MXPA00011011A - Factores que afectan la actividad de la enzima de liberacion del receptor del factor de la necrosis del tumor - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a los efectos biológicos del TNF citocina son mediados por la unión a los receptores sobre la superficie de las células. Esta descripción describe nuevas proteínas y polinucleotidos que promueven la segmentación y liberación enzimática de los receptores de TNF. También se proporciona un método para identificar los compuestos adicionales que tienen influencia sobre la dispersión del receptor de TNF. Como el ingrediente activo en una composición farmacéutica, los productos de esta invención incrementan o reducen la transducción de la señal de TNF, por lo cual se alivia la patología de la enfermedad.

Description

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA DE LIBERACIÓN DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE IA NECROSIS DEL TUMOR Campo de" la Invención Esta invención se refiere en general al campo de la transducción de las señales entre las células, por medio de las citocinas y sus receptores. Más específicamente, la misma se refiere ' a la actividad enzimática que segmenta y libera el receptor para TNF encontrado sobre la superficie de la célula, y a los efectos biológicos consecuentes. Ciertas modalidades de esta invención son composiciones que afectan tal actividad enzimática y pueden ser incluidas en los medicamentos para el tratamiento de la enfermedad.

Antecedentes de la Invención Las citocinas desempeñan un papel central en la comunicación entre las células. La secreción de una citocina desde una célula en respuesta a un estímulo puede activar una célula adyacente para que padezca una respuesta biológica apropiada - tal como la estimulación, diferenciación, o apoptosis. Se tiene la hipótesis de que los eventos biológicos importantes pueden estar influidos 124919 no solamente porque se afecta la liberación de la citocina de la primera célula, sino también por la unión a los receptores sobre la segunda célula, la cual medía la respuesta subsiguiente. La invención descrita en esta solicitud de patente proporciona nuevos compuestos para afectar la transducción de la señal desde un factor de la necrosis del tumor. La citocina conocida como el factor de necrosis del tumor (TNF o TNF-a) está relacionada estructuralmente con la linfotoxina (LT o TNF-ß) . Las mismas tienen aproximadamente 40 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos "(Oíd, Nature 330:602-603, 1987). Estas citocinas son liberadas por los macrófagos, los monocitos y las células exterminadoras naturales y desempeñan un papel en los eventos inflamatorios e inmunológicos. Las dos citocinas provocan un espectro amplio de efectos tanto in vitro como in vivo, incluyendo: (i) la trombosis vascular y las necrosis del tumor; (ii) la inflamación; (iii) la activación de los macrófagos y los neutrófilos; (iv) la leucocitosis; (v) la apoptosis; y (vi) los choques. El TNF ha estado asociado con una variedad de estados de enfermedad que incluyen varias formas del cáncer, la artritis, la psoriasis, los choques endotóxicos, la sepsis, las enfermedades autoinmunes, las infecciones, la obesidad, y la caquexia. El TNF parece que desempeña un papel en los tres factores que contribuyen al control del peso corporal; la admisión, el consumo, y el almacenamiento de la energía (Rothwell, Int. J. Obesity 17.S98-S101, 1993). En la septicemia, las concentraciones de la toxina incrementadas parece que elevan los niveles del TNF (Beutler y colaboradores, Science 229:869-871, 1985). Se ' an hecho intentos para alterar el curso de una enfermedad tratando al paciente con los inhibidores del TNF, con un grado variable de éxito. Por ejemplo, al inhibidor de TBF de dexanabinol proporcionó protección contra los efectos mediados por el TNF a continuación de la lesión traumática del cerebro (Shohami y colaboradores J. Neuroimmun. 72:169-77, 1997). Se produjo alguna mejora en la enfermedad de Crohn por el tratamiento con los anticuerpos anti-TNF (Neurath y colaboradores, Eur. J. I mun. 27:1743-50, 1997). El TNF y el LT humanos median sus actividades biológicas por la unión específicamente a dos receptores de la membrana del plasma de la glicoproteína distintos (de tamaño de 55 kDa y 75 kDa, conocidos como p55 y p75 THF-R, respectivamente) . Los dos receptores comparten 18 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos en sus dominios extracelulares, los cuales están compuestos de cuatro regiones ricas en cisteína de repetición (Tartaglia y Goeddel, Immunol. Today 13:151-153, 1992). Sin embargo, los receptores carecen de una homología de la secuencia significativa en sus dominios extracelulares, y media las diferentes respuestas intracelulares para la activación del receptor. De acuerdo con las diferentes actividades del TNF y LT, la mayoría de las células humanas expresan niveles bajos de ambos receptores de TNF: aproximadamente 2,000 hasta 10,000 receptores por célula (Brockhaus y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:3127-3131, 1990) . La expresión de los receptores de TNF sobre las células tanto linfoides como no linfoides puede ser influida experimentalmente por muchos agentes diferentes, tales como los lipopolisacáridos bacterianos (LPS), forbol miristato acetato {PMA; un activador de la proteína cinasa C) , la interleucina-1 (IL-1), la interferona-gamma (IFN-?) e IL-2 (Gatanaga y colaboradores, Cell Immunol . 138:1-10, 1991; Yui y colaboradores Placenta 15:819-835, 1994). Se ha mostrado que los complejos del TNF humano unidos a su receptor son internalizados desde la membrana celular, y luego el receptor es ya sea degradado o reciclado (Armitage, Curr. Opin. I munol. 6:407-413, 1994). Se ha propuesto que la actividad del receptor de TNF pueda ser modulada utilizando los péptidos que se unen intracelularmente al receptor, o los cuales se unen al sitio de unión del ligando, o que afectan la difusión del receptor. Véanse por ejemplo las publicaciones de las patentes WO 95/31544, WO 95/33051, WO 96/01642, y EP 568 925. Las proteínas de unión del TNF (TNF-BP) han sido identificadas a niveles elevados en el suero y la orina de los pacientes febriles, los pacientes con falla renal, y los pacientes con cáncer, y aún ciertos individuos sanos. Los tumores de los ovarios y el cerebro humano produjeron niveles elevados en el suero del TNF-BP. Estas moléculas han sido purificadas, caracterizadas, y clonadas (Gatanaga y colaboradores, Lymphokine Res. 9:225-229, 1990a; Gatanaga y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 87:8781-8784, 1990b) . El TNF-BP Humano consiste de proteínas de 30 kDa y 40 kDa las cuales son idénticas a los dominios extracelulares N-terminales de los receptores de TNF de p55 y p75, respectivamente (Patente US No. 5,395,760; EP 418,014). Tales proteínas han sido sugeridas para su uso en el tratamiento del choque endotóxico. Mohler y colaboradores, J. Immunol. 151:1548-1561, 1993. Existen varios mecanismos posibles para la producción de las proteínas secretadas que se asemejan a los receptores unidos a la membrana. Uno involucra la translación o traducción de los ARNms segmentados alternativamente que carecen de las regiones citoplásmica y de la transmembrana. Otro involucra la segmentación proteolítica de los receptores de la membrana intactos, seguido por la difusión del receptor segmentado desde la célula. La forma soluble del TNF-R de p55 y p75 no parece que sea generada a partir del empalme del ARNm, puesto que solamente el ARNm del receptor de longitud completa ha sido detectado en las células humanas in vitro (Gatanaga y colaboradores, 1991) . Los estudios de mutación y secuenciamiento terminales de carboxilo sobre el TNF-R de p55 humano indican que un sitio de segmentación puede existir entre los residuos de Asn 172 y Val 173 (Gullberg y colaboradores, J. Cell. Biol. 58:307-312, 1992). Existen reportes de que un inhibidor de la metaloproteasa específica, el inhibidor de la proteasa de TNF-a (TAPI) bloquea la dispersión del TNF-R de p75 y p55 soluble (Crowe y colaboradores, J. Exp. Med. 181:1205-1210, 1995; Mullberg y colaboradores, J. Immunol . 155:5198-5205, 1995) . El procesamiento del pro-TNF sobre la membrana celular para liberar el ligando de TNF parece que va a ser dependiente de una metaloproteasa de la matriz semejante a la enzima (Gearing y colaboradores, Nature 370:555-557, 1994) . Esta es una familia de enzimas de degradación de la matriz relacionadas estructuralmente que desempeñan un papel principal en la remodelación y reparación de los tejidos asociada con el desarrollo y la inflamación (Birkedal-Hansen y colaboradores, Crit. Rev. Oral Biol.

Med. 4:197-250, 1993). Las enzimas tienen Zn2+ en sus dominios catalíticos, y el Ca2+ estabiliza su estructura terciaria significativamente. En la solicitud de patente europea EP 657536A1, Wallach y colaboradores sugieren que podría ser posible obtener una enzima que desdobla el receptor de TNF de 55,000 kDa encontrando una forma mutada del receptor que no es segmentada por la enzima, pero todavía se une al mismo. La única fuente propuesta para la enzima es un extracto detergente de las membranas para las células que parece que tienen la actividad de la proteasa. Si fuera posible obtener una enzima de conformidad con este esquema, luego la enzima podría comprender presumiblemente una región de expansión o extensión de la membrana. La solicitud de patente no describe ninguna proteasa que fuera obtenida actualmente. En una solicitud de patente previa en la presente serie (Publicación de Patente Internacional WO 9820140), se describen métodos para obtener una enzima aislada que segmenta el TNF-R tanto de p55 como de p75 desde las superficies celulares. Una fuente conveniente es el medio de cultivo de las células que han sido estimuladas con el forbol miristato acetato (PMA) . A la actividad de la enzima se le dio el nombre de TRRE (enzima de liberación del receptor de TNF) . En otros estudios, el TRRE fue liberado g inmediatamente durante la estimulación con el PMA, indicando que el mismo es presintetizado en una forma inactiva para ser convertida rápidamente a la forma activa durante la estimulación. La evidencia para la segmentación directa del TNF-R es que la difusión empieza muy rápidamente (~5 minutos) con una difusión máxima dentro del intervalo de 30 minutos. El TRRE es específico para el TNF-R, y no segmenta los receptores de IL-1, CD30, ICAM-1 o CDllb. La actividad del TRRE es mejorada agregando Ca++ o Zn++, y se inhibió por el EDTA y fenantrolina. Dado el involucramiento del TNF en una variedad de condiciones patológicas, es deseable obtener una variedad de factores que podrían permitir al receptor que la difusión sea modulada, por lo cual se controla la transducción de la señal desde el TNF en un sitio de la enfermedad.

Breve Descripción de la Invención Esta descripción proporciona nuevos compuestos que promueven la segmentación enzimática y la liberación de los receptores de TNF desde la superficie celular. Nueve clones nuevos del ADN han sido seleccionados después de una filtración repetida en un ensayo que prueba la capacidad para mejorar la liberación del receptor. Las secuencias de polinucleótidos de esta invención y las proteínas codificadas por ellas tienen potencial como auxiliares para diagnóstico y los compuestos terapéuticos pueden ser utilizados para ajustar la transducción de la señal de TNF de una manera benéfica. Una modalidad de la invención es un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos con las siguientes propiedades: a) la secuencia es expresada al nivel del ARNm en las células Jurkat T; b) cuando las células COS-1 que expresan el receptor de TNF son transformadas genéticamente para expresar la secuencia, las células tienen una actividad enzimática incrementada para la segmentación y la liberación del receptor. Si una secuencia de polinucleótidos es expresada en las células Jurkat, entonces la misma puede ser encontrada en la biblioteca de expresión de las células de Jurkat depositada en el ATCC (No. de Acceso TIB-152) . Se reconoce que los polinucleótidos pueden ser obtenidos de otras líneas celulares, o producidos por técnicas recombinantes. Están incluidos los nucleótidos en los cuales la secuencia de nucleótidos está contenida en cualquiera de las SEC. ID NOS: 1-10. También están contemplados los polinucleótidos que comprenden al menos 30 y preferentemente más nucleótidos consecutivos en la secuencia de nucleótidos, y al menos 50 nucleótidos consecutivos que son homólogos a dicha secuencia a un nivel significativo, preferentemente al nivel del 90% o mayor. También están incluidos los polinucleótidos de ribosomas y antisentido que inhiben la expresión de un modulador de TRRE. Otra modalidad de la invención son los polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido • de esta invención. Los ejemplos no limitativos son las secuencias mostradas en las SEC. ID Nos: 147-158. Los fragmentos y las proteínas de fusión están incluidas en esta invención, y comprenden preferentemente al menos 10 residuos consecutivos codificados por un polinucleótido de esta invención, o al menos 15 aminoácidos consecutivos que son homólogos a un nivel significativo, preferentemente de al menos 80%. Los polipéptidos preferidos promueven la segmentación y la liberación de los receptores de TNF desde la superficie celular, especialmente las células COS-1 transformadas genéticamente para expresar el receptor de TNF. Los polipéptidos pueden o no pueden tener un dominio de extensión de la membrana, y pueden ser producidos opcionalmente por un proceso que involucra la secreción de una célula. Están incluidos los homólogos de las especies con la actividad deseada, y los mutantes artificiales con propiedades benéficas adicionales.

Otra modalidad de esta invención es un anticuerpo específico para un polipéptido de esta invención. Son preferidos los anticuerpos que se unen a una proteína moduladora de TRRE, pero no a otras substancias encontradas en las muestras de tejidos humanos en cantidades comparables . Otra modalidad de la invención es un método de ensayo para la determinación de la actividad de TRRE alterada en una muestra de célula o tejido, utilizando un polinucleótido o anticuerpo de esta invención para detectar la presencia o ausencia del modulador de TRRE correspondiente. Este método de ensayo puede ser utilizado opcionalmente para el diagnóstico o la evaluación de una condición clínica que se refiere a los niveles de TNF anormales o a la transducción de la señal de TNF. Otra modalidad de la invención es un método para incrementar o reducir la traducción de la señal desde una citocina hacia una célula (incluyendo pero sin estar limitado al TNF) , que comprende poner en contacto la célula con un polinucleótido, polipéptido, o anticuerpo de esta invención. Una modalidad adicional de la invención es un método para seleccionar polinucleótidos para verificar una capacidad de modular la actividad de TRRE. El método involucra proporcionar células que expresen tanto el TRRE como el receptor de TNF; alterar genéticamente las células con los polinucleótidos que van a ser seleccionados; clonar las células; e identificar los clones con la actividad deseada. Todavía otra modalidad de la invención es un método para seleccionar las substancias para verificar una capacidad para afectar la actividad de TRRE. Esto involucra típicamente incubar las células que expresan el receptor de TNF con un modulador de TRRE de esta invención en la presencia o ausencia de la substancia de prueba; y medir el efecto sobre la difusión del receptor de TNF. Los productos de la invención pueden ser utilizados en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o animal. El medicamento contiene una cantidad efectiva clínicamente para el tratamiento de una enfermedad tal como la falla del corazón, la caquexia, la inflamación, el choque endotóxico, la artritis, la esclerosis múltiples, la sepsis, y el cáncer. Estas composiciones pueden ser utilizadas para la administración a un sujeto sospechoso de tener o estar en riesgo de la enfermedad, opcionalmente en combinación con otras formas de tratamiento apropiadas para su condición.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una representación esquemática del plásmido pCDTR2. El plásmido expresa p75 TNF-R, la forma de -75 kDa del receptor de TNF. PCMV significa el citomegalovirus; BGHpA significa la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento del bovino. La Figura 2 es una línea que muestra los niveles de p75 TNF-R detectados en las células COS-1 alteradas genéticamente para expresar el receptor. Los resultados de las células transformadas, designadas C75R (•, línea de ascenso hacia arriba) es comparada con aquella de las células COS-1 originales (H, línea base) . El número del receptor se calculó por el análisis de Scatchard (insertado) . La Figura 3 es una gráfica de supervivencia, que muestra que el TRRE reduce la mortalidad en los ratones estimulados con lipopolisacáridos (LPS) para inducir la peritonitis séptica. ( ) LPS solo; (B) LPS más solución amortiguadora de control; (•) LPS más TRRE (2,000 U) ; (A) LPS más TRRE (4,000 U) . La Figura 4 es una reproducción de medio tono de una gráfica de barras, que muestra el efecto de 9 nuevos clones sobre la .actividad de TRRE sobre las células C75R (células COS-1 transfectadas para expresar el receptor de TNF) . Cada uno de los 9' clones incrementó la actividad de TRRE arriba de 2 veces. La Figura 5 es una gráfica de supervivencia, que muestra la capacidad de 4 nuevos clones expresados para salvar ratones estimulados con LPS. ( ) solución salada; (B) BSA; (?) Mey-3 (100 µg); (X) Mey-3 (10 µg) ; {*) Mey-5 (10 µg); (•) Mey-8 (10 µg) .

