y los ligandos de integrina ß2 median el paro, con una contribución variable de integrina a4ß1 y VCAM-1 (Butcher & Picker (1996) supra) . Por consiguiente, para determinar si el ligando de CCR4 , TARC, podría mediar el paro de linfocitos dependiente de la activación rodando bajo condiciones fisiológicas, recubrimos tubos capilares con E-selectina en combinación con TARC y/o ICAM-1, y pasamos linfocitos de sangre periférica a través del tubo, con una tensión de desgarre de la pared de 2 dinas/centímetro cuadrado. Como se ilustra en la Figura 8, muchos linfocitos rodados llegaron a un paro rápido. El paro ocurrió dentro de menos de 1 segundo después del rodado inicial para la mayoría de las células (Figuras 9A y 9B) , y requirió de la presencia combinada de los tres componentes; el rodado de los linfocitos no perturbado en ausencia de ICAM-1 o TARC, pero el paro fue dramáticamente menos eficiente (Figura 8) . Concluimos que la TARC puede combinarse con los ligandos vasculares de E-selectina e integrina en una cascada de adhesión de múltiples pasos, en donde tanto CLA/E-selectina como CCR4/TARC contribuyen al paro selectivo de las células T de envío a la piel. Se realizaron ensayos de adhesión bajo esfuerzo cortante, mostrados en la Figura 8, como se describe anteriormente. Dicho de una manera breve, se pasaron células a 2 x 106/mililitro a través de un tubo capilar (diámetro interno de 1.025 milímetros, Drummond, Broomall, PA) a 1,250 microlitros/minuto (controlado mediante una bomba de jeringa Harvard 33 Harvard Apparatus, South Natick, A) , lo cual genera una tensión de desgarre de la pared de aproximadamente 2.0 dinas/centímetro cuadrado. Se contaron las células adherentes en 10 campos (campos registrados a intervalos de 30 segundos) entre 6 y 11 minutos después del inicio de ensayo. Se muestran los datos combinados para cuatro donadores sanos diferentes (de 10 campos cada uno) . Las barras de error indican la desviación estándar. La diferencia en la acumulación celular entre los tubos recubiertos con E-selectina, TARC, e ICAM-1, y los tubos a los que les faltaban TARC o ICAM-1, fue altamente significativa para los cuatro donadores mediante la prueba de orden de rangos Mann-Whitney (p< 0.03) . La E-selectina humana se purificó a partir de células Ll/2 transíectadas con E-selectina sobre una columna por afinidad de anticuerpo monoclonal E8.16-3 (PDL, Inc.) conjugado con Sepharose, utilizando el procedimiento de lisis de tejido previamente descrito (Honda y colaboradores, J. Immunol . 152:4026-4035) . Se preparó ICAM-1 a partir de bazo y nodos de linfa de ratón, como se describe en Campbell y colaboradores, (1998), supra . Las moléculas de adhesión solubilizadas en detergente (ICAM-1 y E-selectina), y las quimiocinas , se recubrieron sobre las superficies internas de los tubos como se describió anteriormente (infra) . La Figura 9 muestra las gráficas que ilustran el comportamiento de células individuales que interactúan con las áreas recubiertas de los tubos capilares, como se describió anteriormente. Cada linea representa una célula que inició la interacción con las moléculas de adhesión recubiertas dentro del campo de observación. La inclinación de la linea es proporcional a la velocidad de la célula. Se muestra el comportamiento de 5 células representativas para cada ensayo. El eje y indica la longitud del campo microscópico (220 mieras), con cero como la entrada en el campo, y 220 como la salida corriente abajo desde el campo. El tiempo ilustrado en el que la célula entra al campo es arbitrario. Se recubrieron los tubos capilares con una combinación de E-selectina e ICAM-1 más el medio solo (Figura 9A) o TARC (Figura 9B) . La velocidad promedio del volteo de las células fue de 327 mieras/segundo (desviación estándar + 88) bajo estas condiciones, determinada para 10 células aleatoriamente seleccionadas sobre las áreas