MXPA01005749A

MXPA01005749A - Homologo zvegf3 del factor de crecimiento

Info

Publication number: MXPA01005749A
Application number: MXPA/A/2001/005749A
Authority: MX
Inventors: Paul O Sheppard; Zeren Gao; Christopher S Piddington; Charles E Hart; Kimberly E Shoemaker; Debra G Gilbertson; James W West
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 2001-06-07
Publication date: 2002-05-09

Abstract

La presente invención describe factores de crecimiento del polipéptido, métodos de su elaboración, polinucleótidos que los codifican, anticuerpos a estos y métodos para usarlos. Los polipéptidos comprenden un segmento de aminoácido que es al menos 90%idéntico a los residuos 46-163 de la SEC ID NO:2 o residuos 235-345 de la SEC ID NO:2. También se describen multímeros de los polipéptidos. Los polipéptidos, las proteínas multiméricas, y polinucleótidos pueden ser usados en el estudio y regulación del desarrollo de células y tejidos, como componentes de medios de cultivos de células y como agentes de diagnóstico.

Description

HOMOLOGO ZVEGF3 DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En animales multicelulares, el crecimiento, -diferenciación y migración celular son controlados por los factores de crecimiento de polipéptidos. Estos factores de crecimiento juegan un papel en tanto el desarrollo normal como la patogénesis, incluyendo el desarrollo de tumores sólidos. Los factores de crecimiento de polipéptidos, influencian los eventos celulares por el enlace a los receptores de la superficie celular, muchos de los cuales - son tirosinas cinasas. El enlace inicia una cadena de eventos de señalización dentro de la célula, los cuales finalmente resultan en los cambios fenotípicos tales como la división celular, producción de proteasas y migración celular . Los factores de crecimiento se pueden clasificar en familias con base a las similitudes estructurales. Una de tales familias, la familia PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), está caracterizada por una estructura dimérica estabilizada por enlaces disulfuro. La familia incluye PDGF, los REF: 129859 factores de crecimiento placentales (PIGFs), y factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGFs). Las cadenas de polipéptidos individuales de estas proteínas, forman estructuras de orden superior características, que tienen una configuración similar a una unión curvada, alrededor de un nudo de cisteína, formado por el enlace disulfuro entre los pares de residuos de cisteína. Las interacciones hidrófobas entre los lazos o bucles, contribuye a la dimerización de los dos monómeros. Veáse Daopin et al., Sci en ce 257:369, 1992; Lapthorn et al., Na ture 369 : 455, 1994. Los miembros de esta familia son activos tanto homodímeros como heterodímeros. Véase por ejemplo, Heldin et al., EMBO J. 7_: 1387-1393 ' 1988; Cao et al., J Biol . Chem . 271: 3154-3162, 1996. La porción de nudo de cisteína y el pliegue de unión curvada son también características de los factores de crecimiento que transforman el factor de crecimiento beta (TGF-ß) y el factor de crecimiento del nervio (NGF) , y las hormonas de glicoproteínas. Aunque sus secuencias de aminoácidos son completamente divergentes, estas proteínas todas contienen los seis residuos de cisteína conservados del nudo de cisteína. Se han identificado cuatro factores de crecimiento endotelial vascular: VEGF, también conocidos como factor de permeabilidad vascular (Dvorak et al., Am. J. Pa thol . 146: 1029-1039, 1995); VEGF-B (Olofsson et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 93:2567-2581, 1996; Hay ard et al., Publicación WIPO WO 96/27007); VEGF-C (Joukov et al., EMBO J. 15:290-298, 1996); y VEGF-D (Oliviero, WO 97/12972; Achen et al., WO 98/07832). Cinco polipéptidos VEGF (121, 145, 165, 189, y 206 aminoácidos) surgen a partir de la unión alternativa del ARNm de VEGF. Los VEGFs estimulan el desarrollo de la vasculatura a través de un proceso conocido como angiogénesis, en donde las células endoteliales vasculares re-entran en el ciclo celular, degradan la membrana de basamento fundamental, y migran para formar nuevos brotes capilares. Estas células después se diferencian y se forman los bazos maduros. Este proceso de crecimiento y diferenciación está regulado por un balance de los factores pro-angiogénicos y antiangiogénicos. La angiogénesis es la formación central a normal y reparación del tejido, que ocurre en el desarrollo embrionario y en la sanación de heridas. La angiogénesis es también un factor en el desarrollo de ciertos padecimientos, incluyendo tumores sólidos, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular y arterosclerosis . Se han identificado un número de proteínas a partir de vertebrados e invertebrados por influenciar el desarrollo neural. Entre estas moléculas, son miembros de la familia de neuropilina y la familia semaforina/colapsina . Los tumores de células neuronales, conocidos como protuberancias, crecen lejos del cuerpo celular para formar conexiones sinápticas. Las protuberancias delgadas, largas, que llevan información lejos del cuerpo celular, son llamadas axones, y las protuberancias más gruesas, cortas, las cuales llevan información a y del cuerpo celular, son llamadas dendritas. Los axones y las dendritas son colectivamente referidas como neuritas. Las neuritas se extienden por medio de conos de crecimiento, las puntas o extremos de crecimiento de las neuritas, las cuales son altamente móviles y son finalmente responsables del incremento y extensión de la red neuronal en el cuerpo. Se han identificado tres receptores VEGF: KDR/Flk-1 (Matthews et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 88: 9026-9030, 1991), Flt-1 (de Vries et al., Science 255: 989-991, 1992), y neuropilina-1 (Soker et al., Cel l 92^:735-745, 1998),. La neuropilina-1 es una glicoproteína de la superficie celular que se identificó inicialmente en el tejido nervioso de Xenopus de renacuajo, después en pollitos, ratones y humanos. La estructura primaria de neuropilina-1 está altamente conservada entre estas especies de vertebrados. La neuropilina-1 se ha demostrado como un receptor para varios miembros de la familia de semaforina, incluyendo la semaforina III (Kolodkin et al., Cell 90: 753-762, 1997), Sema E y Sema IV (Chen et al., Neuron 19:547-559, 1997). Se han asociado una variedad de actividades con el enlace de la neuropilina-1 a sus ligandos. Por ejemplo, el enlace de la semaforina III a la neuropilina-1 puede inducir el colapso del cono de crecimiento neuronal y la repulsiónl de las neuritas ín vi tro (Kitsukawa et al., Neuron 19 : 995-1005, 1997) . En ratones, la neuropilina-1 se expresa en el sistema cardiovascular, sistema nervioso, y limbos en estados de desarrollo particulares. Los ratones quiméricos que sobre expresan la neuropilina-1 , se| encuentran como embriónicos letales (Kitsukawa et al., Devel opmen t 121: 309-4318, 1995). Los embriones quiméricos presentan anormalidades morfológicas severas, incluyendo excesos capilares y bazos sanguíneos, dilatación de los bazos sanguíneos, corazones malformados, brotes ectópicos y desfasciculación de las fibras nerviosas, y dedos extra o adicionales. Todas estas anormalidades ocurren en los órganos en los cuales se expresa la neuropilina-1 en el desarrollo normal. Los ratones carentes del gen neuropilina-1 tienen anormalidades cardiovasculares severas, incluyendo deterioro de la formación de la red vascular en los sistemas nerviosos centrales y periféricos (Takashima et al., American Heart Association 1998 Meeting, Abstract #3178) . Se ha identificado la Neuropilina-1 como un receptor de la superficie celular para VEGF (Soker et al., ibid. ) , y presenta actividad de enlace selectiva para VEGF165 sobre VEGF?2?. Se ha mostrado por estar expresada en las células endoteliales vasculares y células tumorales in vi tro . Cuando la neuropilina-1 es co-expresada en las células con KDR, la neuropilina-1 incrementa el enlace del VEGF165 KDR y VEGF165, mediada por la quimotaxis. Contrariamente, la inhibición del enlace VEGF165 a la neuropilina-1 , inhibe su enlace a KDR y su actividad mitogénica para las células endoteliales (Soker, et al., ibid. ) . La neuropilina-1 también es un receptor para PIGF-2 (Migdal et al., J. Bi ol . Chem . 273 : 22272-22278, 1998). Un segundo receptor de la semaforina, la neuropilina-2 , presenta homología con la neurofilina-1, pero ha diferido en la especificidad del enlace (Chen et al. Neuron 19:5 7-559, 1997). Las se aforinas son una gran familia de moléculas, las cuales portan la definición del dominio de semaforina de aproximadamente 500 aminoácidos. Esta familia puede ser subdividida en subfamilias múltiples que contienen tanto proteínas secretadas como enlazadas a las membranas. Los elementos seleccionados de estas-subfamilias, clase III (SemD) y clase IV (SemD), forman homodímeros ligados por los puentes disulfuro. En el caso de SemD, hay un procesamiento proteolítico adicional que crea una isoforma 65-kDa que carece de la secuencia carboxi-terminal de 33 kDa. La dimerización se cree es importante para la actividad funcional (Klostermann et al., J. Bi ol . Chem . 273: 7326-7331, 1998). La colapsina-1, el primer miembro vertebrado identificado de la familia de semaforina de las proteínas guías de axones, también ha mostrado formar dímeros covalentes, con la dimerización necesaria para colapsar la actividad (Koppel et al., J. Biol . Chem . 273: 15708-15713, 1998). La semaforina III se ha asociado in vi tro con la regulación del clon de crecimiento y la quimorepulsión de las neuritas. También se ha mostrado in vivo por ser requerida para la inervación aferente sensoria correcta y otros aspectos del desarrollo, incluyendo defectos esqueléticos y cardiacos (Fehar et al., Na ture 383:525-' 528, 1996). Otros miembros de la familia de la semaforina han mostrado estar asociados con otras formas de biología. El gen de la semaforina E humana se expresa en las células sinoviales reumatoides y se piensa, juega un papel inmunosupresivo en la inhibición de las citocinas (Mangasser-Stephan et al., Biochem . Biophys . Res . Comm . 234: 153-156, 1997). El DC100, una semaforina del leucocito, promueve la agregación y diferenciación de las células B (Hall et al., Proc. Na tl . Acad . Sci . USA 93: 11780-11785, 1996) . El DC100 también ha mostrado estar expresado en muchos linfomas de las células T, y puede ser un marcador del neoplasma de las células T malignas (Dorfman et al.,, Am . J. Pa thol . 153: 255-262, 1998). LoA homólogos de semaforina también se han identificado en los virus del ADN (Lang, Genomi cs 5_1: 340-350, 1998) y en poxvirus (Comeau, et al., Immunity 8_: 473-482, 1998). La transcripción del gen de semaforina de ratón, M-semaH, se correlaciona con la habilidad metastática de las líneas celulares del tumor de ratón (Christensen et al., Cán cer Res . 58_:1238-1244, 1998). El papel de los factores de crecimiento, otras moléculas reguladoras, y sus receptores en el control de los procesos celulares, los hace del mismo modo, candidatos y objetivos para la intervención terapéutica. El factor de crecimiento derivado de las plaquetas por ejemplo, se ha descrito para el tratamiento de padecimientos periodontales (Patente Estadounidense No. 5,124,316), úlceras gastrointestinales (Patente Estadounidense No. 5,234,908) y úlceras dérmicas (Robson et al., Lancet 339:23-25, 1992; Steed et al., J. Vascf Surg . 2171-81, 1995) . Se ha mostrado que la inhibición de la actividad del receptor PDGF reduce la hiperplasia íntima en arterias de babuinos dañadas (Giese et al., Restenosis Summit VII, Poster Session #23, 1996; Patente Estadounidense No. 5,620,687). Los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGFs), han mostrada promover el crecimiento de los bazos sanguíneos en limbos isquémicos (Isner et al., The Lancet 348 : 370-374, 1996), y se han propuesto para usarse como agentes sanadores de heridas, para el tratamiento de padecimientos periodontales, para promover la endotelialización en la cirugía de injerto vascular, y para promover la circulación colateral seguida al infarto al miocardio (Publicación WIPO No. WO 95/24473; Patente Estadounidense No. 5,219,739), los VEGFs son también empleados para promover el crecimiento de las células endoteliales vasculares en el cultivo. Se ha encontrado un receptor VEGF soluble (flt-1 soluble), que bloquea el enlace del VEGF a los receptores de la superficie celular e inhibe el crecimiento del tejido vascular in vitro ( Bi otechnol ogy News 16(17) :5-6, 1996). En vista de la utilidad clínica provista de hormonas, existe una necesidad en la técnica para tales moléculas adicionales para usarse como agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico, y herramientas de investigación y reactivos. Estas y otras necesidades se dirigen por la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un polipéptido aislado de al menos 15 residuos de aminoácidos que comprenden una porción que porta un epitope de una proteína de la SEC ID NO: 2. Dentro de ciertas modalidades, el polipéptido comprende un segmento que es 90% idéntico a los residuos 46-163 de la SEC ID NO:2 o residuos 235-345 de la SEC ID NO:2. Dentro de modalidades adicionales, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de residuos 15-163 de la SEC ID NO: 2, residuos 46-163 de la SEC ID NO:2, residuos 15-170 de la SEC ID NO:2, residuos 46-170 de la SEC ID NO:2, residuos 15-234 de la SEC ID NO:2, residuos 46-234 de la SEC ID NO:2, residuos amida 15-229 de la SEC ID NO:2, residuos -230 de la SEC ID NO:2, residuos 15-345 de la SEC ID NO:2, residuos 46-345 de la SEC ID NO:2, residuos 235-345 de la SEC ID NO:2, y residuos 226-345 de la SEC ID NO:2. La invención también proporciona un polipéptido, aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula Rlx-R2y-R3z, en donde Rl comprende un polipéptido de 100 a 120 residuos de longitud, que son al menos, 90% idénticos a los residuos 46-163 de la SEC ID NO:2, y comprende una porción de secuencia C[KR] Y[DNE] [WYF] {11, 15}G[KR] [WYF]C (SEC ID NO:4), que^ corresponde- a los residuos 104-124 de la SEC ID NO:2; R2 es un polipéptido de al menos, 90% idéntico a los residuos 164-234 de la SEC ID NO:2, R3 es un polipéptido de al menos, 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a los residuos 235-345 de la SEC ID NO:2 y comprende residuos de cisteína a las posiciones que corresponden a los residuos 250, 280, 284, 296, 335 y 337 de la SEC ID NO:2, un residuo de glicina a la posición correspondiente al residuo 282 de la SEC ID NO:2, y una porción de secuencia CX { 18 , 33 } CXGXCX{ 6, 33 } CX { 20 , 0 } CXC (SEC ID NO: 3), que corresponde a los residuos 250-337 de la SEC ID NO: 2, cada uno de x, y e z son individualmente 0 ó 1, sujetos a las limitaciones que al menos uno de z y z sea 1, y si x y z son cada uno 1, entonces y es 1. Además, se proporcionan polipéptidos aislados de la fórmula anterior, en donde (a) x=l, (b) z=l, y (c) x=l y z=l . Dentro de ciertas modalidades, x=l y Rl es al menos, 90% idéntico a los residuos 18-163 de la SEC ID NO:2. Dentro de las modalidades relacionadas, x=l y Rl comprende residuos 46-163 de la SEC ID NO:2. Dentro de otras modalidades, z=l y R3 comprenden residuos 235-345 de la SEC ID NO: 2. Dentro de modalidades adicionales, x=l, z=l, y el polipéptido comprende residuos 46-229 de la SEC ID NO:2, residuos 164-345 de la SEC ID NO:2, o residuos 46-345 de la SEC ID NO:2. El polipéptido aislado puede además, comprender residuos de cisteína a las posiciones correspondientes a los residuos 286, 287, 291 y 294 de la SEC ID NO: 2. Dentro de otras modalidades, el polipéptido aislado además comprende un extremo de afinidad. Dentro de una modalidad relacionada, el polipéptido aislado comprende un dominio constante de inmunoglobulina . La presente invención también proporciona una proteína aislada que comprende un primer polipéptido aislado operablemente ligado a un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula Rlx-R2y-R3z como se describe anteriormente. La proteína modula la proliferación, diferenciación, metabolismo o migración celular. Dentro de una modalidad, la proteína es un heterodímero. Dentro¡ de modalidades relacionadas, el segundo polipéptido se selecciona del grupo que consiste de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, zvegf4, PIGF, PDGF-A y PDGF-B. Dentro de otra modalidad, la proteína es un homodímero. También se proporciona una proteína aislada producida por un método que comprende las etapas de (a) cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operablemente ligados: un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifica a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de (i) residuos 46-345 de la SEC ID N0:2, (ii) residuos 46-234 de la SEC ID N0:2, (iii) residuos 164-345 de la SEC ID N0:2, y (iv) residuos 235-345 de la SEC ID N0:2; y un terminador de la transcripción, bajo condiciones en donde el segmento de ADN es expresado; y (b) recuperar de la célula el producto de la proteína de expresión del constructo de ADN. Dentro de otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado de hasta aproximadamente 4 kb de longitud, en donde dicho polinucleótido codifica a un polipéptido como se describe anteriormente. Dentro de una modalidad de la invención,, el polinucleótido es ADN. Dentro de un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operablemente ligados: (a) un promotor de la transcripción; (b) un polinucleótido de ADN como se discute anteriormente; y (c) un terminador de* la transcripción. El vector puede además, comprender una secuencia de señal secretoria operablemente ligada al polinucleótido de ADN.

También proporcionada por la invención está una célula cultivada dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión como se discute anteriormente, en donde la célula expresa al polipéptido codificado por el fragmento de ADN. La célula cultivada puede ser usada con un método para producir un polipéptido, el método comprende cultivar la célula y recuperar al polipéptido expresado . Las proteínas proporcionadas aquí, pueden ser combinadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable para proporcionar una composición farmacéutica. La invención también proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a un epítope de un polipéptido como se describe anteriormente. Los, anticuerpos de la invención incluyen inter alia , anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadenas únicas, y pueden ligarse a una molécula reportera. La invención además proporciona un método para detectar una anormalidad genética en un paciente, que comprende las etapas de (a) obtener una muestra genéticaj^ de un paciente, (b) incubar la muestra genética con un polinucleótido que comprende al menos, 14 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO : 1 o el complemento de la SEC ID N0:1, bajo condiciones en donde dicho polinucleótido hibridizará a una secuencia de polinucleótidos complementaria, para producir un primer producto de reacción, y (c) comparar el primer producto de reacción con un producto de reacción de control, en donde una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control es indicativa de una anormalidad genética en el paciente. Dentro de un aspecto adicional, la invención proporciona un método para estimular el crecimiento de los fibroblastos o células del músculo suave que comprende, aplicar a las células una cantidad efectiva de una proteína como se describe anteriormente. Dentro de otro aspecto, la invención proporciona métodos para la modulación del crecimiento celular u otras protuberancias celulares. Dentro de una modalidad, se proporciona un método para estimular el crecimiento de los fibroblastos o células del músculo suave, que comprende aplicar a las células una cantidad efectiva de una proteína como se describe anteriormente. Dentro de otra modalidad, se proporciona un método de activación de un receptor alfa 'PDGF de la superficie celular, que comprende la exposición de una célula que comprende un receptor alfa PDGF de la superficie celular a un polipéptido o proteína como se discute anteriormente, con ello, el polipéptido o proteína se enlaza a y activa al receptor. Dentro de una modalidad adicional, se proporciona un método para inhibir un proceso celular mediado por el receptor alfa PDGF, que comprende exponer una célula que comprende un receptor' alfa PDGF a la superficie celular, a un compuesto que inhibe el enlace de un polipéptido o proteína como se describe arriba para el receptor. Dentro de un método adicional de la invención, se proporciona un método para inhibir la actividad zvegf3 en un mamífero que comprende administrar al mamífero de una cantidad efectiva de un antagonista zvegf3. Dentro ciertas modalidades, el antagonista es un anticuerpo, un receptor, un fragmento del receptor de enlace al ligando, o un receptor de la proteína de fusión IgG-Fc. Dentro de otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido antisentido, aislado, que es el complemento de un polinucleótido que codifica a uA polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula Rlx-R2y-R3z, en donde Rl comprende un polipéptido de 100 a 120 residuos de longitud que son al menos, 90% idénticos a los residuos 46-163 de la SEC ID NO: 2, y comprenden una porción de secuencia C[KR] Y[DNE] [WYF]XU1, 15}G[KR] [WYF]C (SEC ID NO:4) que corresponde a los residuos 104-124 de la SEC ID NO:2; R2 es un polipéptido al menos, 90% idéntico a los residuos 164-234 de la SEC ID NO:2; R3 es un polipéptido al menos, 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a los residuos ^ 235-345 de la SEC ID NO:2 y comprende los residuos a las posiciones correspondientes a los residuos 250, 280, 284, 296, 335 y 337 de la SEC ID NO:2, un residuo de glicina a una posición correspondiente al residuo 282 de la SEC ID NO : 2 , y una porción de secuencia CX{18, 33}CXGXCX{6, 33}CX{20, 40}CXC (SEC ID NO:3), que corresponden a los residuos 250-337 de la SEC ID NO:2; y? cada uno de x, y y z, son individualmente 0 o 1, sujeto a las limitaciones de que al menos, uno de x y z es 1, si x y z son cada uno 1, después y es 1. Dentro de una modalidad, el polinucleótido antisentido además comprende un promotor de la transcripción operablemente ligado y secuencias terminadoras. El polinucleótido antisentid?| puede ser usado dentro de un método para inhibir la producción de zvegf3 en una célula que comprende administrar a la célula el polinucleótido antisentido.

Estos y otros aspectos de la invención llegarán a ser evidentes después de la referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y de los dibujos adjuntos. En los dibujos: La Figura 1 es un perfil de hidrofilicidad Hopp/Woods de la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID N0:2. El perfil se basa en una ventana de seis residuos unidos. Los residuos G, S, y T enmascarados y los residuos H, Y y W expuestos, se ignoraron. Estos residuos se indican en la figura por letras minúsculas. La Figura 2 es una ilustración del vector pHB12-8 para usarse en la expresión de los ADNcs en animales transgénicos. La Figura 3 es una ilustración del pZMP6/zvegf3. La Figura 4 es una lustración del vector pZMPll/zv3GF-otPA. La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de enlace al receptor para zvegf3. La Figura 6 es una alineación de las secuencias de aminoácidos humanas (SEC ID NO: 2) y de ratón (SEC ID NO: 43) .

El término "etiqueta de afinidad" es usado aquí para denotar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar purificación o detección del segundo polipéptido, o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un substrato. En principio, cualquier polipéptido o proteína por la cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico está disponible, puede ser usado como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferasa S de glutationa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), proteína de enlace a la maltosa (Kellerman y Ferenci, Methods Enzymol . 90 : 45 —j 463, 1982; Guan et al., Gene 67:21-30, 1987), etiqueta de afinidad Glu-Glu, ( Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985; véase SEC ID N0:5), substancia P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), péptido de enlace a la estreptavidina, tiredoxina, ubiquitina, proteína de enlace a la celulosa, polimerasaj T7, u otro epitope antigénico u dominio de enlace. Véase en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Las etiquetas de afinidad que codifican a los ADNs, están disponibles a partir de proveedores comerciales (por ejemplo Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . New England Biolabs, Beverly, MA; y Eastman Kodak, New Haven, CT) . El término "variante alélica" es usado aquí para denotar cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa los mismos locus o^ sitios cromosomales. La variación alélica se alcanza naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones del gen pueden ser silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácido alteradas. El término variante alélica. es también usado aquí para denotar unA proteína codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxil-terminal" son usados aquí para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos término son usados con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denota^^ proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia carboxil-terminal colocada a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está localizada próxima al término carboxilo de la secuencia de referencia, pero rio está necesariamente en el término carboxilo del polipéptido completo. Una "región similar a la hebra beta", es una región de una proteína caracterizada por ciertas combinaciones de los ángulos phi (f) y psi (?) dihédricos del esqueleto del polipéptido. Las regiones en donde f es menor que -60° y ? es mayor que 90°, son similares a las hebras beta. Aquellos expertos en la técnica, reconocerán que los límites de una ß-hebra, son algunas veces imprecisos y pueden variar con el criterio usado para definirlos. Véase por ejemplo, Richardson y Richardson en Fasman, ed., Prediction of Protein Structure and the Principies of Protein Conformation, Plenum Press, New York, 1989; y Lesk, Protein Architecture: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1991. Un "complemento" de una molécula de polinucleótido, es una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia base complementaria y orientación inversa comparada con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ejemplo, ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' .

"Correspondiente a", cuando se usa con referencia a un nucleótido o secuencia de aminoácido, indica la posición en una segunda secuencia que se alinea con la posición de referencia cuando las dos secuencias están óptimamente alineadas. El término "secuencia de nucleótido degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (como los comparados a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica a un polipéptido) . Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican al mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifican a Asp) . El término "vector de expresión" es usado paraß^ denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica a un polipéptido de interés operablemente ligado a segmentos adicionales que se proporcionan para su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y pueden también incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un incrementador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión se derivan de manera general, del plasmido o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos . El término "aislado" cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido se ha removido de su medio genético natural y está además, libre de otras secuencias codificantes no deseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para usarse con sistemas de producción de la proteína diseñadas genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que están separadas de su ambiente natural e incluyen clones genómicos y ADNc. Las moléculas ADN aisladas de la presente invención, están libres de otros genes con los cuales están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se originanj naturalmente, tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para un ordinario experto en la técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Na t ure 316: 774-78, 1985). Un polipéptido o proteína "aislada" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condici? diferente de su ambiente nativo, tal como aparte de la sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos o proteínas de origen animal. Se pueden proporcionar los polipéptidos y proteínas en una forma altamente purificada, es decir, mayores del 95% puro, más preferiblemente mayores del 99% puro. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido o proteína en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas . Una "porción" es una serie de posiciones de aminoácidos en una secuencia de proteína, para la cual ciertos residuos de aminoácidos se requieren. Una porción define la serie de residuos posibles a cada posición. El término "operablemente ligado", indica ua^ dos o más entidades están unidas juntas de tal forma que funcionan de acorde a sus propósitos propuestos. Cuando se refieren a segmentos de ADN, la frase indica, por ejemplo, que las secuencias codificantes están unidas en la estructura lectora correcta, e inician la transcripción en el promotor y proceden a través deJ^ segmento o segmentos de codificación al terminador. Cuando se refiere a polipéptidos, "operablemente ligados" incluye tanto secuencias ligadas covalentemente (por ejemplo, por enlaces disulfuro) y no covalentemente (por ejemplo, por enlaces hidrógeno, interacciones hidrófobas, o interacciones de puentes de sal), en donde son retenidas la función o funciones de las secuencias deseadas. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenida a partir de unas especies que son la ^r contraparte funcional de un polipéptido o proteína de unas especies diferentes. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la evolución de las especies. Un "proceso celular mediado por el receptor alfa PDGF", es un proceso celular que ocurre en respuesta a la activación de un receptor alfa PDGF. Tal proceso ^ incluye, sin limitación, la división celular, quimiotaxis, diferenciación celular, y producción y liberación de macromoléculas. Un "polinucleótido" es un polímero de hebra sencilla o doble de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leídas a partir del extremo 5' y 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, sintetizados in vi tro, o preparados a partir de una combinación de moléculas sintéticas o naturales. Los tamaños de polinucleótidos están expresados como pares base (abreviados "bp") , nucelótidos ("nt"), o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permite, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de hebra sencilla o doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para denotar la longitud completa y se entenderán como equivalentes al término "pares base". Se reconocerá por aquellos expertos en la técnica, que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en la longitud y que los extremos del mismo pueden ser escalonados como un resultado de la escisión o desdoblamiento enzimático; así, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra no pueden ser apareados. Tales extremos no apareados en general, no excederán de 20 nt en longitud. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, de algún modo producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente referidos como "péptidos". El término "promotor" es usado aquí por su significado reconocido en la técnica para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que se proporcionan para el enlace de la polimerasa de ARN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente pero no siempre, encontradas en las regiones no codificantes 5' de los genes. Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidratos. Los carbohidratos y otros substituyentes no-peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual la proteína se produce, y variará con el tipo de célula. Las proteínas están definidas aquí en términos de sus estructuras de esqueletos de aminoácidos; los substituyentes tales comol los grupos carbohidratos no están especificados de manera general, pero sin embargo pueden estar presentes. El término "secuencia de señal secretoria" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (una "secuencia secretoria") que, como un componente de un polipép.tido más largo, dirige el polipéptido más largG^k a través de una trayectoria secretoria de una célula en la cual es sintetizada. El polipéptido más largo es comúnmente escindido para remover el péptido secretorio durante el tránsito a través de la trayectoria secretoria . Un "segmento" es una porción de una molécula más grande (por ejemplo, polinucleótido o polipéptido) que tienen atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica a un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plasmido o fragmento de plasmido, que cuando se lee de la dirección 5' a 3' , codifica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado. Los pesos y longitudes moleculares de los polímeros determinados por los métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel), se entenderán como valores aproximados. Cuando tal valor es^ expresado como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, el valor declarado de X se entenderá ser exacto a 20%. Todas las referencias citadas aquí están incorporadas por referencia en su totalidad. La presente invención se basa en parte, en el descubrimiento de una molécula de ADN nueva que codific^ a un polipéptido que comprende un dominio del factor de crecimiento y un dominio CUB. El dominio del factor de crecimiento se caracteriza por un arreglo de los residuos de cisteína y las hebras beta que son características de la estructura de "nudo de cisteína" de la familia PDGF. El dominio CUB muestra homología de secuencias a los dominios CUB en las neuropilinas (Takagai et al., Neuron 2:295~307' 1991; Soker et al., ibid . ) , de la proteína 1 morfogenética ósea humana (Wozney et al., Science 242 : 1528-1534, 1988), proteína del plasma seminal porcino, y proteína del fluido seminal acídico bovino (Romero et al., Nat. Struc. Bi ol . _4:783-788, 1997), y proteína similar al toloide de X. Lavéi s (Lin et al., Dev, Growth Differ . 3_9:43-51, 1997). El análisis de la distribución del tejido del ARNm que corresponde a este ADN nuevo, mostró que la expresión se distribuyó en el tejido de adulto humano, y que la expresión ocurrió hasta^k el día 15 en el embrión de ratón. Se ha diseñado el polipéptido "zvegf3" en vista de su homología al VEGFs en el dominio del factor de crecimiento. Las predicciones estructurales basadas en la secuencia zvegf3 y su homología a otros factores de crecimiento, sugieren que el polipéptido pueda forma; homomultímeros o heteromultímeros que actúan en los tejidos para el control del desarrollo del órgano mediante la modulación de la proliferación, migración, diferenciación o metabolismo celular. Los heteromultímeros Zvegf3 pueden comprender un polipéptido a partir de otro miembro de la familia de proteínas PDGF/VEGF, incluyendo VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, Zvegf4 (SEC ID Nos: 36 y 37), PIGF (Maglione et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 88_: 9267-9271, 1991), PDGF-A (Murray et al., Patente Estadounidense No. 4,899,919; Heldin et al., Patente Estadounidense No. 5,219,759), o PDGF-B (Chiu et al., Cel l 37_:123-129, 1984; Jonson et al., EMBO J3921-928, 1984). Los miembros de la familia de polipéptidos regulan el desarrollo y regeneración del órgano, crecimiento del órgano posterior del desarrollo,, y mantenimiento del órgano, así también como procedimientos de reparación y mantenimiento del tejidoi^ Estos factores están también involucrados en los procesos patológicos, en donde se requieran los tratamientos terapéuticos, incluyendo cáncer, artritis reumatoide, retinopatía diabética, padecimientos del limbo isquémicos, padecimientos vasculares periféricos, isquemia miocardial, hiperplasia íntima vascularj arterosclerosis y formación de hemangioma. Para tratar estas condiciones patológicas, se requerirá a menudo, desarrollar compuestos para antagonizar a los miembros de la familia de proteínas PDGF/VEGF, o sus receptores respectivos. Estos pueden incluir el desarrollo de anticuerpos neutralizantes, antagonistas de moléculas pequeñas, formas modificadas de los factores de crecimiento que mantienen la actividad de enlace del receptor, pero carecen de la actividad de activación del receptor, receptores solubles, o moléculas antisentido o ribozimas, para bloquear la producción del péptido. La SEC ID NO: 2 es la secuencia de un polipéptido representativo de la presente invención. El análisis de la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 2 indica que los residuos 1 a 14 forman un péptido secretorio. El dominio CUB se extiende del residuo 46 al residuo 163. Una secuencia similar al propéptido sel extiende del residuo 164 al residuo 234, e incluye dos sitios de desdoblamiento potencial a su término carboxilo, un sitio dibásico a los residuos 231-232 y un sitio objetivo para furina o una proteasa similar a la furina a los residuos 231-234. El dominio del factor de crecimiento se extiende del residuo 235 al residuo 345 Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los límites del dominio son algunas veces imprecisos y puede esperarse que varíen por hasta + 5 residuos a partir de las posiciones especificadas. Los sitios de escisión o desdoblamientos proteolíticos potenciales ocurren en los residuos 232 y 234. El procesamiento de Zvegf3 recombinante producido en las células BHK se ha encontrado que ocurre entre los residuos 225 y 226. La escisión o desdoblamiento peptídico de señal se predice ocurre después del residuo 14 (residuo +_3) . Este análisis' sugiere que la cadena de polipéptido Zvegf3 se pueda escindir para producir una pluralidad de especies monoméricas como se muestra en la Tabla 1. La escisión después de Arg-234 se espera resulte en la remoción subsecuente de los residuos 231-234, con la posible conversión de Gly-230 a una amida. El desdoblamiento después de Lys-232 se espera resulte en la remoció| subsecuente del residuo 231, nuevamente con la posible conversión de Gly-230 a una amida. Además, puede ser ventajoso incluir hasta siete residuos de la región interdominante al término carboxilo del dominio CUB. La región interdominio puede truncarse a su término amino por una cantidad similar. Véase Tabla 1.

