MXPA01001307A - Conjugados de dextrano-leptina, composiciones farmaceuticas y metodos relacionados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de conjugados de dextrano-leptina y a métodos relacionados de preparación, métodos de uso y composiciones farmacéuticas.

Description

CONJUGADOS DE DEXTRANO-LEPTINA, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS RELACIONADOS Campo de la Invención La presente invención se refiere ampliamente al campo de la modificación de proteina, y, más específicamente, a la unión de las porciones dextrano a las proteínas leptina que incluyen análogos del mismo (el término "proteina" como se usó aqui, es sinónimo con "polipéptido" o "péptido" a menos que se indique de otro modo) . En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen conjugados dextrano-leptina . La presente invención también proporciona composiciones relacionadas y métodos de fabricación y uso de tales composiciones .

Antecedentes de la Invención Aunque las bases moleculares para la obesidad son ampliamente desconocidas, la identificación del "gen OB" y su proteina codificada ("Proteina OB" o "leptina") ha iluminado los mecanismos a los usos corporales para regular la REF . : 126741 *»** - • - -' ?*»*?*ti^^***« >- ^ - ,^ Y ^ÉÉ^- deposición de la grasa corporal. Véase PCT WO 96/05309, titulada "Moduladors of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof", aqui 5 incorporado por referencia en su totalidad; Zhang et al., Nature 372:425-32 (1994); véase también, la Correction at Nature 374:479 (1995), ambas de las cuales están aqui incorporadas por referencia. La proteina OB es activa in vivo en ambos ratones mutantes ob/ob (ratón obeso debido a un defecto en la producción del producto del gen OB) , asi como también en ratones de tipo silvestre, normales. La actividad biológica manifiesta asi mismo, entre otras cosas, pérdida de peso. Véase, de manera general, Barinaga "Obese" Protein Slims Mice", Science 269:475-76 (1995) . La proteina OB, análogos, derivados y usos del mismo como moduladores para el control del peso y la adiposidad de animales, incluyendo mamiferos y humanos, han sido descritos en gran detalle en WO 96/05309, supra . Véase también, Solicitud Internacional PCT Números WO 96/40912, WO 97/06816, 97/18833, WO 97/38014, WO 98/08512 y WO 98/28427. La proteina Ob, o leptina, como es llamada aqui, causa pérdida de peso en humanos. Greenberg et al., "Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by SC injection in lean and obese subjects." Poster presented at : 58 th Annual Meeting and Scientific Sessions of the American Diabetes Association; Junio 14, 1998; Chicago, IL. Se sabe que la administración continua de una proteina leptina dentro de la circulación sistémica, por ejemplo, bomba osmótica o por leptina químicamente modificada tiene un tiempo de circulación incrementado, reduce las dosificaciones necesarias para la pérdida de peso. Por ejemplo, PCT WO 96/40912, titulada "OB Protein Compositions and Methods", aqui incorporada por referencia. Generalmente, las ventajas sugeridas por la formulación de proteina y modificación química pueden incluir, bajo ciertas circunstancias, incremento de la estabilidad y tiempo de circulación de la proteina terapéutica y decremento de la inmugenidad. Ua articulo revisado que describe la modificación de la proteina y las proteínas de fusión es Francis, Focu s on Growth Fac tors 3_ : 4-10 (Mayo 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet La e, London N20, OLD, UK) . Varios medios para la unión de las porciones químicas son actualmente disponibles, véase , por ejemplo, Tratado de Cooperación de Patente ("PCT) Publicación Internacional No. WO 96/11953, titulado "N-terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", aqui incorporada para referencia en su totalidad. Esta publicación de PCT describe entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua al N-término de las proteínas . Los polietilenglicoles son un tipo de polímero soluble en agua, los cuales pueden ser usados para la modificación de la proteina. Véase WO 96/11953, supra, la cual también describe el factor estimulante de la colonia de granulocitos N-terminalmente monopegilados ("G-CSF") e interferona consenso N-terminalmente monopegilada ("N-terminalmente monopegilada" denotando que la porción de la proteina se ha unido a una porción de polietilenglicol única al N-término) . Las porciones de polietilenglicol pueden ser usadas con muchos sucesos para algunas proteínas terapéuticas, tal como el factor de crecimiento y desarrollo del G-CSF y egacarocitos ("MGDF") (Sheridan & Menchaca, "Overview of the Safety and Biologic Effects of PEG-rHuMGDF in Clinical Triáis", en Stem Cells 16 (supp. 2) : 193-98 (1998) ) . Los polímeros de polisacáridos son otro tipo ufe» de polímeros solubles en agua, los cuales pueden ser usados para la modificación de la proteina. Los dextranos son polímeros polisacáridos que comprenden de subunidades individuales de glucosa predominantemente ligada por enlaces al-6. El dextrano mismo está disponible en muchos rangos de pesos moleculares, y es fácilmente disponible en pesos moleculares desde aproximadamente 1 kilo Dalton ("kD") hasta aproximadamente 70 kD (el término "aproximado" se usa para significar el peso molecular promedio en una preparación comercial típica de dextrano de grado farmacéutico como algunas moléculas de dextrano por peso ligeramente arriba del peso declarado, y algunas veces por debajo) . El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para La modificación de la proteina. Véase, WO 96/11953, supra, y WO 96/05309, supra . También se ha reportado el uso del conjugado de dextrano para inmunoglobulinas terapéuticas o diagnósticas. Publicación de Patente Europea ("EP") No. 0 315 456, titulada "Polysaccharide-Modified Immunoglobulins Having Reduced Immunogenic Potential o Improved Pharmacokinetics", aqui incorporada por referencia, reporta inmunoglobulinas o fragmentos del mismos, ligados a polisacáridos de peso molecular bajo modificado, incluyendo dextranos. Hay experiencia clínica substancial en el uso de cantidades grandes de dextrano en solución como extendedores del plasma (expansores de volumen) . 5 Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th, ed., a 804-05 (Mack Publishing Co.: Easton, PA (1990)), aqui incorporada por referencia. Las soluciones que contienen dextranos de peso molecular relativamente grande, tales como dextranos con pesos moleculares de aproximadamente 40, 70 y 75 kD, son disponibles y administrados en cantidades en gramos. La soluciones de dextrano-hierro son también usadas en el tratamiento de la anemia. Dextranos de peso molecular grande, cuando se administran en grandes cantidades, se reportan por resultar en vacuolas en el riñon. Por ejemplo, Diomi et al., Annals of Surgey 172:813-24 (1970) (reporti g kidney vacuolization in dogs); Maunsbach et al., Laboratory Inves tigation 11:421-32 (1962) (reportiig kidney vacuolization in rats); véase también, Enberg, Acta Chir. Scand. 142:172-89 (1976). Los conjugados de polietilenglicol-proteina, en particular los ejemplos, también han sido asociados con la inducción de las vacuolas del riñon. Bendele et al., Toxicological Sciences 42:152-57 (1998). Aunque las ^ ^>^*&>. „ ^^ - '^*¿¿t &&£k&¿^>£t¿ Y JA..., .,.....-'...--. ¡**? ^~ .+*á*.~&*á vacuolas del riñon no son actualmente entendidas por ser clínicamente relevantes, en general, una composición farmacéutica deberá ser eficaz sin causar cambios anatómicos no justificados. Además, los 5 dextranos con peso molecular grande y los polímeros de polietilenglicol no pueden ser aplicables generalmente para la modificación química de todas las proteínas terapéuticas. Otra desventaja para usar el dextrano de peso molecular grande en un conjunto clínico es la posibilidad de una reacción anafiláctica en el paciente. Véase, por ejemplo., Richter et al., Immunology Today 3:132-38 (1982), aqui incorporada para referencia, asi como también las referencias citadas aqui, para una revisión. Se cree que ciertos individuos pueden tener en su circulación sistémica, anticuerpos pre-formados los cuales se enlazan a estos dextranos de peso molecular grande. La administración de dextranos clínicos de peso molecular grande a una subpoblación pequeña (pero impredecible ) de individuos con altos títulos de estos anticuerpos reactivos de dextrano pre-formados ("DRA") de la clase IgG resulta en apoplejía anafiláctica y posibilidad de muerte. Se cree que los dextranos clínicos generan complejos inmunes dañinos, en los cuales ocurre el complemento activado y agregación de los leucocitos y plaquetas. El material agregado puede ser secuestrado en el pulmón y liberado de los mediadores vasoactivos puede conducir 5 a reacciones anafilácticas . Richter et al., supra, a 136. Para superar este riesgo potencial, las soluciones de dextrano que contienen dextrano con un peso molecular de aproximadamente 1000 D, han sido estudiados como inhibidores de hapteno del DRA preformado. Un fragmento de dextrano de seis unidades de glucosa (peso molecular 990) se encontró adecuado como una preparación de hapteno monovalente para experimentos in-vivo . Richter et al., supra, at 136 et seq. El uso de la inhibición de hapteno para reducir las reacciones anafilácticas han sido completamente exitosos para los expansores sanguíneos. Por ejemplo, Ljungstrom, Infusionsther Transfus ionsmed 20:206-10 (1993), aqui incorporada por referencia. En los años 1983 a 1992, el uso de una preparación comercial llamada Promit®, se reporta por haber reducido la incidencia dramáticamente de reacciones anafilácticas inducidas por dextrano severo ("DIAR") . Las reacciones fatales se reportaron en una incidencia de uno en 2.5 *- -*^™aMt' *->--•**• - - - - Y¡^jjj^ millones de dosis. La EP 0 315 456, como se notó anteriormente, reporta el uso de dextranos que tienen un peso molecular de aproximadamente 6 kD para la conjugación de inmunoglobulinas. Se reporta que los anticuerpos monoclonales a pesar de que son empleados para propósitos terapéuticos conjugados con dextranos, tienen inmunogenicidad reducida, mientras retienen la inmunoreactividad deseada, y pueden poseer propiedades farmacocinéticas deseadas. Véase también Mikolajczyk et al., Bioconjugate Chem. 7: 150-58: (1996) (Fab' component of a Fab' -ß-lactamasa conjúgate); Fagnani et al., Nuclear Medicine Comm. 16:326:69 (1995) (Fab' fragments of a murine anti- carcinoembryonic antigen monoclonal antibody) ; Fagnani et al., Cáncer Res. 50:3638-45 (1990) (murine and rabbit immunoglobulins ) . Podrá por lo tanto, ser deseable tener composiciones farmacéuticas que contienen conjugados de dextrano-leptina, los cuales no son anafilácticos a individuos con DRA preformado, circulante. Sin embargo, podrá ser particularmente deseado, tener conjugados de dextrano-leptina los cuales presentan características deseadas de, como las comparadas a la leptina no modificada, tiempo de circulación ampliado, eficacia y solubilidad mejorada. La presente invención proporciona conjugados de dextrano-leptina los cuales tienen las ventajas de proteínas de leptina químicamente modificadas, sin el riesgo potencial asociado con el polietilenglicol o dextranos que inducen anafilácticos .