Descripción Detallada de la Invención Se ha descubierto que ciertas células involucradas en la ruta de transducción del TNF expresan la actividad enzimática lo cual provoca que los receptores de TNF sean difundidos desde la superficie celular. A la actividad enzimática para segmentar y liberar los receptores de TNF se le ha dado la designación TRRE. El forbol miristato acetato induce la liberación del TRRE desde las células en el medio de cultivo. Una proteína de TRRE ejemplar ha sido purificada desde el sobrenadante de las células de TNF-1 (Ejemplo 2) . La proteasa lleva ciertas marcas de pureza o contraste de la familia de la metaloproteasa, y es liberada rápidamente de la célula durante la activación. Para averiguar la naturaleza de esta proteína se llevó a cabo una clonación funcional. Las células Jurkat fueron seleccionados porque son una buena fuente de TRRE. El ADNc de una biblioteca Jurkat fue expresada, y el sobrenadante de las células se probó para verificar una capacidad para liberar los receptores de TNF de las superficies de la célula. La clonación y la prueba del producto de la expresión se llevó a cabo por medio de varios ciclos, y los nueve clones fueron obtenidos que más que duplicaron la actividad del TRRE en el ensayo (Figura 4) . Al nivel del ADN, todos los 9 clones tuvieron secuencias diferentes. Los productos de expresión de la proteína a partir de los clones han sido probados en un modelo de animal de lipopolisacárido para la sepsis. La proteína de tres clones diferentes rescató exitosamente a los animales de una dosis letal de LPS (Figura 5) . Esto apunta a un papel importante para estas moléculas en el manejo de las condiciones patológicas mediadas por el TNF. El número de nuevos clones promotores de TRRE obtenidos de la biblioteca de expresión fue sorprendente. La especificidad del substrato del TRRE aislado en el Ejemplo 2 distingue los receptores de TNF de 75 kDa y de 55 kDa de otros receptores de la citocina y de las proteínas de la superficie celular. Existen muy pocas razones previas para sospechar que las células podrían tener nueve proteasas diferentes para el receptor de TNF. Es posible que uno de los clones codifique el TRRE aislado en el Ejemplo 2, o una proteína relacionada. Es posible que alguno de los otros clones tenga una actividad proteolítica para segmentar los receptores de TNF en el mismo sitio, o en otro sitio que provoque la liberación de la forma soluble desde la célula. Es una hipótesis de esta descripción que algunos de los clones pudieran no tener una actividad proteolítica por sí mismos, pero desempeñan un papel en la promoción de la actividad de TRRE de un modo secundario. Esta posibilidad es consistente con las observaciones hechas, a causa de que existe un nivel endógeno de actividad de TRRE en las células utilizadas en el ensayo. El ensayo de segmentación involucra la verificación de la liberación del receptor de TNF desde las células C75, las cuales son células COS-1 alteradas genéticamente para expresar el p75 TNF-R. El ensayo estándar es llevado a cabo poniendo en contacto las células transformadas con un fluido que se cree que contiene el TRRE. El nivel de la actividad de TRRE endógeno es evidente de la velocidad de liberación espontánea del receptor aún cuando ningún TRRE exógeno sea agregado (aproximadamente 200 unidades) . En consecuencia, las proteínas accesorias que promueven la actividad de TRRE podrían incrementar la actividad medida en el ensayo. Son posibles muchos mecanismos de promoción, incluyendo las proteínas que activan una forma de zimógeno del TRRE, las proteínas que liberan el TREE de otros componentes de la superficie de la célula, o las proteínas que estimulan la secreción del TRRE desde adentro de la célula. No es necesario entender el mecanismo para utilizar los productos de esta invención en la mayoría de las modalidades descritas. Se anticipó que varios de los clones tendrán actividad no solo para promover la segmentación del receptor de TNF, sino que también tienen un efecto sobre las proteínas superficiales. Hasta el grado que las secuencias se segmenten o las proteínas accesorias sean compartidas entre los diferentes receptores, ciertos clones podrían promover un cambio fenotípico (tal como la liberación del receptor) para la familia de los substratos relacionados. Esta descripción proporciona polipéptidos que promueven la actividad de TRRE, polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, y anticuerpos que se unen a tales polipéptidos. La unión del TNF a su receptor está mediada por un número de efectos biológicos. La segmentación del receptor de TNF por el TRRE disminuye la transducción de la señal por el TRRE. Los potenciadores de la actividad de TRRE tienen el mismo efecto. Por consiguiente, los productos de esta invención pueden ser utilizados para modular la transducción de la señal por las citocinas, lo cual es de importancia considerable en el manejo de las condiciones de la enfermedad que son afectadas por la acción de la citocina. Los productos de esta invención también pueden ser utilizados en los métodos de diagnóstico, para determinar cuando la señal de la transducción está siendo afectada inapropiadamente por la actividad de TRRE anormal. Los sistemas de ensayo descritos en esta descripción proporcionan un método para seleccionar los compuestos adicionales que pueden tener influencia en la actividad de TRRE, y por consiguiente sobre la transducción de la señal de TNF. Con base en la breve descripción de la invención, y guiado por las ilustraciones en la sección de ejemplos, una persona con experiencia en la técnica sabrá fácilmente que técnicas utilizar en la práctica de la invención. La siguiente descripción detallada es provista para conveniencia adicional del lector.

Definiciones y técnicas básicas Cuando se utilice en esta descripción, "actividad de TRRE" se refiere a la capacidad de una composición para segmentarse y liberar los receptores de TNF desde la superficie de las células que las expresan. Un ensayo preferido es la segmentación de las células COS-1 transfectadas como se describió en el Ejemplo 1. Sin embargo, la actividad de TRRE puede ser medida sobre cualesquiera células que lleven los receptores de TNF del tamaño de 55 kDa y de 75 kDa. Otras características de la enzima de TRRE obtenidas de la inducción del PMA de las células de THP-1 (ejemplificadas en el Ejemplo 2) no necesitan ser una propiedad de la actividad de TRRE medida en el ensayo. La actividad unitaria del TRRE está definida como 1 pg del TNF-R de p75 soluble liberado de la superficie de la célula en un ensayo estándar, después de la corrección de la liberación espontánea. La medición de la actividad de TRRE es explicada adicionalmente en el Ejemplo 1. Un "modulador de TRRE" es un compuesto que tiene la propiedad ya sea de incrementar o de reducir - la actividad de TRRE para procesar el TNF sobre la superficie de las células. Aquellos que incrementan la actividad de TRRE pueden ser referidos como promotores de TRRE, y aquellos que reducen la actividad de TRRE pueden ser referidos como inhibidores de TRRE. Los promotores de TRRE incluyen los compuestos que tienen actividad proteolítica para el TNF-R, y los compuestos que aumentan la actividad de las proteasas de TNF-R. Los nueve clones de polinucleótidos descritos en el Ejemplo 5, y sus productos de la proteína, son promotores de TRRE ejemplares. Los inhibidores de la actividad de TRRE pueden ser obtenidos utilizando los ensayos de selección descritos posteriormente. El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de los nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden desempeñar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, (ARNm) , ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender los nucleótidos modificados, tales como los nucleótidos metilados y los análogos de los . nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones a la estructura de los nucleótidos pueden ser impartidas antes o después ' del montaje del polímero. El término polinucleótido se refiere intercambiablemente a las moléculas de una sola hebra y de dos hebras. A menos que se especifique o se requiera de otra manera, cualquier modalidad de la invención descrita aquí es un polinucleótido que abarca ambas formas de doble hebra, y cada una de las dos formas de una sola hebra complementarias que se sabe o que se predice que componen la forma de doble hebra. "Hibridación" se refiere a una reacción en la cual uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que es estabilizado por medio de la unión del hidrógeno entre las bases de los residuos de los nucleótidos. Las reacciones de la hibridación pueden ser efectuadas bajo condiciones diferentes de "exigencia". Las condiciones relevantes incluyen la temperatura, la fuerza iónica, y la presencia de solutos adicionales en la mezcla de la reacción tales como la formamida. Las condiciones de incremento de la exigencia o las características estrictas son de 30 °C en 10X SSC (0.15M NaCl, 15 mM solución amortiguadora de citrato); 40 °C, en 6X SSC; 50 °C en 6.X SSC 60 °C. en 6X SSC, o a aproximadamente 40 °C. en 0.5X SSC, o a aproximadamente 30 °C. en 6.X. SSC que contiene 50% de formamida. El SDS y una fuente del ADN fragmentada (tal como el esperma de salmón) también están presentes típicamente durante la hibridación. Unas características estrictas más elevadas requieren un mínimo más elevado de capacidad de complemento entre los elementos de hibridación para que se forme un complejo de hibridación estable. Véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989) .

Se sobreentiende que las bases nitrogenadas de purina y pirimidina con estructuras similares pueden ser equivalentes funcionalmente en términos de la formación de parejas base de Watson-Crick; y la substitución interna de las bases nitrogenadas semejantes, particularmente uracilo y timina, o la modificación de las bases nitrogenadas, tales como por metilación, no constituyen una substitución del material. El porcentaje de identidad de la secuencia para los polinucleótidos o polipéptidos es calculada alineando las secuencias que son comparadas, y luego contando el número de residuos compartidos en cada posición alineada. Ninguna penalidad es impuesta para verificar la presencia de las inserciones o deleciones, sino que están permitidas solamente en donde se requiera para acomodar un número incrementado obviamente de residuos de aminoácidos en una de las secuencias que están siendo alineadas. Cuando una de las secuencias es comparada, que está indicada como que es "consecutiva", entonces ningún hueco es permitido en esta secuencia durante. la comparación. El porcentaje de identidad se da en términos de los residuos en la secuencia de prueba que son idénticas a los residuos en la secuencia de comparación o referencia. Cuando se utilice aquí, la "expresión" de un polinucleótido se refiere a la producción de una transcripción del ARN. La traducción subsiguiente en la proteína u otros compuestos efectores también puede ocurrir, pero no es requerida a menos que esté especificado. "Alteración genética" se refiere a un proceso en donde un elemento genético es introducido en una célula de manera diferente que por mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo con respecto a la célula, o puede ser una copia adicional o una versión mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alternación genética puede ser efectuada, por ejemplo, por la transducción de una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido por medio de cualquier proceso conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación con fosfato de calcio, o la puesta en contacto con un complejo de polinucleótidos-liposomas. La alteración genética también puede ser efectuada, por ejemplo, por transducción o infección con un virus de ADN o de ARN o un vector viral. Es preferible que la alteración genética sea heredable por la progenie de la célula, pero esto no es requerido generalmente a menos que sea especificado. Los términos "polipéptido, "péptido" y "proteína" son utilizados intercambiablemente aquí para referirse a los polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, el mismo puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por elementos diferentes de los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, la formación de enlaces de disulfuro, la glicosilación, la lipidación, la acetilación, la fosforilación, o cualquier otra manipulación, tal como la conjugación con un componente de etiquetación. Un "polipéptido de fusión" es un polipéptido que comprende las regiones en una posición diferente en la secuencia que está presente en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en las proteínas separadas y son llevadas conjuntamente en el polipéptido de fusión; los mismos pueden existir normalmente en la misma proteína pero son colocados en un nuevo arreglo en el polipéptido de fusión; o los mismos pueden ser arreglados sintéticamente. Un "fragmento equivalente funcionalmente" de un polipéptido, varía de la secuencia natural por la adición, deleción, o substitución de los residuos de aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos, mientras que se preserva una propiedad funcional del fragmento relevante con respecto al contexto en el cual el mismo está siendo utilizado. Los péptidos de fusión y los fragmentos equivalentes funcionalmente están incluidos en la definición de los polipéptidos utilizados en esta descripción.

Se entiende que el pliegue y la función biológica de las proteínas puede acomodar las inserciones, las deleciones, y las substituciones en la secuencia de aminoácidos. Algunas substituciones de aminoácidos son toleradas más fácilmente. Por ejemplo, la substitución de un aminoácido con las cadenas laterales hidrofóbicas, las cadenas laterales aromáticas, las cadenas laterales polares, las cadenas laterales con una carga positiva o negativa, o las cadenas laterales que comprenden dos o una cantidad más pequeña de átomos de carbono, por otro aminoácido con una cadena lateral de propiedades semejantes, puede ocurrir sin alteración de la identidad esencial de las dos secuencias. Los métodos para determinar las regiones homologas y la marcación del grado de homología se describen en Altschul y colaboradores, Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986; y Henikoff y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915-10919, 1992. Las substituciones que preservan la funcionalidad del polipéptido, o que confieren una propiedad nueva y benéfica (tales como una actividad mejorada, estabilidad, o inmunogenicidad reducida) son preferidos especialmente. Un "anticuerpo" (utilizado intercambiablemente en la forma plural) es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a un blanco u objetivo, tal como un polipéptido, por medio de al menos un sitio de reconocimiento del antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Cuando se utilice aquí, el término abarca no solamente los anticuerpos intactos, sino también los equivalentes de los anticuerpos que incluyen al menos un sitio de combinación del antígeno de la especificidad deseada. Estos incluyen pero no están limitados a los anticuerpos de los fragmentos enzimáticos o producidos recombinantemente, las proteínas de la fusión, los anticuerpos humanizados, las regiones variables de una sola cadena, los diacuerpos, y las cadenas de anticuerpos que padecen un montaje o ensamble inducido por los antígenos. Un polinucléotido, polipéptido, proteína, anticuerpo, u otra substancias "aislada", se refiere a la preparación de la substancia desprovista de al menos alguno de los otros componentes que también puede estar presente en donde la substancia o una substancia similar está presente naturalmente o es obtenida inicialmente a partir de ésta. Así, por ejemplo, una substancia aislada puede ser preparada utilizando una técnica de purificación para enriquecerla desde una mezcla fuente. El enriquecimiento puede ser medido sobre una base absoluta, tal como el peso en volumen de la solución, o puede ser medido con relación a una segunda substancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente. Los enriquecimientos crecientes de las modalidades de esta invención son preferidas cada vez más. Así, por ejemplo, se prefiere un enriquecimiento de 2 veces, un enriquecimiento de 10 veces es más preferido, un enriquecimiento de 100 veces es más preferido, un enriquecimiento de 1000 veces es aún más preferido. Una substancia también puede ser provista en un estado aislado por un proceso de montaje o ensamble artificial, tal como por síntesis química o expresión recombinante. Una "célula huésped" es una célula la cual ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser transformada, por la administración de un polinucléotido exógeno. El término "muestra clínica abarca" una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y útiles en un procedimiento in vitro, tal como una prueba de diagnóstico. La definición abarca las muestras de tejidos sólidos obtenidas como una remoción quirúrgica, un espécimen de patología, o un espécimen de biopsia, las células obtenidas de un sujeto clínico o su progenie obtenidas del cultivo, las muestras líquidas tales como la sangre, el suero, el plasma, el fluido espinal, y la orina, y cualesquiera fracciones o extractos de tales muestras que contienen una indicación potencial de la enfermedad. A menos que se indique de otra manera, la práctica de la invención empleará las técnicas convencionales de la biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas son explicadas en la literatura estándar, tales como: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989), "Oligonucleotide Synthsis" (M. J. Gait, ed., 1984), "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); las series "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, Eds.), "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987), "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel y colaboradores, eds., 1987); y "Current Protocols in Molecular Biology" (J. E. Coligan y colaboradores, eds., 1991) . El lector también puede elegir dirigirse a una solicitud de patente previa que refiere al TRRE, Solicitud de Patente Internacional WO 98020140. Para los propósitos de proseguimiento en los Estados Unidos de América, y en otras jurisdicciones en donde sea permitido, todas las patentes, las solicitudes de patente, los artículos y publicaciones indicados en cualquier lugar en esta descripción, son incorporados aquí para referencia en su totalidad.