Tabla 1 Monómero Residuos (SEC ID NO:2) Dominio Cub 15-163 46-163 15-170 46-170 Dominio Cub + región interdominio 15-234 46-234 amida 15-229 15-230 Dominio Cub + región interdominio + factor de crecimiento 15-345 46-345 Dominio del factor de crecimiento 235-345 226-345 Dominio del factor de crecimiento + región interdominio 164-345 171-345 También incluidos dentro de la presente invención, están los polipéptidos que son al menos, 90% idénticos o al menos 95% idénticos a los polipéptidos descritos en la Tabla 1, en donde estos polipéptidos adicionales retienen ciertas porciones de secuencia características como se describe abajo. Los polipéptidos Zvegf3 son diseñados aquí con un subíndice que indica los residuos de aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos del dominio CUB descritos en la Tabla 1 están designados como "Zvegf3?5-?63", Zvegf346-i63", "Zvegf3i5-?70", y "Zvegf346-?70" . La estructura de orden superior de los polipéptidos Zvegf3 se pueden predecir por la alineación de secuencia con homólogos conocidos y análisis de computadoras, usando software disponible (por ejemplo, el revisor Insight II ® y las herramientas de modelación de homología; MSI, San Diego, CA) . El análisis de la SEC IC( NO: 2 predice que la estructura secundaria de los dominios del factor de crecimiento son dominados por el nudo cisteína, los cuales anudan regiones variables similares a la hebra beta y las lazan en una estructura similar a la unión de un arco. La alineación de secuencia indica que los residuos Cys dentro del dominio del factor crecimiento a las posiciones 250, 280, 284, 296, 335 y 337, y Gly 282 están altamente conservadas dentro de la familia. El análisis adicional sugiere el apareamiento (formación de enlaces disulfuro) de los residuos Cys 250 y 296, 280 y 335, 284 y 337 para formar el nudo cisteína. Este arreglo de residuos conservados puede ser representado por la fórmula CX{18,33}CXGXCX{6,33}CX20,40}CXC (SEC ID NO : 3 ) , en donde los residuos de amino ácidos están representados por el código de una letra convencional, X es cualquier residuo de aminoácido, y {y,z} indica una región de residuos variables (X) de residuos y a z en longitud. Se forma una estructura de unión de arco consenso como: termino amino al nudo cisteína —» región 1 similar a la hebra beta —» lazo 1 variable—> región 2 similar a la hebra beta—» nudo cisteína—» región 3 similar a la hebra 3—» lazo variable 2—» región 4 similar a la hebra beta-» nudo cisteína-región 5 similar a la hebra beta— lazo variable 3—» región 6 similar a la hebra beta-» nudo cisteína. Los lazos variables 1 y 2 forman una cara de la unión de arco, con el lazo variable 3 formando el otro lado. La estructura del dominio del factor de crecimiento Zvegf3 parece divergir de la estructura consenso de otros miembros de la familia en los lazos 2 y las regiones 3 y 4 similares a la hebra beta, en donde todas están abreviadas y esencialmente reemplazadas por una casilla de cisteína que comprende residuos 285 (Ala) hasta 295 (Gln) , los cuales incluyen los residuos de Cys a las posiciones 286,287, 291, y 294 de la SEC ID N0:2. Los límites aproximados de las regiones similares a la hebra de beta en la SEC ID NO: 2. son: región 1, residuos 251-259; región 2, residuos 275-279; región 5, residuos 297-301; región 6, residuos 329-334. Los lazos separan las regiones 1 y 2, y las regiones 5 y 6. El dominio CUB de Zvegf3 se cree forma una estructura de barrera beta con nueve distintas regiones similares a la hebra beta. Estas regiones comprenden los residuos 48-51, 55-59, 72-78, 85-90, 92-94, 197-112, 119-123, 139-146, y 156-163 de la SEC ID NO:2. Una alineación múltiple de los dominios CUB del precursor de neuropilina Xenopus la evi s (Takagi et al., ibid . ) , BMP-1 humano (Wozney et al., ibid.), y proteína similar al toloide de X. La véis (Lin et al., ibid . ) , indica la presencia de una porción conservada correspondiente a los residuos 104-124 de la SEC ID NO:2. Esta porción está representada por 1^ fórmula C [KR] Y [DNE] [WYF] X{ 11, 15 } G [KR] WYF] C (SEC ID NO:4), en donde los paréntesis cuadrado indican los residuos permisibles a una posición dada y X{y,z} es como se define anteriormente. Las proteínas de la presente invención incluyen proteínas que comprenden los dominios CUB al dominio CUB de Zvegf3. Estos dominios homólogos son residuos 100 a 120 de longitud y comprenden una porción de la secuencia C[KR] Y[DNE] [WYF]X{11, 15 } G [KR] YF] C (SEC ID NO:4) que corresponde a los residuos 104-124 de la SEC ID NO : 2. Estos dominios CUB homólogos son al menos, 90% idénticos a los residuos 46-163 de la SEC ID NO:2 o al menos, 95% idénticos a los residuos 46-163 de la SEC ID NO : 2. Las proteínas que contienen el dominio CUB de la presente invención, pueden además, incluir una región interdominante u homologa Zvegf3 del mismo. La región interdominante es al menos, 90% idéntica a los residuos 164 a 234 de la SEC ID NO:2. Las proteínas adicionales de la presente invención comprenden el dominio del factor de crecimiento Zvegf3 o un homólogo del mismo. Estas proteínas así, comprenden un segmento polipéptido que es al menos, 90% o 95% idéntico a los residuos 235-345 de la SEC ID NO:2, en, donde el segmento polipéptido comprende residuos de Cys en las posiciones correspondientes a los residuos 250, 280, 284, 296, 335 y 337 de la SEC ID NO:2; una glicina a una posición correspondiente a los residuos 284 de la SEC ID N0:2; y la porción de la secuencia CX{18,33}CXGXCX{6, 33}CX{20, 40 } CX (SEC ID NO:3), que corresponde a los residuos 250-337 de la SEC ID NO : 2. Las proteínas adicionales que comprenden combinaciones del dominio CUB, región interdominio, y dominio del factor de crecimiento se muestran arriba en la Tabla 1. En cada caso, la invención también incluye proteínas homologas que comprenden dominios homólogos como se describen arriba. El análisis estructural y la homología predicen que el complejo de polipéptidos Zvegf3 con un segundo polipéptido, formen proteínas multiméricas. Estas proteínas incluyen homodímeros y heterodímeros. En último caso, el segundo polipéptido puede ser un polipéptido truncado u otra variante Zvegf3 u otro polipéptido tal como, PIGF, PDGF-A, PDGF-B, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o polipéptidos Zvegf4. Entre las proteínas diméricas dentro de la presente invención, están los dímeros formados por asociación no covalente (P°tffc ejemplo, interacciones hidrófobas) con una segunda subunidad, ya sea un segundo polipéptido Zvegf3 u otra segunda subunidad, o por asociación covalente estabilizada por los enlaces disulfuro intermoleculares entre los residuos de cisteína de los componentes monómeros. Dentro de la SEC ID NO: 2, los residuos Cys en las posiciones 274, 286, 287, 291, 294, y 339 pueden formar enlaces disulfuros intramoleculares o intermoleculares. Es probable que los residuos 274 y 287 formen enlaces de disulfuro intercadenas. En los homodímeros, los componentes polipéptidos (designados A y B) , pueden unirse en un arreglo antiparalelo con un patrón de enlaces de disulfuro intercadenas A274-B287, A287-B274. Los datos además sugieren que los disufuros intercadenas adicionales se formen por el apareamiento de Cys28 con Cys291, y Cis294 con Cys339, aunque algunos o todos estos cuatro residuos puedan estar involucrados etA el apareamiento intercadenas. La presente invención así proporciona una variedad de proteínas multiméricas que comprenden un polipéptido Zvegf3 como se describe arriba. Estos polipéptidos Zvegf3 incluyen Zvegf3?s-234, Zvegf346-23 , amida Zvegf3?5-229, Zvegf3?5-230, Zvegf3?5-345, Zvegf346-345, !^ Zvegf3235-35, así como también variantes y derivados de estos polipéptidos como se describen aquí. El porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Véase por ejemplo, Altshul et al., Bull . Ma th . Bio . 48: 603-616, 1986, y Henikoff y HenikoEf, Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 89:10915-10919, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar los registros de alineación usando una penalización de espacio abierto de 10, una penalización de extensión de la apertura de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 2 (los aminoácidos están indicados por los códigos estándares de una letra) . El porcentaje de identidad entonces es calculado como: Número total de pares idénticos x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de aberturas introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias] *- r^ M <? ? <V ^ o co # ^ O M tM T u. «O -«J- CN «N ,_ c m o M 10 m < »- n N (N N n o n N n T- n oo n n T- N ^- N »• N N .N co CD tO ^ ^ CM t O CvI o CM CM CO CO tu UÍ *? o C col co ,- CM CO o CO CM CN s lO M ^ O ^ ^ -- O ^ O ^ T 0!' o m C -«- r CO *- t- < t- CN CO t- *- CN CN t- o CO O CM '- •»— <0 «- c? O O O t- CO o ^ <? <> t- 0 ',T c C? ?n Q C C - o < o > CN (M »— < ^- - N M o '*_ ,_ ? J ^- t- t- - C ?- ^ o *' fN' ? < C Z Q Ü ? lll O I _ J !¿ S u. D? ffl l- 5 >- > El nivel de identidad entre las secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA", descrito .por Pearson y Lipman ( Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988) y por Pearson (Meth . Enzymol . 183:63, 1990). Brevemente, el FASTA caracteriza primero la similitud de secuencia por la identificación de regiones portadas por la secuencia de interrogación (por ejemplo SEC ID NO:29 y la secuencia de prueba que tiene ya sea la densidad más alta de identidades (si la variable ktup es 1) o pared de identidades (si ktup=2), sin considerar las substituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos conservativos. Las diez regiones con la densidad más alta de identidades son entonces re-registradas por ^^ comparación de la similitud de todos los aminoácidos apareados usando una matriz de substitución de aminoácido, y los extremos de las regiones son "ordenadas" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen al registro más alto. Si hay varias regiones con registros superiores que el valor "cutoff" (calculad por una fórmula predeterminada, basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup) , después las regiones iniciales ordenadas, son examinadas para determinar si las regiones pueden unirse para formar una alineación próxima con las aberturas. Finalmente, las regiones de registro más altas de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo Neddleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . 4j¡_:444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl . Meth . 26:787 , 1974), el cual se permite para las inserciones y supresiones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup=l, penalización de espacio abierto = 10, penalización de extensión de la separación = 1, y matriz de substitución = "BLOSUM62". Estos parámetros se pueden introducir en un programa FAST por la modificación del archivo de la matriz de registro ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson,1 1990 ( ibi d . ) . El FASTA puede también ser usado para determinar la identidad de secuencia de las moléculas de ácido nucleico usando una proporción como se describe anteriormente. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede variar entre uno a seis,? preferiblemente de tres a seis, más preferiblemente tres, con otros parámetros expuestos fuera de lugar. La presente invención incluye polipéptidos que tienen uno o más cambios de aminoácidos conservativos comparados con la secuencia de aminoácido de a SEC ID N0:2. La matriz BLOSUM62 (Tabla 2), es una matriz de substitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2,000 alineaciones locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representa regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff ^^ y Henikoff, ibid.). Por consiguiente, las frecuencias de substitución de BLOSUM62 pueden ser usadas para definir las substituciones conservativas de aminoácidos, que pueden ser introducidas en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Como se usa aquí, el término "substituciones conservativas de aminoácidos", se refiere a una substitución representada por un valor de BLOSUM62,! más grande que -1. Por ejemplo, una substitución de aminoácido es conservativa si la substitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 o 3. Las substituciones de aminoácidos conservativas preferidas, se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las substitucione^^ conservativas de aminoácidos más preferidas, se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3) .

Las proteínas de la presente invención pueden además, comprender extensiones amino o carboxi-terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un residuo de cisteína amino o carboxil-terminal, para facilitar el enlace subsecuente a la hemocianina del linfo clave principal activado por la maleimida, un péptido reticulador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión de polipéptido que facilita la purificación (o extremo de afinidad) como se describe anteriormente. Dos o más extremos de afinidad se pueden usar en combinación. Los polipéptidos que comprenden extremos de afinidad, pueden comprender además, un reticulador polipéptido y/o un sitio de escisión proteolítica entre el polipéptido Zvegf3 y el extremo de afinidad. Los sitios escindidos ejemplares incluyen, sitios de escisión de la trombina y los sitios de escisión del factor Xa. La presente invención además proporciona una variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más| funciones de polipéptidos. Por ejemplo, un polipéptido Zvegf3 puede prepararse como una fusión para una proteína dimerizante como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas dimerizantes ejemplares en este sentido, incluyen dominios de regiones constantes de inmunoglobulina. La dimerización puede también ser estabilizada por la fusión de un polipéptido Zvegf3 a una secuencia de cierre de leucina (Riely et al., Protein Eng. 9_223-230, 1996; Mohamed et al., J. Steroid Bi ochem . Mol . Bi ol . . 51:241-250, 1994). Las fusiones del péptido Zvegf3 de inmunoglobulina y las fusiones de cierre leucina, se pueden expresar en células diseñadas genéticamente para producir una variedad de análogos Zvegf3 multiméricos. Los dominios auxiliares pueden fusionarse a los polipéptidos Zvegf3 para señalarlos a las células, tejidos o macromoléculas específicas (por ejemplo, colágeno). Por ejemplo, un polipéptido o proteína Zvegf3 puede señalarse a un tipo de célula predeterminada, por la fusión de un polipéptido Zvegf3 a un ligando que específicamente se enlaza a un receptor en la superficie de la célula objetivo. De esta forma, los polipéptidos y proteínas pueden ser señalados para propósitos^^ terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido Zvegf3 puede fusionarse a dos o más porciones, tales como un extremo de afinidad para la purificación y un dominio objetivo. Las fusiones de polipéptidos pueden también comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, Tuan et al., Connecti ve Tissue Research 34_:l-9, 1996. Las fusiones de polipéptidos de la presente invención, generalmente contendrán no más de aproximadamente 1,500 residuos de aminoácidos, a menudo no más de aproximadamente 1,200 residuos, a menudo, no más de aproximadamente 1,000 residuos, y serán en muchos casos considerablemente más pequeños. Por ejemplo, un polipéptido Zvegf3 de 331 residuos (residuos 15-345 de la SEC ID NO:2), puede fusionarse a la ß-galactosidasa de E . coli (1,021 residuos; véase Casadaban et al., J. Ba cteriol . 143: 971-980, 1980), un separador de 101 residuos, y un sitio de escisión del factor Xa de 4 residuos para proporcionar un polipéptido de 1366 residuos. En un segundo ejemplo, los residuos 235-345 de la SEC ID NO: 2 pueden fusionarse a la proteína de enlace a la maltosa (aproximadamente 370 residuos), un sitio de escisión de 4 residuos, y un extremo de polihistidina 6 residuos. Un polipéptido que comprende el dominio del factor de crecimiento Zvegf3 (por ejemplo, Zvegf3235-345 o Zvegf3?64-3 5) , pueae fusionarse a un dominio UB no Zvegf3. Dentro de una modalidad relacionada de la invención, un polipéptido Zvegf3 que comprende un factor de crecimiento Zvegf3 y dominios CUB se fusionan a un dominio CUB no Zvegf3, tal como un dominio CUB que comprende al polipéptido de neuropilina. La presente invención además proporciona fusiones de polipéptidos que comprenden el dominio CUB de Zvegf3 (por ejemplo, Zvegf345-i63) . El dominio CUB con su homología a la neuropilina-1, se puede usar para señalar Zvegf3 u otras proteínas contenidas en las célula que tienen superficies celulares de semaforina, incluyendo células endoteliales, células neuronales, linfocitos y células tumorales. El dominio CUB Zvegf3 puede así, unirse a otras porciones, incluyendo polipéptidos (por ejemplo, otros factores de crecimiento, anticuerpos, y enzimas), y porciones no peptídicas (por ejemplo, radionúclidos, agentes de contraste y similares); para señalarlos a las células que expresan semaforinas en la superficie celular. Los sitios similares a la furina yá dibásicos entre los dominios del factor de crecimiento y CUB de Zvegf3, pueden permitir la liberación proteolítica del dominio del factor de crecimiento u otra porción a través de las proteasas locales existentes dentro de los tejidos, o por las proteasas agregadas de las fuentes exógenas. La liberación de la porción señalada puede proporcionar más efectos biológicos localizados. . Las proteínas que comprenden el dominio CUB Zvegf3 de tipo silvestre y las variantes de los mismos, se pueden usar para modular actividades mediadas por las semaforinas de la superficie celular. Mientras no se quiera ligar por la teoría, el Zvegf3 puede enlazarse a las semaforinas vía su dominio CUB. La observación de que la semaforina III está involucrada en el desarrollo vascular, sugiere que los miembros de la familia del factor de crecimiento vascular de las proteínas, puedan también estar involucradas, especialmente debido a la{ actividad co-enlazante de VEGF y la semaforina III a la neuropilina-1. El Zvegf3 puede así, ser fusionado para diseñar agonistas y antagonistas de las interacciones neuropilina-semaforina . Por ejemplo, la secuencia Zvegf3 descrita aquí, proporciona un punto de partida para el diseño de moléculas que antagonizan las actividades^^ estimuladas por la semaforina, incluyendo el crecimiento de la neurita, desarrollo cardiovascular, desarrollo del limbo y cartílago, y función de las células T y B. Las aplicaciones adicionales incluyen la intervención en varias patologías, incluyendo artritis reumatoide, varias formas de cáncer, padecimientos autoinmunes, inflamación, retinopatías , hemangiomas, eventos isquémicos dentro de los tejidos, incluyendo el corazón, riñon y arterias periféricas, neuropatías y daño al nervio, y padecimientos de los sistemas nerviosos centrales y periféricos . Los cambios de la secuencia de aminoácido se hacen en los polipéptidos Zvegf3 tal como la disolución mínima de la estructura de orden superior esencial para la actividad biológica. En general, se prefieren los cambio conservativos de aminoácidos. Los cambios en los residuos de aminoácidos se harán en tanto no se disuelva( el nudo cisteína y el arreglo "de unión del arco" de los lazos en el dominio del factor de crecimiento que es característico de la familia de proteínas. Las porciones conservadas también se mantendrán. Los efectos de los cambios de las secuencias de aminoácidos pueden predecirse por el moldeo en computadora como se describßßk anteriormente o determinado por el análisis de estructura de cristal (véase por ejemplo, Lapthorn er al., ibid.). Un perfil de hidrofobicidad de la SEC ID NO: 2 se muestra en la Figura 1. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que esta hidrofobicidad se tomará en cuenta cuando se diseñen las alteraciones en la secuencia de aminoácido de un polipéptido Zvegf3, de manera que no se disuelvan los perfiles totales. La guía adicional en la selección de las substituciones de aminoácidos se proporciona por el alineamiento de las secuencias de ratón y humano Zvegf3 mostradas en la Figura 6. Los polipéptidos de la presente invención pueden también, comprender residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente. Los aminoácidos que no se originan naturalmente incluyen sin limitación, trans-3-metilprolina, 2 , 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-trenonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina . Se conocen varios métodos en la técnica para la incorporación de residuos de aminoácidosj que no se originan naturalmente en las proteínas. Por ejemplo, un sistema in vi tro puede emplearse en donde son suprimidas las mutaciones no sentido usando supresores tARNs químicamente aminoacilados . Se conocen en la técnica métodos para sintetizar aminoácidos y ARNt aminoacilados. La transcripción y traducción de los plasmidos que contienen mutaciones no sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende extracto de E . coli S30 y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas son purificadas por cromatografía. Véase por ejemplo, Robertson et al., J. Am . Chem . Soc . 113:2722, 1911; Ellman et al., Methods Enzymol 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-809, 1993; y Chung et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 90: 10145-10149, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus por la microinyección de ARNm mutado y supresoresi tARNs químicamente aminoacilados (Tucartti et al., J Biol . Chem . 271: 1991-1998, 1996). Dentro de un tercer método, las células E . col i son cultivadas en la ausencia de un aminoácido natural que será reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia de los aminoácidos que no se originan naturalmente) (pori ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4-fluorofenilalanina) . El aminoácido que no se origina naturalmente se incorpora en la proteína en lugar de su contraparte natural. Véase Koide et al., Biochem 3_3 : 7470-7476, 1994. Los residuos de aminoácido que se originan naturalmente, se pueden convertir a especies que no se originan naturalmente por modificación química in vi tro . La modificación química se puede combinar con la mutagénesis dirigida al sitio, para expandir además, el rango de substituciones (Wynn y Richards, Protein Sci . 2_:395-403, 1993). Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención, se pueden identificar de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244, 1081-1085, 1989; Bass et al. Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 88: 498- 502, 1991). En la última técnica, las mutaciones de alanina únicas se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban por su actividad biológica de otras propiedades para identificar residuos de aminoácidos que son críticos a la actividad de 1( molécula . Las substituciones de aminoácidos múltiples se pueden hacer y probar usando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquellos descritos por Rediharr-Olson y Sauer ( Sci ence 241 : 53-57 , 1998) o Bowie y Sauer ( Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 86:2152-2156, 1989. Brevemente, estos autores describen métodos para simultáneamente aleatorizar dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionado por su polipéptido funcional, y después, secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de substituciones permisibles a cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen presentación del fago (por ejemplo, Lowman et al., Bi ochem 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5,223,409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., ADN 1_: 121 , 1988) Las variantes de las secuencias de polipéptidos y ADN de Zvegf3 descritas, se pueden generar a través del desordenamiento de ADN como se describe por Stemmer, Na ture 370: 389-391, 1991 y Stemmer, Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 9_1: 10747-10751, 1994. Brevemente, los genes variantes se generan por recombinación homologa in vi troi por fragmentación aleatoria de un gen original, seguido por el reacomodo usando PCR, resultando en mutaciones de punto introducidas aleatoriamente. Esta técnica puede modificarse por el uso de una familia de genes originales, tales como variantes alélicas o genes de especies diferentes, para introducir variabilidad adicional en el proceso. La selección o separación de la actividad deseada, seguida por las separaciones adicionales de mutagénesis y los ensayos proporcionan una rápida "evolución" de las secuencias por la selección de las mutaciones deseables, mientras se seleccionan simultáneamente los cambios contra los cambios deteriorantes. Los métodos de mutagénesis como se describe anteriormente, pueden combinarse con métodos de selección de alto rendimiento o alto volumen para detectar actividad biológica de los polipéptidos variantes Zvegf3,< en particular la actividad biológica en la modulación de la proliferación celular o diferenciación celular. Por ejemplo, los ensayos de mitogénesis que miden la incorporación de tintes o incorporación de 3H-timidina, se pueden llevar a cabo en gran número de muestras, como pueden ser ensayos a base de células que detectan expresión de un gen reportero (por ejemplo, un gen luciferaza) . La mutagénesis del dominio CUB puede usarse para modular su enlace a los miembros de la familia de semaforina, incluyendo incrementar o inhibir el enlace a los miembros de la familia seleccionada. Un espectro modificado de la actividad enlazante puede ser deseable para la optimización de la utilidad terapéutica y/o de diagnóstico de las proteínas que comprenden un dominio CUB de Zvegf3. La proteína CUB etiquetada utilizando enlace directo, se puede usar para monitorear los cambios en la actividad enlazante del dominio CUB a los miembros de la familia semaforina seleccionados. Las semaforinas de interés en este sentido, incluyen proteínas aisladas, proteínas presentes en las membranas celulares, y proteínas presentes en las superficies celulares. El dominio CUB se puede etiquetar por una variedad de métodos incluyendo, radioetiquetación coiA isótopos, tal como 125I, conjugación a las enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, conjugación con biotina, y conjugación con varios marcadores fluorescentes, incluyendo FITC. Estos y otros ensayos se describen en más detalle abajo. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican a los polipéptidoa^ Zvegf3 activos, pueden recuperarse de las células hospederas y rápidamente secuenciadas usando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. Usando los métodos discutidos arriba, uno de habilidad ordinaria en la técnica, puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que son homólogos a los polipéptidos Zvegf3 descritos anteriormente en la Tabla 1 y retienen las propiedades biológicas de la proteína de tipo nativa. Tales polipéptidos pueden también incluir segmentos de polipéptidos adicionales como se describe de manera general anteriormente. La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, incluyendo moléculas de AND y ARN, que codifican a los polipéptidos Zvegf3 descritos arriba. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen la hebra sentido, la hebra antisentido; y el ADN como doble hebra, que tiene tanto la hebra sentido como antisentido, fortalecidas juntas por enlaces hidrógeno. Una secuencia de ADN representativa que codifica a los polipéptidos Zvegf3 se expone en la SEC ID NO:l. Lasi secuencias de ADN adicionales que codifican a los polipéptidos Zvegf3, pueden ser fácilmente generadas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, basados en el código genético. Las secuencias de ARN contrapartes, se pueden generar por la substitución de U por T. Aquellos en la técnica, fácilmente reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, la variación de la secuencia considerable es posible entre las moléculas de polinucleótidos que codifican a los polipéptidos Zvegf3. La SEC ID NO: 6 es una secuencia de ADN degenerada que abarca todos los AND que codifican al polipéptido Zvegf3 de la SEC ID N0:2. Aquellos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEC ID NO: 6 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican a la SEC ID NO: 2, por la substitución de U por T. Así, los polinucleótidos que codifican al polipéptido Zvegf3 comprenden nucleótidos 1-1035, 1-489, 43-489, 136-189, 43-702, 136-702, 43-690, 43-1035, 136-1035, y 703-1035 de la SEC ID NO : 6 y sus ARN equivalentes están contemplados por la presente invención. La Tabla 3 expone el código de una letra usado dentro de la SEC ID NO: 6 para denotar posiciones de nucleótidos degeneradas. Las "resoluciones" son los nucleótidos denotados por eli código de una letra. "Complemento" indica el código para los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y denota ya sea C o T, y su complemento R denota A o G, A es complementario a T, y G es complementario a C.

Tabla 3 Nucleótido Resoluciones Complemento Resoluciones _ _ _ _ C C G G G G C C T T A A R A | G Y C | T Y C | T R A | G M A | C K G | T K G | T M A | C S C | G S C | G W A | T W A | T H A | C | T D A | G | T B C | G | T V A | C | G V A|C|T B C | G | T D A | G | T H AICIT N A | C | G | T N A | C | G | T Los codones degenerados usados en la SEC ID NO:6, que abarcan todos los codones posibles para un aminoácido dado, se exponen en la Tabla 4 Tabla 4 Ami no Código de Codones Codon ácido una Letra Degenerado Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACÁ ACC ACG ACT CAN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAÁ CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG lie I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter • TAA TAG TGA TRR RAY Asn | B Asp \ Glu | Z SAR Gln Cual qui era X NNN Apertura — Una persona con experiencia ordinaria en la técnica, apreciará que se introduce alguna ambigüedad en la determinación de un codon degenerado, representativo de todos los posibles codones que codifican a cada aminoácido. Por ejemplo, el codon degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar la ^ arginina (ARG), y el codon degenerado para la arginina (MGN) , puede en algunas circunstancias, codificar la serina (AGY) . Existe una relación similar entre los codones que codifican la fenilalanina y la leucina. De este modo, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar las secuencias^ variantes de aminoácidos, pero una persona con experiencia ordinaria en la técnica, puede identificar fácilmente tales secuencias variantes mediante la referencia la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO Las secuencias variantes pueden ser probadas fácilmente para s ^t funcionalidad como se describe aquí. Dentro de ciertas modalidades de la invención, los polinucleótidos aislados hibridizarán a regiones de tamaños similares de la SEC ID NO:l, o una secuencia complementaria a esta, bajo condiciones rigurosas. En general, se seleccionan las condiciones estrictas como aproximadamente 5°C inferior que el punto de fusión término (Tm) para esta secuencia específica a una fuerza iónica definida y pH. El Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica definida y pH) , a la cual, el 505 de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente igualada. Las condiciones rigurosas típicas son aquellas en las cuales la concentración de sal es de hasta aproximadamente 0.03 M a pH 7 y la temperatura es al menos, aproximadamente 60CC. Como se notó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ARN y ADN. LOSÍ métodos para la preparación del ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. Los clones ADN (ADNc) complementarios se preparan del ARN que es aislado de un tejido o de células que producen cantidades grandes de ARN de Zvegf3. Tales tejidos y células se identificaron por el manchado Northern (Thomas, Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 11_ 5201 , 1980), e incluyen glándulas tiroide, médula espinal y glándula adrenal. El ANR total se puede preparar usando extracción de HCl de guanidina seguida por el aislamiento por centrifugación en un gradiente CsCl (Chirgwin et al., Bi ochemis try 18 : 52-94, 1979). El ANR Poli (A) + se prepara a partir del ARN total usando el método de Aviv y Leder (Proc. Na tl . Acad. Sci . USA 69: 1408-1412, 1972) . El ADN complementario (ADNc) se prepara del ARN poly (A) + usando métodos conocidos. En la alternativa, el ADN genómico se puede aislar. Para algunas aplicaciones (por ejemplo, la expresión en animales transgénicos), puede ser preferible usar un clon genómico para modificar un clon de ADNc para incluir al menos, un intrón genómico. Los métodos para la identificación y aislamiento de los clones genómicos y de ADNc, son bien conocidos y están dentro del nivel de un ordinario experto en la técnica, e incluye el uso de la secuencia descrita aquí, o partes de las mismas, para someter a sondas o a cebación una genoteca. Los polinucleótidos que codifican a polipéptidos Zvegf3 están identificados y aislados mediante por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa o hibridación ("PCR", Mullís, Patente Estadounidense 4,683,202). La expresión de la.'^ genotecas puede ser sometida a sondas con anticuerpos a Zvegf3, fragmentos del receptor u otros patrones de enlaces específicos.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán que las secuencias descritas en las SEC ID NOs: 1 y 2, representan un alelo único del Zvegf3 humano. Las variantes alélicas de estas secuencias se pueden clonar mediante el ADNc de sonda o bibliotecas genómicas de individuos diferentes de conformidad con los procedimientos estándares. Las formas alternativamente ^ unidas de Zvegf3 también se espera que existan. La secuencia de polinucleótido de Zvegf3 descrita aquí, puede ser usada para aislar polinucleótidos de conformidad con otras proteínas Zvegf3. Tales otros polinucleótidos incluyen variantes alélicas, cANDs alternativamente unidos y polinucleótidos de contrapartes a. partir de otras especies (ortólogos) Estos polinucleótidos ortólogos pueden ser usados ínter alia , para preparar las proteínas ortólogas respectivas. Otras especies de interés incluyen, pero no están limitadas a, especies de mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otros vertebrados e invertebrados- De interés particular son lo^^^ polinucleótidos Zvegf3 y las proteínas de otras especies de mamíferos, incluyendo polinucleótidos y proteínas de primates no humanos, murino, porcino, ovino, canino, felino y equino. Los polipéptidos y polinucleótidos ztbgl no humanos, así como también los antagonistas de los mismos y otras moléculas relacionadas, pueden ser usadas inter a l ia , en medicina veterinaria. Los ortólogos de Zvegf3 humanos pueden ser clonados usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado usando ARNm obtenido a partir de un tipo de célula o tejido que expresa el Zvegf3 como se describe aquí. Las fuentes adecuadas de ARNm se pueden identificar al sondear los manchados Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas aquí. Una biblioteca es entonces preparada del ARNm de una línea celular o tejidoá positivo. Una ANDc que codifica a un Zvegf3 se puede entonces, aislar por una variedad de métodos, tales como por el sondeo con un ANDc humano parcial o completo, o con una o más series de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. La hibridización generalmente se hará bajo condiciones de rigurosidad bajas, en donde lavado se lleva a cabo en 1 x SSC con un lavado inicial a 40°C y con lavados subsecuentes a intervalos superiores de 5°C hasta que se reduce adecuadamente el medio ambiente. Un ADNc también se pude clonar usando la reacción en cadena de la polimerasa, o por PCR (Mullís, Patente Estadounidense No. 4,683,202), usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de Zvegf3 humana representativa descrita aquí. Dentro de un método adicional, la biblioteca de ADNc se puede usar para transformar o transfectar las células hospederas, y la expresión del ADNc de interés pueden también detectarse con un anticuerpo al polipéptido Zvegf3. Se pueden aplicar también, técnicas similares al aislamiento de los clones genómicos. Para cualquier polipéptido Zvegf3, incluyendo variantes y proteínas de fusión, uno de habilidad ordinaria en la técnica puede fácilmente generar unaá secuencia de polinucleótido completa que codifica a tal variante usando la información expuesta en las Tablas 3 y 4 anteriores. Las regiones conservadas de Zvegf3, identificadas por el alineamiento con las secuencias de los otros miembros de la familia, se pueden usar para^k identificar polinucleótidos y proteínas relacionadas. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) y otras técnicas conocidas en el arte, se pueden usar para amplificar secuencias que codifican a las porciones conservadas presentes en el Zvegf3 a partir del ARN obtenido de una variedad de fuentes de tejidos. En particular, los cebadores altamente degenerados como se muestran en la Tabla 5 (diseñados a partir de una alineación de Zvegf3 con cadenas PDGF A y V, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, y VEGF-D) , son útiles para la clonación de polinucleótidos que codifican a los dominios del factor de crecimiento homólogo. Los cebadores mostrados en la Tabla 6, diseñados a partir de un alineamiento de Zvegf3 con el precursor de neuropilina X. La véi s , BMP-1 humano, y la proteína similar al toloide de X. Lavéis , son empleados para la clonación de polinucleótidos que codifican a los dominios CUB. Losi cebadores de las Tablas 6 y 7 pueden por lo tanto, usarse para obtener polinucleótidos adicionales que codifican a los homólogos de la secuencia Zvegf3 de la SEC ID NO:l y No:2.