Breve Descripción de la Invención La presente invención resulta de la observación de que ciertos conjugados de dextrano- leptina de peso molecular relativamente bajo, poseen sorprendentemente, las caracteristica's deseadas de eficacia y tiempo de circulación mejorados, y poseen otras características deseadas, tales como solubilidad incrementada y reducción en el sitio de inyección como el comparado con la leptina humana nativa. Además, la desventaja potencial de la vacuolización del riñon, véase con ciertos conjugados de polieti lenglicol-leptina, no se observaron con los conjugados de dextrano-leptina sujetos. Los ejemplos de trabajo expuestos abajo, demuestran los conjugados de dextrano-leptina, los cuales tienen las siguientes características: (a) eficacia mejorada sobre la leptina humana metionilo i . tí?A t- AI-'á- . v- a. recombinante no modificada ("rmetHu-leptina"); (b) un tiempo de circulación del plasma ampliado, sobre la rmetHu-leptina no modificada; (c) solubilidad acuosa mejorada a pH fisiológico sobre la rmetHu-leptina no modificada; (d) reacciones del sitio de la inyección medias o no existentes; (e) no inmunogenicidad del conjugado dextrano-leptina; y (f) no inducción de la vacuoli zación del riñon. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona conjugados de dextrina-leptano que comprenden al menos, una porción de dextrano de peso molecular bajo unida a al menos, una porción de leptina, en donde la porción de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 20 kD. Preferiblemente para facilidad en la manufactura comercial de un producto farmacéutico, la porción de dextrano tiene un peso molecular desde aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 10 kD, y más preferiblemente, todavía de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 7 kD. Una porción de dextrano particularmente preferido es de aproximadamente 6 kD como se ejemplifica en los ejemplos abajo. En otro aspecto de la presente invención, los conjugados de dextrano-leptina se proporcionan en .frltájfip ^^^^^ ^ ^^^^í^^^^á|^^ donde una porción de dextrano de bajo peso molecular está unida a una o más porciones de leptina. En todavía otro aspecto de la invención, los conjugados de dextrano-leptina se proporcionan en donde al menos, dos porciones de dextrano de peso molecular bajo, están unidas a una o más porciones de leptina. Además, la presente invención incluye dentro de su ámbito, una mezcla de conjugado de dextrano-leptina que contiene cualquier combinación de al menos, tres especies predominantes de conjugados de dextrano-leptina: 1) conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano está unida a una porción de leptina; 2) un conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano está unida a dos porciones de leptina; y 3) conjugado de dextrano-leptina en donde dos porciones de dextrano están unidas a dos porciones de leptina, el par de conjugados de dextrano-leptina está unido a cada uno de los otros. Preferiblemente, los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, contienen predominantemente 1) un conjugado de dextrano-leptina, en donde una porción de dextrano está unida a dos porciones de leptina; y 2) conjugado de dextrano-leptina, en donde dos porciones de dextrano están unidas a dos porciones de leptina, el par de conjugados de ^^^^-^-^aMtaas .-->-*>-- dextrano-leptina están unidos a cada uno de los otros . Se prevé que las características de realización de los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención descritos anteriormente, pueden ser mejorados sobre el incremento del grado de derivatización (es decir, unión adicional de porciones de dextranos a una porción de leptina) sin algún efecto deteriorante en el potencial que induce anafilaxis. Asi, los conjugados de dextrano-letpina en donde las porciones de dextrano múltiples están unidas a la porción de leptina, están dentro del ámbito de la invención. Tal conjugado de dextrano- leptina múltiples, podrían presentar las mismas características deseables como se describe anteriormente . En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contiene los presentes conjugados de dextrano-leptina en un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas presentes contienen 1) un conjugado de dextrano- leptina en donde una porción de dextrano está unida a dos porciones de leptina; y 2) un conjugado de dextrano-leptina en donde dos porciones de dextrano están unidas a dos porciones de leptina, el par de conjugados de dextrano-leptina están unidos a cada uno de los otros. Una porción de dextrano particularmente preferida es de aproximadamente 6 kD 5 como se ejemplifica en los conjugados de dextrano- leptina abajo. La presente invención también se refiere a procesamientos para la preparación de conjugados de dextrano-leptina como se resume abajo. 10 La presente invención también se refiere a métodos de tratamiento de individuos que usan conjugados de dextrano-leptina y mezclas de conjugados como se resume abajo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJO La Figura 1A es un trazo de mapeo del péptido de digestión Endolis-C del rmetHu-leptina no modificada ("Leptina") y conjugado de dextrano- 20 rmetHu-leptina ( "Dextrano-Leptina" ) ; La Figura IB es un trazo de mapeo del péptido de digestión Endoasp-N. La flecha en cada trazo indica el péptido N-terminal de la rmetHu-leptma no modificado. La Figura 2 representa un gel de gradiente 25 SDS-PAGE de reducción de Tris-Glycina 4-20% que -^^— *— *?- -?*~t... ~¿ .. ^ — ?ji^?aí^¿ t? ÍKM?AassajáS^ muestra que una porción significante del conjugado de leptina dextrano de 6 kD es dimerizado. La linea 1 es pesos estándares moleculares (Mark 12, Novex, San Diego, CA) ; La linea 2 es rmet-Hu-leptina no 5 modificada como control; la linea 3 es una mezcla de conjugado de dextrano-rmetHu-leptina; y la linea 4 es un conjugado de dextrano-rmetHu-leptina después de la cormatografia de intercambió iónico. La Figura 3 es una gráfica que muestra los datos de ratón en la cantidad de pérdida de peso relativa al control amortiguador contra las dosis al final del séptimo dia, el estudio de la dosificación diariamente para (a) rmetHu-leptina no modificada ("leptina"); y (b) conjugado de dextrano-rmetHu- 15 leptina N-terminal ( "dex- leptina" ) . La Figura 4 es una gráfica que muestra los datos de ratón con el efecto de pérdida de peso sostenida del conjugado dextrano-leptina de 6 kDa, comparado con el rmetHu-leptina no modificado en un estudio de dosis única. La pérdida de peso se midió como % de pérdida de peso relativo a un control amortiguador contra el tiempo (dias). La Figura 5 muestra los tiempos de circulación de la sangre para el conjugado dextrano- 25 leptina de 6 kDa comparado con el rmetHu-leptina no modificada en un estudio de rata de dosis única. La Figura 5A muestra los datos de inyección intravenosa; la Figura 5B muestra los datos de inyección subcutánea . La Figura 6 es una gráfica que muestra los datos del ratón en el porcentaje de pérdida de peso, relativo a un control amortiguador contra el tiempo al final del séptimo dia, el estudio de dosificación diaria para (a) la remtHu-leptnina no modificada y (b) conjugado de dextrano-leptina 17.5 kDa. La Figura 7 es una gráfica que muestra los datos del ratón en el porcentaje de pérdida de peso, relativo a un control amortiguador contra el tiempo en un estudio de dosis única para (a) rmetHu-leptina no modificada y (b) conjugado dextrano-leptina de 17.5 kDa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona conjugados de dextrano-leptina que tienen las ventajas de eficacia mejorada, tiempos de circulación del plasma más largos y no tienen formación de vacuolas en el riñon, entre otros. Las ventajas adicionales de los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, incluyen solubilidad mejorada y reacciones de sitio de la inyección mínimas.

Dextranos Los dextranos de bajo peso molecular usados en la práctica de esta invención, incluyen dextranos que tienen un peso molecular desde aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 20 kD, los dextranos más preferidos tienen un peso molecular en el rango de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 10 kDa. Todavía más preferidos, son los dextranos que tienen un peso molecular desde aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 7 kD. Un dextrano particularmente preferido para facilidad en la manufactura comercial de un farmacéutico para uso humano, es uno que tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kD. (El término "aproximadamente" es usado como se indica anteriormente en la sección "Antecedentes") . En promedio, una mole de dextrano de 6 kDa está compuesta de 33.3 subunidades de glucosa. Además preferido por las mismas razones, es un dextrano no ramificado. Dextrano "nativo" se produce por la bacteria Leuconostoc ssp. El dextrano "clínico" es preparado por la despolimerización del dextrano nativo. Del tiempo a tiempo, las porciones de dextrano se pueden producir, de manera tal que se formen ciertos grupos laterales de moléculas ds glucosa ligadas por los enlaces al-3. La formación de tales grupos laterales es comúnmente referida como "ramificación" en la técnica. Aunque no se entienda totalmente la presente, las porciones de dextrano de peso molecular grande, con tales grupos laterales, pueden tener más tendencia a causar anafilaxis en humanos. Mientras no se quiera ligar por la teoría, se cree que existe menos potencial para la ramificación en dextranos de peso molecular bajo y, en particular, ramificaciones múltiples, es decir,, más de un grupo lateral al-3 por molécula de dextrano. Esto es critico, debido a que las ramificaciones múltiples se asumen responsables para la agregación de los anticuerpos reactivos de dextranos preformados en el dextrano, con ello, se causa la formación de complejos inmune grandes. Por lo tanto, preferiblemente, para un producto terapéutico humano, las porciones de dextrano para las composiciones contempladas aqui son aquellas con enlaces predominantemente al-6 entre las subunidades de glucosa, y minimizando los grupos laterales al-3. Se ha mostrado que el dextrano clínico producido por las cepas NRRL B 512 de Leuconostoc mesenteroides minimiza las reacciones anafilácticas . Richter et al . , supra . Además, una característica importante de los dextranos de bajo peso molecular usados en los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, es que no son anafilácticos a individuos con altos títulos de DRA preformado, circulante.

Activación de Dextrano Las porciones de dextrano son "activadas" de manera tal que pueden estar unidas a la porción de la proteina leptina. Tales métodos de activación son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, e incluyen entre otros, introducción de una porción química en el dextrano, la cual puede formar un enlace con una porción química presente en la proteina leptina. Véase, de manera general, Larsen, Advanced Drug Delivery Reviews 3:103-54 (1989), aquí incorporada por referencia. El término dextrano "activado" se refiere a dextrano que contiene múltiples grupos reactivos. El tipo de porción química "activada" en el dextrano, dependerá de la forma en que se quiera unir la porción de dextrano a la porción de la proteina. Por ejemplo, se pude agregar un grupo aldehido al dextrano, de manera tal que la porción de dextrano pueda estar unida a la porción de leptina, bajo condiciones de reducción para formar un enlace amina. Un método particularmente preferido de activación es la oxidación de periodato de sodio. El dextrano es oxidado para contener múltiples grupos aldehidos de conformidad con un procedimiento bien conocido. Battersby et al., J. Contr. Reí. 42:143-56 (1996); Fagnani et al. (1990), supra, aqui incorporado por referencia. Un método de oxidación preferido se describe en los Ejemplos infra . La relación molar de periodato a subunidad glucosa puede variar dependiendo del grado de oxidación deseado. De manera general, la relación molar del periodato a subunidad glucosa puede variar de aproximadamente 0.02:1 hasta aproximadamente 3:1, preferiblemente desde aproximadamente 0.1:1 hasta aproximadamente 1.5:1. Se prevé que aproximadamente 5% hasta aproximadamente 50% de las subunidades de glucosa de dextrano son oxidadas. Este porcentaje representa un promedio para la mezcla de reacción total, las porciones de dextrano individuales pueden tener un porcentaje más alto o más bajo. Se prefiere particularmente que aproximadamente 10% de las subunidades de glucosa contengan grupos aldehidos. El término dextrano "oxidado" se refiere a dextrano que contiene múltiples grupos aldehidos.