no recubiertas del capilar. La velocidad promedio de las células rodantes fue de 5.5 mieras/segundo (desviación estándar + 1.9), determinada para 10 células aleatoriamente seleccionadas sobre E-selectina + ICAM-1 (sin TARC) . El tiempo de desaceleración se definió como el tiempo transcurrido entre el punto en el que la velocidad de la célula bajo dos desviaciones estándares debajo de la velocidad de volteo promedio (327-176=151 mieras/segundo) , y el punto el cual la célula llegó a una detención completa. El tiempo de desaceleración promedio se determinó para 13 células gue permanecieron detenidas durante >1 minuto, y fue de 0.87 segundos (desviación estándar + 0.92) . La desaceleración más larga fue de 2.51 segundos para una célula que inicialmente se detuvo, luego rodó otra longitud de la célula antes de llegar a un paro completo. El tiempo de desaceleración más rápido fue de <0.03 segundos, la duración de un marco de video VHS, que se observó para 3 de las 13 células. Los reportes recientes han sugerido un papel para CCR4 y sus ligandos, especialmente MDC, en la quimiotaxis selectiva de linfocitos T Th2 polarizados in vitro. Sin embargo, las células T CAL+ no están enriquecidas en células Th2. De hecho, después de un estimulo de corto plazo con estímulos activadores generales, las fracciones esencialmente idénticas de células CD4 CLA+ y CLA~ de memoria sanguínea exhiben perfiles de cxtocina Thl contra Th2. Los datos anteriores muestra que, sobre los linfocitos de memoria circulantes, CCR4 funciona como un "receptor de envío" quimioatrayente para la piel, y potencialmente para otros tejidos no intestinales, independientemente de los patrones de compromiso de las citocinas . Su expresión diferencial y su función sobre las células Th2 contra Thl completamente polarizadas in vitro. Pueden implicar un papel paralelo para las células Th2 efectoras relativamente infrecuentes que entran a la sangre, o puede ser más pertinente para el comportamiento de las células T efectoras activadas dentro de los sitios extravasculares de la inflamación . En conclusión, TARC y su receptor de linfocitos CCR4 están involucrados en el envío de las células T de memoria circulante, y sus interacciones con el endotelio vascular en los sitios cutáneos de inflamación. Proporcionan la primera evidencia para el involucramiento de la quimiocina en el reconocimiento endotelial de linfocitos selectivo del tejido, y sugieren que CCR4 y sus ligandos tienen un papel fundamental en la dirección regional de las células T de memoria, y por lo tanto, en la segregación funcional de las respuestas inmunes intestinales contra sistémicas, especialmente cutáneas. Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente aparente para los expertos ordinarios en este campo, a la luz de las enseñanzas de esta invención, que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas. La línea celular de hibridoma (LS141-1G1-65-15-1 ) que produce el anticuerpo monoclonal de murino 1G1, se depositó con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, el 6 de enero de 1999, a nombre de LeukoSite, Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142, y se le asignó el número de acceso ATCC HB-12624. La depositante, LeukoSite, Inc., ha autorizado a la solicitante a referirse al material biológico depositado en la solicitud, y ha dado su consentimiento sin reservas e irrevocable para que el material depositado se ponga a disposición del público de acuerdo con la Regla 28 de los Reglamentos de Implementación de la Convención Europea de Patentes (Regla 28(1) (d) de EPC) . Las células se pueden cultivar en DMEM, suero bovino fetal al 10 por ciento, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, y 100 nanogramos /mililitro de IL-6. El medio de cultivo también puede contener 50 unidades /mililitro de penicilina, y 50 microgramos /mililitro de estreptomicina.