Tabla 5 Residuos 279-284 de Zvegf3 Degenerado: MGN TGY GGN GGN AAY TG (SEC ID NO: 7) Consenso: MGN TGY DSN GGN WRY TG (SEC ID NO: 8) Complemento: CAR YWN CCN SHR CAN CK (SEC ID NO: 9) Residuos 270-275 de Zvegf3 Degenerado: TTY TGG CCN GGN TGY YT (SEC ID NO: 10) Consenso: NTN DDN CCN NSN TGY BT (SEC ID NO: 11) Complemento: AVR CAN SNN GGN HHN AN (SEC ID NO: 12) Residuos 332-337 de Zvegf3 Degenerado CAY GAR GAR TGY GAY TG (SEC ID NO: 13) f Consenso: CAY NNN NVN TGY VVN TG (SEC ID NO: 14) Complemento: CAN BBR CAN BNN NNR TG (SEC ID NO: 15) Residuos 250-255 de Zvegf3 Degenerado: TGY CAN CCN MGN AAY TT (SEC ID NO: 16) Consenso: TGY HNN MCN MKN RMN DH (SEC ID NO: 17) Complemento: DHN KYN MKN GKN NDR CA (SEC ID NO: 18) Residuos 104-109 de Zvegf3 Consenso. TGY AAR TAY GAY TEY GT (SEC ID NO: 19) Complemento: ACR WAR TCR TAY TTR CA (SEC ID NO: 20) Residuos 120-125 de Zvegf3 Consenso: YW GGN NMR TDB TGY GG (SEC ID NO: 21) Complemento: CCR CAV HAN YKN CCN WR (SEC ID NO:22).

Residuos 63-68 de Zvegf3 Consenso: TDB CCN MAN DVN TAY CC (SEC ID NO: 23) Complemento: GGR TAN BHN TKN GGV HA (SEC ID NO: 24) Las secuencias de polinucleótidos Zvegf3 descritas aquí, pueden también usarse como sondas °^^ cebadores para clonar las regiones 5' no codificantes de un gen Zvegf3, incluyendo secuencias promotoras. Estas secuencias de flanqueo se pueden usar para dirigir la expresión de Zvegf3 y otras proteínas recombinantes. Además, las secuencias de flanqueo 5' se pueden usar como sitios objetivos para los constructos regulatorios par^ activar o incrementar la expresión del gen Zvegf3 endógeno como se describe por Treco et al., Patente Estadounidense No. 5,641,670.

Los polinucleótidos de la presente invención, pueden también, ser preparados por síntesis automatizada. El método actual de selección es el método de fosforamidita. Si se requiere el ADN de doble hebra sintetizado químicamente, cada hebra complementaria se hace separadamente. La producción de segmentos cortos de doble hebra, (60 a 80 bp) , es técnicamente de manera 9 directa, y puede estar acompañada por la sintetización de las hebras complementarias y después su fortalecimiento. Los segmentos más largos (típicamente >300 pb) están unidos en la forma modular a partir de fragmentos de hebras únicas que son de 20 a 100 nucleótidos de longitud. La síntesis automatizada de polinucleótidos, está dentro del nivel de uno de habilidad ordinaria en la^^ técnica, y equipo adecuado y los reactivos están disponibles a partir de suministradores comerciales. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994; Itakura et al., Ann . Rev. Biochem . 53: 323-56, 1984; y Climie et al. A Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 87_: 633-7 , 1990. Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo polipéptidos de longitud completa, fragmentos biológicamente activos y polipéptidos de fusión, se pueden producir en células hospederas diseñadas genéticamente de conformidad con las técnicas convencionales. Las células hospederas adecuadas son aquellos tipos de células que se pueden transformar o transfectar con el ADN exógeno y crecer en un cultivo incluyendo, células de bacterias, fúngicas, y células eucarióticas superiores cultivadas (incluyendo células cultivadas de organismos multicelulares). Las técnicas para manipular las moléculas de ADN clonadas e introducir el ADN exógeno en una variedad de células hospederas, se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora tory Manua l , 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green and John Wiley and Sons, Inc., NY, 1993. En general, una secuencia de ADN que codifica a un polipéptido Zvegf3 está ligada operablemente a otros elementos genéticos, requeridos para su expresión, generalmente incluyendo un promotor de la transcripción,! un terminador, dentro de un vector de expresión. El vector también comúnmente contendrá uno o más marcadores seleccionables y un o más orígenes de replicación, aunque un experto en la técnica reconocerá que ciertos sistemas de marcadores seleccionables se pueden proporcionar en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno se puede proporcionar por la integración en el genoma de la célula hospedera. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables y otros elementos es tema de rutina designado dentro del nivel del ordinario experto en la técnica. Muchos elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido Zvegf3 en la trayectoria secretoria de una célula hospedera, una. secuencia de señal secretoria (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) , se| proporciona en el vector de expresión. La secuencia de señal secretoria puede ser aquella de Zvegf3 o se puede derivar de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA; ver, Patente Estadounidense No. 5,641,655) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretoria está operablemente ligada a la secuencia de ADN de Zvegf3, eeA decir, las dos secuencias están unidas en la estructura lectora correcta y colocadas para dirigir al polipéptido recientemente sintetizado en la trayectoria secretoria de la célula hospedera. Las secuencias de señal secretorias, son comúnmente colocadas 5' en la secuencia de ADN que codifica al polipéptido de interés, aunque pueden ser colocadas del mismo modo, ciertas secuencias de señal en la .secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo, Welch et al., Patente Estadounidense No. 5,037,743, Holland et al., Patente Estadounidense No. 5,143,830). La expresión de los polipéptidos Zvegf3 vía una trayectoria secretoria de la célula hospedera, se espera resulte en la producción de proteínas multiméricas. Como se notó anteriormente, tales multímeros incluyen tanto homomultímeros como heteromultímeros, las últimas incluyen proteínas que comprenden solamente polipéptidos y proteínas Zvecjf3 incluyendo Zvegf3 y polipéptidos heterólogos. Por ejemplo, un heteromultímero que comprende un polipéptido Zvegf3 y un polipéptido a partir de un elemento de la familia relacionado (por ejemplo, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, Zvegf4, PIGF, PDGF-A o PDGF-B) , puede producirse pro la co-expresión de los dos polipéptidos en una célula hospedera. Se conocen lasí secuencias que codifican a estos otros miembros de la familia. Véase por ejemplo, Dvorak et al., ibid. ; Olofsson et al., ibid. ; Hayward et al., ibid. ; Joukov et al., ibid. ; Oliviero et al., ibid . ; Achen et al., ibid. ; Maglione et al., ibi d . ; Heldin et al., Patente Estadounidense No., 5,219,759; y Johnsson et al., ibid. Si una mezcla de proteínas resulta de la expresión, se aislan especies individuales por métodos convencionales. Los monómeros, dímeros, y multímeros de orden superior están separados mediante por ejemplo, la cromatografía de tamaño de exclusión. Los heteromultímeros pueden separarse de los homomultímeros por la cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para los dímeros individuales o por etapas de inmunoafinidad secuenciales, usando anticuerpos específicos para polipéptidos de componentes individuales. Véase en general, la Patente Estadounidense U.S No. 5,094,941. Los) multímeros pueden también ser unidos in vi tro después de la incubación de los polipéptidos componentes bajo condiciones adecuadas. En general, la unión in vi tro incluye la incubación de la mezcla de la proteína bajo condiciones de desnaturalización y reducción, seguidas por el repliegue y reoxidación de los polipéptidos ^b partir de homodímeros y heterodímeros. La recuperación y unión de las proteínas expresadas en las células bacterianas está descrita abajo.

Las células de mamífero cultivadas son hospederos adecuados para usarse dentro de la presente invención. Los métodos para la introducción del ADN exógeno en las células hospederas de mamíferos, incluyen transfección mediada por el fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14_:725, 1978; Corsaro y Pearson, Soma ti c Cel l Geneti cs 1_: 603 , 1981: Graham y Van der Eb, Vi rol ogy 5_2:456, 1973), e ectroporación (Neumann et al., EMBO J. 3^:841-845, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid . ) , y transfección mediada por las liposomas (Felgner et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA £ :7413-7, 1987; Mackey et al., Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 85:8027-31, 1988; Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 1_5:80, 1993). La producción de los polipéptidos recombinantes en las células de mamífero cultivadas, se describe por ejemplo en Levinson Patente Estadounidense No. 4,713,339; Hagen et al., Patente Estadounidense No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente Estadounidense No. 4,579,821; y Ringold, Patente Estadounidense No. 4,656,134. Las células de mamíferc adecuadas incluyen las COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. 10314), 293 (ATCC No. CRL 1373; Graham et al., J. Gen . Virol . 3_6:59-72, 1977) y líneas celulares de ovario de hámster Chino (por ejemplo, CH0-K1; ATCC No. CCL 61). Las líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en la técnica y están disponibles a partir de depositarios públicos tales como the American Type Collection, Rockville, Maryland. Los promotores fuertes de la transcripción incluyen promotores a partir de SV-40 o citomegalovirus. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos a partir de los genes de metalotioneína (Patentes Estadounidenses Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío mayor de adenovirus. Los vectores de expresión para usarse en las células de mamíferos incluyen pZP-1 y pZP-9, los cuales han sido depositados1 con el American Type Culture Collection, Rockville, MD USA, bajo los accesos Números 98669 y 98668, respectivamente . La selección del fármaco se usa generalmente para seleccionar células de mamíferos cultivadas en las cuales se ha insertado el ADN ajeno. Tales células son! comúnmente referidas como "transfectantes". Las células que se han cultivado en la presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie, son referidas como "transfectantes estables". Un marcador ejemplar seleccionable es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en la presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección se pueden usar también para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo mediante el cultivo de los transfectantes en la presencia de un nivel bajo del agente selectivo y que incrementa la cantidad del agente selectivo seleccionado por las células que producen niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable ejemplar, es la reductasa de( hidrofolato, la cual confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a los fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, acetiltransferasa de puromicina), también se pueden usar. Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal como una proteína fluorescente verte o las proteínas de la superficie celular, tales como CD4, CD8, MHC Clase I, fosfatasas alcalinas placentales, se piueden usar para células transfectadas de especies, a partir de células no transfectadas por tales medios como clasificación FACS o tecnología de separación por perlillas magnéticas. Otras células eucarióticas superiores que pueden también ser usadas como hospederos, incluyen células de insecto, células de plantas y células de aves. El uso de Agroba cterí um rhi zogenes como un vector para expresar genes en las células de plantas ha sido revisado por Sinkar et al., J. Bi os ci . (Banga l ore) 11:47-58, 1987. La transformación de las células de insectos y la producción de los polipéptidos ajenos se describen por Guarino et al., Patente Estadounidense No. 5,162,222 y Publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insectos pueden ser infectadas! con vectores de baculovirus recombinantes, los cuales son comúnmente derivados de virus de polihedrosis nuclear múltiples de Au tographa ca l i forni ca (AcNPV) . Véase Ver, King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, et al., Baculovirus Expression Vectors: 3^ Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; y, Richardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Los baculovirus recombinantes también se pueden producir a través del uso de un sistema a base de transposon descrito por Luckow et al. ( J. Vi rol . 62:4566-79, 1993). Este sistema, el cual utiliza los vectores de transferencia, está comercialmente disponible en forma de equipo (equipo Bac-to-Bac™; Life Technologies, Rockville, MD) . El vector de transferencia (por ejemplo, pFastBacl™; Life Technologies), contienen un transposon Tn7 para mover el ADN que codifica a la proteína de interés en un genoma de baculovirus mantenido en E . col i como un plasmido grande llamado un "bacmido". Véase, Hill-Perkins y Possee, J. Gen . Vi rol . 71: 971-976,. 1990; Bonning et al., J. Gen . Vi rol . 7_5: 1551-1556, 1994; y Chazenbalk y Rapoport, J. Bi ol . Chem . 270: 1543-1549,1 1995. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en estructura con un ADN que codifica a una extensión de polipéptido o extremo de afinidad como se describe anteriormente. Usando técnicas conocidas en el arte, un vector de transferencia que contiene una secuencia codificante Zvegf3, es transformado en hospederas de E . col i , y las células son seleccionadas para los bacmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de un baculovirus recombinante. El ADN bacmido que contiene al genoma del baculovirus recombinante es aislado, usando técnicas comunes y se usa para transfectar células se Spodoptera frugiperda , tales como las células Sf9. El virus recombinante que expresa a la proteína Zvegf3 se produce subsecuentemente. Las pilar virales recombinantes se elaboran por métodos comúnmente usados en la técnica. Para la producción de la proteína, el virus recombinante se usa para infectar a las células hospederas, típicamente una línea celular derivada del gusano soldado muerto, Spodoptera frugiperda (por ejemplo células Sf9 o Sf21) o Tri chopl usia ni (por ejemplo células High Five™ Invitrogen, Carlsbad, CA) . Véase en general Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Veáse también, la Patente Estadounidense No. 5,300,435. Se usa el medio libre de suero se usa para hacer crecer y mantener las células. Las formulaciones del medio adecuadas se conocen en la técnica y se pueden obtener a partir de proveedores' comerciales. Las células se hacen crecer a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células, a una densidad de 1-2 x 106 células, al tiempo del cual, las pilas virales recombinantes se agregan a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 a 10, más típicamente, cercana a 3. Los procedimientos usados se describen de manera general en manuales de laboratorio disponibles (por ejemplo, King y Possee, ibid. ; O'Reilly et al., ibid. ; Richardson, ibid. ) . Las células fúngicas, incluyendo las células de ^^ insecto pueden también usarse dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés particular en este sentido incluyen Sa ccharomyces cerevisiae , Pichia pa s toris y Pi chia methanoli ca . Los métodos para la transformación de las células de S . cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de estos, se describe mediante ejemplo, Kawasaki, Patente Estadounidense No. 4,599,311; Kawasaki et al., Patente Estadounidense No. 4,931,373; Brake, Patente Estadounidense No. 4,870,008; Welch et al., Patente Estadounidense No. 5,037,743; y Murray et al., Patente Estadounidense No. 4,845,075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo por el marcador seleccionable, comúnmente resistencia al fármaco o la habilidad para crecer en la ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vector ejemplar para usarse en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vector POTl descrito por Kawasaki et al. (Patente Estadounidense No. 4,931,373), el cual permite a las células transformadas, seleccionarlas para crecer en un medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usarse en las levaduras incluyen aquellos de los genes de la enzima glicolítica (véase, por ejemplo, Kawasaki, Patente Estadounidense No. 4,599,311; Kingsman et al., Patente Estadounidense No. 4,615,974; y Bitter, Patente Estadounidense No. 4,977,092) y genes del alcohol deshidrogensa . Véase también Patentes Estadounidenses Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras incluyen' Hansenula polymorpha , Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis , Ustilago maydis, Pichia pastoris , Pichia methanolica , Pichia guillermondii y Candida maltosa se conocen en la técnica. Véase por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986; Cregg, Patente Estadounidense No 4,882,279; y Raymond et al., Yeast 14_, 11-23, 1998. Las células de Aspergillus pueden' ser utilizadas de conformidad con los métodos de McKnight et al., Patente Estadounidense No. 4,935,349. Los métodos para la transformación de Acremoni um chrysogen um se describen por Sumino Patente Estadounidense No. 5,162,228. Los métodos para la transformación de Neurospora se describen por Lambowitz, Patente Estadounidense No. 4,486,533. La producción de proteínas recombinantes en Pi chia methanoli ca se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,716,808, 5,736,383, 5,854,039, y 5,888,868. Las células hospederas procarióticas, incluyendo cepas de la bacteria Escheri chia col i , Bacillus y otro género, también son células hospederas empleadas dentro de la presente invención. Las técnicas para la transformación de estos hospederos y expresar las secuencias de ADN ajenas clonadas aquí, son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., ibid.) . Cuando se expresa un polipéptido Zvegf3 en la bacteria, tal como E . col i , el polipéptido puede retenerse en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso formados, las células son sometidas a lisis, y los granulos recuperados y desnaturalizados usando por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede entonces, replegarse y dimerizarse por la dilución del desnaturante, tal como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de la glutationa oxidada y reducida, seguida por la diálisis contra una solución de salina amortiguada. En la alternativa, la proteína se puede recuperar del citoplasma en la forma insoluble y aislar sin el uso de desnaturantes. La proteína se recupera de la célula como un extracto acuoso en, por ejemplo, salina amortiguada de fosfato. Para capturas la proteína de interés, el extracto es aplicado directamente a un medio cromatográfico, tal como un anticuerpo inmovilizado o columna de heparina-Sefarosa . Los polipéptidos secretados pueden recuperarse a partir del espacio periplásmico en la forma soluble y funcional por la disolución de las células (por ejemplo, sonicación o golpe osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, con ello, se hace obvia la necesidad de desnaturalización y repliegue. La producción de las proteínas de fusión Zvegf3 en las células hospederas procarióticas es de interés particular. Una ejemplificación de tal proteína de fusión comprende, un polipéptido Zvegf3 fusionado a la proteína de enlace a la maltosa. Tales fusiones pueden además, comprender secuencias adicionales, tales como polihistidina para proporcionar purificación de afinidad de la fusión del polipéptido. Un sitio de escisión enzimático (por ejemplo, un sitio de escisión de la trombina) , puede también incluirse para permitir la separación de los componentes Zvegf3 y no Zvegf3 de la fusión. Las células hospederas transfectadas o transformadas, son cultivadas de conformidad con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para-el crecimiento de las células hospederas seleccionadas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios1 definidos y medios complejos, se conocen en la técnica, y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. El medio puede también contener tales componentes como factores de crecimiento o el suero, como se requiera. El medio de crecimiento generalmente serál seleccionado para las células que contienen el ADN exógenamente agregado y, por ejemplo, la selección del fármaco o deficiencia en un nutriente esencial el cual es complementado por el marcador seleccionable llevado en el vector de expresión o co-trasnfectado en las células hospederas. Las células P. Me thanol i ca s , por ejemplo, son cultivadas en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y rastros de nutrientes a una temperatura de aproximadamente 25°C hasta 35°C. Los cultivos líquidos se proporcionan con suficiente aireación por medios convencionales, tales como sacudimiento de matraces pequeños o esparción de los termentadores. Los polipéptidos Zvegf3 o fragmentos de los mismos, también se pueden preparar a través de síntesis química de conformidad con los métodos conocidos en la técnica, incluyendo síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis de solución clásica. Véase por ejemplo, Merrifield, J. Am . Chem . Soc . 8_5:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2da Edición), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer y Rapp, Chem . Pept . Pro t . .3:3, 1986; y Atherton et al.,( Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989. Los complejos no covalentes que comprende un polipéptido Zvegf3 se pueden preparar mediante la incubación de un polipéptido Zvegf3 y un segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido Zvegf3 u otro polipétido de la familia PDGF/VEGF) a pH cercano al fisiológico. En una reacción típica, los polipéptidos a una concentración de aproximadamente 01-0.5 µg/µl se incuban a pH «7.4 en un amortiguador débil (por ejemplo, 0.01 M de amortiguador de fosfato o acetato); el cloruro de sodio se puede incluir a una concentración de aproximadamente 0.1 M. A 37°C, la reacción es esencialmente completa con 4-24 horas. Véase por ejemplo, Weintraub et al., Endocrinology 101:225-235, 1997. Los complejos covalentes pueden también hacerse por el aislamiento de los polipéptidos de componentes deseados y la combinación de estos in vi tro . Los complejos covalentes que pueden prepararse de esta manera incluyen, homodímeros de los polipéptidos Zvegf3, heterodímeros o dos diferentes polipéptidos Zvegf3, y heterodímeros de un polipéptido Zvegf3 y un polipéptido a partir de otro elemento de la familia de la familia de" proteínas VEGF/PDGF. Los dos polipéptidos son mezclados juntos bajo condiciones de desnaturalización y reducción, seguidas por la renaturalización de las proteínas por la remoción de los desnaturantes. La remoción se puede hacer por ejemplo, por diálisis o cromatografía de exclusión de tamaño, para proporcionar intercambio de amortiguador. Cuando se combinan dos diferentes polipéptidos, las proteínas renaturalizadas resultantes pueden formar homodímeros de los componentes individuales así como también heterodímeros de los dos diferentes componentes. Véase, Cao et al., J. Bi ol . Chem . 271:3154-3162, 1996. Dependiendo del uso propuesto, los polipéptidos y proteínas de la presente invención se pueden purificar a >80% de pureza, a >90% de pureza, hasta >95% de pureza, o a un estado farmacéuticamente puro, que es superior al 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos^ nucleicos y libres de agentes infecciones y pirogénicos. Las proteínas Zvegf3 recombinantes expresadas (incluyendo polipéptidos quiméricos y proteínas multimérica) , son purificadas por métodos convencionales de purificación de la proteína, típicamente por una combinación de técnicas cromatográficas . Véase er^ general, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988; y Scopes, R. (ed. ) Protein Purification: Principies and practice, Springer-Verlag, New York, 1994. Las proteínas que comprenden un extremo de afinidad de histidina (típicamente de aproximadamente 6 residuos de cisteína), se purifican por cromatografía de afinidad en una resina quelada de níquel. Véase por ejemplo, Houchuli et al., Bio/Technol . 6 : 1321-1325, 1988. Además, el mismo dominio del factor de crecimiento se enlaza a una resina de níquel a pH 7„8-8.0 y 25 mM de fosfato de Na, 0.25 M de NaCl. La proteína enlazada puede eluirse con un gradiente de pH descendiente, bajando a pH 5.0 ó un gradiente de imidazol. Las proteínas que comprenden un extremo glu-glu, pueden ser purificadas por cromatografía de inmunoafinidad , de conformidad con los procedimientos convencionales. Véase por ejemplo, Grussenmeyer et al. 9 idib. Las fusiones de la proteína de enlace a la maltosa se purifican en una columna de amilosa, de conformidad con los métodos conocidos en la técnica. Como se describe en más detalle abajo, la proteína del dominio del factor de crecimiento Zvegf3, se puede purificar usando una combinación de cromatografía en un intercambiador fuert( de cationes, seguido por una cromatografía de interacción hidrofóbica. Cuando la proteína se produce en las células BHK, la proteína 4 de enlace al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP4) co-purifica con Zvegf3 bajo estas condiciones. La purificación además, se puede obtener usando HPLC de fase inversa, intercambio aniónico o un intercambiador de catión fuerte de amina cuaternaria a baja fuerza iónica y pH de 7.0 a 9.0, o cromatografía de interacción hidrofóbica en una resina de éter fenilo. Se ha encontrado también que Zvegf3 se enlaza a varias' matrices de tinte (por ejemplo, BLUE1, BLUE2, ORANGE 1, ORANGE 3, y RED3 a partir de Lestón Scientific, Signal Hill, CA) , en PBS a pH 6-8, a partir del cual, la proteína enlazada se puede eluir en 1-2M de NaCl en 20 mM de amortiguador de ácido bórico a pH 8.8. La proteína eluida de RED3 se puede pasar sobre RED2 (Lestón Scientific) para remover los contaminantes restantes. Usando los métodos conocidos en la técnica, las proteínas Zvegf3 se pueden preparar como monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no, incluir un residuo de minoácido de metionina inicial. La invención además proporciona polipéptido que comprenden una porción que porta un epitope de una proteína como se muestra en la SEC ID NO : 2 , Un "epitope" es una región de una proteína a la cual se puede enlazar un anticuerpo. Véase por ejemplo, Geysen et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA ¡ : 3998-4002 , 1984. Los epitopes pueden ser lineales o conformacionales, el último está compuesto de regiones discontinuas de la proteína que forman un epitope después del repliegue de la proteína. Los epitopes lineales son generalmente al menos, 6 residuos de aminoácidos de longitud. Los péptidos sintéticos relativamente cortos que mimetizan parte de una secuencia de proteína, son rutinariamente capaces de estimular un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente mimetizada. Véase Sutcliffe et al., Sci ence 219: 660-666, 1983. Los anticuerpos que reconocen epitopes. lineales, cortas, son particularmente empleados en las aplicaciones de diagnóstico y analíticas que emplean proteína desnaturalizada, tal como el manchado Western (Tobin, Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 7j>: 4350-4356, 1979). Los anticuerpos a los péptidos cortos, pueden también reconocer proteínas en la conformación nativa y así, serán útiles para monitorear la expresión de la proteína y el aislamiento de la proteína, y en la detección proteínas Zvegf3 en solución, tal como por ELISA o en estudios de inmunoprecipitación. Los polipétidos antigénicos, que portan epítopes de la presente invención, son empleados para alcanzar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que específicamente se enlazan a una proteína Zvegf3. Los polipéptidos que portan epitopes antigénicas, contienen una secuencia de al menos seis, a menudo al menos nueve, más a menudo de 15 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína Zvegf3 (por ejemplo, SEC ID NO:2). Están incluidos los polipéptidos que comprenden una porción más larga de una proteína Zvegf3 es decir, de 30 a 50 residuos hasta la secuencia completa. Se prefiere que la secuencia de aminoácido del polipéptido que porta el epitope, se seleccione para proporcionar solubilidad substancial en los solventes acuosos, esto es que laf secuencia que incluye residuos relativamente hidrofílicos y residuos hidrófobos se evite substancialmente. Como se notó anteriormente, se prefiere de manera general, el uso algunas veces de péptidos más largos como inmunógenos, tales como un péptido que comprenden los residuos 80-104, 299-314 y 299-314, y 299-326 de la SEC ID NO : 2. El último^ polipéptido se puede preparar con un residuo cys N-terminal adicional para facilitar el acoplamiento. Como se usa aquí, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales, y fragmentos enlazantes al antígeno, tal como fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos intactos diseñados genéticamente, tales como los anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadenas únicas y similares, así como' también péptidos y polipéptidos de enlace antigénico sintético están también incluidos. Los anticuerpos no humanos pueden ser humanizados por el injerto del CDRs no humano en la estructura humana y regiones constantes, o por la incorporación de los dominios variables no humanos completos (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie similar a la humana, por el reemplazo de residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "revestido"). En algunos ejemplos, los anticuerpos humanizados pueden retener los residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de región variable humana para incrementar las características de enlace propias. A través de los anticuerpos humanizados! se puede incrementar la vida media biológica, y se reduce el potencial para las reacciones inmunes adversas después de la adminis ración a humanos. Los anticuerpos monoclonales pueden también producirse en ratones que han sido alterados genéticamente para producir anticuerpos que tienen una estructura humana. Los métodos para la preparación y asilamiento de anticuerpos monoclonales y policlonales, son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Cooligan, et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R., (ed.), Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982. Como podrá ser evidente para uno de habilidad ordinaria en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden generar a partir de una variedad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollitos, conejos, ratones y ratas con un polipéptido Zvegf3 o un fragmento del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido Zvegf3 se puede incrementar a través del uso de un adyuvante, tal comí alum (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto Freund. Los polipéptidos empleados para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión tales como fusiones de Zvegf3 o una porción de la misma, con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína de enlace a la maltosa. Si la porción de polipéptido es "similar al hapteno", tal porción puede ser unida ventajosamente o ligada a un portador macromolecular (tal como hemocianina del linfo clave (KHL), albúmina de suero bovino (BSA), o tetanus toxoide) para inmunización. Las técnicas alternativas para la generación o selección de anticuerpos incluye, exposición in vi tro de los linfocitos a la proteína o péptido Zvegf3, y selección de los anticuerpo que presentan bibliotecas en los vectores fago o similares (por ejemplo, a través del uso de una prcteína o péptido Zvegf3 etiquetado o inmovilizado) . Las técnicas para la creación y de tales péptidos aleatorios que presentan bibliotecas, se conocen en la técnica (Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5,223,409; Ladner et al., Patente Estadounidense No. 4,946,778; Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5,403,484 y Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5,571,698), y péptidos aleatorios presentan bibliotecas y equipos para la selección de tales biblioteca, están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc.

(San Diego, CA) , New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . El péptido aleatorio que presenta bibliotecas se puede seleccionar usando las secuencias Zvegf3 descritas aquí para identificar proteínas las cuales se enlazan al Zvegf3. Estas "proteínas enlazantes", las cuales interactúan con los polipéptoidos Zvegf3, se pueden usar para señalar células o para aislar polipéptidos homólogos por purificación de afinidad, o pueden ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares. Estas proteínas enlazantes se pueden usar en métodos analíticos, tales como para la selección de expresión de bibliotecas y actividad neutralizante; dentro de los ensayos de diagnósticos j^ tales como para determinar los niveles circulantes de los polipéptidos; para detectar o cuantificar polipéptidos solubles como marcadores de patología o padecimiento fundamental; y como antagonistas de Zvegf3 para bloquear el enlace Zvegf3 y la transducción de la señal in vi tro e in vivo . (flb Los anticuerpos se determinan por estar específicamente enlazados si se enlazan al polipéptido Zvegf3, péptido o epitope con una afinidad de la menos, 10 veces superior que la afinidad de enlace de control del polipéptido o proteína (no Zvegf3). En este sentido, un "polipétpdido no Zvegf3" incluye las moléculas relacionadas VEGF,, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDGF-A y PDGF-B, pero excluye a los polipéptidos Zvegf3 de las especies no humanas. Debido al alto nivel de la identidad de secuencia de aminoácido esperada entre los ortólogos Zvegf3, los anticuerpos específicos para Zvegf3, pueden también enlazarse a Zvegf3 a partir de otras especies. La afinidad de enlace de un anticuerpo se puede determinar fácilmente por una de habilidad ordinaria en la técnica, por ejemplo, por análisis Scatchard (Scatchard, G. , Ann .-NY Acad. Sci . !5_: 660-672, 1949). Los métodos para la selección y aislamiento de los anticuerpos específicos,! son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Paul (ed.), Fundamental Immunology, Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv . in Imm unol . 43_:l-98, 1988; Goding, J.W. (ed. ) , Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Ltd., 1996; Benjamín et al., Ann . Rev. Immunol . 2 : 67-101, 1984. Una variedad de ensato conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden utilizar para detectar anticuerpos los cuales se enlazan específicamente a las proteínas o péptidos Zvegf3. Los ensayos ejemplares se describen en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: imunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmuno-precipitación, ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) , manchado dot o ensayo de manchado Western, ensayo de inhibición o competición, y ensayo intercalado. Ad.emás, los anticuerpos se pueden seleccionar por enlazarse a tipos nativos contra las proteínas o polipéptidos Zvegf3 mutantes. Los anticuerpos a Zvegf3 se pueden usar para señalar células que expresan Zvegf3; para aislar Zvegf3 por purificación de afinidad; para ensayos ^4v diagnósticos para determinar los niveles de circulación de los polipéptidos Zvegf3; para detectar o cuantificar el Zvegf3 soluble como un marcador de patología o padecimientos fundamentales; en métodos analíticos empleando FACS; para la selección de las bibliotecas de expresión; para la generación de anticuerpos anti( idiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear la actividad Zvegf3 in vitro e in vivo. Los extremos directos adecuados o etiquetas, incluyen radionúclios, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y las similares; los extremos indirectos o etiquetas, pueden usar características de biotina-avidina u otros pares complemento/anticomplementos como intermediarios. Los anticuerpos pueden también ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados se pueden usar para las aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo. Sin embargo, los anticuerpos a Zvegf3 o fragmentos de los mismos, se pueden usar in vitro para dirigir el Zvegf3 desnaturalizado o fragmentos de los mismos en ensayos, por ejemplo, Manchados Western u otrod^^ ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos también se pueden usar para señalar una porción de diagnóstico o terapéutica unida para células que expresan Zvegf3 o receptores para Zvegf3. Para algunas aplicaciones (por ejemplo, ciertas aplicaciones terapéuticas9 , es preferido usar anticuerpo( neutralizantes. Como se usa aquí, el término "anticuerpo neutralizante" denota un anticuerpo que inhibe al menos 50% de la actividad biológica del antígeno cognato cuando el anticuerpo se agrega a un acceso de 100 partes molares. Aquellos de habilidad en la técnica, reconocerán que la actividad neutralizante superior es algunas veces deseable, y los anticuerpos que proporcionan 50% de inhibición a un exceso molar de 100 partes o 10, pueden ser ventajosamente empleados. La actividad de las proteínas Zvegf3 y antagonistas de los mismos, se puede medir in vitro usando células cultivadas o in vivo por la administración de moléculas de la invención reivindicada a un modelo animal apropiado. Las células objetivo para usarse en los ensayos de la actividad Zvegf3, incluyen las células vasculares (especialmente células endoteliales y células del músculo liso) , células hematopoiéticas (mieloide y^B linfoide); células de hígado (incluyendo hepatocitos, células endoteliales fenestradas, células Kupffer, y células Ito) , fibroblastos (incluyendo fibroblastos dérmicos humanos y fibroblastos de pulmón) , células de neuritas (incluyendo astrositos, células gliales, células dnetríticas, y células PC-12), células Schwann, célulai de pulmón fetal, sinoviocitos articulares, pericitos, condorcitos, oligodendrocitos, osteoblastos y otras células que expresan a los receptores alfa de PDFG.