Polinucleótidos Los polinucleótidos de esta invención pueden ser preparados por cualquier' técnica adecuada en el arte. Utilizando los datos provistos en esta descripción, las secuencias de menos de ~50 pares base son preparadas convenientemente por síntesis química, ya sea por medio de un servicio comercial o por un método sintético conocido, tal como el método del triéster o el método del fosfito. Un método preferido es una síntesis en fase sólida utilizando unidades de acoplamiento de la fosforamidita del aminonucleósido (Hirose y colaboradores, Tetra. Lett. 19:2449-2452, 1978; Patente U.S. No. 4,415,732). Para su uso en la terapia antisentido, los polinucleótidos pueden ser preparados por la química que produce preparaciones farmacéuticas más estables. Los ejemplos no limitativos incluyen los nucleósidos derivados del tiol (Patente U.S. No. 5,578,718), y los oligonucleótidos con esqueletos modificados (Patentes U.S. Nos. 5,541,307 y 5,378,825). Los polinucleótidos de esta invención también pueden ser obtenidos por amplificación por PCR de un molde con la secuencia deseada. Los cebadores de oligonucleótidos que se extienden a la secuencia deseada son recocidos hasta un molde, alargados por una polimerasa del ADN, y luego fundidos a temperatura más elevada de modo que el molde y los oligonucleótidos alargados se disocien. El ciclo es repetido hasta que se obtiene la cantidad deseada del polinucleótido amplificado (Patentes U.S. Nos. 4,683,195 y 4,683,202). Los moldes adecuados incluyen la biblioteca de las células T de Jurkat y otras bibliotecas de expresión humana o animal que contienen las secuencias de codificación del modulador de TRRE. La biblioteca de la célula T de Jurkat está disponible del American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110, E.U.A. (ATCC #TIB-152) . Las mutaciones y otras adaptaciones pueden ser efectuadas durante la amplificación por el diseño de los cebadores adecuados, o pueden ser incorporadas después de esto por empalme genético. Las cantidades a la escala de producción de los polinucleótidos grandes son obtenidas más convenientemente insertando la secuencia deseada en un vector de clonación adecuado y reproduciendo el clon. Las técnicas para la clonación de los nucleótidos se dan en Sambrook, Fritsch & Maniatis (supra) y en la Patente U.S. No. 5,552,524. Los métodos de clonación y expresión ejemplares son ilustrados en el Ejemplo 6. Las secuencias de los polinucleótidos preferidas son 50%, 70%, 80%, 90%, o 100% idénticas a una de las secuencias ejemplificadas en esta descripción; en este orden de preferencia creciente. La longitud de los residuos consecutivos en la secuencia idéntica u homologa comparada con la secuencia ejemplar puede ser de aproximadamente 15, 30, 50, 75, 100, 200 o 500 residuos en este orden de preferencia creciente, hasta la longitud del clon completo. Los cambios de los nucleótidos que provocan una substitución conservadora o que tienen la función del polipéptido codificado (en términos de las propiedades de hibridación o de lo que es codificado) son preferidos, especialmente las substituciones. Los polinucleótidos de estos pueden ser utilizados para medir la actividad de TRRE alterada en una muestra de la célula o de tejido. Esto involucra poner en contacto la muestra con el polinucleótido bajo condiciones que permiten que el polinucleótido se hibridice específicamente con el ácido nucleico que codifica • un modulador de la actividad de TRRE, si está presente en la muestra, y que determina el polinucleótido que ha sido hibridizado como un resultado del paso a) . La especificidad de la prueba puede ser provista en una de varias maneras. Un método involucra el uso de una sonda específica - un polinucleótido de esta invención con una secuencia lo suficientemente grande y de identidad suficiente con respecto a la secuencia que es detectada, de modo que el mismo se una al blanco y no a otro ácido nucleico que podría estar presente en la muestra. La sonda típicamente es etiquetada (ya sea directamente o a través de un reactivo secundario) de modo que la misma pueda ser detectada subsiguientemente. Las etiquetas adecuadas incluyen 32P y 33P, los reactivos quimioluminiscente y fluorescente. Después de la reacción de hibridación, la sonda que no reaccionó es retirada por lavado de modo que la cantidad de la sonda hibridizada pueda ser determinada. La señal puede ser amplificada utilizando las sondas ramificadas (Patente U.S. No. 5,124,246). En otro método, el polinucleótido es un cebador para una reacción de PCR. La especificidad es provista por la capacidad de las sondas ubicadas por parejas para amplificar la secuencia de interés. Después de un número adecuado de ciclos de PCR, la cantidad del producto de amplificación presente se correlaciona con la cantidad de la secuencia de blanco u objetivo presente originalmente en la muestra. Tales pruebas son útiles tanto en la investigación, como en el diagnóstico o la evaluación de una condición de la enfermedad. Por ejemplo, la actividad de TNF desempeña un papel en la eliminación de las células tumorígenas (Ejemplo 4), y un cáncer puede evadir el proceso de eliminación activando la actividad de TRRE en el tejido deseado. Por consiguiente, bajo algunas condiciones, la expresión elevada de los moduladores de TRRE puede correlacionarse con la progresión del cáncer. Las pruebas de diagnóstico también son de uso en la terapia de verificación, tal como cuando la terapia de los genes es efectuada para incrementar la actividad de TRRE. Los polinucleótidos de esta invención también pueden ser utilizados para la producción de los polipéptidos y para la preparación de medicamentos, como se explica posteriormente.

Polipéptidos Los polipéptidos cortos de esta invención pueden ser preparados por la sínteis química en fase sólida. Los principios de la síntesis química en fase sólida pueden ser encontrados en Dugas & Penney, Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag NY pp. 54-92 (1981), y Patente U.S. No. 4,493,795. La síntesis del péptido en fase sólida, automatizada, puede ser efectuada utilizando los dispositivos tales como el sintetizador de péptidos PE-Applied Biosystems 430A (disponible comercialmente de Applied Biosystems, Foster City CA) . Los polipéptidos más largos son obtenidos convenientemente por la clonación de la expresión. Un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado está enlazado operativamente a los elementos de control para la transcripción y la traducción, y luego transfectados en una célula huésped adecuada. La expresión puede ser efectuada en los procariotas tales como E. coli (Acceso del ATCC No. 31446 o 27325), los microorganismos eucarióticos tales como el Saccharomyces cerevisiae de la levadura, o los eucariotas más elevados, tales como las células de insectos o de mamíferos. Un número de sistemas de expresión se describen en la Patente U.S. No. 5,552,524. La clonación de la expresión está disponible de servicios comerciales tales como Lark Technologies, Houston TX. La producción de la proteína a partir de los 4 clones ejemplares de esta invención en las células de los insectos es ilustrada en el Ejemplo 6. La proteína es purificada a partir de la célula huésped productora por los métodos estándares en la química de las proteínas, tales como la cromatografía de afinidad y CLAR. Los productos de la expresión son producidos opcionalmente con una etiqueta de la secuencia para facilitar la purificación por afinidad, los cuales pueden ser removidos subsiguientemente. Las secuencias preferidas son del 40%, 60%, 80%, 90%, o 100% idénticas con una de las secuencias ejemplificadas en esta descripción; en este orden de preferencia creciente. La longitud de la secuencia idéntica u homologa comparada con el polinucleótido humano natural puede ser de aproximadamente 7, 10, 15, 20, 30, 50 o 100 residuos en este orden de preferencia creciente, hasta la longitud de la región de codificación completa. Los polipéptidos pueden ser probados para verificar su capacidad para modular el TRRE en un ensayo de segmentación de TNF-R. El polipéptido se pone en contacto con el receptor (expresado preferentemente sobre la superficie de una célula, tal como una célula C75), y la capacidad del polipéptido de incrementar o reducir la segmentación del receptor y la liberación, es determinada. La segmentación de TNF-R por los polipéptidos ejemplares de esta invención es ilustrada en el Ejemplo 7. Los polipéptidos de esta invención pueden ser utilizados como inmunógenos para elevar la concentración de los anticuerpos. Las proteínas grandes harán surgir una mezcla de anticuerpos, mientras que los fragmentos de péptidos cortos harán surgir anticuerpos contra una región pequeña de la proteína intacta. Los clones de los anticuerpos pueden ser mapeados o se les asignan coordenadas para el sitio de unión de la proteína produciendo péptidos de superposición corta de aproximadamente 10 aminoácidos de longitud. Los péptidos de superposición pueden ser preparados sobre un soporte de la membrana de nilón por la química de F-Moc estándar, utilizando un juego o conjunto de SPOTS® de Genosys de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los polipéptidos de esta invención también pueden ser utilizados para efectuar la transducción de la señal de TNF, como se explicará posteriormente.

Anticuerpos Los anticuerpos policlonales pueden ser preparados por la inyección de una vértebra con un polipéptido de esta invención en una forma inmunogénica. La inmunogenicidad de un polipéptido puede ser mejorada por el enlace a un portador tal como el KLH, o la combinación con un auxiliar, tal como el auxiliar de Freund. Típicamente, una inyección de cebadura es seguida por una inyección de refuerzo después de aproximadamente 4 semanas, y el antisuero es colectado una semana más tarde. La reacción cruzada de actividad indeseable con otros antígenos, si esta presente, puede ser eliminada, por ejemplo, haciendo correr la preparación sobre los adsorbentes hechos de estos antígenos fijados a una fase sólida, y colectando la fracción no unida. Si se desea, la actividad de anticuerpo específica puede ser purificada adicionalmente por una combinación de técnicas, las cuales pueden incluir la cromatografía de la proteína A, la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de intercambio iónico, la CLAR, y la cromatografía de inmunoafinidad utilizando el polipéptido de inmunización acoplado a un soporte sólido. Los fragmentos de anticuerpos y otros derivados pueden ser preparados por métodos inmunoquímicos estándares, tales como someter el anticuerpo a segmentación con enzimas tales como la papaína o la pepsina. La producción de los anticuerpos monoclonales se describe en referencias estándares tales como Harrow & Lañe (1988), las Patentes U.S. Nos. 4,491,632, 4,472,500 y 4,444,887, y Methods in Enzimology 73B:3 (1981). Brevemente, un mamífero es inmunizado, y las células productoras de los anticuerpos (usualmente los esplenocitos) son colectadas. Las células son inmortalizadas por la fusión con un mieloma no productor, la transfección con el Virus de Epstein Barr, o la transformación con el ADN oncogénico. Las células tratadas son clonadas y cultivadas, y se seleccionan los clones que producen anticuerpos de la especificidad deseada. Otros métodos de obtención de las moléculas de los anticuerpos específicas (de manera óptima en la forma de las regiones variables de una sola cadena) involucran poner en contacto una biblioteca de las células inmunocompetentes o partículas virales con el antígeno de blanco u objetivo, y hacer crecer externamente los clones seleccionados positivamente. El fago inmunocompetente puede ser construido para expresar los segmentos de la región variable de la inmunoglobulina sobre su superficie. Véase Marks y colaboradores, New Eng. J. Med. 335:730, 1996, las Solicitudes de Patentes Internacionales WO 9413804, WO 9201047, WO 90 02809, y McGuinness y colaboradores, Nature Biotechnol. 14:1449, 1996. Los anticuerpos de esta invención pueden ser utilizados en inmunoensayos para los moduladores de TRRE. Las técnicas generales del inmunoensayo pueden ser encontradas en "The Immunoassay Handbook", Stockton Press NY, 1994; y "Methods of Immunological Analysis", Weinheim: VCH Verlargs gessellschaft mbH, 1993) . El anticuerpo es combinado con una muestra de prueba bajo condiciones en donde el anticuerpo se unirá específicamente a cualquier modulador que podría estar presente, pero no a cualesquiera otras proteínas unibles que van a estar en la muestra. El complejo formado puede ser medido in situ (Patentes U.S. Nos. 4,208,479 y 4,708,929), o separándolo físicamente de los reactivos que no reaccionaron (Patente U.S. No. 3,646,346). Los ensayos de separación involucraron típicamente el reactivo de TRRE etiquetado (ensayo de competición), o el anticuerpo etiquetado (ensayo de intercalación) para facilitar la detección y la cuantificación del complejo. Las etiquetas adecuadas son los radioisótopos tales como 125I, las enzimas tales como la ß-galactosidasa, y las etiquetas fluorescentes tales como la fluorosceína. Los anticuerpos de esta invención también pueden ser utilizados para detectar los moduladores de TRRE en las secciones fijas del tejido por inmunohistología. El anticuerpo se pone en contacto con el tejido, el anticuerpo que no reaccionó se retira por lavado, y luego el anticuerpo unido es detectado - típicamente utilizando un reactivo de anti-inmunoglobulina etiquetado. La inmunohistología mostrará no solamente si el modulador está presente, sino en donde está localizado en el tejido. La detección de los moduladores de TRRE es de interés para los propósitos de investigación, y para uso clínico. Como se indicó al principio, la expresión elevada de los moduladores de TRRE puede correlacionarse con la progresión del cáncer. Las pruebas de diagnóstico también son de uso en la verificación de los moduladores de TRRE que son administrados en el curso de la terapia. Los anticuerpos de esta invención también pueden ser utilizados para la preparación de los medicamentos. Los anticuerpos con el potencial terapéutico incluyen aquellos que afectan la actividad de TRRE - ya sea promoviendo el despeje de un modulador de TRRE, o por el bloqueo de su acción fisiológica. Los anticuerpos pueden ser seleccionados para verificar su actividad deseable de acuerdo con los ensayos descritos en la siguiente sección.

Ensayos de Selección inmunoensayo del sobrenadante para verificar el receptor liberado (ejemplo 1) . El ensayo de selección es conducido poniendo en contacto las células que expresan el TRRE y el TNF-R con los polinucleótidos que van a ser seleccionados. El efecto del polinucleótido sobre la liberación enzimática del TNF-R desde la célula es determinado, y los polinucleótidos con la actividad deseable (ya sea que promueven o inhiben la actividad del TRRE) son seleccionados. En una variación de este método, las células que expresan la actividad del TRRE pero no del TNF-R (tales como las células COS-1 no transfectadas) se ponen en contacto con el polinucleótido de prueba. Luego el medio de cultivo es colectado, y utilizado para evaluar la actividad de TRRE utilizando un segundo TNF-R de expresión de la célula (tales como las células C75) . Este tipo de ensayo de selección es útil para la selección de los polinucleótidos desde una biblioteca de expresión que se cree que contiene las secuencias de codificación para los moduladores de TRRE. La biblioteca de expresión de las células de Jurkat (Acceso del ATCC No. TIB-152) es ejemplar. Otras células a partir de las cuales las bibliotecas adecuadas pueden ser construidas son aquellas que se sabe que expresan niveles elevados del TRRE, especialmente después de la estimulación del PMA, tales como THP-1, U-937, HL-60, ME-180, MRC-5, Raji, K-652, y los monocitos humanos normales. La selección involucra la expresión del ADN desde la biblioteca en la línea celular seleccionada que es utilizada para la sección. Las cavidades con la actividad deseada son seleccionadas, y el ADN es recuperado, opcionalmente después de la replicación o clonación de las células. Los ciclos repetidos de filtración y selección funcional pueden conducir a la identificación de nuevos clones de polinucleótidos que promueven o inhiben su actividad de TRRE. Esto es ilustrado posteriormente en el Ejemplo 5. Se pueden efectuar experimentos adicionales sobre los polinucleótidos seleccionados para determinar si modulan la actividad de TRRE dentro de la célula, o a través de la acción de un producto de la proteína. Un marco de lectura abierta largo sugiere un papel para un producto de la proteína, y el examen de la secuencia de aminoácidos para un péptido de la señal y una región de extensión de la membrana puede ayudar a determinar si la proteína es secretada desde la célula o expresada en la membrana superficial. Este tipo de selección también es útil para el desarrollo adicional de los polinucleótidos de esta invención. Las construcciones de la expresión, por ejemplo, pueden ser desarrolladas, las cuales codifican los fragmentos de los péptidos funcionales, las proteínas de la fusión, y otras variantes. El tamaño mínimo de la secuencia de polinucleótidos que todavía codifica la actividad de modulación del TRRE puede ser determinada removiendo parte de la secuencia y luego utilizando el ensayo de selección para determinar si la actividad todavía está presente. Las secuencias mutada y extendida pueden ser probadas de la misma manera. Este tipo de ensayo de selección también es útil para desarrollar compuestos que afectan la actividad de TRRE por la interferencia con el ARNm que codifica un modulador de TRRE. Son de interés particular los ribozimas y los oligonucleótidos de antisentido. Los ribozimas son endorribonucleasas que catalizan la segmentación del ARN en un sitio específico. Los mismos comprenden una secuencia de polinucléotidos que es complementaria con el sitio de segmentación sobre el blanco u objetivo, y la secuencia adicional que provee la estructura terciaria para efectuar la segmentación. La construcción de los ribozimas se describe en las Patentes U.S. Nos. 4,987,071 y 5,591,610. Los oligonucleótidos antisentido que se unen al ARNm comprenden una secuencia corta complementaria con el ARNm (típicamente de 8-25 bases de longitud) . La química preferida para la construcción de los oligonucleótidos antisentido es descrita en una sección previa. La especificidad es provista tanto por la secuencia complementaria, como por las características de la estructura química. Las moléculas antisentido que inhiben la expresión de los receptores de la superficie celular se describen en las Patentes U.S. Nos. 5,135,917 como 5,789,573. La selección o filtración involucra poner en contacto la célula que expresa la actividad del TRRE como de TNF-R con el compuesto y determinar el efecto sobre la liberación del receptor. Los ribozimas y las moléculas antisentido efectivas para la alteración de la expresión de un promotor de TRRE deben incrementar la liberación de TNF-R. Los ribozimas y las moléculas antisentido efectivas para alterar la expresión de un inhibidor de TRRE podrían incrementar la liberación del TNF-R. Otro método de selección descrito en esta descripción es para probar la capacidad de los polipéptidos para modular la actividad de TRRE (Ejemplo 7) . Las células que expresan tanto el TNF-R como un nivel moderado de actividad de TRRE se ponen en contacto con los polipéptidos de prueba, y la velocidad de la liberación del receptor es comparada con la velocidad de la liberación espontánea. Una velocidad incrementada de liberación indica que el polipéptido es un promotor de TRRE, mientras que una velocidad reducida indica que el polipéptido es un inhibidor de TRRE. Este ensayo puede ser utilizado para probar la actividad de los nuevos polipéptidos, y desarrolla variantes de los polipéptidos que ya se sabe que modulan el TRRE. El tamaño mínimo de la secuencia de polipéptidos que todavía codifica la actividad de modulación de TRRE puede ser determinada fabricando o haciendo un fragmento más pequeño del polipéptido y luego utilizando el ensayo de selección o filtración para determinar si la actividad todavía está presente. Las secuencias mutada y extendida pueden ser probadas de la misma manera. Otro método de selección en el cual toma cuerpo esta invención es un método para seleccionar las substancias que interfieren con la acción de un modulador de TRRE al nivel de la proteína. El método involucra la incubación de las células que expresan el receptor de TNF (tales como las células C75R) con un polipéptido de esta invención que tiene la actividad promotora del TNF. Existen dos opciones para proveer el modulador de TRRE de esta manera. En una opción, el polipéptido es agregado al medio de las células como un reactivo, en compañía de la substancia que va a ser probada. En otra opción, las células son alteradas genéticamente para expresar el modulador de TRRE a un nivel elevado, y el ensayo requiere solamente que la substancia de prueba sea puesta en contacto con las células. Esta opción permite una selección o filtración de rendimiento elevado de un número de compuestos de prueba. De cualquiera manera, la velocidad de la liberación del receptor es comparada en la presencia y ausencia de la substancia de prueba, para identificar los compuestos que mejoran o disminuyen la actividad de TRRE. Se deben llevar a cabo experimentos paralelos en los cuales la actividad de la substancia sobre la extensión del receptor es probada en la ausencia de los polipéptidos agregados (utilizado células que no expresan el polipéptido) . Esto determinará si la actividad de la substancia de prueba ocurre por medio de un efecto sobre el promotor de TRRE que es agregado, o a través de algún otro mecanismo. Este tipo de ensayo de selección es útil para identificar los anticuerpos que afectan la actividad de un modulador de TRRE. Los anticuerpos son alistados contra un modulador de TRRE como se describió en la sección previa. Si el anticuerpo disminuye su actividad de TRRE en el ensayo de selección o filtración, entonces el mismo tiene un potencial terapéutico para reducir la actividad de TRRE inferior in vivo. La selección o tamización de los anticuerpos monoclonales utilizando este ensayo también puede ayudar a identificar la unión o los sitios catalíticos en el polipéptido.

Este tipo de ensayo de selección o filtración también es útil para una selección o filtración de rendimiento elevado de los compuestos de moléculas pequeñas que tienen la capacidad de afectar el nivel de los receptores de TNF sobre una célula, por medio de su influencia sobre un modulador de TRRE. Los compuestos de moléculas pequeñas que tienen la actividad deseada son preferidos frecuentemente para las composiciones farmacéuticas, a causa de que los mismos son frecuentemente más estables y menos costosos de producir.

Medicamentos y su uso Como se describió al inicio, una utilidad de ciertos productos en los cuales toma cuerpo esta invención, es afectar la transducción de la señal de las citocinas (particularmente el TNF) . Los productos que promueven la actividad de TRRE tienen el efecto de incrementar los receptores de TNF sobre las superficies de las células, lo cual podría reducir la transducción de la señal desde el TNF. Por el contrario, los productos que inhiben la actividad de TRRE previenen la segmentación de los receptores de TNF, incrementado la transducción de la señal.

La capacidad de afectar la transducción de la señal de TNF es de interés considerable en el manejo de las condiciones clínicas en las cuales la señalización de TNF contribuye a la patología de la condición. Tales condiciones incluyen: -i Falla Cardiaca. La IL-lß y el TNF se cree que van a ser mediadores centrales para perpetuar el proceso inflamatorio, reclutando y activando las células inflamatorias. La inflamación reduce la función cardiaca en la falla congestiva del corazón, el rechazo de los trasplantes, la miocarditis, la sepsis, y el choque por quemaduras. M Caquexia. El ayuno y la pérdida de peso general que ocurren en el curso de las enfermedades crónicas, tales como el cáncer. El TNF se cree que afecta el apetito, el consumo de la energía, y el ritmo metabólico. -i Enfermedad de Crohn. El proceso inflamatorio mediado por el TNF conduce al engrosamiento de la pared del intestino, resultante del linfedema e infiltración linfocítica. M Choque endotóxico. El choque inducido por la liberación de las endotoxinas desde las bacterias gram-negativas, tales como E. coli, involucra la inflamación mediada por el TNF.

• Artritis. El TNF promueve la expresión de la óxido nítrico sintetasa, que se cree que va a estar involucrada en la patogénesis de la enfermedad. Otras condiciones de interés son la esclerosis múltiple, la sepsis, la inflamación ocasionada por la infección de los microbios, y las enfermedades que tienen una etiología autoinmune, tales como la Diabetes del Tipo I. Los polipéptidos de esta invención que promueven la actividad de TRRE pueden ser administrados con el objetivo de reducir o normalizar la transducción de la señal de TNF. Por ejemplo, en la falla congestiva del corazón o enfermedad de Crohn, el polipéptido se proporciona a intervalos regulares para reducir las secuelas inflamatorias. El tratamiento es opcionalmente en combinación con otros agentes que afectan la señal • de transducción del TNF (tales como los anticuerpos para el TNF o los antagonistas receptores) o que reducen la extensión de la inflamación de otras maneras. Los polinucleótidos de esta invención también pueden ser utilizados para promover la actividad de TRRE por la terapia del gen. La secuencia de codificación está enlazada operativamente para controlar los elementos para la transcripción y la traducción en las células humanas. Los mismos son provistos entonces en una forma que promoverá la entrada y la expresión de la secuencia de codificación en las células en el sitio de la enfermedad. Las formas adecuadas para la inyección local incluyen el ADN puro, los polinucleótidos empacados con lípidos catiónicos, y los polinucleótidos en la forma de los vectores virales (tales como las construcciones del adenovirus y de AAV) . Los métodos de la terapia del gen conocidos por aquellos expertos en la técnica incluirán aquellos descritos en las Patentes U.S. Nos. 5,399,346, 5,827,703, y 5,866,696. La capacidad para afectar la transducción de la señal de TNF también es de interés en donde el ADN se piensa que desempeña un papel benéfico en la resolución de la enfermedad. En particular, el TNF desempeña un papel benéfico en la necrotización de los tumores sólidos. En consecuencia, los productos de esta invención pueden ser administrados a los pacientes con cáncer para inhibir la actividad de TRRE, por lo cual se incrementa la transducción de la señal de TNF y se mejoran los efectos benéficos. Las modalidades de la invención que inhiben la actividad de TRRE incluyen los polinucleótidos antisentido. Un método para conferir una actividad inhibidora a largo plazo es administrar la terapia genética de antisentido. Una construcción genética es diseñada la cual expresará el ARN dentro de la célula lo cual a su vez reducirá la transcripción del gen de blanco u objetivo (Patente U.S. No. 5,759,829). En los seres humanos, una forma más frecuente de la terapia antisentido es administrar la molécula antisentido efectora directamente, en la forma de un fragmento de polinucleótido estable corto que es complementario con un segmento del ARNm de blanco u objetivo (Patentes U.S. Nos. 5,135,917 y 5,789,573) - en este caso, la transcripción que codifica el modulador de TRRE. Otra modalidad de la invención que inhibe el TRRE son los ribozimas, construidos como se describió en una sección previa. La función de los ribozimas en la inhibición de la traducción del ARNm es descrita en las Patentes U.S. Nos. 4,987,071 y 5,591,610. Una vez que se encuentra que un producto de esta invención tiene una actividad de modulación del TRRE adecuada en los ensayos in vitro descritos en esta descripción, es preferible también probar su efectividad en una modelo animal de un proceso de enfermedad mediado por el TNF. El ejemplo 3 describe un modelo de LPS para la sepsis que puede ser utilizado para probar los promotores de la actividad de TRRE. El ejemplo 4 describe un modelo de necrosis del tumor, en el cual los inhibidores de TRRE podrían ser probados para verificar su capacidad para mejorar la actividad necrotizante. Aquellos expertos en la técnica sabrán de otros modelos de animales adecuados para probar los efectos sobre la transducción de la señal de TNF o sobre la inflamación. Otras ilustraciones son los modelos de reperfusión de la isquemia cardiaca de Weyrich y colaboradores (J. Clin. Invest. 91:2620, 1993) y Garcia-Criado y colaboradores (J. Am. Coil. Surg. 181:327, 1995); el modelo de reperfusión por isquemia pulmonar de Steinberg y colaboradores (J. Hert Lung Transplant. 13: 306, 1994) , el modelo de inflamación del pulmón de la Solicitud de Patente Internacional WO 9635418; el modelo de peritonitis bacteriana de Sharar et al. (J. Immunol . 151:4982, 1993), el modelo de colitis de Meenan y colaboradores (Scand. J. Gasentrerol. 31:786, 1996), y el modelo de diabetes de von Herrath y colaboradores (J. Clin. Invest. 98:1324, 1996). Los modelos para el choque séptico son descritos en Mack y colaboradores, J. Surg. Res. 69:399, 1997; y Seljelid y colaboradores, Scand. J. Immunol. 45:683-7. Para su uso como un ingrediente activo en una preparación farmacéutica, un polipéptido, polinucleótido, o anticuerpo de esta invención es purificado generalmente apartándolo de otros componentes reactivos o potencialmente inmunogénicos presentes en la mezcla en la cual los mismos son preparados. Típicamente, cada ingrediente activo es provisto con al menos aproximadamente 90% de homogeneidad, y más preferentemente 95% o 99% de homogeneidad, como se determinó por ensayo funcional, cromatografía, o ADS electrofóresis del gel de poliacrilamida. El ingrediente activo es compuesto entonces en un medicamento de acuerdo con los procedimientos aceptados generalmente para la preparación de las preparaciones farmacéuticas, tales como las descritas en Remington' s Pharmaceutical Sciences 18/a. Edición (1990), E. W. Martin ed., Mack Publishing Co., PA. Los pasos en la composición del medicamento dependen en parte del uso propuesto y del modo de administración, y pueden incluir la esterilización, el mezclado con los excipientes y portadores no tóxicos y no interferentes, apropiados, la división en dosis unitarias, y el encierro en un dispositivo de suministro. El medicamento típicamente será empacado con información acerca de su uso propuesto. El modo de administración dependerá de la naturaleza de la condición que es tratada. Para las condiciones que se espera que requieran una dosificación moderada y que son sitios bien perfusionados (tales como una falla cardiaca) , la administración sistemática es aceptable. Por ejemplo, el medicamento puede ser formulado para administración intravenosa, inyección intramuscular, o absorción de manera sublingual o intranasal. En donde sea posible administrar el ingrediente activo localmente, esto es preferido usualmente. La administración local tanto mejorará la concentración del ingrediente activo en el sitio de la enfermedad, como minimizará los efectos sobre los receptores de TNF sobre otros tejidos no involucrados en el proceso de la enfermedad. Las condiciones que conducen por sí mismas a la administración directamente en el sitio de la enfermedad incluyen el cáncer y la artritis reumatoide. Los tumores sólidos pueden ser inyectados directamente cuando están cercanos a la piel, o cuando los mismos pueden ser alcanzados por un procedimiento endoscópico. Los ingredientes activos también pueden ser administrados a un sitio del tumor durante la resección quirúrgica, pueden ser implantados en una matriz gelatinosa o en una membrana adecuada tal como Gliadel® (Guilford Sciences) . En donde la administración directa no sea posible, la administración puede ser provista a través de una arteriola que conduzca al sitio de la enfermedad. Alternativamente, la composición farmacéutica puede ser formulada para mejorar la acumulación del ingrediente activo en el sitio de la enfermedad. Por ejemplo, el ingrediente activo puede ser encapsulado en un liposoma u otra estructura de la matriz que exhibe un anticuerpo o ligando capaz de unirse a una proteína de la superficie celular sobre la célula de blanco u objetivo. Los agentes para ubicación de un blanco, adecuados, incluyen los anticuerpos contra los antígenos del cáncer, los ligandos para los receptores específicos para el tejido (por ejemplo, la serotonina para la ubicación de un blanco pulmonar) . Para las composiciones que reducen la transducción de la señal de TNF, una molécula de ubicación de blanco apropiada puede ser el ligando de TNF, puesto que el tejido de blanco u objetivo puede exhibir de manera semejante una densidad inusualmente elevada del receptor de TNF. Las cantidades efectivas de las composiciones de la presente invención son aquellas que alteran la actividad de TRRE en al menos aproximadamente 10%, típicamente en al menos aproximadamente 25%, más preferentemente en aproximadamente 50% o 75%. En donde la ablación casi completa de la actividad de TRRE sea deseable, las composiciones preferidas disminuyen la actividad de TRRE en al menos el 90%. En donde el incremento de la actividad de TRRE sea deseable, las composiciones preferidas incrementan la actividad de TRRE en al menos 2 veces. Una cantidad efectiva mínima del compuesto activo dependerá de la enfermedad que es tratada, de cual de los moduladores de TRRE sea seleccionado para su uso, y de que si la administración será sistemática o local. Para la administración sistemática, una cantidad efectiva de la actividad generalmente será una cantidad del modulador de TRRE que puede provocar un cambio en la actividad de la enzima en 100 a 50,000 Unidades - típicamente de manera aproximada 10,000 Unidades. La cantidad en masa de la proteína, el ácido nucleico, o el anticuerpo, es elegida de acuerdo con esto, con base en la actividad específica del compuesto activo en Unidades por gramos. Los siguientes ejemplos se proveen como una guía adicional para el practicante, y no están propuestos para limitar la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Sistema de ensayo para verificar la actividad de TRRE.

Este ejemplo ilustra un sistema de ensayo que mide la actividad de TRRE sobre el TNF-R humano en su conformación natural en la membrana de la superficie celular. El TNF-R asociado con la membrana fue elegido como el substrato, porque tiene un medio ambiente similar a aquel del substrato para el TRRE in vivo. El TNF-R asociado con la membrana también requiere más actividad específica, la cual podría diferenciar las proteasas menos específicas.

Las células que expresan un nivel elevado de la forma p75 del TNF-R fueron construidas por la transfección del ADNc en las células COS-1 del mono las cuales expresan el TNF-R pequeño del tamaño ya sea de 75 kDa o de 55 kDa. El procedimiento para la construcción de estas células fue como sigue: el ADNc del p-75 TNF-R humano se clonó desde una biblioteca de ADNc ?gtlO derivada de las células U-937 monocíticas humanas (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) . Los primeros 300 pb sobre ambos extremos 5' y 3' del fragmento clonado se secuenciaron y se compararon con la secuencia de ADNc reportada del p75 TNF-R humano. La secuencia clonada fue un fragmento de 2.3 kb que cubre las posiciones 58-2380 de la secuencia de p75 TNF-R reportada, la cual abarca la longitud total de la secuencia de codificación de p75 TNF-R desde las posiciones 90-1475. El ADNc del p75 TNF-R de 2.3 kb fue subclonado entonces en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión eucariótico pCDNA3. La orientación del ADNc del p75 TNF-R se verificó por el mapeo de la endonucleasa de restricción. La Figura 1 ilustra la construcción de 7.7 kb final, pCDTR2. La misma lleva el gen de resistencia de la neomicina para la selección de las células transfectadas en G418, y la expresión del p75 TNF-R es impulsada para el promotor del citomegalovirus. El pCDTR2 fue transfectado entonces en las células COS-2 del riñon del mono (ATCC CRL-1650) utilizando el método de precipitación del ADN del fosfato de calcio. El clon seleccionado en el medio G418 se identificó y se subcultivó. A este clon se le dio la designación C75R. Para determinar el nivel de expresión del p75 TNF-R sobre las células C75R, 2 x 105 células/cavidad fueron colocadas en placas en una placa de cultivo de 24 cavidades e incubadas durante 12 a 16 horas en C02 al 5% a 37 °C. Las mismas fueron incubadas entonces con 2-30 ng del TNF recombinante humano del 125 (radioetiquetado utilizando el método de la cloramina) en la presencia o ausencia de un exceso de 100 veces del TNF humano no etiquetado a 4 °C durante 2 h. Después de tres lavados con el PBS enfriado con hielo, las células fueron usadas con NaOH O.lN y la radioactividad unida o relacionada se determinó en un contador de Pharmacia Clinigamma (Uppsala, Suecia) . La Figura 2 muestra los resultados obtenidos. El C75R tuvo un nivel muy elevado de unión específica del 125i-TNF radioetiquetado, mientras que las células COS-1 originales no lo tuvieron. El número de TNF-R expresado sobre el C75R se determinó que va a ser de 60,000-70,000 receptores por célula por el análisis de Scatchard (Figura 2, intercalada). El valor de Kd calculado fue de 5.6 x 10"10 M. Este valor de Kd estuvo estrechamente de acuerdo con los valores reportados previamente para el p75 TNF-R natural. El TRRE se obtuvo por la estimulación con PHA de las células de TPH-1 (WO 9802140) . Las células de THP-1 (ATCC 45503) que crecen en una fase logarítmica fueron colectadas y resuspendidas hasta lxlO6 células/ml del RPMI-1640 suplementado con 1% de FCS e incubado con 10"6 M PMA durante 30 minutos en C02 al 5% a 37 °C. Las células fueron colectadas y lavadas una vez con el medio libre del suero para remover el PMA y se resuspendió en el mismo volumen del RPMI-1640 con 1% de FCS. Después de 2 horas de incubación en C02 al 5% a 37 °C, la suspensión celular se colectó, se centrifugó, y el sobrenadante libre de células se colectó como la fuente de TRRE. Para medir el efecto del TRRE sobre TNF-R unido a la membrana en las construcciones de la célula de COS-1, se efectuó el siguiente experimento. Las células C75R fueron sembradas a una densidad de 2 x 105 células/cavidad en una placa de cultivo celular de 24 cavidades y se incubó durante 12 a 16 horas a 37 °C en 5% de C02. El medio en las cavidades fue aspirado, reemplazado con el medio fresco solo o con el medio de TRRE, y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. El medio fue reemplazado entonces con el medio fresco que contiene 30 ng/ml del TNF etiquetado con 125I. Después de 2 horas a 4 °C, las células fueron usadas con NaOH O.lN y el nivel de la radioactividad unida o ligada fue medido. El nivel de la unión específica del C75R por el 125I-TNF fue reducido significativamente después de la incubación con TRRE. El conteo radioactivo fue de 1,393 cpm sobre las células incubadas con TRRE comparado con 10,567 cpm sobre las células no tratadas con TRRE, una pérdida del 87% de la capacidad de unión. Para determinar el tamaño del p75 TNF-R despejado del C75R por el TRRE, se llevó a cabo el siguiente experimento. 15 x 106 células de C75R fueron sembradas en una placa de cultivo celular de 150 mm y se incubaron a 37 °C en C02 al 5% durante 12 a 16 horas. El medio de TRRE se incubó con las células C75R en la placa de 150 mm durante 30 minutos y el sobrenadante resultante se colectó y se centrifugó. La muestra concentrada se aplicó a ADS-PAGE al 10% de acrilamida y se transfirió electroforéticamente a una membrana del difluoruro de polivinilideno (Immobilon) . El inmunoteñido condujo a una banda única de 40 kDa, similar al tamaño encontrado en los fluidos biológicos. Así, las células COS-1 transfectadas, expresaron niveles elevados de a p75 TNF-R humano en una forma similar al TNF-R natural. El siguiente método de ensayo fue adoptado para la medición de rutina de la actividad de TRRE. Las células C75R y las células COS-1 fueron sembradas en placas de cultivo de 24 cavidades a una densidad de 2.5 x 105 células/ml/cavidad y se incubaron toda la noche (durante 12 a 16 horas) en C02 al 5% a 37 °C. Después de la aspiración del medio en la cavidad, 300 µl del medio de TRRE se incubaron en cada cavidad de las placas tanto de C75R como de COS-1 durante 30 minutos en C02 al 5% a 37 °C (que corresponde a A y C mencionados anteriormente, de manera respectiva) . Simultáneamente, las células C75R en las placas de 24 cavidades también fueron incubadas con 300 µl del medio fresco o solución amortiguadora. Los sobrenadantes fueron colectados, centrifugados, y luego evaluados para verificar la concentración del p75 TNF-R soluble por ELISA. El ensayo de ELISA para el TNF-R liberado (WO 9802140) se efectuó como sigue: Los anticuerpos policlonales para el p75 TNF-R humano se generaron por inmunización de los conejos hembra blancos de Nueva Zelanda (Yamamoto y colaboradores, Cell. Inmunol. 38:403-416, 1978). La fracción de IgG del suero de ratón inmunizado se purificó utilizando una columna de afinidad (Ey y colaboradores (1978) de proteína G (Pharmacie Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) Immunochemistry 15:429-436, 1978). La fracción de IgG fue etiquetada entonces con la peroxidasa del rábano picante (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Tejssen y Kurstok, Anal. Biochem. 136:451-457, 1984). En el primer paso del ensayo, 5 µg del IgG no etiquetado en 100 µl de la solución amortiguadora 0.05M (pH 9.6) se unió a una microplaca de ELISA de 96 cavidades (Corning, Corning, NY) por la incubación toda la noche a 4 °C. Las cavidades individuales fueron lavadas tres veces con 300 µl de Tween-20 al 0.2% en la solución salada amortiguada con fosfato (PBS) . Los 100 µl de las muestras y los estándares del receptor recombinante fueron agregados a cada cavidad y se incubaron a 37 °C durante 1 a 2 horas. Las cavidades fueron lavadas entonces de la misma manera, se agregaron 100 µl del IgG etiquetado con peroxidasa de rábano picante y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. las cavidades fueron lavadas una vez más y el color fue desarrollado durante 20 minutos (min) a temperatura ambiente con los substratos ABTS (Pierce, Rockford, IL) y 30% H202 (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) . El desarrollo del color se midió a 405 nm. Cuando las células de C75R fueron incubadas con el medio de TRRE, el p75 TNF-R soluble fue liberado en el sobrenadante el cual se puede medir por ELISA. La cantidad de los receptores liberada correspondió a la cantidad de TRRE agregada. También existió un nivel de liberación de TNF-R espontánea en las células de C75R incubadas de manera única solo con el medio. Se tiene la hipótesis de que esto se debe a una fuente endógena de la enzima proteolítica, un homólogo de la TRRE humana del origen del mono. Se efectuaron los siguientes cálculos. A = (cantidad de p75 TNF-R soluble en una placa de C75R tratada con la muestra que contiene el TRRE) ; es decir la cantidad total del sTNF-R en una placa de C75R. B = (cantidad del p75 TNF-R soluble liberado espontáneamente en una placa de C75R tratada solo con el medio o la solución amortiguadora que contiene el mismo reactivo que las muestras correspondientes pero sin el TRRE exógeno) ; es decir la liberación espontánea del sTNF-R desde las células C75R. C = (cantidad del p75 TNF-R soluble en una placa de C0S-1 tratada con la muestra de TRRE o el nivel del fondo del p75 TNF-R soluble liberado por el THP-1); es decir el valor degradado del STNF-R transferido (preexistente) en la muestra del TRRE durante 30 minutos de incubación en una placa de COS-1. Esto corresponde al nivel del fondo del sTNF-R degradado en una placa de C75R. La liberación neta del p75 TNF-R soluble producido solamente por la actividad de TRRE existente en la muestra es calculado como sigue: (Liberación neta del p75 TNF-R soluble solamente por TRRE) = A - B - C. La Actividad Unitaria de TRRE se definió como sigue: 1 pg de la liberación neta del p75 TNF-R soluble (A-B-C) en el curso del ensayo es una unidad (U) de la actividad de TRRE. Utilizando este ensayo, el curso del tiempo de la extensión del receptor por TRRE se midió en el siguiente experimento. El medio de TRRE se incubó con las células C75R y COS-1 a intervalos de tiempo variables. Los sobrenadantes fueron colectados y ensayados entonces para verificar el nivel del p75 TNF-R soluble por ELISA y se calculó la actividad de TRRE neta. Los niveles detectables del receptor soluble fueron liberados por el TRRE dentro de 5 minutos e incrementados hasta 30 minutos. Los tiempos de incubación más prolongados mostraron que el nivel del TRRE permaneció relativamente constante durante 30 minutos, presumiblemente a partir del agotamiento de los substratos. Por lo tanto, 30 minutos se determinó que va a ser el tiempo de incubación óptimo. Las configuraciones de inducción del TRRE y los MMPs conocidos por la estimulación de PMA son muy diferentes. Para inducir los MMPs, las células U-937 monocíticas, las células HT-1080 del fibrosarcoma, o los macrófagos del exudado peritoneal (PEM) usualmente tienen que ser estimulados de uno a tres días con LPS o PMA. Por otra parte, cuando se compara con esta inducción prolongada, el TRRE es liberado muy rápidamente en el sobrenadante del cultivo a continuación de 30 minutos de la estimulación con PMA. La hipótesis de que el TRRE y el sTNF-R forman un complejo in vitro se confirmó por el experimento que 25% de la actividad de TRRE fue recuperada de la columna de afinidad de p75 TNF-R soluble. Esto significa que el TRRE libre tiene la capacidad de unirse a su producto catalítico, el sTNF-R. El 75% restante el cual no se combinó con la columna de afinidad puede ya estar unido al sTNF-R o puede no tener una afinidad suficiente para unirse al sTNF-R aún y cuando esté en una forma libre.

Ejemplo 2: Caracterización del TRRE obtenido de las células de THP-1.

El TRRE obtenido por la estimulación de PHA de las células de THP-1 se purificó parcialmente del medio de cultivo (WO 9802140) . En primer lugar, la proteína del medio se concentró por la precipitación con sulfato de amonio saturada al 100%, a 4 °C. El precipitado se convirtió en microesferas por la centrifugación a 10,000 x gravedades durante 30 minutos y se volvió a suspender en PBS en aproximadamente dos veces el volumen de las microesferas. Esta solución fue dializada entonces a 4 °C contra 10 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 7.0. Esta muestra se cargó sobre una columna Sephadex de Diaminoetilo (DEAE), para cromatografía por intercambio de aniones (Pharmacia Biotech) (2.5 x 10 cm) previamente equilibrada con 50 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 8.0. El TRRE se eluyó entonces con un gradiente lineal de fuerza iónica de 60 a 250 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0. Cada fracción se midió para verificar la absorbencia a 280 nm y se evaluó para verificar la actividad de TRRE. Las fracciones de DEAE con la actividad específica más elevada (el valor más elevado de las unidades de TRRE/A280) se agruparon y se utilizaron en las caracterizaciones del TRRE descritas en este ejemplo. En el siguiente experimento, la especificidad del substrato de la enzima fue averiguada utilizando técnicas inmunohistoquímicas. Se utilizaron un anti-CD54 conjugado con isotiocianato de fluorosceína (FITC), los anticuerpos de ratón y anticonejo de la cabra conjugados con FITC, el anti-CD30 monoclonal del ratón, el anti-CDllb y el anti-IL-1R (Serotec, Washington D.C.). El anti-p55 y p75 TNF-R fueron obtenidos de acuerdo con Yamamoto et al. (1978) Cell Immunol. 38:403-416. Las células de THP-1 fueron tratadas durante 30 minutos con 1,000 y/o 5,000 U/ml de TRRE eluidas a partir de la columna de DEAE-Sephadex, y luego se transfirieron a tubos de poliestireno de 12 x 75 mm (Fischer Scientific, Pittsburg, PA) a 1 x 105 células/100 µl/tubo. Las células fueron convertidas en microesferas entonces por centrifugación a 350 x gravedades durante 5 minutos a 4 °C y se tiñeron directamente con 10 µl de anti-CD54 conjugado con FITC (diluido lateralmente en sodio al 0.5%/PBS frío), indirectamente con el anticuerpo de antirratón conjugado con FITC después del tratamiento con anti-CDllb monoclonal del ratón, el IL-1R y el CD30 y también indirectamente con el anticuerpo de anticonejo conjugado con FITC después del tratamiento del anti-p55 y p75 ÍNF-R policlónal del conejo. Las células de THP-1 teñidas con cada uno de los anticuerpos sin el tratamiento del TRRE fueron teñidas como los controles negativos. Los tubos fueron incubados durante 45 minutos a 4 °C, se agitaron cada 15 minutos, se lavaron dos veces con PBS/2% de FCS, se volvieron a convertir en microesferas y luego se volvieron a suspender en 200 µl de 1% de paraformaldehido. Estas células de THP-1 etiquetadas fueron analizadas utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) (Becton-Dickinson, San José, CA) con un rayo láser de argón de 15 mW con una excitación de 488 nm. Las señales fluorescentes fueron introducidas o tomadas en cuenta con base en la difusión de la luz hacia adelante y a ángulos rectos para eliminar las células muertas y los agregados del análisis. Las señales de entrada (104) fueron detectadas en el filtro de 585 PB y analizados utilizando el programa Lysis II. Los valores fueron expresados como el porcentaje de las células positivas, el cual se calculó dividiendo la intensidad de la fluorescencia del canal promedio (MFI) de las células de THP-1 teñidas, tratadas con el TRRE por el MFI de las células sin el tratamiento de TRRE (células de control negativo) .

Para probar el ensayo citolítico del TNF in vitro por el tratamiento del TRRE, se efectuó el ensayo citolítico L929 de acuerdo con el método descrito por Gatanaga y colaboradores (1990b) . Brevemente, las células L929, una línea celular del fibroblasto del murino adherente, fueron colocadas en placas (70,000 células/0.1 ml/cavidad en una placa de 96 cavidades) toda la noche. Las células L929 de una sola capa fueron pretratadas durante 30 minutos con 100, 500 o 2,500 U/ml del TRRE purificado parcialmente y luego se exponen a las diluciones en serie del TNF humano recombinante durante 1 hora. Después del lavado de la placa con RPMI-1640 con FCS al 10% para remover el TRRE y el TNF, las células fueron incubadas durante 18 horas en RPMI-1640 con 10% de FCS que contiene 1 µg/ml de actinomicina D a 37 °C en C02 a 5%. Los sobrenadantes del cultivo fueron aspirados entonces y se agregaron 50 µl de la solución violeta cristal al 1% a cada cavidad. Las placas fueron incubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después que las placas fueron lavadas con agua del grifo y secadas con aire, las células teñidas con violeta cristal se usaron con 100 µl por cavidad de 100 mM HCl en metanol. La absorbencia a 550 mm se midió utilizando un lector de placas EAR 400 AT (SLT-Labinstruments, Salzburgo, Austria) .

Para investigar si el TRRE también se trunca en el tamaño de -55 kDa del TNF-R, el TREE purificado parcialmente se aplicó a las células de THP-1 las cuales expresan niveles bajos del TNFR tanto de p55 como de p75 (aproximadamente 1,500 receptores/célula por el análisis de Scatchard) . El TRRE eluído de la columna de DEAE-Sephadex fue agregado a las células de THP-1 (5 x 106 células/ml) a una concentración de TRRE final de 1,000 U/ml durante 30 minutos. La concentración del p55 y p75 TNF-R en este sobrenadante fue medida por ELISA de p55 y p75 TNF-R soluble. El TRRE se encontró que trunca el TNF-R tanto de p55 como de p75 sobre las células de THP-1 y liberaron 2,382 y 1,662 pg/ml de p55 y p75 TNF-R soluble, respectivamente . Por lo tanto, el TRRE obtenido por estimulación del PHA de las células de THP-1 es capaz de segmentar y liberar enzimáticamente el p75 TNF-R sobre las células de C75R, y el TNF-R tanto de p55 como de p75 humano, sobre las células de THP-1. La inhibición parcial de la actividad de TRRE se obtuvo por agentes quelantes tales como la 1,10-fenantrolina, el EDTA y el EGTA (los % de actividad del TRRE restantes fueron del 41%, 67% y 73%, respectivamente, a una concentración 2 mM) . Por otra parte, los inhibidores de la serina proteasa tales como PMSF, ARBSF y 3,4-DCI, y los inhibidores de la serina y cisteína proteasa tales como TCLK y TPCK no tienen efecto sobre la inhibición del TRRE. El TRRE fue activado ligeramente en la presencia del Mn2+, Ca2+, Mg2+, y Co+ (los % de las actividades del TRRE restantes fueron de 157%, 151%, 127%, y 123%, respectivamente) , mientras que la inhibición parcial ocurrió en la presencia del Zn2+ y Cu2+ (los % de las actividades de TRRE restantes fueron del 23% y el 47%, respectivamente) (WO 9802140). Las fracciones de TRRE desde la fracción de DEAE más activa (60 mM hasta 250 mM NaCl) pueden ser purificadas adicionalmente. En un método (WO 9802140), las fracciones fueron concentradas hasta 500 µl con un filtro Centiprep-10 (membrana de corte de PM 10,000) (Amicon). Esta muestra concentrada se aplicó al 6% de PAGE bajo condiciones naturales no desnaturalizantes. El gel se rebanó horizontalmente en tiras de 5 mm y cada una se eluyó en 1 ml de PBS. Las substancias eluidas fueron probadas entonces de acuerdo con el ensayo (Ejemplo 1) para verificar la actividad de TRRE.

Ejemplo 3: La actividad de TRRE alivia el choque séptico El siguiente protocolo fue utilizado para probar los efectos del TRRE en la prevención de la mortalidad en un modelo para el choque séptico. Los ratones fueron inyectados con niveles letales o subletales, y luego con una solución amortiguadora de control o TRRE. Las muestras de la sangre periférica fueron colectadas entonces a intervalos para establecer si el TRRE bloqueó la producción inducida de las otras citocinas en la corriente de la sangre. Los animales fueron evaluados para verificar la capacidad del TRRE para bloquear los efectos clínicos del choque, y luego se eutanizaron y los tejidos se examinaron por métodos histopatológicos. Los detalles fueron como sigue: ratones Balb/c adultos, fueron colocados en un dispositivo de restricción y se inyectaron intravenosamente por medio de la vena de la cola con una solución de 0.1 ml que contiene 10 ng a 10 mg del LPS en la solución amortiguadora del fosfato (PBS) . Estos niveles del LPS indujeron niveles desde suaves hasta letales de choque en esta cepa de los ratones. El choque fue el resultado de los cambios en la permeabilidad vascular, la pérdida de fluidos, y la deshidratación, y frecuentemente está acompañado de síntomas que incluyen la letargía, una posición estacionaria, encorvada, un pelaje desgreñado, el dejar de comer, la cianosis, y, en casos serios, la muerte dentro del intervalo de 12 a 24 horas. Los ratones de control recibieron una inyección de PBS. Diferentes cantidades (2,000 o 4,000 U) del TRRE humano purificado fueron inyectadas IV en un volumen de 0.1 ml dentro del transcurso de una hora previo a, o después de, la inyección de LPS. El suero (0.1 ml) fue colectado con una aguja de calibre 27 y una jeringa de 1 ml IV de la vena de la cola a los 30, 60 y 90 minutos después de la inyección de LPS. Este suero fue heparinizado y almacenado congelado a -20 °C. Las muestras de los experimentos múltiples fueron probadas por ELISA para verificar la presencia de sTNF-R, TNF, IL-8 e IL-6. Los animales fueron verificados durante las siguientes 12 horas para observar los efectos clínicos del choque. Los animales seleccionados fueron eutanizados a períodos desde 3 hasta 12 horas después del tratamiento, se les practicó la autopsia y varios órganos y tejidos se fijaron en formalina, se empaparon o sumergieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron por hematoxalina-eosina (H y E) . Las secciones del tejido fueron sometidas a examen histopatológico e inmunopatológico. La Figura 3 muestra los resultados obtenidos. ( ) LPS solo; (H) LPS más solución amortiguadora de control; (•) LPS más TRRE (2,000 U) ; (A) LPS más TRRE (4,000 U) . Los ratones inyectados con LPS solo o con LPS y una solución amortiguadora de control murieron brevemente después de la inyección. 50% de los animales de prueba fueron muertos después de 8 horas (LPS) o 9 horas (LPS más solución amortiguadora de control), y 100% de los animales fueron muertos a las 15 horas. En contraste, los animales tratados con el TRRE obtenido como se describió en el Ejemplo 1 fueron mucho mejores. Cuando las inyecciones de LPS estuvieron acompañadas por inyecciones de 2,000 U del TRRE, la muerte fue retardada y las velocidades de mortalidad fueron inferiores. Solo 40% de los animales fueron muertos a las 24 horas. Cuando 4,000 U del TRRE se inyectaron en compañía del LPS, la totalidad de los animales ha sobrevivido a las 24 horas. Por consiguiente, el TRRE es capaz de contrarrestar la mortalidad inducida por el LPS en los animales de prueba.

Ejemplo 4: La actividad del TRRE reduce la actividad de necrotización de los tumores El siguiente protocolo fue seguido para probar los efectos del TRRE sobre la necrosis del tumor en los animales de prueba en los cuales los tumores fueron producidos, en los cuales el TNF fue inyectado subsiguientemente . El día 0, los tumores Meth A cutáneos fueron producidos sobre la pared abdominal de quince ratones BALB/c por inyección intradérmica de 2 x 205 células del tumor de Meth A. El día 7, los ratones fueron divididos en tres grupos de cinco ratones cada uno y se trataron como sigue: M Grupo 1: Inyectados intravenosamente con TNF (1 µg/ratón) . M Grupo 2: Inyectados intravenosamente con TNF (1 µg/ratón) e inyectados intratumorígenamente con el TRRE obtenido como en el Ejemplo 1 (400 unidades/ratón, 6, 12 horas después de la inyección del TNF) . M Grupo 3: Inyectados intravenosamente con TNF (1 µg/ratón) e inyectados intratumorígenamente con el medio de control (6, 12 horas después de la inyección del TNF) . El dia 8, se midió la necrosis del tumor con los siguientes resultados: Grupo 1: 100% de necrosis (5/5); Grupo 2: 20% (1/5); Grupo 3: 80% (4/5). Las inyecciones del TRRE redujeron ampliamente la capacidad de inducir la necrosis en los tumores de Meth A en los ratones BALB/c. Puesto que la adición de la actividad de TRRE desgasta o reduce la actividad necrotizante benéfica del TNF, el bloqueo de la actividad del TRRE endógeno podría promover los efectos benéficos del TNF.

Ejemplo 5: Nueve nuevos clones de polinucleótidos que afectan la actividad del TRRE Se han encontrado varias células que expresan niveles elevados de actividad de TRRE, especialmente después de la estimulación con PMA. Estas incluyen las líneas celulares designadas THP-1, U-937, HL-60, ME-180, MRC-5, Raji, K-562. Las células Jurkat tienen una actividad de TRRE elevada (850 TRRE U/ml a 10~2 PMA). En este experimento, la biblioteca de expresión de la célula T de Jurkat (ATCC #TIB-152) fue obtenida y utilizada para obtener 9 clones de polinucleótidos que aumentan la actividad de TRRE. La selección de las secuencias de la expresión en la biblioteca se hizo por ios ciclos repetidos de la transfección en las células de COS-l, seguido por la evaluación del sobrenadante como en el Ejemplo 1 para verificar la presencia de la actividad que segmenta y libera el receptor de TNF. Las técnicas estándares fueron utilizadas en la manipulación genética. Brevemente, el ADN de 106 células de Jurkat se extrajo utilizando un juego o conjunto de extracción del plásmido InVitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se insertó en el vector de EcoRI/Express® (cat. No. 938201, Stratagene, La Jolla CA) . La biblioteca se dividió en 48 grupos del ADN y se transformó en las células COS-1 utilizando el método de transfección de CaCl. Una vez que las células se hicieron crecer externamente, el ensayo de TRRE fue efectuado, y se seleccionaron cinco grupos positivos. El ADN de cada uno de estos cinco grupos fue obtenido, y se transfectó en el E. coli, con 15 placas por grupo. El ADN fue preparado a partir de estas células y luego se transfectó en las células de C0S-1 una vez más. Las células se hicieron crecer externamente, y la actividad del TRRE fue probada nuevamente. Dos grupos positivos fueron seleccionados y transfectados en el E. coli, produciendo 98 colonias. El ADN se preparó a partir de 96 de estas colonias y se transfectó en las células C0S-1. La actividad del TRRE se llevó a cabo nuevamente, y nueve clones se encontró que incrementan substancialmente la actividad del TRRE en el ensayo. Estos clones fueron designados 2-8, 2-9, 2-14, 2-15, P2-2, P2-10, P2-13, P2-14, y P2-15. La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra la actividad de TRRE observada cuando los nueve clones fueron probados con las células C75 en el ensayo estándar (Ejemplo 1) . Estos nueve clones fueron secuenciados entonces de acuerdo con el siguiente procedimiento: 1. El ADN del plásmido se preparó utilizando un procedimiento de lisis alcalina modificada. 2. El secuenciamiento del ADN se efectuó utilizando las reacciones de terminación de DyeDeoxi (ABI) . Los tintes fluorescentes específicos para la base fueron utilizados como las etiquetas. 3. Las reacciones de secuenciamiento fueron analizadas sobre geles Long Ranger® al 5.75% por un ABI 373A-S o sobre los geles Long Ranger® al 5.0% por un secuenciador automatizado ABI 377. 4. El análisis de los datos subsiguientes se efectuó utilizando el programa Sequencher® 3.0. Los cebadores estándares T7X, T3X, -40, -48 Inverso, y BK Inverso (BKR) fueron utilizados en las reacciones de secuenciamiento. Para cada clon, se sintetizaron varios cebadores de secuenciamiento internos adicionales (listados posteriormente) . El análisis de la secuencia NCBI BLAST (Herramienta de Investigación del Alineamiento Local Básico) (Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) se efectuó para determinar si otras secuencias fueron significativamente similares a estas secuencias. Tanto las secuencias del ADN de los clones como los ORFs correspondientes (si es que existe alguno), fueron comparadas con las secuencias disponibles en las bases de datos. Los siguientes clones fueron obtenidos y secuenciados: Clones 2-9 (AIM2) : Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC. ID NOS: 11-38. La secuencia de AIM2 es presentada en la SEC ID NO:l. La hebra complementaria de la secuencia de AIM2 es la SEC ID NO: 147. El marco de lectura abierta (ORF) más larga en la secuencia de AIM2 es de 474 AA de longitud y está representado en la SEC ID NO: 148. Clones 2-8 (AIM3) : Dos secuencias parciales de longitud 739 y 233 fueron obtenidos y designados AIM3T3 y AIM3T7. Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC. ID NOS: 39-46. Las secuencias de AIM3T3 y AIM3T7 son presentados en las SEC. ID NOS: 2 y 3, respectivamente. La investigación de BLAST reveló que la secuencia de AIM3T3 puede ser homologa al ARN ribosómico 28S del ratón (M. musculus) (Hassouna y colaboradores, Nucleic Acids Res. 12:3563-3583, 1984) y los genes pre-ARN 45S de M. musculus (Acceso No. X82564). La secuencia complementaria de la secuencia de AIM3T3 mostró una similaridad del 99% arriba de 408 pb que inician con nt 221 de la SEC ID NO: 2 con respecto al primero y 97% de similaridad sobre la misma extensión con respecto al último.

Clones 2-14 (AIM4) . Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC ID NOS : 14-65. La secuencia de AIM4 es presentada en la SEC ID NO: 4. La hebra complementaria de la secuencia de AIM4 es la SEC ID No: 149. El ORF más largo de la secuencia de AIM4 es de 236 AA de longitud y está representado en la SEC ID NO: 150. El AIM4 tiene alineamientos significativos con la arfaptina 2 de las secuencias humanas, el ARNm del ADE2H1 que muestra homologías con la sintetasa de SAICAR, el ARNm de la proteína de unión del tracto de la polipirimidina (ribonucleoproteína I nuclear heterogénea) varios genes de PTB para las proteínas de unión del tracto de la polipirimidina, el ARNm para la proteína porl. La arfaptina 2 humana es una proteína de blanco u objetivo supuesta del factor de ADP-ribosilación que interactúa con el RAC1 uniéndose directamente a la misma. El RAC1 está involucrado en el plegado de la membrana. La arfaptina 2 tiene segmentos de la transmembrana posibles, sitios de fosforilación de CK2 potenciales, un sitio de fosforilación de PKC y una secuencia de fijación de la célula de RGD. Clones 2-15 (AIM5) : Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC ID NOS: 66-80. La secuencia de AIM5 es presentada en la SEC ID NO: 5. La búsqueda o investigación BLAST reveló que la secuencia de AIM5 muestra alguna similaridad con el Factor 5A de Iniciación Humana (elF-5A) Koettnitz y colaboradores (1995) Gen 159:283-284, 1995 y el Factor 4D de Iniciación Humano (elF 4D) de Smit-Mcbride y colaboradores (1989) J. Biol. Chem. 264:1578-1583, 1989. Clon P2-2 (AIM6) : Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC. ID NOS: 81-93. La secuencia de AIM6 es presentada en la SEC ID NO: 6. El ORF más largo en la secuencia de AIM6 es de 1038 AA de longitud y está representado en la SEC ID NO: 151. Clon P2-10 (AIM7): Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC ID NOS : 94-106. La secuencia de AIM7 es presentada como la SEC ID NO: 7. El ORF más largo en la secuencia de AIM7 es de 849 AA de longitud y está representado en la SEC ID NO: 152. La búsqueda o investigación BLAST reveló que este clon puede estar relacionado con el Receptor del Factor de Crecimiento II semejante a la Insulina Humana (Morgan y colaboradores, Nature 329:301-307, 1987 o el ARNm del Receptor de 6-Fosfato de la Mannosa Independiente del Catión Humano (Oshima y colaboradores, J. Biol. Chem. 263:2553-2562, 1988). La secuencia de AIM7 mostró aproximadamente 99% de identidad con respecto a ambas secuencias arriba de los 2520 nucleótidos que empiezan con nt 12 de la SEC ID NO: 7 y 99% de similaridad con respecto a esta última sobre la misma extensión.

Clon P2-13 (AIMB) : Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC: ID NOS: 107-118. La secuencia de AIM8 es presentada como la SEC ID NO: 8. El ORF más largo en la secuencia de AIM8 es de 852 AA de longitud y está representado en la SEC ID NO: 153. Clon P2-14 (AIM9) : Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC: ID NOS: 119-124. La secuencia del AIM9 es presentada en la SEC ID NO: 9. El ORF más largo fue de aproximadamente 149 aminoácidos de longitud. Clon P2-15 (AIM10) : Los cebadores internos utilizados para el secuenciamiento son mostrados en las SEC. ID NOS: 125-146. La secuencia de AIM10 es presentada como la SEC ID NO: 10. El ORF más largo en la secuencia de AIM10 es de 693 AA de longitud y está representado en la SEC ID NO: 154. La secuencia 10 sobre la búsqueda o investigación BLASTN de las bases de datos no redundantes en NCBI se alinea con el ARNm Humano para la proteína asociada con Elb-55kDa, el sitio HSA7509 (Acceso AJ007509, NID g3319955). El ADN clonal puede ser inyectado directamente en los animales de prueba para probar la capacidad de estos ácidos nucleicos para inducir la actividad de TRRE, contrarrestar el choque séptico y/o afectar la necrosis del tumor, como se describió con detalle en los Ejemplos 3 y 4.

S3 Alternativamente, las proteínas o el ARN pueden ser generados a partir del ADN clonal para una prueba similar.

Ejemplo 6: Expresión de los clones obtenidos recientemente El Ejemplo 5 describe 9 nuevos clones los cuales mejoran la actividad de TRRE en un sistema de ensayo de la superficie celular. Los clones fueron obtenidos en el vector del pBK-CMB Phagmid. El siguiente trabajo se hizo en convenio con el laboratorio comercial Lark Technologies, Houston, TX. Los clones fueron removidos de los vectores de lanzamiento y se insertaron en los vectores de expresión de la siguiente manera. El plásmido recombinante (pBK-CMV que contiene el inserto) se digirió con la(s) enzima (s) de restricción apropiada (s) tales como Spe I, Xba I, EcoR I u otras, cuando sea apropiado. El Vector de Transferencia del Baculovirus (Vector de Transferencia del Baculovirus pAcGHLT-A, PharMingen, San Diego, CA, Cat. No. 21460P) también fue cortado con la(s) enzima (s) de restricción apropiada (s) dentro o cerca del sitio de clonación múltiple para recibir el inserto removido del vector de lanzamiento. El fragmento de interés que es subclonado se aisló del material digerido utilizando la electrofóresis de agarosa de punto de Fusión Bajo y se purifica a partir del gel utilizando un Juego o Conjunto de Extracción con un Gel que se consigue de Lark SOP MB 020602. Si es necesario, el vector de recepción se trata con la fosfatasa alcalina de acuerdo con Lark SOP MB 090201. El fragmento se ligó en el sitio elegido del pAcGHLT-A del vector. El plásmido recombinante se transformó en las células XLl Azules de MRF' de E. coli y las células bacterianas transformadas fueron seleccionadas sobre las placas de agar de LB que contienen ampicilina (100 µg/ml) . Las colonias resistentes a la ampicilina fueron colectadas y se hicieron crecer sobre el caldo LB que contiene ampicilina para la preparación del plásmido. El ADN del plásmido se preparó utilizando el Procedimiento del Minilisado Alcalino {Lark SOP MB 010802 y se digirió con la(s) enzima (s) de restricción apropiada (s) . Los subclones seleccionados se confirmó que van a ser del tamaño correcto. Los subclones fueron digeridos con otra(s) enzima (s) de restricción apropiada (s) para averiguar la orientación correcta del inserto confirmando la presencia de los fragmentos del (de los) tamaño(s) apropiado (s) . Un subclon se hizo crecer en 100 ml del caldo de LB que contiene la ampicilina {100 µg/ml) y el ADN del plásmido se preparó utilizando el Juego o Conjunto de Preparación del Plásmido de Qiagen Midi (Lark SOP MB 011001) . La concentración del ADN se determinó midiendo la absorbencia a 260 nm y la muestra del ADN se verificó que va a ser originada a partir del subclon correcto por la digestión de restricción. Así se produjeron las construcciones de expresión para Mey3, Mey5, Mey6, Mey8 ahora con la secuencia de codificación de interés fusionada al gen GST con la etiqueta de polihistidina, el sitio de la proteína cinasa A y el sitio de segmentación de la trombina. El gen de GST y ahora la proteína de fusión están bajo el promotor de polihedrina. El PharMingen (San Diego, CA) incorporó el vector con el inserto en las partículas del baculovirus funcional por la coinserción del vector de transferencia (pAcGHLT) en la línea celular S de los insectos susceptibles en compañía del ADN del virus linearizado (PharMingen, San Diego, CA, ADN viral BaculoGold, Cat. No. 21100D) . Las partículas del virus funcional se hicieron crecer nuevamente sobre las células de los insectos para generar una materia prima de concentración elevada. La producción de la proteína se hizo entonces por la infección de un cultivo grande de las células en la célula Tini. Las células fueron colectadas cuando el rendimiento de la proteína alcanzó un máximo y antes de que el virus haya exterminado las células. Las proteínas de fusión fueron colectadas sobre una columna de agarosa-glutationa, se lavan y se liberan con glutationa.

Las proteínas colectadas de la columna de afinidad fueron cuantificadas midiendo la OD2ao y fueron evaluadas sobre los geles utilizando SDS-PAGE y el manchado de Western con el anti-GST etiquetado (PharMingen, San Diego, CA, mAbGST Cat. No. 21441A) para confirmar que la totalidad de las bandas presentes incluyeron la porción de GST. Cuatro de las diez secuencias han sido clonadas, expresadas en las células de insectos infectadas con el baculovirus, y luego purificadas.

Los geles indicaron la presencia de la proteína de GST además de proteínas más grandes que también son positivas con el anticuerpo anti-GST en los análisis de Western. El Mey3 exhibió repetidamente la presencia de proteínas alrededor de 32kDa, 56kDa, las bandas alrededor de 60-70kDa y otras más grandes que 70kDa. El Mey5 consistentemente tuvo proteínas que migran como aproximadamente 34kDa, 38kDa, 58kDa, alrededor de 60-70kDa, y otras más grandes que 70kDa. El Mey6 tuvo bandas de la proteína alrededor de 34kDa, 56kDa, 58kDa, y las bandas alrededor de 60-70kDa. El Mey 8 tuvo proteínas alrededor de 36kDa, 58kDa y las bandas alrededor de 60-70kDa. La totalidad de las bandas indicadas fueron positivas para GST. Las bandas pueden representar la proteína de fusión deseada o el producto de degradación/segmentación generado durante el crecimiento y la purificación.

Ejemplo 7: Ensayo de los productos de la expresión para verificar el efecto sobre la actividad de segmentación de TNF-R El siguiente método se utilizó para medir la actividad de TRRE de Mey 3, 5, 6 y 8. Las células C75R y COS-1 fueron sembradas en placas de cultivo de 24 cavidades a una densidad de 2.5 x 105 células/ml/cavidad y se incubaron toda la noche (durante 12 a 16 horas) en C02 al 5% y 37 °C. Después de aspirar el medio en la cavidad, 300 µl de 1 ug de Mey 3, 5 y 8 fueron incubados en cada cavidad de las placas tanto de C75R como de COS-1 durante 30 minutos en C02 al 5% a 37 °C (que corresponden a A y C mencionados posteriormente, de manera respectiva) . De manera simultánea, las células C75R en las placas de 24 cavidades también fueron incubadas con 300 µl del medio o la solución amortiguadora (que corresponde a B mencionado posteriormente) . Los sobrenadantes fueron colectados, centrifugados y luego evaluados para verificar la concentración del p75 TNF-R soluble por ELISA como se describió en el Ejemplo 1. Se obtuvieron los siguientes resultados: Ejemplo 8: Efectividad de los productos de la expresión en el tratamiento del choque séptico El protocolo descrito en el Ejemplo 3 se utilizó para probar los efectos de los productos de la expresión de los nuevos clones en la prevención de la mortalidad en el modelo del choque séptico.

Diferentes cantidades de los Mey 3, 5, y 8 recombinantes (10 -100 ug/ratón) se inyectaron i.v. en un volumen de 0.05 ml en el transcurso de una hora previo a o después de la inyección de una dosis letal de LPS. El suero (0.1 ml) se colectó utilizando una aguja de calibre 27 y una jeringa de 1 ml desde la vena de la cola a 30, 60 y 90 minutos después de la inyección de LPS. Este suero se heparinizó y se almacenó congelado a -20 °C. Las muestras de los experimentos múltiples fueron probadas por ELISA para verificar la presencia del TNR-R solubilizado, el ligando de TNR, el IL-8, y el IL-6. Los animales fueron verificados durante las siguientes 12 horas para verificar los efectos clínicos del choque. Los animales seleccionados fueron eutanizados desde 3 hasta 12 horas después del tratamiento, se les practicó la autopsia y varios órganos y tejidos se fijaron en formalina, se empaparon o sumergieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxalina-eosina (H y E) . Las secciones del tejido fueron sometidas a examen histopatológico e inmunopatológico. La Figura 5 muestra los resultados obtenidos. (^) solución salada; (•) BSA; (?) Mey-3 (100 µg) , (X) Mey-3 (10 µg); (*) Mey-5 (10 µg) ; (•) Mey-8 (10 µg) . Los ratones inyectados con LPS solo o con LPS, una solución amortiguadora de control o la proteína de control (BSA) murieron rápidamente. La totalidad de los animales en este grupo resultaron muertos a las 24 horas. En contraste, cuando las inyecciones de LPS estuvieron acompañadas por las inyecciones de unos 10 - 100 ug de Mey 3, 5 y 8, la muerte fue retardada y las velocidades de la mortalidad fueron inferiores. Ninguno de los animales murió a las 24 horas que han sido tratados con el Mey 3 y el Mey 5. Solamente 66% de los animales murieron a las 24 horas de aquellos que han sido tratados con Mey 8. Por consiguiente, Mey 3, 5 y 8 fueron capaces de contrarrestar la mortalidad inducida por LPS en los animales de prueba.

LISTADO DE LAS SECUENCIAS FORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Gatanaga, T. Granger, G.A. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Factores que Afectan la Actividad de la Enzima de Liberación del Receptor del Factor de la Necrosis del Tumor (iíi) NUMERO DE SECUENCIAS: 154 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: MORRISON & FOERSTER (B) CALLE: 755 PAGE MILL ROAD (C) CIUDAD: Palo Alto (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: EUA (F) ZONA POSTAL: 94304-1018 (v) FORMA LEÍBLE POR LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete ' (B) COMPUTADORA: Compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows (D) PROGRAMA: FastSEQ para Windows Versión 2.0b (vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: USSN 09/081,385 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 014-NOV-1998 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/MANDATARIO: (A) NOMBRE: (B) NUMERO DE REGISTRO: (C) NUMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 22000-20577.21 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 650-813-5600 (B) TELEFAX: 650-494-0792 (C) TELEX: 706141 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4047 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:l: AAGCTTTTTG CTTTCCTTCC CCGGGAAAGG CCGGGGCCAG AGACCCGCAC TCGGACCAGG 60 CGGGGGCTGC GGGGCCAGAG TGGGCTGGGG AGGGCTGGGA GGGCGTCTGG CGCCGGCTCC 120 TCCAGGCTGG GGGCCGCCAG CTCCGGGAAG GCAGTCCTGG CCTGCGGATG GGGCCGCGCG 180 TGGGGCCCGG CGGGGCGGCC TCGGGAGGCG TCCAGGCTGC GGGAGCGGGA GGAGCGGCCG 240 TGCGGGCGCC AGCGCCGTGG GTGGAGGTCG CCGTCCCTCC TGAGGGGCAG CCAGTGCGTT 300 TGGGACCCGG GAGCAGAGCC CGCGCCTCCC CAGCGGCCTC CCCGGGGGTC TCACCGGGTC 360 'ACCCGAGAGC GGAGGCCCCG GCTCCGCAGA AACCCGGGGC GGCCGCGGGG AAGCAGCGCC 420 CTCAGGCGTC GGAGGAGCCC CCAGAAGGAC CTCGCGCCTT CCCGCCGGGC TCCGACCGCC 480 TGGGTTCGGT GCGGGACGGC CCAGGCCGCC AGGACCCCCA AGCGCAGCTC AGTCTGCGGG 540 GCACGACCCA GAGGCCAGCA GCAGAGGACG GGGCCGGGGC CGGGAGAGGG CGGGGAGGGC 600 GCTCCTGGGA GGTCA?GGCC AGGGCTAGAC TTTCAGGGTC ATGGCCTGGC CCCTCATCCC 660 CAGGG?GGTG AGGGGGCTCT GTGAGCAGAG GGGGCCCCGG TGGAGAAGGC GCTGCTAGCC 720 AGGGGCGGGG CAGGAGCCCA GGTGGGGACT TAAGGGTGGC TGAAGGGACC CTCAGGCTGC 780 AGGGATAGGG AGGGAAGCTA GGGGTGTGGC TTGGGGAGGT GCTGGGGGAC CGCGGGCGCC 840 CTTTATTCTG AAGCCGAATG TGCTGCCGGA GTCCCCAGTG ACCTAGAAAT CCATTTCAAG 900 ATTTTCAGGA GTTTCAGGTG GAGACAAAGG CCAGGCCCAG GTGAAAATGT GGCAGTGACA 960 GAGTATGGGG TGAGAACCAC GGAGAGAGGA AGTCCCCGAG GCGGATGATG GGACAGAGAG 1020 CGGGGACCAG AATTTTTTAA A?CGCATCTG AGATGCGTTT GGCAGACTCA TAGTTGTTTT 1080 CCTTTCACGG AGA?AGTGTG GGCAGAAGCC AGCTCTAAAG CCCAGGCTGC CCAGCCTGCA 1140 TGGCAGAGC TGACGGAAGG CCAGGGCAGA GCCTTCCCTC CCTGTCACAG ACATGAGCCC 1200 TGGAG?TCTG GAATGAGGCA GATGTGCCCA GGGAAAGCTG ATCCGCCCCG ?CCC?GGGCC 1260 CCCCGGGTGC CCCTTTGAGC GTGGAATCGT TGCCAGGTCA TGGCTCCCTG CTATCGAACA 1320 CCGGACACGG GTCGTGTGCT GCACCTGGCA GTTGCAGGAC CGACACCCAC AATGCCTTAA 1380 GAGGTGATGA CTGCCTTCCA GGGGCCTGGC TGGCTGACAC TTTGCATGGC TCCTGGAGAA 1440 GAGGGATTGA GTGGAGTCCA CGGGTCATGG CCACGTCCTG GGTGCTGCCT CTGAGGCAGG 1500 GCCCGGCTGG GGTGAGAAGG GGCTGGAGAC AGGTTCCTGC CAGTTCAGCC TCTAACCGGT 1560 GGTCTTC?TG CCTAGGAACC CACTGGGGGC TTATGAAACT GCAGGTGGCT GAGTCCTTGC 1620 CATGGGGTCT CTCCTTCAGG AGGTCTGGGT GGGGCCGGAG ACTGTACCCC ACA?AGGGTC 1680 CCAGGTGAGG CGGATGTGGC CTGGCGCTGT GTGGCTCTGG ACCTAGTCCT TGGGCTTGGG 1740 CTGGCGCCC? 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ATGGGGAGCC CCATTGCTGG 2040 CCTTGCATCT GAATAGGCCT ACCCTCACCA TTTATTCACT AATACATTTT ATTTGTGTTC 2100 TCTAATTTAA AATTACCTTT TCATCTTGCT TGATTTTCCT TCAGCTAAAT TAGAAATTTG 2160 TAGTTTTTCC CCTAAAAAAT TCAATGGCAT TCTTTCTTAT AAATTACATT CTCTGATTTT 2220 CTTGTCAGCC TGCTTCAAGG AAATCCATGT GTTCAAAATG CTTGCTCGCA GTTTGCTCCA 2280 TACCAAATGG TTGCTTAACC CAAATATCTG AGCAGCAAAT TGAGCTGATC CTTCTGGAGA 2340 AAGTACGGTT GAACAGCC?A GACCACTGGG TAGTCGAAGA GAAGACCACA CATCCTGAAC 2400 TCCCCAGTCT GGTGTGAGGG GAGGACAGCT GATAACTGGA TATGCAGTGT TCCCAGACAT 2460 C?CTGGTCCC AAACCATTAC TTCTGCCTGC CACTGCCACA AATACAGTAG GAATGCCATC 2520 CECTTCATAC TCAGCTTTAA TCCTCAGAGT TTCATCTGGT CCTTTATGCG CAGATGTTAC 2580 TCGAAGTTCA CATGGAATGC CAAAATTTCC ACAGGCCTTC TTGATTTTTT CACAGTGACC 2640 AAGATCAGAA GTAGAGCCCA TCAACACTAC AACCCTGCAC TGACTTTCTG ATTTCAAAAG 2700 CAACTCTACT CTCTCTGCAA CCCACTCAAA GTTTTTCTTT ACCATTTGGA GCCCTTCAGG 2760 AGTTACTTCT TTGAGGTCCC GATAAGACTG TTTGTCTTTC TGTTGGCTTC GATCTCCTGA 2820 TGGCCAGAGT CTCCAGGAAT CATTGTCAAT AACATCAGCA AGAACAATTT CTTTGGTGGT 2880 TACATCAACA CCAAATTCAA TCTTCATATC AACCAGTGTA CAATTCTGGG GCAACCAGGA 2940 TTTCTCCAGT ATTTCAAATA TAGCCTGTGT AGCATCTCGT GCCGAATTCA AAAAGCTT 2998 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4152 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5 GCCCACTGGG GCCACCCAGG GGCACCTGCA CAGCCTGGGT GCCATTGAAC CAGTAGATCA 2700 GGCTGCTGTC CTGGCTGTAG TGCACCGAGA GTCCTGCTGT CCAGTTGGCA TTGGGGCCAG 2760 GCATGGGCAA CAGATCCACT TCCCCAGTGG CAGCACCACA GAGTTTCCGC AGCGCCCGCT 2820 CTGAGTAGTT GTCACGGTCA CAGCCCTTGG CCACATGGCT GGTCTGCAGC TCTATGGTGG 2880 CCTGAATGTT CCAGAGTGGT TCATCACAGG TCTCGAGGCG GATACCAGGG AACAAAGCCA 2940 AGCTCCCAGC ACCTGGTGCA TATTCGATCC TTTTGTTCCA GCCTTGCCAG CTGGGTTTAC 3000 AGGTGGGCTT CACCTGAATC TCCACCTCAG CATCATCTGC TGCCCGCTTC TTCCCACAGT 3060 CATAAGCTGT CACTGTAAAC TTATAGAGCC TCTCACCACT GTACTGCAGC TTCTCTGTGT 3120 TCTCAATGTT CCCGTCATTG TCAATGAGGA AAGGGGTGTT GGGTGTGAGA ATCTCATAGT 3180 AGCAGATCTG GCTGTACTGG GGGGAGCAGT CACCGTCAAT GGCTTCCACC CGCAGGATGC 3240 GATCGTACAG CTTCCCCTCT GTCACAGCCG CACGATACAG CCGTTCCACA A?CACTGGGG 3300 CAAACTCGTT CACATCGTTG ACCCGCACAT GCACAGTGGC CTTGTGGGAC TTCTTGGTGT 3360 TGGCCCCGTC GGGGCCCTCG CCACAGTCAT AGGCCTGGAT GGTGAAGGTG TGTTCCTTCT 3420 GGGCCTCGC? 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TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: GAGCTCGCGC GCCTGCAGGT CGACACTAGT GGATCCAAAG AATTCGGCAC GAGGGAAACT 60 CAACGGTGTA CGAGTGGAGG ACAGGGACAG AGCCCTCTGT GGTGGA?CGA CCCCACCTCG 120 AGGAGCTTCC TGAGCAGGTG GCAGAAGATG CGATTGACTG GGGCGACTTT GGGGTAGAGG 180 CAGTGTCTGA GGGGACTGAC TCTGGCATCT CTGCCGAGGC TGCTGGAATC GACTGGGGCA 240 TCTTCCCGGA ATCAGATTCA AAGGATCCTG GAGGTGATGG GATAGACTGG GGAGACGATG 300 CTGTTGCTTT GCAGATCACA GTGCTGGAAG CAGGAACCCA GGCTCCAGAA GGTGTTGCCA 360 GGGGCCCAGA TGCCCTGACA CTGCTTGAAT ACACTGAGAC CCGGAATCAG TTCCTTGATG 420 AGCTCATGGA GCTTGAGATC TTCTTAGCCC AGAGAGCAGT GGAGTTGAGT GAGGAGGCAG 480 ATGTCCTGTC TGTGAGCCAG TTCCAGCTGG CTCCAGCCAT CCTGCAGGGC CAGACCAAAG 540 AGAAGATGGT TACCATGGTG TCAGTGCTGG AGGATCTGAT TGGCAAGCTT ACCAGTCTTC 600 AGCTGCAACA CCTGTTTATG ATCCTGGCCT CACCAAGGTA TGTGGACCGA GTGACTGAAT 660 TCCTCCAGCA AAAGCTGAAG CAGTCCCAGC TGCTGGCTTT GAAGAAAGAG CTGATGGTGC 720 AGAAGCAGCA GGAGGCACTT GAGGAGCAGG CGGCTCTGGA GCCTAAGCTG 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DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12: GCAGTCCTGG CCTGCGGAGT 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13: GTCGACAGGA GAATTGGTTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14: GCCTGGGTTC GGTGCGGGAC 20 .2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal {xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15: TGGTCGGGTG TTTGTGAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16: CCTCTTCCGT CTCCTCAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17: GGATTGCTAG TC CACAGAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:lí TTAAGGGTGG CTGAAGGGAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19: ACCTTCCCTC CCTGTCACAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20: TGGTCGGGTG TTTGTGAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21: ACACCATTCC AGAAATTCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22: AAACTGCAGG TGGCTGAGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23: GTCCTAATGT TTTCAGGGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24 AAAACCTATG GTTACAATTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25: TCCTAGACAT GGTTCAAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26: .i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26: GATATAATTA GTTCTCCATC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27: (i)' CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27 ATGCCTGTTC CAGGCTGCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple 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HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36: GTTCCCAGAG CTTGTCTGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 37 GTTTGGCAGA CTCATAGTTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3í TAGCAGGGAG CCATGACCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 39: CTTGGCGCCA GAAGCGAGAG 20 .2} INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 40: CCTCTCTCTC TCTCTCTCTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 41; TCCCCGCTGA TTCCGCCAAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 42: CTTTTTGAAT TCGGCACGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SÉC ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 43: CCCCTGGTCC GCACCAGTTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 44 GAGAAGGGTC GGGGCGGCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 45: AAATCACATC GCGTCAACAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 46; TAAGAGAGTC ATAGTTACTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 47: GCTCTAGAAG TACTCTCGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) 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(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 84 CTCCTTCTCT TGGATCTCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 85: TTACTTCAGC ACTGTTAGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 86: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 86: AGGGAGGTAG CTCAAAGCTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 87: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 87 TGGGTCCACA GTTCGCACAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 88 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 88: CAACTCTGTG ATGGCTCCAG 20 .2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 89: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 89: AGCAGGGTTC TGTTCAAGAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 90: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 90: CCATTGGGTG CTAGTCTCTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 91 CAGCCATGCT GTCCCAGCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 92: CTGGACCTGA GGTAGCGCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 93; ATAACCACCC TGAGGCACTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 94 CCTGCAGGTC CACACTAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 95: AATTGGAATG AGGAGGACTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 96: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 96; GCTCTAGAAG TACTCTCGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 97 ATTGTATGAC AATGCACCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 98: TCCACAGAGG GCTTCATCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 99: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 99: CCTGACTGGC CTAAGCACAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 100: AAGCCTCATA ACCACCAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 101 TGTCAACGGT GACAAGTGTG 20 [2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple ' (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 102: TTGTACACCA GCTGCAGGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 103: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 103: GGGTGTGGTG CAGATGAGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 104: ATCACACTCT TATAGCTCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 105: GTGGGAAGCT TTCCTCAGAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 106; TGATGAACAT GGGCCTGGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 107 CATTGTGGAT GTACTACCAC 20 .2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10Í TGTGTTTTGC AACCTGAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 109: ATAGTGGCAC CACTTACGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 110; AATTCTGCAA CGTGATGGCG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 111: •(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 111 CACAAGATGC CTCGTCTGTG 20 .2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 112: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 112; AATCCGGACA AGGTACAGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 113: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 113: GCACGAGTGG CACAAGCCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 114: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 114: GCAAGCGTGT GGTGTCAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 115: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 115: TGTTTGAACA GGCTCTGGAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 116: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 116: CGGCATGGCA ATGAGGACAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 117: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 117 AGGACGAGAT GGACCTCCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 118: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11.

CCCTCTGTCC TCTAGCCCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 119: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 119; TCTTGAGGGG ACTGACTCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 120: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 120: TGAGTGAGGA GGCAGATGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 121: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 121 TGGCTTTGAA CAAAGAGCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 122: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 122; GCAAAAGACC AGGCTGACTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 123: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 123: TGCAGCTCCT TGGTCTTCTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 124: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 124 GATTCACAGT CCCAAGGCTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 125: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 125: ATCTGGATGA GGCGGTTGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 126: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico ' (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 126: GGTCACTCTC CGACGAGGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 127: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 127 GGATCCAAAG TTCGTCTCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 128: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12.

CGCTGTGTGT CTGATCCCTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 129: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 129: ATGAAGGTAA ACCCCGGGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 130: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 130: TGGTCTCTGG CTCTGAGCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 131: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: "lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 131: GCCTGGAGAA GCCCAGTCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 132: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 132: CACACTCTGG ACCGTTGCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 133: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 133: AAAGCTCCGC AGCCGCAGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 134: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 134: TCTTCCAGGA AGCTGCGGTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 135: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 135; GATGGTGGGG CAGCATTGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 136: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 136: GTCACCAGTG GTGCCTGCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 137: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 137 ACCTCACGGT TGCCAACCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 138: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 138 CGCAACAGCG TCTCCCTCTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 139: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple fD) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 139; AGTACCTTCA TAAGTTCTTC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 140: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 140; TCCCAGACTT CAACCTTCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 141: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 141, AAACATCTTC CCGGTCGGAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 142: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 142 GCTGAGCACC TTTACCTCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 143: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 143; GACGTCCGTC CGGGAAGATG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 144: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 144 ACACAGGAGA TGCAGGTCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 145: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 145: GAGTCTTCCA TGAAGAACAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 146: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 146: GCAGTGAGGA AGGTAAGGAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 147: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4047 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble CD) TOPOLOGