MXPA01000789A - Peptidos novedosos para utilizarse en inmunoterapia de enfermedades autoinmunes - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de péptidos novedosos en una terapia de tolerancia inducida por péptido, para prevenir desórdenes autoinmunes, y en particular a su uso en el tratamiento de destrucción crónica del cartílago articular. Además, la invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden estos péptidos, y un método de diagnóstico para la detección de células T auto-reactivas en una muestra de prueba.

Description

PEPTIDOS NOVEDOSOS PARA UTILIZARSE EN INMUNOTERAPIA DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES La invención se refiere a péptidos novedosos, a su uso en el tratamiento de destrucción crónica del cartílago articular en enfermedades autoinmunes, a composiciones farmacéuticas que comprenden este péptido, y a un método de diagnóstico para la detección de células T auto-reactivas en una muestra de prueba. El sistema inmune se establece sobre un principio de discriminación entre antígenos extraños (no antígenos propios) y autoantígenos (antígenos propios, derivados a partir del propio cuerpo de los individuos) lograda mediante una tolerancia integrada contra los autoantígenos. El sistema inmune protege a los individuos contra los antígenos extraños, y responde a la exposición a un antígeno extraño mediante la activación de células específicas, tales como linfocitos T y B, y mediante la producción de factores solubles como interleucinas, anticuerpos, y factores de complemento. El antígeno al que responde el sistema inmune es degradado por las células presentadoras de antígeno (APCs) , y se expresa un fragmento del antígeno sobre la superficie celular asociada con una glicoproteína de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase II. El complejo de glicoproteína MHC-antígeno-fragmento se presenta ante una célula T, la cual, en virtud de su receptor de células T reconoce el fragmento del antígeno conjuntamente con la proteína MHC clase II con la que está enlazado. La célula T llega a activarse, es decir, se prolifera y/o produce interleucinas dando como resultado la expansión de los linfocitos activados dirigidos hacia el antígeno bajo ataque (Grey y colaboradores, Sci. Am. , , 261: 38-46, 1989). Los auto-antígenos también son continuamente procesados y presentados como fragmentos de antígeno por las glicoproteínas MHC ante las células T (Jardetsky y colaboradores, Nature 353 : 326-329 , 1991). Por consiguiente, el auto-reconocimiento es intrínseco para el sistema inmune. Bajo circunstancias normales, el sistema inmune es tolerante a los auto-antígenos, y se elimina la activación de la respuesta inmune por parte de estos auto-antígenos. Cuando se pierde la tolerancia a los anto-antígenos, el sistema inmune puede llegar a activarse contra uno o más auto-antígenos, dando como resultado la activación de células T auto-reactivas, y la producción de auto-anticuerpos. Este fenómeno es referido como antoinmunidad. Debido a que la respuesta inmune es en general destructiva, es decir, destruye al antígeno extraño invasivo, las respuestas autoinmunes pueden ocasionar destrucción del propio tejido del cuerpo. • En varios estudios se ha establecido la contribución de las células T a las enfermedades autoinmunes. En ratones, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es mediada por un grupo altamente restringido de células T, enlazadas por su especificidad para un solo epítopo de proteína básica de mielina (MBP) que forma complejo con una molécula MHC clase II. En la rata de Lewis, una especie con alta susceptibilidad a diferentes enfermedades autoinmunes, se ha demostrado que la enfermedad es mediada por células T. En las enfermedades autoinmunes de seres humanos, también se piensa que están asociadas con el desarrollo de células T auto-agresivas . Sea implicado una respuesta autoinmune destructiva en diferentes enfermedades, tales como artritis reumatoide (RA) , en donde se destruye la integridad del cartílago articular mediante un proceso inflamatorio crónico resultante de la presencia de grandes números de linfocitos activados y células que expresan MHC clase II. La mera presencia del cartílago parece necesaria para sostener la respuesta inflamatoria local: Se ha sugerido que la degradación del cartílago está asociada con la actividad de las células T auto-reactivas que responden al cartílago en la artritis reumatoide (Sigall y colaboradores, Clin. Exp. Rheumat . 6.: 59, 1988; Glant y colaboradores, Biochem. Soc. Trans. 1£:796, 1990; Burmester y colaboradores, Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (editores) Springer-Verlag Berlín Heidelberg, 1992) . Además, se demostró que la remoción del cartílago de los pacientes de artritis reumatoide mediante cirugía reduce el proceso inflamatorio (R.S. Laskin, J. Bone Joint Surgery (Am) 72:529, 1990). Las proteínas de cartílago, por consiguiente, se consideran como autoantígenos blanco que son competentes para estimular las células T. La activación de estas células T auto-reactivas conduce al desarrollo de la enfermedad autoinmune. Sin embargo, la identificación de los componentes autoantigénicos que tienen un papel en el establecimiento de artritis reumatoide, hasta ahora ha seguido siendo elusiva. La respuesta inflamatoria que da como resultado la destrucción del cartílago, se puede tratar mediante varios fármacos, tales como, por ejemplo, fármacos esteroides. Sin embargo, estos fármacos con frecuencia son fármacos inmunosupresores que no son específicos y que tienen efectos secundarios tóxicos. Los inconvenientes de la inmunosupresión no específica hace que ésta sea una terapia altamente desfavorable . La terapia de inmunosupresión no tóxica específica del antígeno proporciona una alternativa muy atractiva para la inmunosupresión no específica. Esta terapia específica del antígeno involucra el tratamiento de pacientes con el autoantígeno blanco, o con los péptidos que reaccionan con células T sintéticos derivados a partir del autoantígeno .

Estos péptidos sintéticos corresponden a los epítopos de células T del autoantígeno, y se pueden utilizar para inducir tolerancia específica a células T, tanto consigo mismos como con el autoantígeno. Aunque parece paradójico desensibilizar el sistema inmune con el mismo antígeno responsable de activar el sistema inmune, la administración controlada del (auto) antígeno blanco puede ser muy efectiva en la desensibilización del sistema inmune. La desensibilización o la tolerancia inmunológica del sistema inmune se basa en el fenómeno durante mucho tiempo observado de que los animales que han sido alimentados con, o que han inhalado, un antígeno o epítopo, son menos capaces de desarrollar una respuesta inmune sistémica hacia este antígeno o epítopo, cuando este antígeno o epítopo se introduce por medio de una ruta sistémica. La glicoproteína-39 de cartílago humano (HC gp-39) fue previamente identificada como un autoantígeno blanco en artritis reumatoide (RA) (Verheijden y colaboradores, Arthritis Rheum. 40:115-1125, 1997). La estrategia seguida para la identificación de los auto-epítopos pertinentes dentro de HC gp-39, se basó en la suposición de que las moléculas DR4 ó DRl predisponen a la artritis reumatoide (Gao y colaboradores, Arthritis Rheum. 11:939-946, 1990; Nelson y colaboradores Rheumatoid Arthritis, En Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility orkshop and Conference. Volumen I, Tsuj i y colaboradores, editores, Oxford University Press. 1991) en dos niveles, primeramente mediante la configuración del repertorio de células T, y en segundo lugar, mediante selección determinante. El epítopo compartido que se encuentra entre las moléculas DR asociadas con artritis reumatoide podría estar involucrado en la selección de conjuntos similares de péptidos para presentarse ante las células T (Gregerson y colaboradores, Arthritis Rheum. Q: 1205-1213 , 1987). Se identificaron secuencias de enlace supuestas dentro de la estructura primaria de HC gp-39, mediante la utilización de un motivo de enlace peptídico DR4 (Bl*0401) (Verheijden y colaboradores, Arthritis Rheum. 4_Q: 1115-1125, 1997) . La HC gp-39, una proteína de 362 aminoácidos, excluyendo la secuencia de señal (Hakala y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:25803-25810, 1993), contiene seis regiones que acomodan este motivo. Se sintetizaron cuatro péptidos así seleccionados, y se probaron para determinar su enlace con las variantes DRl y DR4 asociadas con artritis reumatoide (Bl*0401 y 0404) . Se encontró que todos los péptidos basados en motivo, que se extienden en los residuos 103-116, 259-275, 263-275 y 326-338 de HC gp-39, se enlazan con una alta afinidad relativa con las moléculas DRB1*0401. Subsecuentemente se examinó el reconocimiento de estos péptidos por parte de las células T de la sangre periférica de pacientes de artritis reumatoide de donadores sanos. Todos los péptidos basados en motivo fueron fácilmente reconocidos en los pacientes de artritis reumatoide, sugiriendo de esta manera una alta frecuencia de células T específicas de HC gp-39 en artritis reumatoide. La respuesta al 263-275 fue más prominente; 8 de 18 pacientes de artritis reumatoide respondieron a este péptido (Verheijden y colaboradores, Arthritis Rheum 4J2.: 1115-1125 , 1997) . Por consiguiente, la HC gp-39 es un blanco para el reconocimiento inmune en la articulación. El significado de esta proteína para la enfermedad artrítica se demostró adicionalmente mediante su artritoge-nicidad en ratones Balb/c. Una sola inyección en la región del pecho con cantidades en microgramos de proteína mezclada en IFA, indujo una inflamación crónica de la articulación que recordaba la artritis reumatoide (Verheijden y colaboradores, Arthritis Rheum 4_0_L1115-1125 , 1997) . Recientemente, se aisló una proteína humana de condrocito novedosa, YKL-39, y se describió (Hu y colaboradores, J. Biol. Chem. 271: 19415-19420, 1996). La proteína comparte una identidad de secuencia significativa con HC gp-39 (YKL-40) . Otro homólogo de HC gp-39 es secretado por los macrófagos humanos y se denomina quitotriosidasa (Boot y colaboradores, J. Biol. Chem. 270 : 26252-26256, 1995) . Las secuencias correspondientes al péptido HC gp-39 (263-275) RSFTLASSETGVG (SEQ ID NO : 3 ) se identifican como HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO: 2) dentro de la proteína YKL-39 (266-278), y como RSFTLASSSDTRVG (SEQ ID NO: 4) dentro de la quitotriosidasa del macrófago (269-282) , respectivamente (Tabla 1) . .El péptido de quitotriosidasa Chi (269-282) contiene el motivo de enlace peptídico DRB1*0401 que se utilizó previamente para la selección de los epítopos de células T adentro de las proteínas. En contraste, el péptido YKL-39 (266-278) con contiene este motivo 0401. Quedará claro que la tolerización de las células T que reaccionan con HC gp-39 (263-275) puede ser benéfica para los pacientes de artritis reumatoide. De la misma manera, los epítopos de imitación de HC gp-39 (263-275) pueden tener una función similar, y se pueden utilizar para inducir tolerancia. De preferencia, estos epítopos de imitación tendrán cuando menos la misma capacidad de tolerización. Para utilizar efectivamente la terapia de inducción de tolerancia con el fin de tratar la destrucción del cartílago mediada por células T, existe una gran necesidad de identificar los péptidos que reaccionen con células T que puedan desensibilizar a los pacientes contra el autoantígeno que esté activando a las células T responsables del proceso inflamatorio . Aunque el péptido YKL-39 no contiene el motivo 0401, de una manera sorprendente se encontró que el epítopo de YKL-39 (266-278) es un epítopo de imitación de HC gp-39 (263-275) . Por consiguiente, este epítopo es útil para la tolerización de células T auto-reactivas con reactividad a la HC gp-39 (263-275), a YKL-39 (266-278) o a sus epítopos de imitación en los pacientes de artritis reumatoide. Es un objeto de la invención proporcionar péptidos que sean capaces de inducir una tolerancia inmunológica sistémica, más en particular tolerancia específica de células T, de preferencia al antígeno de cartílago responsable en los pacientes que sufren de destrucción de cartílago mediada por células T. Los péptidos de la presente invención se caracterizan porque comprenden una o más de las secuencias de aminoácidos FTLASAETT (SEQ ID NO : 1) . De una manera más específica, un péptido de acuerdo con la invención comprende HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO. 2) . También dentro del alcance de la invención están multímeros de los péptidos de acuerdo con la invención, tales como, por ejemplo, un dímero o trímero de los péptidos de acuerdo con la invención. Un multímero de acuerdo con la invención puede ser un homómero, consistente en una multitud del mismo péptido, o un heterómero consistente en diferentes péptidos . Las secuencias de aminoácidos características de los péptidos de conformidad con la invención, pueden estar flanqueadas por secuencias de aminoácidos aleatorios. Las secuencias de flanqueo preferidas son las que tienen un efecto estabilizante sobre los péptidos, incrementando de esta manera su disponibilidad biológica. La glicoproteína de cartílago humano 39 es un autoantígeno blanco en los pacientes de artritis reumatoide, que activa las células T específicas, ocasionando de esta manera o mediando el proceso inflamatorio. Los péptidos derivados de HC gp-39 fueron predominantemente reconocidos por las células T auto-reactivas a partir de pacientes de artritis reumatoide, pero raramente por células T de donadores sanos, indicando de esta manera que HC gp-39 es un autoantígeno en artritis reumatoide. La naturaleza artritogénica de la HC gp-39 fue sustanciada adicionalmente en el ratón Balb/c. Unan sola inyección subcutánea de esta proteína ratones Balb/c pudo iniciar signos artríticos en los animales. El transcurso de la enfermedad inducida por HC gp-39 se caracterizó por recurrencias que se presentaron periódicamente en las patas delantera y/o en las patas traseras, y se desarrollaron gradualmente desde una artritis ligera hasta una forma más severa. También, se observó una distribución simétrica de las articulaciones afligidas que, junto con la observación de las recurrencias, recuerda el progreso de la enfermedad en artritis, especialmente artritis reumatoide . Fue sorprendente encontrar que el péptido YKL-39 266- 278, fue efectivo como un tolerógeno. Estará claro para los expertos en la materia que los péptidos se pueden extender hacia cualquier lado del péptido, o hacia ambos lados, y todavía ejercer la misma función inmunológica. La parte 5 extendida puede ser una secuencia de aminoácidos similar a la secuencia natural de la proteína YKL 39. Los péptidos de conformidad con la invención se pueden preparar mediante métodos químicos orgánicos bien conocidos para la síntesis de péptidos, tales como, por ejemplo, ^fc 10 síntesis de péptidos en fase sólida, descrita, por ejemplo, en J. Amer. Chem. Soc. 11:2149 (1963), y en Int. J. Peptide Protein Res. 11:161-214 (1990). Los péptidos de acuerdo con la invención también se pueden preparar mediante técnicas de ADN recombinante. Se inserta en un vector de expresión, una secuencia de ácido nucleico que codifique para un péptido de acuerdo con la invención, o un multímero de estos péptidos. Los vectores de expresión adecuados comprenden las regiones fc de control necesarias para la réplica y la expresión. El vector de expresión se puede poner para expresarse en una célula hospedera. Las células hospederas adecuadas son, por ejemplo, bacterias, células de levadura, y células de mamífero. Estas técnicas son bien conocidas en este campo, ver, por ejemplo, Sambrooke y colaboradores, Molecular Cloningra Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. Spring Harbor, 1989.

Los péptidos se pueden estabilizar mediante modificaciones C- y/o N-terminales, las cuales reducirán la hidrólisis catalizada por exopeptidasa . Las modificaciones pueden incluir: acilación C-terminal (por ejemplo, acetilación = Ac-péptido) , introducción de amida N-terminal (por ejemplo, péptido-NH2) , combinaciones de acetilación e introducción de amida (por ejemplo, Ac-péptido-NH2) , e introducción de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos (Powell y colaboradores, J. Pharm. Sci., 11:731-735, 1992). Otras modificaciones se enfocan en la prevención de la hidrólisis por parte de las endopeptidasas . Los ejemplos de estas modificaciones son: introducción de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos, aminoácidos modificados, ciclación adentro del péptido, introducción de enlaces peptídicos modificados, por ejemplo enlaces peptídicos reducidos ? [CH2NH] y, por ejemplo, peptoides (derivados de glicina N-alquilados) (Adang y colaboradores, Recl . Trav. Chim. Pays-Bas, 111:63-78, 1994 y Simón y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 11:9367-9371, 1992). Los péptidos de conformidad con la invención son epítopos de células T, que son reconocidos por, y son capaces de estimular, las células T auto-reactivas. Estas células T auto-reactivas se pueden encontrar, por ejemplo, en la sangre de los pacientes que sufran de enfermedades autoinmunes. Por consiguiente, de acuerdo con la invención, los péptidos que se parezcan a los epítopos de células T restringidos de MHC Clase II presentes en el auto-antígeno blanco que comprendan al péptido de las SEQ ID NO: 1 ó la SEQ ID NO : 2 , son muy adecuados para utilizarse en una terapia para inducir tolerancia específica de células T a este autoantígeno en mamíferos, más específicamente seres humanos, que sufran de destrucción de cartílago mediada por células T, tal como, por ejemplo, artritis, más específicamente artritis reumatoide. Opcionalmente, este tratamiento se puede combinar con la administración de otros medicamentos, tales como DMARDs (Fármacos Anti -reumáticos Modificadores de la Enfermedad, por ejemplo sulfasalazina, anti-malaria (cloroquina, hidroxicloroquina) , oro inyectable u oral, metotrexato, D-penicilamina, azatrioprina, ciclosporina, micofenolato) , NSAIDs (fármacos anti-inflamatorios no esteroidales) , corticosteroides u otros fármacos que se sepa que tienen influencia sobre el transcurso de la enfermedad en pacientes auto- inmunes . Los péptidos de acuerdo con la invención también se pueden utilizar para modular linfocitos que sean reactivos a los antígenos diferentes de ese auto-antígeno, pero que estén presentes en el mismo tejido que el auto-antígeno, es decir, proteínas o partes de las mismas que comprendan al péptido de acuerdo con las SEQ ID NO. 1 ó SEQ ID NO : 2. Mediante la inducción de tolerancia de células T específicas del antígeno, se pueden tratar los desórdenes autoinmunes mediante supresión latente. Más en general, las células que se van a modular son células hematopoiéticas . En general, con el objeto de funcionar como un tolerógeno, el péptido debe satisfacer cuando menos dos condiciones, es decir, debe poseer una capacidad moduladora inmune, y debe expresarse de manera local, normalmente como parte de una proteína más grande . Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para tratar pacientes que sufran de enfermedades autoinmunes inflamatorias, mediante la administración de una preparación farmacéutica que comprenda al péptido de acuerdo con la invención. Estos pacientes pueden sufrir de enfermedades como enfermedad de gravis, artritis juvenil, glomerulonefritis primaria, osteoartritis, síndrome de Sjógren, miastenia gravis, artritis reumatoide, enfermedad de Addison, esclerosis biliar primaria, uveitis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, o diabetes. Los péptidos de conformidad con la presente invención, por consiguiente, se pueden utilizar en la preparación de un producto farmacéutico para inducir tolerancia en pacientes que sufran de estas enfermedades . El tratamiento de desórdenes autoinmunes con los péptidos de acuerdo con la invención hace uso del hecho de que la supresión latente es inducida para antígenos no relacionados, pero co-localizados . Las células reguladoras secretan, en un antígeno, proteínas pleiotrópicas de forma específica, tales como citocinas, que pueden reducir la respuesta inmune. De conformidad con la invención, los pacientes que sufran de destrucción mediada por células T del cartílago articular, se pueden tratar con una composición terapéutica que comprenda uno o más péptidos de acuerdo con la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención inducirá tolerancia inmunológica sistémica, en particular tolerancia de las células T auto-reactivas específicas de estos pacientes, a las proteínas auto-antigénicas en el cartílago articular bajo ataque, y otros auto-antígenos que exhiban los epítopos de células T de enlace de MHC Clase II identificados, caracterizados o imitados por las secuencias de aminoácidos de uno o más dé los péptidos de conformidad con la invención. Por consiguiente, la tolerancia inducida conducirá a una reducción de la respuesta inflamatoria local en el cartílago articular bajo ataque. Los péptidos muy adecuados que se van a utilizar en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención son los péptidos que comprenden al péptido YKL-39 (268-276), ó YKL-39 (266-278) flanqueado por secuencias hasta una longitud total de 55 aminoácidos. De una manera más preferible, los péptidos tienen una longitud de 25 aminoácidos. De una manera todavía más preferible, la secuencia de aminoácidos de los péptidos es FTLASAETT ó HSFTLASAETTVG. Los péptidos de conformidad con la invención tienen la ventaja de que tienen un efecto específico sobre las células T auto-reactivas, dejando de esta manera a los otros componentes del sistema inmune intactos, comparándose con el » efecto supresor no específico de los fármacos inmunosupresores. El tratamiento con los péptidos de acuerdo con la invención será seguro, y no se presentarán efectos secundarios tóxicos . La tolerancia inmunológica sistémica se puede obtener mediante la administración de dosis altas o bajas de los péptidos de acuerdo con la invención. La cantidad de péptido dependerá de la vía de administración, del tiempo de administración, de la edad del paciente, así como de las condiciones de salud general y de la dieta. En general, se puede utilizar una dosificación de 0.01 a 10,000 microgramos de péptido por kilogramo de peso corporal, de preferencia de 0.05 a 500 microgramos, más preferiblemente de 0.1 a 100 microgramos del péptido. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, por ejemplo, suero estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrina, ágar, pectina, aceite de cacahuate, aceite de olivo, aceite de ajonjolí, y agua. Otros vehículos pueden ser, por ejemplo moléculas NHC Clase II, si se desea ^^^F empotradas en liposomas. 5 En adición, la composición farmacéutica de conformidad con la invención puede comprender uno o más adyuvantes . Los adyuvantes adecuados incluyen, entre otros, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, anfigeno, tocofenoles, monofosfenil-lípido A, dipéptido de muramilo, y saponinas, tales como Quill A. De preferencia, los adyuvantes que se van a utilizar en la terapia de tolerancia de conformidad con la invención son adyuvantes de mucosa, tales como la subunidad B de toxina de cólera o carbómeros, que se fijan al epitelio mucoso. La cantidad de adyuvante depende de la naturaleza del adyuvante mismo. Además, la composición farmacéutica de conformidad con la invención pueden comprender uno o más estabilizantes, tales como, por ejemplo, carbohidratos, incluyendo sorbitol, manitol, almidón, dextrina de sacarosa, y glucosa, proteína, tales como albúmina o caseína, y reguladores como fosfatos alcalinos . Las vías de administración adecuadas son, por ejemplo, inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas, o inyecciones intrapéritoneales, administración oral y administración nasal, tal como rociados . Es otro objeto de la invención proporcionar un método para detectar las células T auto-reactivas involucradas en la descripción del cartílago articular, y estuches de prueba para utilizarse en este método. Por consiguiente, los péptidos de acuerdo con la invención también son muy adecuados para utilizarse en un método de diagnóstico para detectar la presencia de células T auto-reactivas activadas involucradas en la inflación crónica y en la destrucción del cartílago articular. El método de diagnóstico de conformidad con la invención comprende los siguientes pasos: a) aislamiento de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) , a partir de una muestra de sangre de un individuo, b) cultivo de estas PBMC bajo condiciones adecuadas, c) incubación de este cultivo de PBMC e la presencia de uno o más péptidos de acuerdo con la invención, y d) detección de una respuesta de células T, por ejemplo una respuesta proliferativa, indicando la presencia de células T auto-reactivas activadas en el individuo. La detección de una respuesta proliferativa de células T se puede hacer, por ejemplo, mediante la incorporación de 3H- timidina . También, dentro del alcance de la invención están los estuches de prueba que comprendan uno o más péptidos de acuerdo con la invención. - Estos estuches de prueba son adecuados para utilizarse en un método de diagnóstico de conformidad con la invención. Los siguientes ejemplos son ilustrativos para la invención, y de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Leyendas de las Figuras Figura 1 Figuras la, b, c. Reactividad cruzada de tres hibridomas diferentes específicos de HC gp-39 (8B12, 14G11, 20H5) con YKL-39 (266-278) (CVR0271B = HC gp-39 (263-275) , KV0432B = YKL-39 (266-278), CC0332B = Chi 8269-282), KV0431A = YKL-39 (262-274)). HCDA.8B12.1D8, 14G11.1H7 y 20H5.4F6.2F6 son hibridomas restringidos por HLA-DRB1*0401 específicos para HC gp-39 (263-275) . La activación de los hibridomas de células T se expresa como producción de IL-2. Figura 2. Tolerización en vivo con HC gp-39 (263-275) ó YKL-39 (266-278) Se tolerizaron Balb/c mediante aplicación intranasal de 50, 10, ó 2 microgramos de HC gp-39 (263-275) ó YKL-39 (266-278) seguido por inmunización con HC gp-39 (263-275). Los ratones se trataron previamente con suero, y los que se dejaron sin tratamiento fuero incluidos como controles.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Alineamiento de secuencias La proteína de condrocito humana, YKL-39 , comparte una identidad de secuencias significativa con HC gp-39 (YKL-40) . Otro homólogo de HC gp-39 es secretado por los macrófagos humanos, y se denomina quitotriosidasa (Boot y colaboradores, 1995) . Las secuencias correspondientes a RSFTLASSETGVG (HC gp-39 (263-275), SEQ ID NO : 3 ) fueron identificadas como HSFTLASAETTVG dentro de la proteína YKL-39 (266-278), y como RSFTLASSSDTRVG (SEQ ID NO : 4) dentro de la quitotriosidasa de macrófago (269-282), respectivamente (Tabla 1). Chi (269-282) contiene el motivo de enlace peptídico HLA-DRB1*0401 que se utilizó previamente para la selección de los epítopos de células T adentro de las proteínas. En contraste, el péptido YKL-39 (266-278) no contiene este motivo. Todos los péptidos se sintetizaron.

Tabla 1. Alineamiento de la secuencia de HC gp-39 (263-275) con la región correspondiente en YKL-39 y en quitotriosidasa de macrófago HCgp-39 263-275 R E T G V G YKL-39 266-278 H V G Chi (269-282! D R V Ejemplo 2. Enlace de los péptidos a HLA-DRB1*0401 Se probaron los péptidos del Ejemplo 1 para determinar su enlace con las moléculas modificadas por DRB1*0401. Las moléculas HLA-DR4 (DRB1*0401) se purificaron a partir de líneas celulares linfoblanstoides B humanas transformadas por EBV homozigóticas Hulyl38IC2, y se realizó el ensayo de enlace del péptido de competencia HLA-DR básicamente como es descrito por Verheijden y colaboradores, 1997. La afinidad de un péptido dado para enlazarse con las moléculas codificadas por DRB1*0401, estuvo relacionada con la competencia con un péptido marcador. Esta afinidad de enlace relativa se definió como la concentración del péptido en la que se reducía la señal al 50 por ciento (IC50) . El péptido HA-F es un control positivo (Hemaglutinina 307-319; PKFVKQNTLKLAT; en la posición 309 Y es sustituido por F; SEQ ID NO: 5) . Se sabe que el péptido tiene una alta afinidad para las moléculas de DRB1*0401. Como se esperaba, se encontró que el péptido Chi (269- 282) se enlazaba con una alta afinidad con DRB1*0401 (ver la Tabla 2) . El péptido YKL-39 (266-278) que no acomoda el motivo de enlace peptídico efectivo DRB1*0401, se enlazó con muy alta afinidad a DR4 (Bl*0401) .

Tabla 2. Enlace peptídico con moléculas modificadas por HLA-DRB1*0401 ND= no determinado Ejemplo 3. Estímulo de hibridomas de células T Se probaron hibridomas específicos para HC gp-39 (263- 275) , para determinar el reconocimiento de las secuencias correspondientes . Para probar la reactividad cruzada de las 3 diferentes líneas celulares de hibridoma específicas de HC gp-39 con el péptido YKL-39 o de quitotriosidasa, 5 x 104 células de hibridoma, y 2 x 105 células B transformadas por EBV y radiadas (12,000 RAD) que llevaban la especificidad de DRB1*0401, se incubaron en volúmenes de 150 microlitros en pozos de una placa de microtitulación de fondo redondo. Se agregó antígeno del péptido (HC gp-39 (263-275) , YKL-39 (266-278) , quitotriosidasa (269-282) , o un péptido de control) en volúmenes de 50 microlitros a pozos duplicados. Cuarenta y ocho horas después, se ensayaron 100 microlitros del sobrenadante del cultivo para determinar la producción de IL-2 utilizando un ELISA de emparedado con anticuerpos Pharmingen específicos para IL-2 de ratón. Se encontró que el péptido sintético YKL-39 (266-278) generó una respuesta similar a HC gp 39 (263-275) , mientras Chi (269-282) no generó ninguna respuesta. Los datos sugieren que las tres diferentes TCRs utilizadas por tres hibridomas diferentes no discriminan entre HC gp-39 (263-275) ó YKL-39 (268-278) al ser presentadas por moléculas codificadas por DRB1*0401 (Figuras la, b, c) , pero sí discriminan entre HC gp-39 (263-275) y Chi (269-282) . Los datos indican que YKL-39 (266-278) es un epítopo de imitación de HC gp-39 (263-275) . (Figuras la, b, c) .

Ejemplo 4. Reconocimiento de YKL-39 (266-278) por parte de las PBMC Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre periférica heparinizada mediante centrifugación estándar sobre Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . Las células se suspendieron en pozos de una placa de 24 pozos en una concentración de 5 x 105 células por mililitro. Las células se incubaron en un medio solamente, o en la presencia de 10 ó 50 microgramos/mililitro de antígeno de péptido (YKL-39 (266-278)). Los cultivos se incubaron durante 6 días a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5 por ciento. Luego las células se suspendieron, y se distribuyeron volúmenes de 100 ó 150 microlitros del medio por cuadruplicado en pozos de una placa de fondo redondo de 96 pozos. Luego se impulsaron las células con 0.5 µCi (1.85 x 104 Bq) [3H] timidina (3H]TdR), y 18 horas después, se midió la radioactividad incorporada. Los resultados como se muestran en la Tabla 3 se expresan como índices de estímulo (SI) (conteos específicos del antígeno/conteos del fondo) . A partir de la Tabla 3a, se puede concluir que el epítopo YKL-39 (266-278) 'es fácilmente reconocido en los pacientes de artritis reumatoide. La Tabla 3b indica que el reconocimiento de YKL-39 (266-278) por parte de las PBMC, coincide con el reconocimiento de HC gp-39 (263-275), y de HC gp-39, y además que el reconocimiento de YKL-39 (266-278) es en general más pronunciado que el reconocimiento de HC gp-39 (263-275) . Tabla 3a. Reconocimiento del epítopo YKL-39 (266-278) por parte de las PBMC a partir de pacientes de artritis reumatoide .

Donador tipo SI SI 10 µg/ml 50 µg/ml 242-0.2 NR 0404/15 3 <2 337-0.2 R 0401/02 19 58 338-0.1 NR 03/14 <2 <2 454-0 R 0401/ 9 9 456-0 R ND 15 4 457-0 NR ND <2 <2 458-0 R ND 4 27 459-0 R ND <2 25 460-0 NR ND 3 <2 SI = conteos específicos del ant ígeno /onteos del fondo . SI > 5 se consideran posi tivos , R = respondente, NR = no respondente .

Tabla 3b. El reconocimiento de YKL-39 (266-278) coincide con el reconocimiento de HC gp-39 (263-275) y de la proteína HC gp-39. Donador R/N YKL-39 (266-278) HC gp-39 (263-275) HC gp-39 SI SI SI SI SI SI µg/ml 10 50 10 50 10 50 169 R 27 32 10 27 24 44 455 R 20 35 1 15 45 95 447 NR 1 2 1 1 1 1 327 R 6 5 3 '5 12 19 SI = conteos específicos del antígeno/conteos del fondo. SI > 5 se consideran positivos. R = respondente, NR = no respondente. NT = no probado. El donador 447 responde al toxoide de tétanos y a Candida Albicans .

Ejemplo 5. Inducción de tolerancia Se desarrolló un ensayo de DTH específico de HC gp-39 (263-275) , adecuado para monitorear la inducción de tolerancia con antígenos de péptido. Se encontró que la inmunización de ratones Balb/c con HC gp-39 (263-275) en adyuvante de Freund incompleto (IFA) es efectiva en la inducción de una respuesta de DTH enseguida del estímulo con el péptido HC gp-39 (263-275) . Este sistema de DTH basado en péptido se utilizó para detectar la modulación de la respuesta de DTH mediante aplicación nasal del péptido HC gp-39 (263-275) . Se encontró que la aplicación nasal de HC gp-39 (263-275), de una manera dependiente * de 'la dosis, reducía la respuesta de DTH inducida por HC gp-39 (263-275) . Sin embargo, la aplicación nasal de YKL 39 (266-278) dio como resultado una reducción mucho mejor de la respuesta de DTH,-indicando que YKL-39 (266-278) puede tolerizar eficientemente una respuesta específica del péptido- inducida con HC gp-39 (263-275) (Tabla 4, Figuras 2a, b, c) .

Tabla 4. Experimento de tolerización de establecimiento experimental .

Tratamiento sensibilización estímulo tolerancia previo Ninguno HC gp-39 (263-275) HC gp-39 (263-275) no Suero HC gp-39 (263-275) HC gp-39 (263-275) no HCgp-39 (263-275)HC gp-39 (263-275) HC gp-39 (263-275) sí YKL-39 (266-278) HC GP-39 (263-275) HC gp-39 (263-275) sí LISTADO DE SECUENCIAS <110> Akzo Nobel N.V. <120> Péptidos novedosos para utilizarse en inmunoterapia de enfermedades autoinmunes <130> <140> » <141> <150> 98202470.5 <151> 1998-07-23 <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Thr Leu Ala Ser Ala Glu Thr Thr 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ala Glu Thr Thr Val Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Pro Lys Phe Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de 9 a 55 residuos de aminoácidos, el cual comprende la secuencia de aminoácidos FTLASAETT (SEQ ID N0:1).

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende la secuencia de aminoácidos HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO: 2) .

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que tiene una secuencia de aminoácidos de hasta 25 residuos de aminoácidos.

4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que tiene la secuencia de aminoácidos FTLASAETT (SEQ ID NO: 1) ó HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO: 2) .

5. Péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para utilizarse como una sustancia terapéutica .

6. Una composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. El uso de uno o más de los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para la fabricación de una preparación farmacéutica para la inducción de tolerancia específica de células T a un autoantígeno en pacientes que sufran de desórdenes autoinmunes, más específicamente artritis .

8. Una composición de diagnóstico que comprende uno o más de los péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un agente de detección.