Las proteínas Zvegf3 se pueden analizar por la actividad de enlace al receptor, por una variedad de métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo los ensayos de competición del receptor (Bowen-Pope y Ross, Methods Enzymol . 109 : 69-100, 1985), uso de receptores solubles, y uso de receptores producidos como proteínas de fusión IgG (Patente Estadounidense No. 5,759,375). Los ensayos de enlace al receptor se pueden realizar en líneas celulares que contienen receptores de la superficie celular conocidos para evaluación. Los receptores se pueden presentar naturalmente en la célula, o pueden ser receptores recombinantes expresados por células diseñadas por ingeniería genética. Los tipos celulares que son capaces de enlazarse a Zvegf3 ser identificados a través del uso de conjugados de Zvegf3-toxinas, tales como los conjugados de una proteína Zvegf3 y saporina. El enlace del conjugado Zvegf3-toxina por las células, ya sea en el cultivo de tejido, en cultivos de órganos, o en series in vivo, permitirá la incorporación del conjugado en la célula. Una vez que e interior de la célula saporina tiene un efecto tóxico en la célula, la mata. Esta actividad puede usarse para identificar tipos celulares que son capaces de enlazarse e internalizar el Zvegf3. Además, para permitir la identificación de los tipos celulares responsables, se pueden usar los conjugados de toxina en estudios in vivo, para identificar órganos y tejidos, en donde el Zvegf3 tiene una actividad biológica por la observación de la patología dentro del animal después de la inyección del conjugado . La actividad de las proteínas Zvegf3 se puede medir in vitro usando células cultivadas. La actividad mitogénica se puede medir usando ensayos, incluyendo 3H-timidina, ensayos de incorporación (como se describe mediante por ejemplo, Raines y Ross, Methods Enzymol . 1^9:749-773, 1985 y Wahl et al., Mol. Cell Biol . 8_:5016-5025, 1988), ensayos de incorporación de tinte (como s^B describe por ejemplo, Mosman, J. Immunol . Meth . 65 : 55-63, 1983 y Raz et al., Acta Trop . 68^:139-147, 1997) o conteos celulares. Los ensayos de mitogénesis adecuados miden la incorporación d.e 3H-timidina en (1) cultivos de confluentes al 20% observados por la capacidad de las proteínas Zvegf3 para estimular además, la proliferación de las células, y (2) células quiescentes mantenidas a confluencia por 48 horas observados por la capacidad de las proteínas Zvegf3 para superar la inhibición del crecimiento inducida por el contacto. Los ensayos de incorporación de tintes adecuados incluyen medición de la incorporación del tinte Alamar azul (Raz et al, ibid.) en las células objetivos. Véase también, Gospodarowicz et al., J. Cell . Biol . 7_0: 395-405, 1976; Ewton y Florini, Endocrinol . 106:577-583, 1980; y Gospodarowicz et al., Proc. Na tl . Aca d . Sci . USA 8_6: 7311-7315 , 1989. La™ diferenciación celular puede ensayarse usando células precursoras adecuadas que se pueden inducir para diferenciarlas en un fenotipo más maduro. Por ejemplo, las células endoteliales y células hematopoieticas, derivadas de una célula ancestral común, el. hemangioblasto (Choi et al., Devel opmen t 125 : 725-732 , 1998). Las células derivadas mesenquimales también S€^v pueden usar para medir la habilidad de la proteína Zvegf3 para estimular la diferenciación en los osteoblastos. La diferenciación está indicada por la expresión de la osteocalcina, la habilidad de las células para mineralizarse y la expresión de la fosfatasa alcalina, de las cuales todas se pueden medir por métodos de rutina conocidos en la técnica. Los efectos de las proteínas Zvegf3 en el crecimiento de las células tumorales y la metástasis pueden ser analizados usando el modelo de carcinoma de pulmón de Lewis, por ejemplo, como se describe Cao, et al., J. Exp . Med. 182:2069-2077, 1995. La actividad de las proteínas Zvegf3 en las células de origen neural se pueden analizar usando ensayos que miden los efectos en el crecimiento de la neurita. La actividad Zvegf3 puede también detectarse usando los ensayos designados para medir la producción inducida por Zve?jf3 de uno o más factores de crecimiento adicionales u otras macromoléculas. Tales ensayos incluyen aquellos para determinar la presencia del factor de crecimiento del hepatocito (HGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor alfa de crecimiento de transformación (TGFa) , interleucina-6 (IL-6), VEGF, factor de crecimiento del fibroblasto acídico (aFGF) ^ angiogenina. Los ensayos adecuados incluyen ensayos de mitogénesis usando células objetivos responsables a las macromoléculas de interés, ensayos de enlace al receptor, ensayos de enlace de competición, ensayos inmunológicos (por ejemplo, ELISA), y otros formatos conocidos en la técnica. La secreción de las metaloproteinasas se mide partir de fibroblastos dérmicos humanos primarios tratados, sinoviocitos y condrocitos . Los niveles relativos de la colagenasa, gelatinasa y estromalisina producidos en respuesta al cultivo en la presencia de una proteína Zvegf3, se miden usando geles de zimogramo (Loita y Steler-Stevenson, Cáncer Biology .1:96-106, 1990). La síntesis de procolágeno/colágeno para fibroblastos dérmicos y condrocitos en respuesta a una proteína de prueba se mide usando la incorporación de 3H-prolina en el colágeno secretado incipiente. El colágeno 3H-etiquetado es visualizado por SDS-PAGE, seguido por autoradiografía (Unemori y Amento, J. Bi ol . Chem . 265 : 10681-10685, 1990) . La secreción de glicosaminoglicano (GAG) , a partir de los fibroblastos dérmicos y condrocitos es medida usando un ensayo de enlace de tinte 1 , 9-dimetilmetileno azul (Farndale et al., Biochim . Bi ophys . Acta 88J3: 173-177 , 1986). Los ensayos GAG y d<f colágeno también se llevan a cabo en la presencia de IL-lß o TGF-ß para examinar la habilidad de la proteína Zvegf3 para modificar las respuestas establecidas a estas citocinas . Los ensayos de la activación del monocito se llevan a cabo (1) para observar la habilidad de la{ proteínas Zvegf3 para estimular además, la activación del monocito, y (2) examinar la habilidad de las proteínas Zvegf3 para modular la activación del monocito inducida por la endotoxina o inducida por la unión (Fuhlbrigde et al., et al., J. Immunol . 138_: 3799-3802 , 1987). Los niveles IL-lß y TNFa producidos en respuesta a la activación, se miden por ELISA (Biosource, Inc, Camarillo, CA) . Las células del monocito/macrófago, en virtud de CD14 (receptor LPS), son exquisitamente ( sensibles a la endotoxina, y las proteínas con niveles moderados de actividad similar a la endotoxina, activarán a estas células. La actividad hematopoietica de las proteínas Zvegf3 se puede ensayar en las varias células hematopoiéticas en cultivo. Los ensayos adecuados incluyen ensayos de la colonia de leucocitos de la sangre periférica o de la médula ósea, y ensayos de colonia! restringidas al linaje en la última etapa, los cuales se conocen en la técnica (por ejemplo, Holly et al., Publicación WIPO WO 95/21920) . Las células de la médula colocadas en un medio adecuado, semi-sólido (por ejemplo, metilcelulosa al 50% que contiene suero de bovino fetal al 15%, albúmina de suero bovino al 10%, y mezcla antibióticos PSN al 0.6%), se incuban en la presencia del polipéptido d.e prueba, después se examina microscópicamente por la formación de colonias. Los factores hematopoieticos se usan como controles. La actividad mitogénica de los polipéptidos Zvegf3 en las líneas celulares hematopoieticas se puede medir usando ensayos de incorporación de 3H-timidina, ensayos de incorporación de tinte, o conteos celulares (Raines y Ross, Methods Enzymol. 109:749-773, 1985 y Foster et al., Patente Estadounidense No. 5,641,655). Por ejemplo, las células son cultivadas en placas microtituladoras de pozos múltiples. Se agregan las muestras de prueba y las 3H-timidinas , y las células se incuban durante la noche a 37°C. Los contenidos de los pozos se transfieren a los filtros, se secan, y cuentan para determinar la incorporación de la etiqueta. La proliferación celular puede también medirse usando un ensayo basado en el rompimiento metabólico de bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) (Mosman, ibid) . Brevemente, una solución de MTT se agrega a 100 µl de células de ensayo, y las células se incuban a 37°C. Después de 4 horas, se agregan 200 µl de 0.04 N de HCl en isopropanol, la solución se mezcla, y 1? absorbencia de la muestra se mide a 570 nm. La migración celular se ensaya esencialmente como se describe por Kálher ( Arteri osclerosi s , Trombosi s , and Va scular Bi ol ogy _17_: 932-939, 1997). Una proteína se considera como quimiotáctica si se induce la migración de las células a partir de un área de concentración de proteína baja a un área de concentración de proteína alta. El ensayo se realiza usando cámaras Byoden modificadas con una membrana de poliestireno que separa a las dos cámaras (Transwell; Corning Costar Corp.). La muestra de prueba, diluida en un medio que contiene BSA al 1%, se agrega a la cámara inferior de una placa que contiene 24 pozos Transwells. Las células son entonces colocadas en el inserto Transwell que ha sido previamente pretratado con gelatina al 0.2%. La migración celular se mide después de 4 horas de incubación a 37°C. Las células que no migran se limpian en la parte superior de membrana Transwell, y las células unidas en la cara inferior de la membrana se fijan y tiñen con violeta de cristal al 0.1%. Las células teñidas son entonces extraídas con ácido acético al 10% y la absorbancia se mide a 600 nm. La migración entonces se calcula a partir de una curva de calibración estándar. La migración de las células del músculo suave (SMC) se puede medir en el ensayo explanta aórtica de Kenagy et al. ( Circula ti on 96:3555-3560, 1997). En un protocolo típico, las explantas son preparadas a partir de aortas torácicas de babuino, y el medio interno se aisla y recorta en piezas de 1-mm2. Las explantas se colocan en matraces de cultivo de tejidos que contienen DMEM suplementado con 5 µg/ml de transferina, 6 µg/mL de insulina, 1 mg/ml de ovalbúmina, y el compuesto de prueba. El numero de células migrantes se determina diariamente . La actividad de la adhesión celular se ensaya esencialmente como se describe por LaFleur et al., (J. Biol . Chem . 272: 32798-32803, 1997). Brevemente, las placas microtituladoras son revestidas con la proteína dé prueba, los sitios no específicos son bloqueados con BSA, y las células (tales como células del músculo liso' células de leucocitos o endoteliales), se colocan a una densidad de aproximadamente 104 -105 células/pozo. Los pozos se incuban a 37 °C (típicamente por aproximadamente 60 minutos), después las células no adherentes se remueven por lavado uniforme. Las células adheridas se cuantifican por métodos convencionales (por ejemplo, po' el teñido con violeta de cristal, sometiendo a lisis las células, y determinar la densidad óptica del lisado). Los pozos de control se revisten con una proteína adhesiva conocida, tal como fibronectina o vitronectina. Los ensayos para la actividad angiogénica también se conocen en la técnica. Por ejemplo, el efecto de las proteínas Zvegf3 en las células endoteliales primordiales en la angiogénesis se puede ensayar en el ensayo de la angiogénesis de la membrana corialantoica de pollito (Leung, Sci en ce 246: 1306-1309, 1989; Ferrara, Ann . NY Acad. Sci . 752:246-256, 1995). Brevemente, una ventana pequeña se corta en la cascara o concha de un huevo fertilizado de ocho días de edad, y se aplica una sustancia de prueba a la membrana corialantoica. Después de 72 horas, la membrana se examina para neovascularización. Otros ensayos adecuados incluyen la microinyección de embriones de codorniz de etapa temprana ( Coturnix co turnix j apóni ca ) como se describe por Drake et al. ( Proc . Na t l . Aca d . Sci . USA 92:7657-7661, 1995); el modelo de roedor de neovascularización corneal descrito por Muthukkaruppan y Auerbach ( Sci en ce 205:1416-1418, 1979), en donde una sustancia de prueba se inserta en una cavidad en la córnea de un ratón endogámico; y ensayo de abazón de hámster (Hóckel et al., Arch . Surg. 128: 423-429, 1993). La inducción de la permeabilidad vascular, la cual es indicativa de la actividad angiogénica, se mide en ensayos designados para detectar el debilitamiento de la proteína a partir de la vasculatura de un animal de prueba (por ejemplo, ratón o cobayo) después de la administración de un compuesto de prueba (Miles y Miles, J. Physi ol . 118 :228-257, 1952; Feng et al., J. Exp . Med . 183: 1981-1986, 1996). Los ensayos in vi tro para la actividad angiogéncia incluyen el modelo de matriz en gel de colágeno tridimensional (Pepper et al., Biochem . Bi ophys . Res . Comm . 189:824-831, 1992 y Ferrara et al., Ann . NY Acad. Sci . 73_2: 246-256, 1995), los cuales miden la formación de las estructuras similares a los conductos por las células endoteliales microvasculares; y modelos de matrigel (Grant et al., "Angiogenesis as a component of epithelial-mesenchymalj interactions" en Goldberg y Rosen, Epi thel ia l -Mesenchymal In tera cti on in Cáncer, Birkháuser Verlag, 1995, 235-248; Baatout, An ti cancer Research 1_7_: 451-456, 1997), los cuales son usados para determinar los efectos en la migración celular y la formación de conductos por las células endoteliales sembrando en matrigel, un de membrana basal enriquecido en laminina. Los ensayos de angiogénesis se pueden llevar a cabo en la presencia y ausencia de VEGF para valorar los efectos combinatoriales posibles. El VEGF puede ser usado como un control dentro de los ensayos in vi vo . La actividad Zvegf3 se puede medir también usando ensayos que miden la guía y crecimiento del axón. De interés particular son los ensayos que indican los cambios en los patrones de crecimiento de la neurona, por ejemplo, aquellos descritos en Hastings, WIPO Publicación 97/29189 y Walter et al., Devel opmen t 101: 686-96, 1987. Los ensayos para medir los efectos en el crecimiento de la neurona son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo C (por ejemplo Raper y Kapfthammer, Neuron 4_:21-9, 1990 y Luo et al. Cel l 75:219-27 , 1993), se pueden usar para determinar la actividad colapsante de Zvegf3 en las neuronas en crecimiento. Otros métodos que pueden valorar los efectos inducidos por Zvegf3 en la extensión de la neurita también se conocen. Véase Goodman, Annu . Rev . Neurosci . 19 : 341-77 , 1996. El medio acondicionado a partir de las células que expresan una proteína Zvegf3, un agonista Zvegf3, o un antagonista Zvegf3, o agregados de tales células, se pueden colocar en células neurales adecuadas cercanas a la matriz de gel, tales como ganglio de raíz dorsal (DRG), o explantas de ganglios simpatéticos, los cuales se han co-cultivados con el factor de crecimiento del nervio. Comparadas con las células de control, se pueden medir los cambios inducidos por Zvegf3 en el crecimiento de la neurona (como se describe mediante por ejemplo, Messersmith et al., Neuron 1_4: 949-59, 1995 y Puschel et al., Neuron 14_: 941-8, 1995). Del mismo modo el tumor o protuberancia de la neurita se puede medir usando crecimiento en suspensiones celulares neuronales en la presencia de moléculas de la presente invención. Véase por ejemplo, O'Shea et al., Neuron 1_: 231 -1 , 1991 y DeFreitas et al., Neuron 15_:333-43, 1995. Las actividades biológicas de las proteínas Zvegf3 se pueden estudiar en animales no humanos por la administración de la proteína exógena, por la expresión! de los polinucleótidos que codifican a Zvegf3, y por la supresión de la expresión de Zvegf3 endógena a través de las técnicas antisentido o de noqueo . Las proteínas Zvegf3 pueden ser administradas o expresadas individualmente, en combinación con otras proteínas Zvegf3, o en combinación con proteínas no Zvegf3,? incluyendo otros factores de crecimiento, (por ejemplo, otros VEGFs, PIGFs o PDGFs). Por ejemplo, una combinación de los polipéptidos Zvegf3 (por ejemplo, una combinación de Zvegf3i5-163, Zvegf3?5-230, y Zvegf3235.345) , se pueden administrar a un animal de prueba o expresarse en el animal. Los animales de prueba son monitoreados por cambios en tales parámetros como señales clínicas, peso corporal, conteos de células sanguíneas, química clínica, histopatología y similares. Los efectos de los antagonistas Zvegf3 y Zvegf3 en la fibrosis de hígado y de riñon, se pueden probar en modelos de animales conocidos, tales como el modelo de ratón db/db descrito por Cohén et al., Diabetol ogia 39^:270-274, 1996 y Cohén et al., J. Clin . Invest . 9_5: 2338-2345, 1995 o modelos de animales transgénicos (Imai et al., Con trib . Nephrol . 107:250-215, 1994). Los efectos en la fibrosis se pueden ensayar! en un modelo de ratón, usando bleomicina. El agente de quimioterapia bleomicina es un agente causativo conocido de la fibrosis pulmonar en humanos y puede inducir padecimientos pulmonares intersticiales en ratones, incluyendo un incremento en el número de fibroblastos, deposición de colágeno incrementada, y remodelación de matriz disregulada. A ratones C57BI/6 se les administró bleomicina mediante una mini bomba osmótica por 1 semana. Siguió un periodo de inflamación, con toxicidad cutánea comenzando aproximadamente 4-7 días después de la administración de la bleomicina y continuando por aproximadamente una semana, después de lo cual, los ratones parecen recuperar la salud. Aproximadamente 3-4 semanas después de terminar el suministro de bleomicina, los ratones se sacrificaron y los pulmones se examinaron histológicamente para las señales de las fibrosis. El registro de basa en la extensión de las lesiones fibróticas del pulmón, y su severidad. El suero se ensaya por la deshidrogenasa láctica, una enzima intracelular que es liberada en la circulación después del daño o muerte celular general. El tejido del pulmón es ensayado-por la hidroxiprolina como una medida de la deposición de colágeno . La estimulación del crecimiento colateral coronario se pude medir en modelos de animales conocidos, incluyendo un modelo de conejo de isquemia de la extremidad periférica e isquemia de la extremidad trasera y en un modelo de cerdo de isquemia miocardial crónica (Ferrara et al., Endocrine Revi ews 33_:4-25, 1997). Las proteínas Zvegf3 se ensayan por la presencia o ausencia de VEGFs, angiopoiet inas , y FGF básico, para probar los efectos combinatoriales . Estos modelos se pueden modificar por el uso de un ADN puro o adenovirus para el suministro del gen como se describe en más detalle abajo, resultando en la expresión local de la proteína o proteínas de prueba. . La eficacia de los polipéptidos Zvegf3 en la promoción de la curación de heridas se puede ensayar en modelos animales. Uno de tales modelos es el modelo de incisión lineal en la piel de Mustoe et al. ( Sci ence 237 : 1333, 1987). En un procedimiento típico, se hace una incisión de 6 cm en la piel dorsal de una rata adulto, después se cierra con sujetadores de heridas. Las substancias de prueba y los controles (en forma de solución, gel o polvo) se aplican antes del cierre primario. La administración a menudo se limitará a unalj aplicación única, a pesar de que se pueden hacer aplicaciones adicionales en los días subsecuentes por la inyección cuidadosa a varios sitios bajo la incisión. La fuerza de rompimiento de herida se evalúa entre 3 y 21 días posteriores a la curación. En un segundo modelo, se hacen las excisiones completamente gruesas, pequeñas,| múltiples en la oreja de un conejo. El cartílago en la oreja une la herida, removiendo la variable de contracción de la herida de la evaluación de cierre. Se aplicaron los tratamientos experimentales y de control. La geometría y anatomía del sitio de herida permitió la cuantificación confiable del crecimiento de las células y la migración epitelial, así como también el análisis cuantitativo de la bioquímica de las heridas (por ejemplo, contenido de colágeno) . Véase Mustoe et al., J Cl in . Inves t . 8_7:6974, 1991. El modelo de oreja de conejo se puede modificar para crear un ambiente de lesión isquémica el cual está más estrechamente reunida en la situación clínica (Ahn et al., Ann . Pla s t . Surg. 24:17, 1990). Dentro de un tercer modelo, se evaluó la curación de heridas en la piel de grosor parcial en cerdos o cobayos (LeGrand et al., Growth Fa ctors 8_:307, 1993). Se aplicaron tratamientos experimentales diariamente o direcciones. Siete días después de la lesión, se determinó el grosor del tejido de granulación. Este modelo es particularmente útil para los estudios de respuesta a las dosis, por lo tanto son más cuantitativos que otros modelos in vivo de curación de heridas. Un modelo de escisión de grosor completo se puede también^^ emplear. Dentro de este modelo, la epidermis y la dermis son removidas hacia abajo del panículo carnoso en roedores o la grasa subcutánea en cerdos. Se aplicaron los tratamientos experimentales tópicamente en o bajo una dirección, y pueden ser aplicados diariamente si se desea. La herida cierra por una combinación de la contracción y crecimiento hacia dentro y proliferación. Los puntos finales medibles incluyen tiempo de cierre de herida, registro histológico y parámetros bioquímicos de tejido lesionado. Los modelos de curación de heridas desiguales también se conocen en la técnica (por ejemplo, Cromack et al., Surgery 113:36, 1993; Pierce et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 86:2229, 1989; Greenhalgh et al., Amer J. Pa thol . 136: 1235, 1990). El retraso o prolongación del proceso de curación de heridas se puede inducir farmacológicamente por el tratamiento con esteroides, irradiación del sitio de la herida, o por estados de padecimientos concomitantes (por ejemplo diabetes). Las incisiones lineales o escisiones de grosor completo son más comúnmente usadas como la herida experimental. Los puntos finales son como se describen anteriormente para cada tipo de herida. Los implantes subcutáneos se pueden usar para valorar los compuestoA que actúan en los estados tempranos de curación de heridas (Broadley et al., Lab . Inves t . 61:571, 1985; Sprugel et al., Amer. J. Pa thol . 129: 601, 1987). Se prepararon los implantes en un contenedor relativamente no inflamatorio, poroso (por ejemplo, esponjas de polietileno o implantes de politetrafluoroetileno expandido rellenos como colágeno bovino) y colocados subcutáneamente en ratones o ratas. El interior del implante está vacío de células, producen un "espacio de lesión" que está bien definido y se puede separar del tejido preexistente. Este arreglo permite la valoración del influjo celular y el tipo celular así como también la medición de la vasculogenesis/angiogénesis y producción de matriz extracelular. La expresión de las proteínas Zvegf3 en animales, proporciona modelos para el estudio de los efectos biológicos de la sobreproducción o inhibición de{ la actividad de la proteína in vivo . Los polinucleótidos Zvegf3 se pueden introducir en animales de prueba, tales como ratones, usando vectores virales o ADN puros, o se pueden producir los animales transgénicos. En general, una proteína Zvegf3 es expresada con un péptido secretorio. Los péptidos secretorios incluyen al péptidoßfc secretorio Zvegf3 (por ejemplo, residuos 1-14 de la SEC ID NO:29 y los péptidos secretorios heterólogos. Un péptido secretorio heterólogo ejemplar es aquel del activador del plasminógeno del tejido humano (t-PA). El péptido secretorio t-PA puede modificarse para recudir el desdoblamiento proteolítico indeseado como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,641,655. Las proteínas de la presente invención se pueden ensayar in vivo usando sistemas de liberación virales. Los virus ejemplares incluyen adenovirus, virus del herpes, retrovirus, virus vaccinia, y virus adenoasociados (AAV) . Para una revisión, véase Becker et al., Meth . Cell . Bi ol . . £3:161-89; y Douglas y Curiel, Scien ce & Medi cine £j_44-53, 1997. El adenovirus (revisado por Becker et al., Meth Cell Biol . 43: 161-89, 1994 y Douglas y Curiel, Science & Medi cine £:44-53, 1997). Ofrece varias ventajas. El adenovirus puede (i) acomodar^ insertos de ADN relativamente grandes; (ii) crecer a tituladores altos; (iii) infectar un rango amplio de tipos de células de mamíferos, y (iv) usarse con muchos promotores diferentes incluyendo promotores ubicuitos, específicos del tejido y regulables. Debido a que los adenovirus son estables en la corriente sanguínea, ser administrados por inyección intravenosa. Si el sistema de liberación o suministro adenoviral tiene una supresión del gen El, el virus no se puede replicar en las células hospederas. Sin embargo, el tejido hospedero (por ejemplo, hígado) expresará y procesará (y si una secuencia de señal secretoria está presente, secreta) la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en la circulación en el hígado altamente vascularizado y se pueden determinar los efectos en el animal infectado. Los vectores adenovirales que contiene varias supresiones de los genes virales se pueden usar en un intento por reducir o eliminar las respuestas inmunes al vector. Tales adenovirus son El suprimidos, y además, contienen supresiones de E2A o E4 (Lusky et al., J Virol . 72 : 2022-2032, 1998; Raper et al., Human Gene Therapy 9 : 671-679, . 1998). Además, la supresión de E2b se reporta por reducir las respuestas inmunes (Amalfitano, et al., J Vi rol 72 : 926-933, 1998)- La generación de adenovirus así llamados "excesivos" en donde todas las unidades de transcripción virales están suprimidas, es particularmente ventajosa para la inserción de insertos grandes de ADN heterólogo. Para una revisión, véase Yeh y Perricauder, FASEB J. 11: 615-623, 1997. Los vectoreA retrovirales se describen pro ejemplo, por Anderson et al., Patente Estadounidense No. 5,399,346; Mann et al., Cel l 33:153, 1983; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,650,764; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol 62:1120, 1980; Temin et al., Patente Estadounidense No. 5,124,263; Dougherty et al., WIPO Publicación WO 95/07358; y Kuo et al.,. Bl ood 82_: 845, 1993. En un método alternativo, se puede introducir un vector por la transfección mediada por las liposomas, una técnica que proporciona ciertas ventajas prácticas, incluyendo la señalización molecular de las liposomas a las células específicas. La dirección de la transfección a los tipos celulares particulares es ventajosamente particular en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, riñon y cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas para los, propósitos de señalización. Los péptidos objetivo o de señalización (por ejemplo hormonas o neurotransmisores), proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas, se pueden acoplar a las liposomas químicamente . Dentro de otra modalidad, las células son removidas del animal, el ADN es introducido como un plasmido ADN puro. Las células transformadas son entonces re-implantadas en el cuerpo del animal. Los vectores ADN puro se pueden introducir en las células hospederas deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación de fosfato de calcio, uso de un disparador de gen o uso de un transportador del vector de ADN. Véase por ejemplo, Wu et al., J Biol . Chem . 267 : 963-7, 1992; Wu et al., J. Biol . Chem . 263: 14621-4, 1988. También se pueden generar ratones diseñados por ingeniería genética que expresan el gen Zvegf3, referido como "ratones transgénicos" y ratones que presentan una ausencia completa de la función del gen Zvegf3, referido como un "ratón noqueado", (Snouwaert et al., Scien ce 257: 1083, 1992; Lowell et al., Na ture ' 366:740-42; 1993; Capecchi, Science244: 1288-1292, 1989; Palmiter et al., Ann . Rev. Genet . 20: 465-499, 1986). Los experimentos transgénicos se pueden realizar usando ratones normales o ratones con padecimientos genéticos u otros fenotipos alterados. Los ratones transgénicos que sobre expresan Zvegf3, ya sea ubicuitamente o bajo un| promotor restringido del tejido o específico del tejido, se pueden usar para determinar si la sobre expresión causa o no un cambio químico. Los promotores adecuados incluyen promotores del gen de la albúmina de metalotioneina (Pinker, et al., Genes Dev. 1 ( 3 ): 268-76, 1987) y queratinocito K-14 (Vassar et al., Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 86 ( 5 ): 1563-1567 , 1989). El promotor de la metalotioneina-1 (MT-1) proporciona expresión en el hígado y otros tejidos, a menudo conduciendo a niveles altos de la proteína circulante. La sobre expresión de un polipéptido Zvegf3 de tipo nativo, fragmento de polipéptido o un mutante del mismo, puede alterar los procesos celulares normales, resultando en un fenotipo que identifica un tejido en el cual la expresión Zvegf3 es funcionalmente relevante y puede indicar un objetivo terapéutico para el Zvegf3, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, se puede diseñar genéticamente un ratón1 transgénico para sobre expresar una secuencia Zvegf3 de longitud completa,, la cual puede resultar en un fenotipo que muestra similitud con los padecimientos humanos. De manera similar, los ratones Zvegf3 se pueden usar para determinar si el Zvegf3 es absolutamente requerido in vivo . El fenotipo de ratones golpeados se predice de losl efectos in vivo de los antagonistas Zvegf3. Los ratones noqueados pueden también ser usados para estudiar los efectos de las proteínas Zvegf3 en modelos de padecimientos incluyendo, por ejemplo, cáncer, arterosclerosis , artritis reumatoide, isquemia, padecimientos cardiovasculares. El ANDc de Zvegf3 humano, se puede usar para aislar el ADNc, ARNm y ADN genómico de Zvegf3 como se describe anteriormente, los cuales son subsecuentemente usados para generar ratones noqueados. Estos ratones pueden ser empleados para estudiar el gen ^ Zvegf3 y la proteína codificada por este en un sistema in vivo, y pueden ser usados como modelos in vivo para los padecimientos humanos correspondientes. Sin embargo, los ratones transgénicos que expresan los polinucleótidos antisentido Zvegf3 o ribozimas dirigidas contra Zvegf3 descritas aquí, se pueden usar análogamente para ratones noqueados descritos aquí. ^ La relación funcional entre los ligandos Zvegf3 y PDGF, se puede investigar a través de los experimentos de golpeteos. Por ejemplo, el gen PDGF A ó PDGF B en un animal, se puede reemplazar por el golpeteo de un gen Zvegf3 o ADNc en un locus o sitio genómico de un ligando PDGF en células originarias embriónicas (ES) , las cualesA son entonces usadas para generar los ratones noqueados, en los cuales, la proteína Zvegf3 es expresada por el locus o sitio genómico PDGF (reemplazado) . Tales ratones noqueados se pueden usar para dirigir un número de cuestiones, tal como si el Zvegf3 pueda sustituir la función PDGF durante el desarrollo, si el Zvegf3 tiene funciones únicas; y, usando las líneas celulares establecidas a partir del ratón, el mecanismo de la traducción de señal Zvegf3. Véase por ejemplo Wang et al., Development 124: 2507-2513, 1997; Zhuang et al., Mol . Cel l Bi ol . 18_: 3340-3349, 1998; Geng et al., Cel l 97:767-777, 1999. En una solicitud adicional de esta tecnología, los dominios individuales de Zvegf3 se pueden suprimir o modificar específicamente por el golpeteo en una secuencia Zvegf3 modificada o una versión específica unida de Zvegf3, con ello se proporciona un modelo transgénico para el estudio de dominios funcionales de la' proteína. Véase por ejemplo, Zhuang et al. (ibid), y Baudoin et al. ( Genes Dev. 12:1202-1216, 1998). En otra aplicación, los tipos celulares y tejidos que expresan el gen Zvegf3 se pueden identificar por el golpeteo de un gen reportero sensitivo (por ejemplo, Lacz), en el locus o sitio Zvegf3. Véase por ejemplo, Monroe et al.,? Immuni ty 1£: 1201-212, 1999; Zhuang et al., ibid. ; Geng et al . , ibid. La metodología antisentido se puede usar para inhibir la transcripción del gen Zvegf3 para examinar los efectos de tal inhibición in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica a Zvegf3 (por ejemplo, un polinucleótido como se expone en la SEC ID N0:1), están diseñados para enlazarse a un ARNm que codifica a un Zvegf3 e inhibe la traducción de tal ARNm. Tales oligonucleótidos antisentido también se pueden usar para inhibir la expresión de los genes que codifican al polipéptido Zvegf3 en el cultivo celular. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los ensayos descritos aquí, pueden ser fácilmente-adaptados para estudiar la actividad de las proteínas Zvegf3, anticuerpos anti-Zvegf3 y otros antagonistas, y( las substancias de prueba derivadas de una variedad de fuentes . Las proteínas Zvegf3 pueden ser usadas terapéuticamente para estimular el desarrollo o reparación del tejido, o diferenciación o proliferación celular. Se ha encontrado el Zvegf3 que enlaza a un receptor PDGF y estimula los procesos celulares mediados por el receptor alfa. La proteína puede por lo tanto, ser usada como un agonista del receptor alfa PDGF. Las aplicaciones específicas incluyen, sin limitación: el tratamiento de las heridas de la piel de grosor completo, incluyendo úlceras estasis venosas, y otras heridas no curadas crónicas, particularmente en el caso de curación de .heridas comprometidas debido la diabetes melitus, padecimientos del tejido conectivo, fumar, quemaduras, y otras condiciones exacerbantes; reparación de fracturas; injertos de la piel; dentro de la cirugía reconstructiva promover la neovascularización e incremento en la sobrevivencia de colgajos de la piel; establecer la red vascular en las células y tejidos transplantados, tales como isletas de Langerhans; tratar desordenes del tracto reproductivo femenino, incluyendo insuficiencia placental crónica o aguda (un factor importante que causa la movilidad y mortalidad perinatal) y sangrado prolongado; promover el crecimiento del tejido dañado por los padecimientos periodontales; promover la reparación del tejido del hígado dañado; en el tratamiento de lesiones crónicas y agudas del tracto gastrointestinal, incluyendo úlceras duodenales, las cuales se caracterizan por une^B deficiencia en los microbazos; promover la angiogénesis y prevenir la degeneración neuronal debido a la isquemia cerebral crónica; acelerar la formación de los bazos sanguíneos colaterales; promover la reparación de los bazos y el desarrollo de la circulación colateral después del infarto al miocardio, para limitar el daño isquémico; y estimular la hematopoiesis . Los polipéptidos son también empleados como aditivos en los tejidos adhesivos para promover la revascularización del tejido sano. De particular interés es el uso de Zvegf3 o antagonistas Zvegf3 para el tratamiento o reparación del daño al hígado, incluyendo el daño debido a padecimientos crónicos del hígado, incluyendo hepatitis activa crónica (incluyendo hepatitis C) y muchos otros tipos de cirrosis. La necrosis masiva, ampliamente esparcida, incluyendo la destrucción virtual del hígado completo, puede causar inter a l i a , la hepatitis viral fulminante;! la ' sobredosis de los analgésicos acetaminofeno; exposición a otros fármacos y químicos tales como inhibidores de la monoamina oxidasa; agentes empleados en el tratamiento de la tuberculosis, fósforo, tetracloruro de carbono, y otros químicos industriales. Las condiciones asociadas con las lesiones ultraestructurales que no necesariamente producen necrosis obvia de las células de hígacio incluyen, síndrome de Reye en niños, toxicidad por tetraciclina, e hígado graso agudo del embarazo. La cirrosis, un proceso difuso, caracterizado por la fibrosis y una conversión de la arquitectura normal en los nodulos estructuralmente anormales, pueden llegar a ser aproximadamente por una variedad de razones, incluyendo abuso de alcohol, cirrosis post-necrótica (usualmente debida a hepatitis activa crónica) , cirrosis biliar, cirrosis de pigmento, cirrosis criptogénica, padecimiento de Wilson, y deficiencia alfa-1-antitripsina . El Zvegf3 puede también, ser empleado para el tratamiento de congestión pasiva crónica hepática (CPC) y necrosis he orrágica central (CHN) , los cuales son dos cambios circulatorios que representan un contador continuo en la insuficiencia cardiaca colateral directa. Otros desórdenes circulatorios que pueden ser tratados' con Zvegf3 incluyen trombosis de la vena hepática, trombosis de la vena portal, y esclerosis cardiaca. En casos de fibrosis del hígado, puede ser benéfico administrar un antagonista Zvegf3 para suprimir la activación de las células estrelladas, las cuales se han implicado en la producción de la matriz extracelular en( el hígado fibrótico (Li y Friedman, J. Ga s troen terol . Hepa tl . l£:618-633, 1999). Los polipéptidos Zvegf3 pueden ser administrados solos o en combinación con otros agentes vasculogénicos o angiogénicos, incluyendo VEGF. Por ejemplo, se ha encontrado que el FGFs y VEGF acídicos y básicos, juegan un papel en el desarrollo de la circulación colateral, y el uso combinado de Zvegf3 uno o más de estos factores puede ser ventajoso. El VEGF también está implicado en la sobrevivencia de las células de islotes transplantadas (Gorden et al. Transplan ta tion 6^3:436-443, 1997; Pepper, Arteriosclerosis , Throm . Vascula r Bi ol . £2:605-619, 1997). El FGF básico ha mostrado inducir la angiogénesis y acelerar la curación de úlceras en animales experimentales (revisado por Folkman, Na ture Medi cine 1:27-31, 1995). El VEGF ha mostrado promover la re-endotelialización de los bazos y reduce la hiperplasia íntima en modelos animales de restenosis (Asahara et al., Circula ti on 91 : 2802-2809, 1995; Callow et al., Growth Fa ctors £0:223-228, 1994); la eficacia de los polipéptidos Zvegf3 se puede probar en estos y otros modelos conocidos. Cuando se usa Zvegf3 en combinación con un agente adicional, los dos compuestosß pueden ser administrados simultáneamente o secuencialmente como sea apropiado para la condición específica a ser tratada.