Unión del Dextrano a la Proteina Leptina Las porciones de dextrano deberán ser unidas a la porción de leptina con consideración de los efectos en los dominios funcionales o antigénicos de la proteina. El método para unión de las porciones de dextrano puede variar, y existe un número de métodos disponibles para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, el dextrano puede estar covalentemente unido a la porción de la proteína. El enlace covalente puede tomar lugar a través de los residuos de aminoácidos via un grupo reactivo, tal como una mina libre o un grupo carboxilo. Un residuo de aminoácido que tiene un grupo amina adecuado puede incluir residuos de lisina y el residuo de aminoácido N-terminal de la porción de la proteina leptina. Estos aminoácidos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido C-terminal de la porción de la proteina. Los grupos sulfhidrilo pueden también ser usados como un grupo ^^^^^ reactivo para la unión de la porción de dextrano. Alternativamente, los grupos reactivos pueden ser introducidos en la porción de la proteina, por ejemplo, por inserción o mutagénesis dirigida al sitio. Preferido para facilidad en la manufactura comercial, está la unión a un grupo amino, tal como al unión al N-término de la porción de la proteina. De manera general, el dextrano activado por aldehido puede estar unido a la porción de la leptina bajo condiciones para formar un enlace amina. Véase, Larsen, supra ; Fagnani et al. (1990), supra; véase también PCT WO 96/11953. La relación molar de las porciones dextrano a las porciones leptina pueden variar desde aproximadamente 5:1 hasba aproximadamente 100:1, preferiblemente desde aproximadamente 20:1. Preferiblemente, el pH de La mezcla de reacción se mantiene a o aproximadamente pH 4.8 para la conjugación de la porción de dextrano oxidada con la porción de leptina como el sitio especifico N-terminal. El pH deberá ser suficientemente acidico de manera tal que la amina amino terminal de la porción leptina no está aún protonada, y por lo tanto, es reactiva mientras los grupos amina a otras posiciones en la porción de leptina están protonados considerándolos no ¿^^ reactivos . Se prevé que un experto ordinario en la técnica, podría ser capaz de preparar porciones de leptina múltiples reactivas al alterar los parámetros 5 de reacción tal como elevación del pH de la mezcla de reacción, usando otros grupos reactivos existentes o introduciendo grupos reactivos adicionales a la porción de leptina, como se describe anteriormente. Un experto ordinario en la técnica, podria saber como combinar algunos de los varios métodos de conjugación química conocidos con el fin de preparar porciones de leptina reactivas múltiples. La porción de dextrano puede también estar unida a la porción de leptina por porciones "enlazadoras" mientras los enlazadores químicos, también conocidos como reactivos "ret iculadores", o aminoácidos son de longitudes variantes. Tales enlazadores químicos son bien conocidos en la técnica e incluyen enlazadores químicos homobifuncionales (es decir, el mismo grupo reactivo a cada extremo del enlazador) y enlazadores químicos heterobifuncionales (es decir, grupos reactivos diferentes a cada extremo del enlazador) . Las consideraciones tales como La clase de grupos reactivos, la longitud entre los extremos reactivos y otras características benéficas ^l^^^? del enlazador, por ejemplo, un enlace metabolizabl e interno que podria permitir el desdoblamiento de la porción de dextrano de la porción de leptina, puede impactar la selección del enlazador químico, como es 5 bien entendida por un ordinario experto en la técnica. Véase también, por ejemplo, the Pierce Product Catalog, 1997 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) para una lista de reactivos de reticulación y referencias aqui citadas. Los enlazadores químicos pueden estar unidos a la porción de leptina vía cualquiera de los grupos reactivos descritos anteriormente en esta sección. Las consideraciones tal como conformación, es decir, flexibilidad, y tamaño del péptido, pueden impactar la selección del enlazador péptido como es bien entendido por un experto en la técnica. E.g., Nevé et al., Cytokine 8:365-70 (1996); Hallewell et al., J.Biol. Che. 264:5260-68 (1989); véase de manera general, Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47:251-76 (1978). Las secuencias enlazadoras de amino ácidos pueden incluir pero no estar limitadas a: (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; 25 (d) gly, gly, **1 ^aA? M . Z*ᣣ¿ i , .AÜit. il.IlMH.EiEi> MifcJfóJfeJA. Aa*~ .***-?* ¡ (e) gly, gly, gly; (f) gly, gly, gly, gly, gly; (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly; (h) gly, pro, gly; 5 (i) gly, gly, pro, gly, gly; y (j) cualquier combinación de subpartes (a) hasta (i) Las secuencias enlazadoras de aminoácidos 10 pueden estar unidas a ya sea, el N-término o C- término de la porción de leptina, por la expresión de la porción leptina como una proteina de fusión.} Conjugados de Dextrano-Leptina Composición de Conjugados de Dextrano- leptina . Los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, se pueden caracterizar usando métodos bien conocidos en la técnica tal como análisis SDS-PAGE, espectrometría de masas, mapeo de péptido RP-HPLC y análisis de secuencia N-terminal. Se ha encontrado que, en general, al menos, tres especies de conjugados de dextrano-leptina N-terminaL existen en la mezcla de reacción después que eL dextrano está unido a la porción de leptina como se describe anteriormente. Las tres especies son: 1) una porción de dextrano unida a una porción de leptina; 2) una porción de dextrano a dos porciones de leptina; y 3) dos porciones de dextranos unidas a dos 5 porciones de leptina. Se cree que las dos especies de leptina-dos de dextrano, se forman por un par de conjugados de dextrano-leptina unidos a cada uno de los otros. Las últimas dos especies elaboradas aproximadamente 65-85% de la mezcla de reacción, con la primer especie tipicamente cuentan por 5-10% de la mezcla de reacción. Las especies menores restantes parecen como leptina sin reaccionar y entidades ce peso molecular más alto en análisis SDS-PAGE. Estos pueden ser removidos de la mezcla, usando métodcs conocidos. Después de la purificación, las des especies de dimeros típicamente elaboran aproximadamente 70-90% del conjugado de dextrano- leptina . Se prevé que, si uno quiere reducir la propensidad del conjugado dextrano-leptina para formar un dimero, un ordinario experto en la técnica, peude preparar un análogo de leptina, como se discute mfra, que tiene una tendencia reducida hacia la formación del dimero. 25 Proteínas leptinas. El tipo de leptina usada para el presente conjugado de dextrano-leptina puede ser seleccionado de aquellos descritos en la Publicación Internacional de PCT Número WO 96/05309, 5 como se cita anteriormente y aqui se incorpora para referencia en su totalidad. La Figura 3 de tal publicación (como la citada en la SEC ID NO: 4) demuestra la secuencia de aminoácido deducida completa derivada para la leptina humana (referida como la proteina humana "OB") . Los aminoácidos son numerados de 1 a 167. Un sitio de desdoblamiento de secuencia de señal es localizado después del aminoácido 21 (Ala) , de manera que la proteina madura se extiende desde el aminoácido 22 (Val) hasta eL aminoácido 167 (Cys). Para la presente descripción, se usa aqui una numeración diferente, en donde la posición del aminoácido 1 es el residuo valina en cual está al comienzo de la proteina madura. La secuencia de aminoácido para la leptina humana metiomlo recombmante madura, está presente aqu como SEC ID NO : 1 , en donde el primer aminoácido de la proteina madura es valma (a la posición 1) y e.. residuo de metionilo está localizado en la posición - 1 (no incluido en la secuencia abajo) . 25 V P I Q K V Q D D T K T L I K T I V T R I N D I S H T Q S V S S K Q K . . V T G L D F I P G L H P I L T L S K M D Q L A V y Q Q I L T s M P s R N V I Q I s N D L E N L R D h L H V L A F s K S c H L G P W A S G L E T L D S L G G V L E A s Y S T E V V A L S R L Q G S L Q D M L W Q L D L S P G c - Sin embargo, como con cualquiera de las presentes porciones de leptina, el residuo de metionilo a la posición -1 puede estar ausente. Alternativamente, se puede usar una variante mutante de la leptina humana, la cual tiene 145 aminoácidos, como los comparados con al rmetHu- leptina de la SEC ID NO:l, tiene una glutamina ausente en la posición 28. De manera general, la porción de leptina para el uso farmacéutico humano aqui, sería capaz de uso terapéutico en humanos (véase también, animal leptins, abajo). Además, uno puede empíricamente, probar la actividad para determinar cuales porciones de leptinas pueden ser usadas. Como se expone en la EP 96/05309, la proteína de leptina en su forma nativa, o fragmentos (tales como productos de .fjfcag- ¡¡Sg j^ S?^g^^R^^l^^^í^^^^^j desdoblamiento de la enzima) u otras formas truncadas y análogos, pueden todos retener la actividad biológica. Cualquiera de tales formas pueden ser usadas como una porción leptina para los presentes conjugados de dextrano-leptina, aunque tales formas alteradas, deberán ser probadas para determinar las características deseadas. Véase también, Publicación Internacional PCT, Números WO 96/40912, WO 97/06816, 97/18833, WO 97/38014, WO 98/08512 y WO 98/28427, aquí incorporada por referencia en su totalidad. Uno puede preparar un análogo de lepti a humano recombinante para la alteración de los residuos de aminoácidos en la secuencia humar.a recombinante, tal como la substitución ae aminoácidos, los cuales divergen de la secuencia murina. La leptina murina es substancialmente homologa a la leptina humana, particularmente corr.o una proteina madura y, además, particularmente como el N-término. Debido a que la proteína humana recombinante tiene actividad biológica en ratones, tal como un análogo, podria del mismo modo, ser activa en humanos. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácido de la leptina humana nativa como se presenta en la SEC ID NO : 1 , uno puede substituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos a las -e * **.'-&* posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 142 y 145. Uno puede seleccionar el aminoácido a la posición correspondiente de la proteina murina (véase Zhang et al., 1994, supra) u otro aminoácido. Uno puede preparar además, moléculas "consenso" basadas en la secuencia de la proteina OB de rata. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:944-52 (1995) aquí incorporado por referencia. La proteina OB de rata, difiere de la proteina OB humana a las siguientes posiciones (usando la numeración de la SEC ID NO : 1 ) : 4, ,3_2, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 78, 8_9, 91_, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y 145. Uno puede substituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos a estas posiciones divergentes. Las posiciones subrayadas son aquellas en las cuales La proteina OB murina asi como también la proteina OB de rata, son divergentes de la proteina OB humana y, además, son particularmente adecuadas para alteración. A una o más de las posiciones, uno puede substituir un aminoácido de la proteina OB de rata correspondiente, u otro aminoácido. Las posiciones tanto de proteina OB murina como de rata, las cuales divergen de la proteina OB humana madura son: 4, 32,- 3*3, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 103, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Una proteína OB de conformidad con la SEC ID NO : 1 que tiene uno o más de 5 los aminoácidos reemplazados con otro aminoácido, tal como el aminoácido encontrado en la secuencia murina o de rata correspondiente, puede también ser efectivo . Además, los aminoácidos encontrados en la proteina OB de mono rhesus, los cuales divergen de la proteína OB humana madura son (con identidades notadas en paréntesis en una hoja de abreviación de aminoácido): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66(1), 67 (N) , 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) y 118 (L) . Puesto que la proteina OB humana recombinante es activa en los monos cinomolgus una proteina OB humana de conformidad con la SEC ID NO:l que tiene uno o más de los aminoácidos divergentes de monos rhesus reemplazado con otro aminoácido, tal como los aminoácidos en paréntesis, pueden ser efectivos. Se deberá notar que ciertos aminoácidos divergentes rhesus son también aquellos encontrados en las especies de rata y murina anteriores (posiciones 35, 68, 89, 100, 108 y 118) . Además, ur.o puede preparar una molécula consenso de murina/rata/rhesus/humana (usando la numeración de la SEC ID N0:1) que tiene uno o más de los aminoácidos reemplazados por otro aminoácido a las posiciones 4, 8, 32, 33, 3_5, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 8_9, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145. Las posiciones subrayadas son aquellas en las cuales todas las tres especies son divergentes de la proteina OB humana. Un análogo de leptina humano particularmente preferido es uno en donde los aminoácidos a la posición 100 (Trp) o 138 (Trp), y más preferiblemente, ambas posiciones, son substituidas con otros aminoácidos, preferiblemente Gln. Otros análogos pueden ser preparados por la supresión de una parte de la secuencia de aminoácido de la proteína. Por ejemplo, la proteína madura carece de una secuencia líder (-22 a -1) . Uno puede preparar las siguientes formas truncadas de las moléculas de la proteina OB humana (usando la numeración de la SEC ID NO : 1 ) : (i) aminoácidos 98-146; (ii) aminoácidos 1-99 y (conectado a) 112- 146; (iii) aminoácidos 1-99 y (conectado a) 112- 146 que tienen uno o más de los aminoácidos 100-111 secuencialmente colocados entre los aminoácidos 99 y 112. Además, las formas truncadas pueden también tener alteradas uno o más de los aminoácidos, los cuales son divergentes (en la proteina OB de murina, rata o rhesus) de la proteína OB humana. Además, cualquiera de las alteraciones pueden ser en la forma de aminoácidos alterados, tal como peptidomiméticos o D-aminoácidos . También incluidas son aquellas proteínas como las expuestas anteriormente con las substituciones de aminoácidos las cuales son "conservativas" de conformidad con la acidez, carga, hidrofobicidad, polaridad, tamaño o algún otra característica conocida por aquellos expertos en la técnica. Estas se exponen en la Tabla 1, abajo. Véase de manera general, Creighton, Proteins, passim (W.H.. Freeman and Company, N.Y., 1984); Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991), los cuales están aqui incorporados por referencia. ^%7¡Y jjY ? . g Uüi tk&¿£X&¡ Tabla 1 Substituciones conservativas de aminoácidos Por lo tanto, los conjugados de dextrano-leptina presentes, pueden ser seleccionados de entre (de conformidad con la secuencia de aminoácido co o se presenta en la SEC ID NO : 1 , aqui) : (a) la secuencia de aminoácido de la SEC ID N0:1, opcionalmente carece de un residuo de glutaminilo a las posiciones 28, y además opcionalmente tiene un residuo de metionilo al litérmino ; (b) una secuencia de aminoácido de la subparte (a) que tiene un aminoácido diferente &&!#$*• substituido en uno o más de las siguientes posiciones: 4, 8, 32, 33, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145; 5 (c) una secuencia de aminoácido de la subparte (b) en donde los aminoácidos a las posiciones 100 y 138 son substituidos con Gln; (d) una proteina de leptina truncada análoga se selecciona de entre: 10 (i) aminoácidos 98-146 (ii) aminoácidos 1-99 y 112-146 (iii) aminoácidos 1-99 y 112-146 que tienen uno o más de los aminoácidos 100-111 secuencialmente colocados entre los aminoácidos 99 y 112; y, (iv) el análogo de leptina truncado de la subparte (i) que tiene uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 142 y 145 substituidos con otro aminoácido; (v) el análogo de leptina truncado de la subparte (iii) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 reemplazados con otro aminoácido; 5 (vi) el análogo de leptina truncado de la subparte (iv) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 10 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 reemplazado con otro aminoácido; y (vii) el análogo de leptina truncado de 15 cualquiera de las subpartes (i)- (vi) que tiene un residuo metionilo N-terminal; (e) una proteina leptina de cualquiera de las subpartes (a)-(d) que tiene una o más de las 20 substituciones de aminoácido conservadas. Las proteínas leptinas, análogos y moléculas relacionadas, son también reportadas en las siguientes publicaciones; sin embargo, no se hace representación con respecto a la actividad de alguna 25 composición reportada: ^— ¿?ajáaa&s ^¿¿¿L*-- ~~ J&ssa fiaasdfr»... ..^. ^».».... . . ^-a, *,.....„. fa-tteáSfai Patente Estadounidense Nos 5, , 521,283 , 525, 705; 5, 532, 336; 5,552, 522; 5, 552, 523 5, 552, 524; 5, 554, 727; 5, 559, 208; 5, 563,243 5,563,244; 5, 563, 245; 5, 567, 678; 5, 567, 803 5,569,743; 5, 569, 744; 5, 574, 133; 5, 580, 954 5, 594, 101; 5, 594, 104; 5, 605, 886; 5,614,37 ,691,309; 5,719,266 (Eli Lilly and Company); PCT W096/23513; W096/23514; W096/23515; W096/23516; W096/23517; W096/23518; W096/23519; WO96/23520; W096/23815; W096/27385; W096/34111; W096/37517; WO97/00886; EP 725978; EP 735079; EP 744408; EP 745610; EP 835879 (Eli Lilly and Company); PCT WO96/22308 ( Zymogenet íes ) ; PCT W096/31526 (A ylin Pharmaceuticals, Inc.); PCT W096/34885; W097/46585 (Smithkline Beecham PCL) ; PCT W096/35787 (Chiron Corporation) ; PCT WO97/16550 (Bristol-Myers Squibb); PCT WO97/20933 (Schering Corporation) EP 736599 (Takeda) EP 741187 (f . Hoffman LaRoche) .

