MXPA01000436A - Metodo para identificar mutantes y moleculas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para reproducir ratones mutagenizados, que permite la detección de sitios genéticos que pueden modificar un fenotipo indizado conocido, que involucra cruzar una cepa fundadora mutagenizada y un segunda cepa del ratón que lleva un alelo en un sitio que confiere el fenotipo indizado. En la generación de prueba, los grupos de individuos son observados para identificar los que se aparten del fenotipo típico. El material genético y las moléculas codificadas por el mismo pueden ser obtenidos utilizando los métodos disponibles. También se describen métodos compactos y mejorados.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR MOTANTES Y MOLÉCULAS Antecedentes de la Invención Están en progreso esfuerzos mundiales para determinar las secuencias del ADN genómico de los seres humanos y otros animales. Tales esfuerzos se enfocan tipicamente a la obtención de la información de la secuencia de los ADNcs en las bibliotecas creadas a partir de los ARNs de varios tejidos. Por consiguiente, las colecciones de las "etiquetas de la secuencia expresada" (ESTs) que incluyen las porciones de las regiones de codificación de la mayoría de los genes humanos. Aunque estas ESTs proporcionan una información estructural útil, las mismas ofrecen un discernimiento pequeño de la relación funcional entre los genes. La relación funcional es de importancia particular para determinar el conjunto de los genes involucrados en un proceso biológico y, subsiguientemente, desarrollar agentes farmacéuticos que afectan uno o más de los componentes del proceso biológico. Véase, por ejemplo, Friedrich, G. A., "Moving Beyond the Genome Projects: Does the Future of Genomics-Based Drug Discovery Lie With the Mouse?," Nature Technology 14:1234-1237 (1996). Ref.126384 Friedrich arguye en favor de utilizar sistemas de modelos que se asemejen a la fisiología humana en la determinación de cuales genes pueden estar involucrados en un proceso biológico, y sugiere que el ratón es un organismo modelo excelente para la biología humana en que el mismo comparte con los seres humanos los aspectos más sobresalientes de la fisiología de los mamíferos. Los genomas de los ratones y de los seres humanos son aproximadamente del mismo tamaño, organización, y estructura. Friedrich propone que el ratón puede ser desarrollado como una herramienta efectiva para el desarrollo de los fármacos. Friedrich emplea una sugerencia "radical" de que no existe barrera lógica que impida las selecciones fenotipicas a gran escala utilizando ratones. Friedrich propone la utilización de un mutágeno insercional en las células del vastago embriónico para generar mutaciones al azar en el genoma del ratón, luego seleccionar una variedad de fenotipos predeterminados y clonar los genes afectados. En particular, la fisiología de, y el tratamiento para, el cáncer del colon son de interés biomédico particular. El cáncer del colon es una de las malignidades mas prevalecientes en el mundo oriental, con un estimado de 145,000 nuevos casos y 60,000 muertes cada año solo en los Estados Unidos de América. Los factores genéticos desempeñan un papel clave en esta enfermedad. Las mutaciones en el gen de coli de poliposis adenomatosa (APC) humano provoca un conjunto de síndromes del cáncer del colon familiares. Los ratones que llevan una mutación en un gen correspondiente (Apc) también desarrollan muchos adenomas intestinales. Los heterozigotos para el alelo Min (Neoplasia Intestinal Múltiple) del gen Apc del ratón desarrollan numerosos adenomas intestinales y colónicos [en promedio de 29 Á 10, sobre un fondo C57BL/6J (o un derivado equivalente] que son similares en morfología con los adenomas observados en los síndromes de poliposis colónica heredada humana tales como la poliposis adenomatosa familiar y el síndrome de Gardner. Los homozigotos Min/Min murieron en el útero. La mutación Min se mapea o se asigna como coordenada al cromosoma 18 del ratón. La secuencia del gen Apc es conocida y está publicada. Los ratones Min llevan una mutación antisentido en el exon 15 del gen Apc del ratón (una mutación de la clase observada tipicamente en los parentescos o linajes del cáncer del colon humano) . Los ratones que llevan Min proporcionan asi un sistema modelo para el estudio de la poliposis adenomatosa familiar humana. Un sitio (Mom-1) que modifica fuertemente el número de tumores en los ratones heterozigotos Min/+ fue mapeado o asignado con coordenadas con respecto al cromosoma 4 distante. Dietrich, . F., y colaboradores, "Genetic Identification of Mom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia en the mouse", Cell 75:631-639 (1993). Mom-1 radica en una región de conservación de sintenia con el cromosoma humano lp35-36, una región de pérdida somática frecuente de heterozigosidad en una variedad de tumores humanos, incluyendo los tumores del colon. Mom-1 es solamente uno de un número desconocido de sitios que modifican la expresión de un síndrome del cáncer heredado, y el mismo no explica la totalidad de las variaciones genéticas en el número de tumores en los cruces intraespecificos . Lo que está faltando es un método sistemático para fijar con precisión los sitios genéticos involucrados en la modificación de los fenotipos conocidos, por mejoramiento o supresión. En el caso particular del cáncer del colon en los seres humanos y los animales, podria ser deseable localizar las secuencias en el genoma (y las moléculas codificadas por estas secuencias) que están involucradas en la aparición de los adenomas intestinales. La falta de tal método sistemático tiene un entendimiento limitado de la oncogénesis y, como tal, ha evitado el desarrollo de substancias farmacéuticas que modifican el proceso oncogénico. Un método sistemático debe incluir no solamente los sitios no esenciales, para los cuales numerosos alelos mutantes pueden ser encontrados entre las cepas de ratón endogámicas homozigóticas, sino también los sitios esenciales, para los cuales los alelos mutantes en la forma heterozigótica pueden tener influencia en el fenotipo. Las mutaciones que inactivan un gen esencial normalmente serán letales cuando son homozigóticas, y asi no serán encontradas entre las cepas de ratones endogámicas .