Las proteínas Zvegf3 pueden ser usadas ya se asólas o en combinación con otros factores hematopoieticos, tales como IL-3, G-CSF, GM-CSF, o factor de las células de origen para incrementar la expansión y movilización de las células de origen del precursor endotelial. Las células que se pueden expandir de esta manera, incluyen células aisladas a partir de la médula ósea o células aisladas a partir de la sangre. Las proteínas Zvegf3 pueden también ser dadas directamente a un individuo para incrementar la producción de las células de origen endoteliales y la diferenciación dentro del individuo tratado. Las células de origen, ya sea desarrolladas dentro del paciente, o proporcionadas nuevamente al paciente, pueden entonces, jugar un papel! en las áreas de modulación de la isquemia dentro del cuerpo, con ello se proporciona un efecto terapéutico. Estas células pueden también ser empleadas en el incremento de la reendotelización de las áreas desprovistas de cobertura endotelial, tales como injertos vasculares, sujeciones vasculares y áreas en donde la( cobertura endotelial se ha dañado o removido (por ejemplo, áreas de angioplastia). Las proteínas Zvegf3 pueden también ser usadas en combinación con otros factores de diferenciación y crecimiento, tales como la angiopoietina-1 (Davis et al., Cell 87: 1161-1169, 1996) para ayudar a crear y estabilizar nuevas formaciones de bazos en áreas que requieren la neovascularización, incluyendo áreas de isquemia (isquemia cardiaca o periférica), transplantes de órganos, curación de heridas e injerto de tejido. Las proteínas Zvegf3, agonistas y antagonistas pueden ser usados para modular el crecimiento de la neurita y desarrollo de estructuras del sistema nervioso demarcadas. Como tal, las proteínas, agonistas o antagonistas de Zvegf3, pueden emplearse en el-tratamiento de neuropatías por el incremento de la espina cordal y el desarrollo de la neurita sensoria, y como! parte de un tratamiento terapéutico para la regeneración del desarrollo de la neurita después de las apoplejías, daño cerebral causado por daños a la cabeza, y parálisis causada por daños espinales. La aplicación se puede hacer en el tratamiento de padecimientos neurodegenerativos, tales como esclerosis múltiple, mal de Alzheimer y mal de Parkinson. La aplicación también se puede hacer en la mediación del desarrollo y patrón de inervación del tejido estomacal.

Para uso farmacéutico, las proteínas Zvegf3 se formulan para administración tópica o parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, proporcionada de acuerdo a métodos convencionales. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un polipéptido Zvegf3 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como salina, salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua, o similares. Las formulaciones pueden además, incluir uno o más excipientes, preservativos, solubilizadores, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de proteína en las superficies viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Remington : The Science and Practi ce of Pharma cy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19ava. Ed., 1995. La Zvegf3 ordinariamente se usará en una combinación de aproximadamente 10 a 100 µg/ml del volumen total, aunque las concentraciones en el rango de 1 ng/ml a 1000 µ/ml pueden ser usadas. Para la aplicación tópica, tal como para la promoción de la curación de heridas, la proteína' se aplicará en el rango de 0.1-10 µg/cm2 del área herida, con la dosis exacta, determinada por el especialista de conformidad con los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y severidad de la condición a ser tratada, estudios del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del ordinario experto en la técnica. Las ormulaciones terapéuticas generalmente se administrarán durante el periodo requerido para la neovascularización , típicamente de uno a varios meses, y en el tratamiento de condiciones crónicas, por un año o más. La dosificación es diariamente o intermitentemente durante el periodo de tratamiento. La administración intravenosa será por inyección del bolo o infusión durante un periodo típico de una a varias horas. Las formulaciones de liberación sostenida también pueden empelarse. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva de Zvegf3 es una cantidad suficiente para' producir un cambio clínicamente significante en la condición tratada, tal como una reducción clínicamente significante en el tiempo requerido para el cierre de la herida, una reducción significante en el área herida, un mejoramiento significante en la vascularización, una reducción significante en la morbilidad, o un registro histológico signi icantemente incrementado. Las proteínas de la presente invención son empeladas para modular la proliferación, diferenciación, migración, o metabolismo de tipos celulares responsables, los cuales incluyen tanto células primarias y líneas celulares cultivadas. De particular interés en este sentido, son las células del hígado, células hematopoieticas (incluyendo células de origen y células linfoides y mieloides maduras), células endoteliales, células neuronales y células mesenquimales (incluyendo^' fibroblastos y células del músculo suave). Los polipéptidos Zvegf3 se agregan al medio de cultivo de tejidos para estos tipos celulares a una concentración de aproximadamente 10 pg/ml hasta aproximadamente 1000 ng/ml. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que las proteínas Zvegf3 pueden ser ventajosamente combinadas con otros factores de crecimiento en el medio de cultivo, Dentro del campo de investigación en laboratorio, las proteínas Zvegf3 pueden también ser usadas como estándares de peso molecular; como reactivos en los ensayos para determinar los niveles de circulación de la proteína, tal como en la diagnosis de alteraciones caracterizadas por la sobre o baja producción de laß proteína Zvegf3, o como estándares en el análisis del fenotipo celular. Las proteína Zvegf3 pueden también ser usadas para identificar inhibidores de su actividad. Se agregan los compuestos de prueba a los ensayos descritos anteriormente para identificar compuestos que inhiben la actividad de la proteína Zvegf3. Además de aquellos ensayos descritos anteriormente, se pueden probar las muestras para la inhibición de la actividad Zvegf3 dentro de una variedad de ensayos designados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de Zvegf3. Por ejemplo, las líneas celulares responsables de Zvegf3 pueden ser transfectadas con un constructo de gen reportero que es responsable a una trayectoria celular estimulada por Zvegf3. Los constructos del gen reportero de este tipo, se conocen en la técnica, y de manera general! comprenderán un elemento de respuesta al suero activada por Zvegf3 (SER), operablemente ligado a un gen que codifica a una proteína que se puede ensayar, tal como la luciferasa. Los compuestos candidatos, soluciones, mezclas o extractos, son probados por su habilidad para inhibir la actividad de Zvegf3 en las células objetivo^ como se evidencia por una disminución en la estimulación Zvegf3 de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectan compuestos que bloquean directamente el enlace de Zvegf3 a los receptores de la superficie celular, así como también compuestos que bloquean los procesos en la trayectoria celular subsecuente al enlace del ligando receptor. En una alternativa, los compuestos u otras muestras se pueden probar para el boqueo directo del enlace de Zvegf3 al receptor usando Zvegf3 etiquetado con una etiqueta detectable (por ejemplo, 125I, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC, y similares). Dentro de los ensayos de este tipo, la habilidad de una muestra de prueba para inhibir el enlace del Zvegf3 etiquetado al receptor es indicativa de la actividad inhibidora, la cual se puede confirmar a través de los ensayos secundarios. Los receptores usados con ensayos de enlace, pueden ser receptores celulares o aislados, receptores' inmovilizados. La actividad de las proteínas Zvegf3 se puede medir con un microfisiometro biosensor a base de silicona que mide la proporción de acidificación extracelular o una excreción de protón asociado con el enlace al receptor y respuestas celulares fisiológicas! subsecuentes. Una ejemplificación de tal dispositivo es el Microfisiometro Cytosensor™ manufacturado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Una variedad de respuestas celulares, tales como proliferación celular, transporte de iones, producción de energía, respuestas inflamatorias, activación del receptor y regulatoria, y similares, pueden ser medidas por este método. Véase por ejemplo, McConnell et al., Sci ence 257 : 1906-1912, 1992; Pitchford et al„, Meth . Enzymol . 228:84-108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol . Meth . 212: 49-59, 1998; y Van Liefde et al., Eur . J. Pha rma col . 346: 87-95, 1998. El microfisiométro puede ser usado para ensayar células eucarióticas o procarióticas adherentes o no adherentes. Mediante la medición de los cambios de acidificación extracelular en el medio celular con el tiempo, el. microfisiometro directamente mide las respuestas celulares a varios estímulos, incluyendo las proteínas Zvegf3, sus antagonistas y agonistas. Se puede usar el microfisiómetro para medir las respuestas de una célula eucariótica responsable de Zvegf3, comparada con una célula eucariótica de control, que no responde al polipéptido ZvegfS. Las células eucarióticas responsables de Zvegf3 comprenden células en las cuales, se ha| transfectado un receptor para Zvegf3, creando una célula que es responsable al Zvegf3, así como también células responsables naturalmente a Zvegf3 tal como células derivadas del tejido vascular o neural. Las diferencias, medidas por un cambio por ejemplo, un incremento o disminución en la acidificación extracelular, en la respuesta de las células expuestas al polipétpidos Zvegf3 con. relación al control no expuesto Zvegf3, son una medida directa de las respuestas celulares moduladas por Zvegf3. Sin embargo, tales respuestas moduladas por ^^ Zvegf3 pueden ser ensayadas bajo una variedad de estímulos. La presente invención así, proporciona métodos para la identificación de agonistas y antagonistas de las proteínas Zvegf3 que comprenden, proporcionar células de respuesta a un polipéptido Zvegf3, cultivar una primera porción de las células en la ausencia de un compuesto de prueba, cultivar una segunda porción de células en la presencia de un compuesto de prueba, una detección de un cambio por ejemplo, un incremento o disminución, en una respuesta celular de la segunda porción de las células comparadas con la primera porción de las células. El cambio en la respuesta celular se muestra como un cambio que se puede medir en l^^ proporción de acidificación extracelular. Cultivar una tercera porción de las células en la presencia de una proteína Zvegf3 y la ausencia de un compuesto de prueba proporciona un control positivo para las células de respuesta Zvegf3 y un control para comparar la actividad agonista de un compuesto de prueba con aquel del polipéptido Zvegf3. Los antagonistas de Zvegf3 se pueden identificar por la exposición de las células a la proteína Zvegf3 en la presencia o ausencia del compuesto de prueba, con ello una reducción en la actividad estimulada por Zvegf3 es indicativa de una actividad antagonista en el compuesto de prueba. Las proteínas Zvegf3 pueden también ser usadas para identificar células, tejidos, o líneas celulares que responden a la trayectoria estimulada por Zvegf3. El microfisiómetro, descrito anteriormente, puede ser usado para identificar rápidamente células responsivas alf ligando, tales como células responsivas a las proteínas Zvegf3. Las células son cultivadas en la presencia o ausencia de los polipéptidos Zvegf3. Aquellas células que provocan un cambio medible en la acidificación celular en la presencia de Zvegf3 son responsivas a Zvegf3. Las células responsivas pueden entonces ser usadas identificar antagonistas y agonistas de los polipéptidos Zvegf3 como se describe anteriormente. Los inhibidores de la actividad Zvegf3 (antagonistas Zvegf3), incluyen anticuerpos anti-Zvegf3, receptores solubles de Zvegf3 (incluyendo receptor alfa PDGF soluble; véase por ejemplo, Herrén et al., J. Biol.. Chem. 268:15088-15095, 1993), anticuerpos anti-receptores, y otros agentes peptídicos y no peptídicos, incluyendo ribozimas, inhibidores de moléculas pequeñas, y fragmentos de enlace al receptor angiogénicamente o mitogénicamente inactivos de los polipéptidos Zvegf3. Tales antagonistas pueden ser usados para bloquear los efectos mitogénicos, quimiotácticos o angiogénicos de Zvegf3. Estos antagonistas pueden por lo tanto, ser empleados en la reducción del crecimiento de tumores sólidos por la inhibición de la neovascularización del tumor en desarrollo, por el bloqueo directamente del' crecimiento del tumor, o por la promoción de la apoptosis a través de la inhibición de los procesos mediados por el receptor alfa PDGF. Por ejemplo, la evidencia experimental indica que el Zvegf3 se produce por las células de glioblastoma, sugiriendo que la inhibición de la actividad Zvegf3 pueda ser empleada en el tratamiento! de estos tumores. Otros usos de los antagonistas Zvegf3 incluyen tratar la retinopatía diabética, soriasis, artritis, y escleroderma; y reducción de la fibrosis, incluyendo formación de marcas, celoides, fibrosis de hígado, fibrosis de pulmón (por ejemplo, silicosis, asbestosis), fibrosis de riñon (incluyendo retinopatía diabética), y glomeruloesclerosis . Los inhibidores de Zvegf3 pueden también ser empelados en el tratamiento de los desordenes vasculares proliferativos, en donde la actividad Zvegf3 es patogénica. Tales desórdenes pueden incluir la arterosclerosis y restenosis hiperplástica íntima después de la angioplastía, endarterectomia, injerto vascular, transplante de órgano, o colocación de sujetadores vasculares. Estas condiciones involucran las respuestas mediadas por el factor de crecimiento complejo, en donde ciertos factores pueden ser benéficos al efecto clínico y otros pueden ser patogénicos. Los inhibidores de Zvegf3 pueden también proporcionar utilidad en el tratamiento de la neovascularización ocular, incluyendo retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad. Las evidencias experimentales sugieren que estas condiciones resultan de la expresión de los factores! angiogénicos inducidos por la hipoxia en la retina. Los antagonistas Zvegf3 son también de interés en el tratamiento de los desórdenes inflamatorios, tales como artritis reumatoide y soriasis. En la artritis reumatoide, los estudios sugieren que el VEGF juega un papel importante en la formación del panus, un tejido extensivamente vascularizado que invade y destruye el cartílago. Las lesiones soriáticas son hipervasculares y sobre expresan al polipéptido IL-8 angiogénico. Los antagonistas Zvegf3 pueden también proporcionar utilidad en el tratamiento de hemangiomas de infantes, los cuales presentan la sobre expresión del VEGF y bFGF durante la fase proliferativa. Se formulan los inhibidores para uso farmacéutico como se describe de manera general anteriormente, tomando en cuenta la naturaleza física y química precisa del inhibidor y la condición a ser! tratada. Las determinaciones relevantes están dentro del nivel del ordinario experto en las técnicas de formulaciones. Otros factores angiogénicos y vasculogénicos , incluyendo VEGF y bFGF, se han implicado en la neovascularización patológica. En tales ejemplos, puede ser ventajoso combinar un inhibidor Zvegf3 con uno| o más inhibidores de estos otros factores. Los polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos de la presente invención, pueden ser usados en la diagnosis y tratamiento de alteraciones asociadas con la pérdida de célula o proliferación celular anormal, incluyendo cáncer, vasculogénesis excesiva o desigual o angiogénesis, y padecimientos del sistema nervioso. Los polipéptidos Zvegf3 etiquetados pueden ser usados para trazar tumores u otros sitios de proliferación celular anormal. En vista del enlace de Zvegf3 al receptor alfa PDGF, los antagonistas Zvegf3 pueden ser empleados en el tratamiento de tumores que expresan este receptor (por ejemplo, glioblastomas, melanomas malignos). Debido a que la angiogénesis en animales adultos está limitada de manera general a la curación de heridas y al ciclo-reproductivo femenino, es un indicador muy específico de los procesos patológicos. La angiogénesis es indicativa! de por ejemplo, desarrollo de tumores sólidos, retinopatías y artritis. Los polipéptidos Zvegf3 y anticuerpos anti-Zvegf3 pueden ser conjugados directamente o indirectamente a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados usados para las! aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vi vo . Por ejemplo, los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención, pueden ser usados para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (receptor o antígeno, respectivamente, por ejemplo) . Más específicamente, los polipéptidos Zvegf3 o anticuerpos anti-Zvegf3 o fragmentos bioactivos o porciones de los mismos, pueden estar acoplados a las moléculas detectables o citotóxicas y suministradas en un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan a la molécula anti-complementaria . Por ejemplo, el dominio Cub de Zvegf3 puede ser usado para dirigir porciones peptídicas y no peptídicas a las semaforinas como se describe anteriormente. Las moléculas detectables adecuadas pueden ser directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluyen radionúclidos, enzimas,' substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden estar directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o de plantas (por ejemplo, difteria toxina,! exotoxinas de Pseudomona s, ricinas, abrinas, saporina, y similares), así como también radionúclidos terapéuticos, tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90. Estas pueden estar directamente unidas al polipéptido o anticuerpo, o indirectamente unidas de conformidad con métodos conocidos, tales como a través de una porción quelante. Los polipéptidos o anticuerpos pueden también estar regulados a los fármacos citotóxicos, tales como adriamicina. Para la unión directa de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede estar conjugada con un elemento de un par complementario/anti-complementario, en donde el otro miembro está enlazado a la porción de polipéptido o anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ejemplar. En otra modalidad, las proteínas de fusión a la| toxina del polipéptido o proteínas de fusión a la toxina del anticuerpo/fragmento, se pueden usar para las células objetivos o la inhibición del tejido o desgaste, tal como en la terapia del cáncer. De interés particular en este sentido, son los conjugados del polipéptido Zvegf3 y una citotoxina, la cual puede ser usada para señalar l3^ citotoxina en un tumor u otro tejido que está sometido a la replicación y modificación celular indeseada. En otra modalidad, las proteínas de fusión a la citosina Zvegf3 o proteínas de fusión a la citosina del anticuerpo/fragmeno, pueden ser usadas para incrementar la citotoxicidad in vi vo (por ejemplo, que es mediada por los anticuerpos monoclonales contra los tumores objetivos) y para incrementar la muerte in vi vo de los tejidos objetivo ( por ejemplo, cánceres de la sangre y médula ósea). Véase de manera general, Hornick et al., Bl ood 8_9: 4437-4447, 1997). En general, las citocinas son tóxicas si se administran sistémicamente . Las proteínas de fusión descritas permiten la señalización de una citosina a un sitio de acción deseado, tal como una célula que tiene sitios de enlace para Zvegf3, con ello, se proporciona una concentración local elevada de la citosina. Las citocinas adecuadas para este propósito! incluyen, por ejemplo, interleucina-2 y el factor de estimulación de la colonia del macrófago del granulocito (GM-CSF) . Tales proteínas de fusión pueden ser usadas para causar la muerte inducida por la citosina de tumores y otros tejidos que presentan replicación celular indeseada. En todavía otra modalidad, un polipéptido Zvegf3 o un anticuerpo anti-Zvegf3 puede ser conjugado con un radionúclido, particularmente con un radionúclido que emite gama o beta, y se usa para reducir la restenosis. Por ejemplo, los ribones impregnados con iridio-192, colocados en recipientes sujetados de pacientes hasta la dosis de radiación requerida, se suministraron resultando en la disminución del crecimiento del tejido en el diámetro luminal más grande y en los bazos, que en el grupo de control que recibió ribones de placebo. Además, la revascularización y la trombosis sostenida, fueron significantemente más bajos en el grupo de tratamiento. Se predicen resultados similares con la señalización de un conjugado bioactivo que contiene un radionúclido como se describe aquí. Los conjugados de polipéptidos o anticuerpos bioactivos descritos aquí, pueden ser suministrados! intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente, o pueden ser introducidos localmente al sitio de acción propuesto . Son empleados los polipéptidos Zvegf3 que codifican a polinucleótidos dentro de las aplicaciones de terapia del gen, en donde se desea incrementar o inhibir^ la actividad de Zvegf3. Por ejemplo, Isner et al., The Lancet (ibid), reporta que la terapia del gen VEGF promueve el crecimiento de los bazos sanguíneos en una extremidad isquémica. Las aplicaciones adicionales de la terapia del gen por Zvegf3 incluyen la estimulación de la curación de heridas, repoblación de los injertos vasculares, estimulación del crecimiento de la neurita, e inhibición del crecimiento del cáncer y metástasis. La presente invención también proporciona reactivos de polinucleótidos para usos de diagnósticos. Por ejemplo, un gen Zvegf3, una sonda que comprende un ADN o ANR Zvegf3, o una subsecuencia del mismo, puede ser usados para determinar si el gen Zvegf3 está presente en el cromosoma 4 de un paciente humano o si ha ocurrido una mutación. Las aberraciones cromosomales detectables al locus o sitio del gen Zvegf3 incluyen, pero no están limitadas a, aneuploidia, cambios en el número de copias! del gen, inserciones, supresiones, cambios en el sitio de restricción y reacomodos. Tales aberraciones pueden ser detectadas usando polinucleótidos de la presente invención, por el empleo de técnicas genéticas moleculares, tales como el análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , análisis enft serie de repeticiones cortas (STR), empleando técnicas de PCR, y otras técnicas de análisis de enlace genético conocidas en el arte (Sambrook et al., ibid. ; Ausubel et . al., ibid . ; A. J. Marian, Chest £08:255-265, 1995). La formación de mapas híbridos por radiación es una técnica genética de células somáticas desarrolladas para la construcción a alta resolución de mapas contiguos de cromosomas de mamíferos (Cox et al., Sci ence 250:245-250, 1990). El conocimiento parcial o completo de una secuencia del gen, permite a uno diseñar cebadores PCR adecuados para usarse con paneles de formación de mapas híbridos por radiación cromosomal. Los paneles de formación de mapas híbridos por radiación comercialmente disponibles que cubren el genoma humano completo, son disponibles como el Panel RH de Stanford G3 y el Panel RH-de GeneBridge 5 (Research Genetics., Inc., Huntsville, AL) . Estos paneles permiten las localizacionesl cromosomales a base de PCR, rápidas, y el ordenamiento de los genes, los sitios de señalización de secuencia (STSs), y otros marcadores no polimórficos y polimórficos dentro de una región de interés. Esta técnica permite a uno establecer directamente las distancias físicas proporcionales entre los genes de interés recientemente^ descubiertos y los marcadores previamente mapeados. El conocimiento preciso de una posición del gen puede ser útil para un número de propósitos, incluyendo; 1) determinación de las relaciones entre las secuencias cortas y las secuencias genéticas circundantes obtenidas adicionales en varias formas, tales como los clones YACs, BACs, o ADNc; 2) proporcionar un gen candidato posible para un padecimiento hereditable el cual muestra en enlace a la misma región cromosomal; y 3) organismos modelos de referencias cruzadas, tales como el ratón, los cuales pueden ayudar en la determinación de que función particular podría tener el gen. La invención está además, ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Clones que comprenden porciones de la secuencia! codificante Zvegf3 se identificaron en las bases de datos públicas y propias de extremos de secuencias expresados (ESTs). Se obtuvo y secuenció un primer clon, que corresponde a un EST en una base de datos propia. Contiene un inserto de 2350 bp en una estructura lectora abierta de aproximadamente 800 bp. El extremo 5' del ORE^^ se perdió. Un segundo clon, que corresponde a un EST en una base de datos pública, entonces se secuenció, pero no extendió la secuencia obtenida a partir del primer clon.

Un tercer clon, a partir de una base de datos propia entonces se secuenció. Este clon contiene aproximadamente 156 bp más que el primer clon, pero también se perdió el extremo 5' . Se realizaron manchados Northern usando una serie de manchados Northern (Múltiple Tissue Northern Blots, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) . Una sonda de ADN de aproximadamente 400-bp, basada directamente en el EST identificado, se generó por digestión de un clon que corresponde al primer EST de propiedad con EcoRI y BglII. La sonda de ADN se purificó en gel usando una columna giratoria que contiene una membrana de gel ele sílice (QIAquick™ Gel Extraction Kit; Quiagen, Inc., Valencia, CA) . La sonda fue^É radioactivamente etiquetada con 32P, usando un equipo de etiquetación de cebador aleatorio comercialmente disponible (Rediprime™ II, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) , de conformidad con las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de empuje (columna NucTrap®; Stratagene, La Jolla, CA; véas^? Patente Estadounidense No. 5,336,412). Una solución de hibridación comercialmente disponible (Solución de Hibridación ExpressHyb™; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , se usó para la perhibridación y como una solución hibridizante para los manchados Northern. La hibridación tomó lugar durante la noche a 65°C, y los manchados entonces se lavaron 4 veces en SSC 2X y SDS al 0.1% a temperatura ambiente, seguida por dos lavados en SSC 0.1X y SDS al 0.1 % a 50°C y un lavado en SSC 0. IX y SDS al 1% a 56°C. Los manchados Northern entonces se expusieron a una película durante la noche a -80°C y por tres días a -80°C. Un tamaño de transcripto se observó en todos los tejidos a aproximadamente 4.0 kb . La intensidad de señal fue más alta en la glándula tiroides, médula espinal y adrenal. La intensidad de señal se promedió en el corazón, riñon, páncreas, próstata, ovario, estómago y tráquea. La intensidad de señal fue débil en todos los( otros tejidos. Se realizó el manchado Northern usando Manchados de Tejidos Múltiples de Ratón obtenidos de Clontech Laboratories de Invitrogen (Carlsbad, CA) . Una sonda de ADN de aproximadamente 400 bp, basada directamente en el EST identificado, se generó portf digestión de un clon que corresponde al primer EST propio con EcoRI y BglII. La sonda de AND se purificó en gel usando una columna giratoria como se describe anteriormente. La sonda se etiquetó radioactivamente con 32P por cebación aleatoria como se describe anteriormente. La sonda se purificó usando una columna de empuje NucTrap®. Las condiciones de hibridación se describen anteriormente. Los manchados se lavaron cuatro veces en SSC 2X, SDS al 0.1%, después dos veces en SSC IX a 50°C, después se expusieron a una película durante la noche a -80°C y por tres días a -80°C. Un tamaño de transcripto de aproximadamente 3.0 kb se observa en el embrión de 7 días. Tres días de exposición mostraron bandas de menos intensidad en el embrión de 11, 15 y 17 días. La intensidad disminuyó con la edad del embrión.-Los manchados Dot mostraron una mancha en el embrión de 17 días, y con tres días de exposición en la glándula! submaxilar. Una banda potencial de aproximadamente 2.0 kb como se observa en los testículos después de tres días. Se realizó el manchado Southern usando un manchado Southern pre-elaborado que contiene ADN genómico digerido con EcoRI, a partir de nueve diferentes especies eucarióticas (ZOO-BLOT de Clontech Laboratories) Una sonda de ADN de aproximadamente 400 bp, basada directamente en la primer base de datos EST propia, se generó por la digestión del clon correspondiente con EcoRI y BglII. La sonda de AND se purificó en gel usando una columna giratoria. La sonda se etiquetó radioactivamente con 32P por cebación aleatoria y se purificó usando una columna de empuje. Las condiciones de hibridación y lavado son como se describen anteriormente para los Manchados de Tejidos Múltiples de Ratón. Los Manchados Northern entonces se expusieron a la película durante la noche a -80°C y por tres días a -80°C. Las bandas fuertes se observaron en conejo, ratón, rata y mono.

Ejemplo 2 Se seleccionó una biblioteca de la glándula salival humana para un clon de longitud completa del Zvegf3 por PCR. Esta biblioteca tiene un arreglo de biblioteca que representa 9.6 X 105 clones elaborados en el vector pZP5x. El vector pZP5x es el mismo como el vector pZP-9 (depositado en el American Type Culture Collection, 1081 University Blvd., Manassas, VA bajo el número de Acceso 98668), pero contiene un promotor del! citomegalovirus en lugar de un promotor de metalotioneina entre los sitios Asp718 y BamHl. El plásmido además comprende un gen de reductasa de hidrofolato bajo el control del promotor temprano SV40 y el sitio de poliadenilación SV40, y un sitio de clonación para insertar el gen de interés bajo el control del promotor CMV y el sitio de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) . La placa de trabajo que contiene 80 agrupamientos de 12,000 colonias, cada una seleccionada por PCR usando cebadores de oligonucleótidos ZC 19,045 (SEC ID NO:25) y ZC 19,047 (SEC ID NO:26) con una temperatura de formación de 60°C por 35 ciclos. Hubo dos agrupamientos fuertes positivos 58 (T-8 F1-F2) y 77 (T-7 H1-H2) . Los agrupamientos que corresponden en la placa de transferencia entonces se seleccionaron por PCR usando las mismas condiciones. Se obtuvieron dos positivos al nivel de transferencia. Los positivos fueron T-7 Hll y T-8 F-10. Las reacciones RACE al 5' se hicieron en los agrupamientos de la placa de transferencia y los fragmentos se secuenciaron para verificar la secuencia Zvegf3 y determinar si el clon de longitud completa está presente. Para la PCR, los cebadores oligonucleótidos ZC 12,700 (SEC ID NO:27) y ZC 19,045 (SEC ID NO:25), sel usaron a una temperatura de funcionamiento de 61°C por 5 ciclos, después a 55°C por 30 ciclos. El secuenciamiento mostró que los agrupamientos T-7 Hll tienen un cambio de estructura. La secuencia FIO del agrupamiento 8 de la placa de transferencia parece ser correcta, así este agrupamiento de ADN, se usó en filtros elevadores. El agrupamiento FIO de la placa de transferencia 8 se colocó y el filtro se elevó usando membranas de nylon (Hybond-N™; Amersham Corporation) . Aproximadamente 1200 colonias por placa en cada uno de los 5 filtros se elevaron para un total de aproximadamente 6000 colonias. Los filtros se marcaron con una aguja caliente para orientación, después se desnaturalizaron por 6 minutos en 0.5 M de NaOH y 1.5 M de Tris-HCl, pH 7.2. Los filtros después se neutralizaron en 1.5 M de NaCl y 0.5 M de Tris-HCl, pH 7.2 por 6 minutos. El ADN se añadió a los filtros usando un! reticulador de UV (Stratalinker®, Stratagene, La Jolla CA) a 1200 joules. Los filtros se prelavaron a 65°C en amortiguador prelavado que consiste de 0.25 X SSC, SDS al 0.25%, y 1 mM de EDTA. La solución se cambió a un total de tres veces durante un periodo de 45 minutos para remover los desechos celulares. Los filtros prehibridizaron por aproximadamente 3 horas a 65°C en 25 ml de ExpressHyb™. La sonda se generó usando un fragmento de aproximadamente 400 bp producidos por digestión del primer clon de la base de datos propia con EcoRI y BglII y se purificó en gel usando una columna giratoria como se describe anteriormente. La sonda de etiquetó radiactivamente con 32P por cebación aleatoria como se describe anteriormente y se purificó usando una columna de empuje. La solución ExpressHyb™ se usó para la solución de hibridación para los tituladores. La hibridación tomó lugar durante la noche a 65°C. Los manchados se enjuagaron 2X en solución 1 a 65°C (2X SSC, SDS al 0.1%), después se lavaron 4 veces en solución 1 a 65°C. Los filtros se expusieron a la película durante la noche a -80°C. Hubo 4 positivos en los filtros. Se perforaron 85 colonias a partir de las áreas positivas y se seleccionaron por PCR usando cebadores de oligonucleótidos ZC 19,045 (SEC ID N0:25) y ZC 19,047 (SEC ID NO:26) y a una temperatura de formación de 60°C. Se obtuvieron trece positivos y se estriaron para los clones individuales. Veinticuatro colonias se perforaron y verificaron por PCR como se describe previamente. Se obtuvieron seis positivos, dos de los cuales se secuenciaron . Ambas secuencias fueron las mismas y de longitud completa. La secuencia se muestra en la SEC ID NO: 1.

Ejemplo 3 El gen Zvegf3 humano se formó en mapas al cromosoma 4 usando el Panel Híbrido de Radiación de GeneBridge 4 comercialmente disponible (Research Genetics, Inc., Huntsvill, AL) . El Panel Híbrido de Radiación de GeneBridge 4 contiene ADNs PCRable de cada uno de los 93 clones híbridos de radiación, más dos ADNs de control (el donador HFL y el recipiente A23) . Un servidor públicamente disponible WWW (http://www-genome . wi .mit . edu/cgi-bin/contig/rhmapper . pl ) permite la formación de mapas con relación al mapa híbrido de radiación de Whitehead Institute/Center for Genome Research MIT, del genoma humano (el mapa de radiación "WICGR" híbrida) , el cual se construyó con el Panel! Híbrido de Radiación de GeneBridge 4. Para la formación de mapas de Zvegf3 con el Panel RH de GeneBridge 4, se colocaron 20 µl de reacciones, en una placa microtituladora de 96 pozos PCRable (Stratagene, La Jolla, CA) y se usó en el ciclizador térmico (RoboCycler® Gradiente 96;* Stratagene) . Cada una de las 95 reacciones de PCR, contienen 2 µl de 10X del amortiguador de reacción por PCR (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla de dNTP (2.5 mM cada uno, PERKIN-ELMER, Foster City, CA) , 1 µl de cebador sentido ZC 20,368 (SEC ID NO:28), 1 µl de cebador antisentido ZC 20,369 (SEC ID NO: 29), 2 µl de un agente de incremento de densidad y tinte de seguimiento (RediLoad, Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 µl de una mezcla de anticuerpo/polimerasa de ADN comercialmente disponible (Mezcla de Polimerasa 50X Advantage™ KlenTaq, obtenida de Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN a partir de un clon híbrido individual o de control, y x µl ddH20 para un volumen total de 20 µl . Las mezclas de reacción se traslaparon con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del funcionamiento cíclico) de PCR fueron como sigue: desnaturalización 4 minutos iniciales a 94°C; 35 ciclos de 45 segundos de desnaturalización a 94 °C, 45 segundos de formación a 56°C, y 75 segundos de extensión a 72°C, seguidos por una extensión final de 7 minutos a 72°C. Los productos de reacción se separaron pro electroforesis en un gel de^^ agarosa al 2% (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los resultaros mostraron los mapas Zvegf3 de 3.56 cR_3000 a partir del marcador de estructura CHLC. GATA72A08 en el cromosoma del mapa híbrido de radiación 4WICGR. Los marcadores de estructuras próximas y distales fueron HCL . GATA72A08 y WI-3936, respectivamente. El uso de posiciones marcadoras circunda al . gen Zvegf3 en la región 4q28.3 en el mapa del cromosoma 4 de LDB integrado (The Genetic Location Datábase, University of Southhampton, servidor WWW: http ://cedar. genetíes. soton.ac. uk/public_html/) . Usando substancialmente el mismo método, el gen Zvegf3 de ratón, se mapeo al cromosoma 3, ligado al marcador de estructura D3Mit212, localizado a 39.7 cM.

Esta región es sintética con el locus o sitio Zvegf3 humano .

Ejemplo 4 Se seleccionó un panel PCR para el ADN Zvegf3 de ratón. El panel contiene 8 muestras de ADNc a partir del cerebro, médula ósea, embrión de 15 días, testículos, glándulas salivales, placenta, embrión de 15 días (Clontech Laboratories), y bibliotecas de embriones de 1 (^9 días . Las mezclas de PCR contenidas en los cebadores de oligonucleótidos zc21, 222 (SEC ID N0:38) y zc21,224 (SEC ID NO: 39). La reacción se corrió a una temperatura de formación de 66°C con un tiempo de extensión de 2 minutos por un total de 35 ciclos usando polimerasa de ADN Ex Taq™ (PanVera, Madison, Wl) más anticuerpo. Las muestras de ADN se encontraron positivas para Zvegf3 por PCR y se confirmaron por el secuenciamiento del ADNc de agrupamiento de genoteca total de embrión de ratón de 15 días incluido, embrión de ratón de 15 días (Clontech Laboratories) y embrión de 17 días (ambos obtenidos de Clontech Laboratories), ANDc de agrupamiento de biblioteca total de la glándula salival de ratón y ADNc de agrupamiento de biblioteca rotal de testículos de ratón. Se secuenciaron los productos de PCR de los fragmentos de aproximadamente 600 bp de cada uno de los! ADNc de agrupamiento total de genoteca de embrión de ratón 15 días, ANDcm de embrión de ratón de 15 días, y ADNmc de embrión de ratón de 17 días. La secuencia del ADNmc de embrión de ratón de 17 días y los productos de ADNc de agrupamiento total de genoteca de embrión de ratón de 15 días, confirmaron que los fragmentos son ADNß^ Zvegf3 de ratón. Se seleccionó la biblioteca de embrión de ratón de 15 días, para el ADN Zvegf3 de longitud completa. Esta biblioteca fue una biblioteca arreglada que representa clones 9.6 x 105 en el vector pCMV. SPORT (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . La placa de trabajo, que contiene 80 agrupamientos de 12,000 colonias cada una, se seleccionó por PCR usando los cebadores de oligonucleótidos zc21,223 (SEC ID NO:40) y zc21,224 (SEC ID NO: 39) con una temperatura de formación de 66°C por 35 ciclos. Se obtuvieron ocho positivos. Los fragmentos de los cuatro agrupamientos (A2, A10, B2, y C4) se secuenciaron. Todos confirmaron codificar a Zvegf3. Las repeticiones adicionales de selección usando las mismas condiciones de reacción y agrupamientos a partir de las placas de trabajo y fuentes identificaron un agrupamiento positivo ( 5D) . Las colonias positivas se seleccionaron por hibridación. La placa #5 de fuente original del agrupamiento 5D, se plaqueó a aproximadamente 250 colonias por placa y se transfirió a las membranas de nylon (Hybond-N™; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) . Se elevaron cinco filtros para un total de ~1250 colonias.! Los filtros se marcaron con una guja caliente para orientación, después se desnaturalizó por 6 minutos en 0.5 M de NaOH y 1.5M de Tris-HCl, pH 7.2. Los filtros entonces se neutralizaron en NaCl 1.5 M y 0.5 M de Tris-HCl, pH 7.2 por 6 minutos. El ADN se fijó a los filtros usando un reticulador UV (Stratalinker®, Stratagene, La Jolla, CA) A 1200 Joules. Se generó una sonda por PCR usando cebadores de oligonucleótidos zc21,223 (SEC ID NO:40) y zc21,224 (SEC ID NO: 39), y un patrón de embrión de ratón de 15 días a una temperatura de formación de 66°C por 35 ciclos. El fragmento de PCR se purificó en gel usando una columna giratoria que contiene una membrana de gel de sílice (Equipo de Extracción en Gel QIAquick*"1; Quiagen, Inc., Valencia, CA) . El ADN fue radioactivamente etiquetado con 32P, usando un equipo comercialmente disponible (sistema de etiquetación aleatorio-cebador RedIPRIME™ II; Amersham Corpo., Arlington Heights, IL) , de conformidad con las! especificaciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de empuje (columna Nuc Trap®; Stratagene, La Jolla, CA; véase Patente Estadounidense No. 5,336,412). Los filtros se prelavaron a 65°C, en un amortiguador de prelavado que consiste de 0.25X SSC, SDS al 0.25% y 1 mM de EDTA. La solución se cambió a un tota de tres veces durante un periodo de 45 minutos para remover los desechos celulares. Los filtros se prehibridizaron durante la noche a 65°C en 25 ml de una solución de hibridación (Solución de Hibridación ExpressHyb™; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , después se hibridizó durante la noche a 65CC en la misma solución. Los filtros se enjuagaron dos veces a 65°C, en un amortiguador pre-lavado (0.25 x SSC, SDS al 0.25%, y 1 mM de EDTA) , después se lavó dos veces en un amortiguador pre-lavado a 65°C. Los filtros se expusieron a la película por 2 días a -80°C. Hubo 10 positivos en los filtros. 3 clones se perforaron de las áreas positivas, se verificaron, y se seleccionaron por PCR 15 colonias individuales a partir de estos positivos, usando los cebadores zc21, 223 (SEC ID NO:40) y zc21, 334 (SEC ID NO: 41) a una temperatura de formación de 66°C. Se recuperaron y secuenciaron dos positivos. Ambas secuencias! encontradas son las mismas y dosifican al Zvegf3 de ratón de longitud completa (SEC ID NO:42). La secuencia de aminoácido está altamente conservada entre el Zvegf3 humano y de ratón, con una identidad de secuencia de aminoácido total del 87%. El dominio CUB, péptido secretorio, interdominio, y T^^B dominio de factor de crecimiento, tienen 82%, 92%, 79% y 94% de la identidad de aminoácido respectivamente.

Ejemplo 5 Se realizó el manchado Northern usando Manchados de Tejido Múltiple de Ratón, de Origene, Rockville, MD y Clontech, Palo Alto, CA. Una sonda de aproximadamente 800 bp se generó por PCR usando el cebador zc21,223 (SEC ID NO:40) para el extremo 5' y el cebador zc21,224 (SEC ID NO: 3) para el extremo 3'. La reacción se corrió por 35 ciclos a una temperatura de formación de 66°C, usando una Polimerasa de ADN Ex Taq™ (PanVera). El producto de reacción se purificó usando una columna giratoria que contiene una membrana de gel de sílice y se etiquetó con 32P usando un equipo de etiquetación comercialmente disponible (sistema de etiquetación Miltipreme™ ADN, Arrersham Corp.), d( conformidad con las especificaciones del fabricante. La sonda etiquetada de purificó usanao una columna de empuje. Una solución de hibridación comercialmente disponible (Solución de Hibridación ExpressHyb™; Clontech Laboratories, Inc.), se usó para la perhibridación y como una solución hioridizante para lo^B manchados Northern. La hibridación toma lugar durante la noche a 65°C, después los manchados son lavados 4 veces en 2X SCC y SDS al 0.05% a temperatura ambiente, seguido por dos lavados en 0. IX SSC y SDS al 0.1% a 50°C. Los manchados se expusieron después a una película de dos días durante la noche a -80°C. Se observaron los tamaños de los transcriptos. Los transcriptos de ~3.5 y ~4.0 kb, se -observaron en embriones de 7, 11, 15 y 17 días, con lo más fuerte al día 7 y escalonamiento al día 17. Se observó un transcripto de ~3.0 kb en el riñon, hígado, cerebro y posiblemente testículos. Se observó un transcripto de ~1.0 kb en los testículos, músculo y bazos. Los manchados dot corresponden a los manchados Northern.

Ejemplo 6 Para fabricar animales transgénicos que expresan el gen Zvegf3, se requieren adultos, machos fértiles (caballos) (B6C3fl, 2-8 de edad (Taconic Farms, Germantown, NY) ) , machos vasectomizados (estériles) (B6D2fl, 2-8 meses, (Tacor.ic Farms)), hembras fértiles prepubescentes (donadores) (PßC3fl, 4-5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles adulto (recipientes (B6D2fl, 2-4 meses, (Taconic Farms) . Los donadores se aclimataron por 1 semana, después se inyectaron con aproximadamente 8 IU/ratón de gonadotropina de Suero de Yegua Preñada (Sigma St. Louis, MO) , I:P:; y 46-47 horas después, 8 IU/Ratón de Gonadotripina Coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir la superovulación . La ovulación ocurre de manera general, dentro de las 13 horas a la inyección de hCG. La copulación se confirma por la presencia de un obturador vaginal la mañana siguiente del apareamiento. Los huevos fertilizados se colocaron bajo un campo quirúrgico (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, Alemania) . Los oviductos de colectaron y los huevos se liberaron en divisiones unianálisis que contienen hialuronidasa (Sigma Chemical Co, ) . Los huevos se lavaron una vez en hialourinidasa, y dos veces en medio W640 de Whitten (Tabla 7; todos los disponibles de Sigma Chemical CO.) que se han incubado con C02 al 5%, C02 al 5% y N2 al 90% a 37°C. Los huevos se almacenaron en un incubador de C02 al 5%/37°C hasta la microinyección .

Tabla 7 mgs/200 ml mgs/500 ml NaCl 1280 3200 KCl 72 180 KH2P04 32 80 MgS04«7H20 60 150 Glucosa 200 500 Lactato Ca- 106 265 Bencilpenicilina 15 37.5 Estreptomicina S0 10 25 NaHC03 380 950 Piruvato Na 5 12.5 H20 200 ml 500 ml 50 mM de EDTA 100 µl 250 µl Fenol Rojo al 5% 200 µl 500 µl BSA 600 1500 El ADNc Zvegf3 se insertó en el vector de* expresión pHB12-8 (véase Fig. 2) . El vector pHB12-8 se derivó de p2999B4 (Palmiter et al., Mol . Cel l Biol . 13:5266-5275, 1993), por la inserción de un intrón de insulina II de rata (aproximadamente 200 bp) y polienlazador (Fse I/Pme I/Asc I) en el sitio Nru I. El vector comprende un promotor de la metalotioneína de ratón (MT-1) (aproximadamente 750 bp) y una región no traducida de la hormona de crecimiento humana (hGH) y una señal de poliadenilación (aproximadamente 650 bp), flanqueada por 1C kb de una secuencia de flanqueo 5' MT-1 y 7 kb de una secuencia de flanqueo 3' MT-1. El ADNc se insertó entre la insulina II y las secuencias hGH. 10-20 microgramos del ADN plasmido se linearizaron, se purificaron en el gel, y se resuspendieron en 10 mM de Tris pH 7.4, 0.25 mM EDTA pH 8.0 a una concentración final de 5-10 nanogramos por microlitro de microinyección . El plasmido de ADN se microinyectó en huevos cosechados contenidos en una gota del medio W640, traslapado por aceite mineral equilibrado con C02, caliente. El ADN se retira en una aguja de inyección (pulida de 0.75mm ID, 1 mm OD, borosilicato de vidrio capilar) y se inyectó en huevos individuales. Cada huevß es penetrado con la aguja de inyección en uno o ambos de los pronúcleos haploides. Picolitros de ADN se inyectaron en el pronucleo, y la aguja de inyección se retiró sin llegar a estar en contacto con el nucléolo. El procedimiento se repitió hasta que se inyectaron todos los huevos. Los huevos exitosamente inyectados se transfirieron en un disco de cultivo de tejido órgano, con un medio pregaseado W640 para almacenarlo durante la noche en un incubador de C02 al 5% /37°C. Al siguiente día, se transfectaron 2 células de embriones en los recipiente seudopreñados . Los recipientes se identificaron por la presencia del obturador de copulación, después se copularon con estériles vasectomizados . Los recipientes se anestesiaron y rasuraron en el lado izquierdo dorsal y se transfirieron a un microscopio quirúrgico. Se hizo un! pequeña incisión en la piel y a través de la pared muscular en la mitad del área abdominal por debajo de la caja toráxica, la garganta y la pata trasera, equidistante de las rodillas y el bazo. Los órganos reproductivos se exteriorizan en una cubierta quirúrgica pequeña. La almohadilla de grasa se expande sobre l( cubierta quirúrgica, y se une una seferina bebe (Roboz, Rockville, MD) a la almohadilla de grasa, y se deja enganchada sobre la cola del ratón, previniendo a los órganos de deslizarse nuevamente. Con una pipeta de transferencia fina, que contiene aceite mineral, seguida por W640 alternante y burbujas de aire, 12-17 embriones de 2 células sanas a partir de la inyección previa del día, se transfirieron en el recipiente. La ampolleta expandida se localizó y se mantuvo el oviducto entre la ampolleta y la cavidad, y se hizo un corte o muesca en el oviducto con una aguja de 28g cerca de la cavidad, haciendo seguro rasgar la ampolleta o cavidad. La pipeta se transfirió en el corte o muesca en el oviducto, y los embriones se soplaron, permitiendo primero a las burbujas de aire escapar de la pipeta. La almohadilla de grasa se empujó uniformemente en T^^V peritoneo, y los órganos reproductivos se dejaron deslizarse. La pared peritoneal se cerró con una sutura, y la piel se cerró con un sujetador de heridas. Los ratones se recuperaron en un calentador deslizante a 37°C por un mínimo de 4 horas. Los recipientes se regresaron a las jaulas e! pares, y se dejaron 19-21 días de gestación. Después del nacimiento, se dejaron 19-21 días post-parto antes del destete. El destete fue por sexos y se colocaron en jaulas por sexos separados, y se recortó una biopsia de 0.5 cm (usada para el genotipo) de la cola con tijeras limpias . Se preparó el ADN genómico a partir del recorte de la cola, usando un equipo comercialmente disponible (Equipo de Tejido DNenasy™ 96; Quiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El AD * genómico se analizó por PCR, usando cebadores diseñados para la porción 3' UTR (hGH) de la hormona de crecimiento humano del vector transgénico. El uso de una región única a la secuencia humana (identificada de una alineación de las secuencias de ADN 3' UTR de la hormona de crecimiento de ratón y humano) asegura que la reacción por PCR no amplifique la secuencia de ratón. Los cebadores zcl7,25! (SEC ID NO:30) y zcl7,252 (SEC ID NO:31), amplifican un fragmento de 368 base pares de hGH. Además, los cebadores zcl7,156 (SEC ID NO:32) y zcl7,157 (SEC ID NO:33), los cuales hibridizan a las secuencias del vector y amplifican el inserto de ADNc, pueden ser usadas junto con los cebadores hGH. En estos experimentos, el ADN d( animales positivos para el transgen, generará dos bandas, una banda de 368 base pares que corresponde al fragmento 3' UTR y una banda de tamaño variable que corresponde al inserto de ADNc. Una vez que los animales confirmaron ser transgénicos (TG) , se cruzaron en una cepa endogámíca por la colocación de una hembra TG con un macho de tipo nativo, o un macho TG con una hembra de tipo nativo. Como En tanto las crías nacieron y se destetaron, se separaron los sexos y sus colas se recortaron para los genotipos. Para verificar la expresión de un transgen en un animal vivo, se realizó una hepatectomía parcial. Se hizo una preparación quirúrgica del abdomen superior directamente por debajo del proceso xifoide. Usando técnica estéril, se hizo una incisión pequeña 1.5-2 cm por debajo del esternón, y el lóbulo lateral izquierdo del hígado se exteriorizó. Usando seda 4-0, se hizo una' atadura alrededor del lóbulo inferior, asegurándolo en el exterior de la cavidad corporal. Se usó una abrazadera atraumática para mantener la atadura mientras un segundo lazo de Dexon absorbible (American Cyanamid, Wayne, NJ) , se colocó próximo a la primer atadura. Se hizo un corte distante de la atadura Dexon, y aproximadamente 100 mg' del tejido de hígado escindido se colocaron en una capa de petri estéril. La sección del hígado escindida se transfirió a un conducto de bola de 14-ml de polipropileno, se congeló para romperse en nitrógeno líquido y se almacenó en hielo seco. El sitio quirúrgico se cerró con suturas y sujetadores de heridas. La jaula del animal se colocó a calentamiento a 37°C por 24 horas post-operativamente . El animal se verificó al día posterior a la operación, y se removieron los sujetadores de heridas 7-10 días después de la cirugía. El análisis del nivel de expresión del ARNm de cada transgen se hizo usando un ensayo de hibridación de solución de ARN o PCR de tiempo real en un Prism 7700 ABI (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Se preparó un vector de adenovirus, usando un incrementador de gen de albúmina específico del hígado un promotor basal (designado "promotor AEO") . El constructo de promotor de albúmina (designado pAEO) se construyó por la inserción de un fragmento de 2.2 kb de Notl/EcoRV de pA Bdelta2L (Pinkert et al., Genes Dev . £:268-276, 1987) y un segmento de 850 bp de Nru/Notl, que comprende el intrón de insulina II de rata, polienlazador Fse 1/Pmel/Acsl , y la secuencia poly A de la hormona de crecimiento humana en un vector fagémido comercialmente disponible (pBluescript KS(+); Stratagene la Jolla, CA) . Para la microinyección, el plasmido se digirió con Notl para liberar el cásete de expresión. Se construyó un vector de adenovirus adicional usando un promotor de gen de queratina (K14) específico de las células endoteliales (Vassar et al., Proc . Na tl .

Acad . Sci . USA 8_6_1563-1567 , 1989). La estructura lectora I abierta de 1038 bp que codifica al Zvegf3 humano de longitud completa, se amplificó por PCR de manera que se introduce un codon de iniciación optimizado y sitios de flanqueo Pmel y 3' Ascl, usando los cebadores ZC20,189 (SEC ID NO:349, y ZC20,181 (SEC ID NO:35). El fragmento resultante Pmel / Ascl se subclonó en el polienlazador de KF0114, un vector transgénico restringido al querat inocito basal que comprende el promotor de la" queratina (K14) humana (un fragmento de aproximadamente 2.3 Kb amplificado a partir del ADN genómico, [obtenido de Clontech Laboratories, Inc.] basado en la secuencia de Staggers et al.,, "Sequence of the promoter for the epidermal keratin gene, K14", GenBank Acceso #U11076, 1994), seguido por un intrón heterólogo (un fragmento 294 bp de BstXI/PstI de pIRESlhyg (Clontech Laboratories Inc.; véase Huang y Gorman, Nucl ei c Acids Res . 18:937-947, 1990), un polienlazador Pmel/Ascl, y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (un fragmento de 627 bp Smal/EcoRI; véase Seeburg ADN 1:239- 249, 1982) . El inserto transgénico se separó de la estructura del plasmido por la digestión Notl y purificación en gel de agarosa, y se fertilizaron los ova de los apareamientos de ratones B6C3FlTac o ratones FVB/Nta procreados, se microinyectaron y se implantaron en las hembras seudopreñadas esencialmente como se describe por Malik et al., Mol ec . Cel l . Bi ol . 15:2349-2358, 1995. Los buscadores transgénicos se identificaron por PCR en el ADN del extremo genómico usando cebadores específicos para la señal poli A de la hormona de crecimiento humano (ZC17,252, SEC ID NO:31, y ZC17,251, SEC ID NO: 30) para amplificar un producto de diagnóstico' de 360 bp . Las líneas transgénicas se iniciaron por los buscadores engendrados con los ratones C57BL/6Ta o FVB/NTac. Ratones transgénicos se diseñaron esencialmente como se describe anteriormente, usando promotores MT-1, K14 o AEO. Se generaron cuatro ratones transgénicos MT-1 l/zvegf3. En un animal (hembra), aproximadamente 800 moléculas de ARNm/célula de Zvegf3 se produjeron en el hígado después de la inducción de zinc. Este animal ha agrandado el hígado y los bazos. También observamos la proliferación de las células sinusoidales hepáticas y la hematopoiesis extra-medular. Un ratón transgénico (hembra) K14/Zvegf3 mostró un nivel de expresión bajo con peso corporal bajo, hematocitos bajos y conteo de plaquetas bajo. Un ratón transgénico (macho) AEO/Zvegf3 con un nivel bajo de expresión, presentó proliferación de las células sinudoidales del hígado.

Ejemplo 7 Un plasmido de expresión que contiene todo o parte de un polinucleótido que codifica a Zvegf3 se construyó vía una recombinación homologa. Un fragmento de ADNc de Zvegf3 se aisló por PCR usando la secuencia dd^r polinucleótido de la SEC ID NO:l, con las regiones de flanqueo a los extremos 5' y 3' que corresponden a las secuencias de vector que flanquean el punto de inserción Zvegf3. Los cebadores para cada PCR incluyen del extremo 5' a 3'; 40 bp de la secuencia de flanqueo a partir del vector de 17 bp que corresponde al término carboxilo amino de la estructura lectora abierta de Zvegf3. Diez µl de los 100 µl de la reacción de PCR se corrieron en gel de agarosa a temperatura de fusión baja al 0.8% (SeaPlauqe GTG®; FMC BioProducts, Rockland, ME), con amortiguador 1 x TBE para análisis. Los 90 µl restantes de la reacción de PCR se precipitaron con la adición de 5 µl de ÍM de NaCl y 250 µl de etanol absoluto. El plasmido pZPMd, el cual se ha cortado con Smal, se usó para la recombinación con el fragmento de PCR. Se construyó el plasmido pZMP6 a partir de pZP6 (depositado en el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo el No. de Acceso 98668), con los elementos genéticos de levadura tomados de pRS316 (depositado en el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo el No. Acceso 77145), un elemento del sitio de entrada ribosomal interno (IRES) de^ poliovirus, y el dominio extracelular de CD8 truncado al extremo C-terminal del dominio de la transmembrana. El pZMP6 es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus, los sitios de restricción múltiples para la inserción de la^^ secuencias de codificación, un codón de detención y un terminador de la .hormona de crecimiento humana. El plasmido también contiene un origen de replicación de E . col i ; una unidad de expresión marcadora seleccionable de mamífero que comprende un promotor SV40, incrementador y origen de replicación, un gen DHFR, y el terminador SV40; así como también las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y replicación en S. cerevi sia e . Cien microlitros de las células de levadura ! competentes (S. cerevi si a e ) se combinaron independientemente con 10 µl de las varias mezclas de ADN anteriores y se transfirieron a una probeta de electroporación ce 0.2 cm. Las mezclas de ADN/levadura se electropulsaron usando series de suministro de energía de 0.75 kV (5 kV/cm) , 8 ohms, 25 µF. A cada probeta se le agregó 600 µl de 1.2 M de sorbitol, y la levadura se colocó en dos alícuotas de 200 µl en dos placas URA-D y i se incubó a 30°C. Después de 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ a partir de una placa única se resuspendieron en 1 ml de H20 y se revolvieron brevemente a pelotillas de células de levadura. La pelotilla celular se resuspendió en 1 ml de amortiguador de lisis (Tritón al 2% X-100, SDS al 1%, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris, p IH 8.0, 1 mM EDTA) . Quinientos microlitros de la mezcla de lisis se agregaron a un tubo Eppendorf que contiene 300 µl de perlillas de vidrio lavadas acidas y 200 µl de fenol-cloroformo, sometidos a vórtices por intervalos de 1 minuto dos o tres veces, y se revolvieron por 5 minutos en un centrífugo Eppendorf a velocidad máxima. Trescientos microlitros de la fase acuosa se transfirieron a un tubo fresco, y el ADN se precipitó con < 600 µl de etanol (EtOH), seguido por centrifugación a 10 minutos a 4°C. La pelotilla de ADN se resuspendió en 10 µl de H20.

La transformación de las células hospederas de E . col i electrocompetente (Células Electromax DH10B™; obtenidas de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) , se hizo con 0.5-2 ml de preparación de ADN de levadura y « 40 ul de las células. Las células se electropulsaron a 1.7 kV, 25 µF y 400 ohms. Después de la electroporación, se colocaron 1 ml de SOC (Tryptona Bacto™ al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0.5%, 10 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgS04, 20 mM de glucosa), en alícuotas de 250 µl en cuatro placa^^ LB AMP (caldo LB (Lennox), 1.8% Agar Bacto™ (Difco), 100 mg/L Ampicilina) . Los clones individuales que albergan el constructo de expresión correcto para Zvegf3 se identificaron pc>r la digestión de restricción para verificar la presencia del inserto Zvegf3 y confirmar que las varias secuencias de ADN se han unido correctamente una con otra. Los insertos de los clones positivos se sometieron a análisis de secuencia. Se aisló el ADN de plasmido de gran escala usando un equipo comercialmente disponible (QUIAGEN Plasmid Maxi Kit, Qiagen, Valencia, CA) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. El constructo correcto se designo pZMP6/Zvegf3 (Figura 3) .

Ejemplo 8 Las células CHO DG44 (Chasin et al., Som . Cel l Mol ec . Genet . £2:555-666, 1986), se colocaron en cajas de petri de cultivos de tejido de 10 -cm y se dejaron crecer a confluencia a aproximadamente 50% a 70%, durante la noche a 37°C, C02 5%, en un medio F12/FBS de Ham (Medio F12 Ham, Life Technologies), suero de bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), 1% L-glutamina (JHR Biosciences ,f Lenexa, KS), 1% piruvato de sodio (Life Technologies). Las células entonces se transfectaron con el plasmido pZMP6/Zvegf3 por transfección mediada por liposomas usando una formulación de liposoma (p/p) 3:1 del lípido policatiónico de 2 , 3-dioleiloxi-N- [2 (espermincarboxamido) etil] -N, N-dimetil-l-propaniminio-trifluoroacetato y el lípido neutral dioleoil fosfat idiletanolamina en agua filtrada por membrana (Reactivo Lipofectamina™, Life Technologies), en una formulación de medio libre de suero (SF) (F12 Ham, 10 mg/ml de transferina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%) . El plasmido pZMP6/Zvegf3 se diluyó en tubos de 15 ml a un volumen total final de 640 µl con medio SF. 35 µl de la Lipofectamina™ se mezclaron con 605 µl del medio SF. La mezcla de Lipofectamina™ se agregó a la mezcla de AND y se dejó incubar por aproximadamente 30 minutos a* temperatura ambiente. Cinco ml del medio SF se agregaron a la mezcla de ADN: Lipofectamina™. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron y se agregó la mezcla de ADN: Lipofectamina™ . Las células se incubaron a 37°C por cinco horas, después se agregaron a cada placa 6.4 ml de F12/10% FBS Ham, medio PSN al 1%* Las placas se incubaron a 37°C durante la noche, y la mezcla de ADN: Lipofectamina™ se reemplazó con un medio fresco de FBS/Ham al 5% al siguiente día. Al día 3 de la post-transfecció , las células se dividieron en matraces T-175 en un medio de crecimiento. Al día 7 post-transfección, las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal FITC-anti-CD8 (Pharmingen, San Diego, CA) , seguido por perlillas magnéticas anti-FITC-conj ugadas (Miltenyi Biotec.) Las células positivos CD8 se separaron < usando columnas comercialmente disponibles (columnas mini-MACS; Miltenyi Biotec) de conformidad con las direcciones del fabricante y colocando en DMEM/Ham F12/5% de FBS sin los nucleósidos, pero con 50 nM de metrotrexato (medio de selección) . Las células son plaqueadas para la subclonación a una densidad de 0.5, 1 y 5 células por pozo en discos de 96 pozos en el medio de selección y se dejan crece! por aproximadamente dos semanas. Los pozos son verificados por evaporación del medio y llevados nuevamente a 200 µl por pozo como sea necesario durante este proceso. Cuando un porcentaje grande de las colonias en la placa está cerca de la confluencia, 100 µl del medio se colectan de cada pozo para el análisis por e^^ manchado dot, y las células se alimentan con un medio de selección fresco. El sobrenadante se aplica a un filtro de nitrocelulosa en un aparato de manchado dot, y el filtro se tratan a 100°C en un horno a vacío para desnaturalizar la proteína. El filtro se incuba en 625 de mM de Tris-glicina, pH 9.1, 5 Mm de ß-mercaptoetanol, a 65°C, 10 minutos, después en 2.5% de amortiguador Western A .lechoso seco sin grasa (gelatina 0.25%, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 0.05% Igepal CA-630) durante la noche a 4°C en un sacudidor de rotación El filtro se incubó con el conjugado de anticuerpo HRP en 2.5% de amortiguador Western A lechoso seco sin grasa por 1 hora a temperatura ambiente en un sacudidor rotatorio. El filtro entonces se lavó tres veces a temperatura ambiente en PBS más 0.01% de Tween 20, 15 minutos por lavado. El filtro se desarrolló con reactivos de quimioluminiscencia (equipo de etiquetación ELC™; Amersham Corp., Arlington Heights, IL), de conformidad con las direcciones del fabricante y expuestos a la película (Hyperfilm ECL, Amersham) por aproximadamente 5 minutos. Los clones positivos se tripsini zaron del disco de 96 pozos y se transfirieron a discos de 6 pozos en un medio de selección para aumento progresi?ro y análisis por manchado Western.

Ejemplo 9 Una proteína Zvegf3 de longitud completa, se produjo en células HBK transfectadas con pZMP6/Zvegf3 (Ejemplo 7), Las células BHK 570 (ATCC CRL-10317), se colocaron en discos de cultivo de tejidos de 10 cm y se dejaron crecer por aproximadamente 50 a 70% de confluencia durante la noche a 37°C, C02 al 5%, en un medio DMEM/FBS (DMEM, Gibcl/BRL High Glucosa; Life Technologies), suero de bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), 1 mM de L-glutamina ( JRH Biosciences, lenexa, KS), 1 mM de piruvato de sodio (Life Technologies). Las células entonces se transfectaron con pZMP6/Zvegf3 de transfección mediada por la liposoma (usando Lipofectamina™'' Life Technologies), en un medio libre del suero (SF) (DMEM suplementado con transferina 10 mg7ml, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, 1% de L-glutamina y 1% ele piruvato de sodio) . El plasmido se diluyó en tubos de 1-5 ml a un volumen final total de 640 µl con un medio SF. 35 µl de la mezcla de lípidos se mezclaron con 605 µl de medio SF, y la mezcla se dejó' incubar por aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Cinco mililitros del medio SF se agregaron al ADN: mezcla de lípidos. Las célula se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron, y la mezcla de lípido:ADN se agregó. Las células se incubaron a 37°C por cinco horas, después se agregó 6.4 ml de DMEM/FBS al 10%, PSN al 1% a cada placa. Las palcas se incubaron a 37°C durante la noche y la mezcla de ADN: lípido se reemplazó con un medio fresco FBS/DMEM al 5% al siguiente día. Al día 5 post-transfección, las células se dividieron en" matraces de T-162 en el medio de selección (DMEM + FBS al 5%, 1% de L-Gln, 1% NaPyr, 1 µM de metotrexato). Aproximadamente 10 días después de la transfección, dos discos de cultivo de 150 mm, de colonias resistentes al metotrexato de cada transfección, se tripsinizaron, y las células se vertieron y colocaron en un matraz T-162 y se transfirieron a un cultivo a gran escala.

Ejemplo 10 Se construyó un vector de expresión de la célula de mamífero para el dominio del factor de crecimiento de Zvegf3, esencialmente como se describe en el Ejemplo 7. La secuencia de codificación para elf dominio del factor de crecimiento (residuos 235-345 de la SEC ID NO:2), unida a una secuencia que codifica a una secuencia de señal secretoria t-PA optimizada (Patente Estadounidense No. 5,641,655) se unió al vector pZMPll linearizado corriente abajo del promotor CMV. El plasmido pZMVll es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene al promotor inmediatamente temprano CMV, un intron consenso a partir de la región variable del sitio o locus de la cadena pesada de inmunoflobulina, secuencias Kozak, sitios de restricción múltiples para la inserción de secuencias codificantes, un codon de detención, y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plasmido también contiene un elemento IRES del poliovirus, el dominio extracelular de DC8 truncado al extremo C-terminal del dominio de la transmembrana, un origen de replicación de E . col i , una unidad de expresión marcadora seleccionable de mamífero, que tiene un promotor SV40, un incrementador y un origen de replicación, un gen DHRF, el terminador SV49, y las secuercias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y replicación en S. cerevisiae. El vector resultante, se designó pZMPl l/zv3GF-otPA se muestra en la Figura 4. Las células BHK 570 se transfirieron con pZMPll/zv3GF-otPA y se cultivaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 9.

Ejemplo 11 Para la construcción de los vectores de adenovirus, la región codificante de la proteína del Zvegf3 humana, se amplificó por PCR, usando cebadores que agregan sitios de restricción Pmel y AscI, al término 5' y 3' respectivamente. Los cebadores PCR ZC20,180 (SEC ID NO:34) y ZC20,181 (SEC ID NO:35), se usaron con un patrón de ADNc de Zvegf3 de longitud completa en una reacción de PCR como sigue; en un ciclo a 95°C por 5 minutos; seguido por 15 ciclos a 95°C por 1 minuto; 61°C por 1 minuto, y 72°C por 1.5 minutos; seguido por 72°C por 7 minutos; seguido por un remojo a 4°C. El producto de reacción en PCR se cargó en gel de agarosa a temperatura de fusión baja al 1.2% en un amortiguador TAE (0.04 m Tris-Acetato,! 0.001 M EDTA). El producto PCR de Zvegf3 se escindió del gel y se purificó usando un equipo comercialmente disponible que comprende una columna giratoria de membrana de gel de sílice (QIAquick™ PCR Purification Kit and gel cleanup kit; Quiagen, Inc.) por las instrucciones del equipo. El producto de PCR entonces se A digirió con Pmel y AscI, se extrajo con cloroformo/fenol, se precipitó con EtOH y se rehidrató en 20 ml de TE (Tris/EDTA pH 8). El fragmento Zvegf3 de 1038 bp entonces se ligó en los sitios Pmel-Ascl del vector transgénico pTG12-8 (también conocido como pHB12-8; véase Ejemplo 6) y transformado en células competentes de E . col i DH10B™ por electroporación. Los clones que contienen Zvegf3 se identificaron por la minipreparación de ADN del plasmido seguida por digestión con Pmel y Ascl. Se secuenció un clon positivo para asegurar que no hubo supresiones y" otras anormalidades en el constructo. Se confirmó la secuencia de ADN de Zvegf3. El ADN se preparó usando un equipo comercialmente disponible (Equipo Maxi Quiagen, Inc.,) y el ADNc de Zvegf3 de 1038 bp se liberó del vector pTG12-8 usando enzimas Pmel y Ascl. El ADN se aisló en gel de agarosa de temperatura de fusión baja al 1% y se extraj ß^ del gel. El gel de sílice se fusionó a 70°C, y el ADN se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol amortiguado con Tris y se precipitó con EtOH. El ADN se resuspendió en 10 µl de H20. El ADNc de Zvegf3 se clonó en los sitios EcoRV-AscI de un pAdTrack-CMV (He, T-C. et al., Proc. Na t l *\ Aca d . Sci . USA 95:2509-2514, 1998). Este constructo contiene el marcador del gen de la proteína fluorescente verde (GPF) . El promotor CMV que acciona la expresión de GFP se reemplazó con el promotor SV40, y la señal de poliadenilación SV40 se reemplazó con la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana. Además, se reemplazó el polienlazador nativo con los sitios Fsel, EcoRV y Ascl. Esta forma modificada de pAdTrack-CMV se nombró pZyTrack. La ligación se realizó usando un equipo de ligación y selección de ADN ,< comercialmente disponible (equipo Fast-Link™; Epicentre Technologies, Madison, Wl) . Los clones que contienen Zvegf3 se identificaron por digestión de ADN miniprep. con Fsel y Ascl. Para linearizar el plásmido, aproximadamente 5 µg del plasmido Zvegf3 pZyTrack, se digirieron con Pmel. Aproximadamente, 1 µg del plasmido linearizado se cotransformaron con 200 ng de superenrrollado (He et . al. ibid.), en células BJ5183 de E . col i (He et. al., ibid.) . La co-transformación se hizo usando un Pulsador de Gen Bio-Rad a 2.5 Kv, 200 ohms y 25 µFa . La mezcla de co-transformación completa se colocó en 4 placas de LB que contienen 25 µg/ml de canamicina. Las colonias más pequeñas se perforaron y expandieron en LB/canamicina, y el ADN de adenovirus recombinante se identificó por procedimientos de minipreparación de ADN estándares. La digestión del ADN de adenovirus recombinante con Fsel y AscI confirmó la presencia del inserto Zvegf3. El ADN miniprep. del adenovirus recombinante, se transformó en células competentes de E . col i DH10B™, y el ADN se preparó usando un equipo Maxi (Quiagen, Inc.) de conformidad con las instrucciones del equipo . Aproximadamente, 5 µg del ADN adenoviral recombinante se digirió con la enzima Pací (New England Biolabs) por 3 horas a 37°C en un volumen de reacción de 100 µl que contienen 20-30U de Pací. El ADN digerido se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. La pelotilla de ADN se resuspendió en 10 µl de agua destilada. Un matraz de células QBI-293A (Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc . Canadá), inoculadas al día anterior y que crecen a confluencia del 60-70%, se transfectaron con el ADN digerido con Pací. El ADN digerido con Pací, se diluyó hasta un volumen total de 50 µl con HBS estéril (150 mM de NaCl, 20 mM HEPES) . En un tubo separado, 20 µl i de 1 mg/ml de sales de N- [ 1- ( 2 , 3-dioleoiloxi ) propil ] -N, N, N-trimetil-amonio (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianápolis , IN), se diluyeron a un volumen total de 100 µl con HBS. El ADN se agregó al DOTAP, se mezcló uniformemente por el pipeteado ascendente y descendente, y se dejó a temperatura ambiente por 15 minutos. El medio se removió de las células 293A y se lavó con 5 ml de medio esencial mínimo libre de suero (MEM) alfa, que contiene 1 mM de piruvato de sodio, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales MEM, y amortiguador HEPES 25 mM (reactivos obtenidos de Life Technologies, Gaithersburg, MD) , 5 ml de MEM libre de suero se agregaron a las células 293A y se mantuvieron a 37°C. La mezcla de ADN/lípido se agregó en forma de gotas al matraz T25 de las células 293A, se mezcló uniformemente y se incubó a 37°C por 4 horas. Después de 4 horas, el medio que contiene la ADN/lípido, se aspiró completamente y se reemplazó con 5 ml de MEM completo que contiene suero bovino fetal al 5%. Las células transfectadas se monitorearon para la expresión GFP y la formación de foci o focos (placas virales ) . Siete días después de la transfección de células 293A con el ADN adenoviral recombinante, las células expresaron la proteína GFP y comenzaron a formar focis o focos ("plaquetas" virales). El lisado viral crudo se colectó usando un raspador celular para colectar todas las células 293A. El lisado se transfirió a un tubo cónico de 50 ni. Para liberar la mayoría de las partículas de virus a partir de las células, se hicieron los ciclos congelados/cebados en un baño de etanol/hielo seco y a un baño de agua a 37°C. Este lisado crudo se amplificó ( amplificadó^ Primaria (1°)) para obtener una "pila" de trabajo del lisado rAdV de Zvegf3. Diez placas de 10 cm de células 293A cercanamente confluentes (80-90%), se colocaron hasta 20 horas previamente, 200 µl del lisado rAdV crudo se agregaron a cada placa de 10 cm y se monitorearon por 48 a 72 horas, observando el CPE bajo el microscopio de luz blanca y la expresión de GFP bajo el microscopia fluorescente. Cuando todas las células 293A mostraron CPE (Efecto Cytopático), esta 1° pila de lisado se colectó y se realizaron ciclos de congelación/cebado como se describe bajo el lisado rAdV crudo. La amplificación secundaria (2o) rAdV de Zvegf3 se obtuvo como sigue: Veinte discos de cultivos tejidos de 15 cm, de células 293A se prepararon de manera que las células fueron de 80-90% de confluencia. Todos los 20 ml del medio MEM al 5% se removieron y cada disco se inoculó con 300-500 µl del lisado rAdV amplificado 1°. Después de 48 horas, las células 293A se sometieron a lisas a partir de la producción del virus, lo lisado se colectó en botellas de centrífugos de polipropileno de 250 ml, y se purificó el rAdV . Se agregó detergente NP-40 a una concentración ! final de 0.5% a las botellas de lisado crudo para lisar todas las células. Las botellas se colocaron en una plataforma rotatoria por 10 minutos agitando tan rápido como sea posible sin que las botellas caigan. Los desechos se formaron en pelotillas por centrifugación a 20,000 x G por 15 minutos. El sobrenadante se transfirió a botellas de centrigufos de policarbonato de 250 ml de policarbonato, y se agregó una solución de 0.5 volumen PEG8000/2.5 M NaCl al 20%. Las botellas se sacudieron durante la noche en hielo. Las botellas se sometieron a centrifugación a 20,000 x G por 15 minutos, y el sobrenadante se descargó en una solución blanqueada. Usando un raspador celular estéril, el virus/PEG blanco precipitado de las dos botellas se resuspendió en 2.5 de PBS. La solución del virus resultante se colocó en tubos microcentri fugos de 2 ml y se centrífugo a 14,000 x G en el microcentrifugo por 10 minutos para remover cualquier desecho celular adicional. El sobrenadante de los tubos microcentrí fugos de 2 ml, se transfirió en un tubo de precipitación cubierto de polipropileno de 15 ml y se ajustó a una densidad de 1.34 g/ml con CsCl . Se estimé el volumen de la solución del virus, y se agregó 0.55 g/ml de CsCl. El CsCl se disolvió, y 1 ml de esta solución pesó 1.34 g. La solución se transfirió a tubos" centrífugos de pared gruesa de policarbonato de 3.2 ml y se giraron a 348,000 x G por 3-4 horas a 25°C. El virus formó una banda blanca. Usando las pintas de las pipetas de perforación amplia, se colectó el virus de la banda. El virus del gradiente tuvo una gran cantidad de CsCl la cual se ha removido antes de usarse en las células. Las columnas de intercambio de ione:{^? comercialmente disponibles (columnas PD-10, preenvasadas con Sephadex® G-25M; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , se usaron para desalar la preparación del virus. La columna se equilibró con 20 ml de PBS. El virus se cargó y se dejo correr en la columna. 5 ml de PBS se agregaron a la columna, y se colectaron las fracciones de 8-l( gotas. Las densidades ópticas de diluciones 1:50 de cada fracción se determinaron a 260 nm en un espectrofotómetro. Se presentó un pico de absorbencia claro entre las fracciones 7-12. Estas fracciones se vertieron, y se determinó la densidad óptica (OD) de una dilución 1:25. La OD se convirtió a la concentración del virus usando la fórmula (OD a 260 nm) ( 25 ) ( 1. lxlO12 ) = virones/ml. La OD de una dilución 1:25 del rdAV Zvegf3 fue 0.145, dando una concentración de virus de 4 x 1012 viriones /ml . Para almacenar el virus, se agregó glicerol al virus purificado a una concentración final de 15%, mezclado uniformemente pero efectivamente, y se almacenó en alícuotas a -80°C. Un protocolo desarrollado por Quantum Biotechnologies, (Montreal, Canadá), siguió después de medir la infectividad del virus recombinante. Breve enteß se sembraron dos placas de cultivo de tejidos de 96 pozos con células 1 x 104 293A, por pozo en MEM que contiene suero de bovino fetal al 2% para cada virus recombinante a ser ensayado. Después de 24 horas, se hicieron diluciones de 10 partes de cada virus de 1X10"2 a 1X10"14 en MEM que contiene suero bovino fetal al 2%. 100 µl d^B cada dilución se colocaron en cada uno de los 20 pozos. Después de 5 días a 37°C, los pozos se leyeron ya sea positivamente o negativamente por su Efecto Citopático (CPE) y se calculó un valor para las "Unidades Formadoras de Placas/ml" (PFU) . La formulación TCID50 usada fue por Quantum Biotechnologies, Inc., anteriormente. El titulador (T)se determinó de una placa en donde el virus de diluyó de ~2 a 10~14, y se leyó 5 días después de la infección. A i cada dilución se determinó una proporción (R) de pozos" positivos por CPE por el número total de pozos. Para calcular el titulador de la muestra de virus sin diluir:' el factor "F"=l+d ( S-0.5 ) ; en donde "S" es la suma de las proporciones (R) ; y "d" es LoglO de la series de dilución, por ejemplo, "d" es igual a 1 por una serie de dilución de diez partes. El titulador de la muestra sin diluir es T=10 TCÍDso/ml a pfu/ml, 0.7 es substraído del exponente en el cálculo para el titulador (T) . El adenovirus Zvegf3 tiene un titulador 1.8 x 1010 pfu/ml.

Ejemplo 12 El tratamiento de ratones con adenovirus Zvegf3 condujo cambios en el hígado y los bazos. El hígado fue pálido y muy agrandado, con bazos agrandados en las puntas de los lóbulos. El hígado también mostró proliferación celular sinusoidal. Los cambios también se observaron en hepatocitos (hipertrofia, degeneración, y necrosis) y fueron más probablemente efectos no específicos de la infección de adenovirus. El cambio del bazo consiste de hematopoiesis extramedularmente incrementadas, las cuales se correlacionan con tamaño del i bazo agrandado.

Ejemplo 13 Los datos de ratones transgénicos y tratados con el adenovirus fueron consistentes con la hematopoiesis y/o angiogénesis incrementada en los animales de prueba. Un estudio fue por lo comprometido para probar si las células estimuladas con Zvegf3 suministradas adenoviralmente en los compartimentos hematopoiet icos o linfoides proliferaron, como se determina por la examinación de la sangre periférica, la examinación histológica, e incorporación de la uridina bromodesoxi (BrdU) en los tejidos. Los ratones (macho, C57BI, de 7 semanas de edad), se dividieron en tres grupos. Al día 0, se administró adenovirus Zvegf3 o parenteral al primero (n=ll) y segundo grupos (n=12), respectivamente, vía la vena posterior, con cada ratón que no recibió tratamiento. A cada ratón se le dieron dos dosis intraperitoneales de 3 mg de solución BrdU recientemente elaborada a apr ximadamente 24 y 12 horas antes del sacrificio. A los días 2, 4, 6, 8 y 10, dos ratones de cada grupo de tratamiento y uno o dos ratones no tratados, se sacrificaron, y los tejidos y la sangre se cosecharon. Las muestras se analizaron para el conteo sanguíneo completo (CBC) y química del suero, y se prepararon laminillas para el análisis manual celular del progenitor de la médula y sangre diferencial. El fémur, pulmón, corazón, timo, hígado, riñon, bazos, páncreas, duodeno y nudos linfáticos mesentéricos se sometieron JrJ histología estándar y se valoraron por la incorporación de BrdU. El revestimiento del duodeno sirvió como el control de tejido para la incorporación de BrdU. Además, dos ratones que recibieron aproximadamente la mitad de la dosis y las partículas de adenovirus Zvegf3 y un ratón que recibió la completa del adenovirus parenteral se sacrificó y analizó como se describe anteriormente al día 16. Una pieza del hígado de cada ratón se- resguardó para el ensayo de ARNm de la proteína de adenovirus para examinar el curso del tiempo de la expresión de las preparaciones de adenovirus. Comenzando al día 6, la mayoría de los animales se trató con ya sea adenovirus que ha visiblemente agrandado el hígado y bazos, comparado con los ratones no tratados. Los hígados de los ratones tratados con" adenovirus Zvegf3 tienden a observarse más pálidos que los animales tratados con el virus parenteral. La proliferación de las células sinusoidales se observó en el hígado. La inspección visual sugirió que estas células fueron células originales y/o fibroblastos. El color del bazo fue el mismo en ambos grupos. La mayoría de los animales que recibieron el adenovirus Zvegf3 tienen eje9 de fémur más descoloridos, con la médula más iluminada en color . Las CBCs de la sangre periférica mostró una posible diferencia en el conteo de plaquetas, pero no en los conteos de RBC o WBC entre Zvegf3 y animales tratados con el virus parenteral. En comparación con los grupo{ tratados con el virus paternal y con los no tratados, el grupo Zvegf3 tuvo el conteo de plaquetas más bajo a los días 2, 4, 6 y 8, pero no al día 10. El volumen medio de la plaqueta (tamaño promedio de plaquetas individuales) en el grupo Zvegf3 también tendió a ser mayor, consistente con un incremento relativo en la población de plaquetas inmaduras más grandes. El etiquetado BrdU mostró incremento en la proliferación celular en el riñon, principalmente en la médula y a una extensión menor en la corteza. Las *^ células proliferantes parecen ser células intersticiales, las cuales pueden incluir fibroblastos y/ células mesangiales.

Ejemplo 14 Se ensayó Zvegf3 en un ensayo de tumor de anillo aórtico (Nicosia y Ottinetti, Labora Inves ti ga ti on 6J3 ( 1 ): 115 , 1990 ; Villaschi y Nicosia, Am . J. Pa thol ogy 143(1) :: 181-190, 1993). Las aortas torácicas se aislaron de ratas macho SD de 1-2 meses de edad y se transfirieron a cajas de petri que contienen solución de sal amortiguada HANK. Las aortas se embebieron con solución de sal amortiguada HANK para remover la sangre, y el tejido adventicio circundante de la aorta fue cuidadosamente removido. Las aortas limpias se transfirieron a cajas de petri que contienen medio basal EBM, libre de suero (Clonetics. San Diego, CA) . Los anillos aórticos se obtuvieron por los cortes de secciones de aproximadamente 1 mm usando una navaja de espalpelo. Los extremos de las aortas usadas para mantener la aorta en su lugar, no se usaron. Los anillo se enjuagaron con un medio basal EBM fresco y se colocaron individualmente en pozos de una placa de 24 pozos revestida con Matrigel (Becton Dikinson, Bedford, MA) . Los anillos se sobrecargaron con un adicional de 50 µl de Matrigel y se colocaron a 37°C por 30 minutos para dejar a la matriz en gel. Las muestras de prueba se diluyeron en medio libre de suero basal EBM suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y amortiguador HEPES y se agregaron a ml/pozo. El control de ambiente fue un medio libre de suero basal EMB solo. Se usó Basic FGF (Systems R&D, Minneapolis, MN ) a 20 ng/ml, como un control positivo. El adenovirus pZyTrack de Zvegf3 (Ejemplo 11), se agregó a los pozos, asumiendo un conteo de células de 500,000 células y una multiplicidad de infección de 500?^P partículas/célula. Se usó un adenovirus ZyTrac nulo (zPar) como un control. Las muestras se agregaron en un mínimo de cuadrupletos . Los anillos se incubaron por 5-7 días a 37°C y se analizaron para crecimiento. El tumor aórtico. se registró por observadores múltiples, protegidos usando 0 como no crecimiento y 4 como crecimiento máximo. El adenovirus Zvegf3 produce un incremento significante en el tumor, comparado con los controles y fue comparable con otros factores de crecimiento potentes (por ejemplo, bFGF) . En experimentos" adicionales, el dominio del factor de crecimiento Zvegf3 purificado también causó un incremento significante en el tumor a concentraciones bajas a aproximadamente 50 ng/ml. Las células responsivas Zvegf3 se tiñeron por actina del músculo suave alfa (características de SMCs), factor von Willebrand (características de las células endoteliales), colágeno tipo I (características ^^ fibroblastos), y vimetinas (teñidos los tres tipos celulares) . Los patrones de teñido observados indican que las células fueron fibroblastos y células del músculo suave, con la posible inclusión de pericitos.

Ejemplo 15 Treinta ratones (macho, c57BL6), se inyectaron cada uno subcutáneamente con 2.5 x 105 Lewis de células de carcinoma de pulmón (obtenidos de American Type Culture Collection, Mannassas, VA) . Tres días después del implante de las células, los ratones se dividieron en tres grupos de diez y se inyectaron con ya sea, salina, adenovirus Zvegf3 (partículas 1 x 1011), o adenovirus de control (partículas lxlO11) . El crecimiento de los tumores de monitoreo por la medición dimensional al día 14 y por el peso del tumor voluminoso al tiempo del sacrificio (día 21) . Los pulmones, hígados y tumores, se examinaron por métodos histológicos. El tamaño del tumor fue significantemente menor en el grupo tratado con Zvegf3 comprado con el grupo de adenovirus de control (p<0.007), pero no significantemente diferentes del grupo tratado con salina (p=0.6) . La incidencia de metástasis fue baja y no difiere entre los grupos.

Ejemplo 16 La actividad mieloproliferativa de Zvegf3 se probó en un modelo de ratón de mielosupresión . Al día 0, ratones (macho C57BI) en los grupos mielosuprimidos se administraron 450cGy de radiación y 1.2 mg ^^B Carboplatino . Una segunda serie de ratones permanecieron sin tratamiento. Entre los días 0 y 7, la Zvegf3 purificada, tro bopoietina, o vehículo de control se administraron subcutáneamente. A los días 7, 6, 10, 15 y 20, los ratones se sangraron bajo anestésicos por punción retro-orbital. Las muestras de sangre se analizaron por CBCs, y se hicieron laminillas por análisis de las células inmaduras y diferenciales manuales. Cuando se observó la recuperación de los linajes de las células de la sangre, los animales se sacrificaron. Se cosechó la médula ósea por análisis microscópico y ensayo progenitor de médula. El hígado y los bazos se cosecharon por examinación histológica para determinar la hematopoiesis extramedular . El pulmón, timo, corazón, testículos, y riñon, se analizaron por histología .

Ejemplo 17 Los anticuerpos anti-peptídicos policlonales se prepararon por inmunización de dos hembras New Zeland con conejos con los péptidos huZvegf3-1 (residuos 80-104 de la SEC ID N0:2), huzvegf3-2 (residuos 299-314 de la SEC ID NO:2), huZvegf3-< (residuos 195-225 de la SEC ID NO:2, con un residuo cis C-terminal) . Los péptidos se sintetizaron usando un sintetizador peptídico Modelo 431A Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los péptidos huzvegf3-l, huZvegf3-3 y huZvegf3-4, entonces se conjugaron a la proteína portadora hemocianina del linfo clave activado por maleimida (KLH) a través de los residuos de cisteína (Pierce Chemical Co . , Rockfordd, IL) . El péptido Zvegf3-2 se conjugó con la proteína^^ portadora KLH usando gluteraldehido . A los conejos se les dio a cada uno, una inyección intraperitoneal inicial (IP) de 200 µg del péptido conjugado en Adyuvante Freund Completo (Pierce Chemical Co . ) seguido por inyecciones IP de refuerzo de 100 µg de péptido conjugado en el Adyuvante Freund Incompleto cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la tercei" inyección de refuerzo, los animales sangraron y se colectó el suero. Los conejos entonces se reforzaron y sangraron cada tres semanas. Los anticuerpos específicos al peptido huZvegf3 fueron purificados por afinidad a partir del conejo usando una columna peptídica CNBr-Sepharose® 41 (Pharmacia Biotech), que se preparó usando 10 mg de los péptidos respectivos por gramo de CNBr-Sepharosa®, seguida por la diálisis en PBS durante la noche. Los anticuerpos huZvegf3 específicos al péptido se caracterizaron por un verificador titulador de ELISA, usando 1 µg/ml del péptido apropiado como, un anticuerpo objetivo. Los anticuerpos específicos del péptido huZvegf3-l tienen un límite de detección inferior (LLD) de 500 pg/ml por ELISA en su anticuerpo objetivo apropiado y reconocen a la proteína recombinante de longitud completa (MBP-fusión; véase Ejemplo 28) por ELISA. Los anticuerpos específicos al péptido huZvegf3-2 tienen un LLD de 1 ng/ml por ELISA. Los anticuerpos específicos al péptido huzvegf3-3 tienen un LLD de 50 ng/ml por ELISA y proteína recombinante reconocida por el análisis del Manchado Western. Los anticuerpos específicos al péptido huZvegf3-4 tienen un LLD de 5 uB pg/ml por ELISA y una proteína recombinante reconocida por el análisis del Manchado Western.

Ejemplo 18 Se analizó Zvegf3 recombinante por el manchado Western, usando anticuerpos a los péptidos huzvegf3-3-huzvegf3—3. La proteína se produjo en las células BHK como se describe anteriormente y en células 293 y MVEC (endoteliales microvasculares), transfectadas con el vector de adenovirus de conformidad con los métodos convencionales. Las muestras se sometieron a elctrofóresis y se transfirieron a nitrocelulosa (0.2 µm; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a temperatura ambiente usando una Manchador modelo TE22 de Hoeffer Scientific Instruments (San Francisco, CA) , con ! agitaciones de conformidad con las instrucciones proporcionadas en el manual del instrumento. La transferencia se corrió a 500 mM por una hora o 50 mM por 12 horas en un amortiguador que contiene 25 mM de base Tris, 200 mM de glicina, y metanol al 20%. Los filtros entonces se bloquearon con leche seca sin grasa al 10% en amortiguador A. (50 mM Tris (pH 7.4), 5 mM de EDTA (pH 8.0), 0.05% Igepal CA-630, 10 mM de NaCl, 0.25% gelatina)! por 10 minutos a temperatura ambiente. La nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, después se agregó el anticuerpo primario en el amortiguador A que contiene 2.5% de leche seca no grasa. Los manchados se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente durante la noche a 4°C con sacudimiento o vueltas uniformes. Después de incubación, los manchados se lavaron tres veces por 10 minutos cada uno en el amortiguador A. Se agregó el anticuerpo secundario (conjugado IgG de anti cabra de conejo a peroxidasa de rábano picante; obtenido de Rockland Inc., Gilberstville, PA) diluido 1:400 en amortiguador A que contiene 2.5% de leche seca sin grasa y los manchados se incubaron por una hora a temperatura ambiente con sacudimientos y oscilaciones. Los manchados entonces se lavaron tres veces, 10 minutos cada uno, en I amortiguador A, después rápidamente enjuagado en H20. Los manchados se desarrollaron usando reactivos de substratos quimioluminiscentes comercialmente disponibles (reactivos SuperSignal® ULTRA 1 y 2, mezclados 1:1; reactivos obtenidos de Pierce Chemical Co . ) , y expuestos a película (Hyperfilm ECL™; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , por tiempo cue varía de 1 segundo a 5 minutos o como sea necesario . Usando el anticuerpo 3-1, el Zvegf3 de longitud completa producido en las células BHK, mostró dos bandas (Mr « 46 kDa y 30 kDa) bajo condiciones de reducción. La banda más larga fue consistente con el tamaño del monómero Zvegf3 de longitud completa, y la banda más pequeña con el dominio CUB + región interdominio. condiciones de no reducción, hubo una banda mayor a Mr « 78 kDa, la cual parece ser la molécula de longitud completa, dimerizada. Dos bandas menores, más pequeñas también se observaron. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo ' 3-3 , pero bajo condiciones de reducción la banda más pequeña corrió a Mr a 22 kDa. En análisis de la secuencia de la banda más pequeña mostró estar aislada del dominio del factor de crecimiento. El dominio del factor de crecimiento ! recombinante (producido en las células BHK) , analizado usando el anticuerpo 3-3, corrió como una banda amplia de Mr « 46 18 kDa bajo condiciones de reducción. Bajo condiciones de no reducción, la proteína corrió como dos bandas de Mr « 16 kDa y 28 kDa, indicando la presencia de tanto formas diméricas como monoméricas del dominio del factor de crecimiento. La proteína Zvegf3 producida en las células 293'" que crecen en un medio libre de suero, mostró tamaños consistentes con la proteína de longitud completa predicha. Bajo condiciones de reducción, la proteína corrió a Mr « 47 kDa, y bajo condiciones sin reducción a Mr » 78 kDa, cuando los manchados se probaron con ya sea anticuerpo 3-1 o 3-3. La adición del suero al medio resultó en el desdoblamiento de la proteína como se observa en el material producido por BHK.

Las células MVEC crecieron en la presencia de proteína Zvegf3 producida en suero al 1% que corre a Mr ^ 23 kDa bajo condiciones de reducción y Mr « 28 kDa bajo condiciones sin reducción usando el anticuerpo 3-3. Estos resultados indican el desdoblamiento de la proteína con el anticuerpo reconociendo las formas monoméricas y ! diméricas del dominio del factor de crecimiento. Cuando las células MVEC se adaptaron al medio libre de suero, se observó la proteína de longitud completa.

Ejemplo 19 El dominio del factor de crecimiento Zvegf3 se produjo en células BHK 570 en factores celulares. Se cosecharon tres litros de cultivo y el medio fue estéril filtrado usando un filtro de 0.2 µl . La expresión de los niveles se estimó por el análisis del manchado western de las muestras del medio concentradas a 20X contra 5K de corte y diluidas serialmente en dos partes a 1.25X. La intensidad de la señal se comparó con el mismo manchado a partir de una proteína de fusión MBP-Zvegf3 estándar1 (véase Ejemplo 26) para lo cual, la concentración de la proteína se ha determinado por el análisis de aminoácido. Los niveles de expresión fueron consistentemente entre 0.25 y 0.35 mg/L del medio. La proteína se purificó del medio acondicionado por una combinación de cromatografía de intercambio de cationes y cromatografía de interacción hidrófoba. El medio de cultivo se diluyó con ácido acético 0.1 M, pH 3.0, que contiene NaCl 0.3M a una proporción de 60%:40% (medio:ácido acético) para suministrar un flujo proceso a 14 mS de conductividad y pH 4.0. Este flujo se suministró a una resina de intercambió catiónico fuerte (Poros® HS; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) con un volumen de asentamiento de 50 ml en una columna de 2 cm de diámetro a una velocidad de flujo de 20 ml/minuto. Un asentamiento de 50 mL fue suficiente para procesar 45 L del medio y capturar toda la proteína objetivo. L* proteína enlazada se eluyó, después del lavado de la columna por 10 volúmenes de columna en ácido acético 10 mM con 0.15 M de NaCl a pH =4.0, por la formación de un gradiente lineal a 2M NaCl en ácido acético 10 mM, pH 4.0. Diez ml de fracciones se capturaron en tubos que contienen 2 ml de Tris 2.0 m, pH 8.0 para neutralizaj la acidez. Las muestras de la columna de intercambio catiónico se analizaron por PAGE SDS con teñidos de plata y teñido westerr para la presencia de Zvegf3. El dominio de crecimiento vegf3 eluyó a 0.2-0.5 M NaCl. Se vertieron las fracciones que contienen la proteína. Un asentamiento de 25 ml de medio de cromatografía (medio de cromatografía Toso Haas Ether) en una columna de 2 cm de diámetro, se equilibró en 1.8 M (NH4)2S04 en 25 mM de amortiguador de fosfato de Na a pH 7.4. La proteína vertida de la etapa de intercambio de cationes, se ajustó! a 1.8 M de (NH2)2S04 en 25 mM de fosfato de Na, pH 7.0. Esta corriente se fluyó sobre la columna a 10 ml/minuto. Una vez que la carga se completó, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna con el amortiguador de equilibrio antes de la elución con un gradiente de columna 10 formado entre el amortiguador de equilibrio y 40 mM de ácido borónico a pH 8.8. La proteína del dominio deft factor de crecimiento Zvegf3 eluyó casi absolutamente en el gradiente entre 1.5 y 1.0 M (NH4)2S02. A este punto, la proteína fue 40-60% pura con un mayor contaminante siendo la proteína 4 de enlace al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP4). La proteína de la etapa de cromatografía HI( (éter), se aplicó a una columna de HPLC de fase inversa. La proteína del dominio del factor de crecimiento Zvegf3 eluyó a acetonitrilo al 36%. Este material todavía contiene aproximadamente 205 de (mole/mole) IGBF .

Ejemplo 20 El dominio del factor de crecimiento Zvegf3 recombinante, se purificó del medio acondicionado de células por una combinación de cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de hidrófoba, y cromatografía de afinidad de níquel. La proteína se capturó en un medio de intercambio de catión fuerte y se eluyó esencialmente como se describe en el Ejemplo 19. La proteína eludía es además purificada por la cromatografía de interacción hidrofóbica en una resina de éter (Poros® ET; PerSeptive Biosystems) . La proteína Zvegf3 parcialmente purificada es entonces enlazada a un^k resina quelada de níquel a pH 7.0-8.0 en amortiguador de fosfato de Na 25 mM que contiene 0.25 M de NaCl. La proteína enlazada se eluyó con un gradiente de pH descendiente hacia abajo a pH 5.0 o un gradiente de imidazol. El eluado de la columna de níquel se ajustó a 1 M (NH4)2S04, 20 mM MES (ácido etansulfónico morfolino) pH 6.0 y se pasó a través de una cromatografía en columna de interacción hidrófoba de feniléter (Pros® PE, PerSeptive Biosystems) que ha equilibrado en 1 M(NH4)2S04, 20 M MES, pH 6.0. Se retienen los contaminantes menores y el IGFBP4 en la columna. Se colecta la fracción a través del paso, el cual contiene Zvegf3 altamente purificado. La proteína colectada es desalada de conformidad con los métodos convencionales (por ejemplo, diálisis, cromatografía de intercambio iónico) .

Ejemplo 21 La Zvegf3 recombinante se analizó por su actividad mitogénica en las células del músculo suave aórtico humano (-lAoSMC; Clontecs Corp.; Walkersville , MD) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC; Clonetics Corp) . HAoSMC y HUVEC, se colocaron a una densidad de 5,000 células/pozo en placas de cultiva de 96 pozos y se hicieron crecer por aproximadamente 24 horas en DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal a 37°C. Las células se hicieron quiescentes y se incubaron por 24 horas en un medio DMEM/Ham F-12 libre de suero que contiene insulina (5 µg/ml), transferina (20 µg/ml), y selenio (16 pg/ml) (ITS) . Al día del ensayo, el medio s^^ removió, y las muestras de prueba se agregaron a los pozos por triplicado. Las muestras consistieron de ya sea, medio acondicionado (CM) de células del queratinocito humano HaCaT infectadas adenoviralmente (Boukamp et al., J. Cell. Biol. 106: 761-771, 1988), expresando el Zvegf3 de longitud completa, el dominio del factor de crecimiento purificado expresado en células BHK, o medio de control a partir de las células infectadas con el adenovirus parental (Zpar) . El CM se concentró 10 veces, usando un dispositivo de filtro! centrífugo con una membrana de filtro 10J (Ultrafree®; Millipore Corp.; Bedford, MA) , Después se diluyó nuevamente a 3X con un medio ITS y se agregó a las células. El CM de control se generó de las células HaCaT infectadas con una proteína verde fluorescente parenteral que expresa el adenovirus y se trataron idénticamente con el CM Zvegf3. La proteína purificada en el amortiguado] que contiene 0.1% de BSA fue serialmente diluida en un medio ITS a concentraciones de 1 µg/ml a 1 ng/ml y se agregaron a la placa de prueba. Un amortiguador de control de BSA al 0.1%, se diluyó idénticamente a la concentración más alta de la proteína Zvegf3 y se agregó a la placa. Para la medición de la incorporación B [3H] timidina, 20 µl de una pila de 50 µCi/ml en DMEM, se agregaron directamente a las células, por una actividad final de 1 µCi/pozo. Después de otras 24 horas de incubación, la actividad mitogénica se valoró por la medición de la captación de [3H] timidina . El medio se removió, y las células se incubaron con 0.1 ml de tripsina hasta que las células se separaron. Las células se cosecharon en placas de filtros de 96 pozos usando un cosechador de muestra (cosechador FilterMate™; Packard Instrument Co.; Meriden, CT). Las placas entonces se1 secaron a 65°C por 15 minutos, se sellaron después agregando cóctel de escintilación de 40 µl/pozo (Microscint™ 0; Packard Instrument Co . ) y se contaron en un contador de escintilación de microplaca (Topcount®; Packard Instrument Co) . Los resultados en la Tabla 8 de muestran que el Zvegf3 CM tiene aproximadamente 1.5 veces la mitogénica superior en las células HAoSM sobre el control de CM, y la proteína purificada causa aun incremento máximo de 1.8 veces en la incorporación de [3H] timidina sobre el amortiguador de control.

Tabla 8 CPM Incorporado Muestra Media Desv. Estándar Zvegf3 (3 x CM) 81089 8866 Zpar (3x CM) 58760 2558 Dominio Zvegf3 GF, 1 µg/ml 63884 3281 Dominio Zvegf3 GF, 500 57484 9744 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 100 70844 10844 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 50 61164 2813 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 10 60676 1514 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 5 ng/ml 60197 2481 Dominio Zvegf3 GF, 1 ng/ml 49205 5208 Control amortiguador 39645 9793 PDGF 10 ng/ml 50634 4238 (respuesta máxima) Medio solo (respuesta 24220 2463 basal ) Los resultados presentados en la Tabla 9 demuestran que el Zvegf3 CM no tiene actividad mitogénica en el HUVEC, comparada con el control CM, y la proteína purificada causa un incremento máximo de 1.3 partes en la incorporación de la [3H]timidina sobre en amortiguador de control .

Tabla 8 M Incorporado Muestra Media Desv . Estándar Zvegf3 (3 x CM) 62723 10716 Zpar (3x CM) 61378 1553 Dominio Zvegf3 GF, L µg/ml 44901 6592 Dominio Zvegf3 GF, 500 41921 5330 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 100 35613 5187 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 50 31107 525 ng /ml Dominio Zvegf3 GF, 10 28505 2950 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 5 ng/ml 29290 988 Dominio Zvegf3 GF, 1 ng/ml 28586 2718 Control amortiguador 33461 404 VEGF 50 ng/ml 53225 5229 (respuesta máxima) Medio solo (respuesta 22264 2814 basal ) Ejemplo 22 Se ensayó la proteína Zvegf3 recombinante para la estimulación de la liberación del calcio intracelular como un indicador del enlace receptor y activación. Las células se cultivaron en laminillas cubiertas con vidrio de borosilicato en cámaras. Al día del ensayo, las células se incubaron por 30 minutos a ambiente en amortiguador KRW (KrebsRingerWollheim; 140 mM NaCl, 3.6 mMKCl, 0.5 mM NaH2P04, 0.5 mM MgS02 2 mM NaHC03, 3 mM glucosa, 1.5 mM CaCl2, 10 mM HEPES pH 7.4), que contiene 2 µM de fura-2 Am (obtenido de Molecular Probes Inc., Eugene, OR) , lavados dos veces con amortiguador KRW, y dejados permanecer a temperatura ambiente por al menos 15 minutos antes de la adición del factor di crecimiento o medio de cultivo (CM) condicionado con la célula a ser probada. Se midieron los cambios en el calcio citosólico por la relación de fluorescencia (excitación a 340 nm, divididos por la excitación a 380 nm) . La formación de imágenes digitales se llevó a cabo usando un microscopio fluorescente invertida TE300), equipada con un objetivo de aceite (Nikon 40x Plan Fluor) . La imágenes se adquirieron usando una cámara digital CCD Princeton y se analizaron con un software Universal Imagine Metafluor. Los datos se presentan en la Tabla 10.

Tabla 10 Linea celular Zvegf3 CM Control CM VEGF PDGF BB Células de + anillo aórtico Pericitos + Células del + músculo suave aórtico Fibroblastos + adventicios aórticos Ejemplo 23 Se realizó el manchado Northern usando ARN total a partir de las líneas celulares guales A172 y neuronales (glioblastoma), NTera 2 (precursor neuronal del teratocarcinoma ; obtenido de Stratagene Clonin! Systems, La Jolla, CA) , U-87 MG (glioblastoma/astrocitoma), U-118 ME (Glioblastoma), U138 G (glioblastoma), U373 MG (glioblastoma). Excepto como se noto, las líneas celulares se obtuvieron del American Type Culture Collection, Masannas, VA. Se prepararon manchados usando 10 µg de ANR por línea. Se generó una sonda de aproximadamente 400 bp por digestión del ADNc de Zvegf3 humano con EcoRI y BglII. La sonda de ADN fue en electrofóresis en gel seguida por extracción usando una columna giratoria que contiene una membrana de gel de sílice (QIAquick™ Equipo de Extracción en Gel; Quiagen, Inc., Valencia, CA) . La sonda se etiquetó radioactivamente con 32P usando un equipo comercialmente disponible (sistema de etiquetación aleatorio-cebado Rediprime™ II; Amersham Corp., Arlington Heights, IL), de conformidad con las instrucciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de empuje. La hibridación tomó lugar durante la noche a 65°C en una solución comercialmente disponible (Solución de Hibridación ExpresHyb™; Clontech Laboratories, Inc.). Los manchados se lavaron entonces 4X en SCC 2X y 0.05% SDS a temperatura ambiente, seguido por dos lavados en SSC 0. IX SDS al 0.1% a 50°C. Se detectó un¿ tamaño de transcripto a aproximadamente 4 kb en muestras de A172, U-87 MG, U-188 MG, U138 MG, y U373 MG . La intensidad de la señal fue superior para U373 MG, U-118MG, y U-87 MG , Ejemplo 24 Se combinaron 10 µg de la proteína del factor de crecimiento Zvegf3 recombinante con 438 µl de PBS que contiene 1 mCi Na-125I (Alersham Corp.) . Se agregó una perlilla de poliestireno no porosa, derivatizada (IODO-Beads®; Pierce Chemical Co., Rockford, IL), y la mezcla de reacción se incubó un minuto en hielo. La proteína yodatada se separó de la sola incorporación de 125I por filtración en gel, PBS de amortiguador de elusión, gelatina 0.25%. La fracción activa contiene 4.9 µg/mL de 125I-Zvegf3 como una actividad específica de 4.3 x 104 cpm/ng . Las siguientes líneas celulares se colocaron en los pozos del disco de cultivo de tejidos de 24 pozos y se cultivaron en un medio de crecimiento por tres días: 1. agrupamiento de anillo aórtico de rata (ARC) 2. Clon 14B (ARC#14B) de anillo aórtico d! rata 3. Células endoteliales de la vena umbilical humana, paso 5 (HUVEC) 4. Fibroblastos adventicios aórticos humanos, paso 4 (AOAF) 5. Células del músculo suave aórticas humanas, paso 9 (AOSMC) 6. Pericitos retínales humanos 4 (pericitos) Las células se lavaron una vez con enlazante en hielo frío (RMPI que contienen BSA al 0.1%.20 mM de Tris:HCl, pH 7.2), y después 250 µl de las siguientes soluciones se agregaron a cada uno de los tres pozos de los discos de cultivo que contienen las células de prueba. Se prepararon soluciones de enlace en 54 mL de amortiguador de enlace con 10 ng/mL 125I-Zvegf3 y: 1. Sin adición 2. Un µg/mL de Zvegf3 3. Un µg/mL VEGF (Systems R&D, Minneapolis, MN) . 4. Un µg/mL PDGFBB. 5. Cinco µg/mL del recepto a de PDGF (System^^ R&D) 6. Cinco µg/mL del receptor ß de PDGF (como fusión del dominio extracelular del receptor Fc de IgG) .

La mezcla de reacción se incubó en hielo por 2 horas, después se lavó tres veces con un mL de amortiguador de enlace enfriado en hielo. El enlace 125?-Zvegf3 se cuantificó por conteo gama en un extracto de las células. Los resultados mostrados en la Fig. 5, indican el enlace de Zvegf3 al receptor a de PDGF. Los datos se graficaron como enlace/pozo de 125I-Zvegf3. Las barras de errores representan desviaciones estándar. Se repitió el experimento con la adición de células estrelladas de hígado de rata, paso 6 (Greenwe! et al., Labora t ory Inves t i ga t i on 6_9:210-216, 1993). Las células estrelladas se enlazaron a Zvegf3 a un nivel comparable a los pericitos.

Ejemplo 25 En enlace de Zvegf3 recombinante a Íol receptores alfa y beta de PDGF se midió por la espectrometría de masas usando un instrumento de ionización y resorpción láser de superficie incrementada (SELDI) (Protein Chip™, Cipheren Biosystems, Palo Alto, CA) . Para este experimento, se usó un arreglo de superficie preactivada, de 8 puntos. A este chip activado por la amina, (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA) , se agregó a una concentración de mg/ml proteína A, y el chip se incubó a 4°C por cuatro horas. Después de bloquear con ÍM de etanolamina pH 8.0 y lavados' subsecuentes (una vez en 0.1% Tritón X-100 en PBS; una vez en 100 mM acetato de Na, pH 4.5, NaCl 0.5M; una vez en 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5, 0.5 M NaCl; una vez en PBS), se agregaron proteínas de fusión del dominio extracelular del receptor Fc de IgG (receptor alfa de PDGF, receptor beta PDFG, o receptor del control no relacionado), y el chip se incubó a 4°C durante la nochei Después de tres lavados en PBS, 250 µl de Zvegf3 (300 ng/ml) , se agregó PDGF-AA, o PDGF-BB, y el chip se incubó durante la noche a 4°C. El chip se lavó dos veces con Tritón X100 al 0.05%, 100 mM de HEPES pH 7.2, después dos veces con agua desionizada. El chip se dejo secar a temperatura ambiente antes de dos adiciones de 0 microlitros de ácido sinapínico (Ciphergen Biosystemas) en una mezcla 50:50 de acetonitrilo y 1% de ácido trifluoroacético. Los ligandos que se enlazan al receptor se retuvieron en el chip después del lavado y subsecuentemente se detectaron por espectrometría de masas. La asignación de un + o - para el enlace se hizo por la comparación del perfil de expectrometría de masas del receptor PDGF a aquél de un control solamente Fc para cada ligando. Los datos se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11 PDGF AA PDGF AB PDGF BB ZVEGF3 PDGFR-alfa/Fc + + + + PDGFR-beta/Fc +/- +/- + Ejemplo 26 Se realizó el análisis de manchado Northern con ARN poly (A) de líneas celulares vasculares humanas HUVEC (células endoteLiales de la vena umbilical; Cascade Biologics, Inc., Pórtland, OR) , HPAEC (células endoteliales de la arteria pulmonar humana; Cascade Biologics), HAEC (células endoteliales aórticas humanas, Cascade Biologics), AoSMC (células del músculo suave; Clonetics Corporation, Walkersville , MD) , UA?MC (células del músculo suave de la arteria umbilical; Clonetics Corp.), HISM (músculo suave intestinal humano; American Type Culture Collection, CRL 7130), SK5 (células del fibroblasto dérmico humano; obtenidas de Dr. Russel Ross, University of Washington), NFL (fibroblastos del pulmón humano normal; Clonetics Corp.), NHDF-neo ( fibroblasto-neonatal dérmico humano normal; Clonetics Corp.); y de las líneas celulares de leucemia, Raji, Molt-4, (todos obtenidos de Clontech Laboratories, Inc.), HL60, Kurkat, y Hut 78. El ARN se cargó a 2 µg por línea. Se generó puna sonda de ADN de aproximadamente 490 bp por digestión de un clon de Zvegf3 de longitud completa con Pvul y Stul . La sonda de ADN se sometió a electroforesis y se purificó usando una columna giratoria que contiene una membrana de gel de sílice (Equipo de Extracción e( Gel de QIAquick™; Quiagen, Inc., Valencia CA) . La sonda se etiquetó radioactivamente con 32P usando un equipo comercialmente disponible (Sistema de etiquetación aleatoria-cebada Rediprime™ II; Amersham Corp. Arlington Heights, IL), de conformidad con las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna c^B empuje. La solución Expresshyb (Clontech, Palo Alto, Ca), se usó para la solución de hibridación para los manchados. La hibridación tomó lugar durante la noche a 65°C en una solución de hibridación comercialmente disponible (Solución de hibridación ExpressHyb™; Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto CA) . Los manchados se lavaron entonces cuatro veces en SSC 2X y 0.1% de SDS a temperatura ambiente, seguido por dos lavados en SSC 0.1X y SDS al 0.1% a 50°C. Se detectó un tamaño de transcripto a aproximadamente 4 kb en NFL, NHDF-neo, SK5," UASMC, HAEC, AoSMC, Jurkat, Hut78. La intensidad de la señal fue superior para UASMC, SK5, NFL, y NHDF-neo.

Ejemplo 27 Los efectos de Zvegf3 en la regeneración endotelial vascular y la hiperplasia íntima se probaron en un modelo de arteria carótida de rata lesionada con u( balón. El adenovirus se usó como un vector de suministro. Para determinar la inefectividad del adenivirus y el nivel de la expresión del gen obtenida en la pared vascular, las ratas lesionadas con un balón, como se describe abaja y se infusionaron con un vector de adenovirus que comprende una unidad de expresión para proteína fluorescente verde (GFP) . Tres grupos de tres ratas cada una, se infusionaron con dosis de 1.5 x 1010 pfu/ml, 3 x 1010 pfu/ml, y 6 x 1010 pfu/ml. Las carótidas lesionadas y no lesionadas, se cosecharon 48 horas después de la infección y se fijaron en formalina amortiguada al 10% por 24 horas. El tejido se procesó y analizó usando un anticuerpo anti-GFP para determinar el % de infectividacl . Los efectos de Zvegf3 se determinaron en un estudio de 14 días, usando dosis óptimas determinadas! para el estudio GFP. Dos grupos de 14 animales cada uno, se lesionaron con balón e infectaron con ya sea adenovirus Zvegf3 o adenovirus de control. La carótida común izquierda se aisló, y el flujo de la sangre a través de los bazos se detuvo por el ligado de la carótida interna, la carótida externa y la carótida común próxima. Se hizo una arteriotomia entre la atadura en li carótida externa y la bifurcación, y el recipiente se enjuagó completamente con Ringer lactado, se insertó un catéter de 2F-embelectomía, se infló y se removió, mientras se giraba, se removieron las células endoteliales; este procedimiento se hizo de una a tres veces. Los bazos entonces se enjuagaron nuevamente aproximadamente 50 µl de la solución de adenovirus se inyectaron en esta usando un catéter de entubado silástico. El catéter se amarra en el recipiente justo distal de la bifurcación y se deja en su lugar por aproximadamente 20 minutos. El catéter es entonces removido y el recipiente se fluye . repentinamente brevemente con sangrado por el aflojamiento del amarre distal. Se hace un amarre justo distal a la bifurcación. El flujo sanguíneo se restaura por la remoción del amarre en la carótida interna y el amarre próximo en la carótida' común. Permanecen los amarres en la carótida externa. Para determinar la producción de la proteína Zvegf3 en la pared del recipiente, dos animales de cada grupo se sacrificaron de los días uno y siete. Los tejidos se procesaron por análisis inmunohistoquímico y análisis de manchado Western. Para el análisis inmunohistoquímico, los tejidos se mantuvieron en formalina por 24 horas( después se transfirieron a alcohol etílico al 70%. Para el análisis del manchado Western, los tejidos se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80°C. Al día trece a los animales se les dio tabletas BdrU subcutáneamente. Al día catorce (24 horas después de la inserción BrdU), el tinte Azul Evan se les dii intravenosamente para teñir los segmentos no endotelializados y los animales se sangraron y sacrificaron. Los animales entonces se exsanguinaron y se fijaron por perfusión con formalina amortiguada al 10%. Tanto las carótidas del hígado, riñon como de los bazos se colectaron. Las carótidas son inspeccionadas visualmente, y se cuantifica la re-endotelialización mediante la medición de la distancia de la bifurcación al límite del tinte distal (blanco/azul). Todos los tejidos se mantuvieron en formalina por 24 horas, después se! transfirieron a alcohol etílico al 70%. Las carótidas se seleccionaron en tres piezas cada una y se embebieron en bloques de parafina. El hígado, riñon y bazo se inspeccionaron visualmente y se procesaron. Se hicieron laminillas de secciones transversales de las carótidas y se tiñeron con Hematoxilina y Eosina, después se midieron usando un programa de diagnóstico SPOT® (Diagnostij Instruments, Inc., Sterling Heights, MI) . Las mediciones incluyen la longitud de la lámina elástica interna y las áreas del medio, íntima y lumen. El análisis ICC incluye el número de células infectadas (usando anticuerpos anti-gfp), proliferación celular (etiquetación BrdU) y % de muerte celular. Se condujo un tercer estudio para determinar el curso de tiempo de la expresión del gen Zvegf3 después de la lesión con balón. Las carótidas se colectaron de animales lesionados con balón (5 animales/punto de tiempo) a T=0 (no lesionados), T=6 horas, 1, 4, 6 y 14 días. Las carótidas se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80°C para el análisis de manchado Northern.

Ejemplo 28 Un plasmido de expresión que contiene un polinucleótido que codifica a u Zvegf3 humano N-terminalmente a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) se construyó vía una recombinación homologa. Un fragmento de ADNc Zvegf3 humano se aisló usando PCR. Dos cebadores se usaron en la producción del fragmento Zvegf3 humano en una reacción de PCR. Ej cebador ZC20,572 (SEC ID NO: 44), contiene 40 bp del vector de la secuencia de flanqueo y 25 bp que corresponden al término amino de la Zvegf3 humana, y el cebador ZC20,575 (SEC ID NO:45) contiene 40 bp del extremo 3' que corresponde a la secuencia de vector de flanqueo y 25 bp que corresponden al término carboxili del Zvegf3 humano. Las condiciones de reacción de PCR fueron 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72°C por 1.5 minutos; seguido por un remojo a 4°C, una corrida por duplicado. Una alícuota de 2 µl de 100 µl de mezcla de reacción, se corrió en gel de agarosa al 1.0% con amortiguador Tris/borato/EDTA para análisis, y se observó la banda esperada de aproximadamente 1000 bp . Los restantes 90 µl de la mezcla de reacción se combinaron con el segundo tubo de PCR precipitado con 400 i µl de etanol absoluto para ser usado para recombinación en el vector pTAP98 del recipiente de corte Smal para producir el constructo que codifica la fusión MBP-Zvegf3. El plasmido pTAP98 se derivó de los plasmidos pRS316 (un vector de lanza Sccha romyces cerevi si a e ; véase, Hieter y Sikorski, Genetics 122:19-21, 1989) y pMAL™-c2X (New England Biolabs; Beberly, MA).E1 último vector lleva el promotor tac que acciona a MalE (gen que i codifica a MBP), seguido por un extremo His, un sitio de escisión de trombina, un sitio de clonación y el terminador rrnB. El vector pTAP98 se construyó usando recombinación homologa de levadura. lOOng de pMAL™-c2X cortado con EcoRI, se recombinaron con 1 µg de pRS316 cortado con Pvul, 1 µg de enlazador, 1 µg de pRS316 cortado con Scal/EcoRI. El enlazador se construyó por la combinación de los oligonucleótidos ZC19,372 (SEC ID NO:46), (100 p mole), ZC19,351 (SEC ID NO:47) (l pmole), ZC19,352 (SEC ID NO:48) (1 pmole), y ZC19,371 (SEC ID NO : 49 ) (100 p mole) en una reacción de PCR por 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72°C por 30 segundos; seguido por un remojo a 4°C. Los productos de pCR se concentraron vía precipitación de etanol al 100%. Se corstruyó un vector que contiene la secuencia de fusión MBP-Zvegf3 mediante recombinación homologa. Cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) se combinaron con 10 µl de una mezcla que contiene aproximadamente 1 µg del inserto Zvegf3 humano y 100 ng del vector pTAP98 digerido con Smal, y se transfirió a una probeta de electroporación de 0.2 cm. La mezcla de ADN/levadura se electropulsó a 0.75 kV (5 kV/cm) , ohms infinitos, 25 µF. A cada probeta se le agregó 600 µl de 1.2 M de sorbitol. La levadura se colocó entonces en dos alícuotas de 300 µl en dos placas de URA D y se incubó a 30°C. Después de aproximadamente 4! ! horas, los transformantes de levadura Ura+ a partir de una sola placa se resuspendieron en 1 ml de H20 y se giraron brevemente a pelotillas de las células de levaduras. La pelotilla celular se resuspendió en 1 ml de amortiguador de lisis (2% de Tritón X-100, SDS al 1%, 10 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA). Quinientos microlitros de la mezcla de lisis se agregó a un tubo Eppendorf que contiene 300 µl de perlillas de vidrio lavadas con ácido y 200 µl de fenol-cloroformo, sometido a vórtices por intervalos de 1 minuto dos o tres veces, seguida por un giro de 5 minutos en un microcentrifugo a velocidad máxima. Trescientos microlitros de la fase acuosa se transfirieron a un tubo fresco, y el ADN se precipitó con 600 µl de etanol (EtOH) , después se centrífugo por 10 minutos a 4°C. La pelotilla de ADN se resuspendió en 100 µl de H20. Las células E . col i electrocompetentes (MC1061; Casadaban et. al., J. Mol Bi ol . 138 : 179-207) se transformaron con 1 µl del ADN de levadura preparada en un volumen de 40 µl . Las células se electropulsaron a 2.0 kV, 25 µF, 400 ohms. Después de la electroporación, 0.6 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 0.5% extracto d^ levadura (Difco Laboratories), 10 mM NaCl. 2.5 mM KCl, 10 mM MgC12, 10 mM MgS04, 20 mM glucosa), se colocaron en una alícuota en placas LB AMP (caldo LB (Lennox), 1.8% ágar (Bacto™; Difco Laboratories), 100 mg/L ampicilina), clones individuales que albergan el constructo de expresión correcta para Zvegf3 se identificaron por expresión. Las células crecieron en un medio mínimo complementado con ácidos casamino y 100 µg/ml de ampicilina durante la noche. 50 µl del cultivo de la noche se usó para inocular 2 ml del medio fresco. Los cultivos crecieron a 37°C, se sacudieron por 2 horas. Un ml del cultivo se indujo con 1 mM IPTG. 2-4 horas después, 250 µl de cada cultivo se mezclaron con 250 µl de perlillas de vidrio lavadas con ácido y 250 µl de amortiguador Thorner (8M de urea, 100 mM Tris, pH 7.0, glicerol al 10%, 2 mM EDTA, SDS al 5%), suplementado con ß-ME al 5% y tinte. Las muestras se sometieron a vórtices i por un minuto y se calentaron a 65°C por 5-10 minutos. 20 µl se cargaron por línea en gel PAGE 4-125 (NOVEX, San Diego, CA) . Los geles se corrieron en amortiguador MES IX. Los clones positivos se designaron pCZR236 y se sometieron a análisis subsecuente. La secuencia de polinucelótido ce la fusión MBP-Zvegf3 en pCZR236 se muestra en la SEC ID NO:50. Para expresar la proteína de fusión, 1 µl de ADN secuenciado se usó para transformar la cepa W3110 de E . col i (obtenida de American Type Culture Collection, Manassas, VA) . Las células se elctropulsaron a 2.0 kV, 25 µF y 400 ohmns . Después de la electroporación, 0.6 ml de SOC (2% Bacto™ Tryptona (Difco Laboratories), 0.5% extracto de levadura (Difco Laboratories), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 M MgC12, 10 mM MgS04, 20 mM glucosa), se colocó en una alícuota en palcas LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8% Bacto™ Agar (Difco Laboratories), 100 mg/L ampicilina) . Las células se perforaron de la placa y se hicieron crecer en un medio mínimo que contiene ácidos casamino durante la noche. Una alícuota de 50 µl del cultivo de la noche se usó para inocular 20 ml del medio fresco. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C con sacudimientos por 2 horas. Un ml del cultivo se indujo con 1 mM de IPTG, y las células se sometieron a lisis esencialmente como se describe anteriormente. Veinte µl de alícuotas del lisado se analizaron por electroforesis en gel como se describe anteriormente.

Ejemplo 29 Se analizó Zvegf3 recombinante para la actividad mitogénica en células estrelladas de ratas (obtenidas de N. Fausto, University Of Washington) . Las células estrelladas se colocaron a una densidad de 2,000 células/pozo en placas de cultivo de 96 pozos, y se hicieron crecer por aproximadamente 72 horas en DMEM que contiene suero bovino fetal al 10% a 37°C. Las células fueron quiescentes por la incubación de estas por 20 horas en medio DMEM/Ham F-12 libre de suero, que contiene1 insulina (5 µl (ml ) , transferina (20 µg/ml), y selenio (16 pg/ml) (ITS) . Al tiempo del ensayo el medio se removió y las muestras de prueba se agregaron a los pozos por triplicado. Las muestras de prueba consisten de ya sea medio condicionado (CM) de células del queratinocito humano HaCaT infectadas adenoviralmente (Boukamp et al., J. Cel l . BU . 106: 761-771, 1998), que expresan Zvegf3 d longitud completa, el dominio del factor de crecimiento purificado expresado en células BHK, o células de medio de control infectadas con adenovirus parenteral (Zpar) que contiene una unidad de expresión para la proteína fluorescente verde. El CM se concentró 10 veces usando un dispositivo de filtro centrífugo de 15-ml con un filtn de membrana 10K (Ultrafree®; Millipore Corp., Bedford, MA) , después se diluyó nuevamente a 3x con medio ITS y se agregó a las células. La proteína purificada en un amortiguador que contiene BSA al 0.1% se diluyó esencialmente en un medio ITS a concentraciones de 1 µg/ml a 1 ng/ml y se agregó a la placa de prueba. Un amortiguador de control de BSA al 0.1% y se diluyó idénticamente a la concentración más alta de la proteína Zvegf3 y se agregó a la placa. Para la medición de la incorporación de la [3H] timidina, 20 µl de una pila de" µCi/ml en DMEM se agregó directamente a las células, para una actividad final de 1 µCi/pozo. Después de otras 24 horas de incubación, la actividad mitogénica se valoró por la medición de la captación de [3H] timidina . El medio se removió, las células se incubaron con 0.1 ml de tripsina hasta que las células se disolvieron. Las células se cosecharon en placas de filtros de 96 pozos, usando un colectador de muestras (Colector FilterMate™; Packard Instrument Co . , Meriden, CT) . Las placas entonces se secaron a 65°C por 15 minutos, se sellaron después de la adición de cóctel de escintilación 40 µl/pozo (Microscint™ O; Packard Instrument Co). y se contaron en un contador de escintilación de microplaca (Topcount®; Packard Instrument Co. ) . Los resultados presentados en la Tabla 12, demuestran que el Zvegf3 CM tuvo aproximadamente 4.4. veces actividad mitogénica superior en las células estrelladas sobre el control CM, y la proteína purificada a 100 ng/ml causó un incremento máximo de 14 veces en la incorporación de [3H]timidina sobre el control amortiguador .

Tabla 8 CPM Incorporado Muestra Media Desv. Estándar Zvegf3 (2 x CM) 42489 1306 Zpar (2x CM) 9629 540 Dominio Zvegf3 GF, 100 77540 4142 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 33.3 74466 18142 ng /ml Dominio Zvegf3 GF, 11.1 52462 6239 ng/ml Dominio Zvegf3 GF, 3.7 15128 4989 ng/ml Control amortiguadoc 5618 573 PDGF-BB 20 ng/ml 19741 2075 PDGF-AA 20 ng/ml 33133 3325 Medio solo (respuesta 6765 226 basal ) De lo anterior, se apreciará que, aunque las modalidades específicas de la invención se han descrito aquí para propósitos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del espíritu y ámbito de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína aislada, caracterizada porque comprende un primer polipéptido disulfuro enlazado a un segundo polipéptido, en donde cada uno de dichos primero y segundo polipéptidos son de 111 a 136 residuos de aminoácidos en longitud y comprenden 235-345 residuos de la SEC ID NO: 2. 2. Una proteína asilada caracterizada porque comprende un primer polipéptido disulfuro enlazado a un segundo polipéptido, en donde cada uno de dichos primero y^ segundo polipéptidos son al menos 90% idénticos a los residuos 235-345 de la SEC ID NO:

2.

3. Una proteína aislada de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de dichos primero y segundo polipéptidos comprenden 230-345 residuos de la SEC ID N0:2.

4. Una proteína asilada de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de dichos primero y segunde polipéptidos comprende 226-345 residuos de la SEC ID NO: 2.

5. Una proteína aislada de .acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de dichos primero y segundo polipéptidos consisten de 235-345 residuos de la SEC ID NO: 2.

6. Una proteína aislada de acuerdo a la" reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de dichos primero y segundo polipéptidos consiste de residuos 226-345 de la SEC ID NO: 2.

7. Una proteína aislada de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque es glicosilada.

8. Una composición, caracterizada comprende una proteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Un anticuerpo, caracterizado porque se enlaza específicamente a una proteína de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

10. El anticuerpo de la reivindicación 9, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.

11. El anticuerpo de la reivindicación 9, caracterizado porque es un anticuerpo de cadena única.

12. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos ligados operablemente: . un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifica un péptido de 111 a 136 residuos de aminoácidos de longitud y que comprenden" 235-345 residuos de la SEC ID N0:2; y un terninador de la transcripción.

13. El vector de expresión de la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende una secuencia de señal secretoria ligada operablemente al segmento de ADN.

14. El vector de expresión de la reivindicación 12, caracterizado porque dicho polipéptido comprende 23?! 345 residuos de la SEC ID NO: 2.

15. El vector de expresión de la reivindicación 12, caracterizado porque dicho polipéptido comprende 226-345 residuos de la SEC ID NO: 2.

16. Le vector de expresión de la reivindicación 12, caracterizado porque dicho polipéptido consiste de 35^ 345 residuos de la SEC ID NO: 2.

17. El vector de expresión de la reivindicación 12, caracterizado porque dicho polipéptido consiste de 226-345 residuos de la SEC ID NO: 2.

18. Una célula cultivada la cual se ha introducido en un vector de expresión de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 12-17, caracterizada porque dicha célula que expresa el polipéptido codificado™ por el segmento de ADN.

19. Un método para preparar un polipéptido, caracterizado porque comprende cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 17, y recuperar el polipéptido codificado por el segmento de ADN y expresado por la célula.

20. Un método para promover la proliferación d| los fibroblastos o células del músculo suave en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a dicho mamífero una composición de la reivindicación 7, en una cantidad suficiente para incrementar la proliferación celular .

21. Un método para promover la curación de ur^fc herida en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a dicho mamífero, una composición de conformidad con la reivindicación 7 en una cantidad suficiente para incrementar la curación de la herida.

22. Un método para promover la proliferación de los osteoblastos o condorcitos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a dicho mamífero, una composición de conformidad con la reivindicación 7 en una cantidad suficiente para incrementar la proliferación celular.

23. Un método para activar un receptor alfa PDFG de la superficie celular, caracterizado porque comprende exponer una célula que comprende un receptor alfa PDGF de la superficie celular a una proteína, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, con ello, la proteína se enlaza a, y activa al receptor.

24. Un polinucleótido antisentido, aislado, que es el complemento de un polinucleótido que codifica a un polipéptiddo, caracterizado porque es de 111 a 136 residuos de aminoácido en longitud, y que comprende 235-345 de la SEC ID N0:2.

25. El polinucleótido antisentido de ll reivindicación 23, caracterizado porque además comprende secuencias terminadoras y promotoras de la transcripción operablemente ligadas.

26. Un método para inhibir la proliferación celular en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero, una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. •