En la extensión, estas referencias se proporcionan para proteínas leptina útiles o ****»***^.** ******** ...**** análogos, o composiciones asociadas o métodos, tales composiciones y/o métodos pueden ser usados en conjunto con los presentes conjugados de dextrano- leptina, tal como para la co-administración (junto o separadamente, en un programa de dosificación seleccionada) . Con las provisiones anteriores, estas publicaciones están aquí, incorporadas para referencia .

Específicamente contemplados, son los siguientes conjugados de dextrano-leptina: leptina humana recombinante ( "rHu-leptina" ) , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:l, opcionalmente carece de un residuo de glutaminilo a la posición 28, y además opcionalmente tiene un residuo metionilo N-terminal, unido a (a) una porción dextrano solamente al N-término; o (b) una porción dextrano al N-término en combinación con porciones dextrano adicionales a las posiciones en lugar del N-término de la proteína leptina. En particular, las porciones de dextrano del presente conjugado dextrano-leptina, pueden tener un peso molecular en el rango de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 20 kD, más particularmente de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 10 kD, aún más particularmente, de aproximadamente 1 kD, has~a .i,^¡?¿?^.., ,?^..^, Mi&L- -. —- **&*&J aproximadamente 7 kD y, más particularmente, que tiene un peso molecular de aproximadamente 6 Kd. También específicamente contemplado está un conjugado dextrano-leptina, elaborado de una porción de 5 dextrano de 6 kD, unida al N-término a rmetHu- leptina. Las porciones dextrano del presente conjugado dextrano-leptina son preferiblemente elaboradas de una cepa de bacteria que minimiza la ramificación al-3. 10 También, específicamente contemplados son las mezclas de conjugado dextrano-leptina, que comprenden lo siguiente en cualquier combinación: (a) un conjugado de dextrano-leptina, en donde una porción de dextrano está unida a una porción de leptina; (b) un conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano está unida a dos porciones de leptina; y (c) un conjugado de dextrano-leptina, 20 en donde dos porciones de dextrano están unidas a dos porciones de leptina, dicho par de conjugados cié dextrano-leptina están unidos a cada uno de los otros; en donde la porción de dextrano está unida al N-término a la porción leptina que tiene la secuencia 25 de aminoácido de la SEC ID NO : 1 , opcionalmente que k^gs3¡& -"ynA carece de un residuo glutaminilo a la posición 28, y además, opcionalmente que tiene un residuo metionilo al N-término.

Leptinas Animales Además de la leptina terapéutica humana, ciertas leptinas animales también son disponibles para uso terapéutico animal. Ciertas leptinas se describen en WP 97/32022, aqui incorporada por referencia. Otras especies animales se describen en las siguientes publicaciones: W096/36644, EP 743321 (porcino y bovino) ; WO 98/04288 (bovino) ; WO 98/04690 (porcino) , de los cuales todos están aquí incorporados para referencia.

Composiciones Farmacéuticas En aún otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas de los presentes conjugados de dextrano-leptina y métodos de tratamiento usando tales composiciones farmacéuticas para usos terapéuticos. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para administración por inyección del bolo o por infusión (por ejemplo, intravenosa o subcutánea), o por administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, comprendidas por al invención, son 5 composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de conjugados dextrano-leptina de la invención, junto con diluyentes farmacéuticamente aceptables, preservativos, solubilizadores, emulsificadores, adyuvantes y/o portadores. Tales composiciones farmacéuticas incluyen diluyentes de varios contenidos de amortiguadores (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) , pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, Polysorbato 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), preservativos (por ejemplo Thimersol, alcohol bencílico) y substancias de abultamiento (por ejemplo, lactosa, manitol); incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o dentro de liposomas. Véase por ejemplo, PCT W096/29989, aquí incorporada por referencia. El ácido halaurónico puede también ser usado, y este puede tener el efecto de incrementación de duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, relación de liberación in vivo, y relación de claridad in vivo de los conjugados de dextrano-leptinas presentes. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18t . Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, el cual está aqui incorporado para referencia. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o pueden ser en polvo seco, tales como la forma liofilizada. Las formulaciones de liberación sostenida implantables, están también contempladas, como son las formulaciones transdérmicas . Las formulaciones oral son contempladas como se describe en PCT WO 95/21629, aquí incorporado por referencia en su totalidad, Esta publicación de PCT, describe la liberación oral de proteínas químicamente modificadas, incluyendo proteínas modificadas por porciones de dextrano. Las composiciones y métodos descritos aqui son aplicables para preparar formulaciones de liberación oral de los presentes conjugados de dextrano-leptina. La liberación pulmonar del presente conjugado de dextrano-leptina están tambié contempladas, y las composiciones y métodos descritos en PCT WO94/20069 son útiles para la preparación y uso de los presentes conjugados de dextrano-leptina. El WO 94/20069, el cual describe la liberación pulmonar de G-CSF químicamente modificados, está 5 aqui incorporado por referencia. Los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, deberán ser más ventajosamente preparados en forma particulada con un tamaño de partícula promedio de menos de 10 micrones, más preferiblemente, 0.5 a 5 micrones, para la liberación más efectiva al pulmón distal. La liberación nasal de los presentes conjugados de dextrano-leptina está también contemplada. La liberación nasal permite el paso de la proteina a la corriente sanguínea directamente después de la administración del producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad de colocación del producto en el pulmón. Las formulaciones para liberación nasal incluyen aquellas con dextrano o dextrina, tal como ciclodextrina. La liberación via el transporte a través de otras membranas mucosas está también contemplada.