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Butcher, Eugene Campbe11 , James Rottman, James Wu, Lijan <120> RECEPTOR DE QUIMIOCINA CC Y SU LIGANDO TARC EN EL ENVIO LINFOCITOS A LA PIEL <130> SUN-110PRV <160> 6 <170> FastSEQ for Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 1677 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (183) ... (1265) <223> CCR4, secuencia de codificación del receptor de quimiocina <400> 1 cgggggtttt gatcttcttc cccttctttt cttccccttc ttctttcctt cctccctccc 60 tctctcattt cccttctcct tctccctcag tctccacatt caacattgac aagtccattc 120 agaaaagcaa gctgcttctg gttgggccca gacctgcctt gacgagcctg tagagttaaa 180 aa atg aac ccc acg gat ata gca gat acc acc ctc gat gaa age ata 227 Met Asn Pro Thr Asp lie Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser lie 1 5 10 15 tac age aat tac tat ctg tat gaa agt ate ccc aac ect tgc acc aaa 275 Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser lie Pro Lys Pro Cys Thr Lys 20 25 30 gaa ggc ate aag gca ttt ggg gag ctc ttc ctg ccc cea ctg tat tec 323 Glu Gly lie Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser 35 40 45 ttg gtt ttt gta ttt ggt ctg ctt gga aat tet gtg gtg gtt ctg gtc 371 Leu Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val 50 55 60 ctg ttc aaa tac aag cgg ctc agg tec atg act gat gtg tac ctg ctc 419 Leu Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu 65 70 75 aac ctt 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Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu lie Asn lie 195 200 205 Leu Gly Leu Val lie Pro Leu Gly lie Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met 210 215 220 lie lie Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala 225 230 235 240 Val Lys Met lie Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr 245 250 255 Pro Tyr Asn lie Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val 260 265 270 Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala lie Gln Ala 275 280 285 Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro lie lie Tyr 290 295 300 Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr lie Leu Gln Leu Phe Lys 305 310 315 320 Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln 325 330 335 lie Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met 340 345 350 Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu 355 360 <210> 3 <211> 538 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (53) ... (337) <223> secuencia de codificación para la quimiocina TARC <400> 3 ccctgagcag agggacctgc acacagagac tccctcctgg gctcctggca cc atg gcc 58 Met Ala 1 cea ctg aag atg ctg gcc ctg gtc acc etc etc ctg ggg gct tet ctg 106 Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu 5 10 15 cag cae ate cae gca gct cga ggg acc aat gtg ggc cgg gag tgc tgc 154 Gln His lie His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys 20 25 30 ctg gag tac ttc aag gga gcc att ccc ctt aga aag ctg aag acg tgg 202 Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala lie Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp 35 40 45 50 tac cag acá tet gag gac tgc tec agg gat gcc ate gtt ttt gta act 250 Tyr Gln Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala lie Val Phe Val Thr gtg cag ggc agg gcc atc tgt tcg gac ccc aac aac aag aga gtg aag 298 Val Gln Gly Arg Ala lie Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys 70 75 80 aat gca gtt aaa tac ctg caá age ctt gag agg tet tga agcctcctca 347 Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser * 85 90 ccccagactc ctgactgtct cccgggacta cctgggacct ccaccgttgg tgttcaccgc 407 ccccaccctg agcgcctggg tccaggggag gccttccagg gacgaagaag agccacagtg 467 agggagatcc catccccttg tctgaactgg agccatgggc acaaagggcc cagattaaag 527 tctttatcct c 538 <210> 4 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Pro Leu Lys et Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Gln His lie His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu 20 25 30 Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala lie Pro Leu Arg Lys Leu Lys 35 40 45 Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala lie Val Phe 50 55 60 Val Thr Val Gln Gly Arg Ala lie Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg 65 70 75 80 Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser 85 90 <210> 5 <211> 2923 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (20) ... (301) <223> secuencia de modificación para la quimiocina MDC <400> 5 gagacataca ggacagagc atg gct cgc cta cag act gca ctc ctg gtt gtc Met Ala Arg Leu Gln Thr Ala Leu Leu Val Val 1 5 10 ctc gtc ctc ctt gct gtg gcg ctt caá gca act gag gca ggc ccc tac 100 Leu Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Gln Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr 15 20 25 ggc gcc aac atg gaa gac age gtc tgc tgc cgt gat tac gtc cgt tac 148 Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr 30 35 40 cgt ctg ccc ctg cgc gtg gtg aaa cae ttc tac tgg acc tea gac tec 196 Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser 45 50 55 tgc ccg agg cct ggc gtg gtg ttg cta acc ttc agg gat aag gag ate 244 Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu lie 60 65 70 75 tgt gcc gat ccc aga gtg ccc tgg gtg aag atg att etc aat aag ctg 292 Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys et lie Leu Asn Lys Leu 80 85 90 age caá tga agagectact ctgatgaccg tggccttggc tcctccagga 341 Ser Gln * aggctcagga gccctacctc cctgccatta tagctgctcc ccgccagaag cctgtgccaa 401 ctctctgcat tccctgatct ccatccctgt ggctgtcacc cttggtcacc tccgtgctgt 461 cactgccatc tcccccctca cccctctaac ccatcctctg cctccctccc tgcagtcaga 521 gggtcctgtt cccatcagcg attcccctgc ttaaaccctt ccatgactcc ccactgccct 581 aagctgaggt cagtctccca agcctggcat gtggccctct ggatctgggt tccatctctg 641 tctccagcct gcccacttcc cttcatgaat gttgggttct agctccctgt tctccaaacc 701 catactacac atcccacttc tgggtctttg cctgggatgt tgctgacact cagaaagtcc 761 caccacctgc acatgtgtag ccccaccagc cctccaaggc attgctcgcc caageagetg 821 gtaattccat ttcatgtatt agatgtcccc tggccctctg tcccctctta ataaccctag 881 tcacagtctc cgcagattct tgggatttgg gggttttctc ccccacctct ccactagttg 941 gaccaaggtt tetagetaag ttactctagt ctccaagcct ctsgcataga gcactgcaga 1001 caggccctgg etcagaatca gageccagaa agtggctgca gacaaaatca ataaaactaa 1061 tgtccctccc ctctccctgc caaaaggcag ttacatatca atacagagac tcaaggtcac 1121 tagaaatggg ccagctgggt caatgtgaag ccccaaattt gcccagattc acctttcttc 1181 ccccactccc tttttttttt tttttttttt gagatggagt ttcgctcttg tcacccacgc 1241 tggagtgcaa tggtgtggtc ttggcttatt gaagcctctg cctcctgggt tcaagtgatt 1301 ctcttgcctc agcctcctga gtagctggga ttacaggttc ctcctaccac gcccagctaa 1361 tttttgtatt tttagtagag acgaggcttc accatgttgg ccaggctggt ctcgaactcc 1421 tgtcctcagg taatccgccc acctcagcct cccaaagtgc tgcgattaca ggcgtgagcc 1481 acagtgcctg gcctcttccc tctccccact gcccccccca actttttttt tttttttatg 1541 gcagggtctc actctgtcgc ccaggctgga gtgcagtggc gtgatctcgg ctcactacaa 1601 cctcgacctc ctgggttcaa gtgattctcc caccccagcc tcccaagtag ctgggattac 1661 aggtgtgtgc cactacggct ggctaatttt tgtattttta gtagagacag gtttcaccat 1721 attggccagg ctggtcttga actcctgacc tcaagtgatc caccttcctt gtgctcccaa 1781 agtgctgaga ttacaggcgt gagetatcae acccagcctc cccctttttt tectaatagg 1841 agactcctgt acctttcttc gttttaccta tgtgtcgtgt ctgettacat ttccttctcc 1901 cctcaggctt tttttgggtg gtcctccaac ctccaatacc caggcctggc etetteagag 1961 taccccccat tccactttcc ctgcctcctt ccttaaatag ctgacaatca aatteatget 2021 atggtgtgaa agactacett tgacttggta ttataagctg gagttatata tgtatttgaa 2081 aacagagtaa ataettaaga ggccaaatag atgaatggaa gaattttagg aactgtgaga 2141 gggggacaag gtgaagcttt cctggccctg ggaggaagct ggctgtggta gcgtagcgct 2201 ctctctctct gtctgtggca ggagccaaag agtagggtgt aattgagtga aggaatcctg 2261 ggtagagacc attctcaggt ggttgggcca ggctaaagac tgggagttgg gtetatetat 2321 gcctttctgg ctgatttttg tagagacggg gttttgccat gttacccagg ctggtctcaa 2381 actcctgggc tcaagcgatc ctcctggctc agcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt 2441 gaatcactgc gcctggcttc ctcttcctct tgagaaatat tcttttcata cagcaagtat 2501 gggacagcag tgtcccaggt aaaggacata aatgttacaa gtgtctggtc ctttctgagg 2561 gaggctggtg ccgctctgca gggtatttga acctgtggaa ttggaggagg ccatttcact 2621 ccctgaaccc agcctgacaa atcacagtga gaatgttcac cttataggct tgctgtgggg 2681 ctcaggttga aagtgtgggg agtgacactg cctaggcatc cagctcagtg tcatccaggg 2741 cctgtgtccc tcccgaaccc agggtcaacc tgcctgccac aggcactaga aggacgaatc 2801 -tgcctactgc ccatgaacgg ggccctcaag cgtcctggga tctccttctc cctcctgtcc 2861 tgtccttgcc cctcaggact gctggaaaat aaatccttta aaatagtaaa aaaaaaaaaa 2921 aa 2923 <210> 6 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Arg Leu Gln Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Val Ala Leu Gln Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu 20 25 30 Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg 35 40 45 Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly 50 55 60 Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Arg 65 70 75 80 Val Pro Trp Val Lys Met lie Leu Asn Lys Leu Ser Gln 85 90

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para modular el tráfico de las células T de memoria sistémica en un mamífero hospedero, comprendiendo el método: administrar una cantidad efectiva de un agente modulador de CCR4, en una dosis efectiva para modular el tráfico de células T de memoria sistémica.

2. El método de la reivindicación 1, en donde esta administración proporciona una concentración localizada prolongada del agente modulador de CCR4.

3. El método de la reivindicación 2, en donde las células T de memoria sistémica son CD4+.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las células T de memoria son CD8+.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las células T de memoria sistémica son CD45RA", e integrina 4ß7~.

6. El método de la reivindicación 5, en donde las células T de memoria sistémica se caracterizan además como CLA+.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la concentración localizada del agente modulador de CCR4 es cutánea .

8. El método de la reivindicación 1, en donde el agente modulador de CCR4 es un agonista de CCR4.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el agonista de CCR4 se selecciona a partir del grupo que consiste en TARC y MDC .

10. El método de la reivindicación 1, en donde el agente modulador de CCR4 es un antagonista de CCR4.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el antagonista de CCR4 es un anticuerpo.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

13. Un método para modular el tráfico de leucocitos de envío a la piel CCR4 + hacia el tejido cutáneo o hacia la piel, comprendiendo el método: administrar una cantidad efectiva de agente modulador de CCR4, en donde este agente modula la interacción entre CCR4 y un ligando.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde este leucocito es un linfocito.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde este linfocito es una célula T.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde esta célula T se caracteriza además como CD+.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde esta célula T se caracteriza además como CD45RA~, e integrina a4ß7~.

18. Un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria de la piel, comprendiendo el método: administrar a un paciente una cantidad efectiva de un antagonista de CCR4, en donde esta antagonista de CCR4 interfiere con la interacción entre CCR4 y un ligado.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde este ligando de CCR4 es TARC o MDC.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde este antagonista de CCR4 es un anticuerpo.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde este anticuerpo se enlaza con CCR4.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde este anticuerpo se enlaza con un ligando de CCR4.