Breve Descripción de la Invención La presente invención permite la detección de un sitio o lugar genético que puede modificar un fenotipo conocido elegido, conferido por un alelo dominante elegido. El método incluye un proceso mutagénico que facilita la identificación y el aislamiento de las secuencias genéticas que codifican las moléculas que pueden modificar el fenotipo elegido, asi como las propias moléculas modificadoras del fenotipo. El método puede ser practicado utilizando cepas endogámicas de animales no humanos, las cuales son preferentemente de mamíferos, y más preferentemente de roedores. Las cepas endogámicas de ratones, ratas y conejos están disponibles. En el presente método, los ratones son los animales mamíferos no humanos de elección, a causa de la sintenia entre los seres humanos y los ratones y a causa de que las características genéticas y la reproducción de los ratones están altamente desarrolladas. Además, el ratón puede exhibir fenotipos de enfermedad que son muy similares a aquellos de los seres humanos, como en la modalidad ejemplificada. Las secuencias genéticas del murino y las moléculas obtenidas en el método son utilizadas para asegurar las secuencias y moléculas correspondientes de los seres humanos. Las secuencias y moléculas humanas son empleadas entonces en los métodos conocidos para desarrollar agentes farmacéuticos. El método de reproducción básico incluye los siguientes pasos. Cada uno de un conjunto de ratones de una cepa de ratón endogámica fundadora es mutagenizada y luego reproducida con respecto a la misma cepa endogámica para producir una generación de retención endogámica ("Generación 1" o "Geni") . Los animales de la cepa de ratón fundadora Geni llevan mutaciones puntuales al azar con relación a los ratones del tipo silvestre de esta cepa. Los ratones Geni son cruzados con un ratón de una cepa de ratón endogámica indizada para obtener la progenie GenlFi. La cepa del ratón endogámica de Índice o indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere un fenotipo elegido. El fenotipo elegido es designado el "fenotipo de Índice". El fenotipo de Índice, el cual se & enfoca al método de selección sobre el fenotipo de interés, está caracterizado en una cepa de Índice y proporciona un fenotipo de referencia contra el cual se pueden comparar los mutantes posibles. El alelo de Índice dominante puede incluir cualquier condición que lleva un proceso biológico en un intervalo en el cual el mismo responde a mutaciones supresoras o mejoradoras heterozigóticas de la clase identificada en la presente invención. La condición puede ser una condición genética reconocible o aún puede ser una condición ambiental no genética. Al menos algo de la progenie del Geni Fi lleva tanto el alelo dominante como al menos una mutación al azar que puede modificar el fenotipo indizado conferido por el alelo dominante. Un animal fundador se juzga que va a ser de interés si un subconjunto de su progenie de GenlFj. es modificado extensamente por el fenotipo de índice o indizado. Cuando un ratón fundador tiene al menos un descendencia GenlFi que exhibe un fenotipo modificado con relación a los animales de control, el animal fundador (Geni) es cruzado con un ratón no mutagenizado de la cepa fundadora para producir una descendencia de la segunda generación (Gen2) . Estas descendencias son cruzadas nuevamente con la cepa de índice o indizada para obtener la progenie Gen2F?. La presencia de una mutación que modifica el fenotipo es verificada entonces si un subconjunto de la -,_ ~&k > ® » ? ^ progenie Gen2F? también es modificado por el fenotipo indizado. Nuevamente, un grupo de animales con los fenotipos indizados modificados proporciona una confianza creciente de que el fundador de Geni lleva una mutación de interés. El material genético que comprende la mutación modificadora del fenotipo puede ser obtenido entonces utilizando los métodos conocidos en la técnica. Las moléculas codificadas por el material genético también pueden ser obtenidas. Los materiales y moléculas genéticas obtenidos (o los equivalentes humanos correspondientes) son utilizados en los métodos conocidos en la técnica para producir agentes farmacéuticos que pueden mejorar los fenotipos señalados en los pacientes humanos o no humanos afectados en el proceso biológico de interés. Es un objeto de la presente invención proporcionar una perspectiva enfocada, rápida, para obtener genes en un organismo mamífero modelo que pueden afectar un fenotipo relevante biomédicamente. Es una ventaja de la presente invención que el método pueda estimular simultáneamente un montaje de varios genes que pueden modificar el fenotipo indicado. Es otra ventaja de la presente invención que el método pueda descubrir genes que tienen otro fenotipo no conocido .

La presente invención ofrece ventajas sobre los métodos existentes de obtención de los genes, tales como el análisis de los ESTs, en que los genes asegurados en el presente método son necesariamente relevantes para un fenotipo biológico. En contraste, los métodos del secuenciamiento del genoma pueden proporcionar una información de secuencias voluminosa para muchos genes, pero ofrecen una guia pequeña o ninguna guía con respecto a la relación funcional entre los genes secuenciados.

Breve Descripción de las Diversas Vistas de los Dibujos La Figura 1 muestra la probabilidad de supervivencia de los ratones GenlFi reproducidos de acuerdo con el método de la presente invención. La Figura 1 también muestra los tiempos de supervivencia de los individuos de cuatro linajes que exhibieron una progenie con tiempos de supervivencia más breves o más prolongados con relación al tiempo de supervivencia promedio de los ratones de GenlFi que llevan el alelo Min de índice o indizado. Los linajes candidatos 248 y 258 supresores (Su) de supervivencia más prolongada son mostrados como cuadrados. Los linajes candidatos 333 y 425 mejoradores (En) de supervivencia más breve son mostrados como círculos.

Descripción Detallada de la Invención Una meta de la presente invención es identificar los sitios genéticos y las secuencias genéticas que pueden modificar un fenotipo conocido. Aunque tal análisis que emplea la mutagénesis no puede ser efectuado en los seres humanos por razones éticas, la conservación de la secuencia y la sintenia entre los genomas humanos y del ratón proporciona un puente fácil para identificar tales sitios y secuencias en el ser humano. Es probable que tales secuencias se correlacionarán con la información de la secuencia genética humana existente. Por consiguiente, las secuencias genéticas y los sitios equivalentes pueden ser buscados en el genoma humano utilizando las técnicas de PCR e hibridación disponibles, convencionales. El método es un método de identificación de la Molécula y del sitio Modificador, mejorado para el Grupo, dirigido al índice, que puede ser referido como un "método ICMM". La disponibilidad de los ratones endogámicos que tienen una composición genética bien definida y fenotipos bien estudiados que modelan los síndromes, enfermedades, y otras condiciones humanas, hace al ratón la especie de mamífero preferida en la cual practicar el presente método. Una especie de ratón preferida es Mus musculus.

El sistema de reproducción descrito aquí es una suposición anticipada de la existencia de un fenotipo que es evidente en los ratones heterozigóticos para el alelo que confiere el fenotipo indizado elegido. Siempre es preferible emplear una cepa indizada que lleve un alelo que provea al fenotipo indizado en el estado heterozigótico. El fenotipo indizado se puede hacer "evidente" por medios visuales, bioquímicos, u otros medios de detección. El alelo que controla el fenotipo puede ser letal cuando está presente en el estado homozigótico. Para el cáncer, el fenotipo puede relacionar cualquiera de los efectos que siguen a la presencia de un alelo inductor del cáncer activado o también de la inactivación de un gen supresor de los tumores que provoca la formación del tumor en la ausencia de una copia normal del gen. El fenotipo puede ser gobernado por un alelo sobre un cromosoma del sexo o sobre un autosoma. Si el alelo está sobre un cromosoma del sexo, las crianzas o reproducciones descritas aquí son modificadas de una manera conocida en la técnica para asegurar que el alelo sea mantenido en el grupo de reproducción. El fenotipo de índice es conferido preferentemente por un solo alelo dominante, aunque teniendo cuidado de producir los animales fundadores adecuados, el fenotipo bajo el control de más de un sitio puede ser estudiado en el método. No es necesario que el alelo que confiere el fenotipo sea de una secuencia genética definida sino que en lugar de esto el alelo pueda ser definido por los métodos genéticos clásicos. Es ventajoso que el alelo esté enlazado estrechamente con un marcador genético para un análisis del genotipo, como se describe en cualquier parte aquí. Con el mapa de microsatélites denso del genoma del ratón disponible comúnmente, esta condición es siempre satisfecha. Los sitios modificadores del fenotipo son obtenidos en la presente invención. Una "modificación" es cualquier cambio demostrable en un fenotipo de índice con relación a los animales de control que carecen del alelo modificador del fenotipo, incluyendo, sin limitación, la mejora o supresión de un fenotipo, tal como la extensión o acortamiento del comportamiento circadiano o de extensión de la vida del animal. No es necesario que el animal completo sea afectado por la modificación. Por ejemplo, un fenotipo modificado puede ser un cambio en un comportamiento particular o un cambio en el nivel de una biomolécula particular, tal como una proteína de la sangre, después de introducir un alelo mutante para la modificación del fenotipo en el método de la presente invención. El ensayo para valores atípicos modificados en la primera etapa de la selección, GenlFi, será usualmente relativamente imperfecto. El lector debe juzgar si un valor atipico está en el intervalo de los primeros o los últimos 10 percentiles de la distribución fenotipica. Por ejemplo, en una cepa de ratones que tienen una actividad de corrida bien definida gobernada por una sola mutación dominante (Clock) , el método descrito aquí puede ser utilizado para obtener animales que tienen una temporización modificada de esta actividad de corrida o funcionamiento. El material genético (y las moléculas de proteína) responsables de esta modificación, puede ser obtenido por mapeo o asignación de coordenadas y clonar posicionalmente la mutación de la modificación. El sistema es particularmente adecuado para el estudio de las interacciones genéticas en los cánceres que se sabe que tienen un componente genético. En particular, los seres humanos que llevan un gen APC aberrante están predispuestas para desarrollar numerosos tumores en el tracto intestinal. Los ratones heterozigóticos para el alelo Min de Apc, el homólogo del murino del APC humano, también desarrollan numerosos tumores en el tracto intestinal, similar a los síndromes de poliposis colónica heredados, humanos. Se demostró aquí que las mutaciones inducidas en el genoma en cualquier parte en que el sitio Apc, pueden modificar la velocidad de supervivencia y la carga de tumores intestinales de los ratones que llevan el alelo Min en este sitio. Varias consideraciones de reproducción importantes dirigen la selección de las cepas del ratón endogámico para su uso en el método. Se sobreentiende que aquellos expertos en la técnica de la reproducción de los ratones están familiarizados con los requerimientos de reproducción de las cepas del ratón disponibles y tales requerimientos no necesitan ser restablecidos aquí. La cepa en la cual son introducidas las mutaciones al azar debe ser una cepa endogámica de modo que todas las modificaciones sean el resultado de la mutagénesis inducida en lugar de la divergencia genómica. La cepa debe ser susceptible a una mutagénesis de la línea germinal eficiente. La cepa debe ser susceptible de una mutagénesis eficiente de la línea germinal. Por "susceptible" los solicitantes proponen que la cepa tenga velocidades de mutación hacia adelante características de al menos 1/500 por gameto por sitio. Además, la cepa debe tener una extensión de la reproducción prolongada de al menos un año. También, se prefiere que la cepa produzca carnadas grandes, en promedio de 8 o más crías por carnada. Una cepa que satisface estos requerimientos es la cepa endogámica BTBR, la cual está disponible del Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine. -->« - 0-»-»¿aáTWa«^M < >?^ >?»>~--J-.>..- .»#*.&$& Es importante que la cepa endogámica en la cual las mutaciones son inducidas puede ser distinguida de la cepa que contiene el alelo que confiere el fenotipo, por ejemplo, por el polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) o por polimorfismos de la longitud de la secuencia simple (SSLP) . Una incidencia elevada de las diferencias informativas en los marcadores genéticos estándares entre las dos cepas es importante para mapear y clonar cualquier mutación de interés. En una modalidad de la invención, el fenotipo indizado (Min) fue provisto sobre un fondo de C57BL/6J (o derivado equivalente) (aquí posteriormente, "B6-Min") . Un "derivado equivalente" tiene un fenotipo indizado comparable con aquel de B6-Min sobre un fondo de C57BL/6J genuino. La cepa BTBR utilizada para la mutagénesis en esta modalidad es polimórfica en aproximadamente la mitad de los sitios marcadores de SSLP, con relación a la cepa endogámica B6. En la forma heterozigótica, el BTBR no tiene un efecto fuerte sobre el fenotipo Min. También es importante que las dos cepas utilizadas en el método estén relativamente libres de los modificadores dominantes polimórficos del fenotipo indizado elegido. Por "relativamente libre" los solicitantes proponen que las diferencias en el fenotipo indizado entre los animales de GenlFi y la cepa indizada sean suficientemente menores para que no enmascaren los efectos de las mutaciones inducidas recientemente. Un experto en la técnica será capaz de determinar la variación permisible para cualquier fenotipo indizado dado. Por ejemplo, en el caso del fenotipo indizado Min, los animales GenlFi deben mostrar no más de aproximadamente un cambio de 1.5 veces en la multiplicidad de los tumores comparado con B6-Min. En el caso de Clock, no debe existir un desplazamiento de más de 30 minutos en el ritmo circadiano. En el método, la cepa que va a ser mutagenizada es tratada con un agente mutagénico que induce mutaciones en la línea germinal. Es importante, por las razones asociadas con la detección y aislamiento subsiguiente de los mutantes de interés, que el mutágeno sea un mutágeno puntual eficiente que puede inducir al menos una mutación por sitio por 500 gametos en la cepa del animal fundador. La etilnitrourea (ENU) es un mutágeno adecuado y preferido el cual introduce mutaciones puntuales casi exclusivamente en la línea germinal del ratón. Un protocolo adecuado para la mutagénesis de ENU de los ratones se describe en Shedlovsky y colaboradores, Genet. Res., Camb. 47:135-142 (1986), incorporada aqui para referencia. Se prefiere, pero no es esencial, que la mutagénesis sea efectuada sobre los ratones machos, puesto que es posible obtener muchas progenies de un solo macho mutagenizado. Los ratones son cruzados entonces con los ratones no mutagenizados de la misma cepa para producir animales isogénicos, heterozigóticos, solo para las diversas mutaciones inducidas por la mutagénesis. Cada elemento del conjunto de los animales de Geni es cruzado con los ratones heterozigóticos para la mutación que confiere el fenotipo indizado. Es deseable producir hasta 1000 de tales animales de Geni, para maximizar la probabilidad estadística de que cada uno de los aproximadamente lxlO5 genes en el genoma del ratón sea examinado al menos una vez. Si la frecuencia de la mutación es de 1 por sitio por 500 gametos, una biblioteca de 1000 elementos de los animales de Geni podria contener un promedio de 2 aciertos para cada sitio que puede modificar el fenotipo indizado. La probabilidad de que un sitio saliente pudiera escapar a la atención seria entonces de e~2 o él0%. El cruce se puede hacer utilizando los animales de Geni de cualquier género o sexo, a menos que el fenotipo indizado comprometa la reproducción exitosa de un género o sexo. Algunas veces es posible fomentar la progenie cuando el origen hembra está comprometido. Los linajes o parentescos son evaluados como sigue. Los comportamientos fenotípicos del conjunto total de los animales de GenlFi son evaluados como lo son los fenotipos de los linajes o parentescos individuales. En donde ninguna modificación está presente, el comportamiento de los individuos en el linaje o parentesco podría variar sobre el comportamiento promedio del conjunto total. Sin embargo, si una mutación modificadora ha sido inducida, y puesto que el padre fundador fue heterozigótico para la modificación de la mutación, en promedio 50% de los miembros del linaje mostrarán un fenotipo fronterizo. Para mejorar la probabilidad estadística de que un fenotipo modificado sea genuino, se prefiere que la modificación sea observada en dos o más animales de un linaje que tiene cuatro o más miembros. Una condensación adicional del método es posible bajo estas condiciones. Véase, infra. Es más preferido que el linaje o parentesco tenga al menos seis miembros y que tres o más miembros sean afectados. Sin embargo, puede ser provechoso estudiar linajes o parentescos más pequeños que contienen un solo valor atipico extremo. Los padres hembras de los linajes que muestran evidencia de una modificación posible por el estándar señalado anteriormente, son cruzados entonces con los ratones no mutagenizados de la misma cepa fundadora para mantener la mutación sobre un fondo fijo ("una generación de copiado") . La descendencia de la generación de copiado es cruzada nuevamente con los ratones heterozigóticos para el fenotipo elegido, para evaluar si cualquiera de su descendencia lleva una mutación modificadora auténtica. Un análisis genotípico puede ser efectuado para determinar cual de estas descendencias lleva el gen que confiere el fenotipo indizado. Puede ser particularmente importante caracterizar la descendencia rápidamente si el fenotipo es uno que afecta la extensión de vida de los animales fundadores de la Geni . Los ratones que demostraron por análisis genotípico que llevan la determinante indizada son evaluados tan tempranamente como sea posible para determinar si es evidente cualquier modificación. Si tal fenotipo modificado es observado, las secuencias genéticas especificas responsables de la modificación pueden ser identificadas sistemáticamente utilizando la tecnología ahora disponible para el arte. Véase, por ejemplo, Zhang, Y. y colaboradores, "Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue", Nature 372:425-432 (1994): Kusumi, K. y colaboradores, "The mouse pudgy mutation disrupts Delta homologue D113 and initiation of early somite boundaries", Nature Genetics, 19:274 (1998); y King, D. P., y colaboradores, "Positional Cloning in the Mouse Circadian Clock Gene, Cell 89:641 (1997), todas incorporadas aqui para referencia en su totalidad. Cada una da un ejemplo concreto de la clonación posicional guiada por la mutación. En este último ejemplo, las mutaciones ^^^^^^^^^^^Sá^^^ . z,-Á¿- 'íí^¿.izz:Íy.^ytz fueron inducidas con ENU. En este enfoque, las secuencias que codifican el murino son identificadas sobre un elemento contiguo (contig) (una secuencia nucleica contigua de una porción de un cromosoma determinada por el análisis de un conjunto de las secuencias del ácido nucleico componentes superpuestas) construido en la región de los marcadores enlazados a una mutación. Las secuencias de codificación del murino fueron identificadas por el atrapamiento del exon (Church, D. M., y colaboradores, Nature Genet. 6:98-105 (1994), incorporada aquí para referencia), el secuenciamiento de los exones atrapados, la comparación de las secuencias de los exones atrapados para todas las secuencias en GenBank, la selección de los exones supuestos para la presencia del ARN correspondiente en una variedad de tejidos por los manchados de northern y la PCR de transcripción inversa. Luego, por los métodos conocidos de hibridación para el material genético humano, se obtuvo el gen humano correspondiente. Alternativamente, los cebadores de PCR preparados a partir de las secuencias genéticas del murino pueden ser utilizados para amplificar las secuencias humanas correspondientes del material genético humano. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la similaridad requerida entre los cebadores derivados del murino y las secuencias de blanco u objetivo, humanas, en los métodos de PCR.

Aunque el método descrito anteriormente es efectivo para encontrar los mutaciones de segregación que modifican un fenotipo indizado, el método es mejorado proporcionando un primer método mejorado que identifica más rápidamente los modificadores que tienen un heterozigoto severo y pronunciado que mejora o suprime el impacto sobre un fenotipo indizado, o proporcionando un segundo método mejorado que facilita la identificación y el mapeo de los modificadores por la reducción del ruido del fondo genético. Los métodos mejorados son descritos posteriormente . También se señaló que los gametos machos pueden ser colectados ahora ventajosamente en la madurez sexual (aproximadamente 6 semanas para los ratones) y preservados indefinidamente o utilizados en un método de fertilización in vitro, por ejemplo, de acuerdo con el método publicado de Sztein, J. M., J.S. Farly J.S., A.F. Young y L.E. Mobraaten, "Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing", Cryobiology 35 (l):46-52 (1998), incorporada aquí para referencia en su totalidad. Utilizando el método de la criopreservación, el plasma del germen se encontró que comprende una mutación modificadora que puede ser rescatada y utilizada en cualquier cruzamiento descrito aquí, aún si el animal fuente está, con respecto al tiempo, demasiado anciano o demasiado enfermo para reproducirse. Cada macho produce suficiente esperma para producir al menos 500 progenies. En cada cruzamiento descrito, también se prefiere que los animales (o, más ampliamente, los gametos), que contribuyen potencialmente a un modificador en el cruzamiento sean animales (o gametos) machos, a menos que un efecto maternal esté involucrado en el fenotipo indizado, a causa de que muchos gametos más pueden ser seleccionados utilizando machos en lugar de hembras. Dependiendo de las cepas utilizadas, se puede requerir una atribución adoptiva. El primer método mejorado, el cual es más compacto y más eficiente que el método previo, requiere un números más pequeño de pasos de cruzamiento, elimina una generación de retención, y puede ser útil en donde el fenotipo indizado modificado acelera la muerte o reduce la capacidad de reproducción. Este método mejorado sacrifica algo de la fuerza o resistencia de la sección del modificador dominante de la 2/a. generación en que el mismo no presenta un candidato sobre la base de un grupo de valores atípleos sobre la curva de supervivencia y en que el mismo pierde la isogenicidad estricta después de la primera generación. Sin embargo, el mismo apunta eficientemente a los modificadores en los genes vitales cuya clonación puede ser buscada como se describió. En este método mejorado, se pueden detectar nuevos alelos modificadores, tanto para los valores atípicos mejoradores como supresores, extremos, en la generación Fi, o en lugar de esto puede utilizar el principio de agrupación del método básico para confirmar valores atípicos de Fi sutiles por la selección de los grupos de animales modificados más sutilmente en la generación de cruzamiento (N2) . Un fenotipo fronterizo "extremo" puede ser definido sobre una base de caso por caso, dependiendo de la naturaleza del fenotipo indizado. Un ejemplo no limitativo podría ser un fenotipo mejorado o suprimido a un nivel abajo del décimo percentil o arriba del nonagésimo percentil, respectivamente. En otro caso, por ejemplo, los niveles "extremos" podrían ser establecidos en los percentiles segundo y nonagésimo octavo. Un cambio "sutil" es un cambio que está dentro del ruido estadístico en los animales Fi, pero primero llega a ser significativo estadísticamente en la generación de cruzamiento o el cruzamiento subsiguiente. En el primer método mejorado, un animal endogámico mutagenizado de una cepa apropiada es apareado directamente con un animal de la cepa indizada para producir la progenie de Fi que fue seleccionada para el fenotipo indizado modificado. Si un animal de Fi parece que lleva una mutación modificadora, el mismo es cruzado con respecto a la cepa indizada (con o sin el alelo indizado) para dar la progenie de N2. En esta generación, los animales múltiples son seleccionados para encontrar grupos de la progenie con un fenotipo modificado. Los grupos de los animales que exhiben el fenotipo modificado llevan la mutación modificadora, mientras que aquellos que no exhiben la modificación fallan en llevar la mutación. Los portadores deben ser heterozigóticos para los alelos enlazados genéticamente al sitio, mientras que los no portadores deben ser homozigóticos para la cepa indizada en el mismo sitio. Por consiguiente, estos animales proporcionan el material para mapear o asignar coordenadas a la nueva mutación utilizando métodos de mapeo a base de PCR bien conocidos (SSLPs y SNPs) . Los polimorfismos de nucleótidos únicos son descritos en Kruglyak, L. "The Use of a Genetic Map of Biallelic Markers in Linkage Studies", Nature Genetics 17:21 (1997), incorporada aquí para referencia en su totalidad. El segundo método mejorado facilita la identificación y el mapeo de las mutaciones modificadoras reduciendo el ruido del fondo genético. El método es un método de selección del modificador isogénico en el cual los animales que contribuyen al alelo dominante y los animales endogámicos fundadores que llevan las mutaciones puntuales al azar comparten un fondo genético endogámico. & j ^^¿A^"*fete-»s-1 Aparte del alelo indizado dominante, los animales indizados están correspondidos estrechamente con los animales endogámicos fundadores que llevan la mutación. Dos modalidades de este segundo método mejorado son contemplados. En la primera modalidad, los modificadores mejoradores y supresores ambos pueden ser detectados cuando el fondo genético compartido por los animales indizados y los animales fundadores no tiene ningún efecto aparente sobre el fenotipo indizado. En un ejemplo de esta modalidad, una cepa de ratón indizada puede contener un alelo Min en el sitio Apc sobre un fondo C57BL/6J (B6) mientras que los animales fundadores mutagenizados pueden ser ratones B6. En la segunda modalidad de este método, el fondo genético afecta al fenotipo indizado, en que cuando el alelo dominante que confiere el fenotipo indizado es provisto sobre un fondo genético particular, el fenotipo indizado es mejorado o suprimido en el animal, facilitando la detección selectiva de los modificadores supresores o mejoradores, respectivamente. La cepa indizada puede ser un derivado congénico de una cepa que tiene un fondo genético que mejora o suprime el fenotipo indizado, en donde la cepa congénica lleva el alelo dominante que confiere un fenotipo indizado. Por ejemplo, en una cepa congénica que tiene un alelo Min en un sitio Apc, sobre el fondo genético de la cepa de BTBR endogámica, el fenotipo Min es mejorado significativamente. Los animales endogámicos congenióos que llevan el alelo indizado son cruzados con animales que han sido mutagenizados como se describe en cualquier otra parte aquí para producir animales de Geni. La supresión y/o la mejora del fenotipo indizado puede ser evaluada como se describió. En donde el padre indizado en este cruzamiento tenga un fenotipo indizado mejorado, los modificadores de supresión supuesta del fenotipo indizado pueden ser evidentes en algunos animales de Geni como un cambio o desplazamiento en el fenotipo indizado aparte del nivel mejorado y hacia el nivel del tipo silvestre. Los modificadores supuestos en los animales de Geni pueden ser mapeados o asignados con coordenadas por el cruzamiento de los animales de Geni con respecto a una cepa endogámica distinguible genéticamente. En cada caso, para facilitar el mapeo y la clonación de un modificador supuesto, los animales que contienen un modificador supuesto son cruzados para hacer distinguible genéticamente el plasma del germen a causa de que los métodos de mapeo demandan diferencias entre los animales que contienen modificadores supuestos y las cepas utilizadas para el mapeo. Sin embargo, las diferencias polimórficas en los fondos genéticos de estas cepas pueden obscurecer la modificación del fenotipo ejercida por una ¿&«98ia > -, .. —t»^ ^ z'ziu.* - «¿wB iaaaaM-MBBgWifc, *s*z ^.^z ^„ ¿at». AjJiíaiitai mutación mejoradora o supresora inducida. Este problema puede ser superado creando una cepa indizada que difiere de la cepa fundadora solamente en los polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) salpicados alrededor de su genoma. Brevemente, una cepa indizada isogénica es creada por la mutagenización de la cepa indizada utilizando un mutágeno que induce cambios de un solo nucleótido, tales como ENU. La cepa de índice marcada con SNP es creada por el apareamiento de hermano-hermana sistemático empezando con un hijo y una hija del animal mutagenizado que ha sido apareado con el animal que lleva la mutación indizada. El proceso del casamiento del parentesco de hermano-hermana secuencial elimina gradualmente las mutaciones perjudiciales y letales. Para hacer válido que los marcadores de SNP introducidos sean fenotípicamente neutrales, el fenotipo indizado de la cepa marcada con SNP puede ser evaluado. A manera de ejemplo, la mutagénesis de ENU de las cepas del ratón BTBR o B6 puede ser esperada para producir tales polimorfismos marcadores a una densidad en el intervalo de 1 por centiMorgan. El enfoque de preparar tal cepa indizada permite que se hagan las selecciones genéticas más cercanas a las isogénicas que se pueden contemplar. Los métodos para identificar los portadores heterozigóticos de los mejoradores y supresores de un fenotipo indizado pueden ser guiados efectivamente aplicando un análisis estadístico apropiado para los datos fenotípicos en los linajes candidatos (por ejemplo, el conteo de tumores, en el caso de Min) . Utilizando el algoritmo, es posible mejorar la eficiencia con la cual se identifican probablemente los portadores y no portadores de un gen modificador heterozigótico candidato. La primera parte de un análisis estadístico de dos partes adecuado, confirma la presencia de un gen modificador que segrega un linaje candidato aplicando una prueba de la relación de probabilidad de la hipótesis nula de que ningún gen modificador del fenotipo se está segregando. La prueba de la relación de la probabilidad considera la hipótesis alternativa de que un gen modificador se está segregando, y la prueba es calibrada exactamente por Monte Cario; es decir, un valor p es obtenido calculando la estadística de la relación de la probabilidad repetidamente para las permutaciones al azar de los animales entre los sublinajes. Para un fenotipo discreto tal como el conteo de tumores, las distribuciones del fenotipo del fondo y modificadas son modeladas como binomiales negativas. Las distribuciones Gaussianas pueden ser apropiadas para los fenotipos continuos. Si el valor p es > 0.05, no existe evidencia de un gen modificador. Ya r*?ti¿¡»».~. sea más datos son necesarios, o diferentes linajes deben ser considerados para un análisis adicional. Si el valor p es < 0.05, entonces, en la segunda parte del análisis, un valor LOD para la presencia del gen modificador es calculado para cada portador potencial que se ha reproducido con la información del fenotipo. El valor de LOD es el logaritmo en base 10 de la relación de la probabilidad de los datos del fenotipo de la descendencia si el animal lleva el gen modificador comparado con la probabilidad de los datos del fenotipo si el animal no llevara el gen modificador. Las probabilidades son calculadas a partir de una distribución del fondo estimado para el denominador, y a partir de una mezcla del fondo estimado y la distribución modificada estimada para el numerador. Las distribuciones estimadas son obtenidas por el método de la probabilidad máxima. Las distribuciones binomiales negativas pueden ser utilizadas para los fenotipos del conteo de tumores, y las distribuciones Gaussianas pueden ser utilizadas para los fenotipos continuos. Los portadores potenciales son ubicados entonces en rangos de acuerdo con sus valores o marcadores de LOD. El mapeo procede analizando primero a los animales con valores de LOD positivos más elevados (probablemente portadores) y valores de LOD negativos más elevados (probablemente no portadores) .

Una mutación modificadora inducida por ENU puede ser mapeada o asignada con coordenadas a una resolución baja con base en su fenotipo heterozigótico, como se describió anteriormente. Como se detalla cerca del final 5 del Ejemplo posterior, el mapeo de resolución más elevada está disponible cuando los homozigotos para la mutación modificadora inducida por la ENU tienen un fenotipo cualitativamente distinto tal como la letalidad. La invención será mejor entendida durante la 10 consideración del siguiente Ejemplo no limitativo.

Ejemplo La mutación Min, descrita por Moser y colaboradores, "A Dominant Mutation that Predisposes to Múltiple Intestinal Neoplasia in the Mouse", Science 247:322-324 (1990), incorporada aqui para referencia, es una mutación de ratón totalmente penetrante, transmitida dominantemente, que provoca un fenotipo en los heterozigotos que se asemejan estrechamente a los síndromes de poliposis colónica heredada humana. En este ejemplo, los ratones C57BL/6 que llevan el alelo Min fueron reproducidos con los ratones de BTBR distinguibles genéticamente que llevaron mutaciones puntuales al azar heredadas de los padres mutagenizados.

A intervalos de aproximadamente 1 mes, 6 a 12 ratones BTBR machos fueron tratados con ENU de acuerdo con el protocolo descrito por Shedlovsky, supra, y fueron cruzados entonces con ratones BTBR no mutagenizados, hembra. La descendencia de Geni de este cruzamiento fueron heterozigotos de animales de BTBR isogénicos para mutaciones posibles que podrían afectar la carga de tumores en los ratones que contienen la mutación Min. Aproximadamente 900 descendencias de Geni hembras fueron obtenidas durante el transcurso del tiempo. Dos cientos noventa y nueve ratones hembra de Geni fueron cruzados con los ratones macho B6-Min. Como a un lado o anteriormente, se señaló que los machos de Geni podrían haber sido cruzados con hembras B6-Min, si las carnadas han sido producidas por madres adoptivas (tales como los ratones ICR, disponibles comercialmente) dentro de pocos días después del nacimiento. Arriba del 90% de tales crías sobreviven. Esta estrategia podría ser ventajosa porque proporciona hembras B6-Min múltiples, la producción de un número suficiente de animales de GenlFi podria ser acelerada. Para efectuar el cruzamiento, dos hembras y un macho fueron colocados en una jaula. Después de dos semanas, las hembras fueron retiradas y reemplazadas por dos nuevas hembras. Los embarazos fueron detectados por la JtXj&aA ;*&¡gB> ^ w&for -palpitación semanal de las hembras separadas. Si ningún embarazo fue detectado después de dos semanas de separación, las hembras fueron recicladas en parejas. La progenie de GenlFi de cada hembra fue genotipificada para Min y fue seleccionada para verificar los signos de enfermedad dos veces por semana partiendo a los 100 días de edad. Cuando los animales empezaron a mostrarse pálidos, los mismos fueron verificados diariamente hasta que parecieron cercanos a la muerte. El análisis genotípico empleó la PCR específica para el alelo o la hibridación específica para el alelo, como se describió por Dietrich y colaboradores, supra, en la página 637, y los documentos citados allí, todos incorporados aquí para referencia, utilizando los mismos cebadores y condiciones de PCR utilizados por Dietrich y colaboradores. Entre la progenie estuvieron 92 linajes que tienen 6 o más miembros. De estos 92 linajes, 5 linajes mostraron al menos dos miembros Min/+ con una posible mejora del fenotipo Min (es decir, un tiempo de supervivencia más corto que la supervivencia del 90/o. percentil de la población total de los ratones de GenlFi) . Siete linajes mostraron al menos dos miembros Min/+ con la supresión del fenotipo Min (es decir, una supervivencia más prolongada que el lO/o. percentil) . Como se esperaba, el mejoramiento o la supresión del fenotipo se segregó dentro de un linaje, puesto que los ratones Min en la generación GenlFi de un linaje sor? heterozigóticos para cualquiera mutaciones inducidas recientemente . La siguiente tabla muestra la supervivencia de cuatro linajes que incluyen la segregación de los sitios mejoradores o supresores del candidato: Número Número Edad % de supervivencia de Linaje de Ratón Nacido Muerto Final sobre curva de GenlF], Su248 1 20/10/añol ll/ll/año2 388 2.9 3 20/10/añol 21/08/año2 306 5.3 2 20/10/añol 26/07/año2 280 6. 6 6 20/10/añol 12/04/año2 175 32.1 Su258 4 11/10/añol 12/ll/año2 398 0.0 2 11/10/añol 16/10/año2 371 3.4 14 14/02/año2 30/09/año2 229 11.0 6 13/12/añol 01/07/año2 201 17.0 7 13/12/añol 19/06/año2 189 22.4 3 11/ 10/añol 16/04/año2 188 22. 6 11 13/12/añol 25/05/año2 164 43.3 En333 15 06/03/año2 05/08/año2 152 56.1 3 25/10/añol 14/03/año2 141 70.8 12 06/03/año2 23/07/año2 139 72.7 2 25/10/añol 12/03/año2 139 72.7 13 06/03/año2 18/06/año2 104 98.7 11 06/03/año2 18/06/año2 104 98.7 10 06/03/año2 18/06/año2 104 98.7 17 06/03/año2 18/06/año2 104 98.7 En425 3 10/11/añol 05/04/año2 147 62.7 1 10/11/añol 25/03/año2 136 76.4 2 10/11/añol 12/03/año2 123 89.5 6 10/11/añol 12/03/año2 123 89.5 8 10/11/añol 27/02/año2 109 97.3 6 10/11/añol 27/02/año2 109 97.3 Si la probabilidad es del 10% de que un ratón del genotipo normal sobrevivirá un tiempo más prolongado que una edad particular, la probabilidad al azar de que 2 ratones en el mismo linaje sobrevivirán un período más prolongado que aquel de la edad es solamente del 1%. La probabilidad al azar de que 3 ratones en un linaje sobrevivirán un tiempo más prolongado es de solamente 0.1%, a su vez. Por lo tanto, cuando el número de elementos de un linaje que tiene una supervivencia corta o larga, fronteriza o limítrofe, se incrementa, también lo hace la probabilidad de que la desviación resulte de una mutación legítima heredada del animal fundador de BTBR mutagenizado.

Este es el principio de agrupación del método. Predeterminando un nivel deseado de agrupación, se pueden fijar limites sobre la capacidad para detectar mutantes y puede elevarse el nivel de purificación de los mutantes obtenidos, por lo cual se enriquece la selección de los mutantes. La Figura 1 muestra la probabilidad de la supervivencia contra la edad en la generación de GenlFi del cruzamiento entre las hembras de BTBR de Geni y de los machos de B6-Min. Los símbolos de abajo y a la izquierda de la curva reflejan los individuos en 2 linajes que se piensa que contienen las mutaciones que mejoran el fenotipo de Min (En333 y En425) . Los símbolos arriba y a la derecha de la curva reflejan los miembros de 2 linajes para quienes el fenotipo Min parece que va a estar suprimido (Su248 y Su258). Un número de los ratones en la última categoría permanecieron vivos en más de 365 días de edad. Los ratones que mostraron una supervivencia más baja o más elevada estadísticamente fueron reproducidos utilizando los métodos estándares para mantener la mutación. En algunos casos, el animal de Geni falló en la reproducción y los ratones de GenlFi supervivientes a largo plazo fueron reproducidos con respecto a la cepa fundadora del tipo silvestre en lugar de esto, como un método de reserva para rescatar las mutaciones de interés. Por ejemplo, el padre fundador del ^I^ 7^~ - "« -• -^^ß^^?^^S i&S?^At^ay« ¡!i^~',^». -»y y . t . ... y -**i* -* *<ll4 ?S&k.t linaje Su258 descrito infra, no fue capaz de reproducción después de que una mutación candidata fue identificada en su progenie. Los animales números 2 y 4 de la progenie que vivieron largamente, por lo tanto, fueron reproducidos con respecto a los ratones de BTBR. Para verificar que estos elementos fronterizos de un linaje realmente no contienen una mutación mejoradora o supresora, se examinó un linaje de la segunda generación. Esto es útil tanto para recuperar los portadores de una mutación mejoradora fuerte como para detectar efectos dominantes sutiles de la clase ya sea supresora o de la clase mejoradora. Comúnmente, los heterozigotos para una pérdida de la función genética mostraron solamente un efecto heterozigótico sutil. Para producir el linaje de la segunda generación, el animal fundador que ocasionó un linaje que evidenció una función ya sea mejoradora o supresora fue cruzado con los animales de BTBR normales. En promedio, el 50% de la descendencia de este cruzamiento se podría esperar que contuviera la mutación supresora o mejoradora. La descendencia de este cruzamiento, llamada Gen2, fue cruzada con respecto a los ratones de B6-Min. Después de 90 días, la progenie mostrada por el análisis genotipico para llevar la mutación Min fue sacrificada y la carga de tumores fue evaluada utilizando los métodos estándares para la determinación de un número y volumen tumorígeno promedio. La carga de los tumores está definida como las veces que tiene el volumen tumorigeno promedio por el número de tumores por ratón. 5 Como una prueba adicional de que una mutación supresora fue obtenida en el linaje 258, dos de los supervivientes a largo plazo en la generación de GenlFi fueron reproducidos y los descendientes de encontró que tienen conteos tumorígenos muy bajos (de aproximadamente 10 o un número más bajo de tumores) . Esto proporcionó una evidencia fuerte de que una mutación legítima que tiene el efecto de suprimir el fenotipo Min fue la segregación durante el paso a la descendencia. Sobre la base de 699 animales en el linaje supresor 258, la multiplicidad tumorígena estimada estadísticamente de los animales +/+ es de 18.8, en promedio, mientras que aquella de los animales Su/+ es estimada como 5.9. Para el linaje mejorador 333, la multiplicidad tumorigena estimada de los animales +/+ es de 20.5 mientras que los miembros En/+ del linaje tuvieron una multiplicidad tumorígena estimada de 36. A causa de los polimorfismos de SSLP conocidos entre el ADB de B6 y BTBR, será posible aislar la porción del genoma de la progenie que contiene el ADN del BTBR y después de esto localizar la mutación puntual responsable de la modificación del fenotipo utilizando las técnicas estándares ahora disponibles para el genetista molecular experto. El hecho de que las mutaciones inducidas por ENU son substituciones de un solo par base, hace a este paso particularmente poderoso. Esto es la base para el nombramiento de "Molécula Modificadora" del método de ICMM. La porción del genoma que contiene la mutación puntual puede ser comparada contra los ESTs conocidos, o puede ser secuenciada de nuevo para determinar la secuencia genética responsable de la codificación de cual molécula que modifica el fenotipo. Utilizando métodos estándares, la secuencia genética puede ser introducida en una construcción genética adecuada que contiene un promotor transcripcional para la producción en una célula huésped procariótica o eucariótica. Se podría utilizar el gen clonado para producir otras mutaciones en este gen en compañía de las cepas del ratón. La secuencia genética es comparada fácilmente contra las secuencias conocidas de los seres humanos para determinar la identidad del gen humano correspondiente. El gen humano puede ser aislado por los métodos estándares de hibridación, la PCR, o la clonación de la expresión. La proteina humana puede ser obtenida probablemente utilizando técnicas estándares, ya sea por el aislamiento del tejido humano, o por la producción en un huésped no natural que utiliza métodos de ADN recombinantes. clgg J3¿ $a» Puede ser posible aislar las mutaciones que suprimen el fenotipo Min indizado en un método más compacto, quizás menos sensible. En este método, los ratones hembra B6-min (heterozigóticos) son cruzados directamente con los ratones macho de BTBR mutagenizados con ENU. Como un control, los ratones machos de BTBR no mutagenizados también son procesados de la misma manera. La descendencia de Fi es adoptada sobre los ratones de ICR. Los ratones Fi machos que tienen el fenotipo Min son mantenidos. A los 170 días, cualquier macho de ApcRn + Fi cuyo peso corporal es mayor que el 95% del peso corporal de control es considerado un portador candidato de un supresor dominante del fenotipo Min, Su/+. Tales portadores candidatos son reproducidos a los 170 días de edad con los ratones hembras B6 del tipo silvestre. La descendencia hembra de este cruzamiento (Apc"111* y Apc+ +) es cruzada con el macho candidato que es ahora de solo aproximadamente 230 días de edad. La progenie de este último cruzamiento es fenotipificado entonces a los 90 días de edad. En este tiempo, el macho candidato es de al menos 340 días de edad. Entre la progenie, cualesquiera fenotipos perjudiciales o letales informarán acerca de la posición del mapa del supresor e indicarán si el macho candidato lleva una mutación supresora. Progenie Apc""1*: +/+ fenotipo Min normal Su/+ carga tumorígena baja a los 90 días? Su/Su carga tumorígena muy baja a los 90 días? o perjudicial o letal? Progenie Apc+ +: +/+ normal Su/+ normal? Su/Su perjudicial o letal? Los animales afectados perjudicialmente serán homozigóticos para los marcadores de BTBR enlazados al sitio supresor. Por el contrario, si Su/Su es una mutación letal embriónica, el conjunto de la progenie nacida viva carecerá de animales homozigóticos para los marcadores de BTBR enlazados al sitio supresor. También puede ser importante rescatar el plasma del germen que lleva una mutación modificadora que mejora o suprime, pero particularmente aquellas que mejoran, el fenotipo Min, utilizando la fertilización in vitro. Por ejemplo, un portador candidato macho que podría estar demasiado enfermo para reproducirse, puede ser sacrificado.

El esperma tomado del macho sacrificado puede ser utilizado para fertilizar los huevos obtenidos de una hembra adecuada (por ejemplo, el BTBR o un ratón que lleva la mutación de interés) . Las técnicas que pueden ser empleadas son descritas en Hogan, B. y colaboradores, Manipulation of the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2/a. ed. (1994), incorporada aquí para referencia. Esta propuesto que los ejemplos precedentes sean no limitativos de la invención, sino que en lugar de esto la invención abarque la totalidad de tales modificaciones y variaciones que lleguen a estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar una mutación de segregación en un sitio genético que modifica un fenotipo 5 de índice en una cepa endogámica indizada, la mutación de segregación provoca un fenotipo fronterizo o limítrofe con relación al fenotipo indizado, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: cruzar una cepa endogámica fundadora con una 10 cepa endogámica indizada para obtener la progenie Fi, la cepa endogámica fundadora lleva mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el 15 fenotipo indizado y que es distinguible genéticamente de la cepa endogámica fundadora, en donde algo de la progenie de Fi que lleva el alelo dominante también lleva al menos una mutación al azar; retrocruzar la progenie Fi con la cepa endogámica 20 indizada, con o sin el alelo indizado, para obtener la progenie del retrocruzamiento N2, en donde al menos algo de la progenie del retrocruzamiento N2 que lleva el alelo dominante también exhibe el fenotipo fronterizo o limítrofe; y ^^ * i -,. verificar que el fenotipo fronterizo o limítrofe sea provocado por una mutación de segregación.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cualquiera de los cruzamientos emplea gametos preservados.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la progenie Fx y algo de la progenie de N2 exhibe un fenotipo fronterizo o limítrofe extremo.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la mutación de segregación es un modificador heterozigótico del fenotipo indizado seleccionado de un grupo que consiste de un modificador mejorador y un modificador supresor.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el alelo dominante es un alelo Min en un sitio Apc.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa endogámica indizada es una cepa indizada isogénica que lleva polimorfismos de un solo nucleótido.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cepa indizada isogénica es producida por un método que comprende los pasos de: tratar un animal de una cepa indizada con un agente mutagénico para inducir mutaciones puntuales en el animal tratado; cruzar el animal tratado con un animal de la cepa indizada para producir la progenie de Fl; y aparear entre hermanos la Fl y la progenie de la generación subsiguiente hasta que las mutaciones perjudiciales y letales sean eliminadas.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa del ratón endogámico fundador es producida por un método que comprende el paso de tratar un ratón endogámico del tipo silvestre con un agente mutagénico para inducir mutaciones puntuales.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente mutagénico es la etilnitrosourea.

10. Un método para identificar una secuencia genética humana que corresponde a una mutación de segregación en un sitio genético en un animal no humano, la mutación de la segregación que provoca un fenotipo fronterizo o limítrofe con relación al fenotipo indizado en una cepa de ratón endogámico indizado, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: cruzar una cepa no humana endogámica fundadora con una cepa no humana endogámica indizada para obtener la progenie Fi la cepa endogámica fundadora lleva mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el fenotipo indizado y que es distinguible genéticamente de la cepa endogámica fundadora, en donde algo de la progenie de Fi que lleva el alelo dominante también lleva al menos una mutación al azar; retrocruzar la progenie Fx con la cepa endogámica indizada, con o sin el alelo indizado, para obtener la progenie del retrocruzamiento N2, en donde al menos algo de la progenie del retrocruzamiento N2 que lleva el alelo ^j^^^^^ ^^^^^^^^^^^£^^Z- dominante también exhibe el fenotipo fronterizo o limítrofe; verificar que el fenotipo fronterizo o limítrofe sea provocado por una mutación de segregación; 5 identificar los marcadores genéticos enlazados a la mutación de la segregación; identificar un gen sobre un elemento contiguo que codifica la mutación de segregación; y recuperar las secuencias genéticas humanas que 10 corresponden al gen de codificación de la mutación.

11. Un método para identificar una mutación de segregación en un sitio genético que modifica un fenotipo indizado en una cepa endogámica indizada, la mutación de la 15 segregación que provoca un fenotipo fronterizo o limítrofe con relación al fenotipo indizado, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: cruzar una cepa endogámica fundadora con una cepa endogámica indizada para obtener la progenie Geni, la 20 cepa endogámica fundadora lleva mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el fenotipo indizado, el alelo es provisto sobre un fondo 25 genético de la cepa endogámica fundadora del tipo silvestre, en donde algo de la progenie de Geni que lleva el alelo dominante también exhibe un fenotipo indizado modificado; y verificar que la progenie Geni que lleva el alelo dominante y que exhibe un fenotipo indizado modificado, lleve una mutación de segregación.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el fondo genético no tiene un efecto modificador sobre el fenotipo indizado.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el fondo genético tiene un efecto modificador sobre el fenotipo indizado.

14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el fondo genético tiene un efecto mejorador sobre el fenotipo indizado, y en donde los animales de Geni exhiben un fenotipo suprimido con relación a la cepa endogámica indizada.

15. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende los pasos de: mapear o asignar coordenadas a la mutación de la segregación cruzando los animales de Geni que tienen el alelo dominante y un fenotipo indizado modificado con una cepa endogámica distinguible genéticamente; y evaluar la progenie del cruzamiento del mapeo o asignación de coordenadas.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cepa endogámica distinguible genéticamente es una cepa endogámica que tiene el fondo genético de la cepa endogámica fundadora del tipo silvestre y además comprende los polimorfismos de un solo nucleótido con relación a la cepa endogámica fundadora del tipo silvestre.

17. Un ratón alterado genéticamente que tiene una característica de fondo genético de una primera hebra del ratón endogámico, el ratón está caracterizado porque comprende en su genoma: un alelo heterozigótico dominante que confiere un fenotipo indizado sobre un ratón que tiene el fondo genético característico; y un modificador de la segregación del fenotipo indizado, el modificador está enlazado genéticamente a una característica del marcador genético de una segunda hebra del ratón endogámico, en donde el fenotipo indizado en el ratón alterado genéticamente es modificado con relación al fenotipo indizado en un ratón que comprende el alelo dominante sobre la característica del fondo genético de la primera hebra del ratón endogámico pero el cual carece del modificador de la segregación.

18. Un ratón de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el alelo dominante es un alelo Min en un sitio Apc.

19. Un animal no humano que comprende una mutación de segregación que modifica un fenotipo indizado, el animal está caracterizado porque es preparado de acuerdo con un método que comprende los pasos de: cruzar una cepa no humana endogámica fundadora con una cepa no humana endogámica indizada para obtener la progenie Fi, la cepa endogámica fundadora lleva mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el fenotipo indizado y que es distinguible genéticamente de la cepa endogámica fundadora, en donde algo de la progenie de Fi que lleva el alelo dominante también lleva al menos una mutación al azar; retrocruzar la progenie Fi con la cepa endogámica indizada, con o sin el alelo indizado, para obtener la progenie del retrocruzamiento de N2, en donde al menos algo de la progenie del retrocruzamiento N2 que lleva el alelo dominante también exhibe el fenotipo fronterizo o limítrofe; verificar que el fenotipo fronterizo o limítrofe sea provocado por una mutación de segregación, y seleccionar un animal que muestre el fenotipo fronterizo o limítrofe.

20. Un animal no humano de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el animal no humano es un ratón.

21. Un animal no humano que comprende una mutación de segregación que modifica un fenotipo indizado, el animal está caracterizado porque es preparado de acuerdo con un método que comprende los pasos de: cruzar una cepa endogámica fundadora con una cepa endogámica indizada para obtener la progenie Geni, la cepa endogámica fundadora lleva mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el fenotipo indizado, el alelo es provisto sobre un fondo genético de la cepa endogámica fundadora del tipo silvestres, en donde algo de la progenie de Geni que lleva el alelo dominante también exhibe un fenotipo indizado modificado; verificar que la progenie Geni que lleva el alelo dominante y que exhibe un fenotipo indizado modificado, lleve una mutación de segregación; y seleccionar un animal que muestre el fenotipo fronterizo o limítrofe.

22. Un animal no humano de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el animal no humano es un ratón.

23. Un animal no humano que comprende una mutación de segregación que modifica un fenotipo de índice, el animal está caracterizado porque es preparado de acuerdo con un método que comprende los pasos de: cruzar una cepa endogámica isogénica fundadora con la cepa endogámica indizada para obtener la progenie de GenlFi, la cepa isogénica fundadora es heterozigótica solamente para las mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el fenotipo indizado, en donde al menos algo de la progenie de GenlFi lleva tanto el alelo dominante como al menos una mutación al azar; cruzar un animal fundador de la cepa endogámica isogénica fundadora con un animal de la cepa fundadora que carece de las mutaciones para obtener la descendencia Gen2 endogámica, en donde el animal fundador tiene al menos una progenie de Fi retrocruzada exhibe el fenotipo fronterizo o limítrofe con relación al fenotipo indizado; cruzar la descendencia de Gen2 con la cepa indizada para obtener una progenie retrocruzada de Gen2F?, la mitad de la cual, en promedio, lleva el alelo dominante que confiere el fenotipo indizado; y verificar que un subconjunto de la progenie de la Gen2F? muestre el fenotipo fronterizo o limítrofe; y seleccionar un animal que muestre el fenotipo fronterizo o limítrofe.

24. Un animal no humano de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el animal no humano es un ratón.

25. Un método para identificar una mutación de segregación en un sitio genético que modifica un fenotipo indizado en una cepa endogámica indizada, la mutación de la segregación provoca un fenotipo fronterizo o limítrofe con 5 relación al fenotipo indizado, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: cruzar una cepa endogámica isogénica fundadora con la cepa endogámica indizada para obtener la progenie de GenlF?, la cepa isogénica fundadora es heterozigótica 10 solamente para las mutaciones puntuales al azar con relación a un animal del tipo silvestre de la cepa endogámica fundadora, la cepa endogámica indizada lleva un alelo dominante en un sitio que se sabe que confiere el fenotipo indizado, en donde al menos algo de la progenie de 15 GenlFi lleva tanto el alelo dominante como al menos una mutación al azar; cruzar un animal fundador de la cepa endogámica isogénica fundadora con un animal de la cepa fundadora que carece de las mutaciones para obtener la descendencia Gen2 20 endogámica, en donde el animal fundador tiene al menos una progenie de i retrocruzada que exhibe el fenotipo fronterizo o limítrofe con relación al fenotipo indizado; cruzar la descendencia de Gen2 con la cepa indizada para obtener una progenie retrocruzada de Gen2Fx, la mitad de la cual, en promedio, lleva el alelo dominante que confiere el fenotipo indizado; y verificar que un subconjunto de la progenie de la Gen2F? muestre el fenotipo fronterizo o limítrofe.