Dosificaciones Un experto en la técnica, será capaz de verificar dosificaciones efectivas para administración y observación del efecto terapéutico 5 deseado. Preferiblemente, la formulación del conjugado será tal entre aproximadamente 0.01 µg de porción de leptina/kg de peso corporal/día y 10 mg de porción de leptina/kg de peso corporal/día proporcionarán el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones efectivas pueden ser determinadas usando herramientas de diagnóstico con el tiempo. Por ejemplo, un diagnóstico para medición de la cantidad de leptina en la sangre (o plasma o suero) pueden primero, ser usados para determinar los niveles endógenos de la proteína leptina. Tal herramienta de diagnóstico puede estar en la forma de un ensayo anticuerpo, tal como el ensayo de emparedado de anticuerpo. La cantidad de proteina leptina endógena es cuantificada inicialmente, y se determina una linea de base. Las dosificaciones terapéuticas son determinadas como la cuantificación de la porción de proteína letpina endógena y exógena (esto ee, proteina, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo, ya sea autoproducido o administrado) se continua durante el curso de la terapia. Las dosificaciones pueden por lo tanto, variar con el curso de la terapia, con, por ejemplo, una dosificación relativamente alta siendo usada inicialmente, hasta que se observa el beneficio terapéutico, y dosificaciones más bajas usadas para mantener los beneficios terapéuticos.

Métodos de Uso Terapéutico : Los usos terapéuticos incluyen modulación del peso, el tratamiento o prevención de la diabetes, reducción lipida sanguínea (y tratamiento de condiciones relacionadas), incremento de la masa corporal delgada e incremento de la sensibilidad a la insulina. Además, las presentes composiciones pueden ser usadas para la manufactura de uno o más medicamentos para el tratamiento o disminución de las condiciones anteriores.

Modulación del peso : Las presentes composiciones y métodos pueden ser usados para la reducción de peso. Revisado de otro modo, las presentes composiciones pueden ser usadas para el mantenimiento de un peso deseado o nivel de adiposidad. Como se ha demostrado en los modelos -^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ murina (véase infra) , la administración de los presentes conjugados de dextrano-leptina resultan sn la pérdida de peso. La perdida de masa corporal es principalmente de tejido adiposo o grasa. Tal pérdida de peso puede ser asociada con el tratamiento de condiciones concomitantes, tal como aquellas posteriores, y por lo tanto, constituyen una aplicación terapéutica. Además, se proporcionan usos cosméticos aqui, si la modulación del peso es solamente para el mejoramiento de la apariencia.

Tratamiento de la diabetes. Las presentes composiciones y métodos pueden ser usados en la prevención o tratamiento de la diabetes Tipo II. Como diabetes Tipo II, pueden ser correlacionadas con la obesidad, el uso de la presente invención para reducir peso (o mantener un peso deseado, o reducir o mantener un nivel de adiposidad) puede también aliviar o prevenir el desarrollo de la diabetes. Sin embargo, aún en la ausencia de dosificaciones suficientes resulta en pérdida de peso, las presentes composiciones pueden ser usadas para prevenir o aminorar la diabetes.

Modulación del Lípido Sanguíneo: Las presentes composiciones y métodos pueden ser usados en la modulación de los niveles lípidos sanguíneos. La Hiperlipidemia (también llamada lipemia; 5 dislipidemia) es la presencia de una cantidad anormalmente grande de lípidos en la circulación sanguínea. Idealmente, en situaciones en donde solamente la reducción en los niveles de los lipidos sanguíneos se desea, o en donde el mantenimiento de los niveles de lipidos en la sangre se desea, la dosificación será insuficiente para resultar en la pérdida de peso. Además, durante un curso inicial de terapia de un paciente obeso, las dosificaciones pueden ser administradas si se alcanza concomitantemente la pérdida de peso y disminución del nivel de lipidos en la sangre. Una vez que se ha alcanzado la pérdida de peso suficiente, una dosificación suficiente para prevenir la ra-ganancia de peso, aún suficiente para mantener los niveles de lipidos en la sangre deseados, u otras condiciones como se exponen aqui, por ejemplo, pueden ser administrados. Estas dosificaciones pueden ser determinadas empíricamente, como los efectos de la proteina leptina sean reversibles. Por ejemplo, Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) a 547.

Además, si las dosificaciones resultantes en la pérdida de peso se observan cuando la pérdida de peso no es deseada, uno podría administrar una dosis baja con el fin de alcanzar los niveles de lipidos en la sangre deseados, aún manteniendo el peso deseado. Véase, por ejemplo, Publicación PCT WO 97/06816, aquí incorporada pro referencia.

Incremento de la Masa Delgada o Sensibilidad a la insulina. Idealmente, en situaciones en donde solamente un incremento en la masa corporal delgada se desea, la dosificación será insuficiente para resultar en la pérdida de peso. Además, durante un curso inicial de terapia de una persona obesa, las dosificaciones pueden ser administradas con lo cual, concomitantemente, se alcanza una pérdida de peso y decremento del tejido graso/incremento de la masa delgada. Una vez que se alcanza suficiente pérdida de peso, una dosificación suficiente para prevenir la ganancia nuevamente de peso, aún suficiente para mantener el incremento de la masa delgada deseada (o prevención de la supresión de la masa delgada) puede ser administrado. Para incrementar una sensibilidad individual a la insulina, las consideraciones de dosificaciones similares pueden tomarse en cuenta. E.L incremento de la masa delgada sin la pérdida de peso, se puede alcanzar suficiente para disminuir la cantidad de insulina (o, potencialmente, amilina, antagonistas o agonistas de amilina, o tiazolidinodionas, u otros fármacos de tratamiento de la diabetes potenciales) un individuo podrá se administrado para el tratamiento de la diabetes. Para incrementar la fuerza total, pueden ser consideraciones de dosificaciones similares. La masa delgada incrementa con el incremento concomitante en la fuerza total puede ser alcanzado con dosis insuficientes para resultar en la pérdida de peso. Otros beneficios, tales como un incremento en las células rojas de la sangre (y oxigenación en la sangre) y un decremento en la resorpción ósea u osteporosis, pueden también alcanzarse en la ausencia de pérdida de peso. Véase por ejemplo, PCT Publicación No. WO 97/18833 aqui incorporada por referencia .

Terapias de Combinación. Las presentes composiciones y métodos pueden ser usados en conjunto con otras terapias, tal como dieta alterada y ejercicio. Otros medicamentos, tales como aquellos empleados para el tratamiento de la diabetes (por ^^£^^S^,Í ejemplo, insulina y posiblemente amilina, antagonistas o agonistas del mismo, tiazolidinodiona s (véase, por ejemplo, Publicación PCT No. WO 98/08512, aqui incorporada por referencia) , u otros fármacos de 5 tratamiento de la diabetes potenciales), medicamentos para la disminución de la presión sanguínea y colesterol (tal como aquellos los cuales reducen los niveles de lípidos en la sangre u otros medicamentos cardiovasculares), medicamento que incrementa la 10 actividad (por ejemplo, anfetaminas) , diuréticos (para eliminación de líquidos) y supresores del apetito (tal como agentes los cuales actúan en los neuropéptidos y receptores o inhibidores de la reingestión de serotonina). Tal administración puede 15 ser simultáneamente o puede ser in seriatim. Además, los presentes métodos pueden ser usados en conjunto con procedimientos quirúrgicos, tal como cirugías cosméticas diseñadas para alterar la apariencia total de un cuerpo (pro ejemplo, liposucción o cirugías 20 láser diseñadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implante diseñadas para incrementar la apariencia de la masa corporal) . Los beneficios de salid de cirugías cardiacas, tal como cirugías bypass o de derivación u otras cirugías diseñadas para 25 relieve una condición dañina causada por el bloqueo ^--*—-^- •-"• ~ ^**** **?~--~ . ~~ .. ~ .,¿^ ^ ^ l,,,^m ^^ ^...^ ..=t, ,-.^^É^^^¿^ ele los vasos sanguíneos por el deposito de grasas, tales como placa arterial, pueden incrementarse con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar piedras en la bilis, tal como métodos láser o ultrasónicos, pueden también ser usados ya se antes, previo a durante o después de un curso de los presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos pueden ser usados como adjuntos a cirugías o terapias per fracturas óseas, músculos dañados, u otras terapias, las cuales podria mejorarse por un incremento en la masa del tejido delgado.

Métodos de Producción de Leptina Las porciones de leptina usadas aqui, pueden elaborarse en células procarióticas o eucarióticas, aunque, para las porciones de leptina usadas en los siguientes ejemplos de trabajos abajo, la bacteria es preferida por facilidad de manufactura comercial. Uno puede además usar la leptina elaborada en células humanas, tal como aquellas elaboradas para controlar un elemento regulatorio introducido o nativo, el cual afecta la regulación de un gen endógeno que codifica la proteina deseada. La expresión recombinante de las porciones de leptina empleadas en los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, se han descrito, por ejemplo, en WO 96/40912, aquí incorporada por referencia, incluyendo todos los depósitos de cepas de vector y huésped citados aquí .

Purificación de Conjugados Los conjugados de dextrano-selecti a seleccionados de la presente invención, pueden ser aislados de las mezclas de conjugado de dextrano-leptina usando métodos bien conocidos en la técnica para la purificación de proteínas. Un procedimiento de purificación de una etapa, puede ser fácilmente alcanzado por la realización de la cromatografía de intercambio catiónico. Véase por ejemplo, Ralph et al., Biochemistry 34: 4889-97 (1995), aquí incorporado pro referencia. Otro método de purificación conocido empleado en la purificación de los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención, involucran la cromatografía de interacción hidrófoba. Véase por ejemplo, Pharmacia Biotech s HiTrap HIC Test Kit Instructions, 71-7147-00, ed. Af, at 1-19 (1993; Uppsala, Sweden) , aqui incorporada por referencia . yjééis&teii La primera serie de ejemplos abajo, demuestran con el conjugado de dextrano-rmetHu- leptina de 6 Kd (1) actividad; (2) tiempo de circulación incrementado in vivo comparado con el rmetHu-leptina nativo; (3) solubilidad incrementada bajo condiciones fisiológicas (comparado con el rmetHu-leptina nativo); (4) carencia de reacciones de sitio de inyección; (5) respuesta inmunogénica mínima en primates; y (6) carencia de vacuolización de riñon. La segunda serie de ejemplos abajo, demuestran algunas de las mismas características de realización como abajo con el conjugado de dextrano-rmetHu- leptina 17.5 Kd.

EJEMPLOS Animales . Los animales de prueba usados en los siguientes experimentos fueron alojados cinco en una jaula para ratones y dos en una jaula para ratas; todos los animales se alimentaron ad libitum. Unas doce horas del ciclo de luz/obscuridad se mantuvieron a través de los experimentos. Los animales se manipularon y cuidaron de conformidad con las prácticas aceptadas para el cuidado de animales de laboratorio Administración de Dextrano-leptina. La administración de ya sea la composición de prueba o placebo, fue por inyección subcutánea ("s.c") en la cervix dorsal del cuello de los animales o intravenosamente a través de un catéter residente en la vena yugular ("i.v") . Todas las dosificaciones del conjugado de dextrano-leptma se calcularon por la determinación de la concentración de proteína leptina del conjugado.

Proteína Leptina. Se usó la leptina humana metionilo recombmante (rmetHu-leptina) para los presentes experimentos.

Ejemplo 1 Este ejemplo muestra la preparación de un conjugado de dextrano-leptina de 6 kD de la presente invención .

Activación del Dextrano. Seis kD de dextrano (pico mol., pero, 6 kD con polidispersidad de aproximadamente 1.77 kD) se compró de Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY) . El dextrano se activó para gfcSBJteW „ . * . ^,.- AnS?nk a agregar grupos aldehido. Brevemente, 0.35 M de periodato de sodio se agregaron lentamente a 10 Mm de tetraborato de sodio en hielo, y el pH se ajustó a pH 3.0. Ciento veinte gramos de dextrano de 6 kD se agregaron a 400 mL de la solución anterior, y la mezcla se agitó por 24 horas a temperatura ambiente. La relación molar del periodato a subunidad de glucosa fue de 0.26:1. Mientras se continuaba agitando, 73.6 mL de etilenglicol se agregaron y La mezcla se agitó por unas dos horas adicionales. El dextrano oxidado se dializó extensivamente contra H20 destionizada, destilada. Tanto antes como después de la activación, el dextrano se probó usando cromatrografía de permeación de gel (GPC) para confirmar la estabilidad de la porción de dextrano. Después de la activación, el número de aldehidos en las porciones de dextrano activadas se cuantificó usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica. Zhao & Heindel, Pharn. Res . 8: 400-02 (1991). Otros dextranos se ensayaron y activaron en una forma similar.

Unión del Dextrano a la Proteina Leptina.

Brevemente, se elaboró rmetHu-leptina en una solución a una concentración de aproximadamente 1 Mita- «_ ^-^ ^..w^»»^^.*^-^^ mg/mL en 40 mM de amortiguador acetato de <-«sodio, p>H 4.8, el cual se mezcló con 10 mg/mL de dextrano oxidado, 40 Mm de una solución de acetato de sodic, pH 4.8. La relación molar final de las porciones de 5 dextrano a porciones de leptina fue de 20:1. La mezcla se agitó en una plataforma rotatoria por 1 hora a temperatura ambiente. 1 mg/mL de una solución de NaBH3CN en 40 mM de acetato de sodio, pH 4.8, se agregó a una relación molar de NaBH3CN a dextrano de 10:1. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por dos horas y después se transfirió a un cuarto frío (4°C) para continuar la agitación. El conjugado dextrano-leptina se trató con 10 mg/mL de NaBH4 en 40 mM de acetato de sodio, pH 4.8 a una relación molar de NaBH4 a unidades de glucosa oxidada de 2.5:1 (10% o 3.3 mol de unidades de glucosa oxidada/mol de dextrano 6 Kd) . La solución de NaBH4 se agregó en forma de gotas a la mezcla, mientras se agitaba en hielo . 20 Caracterización. Se realizó la determinación de la substitución de dextrano de los conjugados. La pureza y peso molecular aproximado de los conjugados de dextrano-leptina se determinaron por el análisis SDS-PAGE.

Se determinó que el enlace de los grupos aldehidos activados de las porciones de dextrano oxidadas, se unió al N-término de las porciones de leptina. Brevemente, el conjugado dextrina-rmetHu- leptina y rmetHu-leptnina no modificado, se cortó por las endoproteasas al los residuos lisina (EndoLys-C) o residuos de ácido aspártico (EndoAsp-N) , respectivamente, en dos experimentos separados. Las muestras se digirieron a una enzima a relación de substrato de 1:50 1:75, respectivamente, a 25°C, por 8 y 7 horas respectivamente. Los fragmentos peptídicos resultantes se mapearon por RP-HPLC, usando una columna YMC C-8 (2.1 mm id), y se eluyeron usando un gradiente de dos solventes, Solvente A) 0.1% TFA en HPLC de grado agua y Solvente B) 0.1% de TFA en 90% de HPLC de grado acetonitirlo, a las siguientes concentraciones: 5 min. 100%A; 80 min. 90% A, 10% B; 5 min. 50 % A, 50% B; 10 min, 10% A, 90%B. La columna se mantuvo a 26°C y se eluyó a 0.2 mL/min. Ralph et al., supra . Comparado con la rmetHu-leptina no modificada, el mapeo peptídico del conjugado de dextrano-rmetHu-leptina con la digestión de Endolys-C (Figura 1A) , mostró que un pico único desapareció a aproximadamente 14 minutos. De manera similar, el mapeo peptidico con la digestión de Endoasp-N (Fig.

IB) mostró que un solo pico desapareció a aproximadamente 16 minutos. Estos péptidos de la rmetHu-leptina no modificada fueron N-terminalmente secuenciados por identificación y confirmaron ser los péptidos N-terminales generados por las digestiones de la proteasa. Además, la unión de la porción dextrano a la porción leptina fue selectiva para los péptidos N-terminales. Además, la secuenciación N- terminal mostró aproximadamente 98.6% N-términos bloqueados, indicando que el dextrano se conjugó aL N-término de rmetHu-leptina. Además, se determinó por el análisis SDS-- PAGE, que la propensidad de la reacción se condujo hacia la formación de dimeros, es decir, la unión de una porción de dextrano a dos porciones de leptina o dos porciones de dextrano a dos porciones de leptina, Como se observa en la Figura 2, una proporción significante del conjugado de dextrano-leptina, presenta a sí mismo, una formación de dimero (Línea 3 es una mezcla de conjugado dextrano-rmetHu-leptina) . Se ha determinado por la espectrometría de masas MALDI-TOF de Extracción Retardada, usando ácido sinapinico como matriz, que la banda principal de la Linea 3, consiste de ambas especies de dimeros (es decir, una porción de dextrano-dos porciones de leptina, dos porciones de dextrano-dos porciones de leptina). La rmetHu-leptina sin reaccionar y algunas de las especies de pesos moleculares superiores formadas en cantidades menores, se separaron de la mayoría de los conjugados de dímeros y la minoría de los monómeros conjugados a través de la cromatografía de intercambio iónico (Linea 4 mostró el conjugado dextrano-rmetHu-leptina después de la cromatografía de intercambio iónico) . 10 Ejemplo 2 Este ejemplo demuestra la eficacia mejorada de los conjugados de dextrano-leptina de 6 kD de la 15 presente invención, sobre el rmetHu-leptina no modificado. El conjugado dextrano-leptina del Ejemplo 1, se probó por su eficacia en la inducción ds pérdida de peso en ratones normales. Ratones hembra normales C57BL/6 (Charles 20 River Laboratories, Wilmington, MA) , de 8-10 semanas de edad y que pesan aproximadamente 20 gramos, se inyectaron diariamente por siete dias con ya sea el conjugado de dextrano-leptina sujeto (como se describe en el Ejemplo 1 anterior), leptina no 25 modificada o placebo (salina amortiguada de fosfato; t^'¡a¡ááBEafe.ag! i^¿_s?^¡¡É|É?^_^ßi xüMa^ ^Maal í^k "PBS") . Las dosis de 1 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg y 100 mg/kg, , se probaron tanto por el conjugado de dextrano-leptina como de la leptina no modificada. Los pesos se monitorearon a través del 5 estudio. El cambio de peso al final del estudio (día 7) para el grupo tratado con el conjugado ce dextrano-leptina, se comparó contra el grupo tratado con leptina no modificada. La pérdida de peso se calculó como la cantidad de pérdida de peso relativa a un control amortiguador ( (peso grupo amortiguador - pelo grupo de muestra) /peso grupo amortiguador x 100) . La eficacia del conjugado de dextrano-leptina que significantemente más grande que para la leptina no modificada a 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, y 100 mg/kg de dosis. Sin embargo, se observó una respuesta a la dosis para el conjugado de dextrano-leptina. El por ciento de pérdida de peso al final del estudio relativo al control de amortiguador PBS se trazó contra la dosis en mg/kg para ambos, el conjugado de dextrano-leptina y la leptina no modificada. Como se muestra en la Figura 3, por la fijación de datos a las curvas algorítmicas simples y asumiendo un ED50 (dosis requerida para alcanzar 50% máximo de pérdida de peso) para dar 7% pérdida de peso, uno puede aproximar los valores ED50 para el conjugado de dextrano-leptina y leptina modificado como 4 mg/kg y 20 mg/kg, respectivamente. Así, los datos demuestran que el conjugado de dextrano-leptina de la presente 5 invención es aproximadamente 5 partes más eficaz que la leptina no modificada.

Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra el efecto de pérdida de peso sostenido de los conjugados de dextrano- leptina de 6 kD de la presente invención. Ratas hembra normales C57BL/6, de 8-10 semanas de edad, y que pesan aproximadamente 20 gramos, se inyectaron s.c. únicamente un dia 0 a una dosis de 100 mg/kg, con ya sea el conjugado de dextrano-lep ina o leptina no modificada. Como se observa en la figura 4, el efecto de pérdida de peso del conjugado de dextrano- leptina continuó por 4-5 dias con un incremento en dos partes en el pico de la pérdida de peso, mientras el efecto de pérdida de peso de la leptina no modificada continuó solamente 1-2 días. Los estudios farmacocinéticos en ratas, mostraron que el conjugado de dextrano-leptina, persisten en la sangre, substancialmente más tiempo que la leptina no modificada. Ratas Wistar Kyoto macho caterizadas, que pesan de 200-250 gramos, se inyectaron con una dosis única a 10 mg/kg del conjugado dextrano-leptina sujeto (como se describe en el Ejemplo 1 anterior) o leptina no modificada, o 5 sea s.c o intravenosamente ("i.v"). A post-inyección de intervalos de tiempo fijos las muestras de sangre se retiraron vía el catéter residente. Como se observa en la figura 5A, el conjugado de dextrano- leptina inyectado i.v. persiste en la sangre durante 72 horas post-inyección, mientras la leptina no modificada fue completamente aclarada por aproximadamente 8-12 horas post-inyección. Aunque ambas moléculas presentaron flujo bifásico, tanto a la media vida de la fase inicial, como, particularmente, la media vida de fase termina, para el conjugado de dextrano-leptina se incrementaron significantemente, indicando que el conjugado de dextrano-leptina diminuye el flujo de la proteína leptina de la corriente sanguínea. Asi, el tiempo de circulación de plasma in vivo del conjugado de dextrano-leptina se extendieron, comparado con el tiempo de circulación del rmetHu-leptina no modi ficada . De manera similar, el conjugado de dextrano- 25 leptina inyectado s.c. persistió en la sangre a través de 96 horas "^ ost-inyección, mientras la leptina no modificada, tiene un flujo relativamente rápido de aproximadamente 18-24 horas post-inyección, como se observa en la Figura 5B .

Ejemplo 4 Este ejemplo demuestra la solubilidad incrementada bajo condiciones fisiológicas de los conjugados de dextrano-leptina de 6 kD de la presente invención, como los comparados con la rmetHu-leptina no modificada. Las muestras del conjugado de dextrano-leptina y leptina no modificada se tomaron después de la purificación de la proteina. Las muestras se dializaron durante la noche a 4°C en PES de Dulbecco, pH 7. Una solución diluta de cada uno de los conjugados de rmetHu-leptina no modificado y dextrano-rmetHu-leptina (aproximadamente 1-2 mg/mL d eproteina leptina) se concentró usando un sistema de concentración Amicon Centriprep™ 10 (Beverly, MA) . Las muestras se centrifugaron en ciclos repetidos de duración decreciente a 4°C, se obtuvo 3400 rpm hasta un volumen de aproximadamente 0.5 mL . La concentración de la proteína se determinó por triplicado por el ensayo de Bradford, Anal . Biochem. 72: 248-54 (1976), usaádo reactivos BioRad (Hercules CA) . Mientras la solución de la rmetHu-leptina no modificada podría comenzar por mostrar la precipitación de la pro'teína a aproximadamente 2-3 mg/mL en PBS a pH neutral, el conjugado de dextrano-leptina fue todavía soluble a 80 mg/ml. A todavía concentraciones más altas, la solución del conjugado de dextrina-leptina llegó a dificultar su manipulación. Como se entenderá bien por un experto ordinario en la técnica, los parámetros tales como un sistema amortiguador, temperatura, tensioactivos, y fuerza iónica, pueden ser ajustados para optimizar las condiciones de solubilidad.

Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra las reacciones al sitio de inyección mínimas de los conjugados de dextrano-leptina de 6 kD de la presente invención. Ratones hembras normales C57BL/6 (tres ratones por grupo) se inyectaron una vez al día por siete días a una dosis de ya sea 25 mg/kg o 100 mg/kg (concentración de 5 mg/mL y 20 mg/mL, respectivamente) con el conjugado de dextrano-leptina (en PBS, pH 7.1) como se preparó en el Ejemplo 1, y rmetHu-leptina no mgpíificada (ln 10 M de amortiguador de acetato de sodio, 5% sorbitol, pH 4.0) . Las muestras del sitio de inyección se colectaron al octavo día. Los sitios de inyección de los animales se analizaron por varios parámetros hidtopatológicos : necrosis, inflamación (mononuclear contra supurativa) , leptina precipitada, fibroplasia y células de gran tamaño. Basados en tal evaluación, el conjugado de dextrano-leptina fue muy bien tolerado al sitio de la inyección, aún cuando se inyectó a una concentración 20 mg/Ml . No hubo evidencia de la precipitación de leptina y no hubo necrosis del tejido alrededor de la trayectoria de la inyección. Comparado con la leptina no modificada, le reacción del sitio de inyección fue bien tolerado a concentraciones más altas que las concentraciones clínicamente aceptables de leptina no modificada. El limite de la concentración superior para las reacciones del sitio de inyección aceptable del conjugado de dextrano-leptina todavía no ha sido determinado . tíU *?*~-j *uatt Ejemplo 6 Este ejemplo demuestra la carencia de una respuesta inmunogénica en primates a los conjugados de dextrano-leptina de 6 kD de la presente invención. Se trataron chimpancés por 4 semanas con una inyección s.c tres veces por pico de 0.1 mg/kg del conjugado de dextrano-leptina de 6 kD, como el preparado en el Ejemplo 1, y el suero de chimp se analizó por ELISA. Se observó poca o ninguna respuesta a IgG o IgM al conjugado de dextrano-leptina. Un nivel de anticuerpo de antecedente alto se observó, y, así, se realizaron los estudios para la inhibición para determinar si estos anticuerpos fueron reactivos contra el dextrano (6 kD o 70 kD) , el conjugado de dextrano-leptina de 6 kD o la proteina leptina misma. Los estudios de inhibiciór> con las muestras pre-derramadas y las muestras del final del estudio (dia 29), no mostraron diferencias significantes en la inhibición, indicando que la reactividad del anticuerpo fue dirigida hacia los anticuerpos pre-formados. En particular, el dextrano de 70 kD mostró inhibición completa, mientras el dextrano de 6 kD mostró inhibición parcial, Además, el conjugado de dextrano-leptina también mostró inhibición completa, mientras la proteina leptina no ñftfifipr wt****z*z8--***¿* modificada sola, mostró inhibición. Estos resultados indican que la actividad anticuerpo fue dirigida contra el dextrano. De manera más parecida, los epitopes del dextrano "ramificado fueron objetivos (70 kD) . Los resultados claramente muestran que no se dirigió actividad anticuerpo a la proteina leptina misma .

Ejemplo 7 10 Este ejemplo demostró la carencia de la formación de vacuolas en el riñon al conjugado de dextrao-leptina de 6 kD de la presente invención, comparado con los conjugados del polímero soluble en agua de la técnica anterior tal como los conjugados de mono-polietilenglicol-leptma . Brevemente, ratones (tres por grupo) se inyectaron una vez por dia por siete dias a una dosis de ya sea 1 mg/kg o 10 mg/kg con el conjugado de dextrano-leptina de 6 kD como se preparó en el Ejemplo 1 y rmetHu-leptina no modificada. Las muestras se colectaron al octavo dia. Se registró la formación de vacuolas tubulares. No hubo inducción de la formación de vacuola en el riñon con el conjugado de dextrano-leptina a cualquier dosis. Los hallazgos de histopatologia fueron comparables con aquellos vistos para la leptina no modificada. En contraste, la leptina monopegilada a dosis de 1 mg/kg y 10 mg/kg inducen la formación de vacuolas medias y marcadas, respectivamente, bajo las mismas condiciones.

Ejemplo 8 Este ejemplo muestra la preparación características de pérdida de peso de otro conjugado de dextrano-leptina de la presente invención. EL conjugado de dextrano-leptina se preparó de conformidad con los métodos del Ejemplo 1 con la excepción de que el dextrano de 17.5 kD se usó en lugar del dextrano de 6 kD. El dextrano de 17.5 kD se compró de Fluka Chemical Corp. El conjugado de dextrano-leptma de 17.5 kD se probó por su eficacia en la inducción de pérdida de peso en ratones normales. Ratones hembra normales C57BL/6, de 8-10 semanas de edad, y que pesan aproximadamente 20 gramos, se inyectaron diariamente por siete dias con ya sea el conjugado dextrano- leptina de 17.5 kD sujeto, rmetHu-leptina no modificada o placebo (salina amortiguada de fosfato "PBS") . Una dosis de 10 mg/kg se probó para ambos, el conjugado de dextrano-leptina de 17.5 kD y leptina no ^^g im *-" *tfcfc"*<MlLt *M?afc-,,J» modificada. Los "pesos se monitorearon a través del estudio . El cambio de peso durante el curso del estudio para el grupo tratado con el conjugado de 5 dextrano-leptma de 17.5 kD, se comparó contra el grupo tratado con leptina no modificada. Como se observa en la figura 6, la eficacia del conjugado de dextrano-leptina fue más grande que aquella para La leptma no modificada a la dosis de 10 mg/kg. 10 Se probó el efecto de pérdida de peso sostenido del conjugado de dextrano-rmetHu-leptina de 17.5 kD. Los ratones se inyectaron s.c. al día 0 solamente a una dosis de 100 mg/kg con ya sea el conjugado de dextrano-rmetHu-leptina de 17.5 kD, o rmetHu-leptma no modificada. Como se observa en la figura 7, el efecto de la pérdida de peso del conjugado de dextrano-leptma continuó por 5-6 dias con uno y un incremento de media parte en el pico de la pérdida de peso, mientras el efecto de la pérdida de peso de la leptina no modificada, continuó solamente 3-4 días. Así, este ejemplo demuestra la eficacia mejorada de los conjugados de dextrano-leptina de 17.5 kD de la presente invención sobre remtHu-leptina no modificada por la pérdida de peso. ef abL>.l¡ífcJ - g£^^^ág g^g£^^|^ ¿ ^g¿*&g^g^¿g Ejemplo 9 Este ejemplo demuestra la carencia de formación de vacuolización del riñon a los conjugados de dextrano-leptina de 17.5 kD de la presente invención, comparado con los conjugados de polímeros solubles en agua de la técnica anterior, tal como conjugados de mono-polietilenglicol-leptina . Ratones se inyectaron a una dosis de ya sea 1 mg/kg o 10 mg/kg con el conjugado de dextrano-leptina de 17.5 kD o rmetHu-leptina no modificada de conformidad con los procedimientos del Ejemplo 7. NO hubo inducción de 1 a formación de vacuola en el riñon con el conjugado de dextrano-leptina de 17.7 kD a cualquier dosis. Los hallazgos de his topatologia fueron comparables por aquellos vistos para la leptina no modificada.

Ejemplo 10 Este ejemplo considera la carencia de respuesta de los conjugados de dextrano-leptma de la presente invención con anticuerpos humanos a partir de individuos susceptibles a reacciones anafilácticas con dextrano. Estos experimentos se realizaron para mostrar que los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención no son anafilácticos a individuos ß * *r? *•"• ^ con altos títulos de anticuerpos reactivos con dextrano, preformados, circulantes. El suero se colecta a partir de pacientes con altos títulos de circulación, DRA preformada que tiene reacciones anafilácticas experimentadas (Ars) de variación severa. El suero de individuos normales es también colectado como controles.

Ensayos In vitro: Las pruebas in vitro para la reactividad DRA incluye métodos conocidos tal como hemaglutinación pasiva. Véase por ejemplo, Hedin et al., Int. Arch. Allergy App. Immunol. 52:145-49 (1976) aquí incorporado por referencia. Se ha mostrado que el titulo de DRA es positivamente relacionado con el grado de severidad de Ars. Richter et al., supra . , a 134-35.

Por ejemplo, sueros de reactores de dextrano se probaron en un ensayo de hemaglutinación pasiva para determinar si el suero reactivo DRA reacciona con los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención. Brevemente, los eritrocitos, a los cuales los conjugados de dextrano-leptina de la presente invención han sido absorbidos en su superficie, así como también eritrocitos absorbidos con la leptina no modificada y dextrano de bajo peso molecular, separadamente, como controles negativos y dextrano de 70 kD como un control positivo, son incubados con suero DRA y después los eritrocitos son observados por señales de algutinación . No toma lugar la aglutinación de eritrocitos, debido a que el suero DRA ha reducido la afinidad para los dextranos de bajo peso molecular usados en la práctica de esta invención y/o los dextranos de bajo peso molecular no causan agregación de anticuerpos en la cascada de efectos .

Pruebas In vivo: Alternativamente, los estudios animales se condujeron para determinar la reactividad de DRA con los conjugados de dextrano-leptina de bajo peso molecular de la presente invención. Los animales son primero sensibilizados usando un antisuero reactivo a través de dextrano y/o antisuero a dextrano de peso molecular alto (por ejemplo, dextrano de 70 kD) a una dosis suficiente para estimular la anafilaxis. Después los animales son cambiados con un conjugado de dextrano-leptina de la presente invención. Los animales son observados por algún signo de reacción anafiláctica tal como y.,, Y,.^a^*^a ^ ^ Aaüfc^.-^AariBU manifestaciones en la piel, una caída rápida en la presión sanguínea, diestrés o angustia respiratoria, paro cardiaco, etc. No se observaron signos de reacciones anafilácticas en tanto los de DRAs preformados no sean reactivos con los dextranos de bajo peso molecular usados en la práctica de esta invención .

Y ¿ .j-,.,. . ~*~ -A**** **-»'*-* - i?.&Xaa**** ~<m c*? ? -^^--'-- rf.:..... «¿ LISTADO DE SECUENCIA ríí <110> Litzinger, David C <i20> conjugados de dextrano-leptina, composiciones farmacéuticas y métodos relacionados <130> A-534 <140> para ser asignado <141> 1999-08-09 <150> 60/096,194 <151> 1998-08-10 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> Humano <400» 1 Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lyß Thr Leu lie Lys Thr 1 5 10 15 He Val Thr Arg He Aan Asp Zle Ser Kis Thr Gln Ser Val Ser Ser 20 25 30 Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro Xle 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Lys Met ?sp Gln Thr Leu Ala Val Tyr G n Gln. llß 50 55 60 Leu Thr Sar Het Pro Ser Arg Aßn Val Zle Gln lie Ser Aßn Aßp Leu 65 70 75 80 Glu Aßn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys T5 90 95 H s Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Gln Gly Ser Leu G n ?sp Met Leu Trp Gln Leu Amp Leu Ser Pro 130 135 10 Gly Cyß 145 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado de dextrano-leptina, caracterizado porque comprende al menos una porción de dextrano de peso molecular bajo unido al menos a una porción de leptina en donde dicha porción de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD.

2. El conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha porció de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 10 kD.

3. El conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 2, caracterizado porque dicha porción de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 7 kD.

4. El conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha porción de dextrano tiene un peso molecular de U^b&á^^s^* ** i kYy.-,As ¿i . aproximadamente 6 kD,

5. El conjugado de dextrano-leptina de la 5 reivindicación 1, caracterizado porque una porción de dextrano está unida a una o más porciones de leptina .

6. El conjugado de dextrano-leptina de ] a 10 reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos porciones de dextrano se unen a una o más porciones de leptina. 15

7. El conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 1, caracterizado porque múltiples porciones de dextrano se unen a una porción de leptina . 20

8. El conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha porción de leptina se selecciona a partir del grupo que consiste de (de acuerdo a la secuencia de aminoácido 25 de SEC ID NO: 1) : a) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1, carente opcionalmente de un residuo de glutaminilo a posición 28, y además opcionalmente tiene un residuo de metionilo al N-término; b) una secuencia de aminoácido de la subparte (a) que tiene un aminoácido diferente substituido en una o más de las siguientes posiciones: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145; c) una secuencia de aminoácido de la subparte (b) en donde el aminoácido a las posiciones 100 y 138 se substituyen con Gln; d) una proteína de leptina truncada análoga seleccionada de entre: (i) aminoácidos 98-146 (ii) aminoácidos 1-99 y 112-146 (iii) aminoácidos 1-99 y 112-146 que tienen uno o más de aminoácidos 100-111 secuencialmente colocados entre los aminoácidos 99 y 112; y (iv) la peptina truncada análoga, de la subparte (i) que tiene uno o más aminoácido 100, 102, 105, 106, 107, 1 08 , 1 1 1 , 1 12 , 1 1 8 , 13 6 , 138 , 1 42 y 1 45 substituidos con otros aminoácidos; (v) el análogo de leptina truncado de la subparte (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 5 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136,, 138 y 145 se reemplazan con otro aminoácido; (vi) el análogo de leptina 10 truncado de la subparte (iv) que tienen uno o más de aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 15 y 145 se reemplazan con otro aminoácido; y (vii) el análogo de leptina truncado de cualquiera de las subpartes (?)-(v?) que tienen un residuo 20 metionilo N-terminal; (e) una proteína de leptina de las subpartes (a)-(d) que tienen uno o más conservas de substituciones de aminoácido. 25

9. Una mezcla de conjugado de dextra-leptina, caracterizada porque comprende los siguientes en cualquier combinación: (a) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a una porción de 1 e t i na ; (b) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a dos o más porciones de leptina; (c) el conjugado de dextrano-leptina en donde al menos dos porciones de dextrano se unen a una porción de leptina; y (d) el conjugado de dextrano-leptina en donde al menos dos porciones de dextrano se unen a] menos a dos porciones de leptina.

10. La mezcla del conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 9, caracterizado porque comprende lo siguiente en cualquier combinación: (a) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a una porción de leptina ; (b) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a dos porciones ^^^^^^^^^^^^^^^^^^¿^^^^^^^^^^^^^^^ de leptina; y '•áíÉ:?'*' (c) el conjugado de dextrano-leptina en donde dos porciones de dextrano se unen a dos porciones de leptina, dicho par del conjugado de dextrano-leptina se unen a cada uno de los otros.

11. La mezcla de conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 10, caracterizado porque consiste predominantemente de: (a) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a dos porciones de leptina; y (b) el conjugado de dextrano-leptina en donde dos porciones de dextrano se unen a dos porciones de leptina, dicha pareja de los conjugados dextrano-leptina se unen a otra.

12. Un conjugado de dextrano-leptina. producido por el método, caracterizado porque comprende : (a) la activación de una porción de dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD; M?^¡g^^^|^¿^^¿^^^?^^^^^j (b) la unión de la porción de dextrano activado a una porción de leptina bajo condiciones reducidas para formar una amina enlazada, en un pH suficientemente acidico así que la amina amino terminal todavía no se ha protonado, mientras los grupos amina en otras posiciones en la proteina de leptina son protonados; (c) obtención del conjugado de dextrano-leptina; y (d) opcionalmente, la purificación del conjugado dextrano-leptina.

13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el conjugado dextrano- leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el conjugado dextrano- leptma de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un método de tratamiento de un individuo para una condición seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia, caracterizado porque dicho método comprende: la administración en cantidad efectiva de un conjugado dextrano-leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 10

16. Un método de tratamiento de un individuo para una condición seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia, caracterizado porque dicho método comprende : la administración en cantidad efectiva 15 de una mezcla del conjugado dextrano-leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

17. Un conjugado de dextrano-leptina, 20 caracterizado porque comprende al menos una porción de dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD unido al N-terminal en al menos una porción de leptina que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, 25 carente opcionalmente de un residuo glutaminilo en posición 28, y además almente un residuo de metionilo en la N-t

18. El conjugado de dextrano-leptina de la reivindicación 17, caracterizado porque dicha porción de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kD.

19. Una mezcla de conjugado de dextrano- leptina, caracterizado porque comprende el siguiente en cualquier combinación: (a) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a una porción de leptina; (b) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a dos porciones de leptina; y (c) el conjugado de dextrano-leptina en donde dos porciones de dextrano se unen a dos porciones de leptina, dicho par de conjugados dextrano-leptina se unen a cada uno de los otros; en donde dicha porción de dextrano y dicho conjugado de dextrano-leptina tienen un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD y se unen al N-término a dicha porción de leptina que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1, carente opcionalmente de un residuo glutaminilo en 5 posición 28, y además opcionalmente que tiene un residuo demetionilo en el N-término.

20. La mezcla de conjugado de dextrano- 10 leptina de la reivindicación 19, caracterizado porque dicha porción de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kD. 15

21. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un conjugado de dextrano-leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18 en un portador farmacéuticamente aceptable. 20

22. Un conjugado de dextrano-leptina producido por el método, caracterizado porque comprende : 25 (a) la activación de una porción de dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD; (b) la unión de la porción de dextrano activado a una porción de leptina bajo condiciones de 5 reducción para formar un enlace de amina, en un pH suficientemente acidico así que la amina amino- terminal aun no se ha protonado mientras el grupo de amina en otra posición en la proteina de leptina se ha protonado; 10 (c) obtención del conjugado de dextrano-leptina; y (d) opcionalmente, la purificación del conjugado de dextrano-leptina; en donde dicha porción de dextrano se une al N- 15 término para dicha porción de leptina que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, carente opcionalmente de un residuo glutammilo en posición 28, y además opcionalmente tiene un residuo metionilo en el N-término. 20

23. Un método de tratamiento de un individuo por una condición seleccionada a partir de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia, caracterizado 25 porque dicho método comprende: la administración en cantidad efectiva de un conjugado de dextrano-leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18.

24. Un conjugado de dextrina-leptine , caracterizado porque comprende al menos una porción de dextrano que tiene un peso molecular ce aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD unido al 10 N-terminal para al menos una porción de leptina que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 en donde el aminoácido en la posición 100 y 138 se substituye con glutamida, carente opcionalmente de un residuo glutaminilo en posición 28, y además 15 opcionalmente tiene un residuo metionilo en el N- término .

25. El conjugado de dextrano-leptina de la 20 reivindicación 24, caracterizado porque dicha porción de dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kD. 25 •^f^^^^^&^^^?^^^

26. Una mezcla de conjugado de dextrano- leptina, caracterizado porque comprende la siguiente en cualquier combinación: (a) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a una porción de leptina; (b) el conjugado de dextrano-leptina en donde una porción de dextrano se une a dos porciones de leptina; y (c) el conjugado de dextrano-leptina en donde dos porciones de dextrano se unen a dos porciones de leptina, dicho par de conjugados de dextrano-leptina de dicho conjugado de dextrano-- leptina tiene un peso molecular de aproximadamente '.. kD a aproximadamente 20 kD y se unen al N-término a dicha porción de leptina que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 en donde el aminoácido en posición 100 y 138 se substituye con glutamina, carente opcionalmente de un residuo glutaminilo en posición 28, y además opcionalmente tiene un residuo en el N-término.

27. La mezcla del conjugado de dextrano- leptina de la reivindicación 26, caracterizada porque dicha porción de dextrano tiene un peso molecular e aproximadamente 6 kD.

28. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un conjugado de dextrano-leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 25 en un portador farmacéuticamente aceptable.

29. Un conjugado de dextrano-leptina producido por el método, caracterizado porque comprende : (a) la activación de una porción de dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD; (b) la unión de la porción de dextrano activada a una porción de leptina bajo condiciones reducidas para formar un enlace de amina, en un pH suficientemente acidico asi que la amina amino terminal aún no se protoniza mientras los grupos de amina en otras posiciones en la proteina de leptina se protonizan; (c) la obtención del conjugado de 9 lr- dextrano-leptina; y (d) opcionalmente, la purificación del conjugado de dextrano-leptina; en donde dicha porción de dextrano se une en al N- término a dicha porción de leptina que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 en donde los aminoácidos en posición 100 y 138 se substituyen con glutamina, carente opcionalmente de un residuo glutaminilo en posición 28, y además opcionalmente tiene un residuo en el N-término

30. Un método de tratamiento de un individuo para una condición seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia, caracterizado porque dicho método comprende: la administración en cantidad efectiva del conjugado de dextrano-leptina de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 25.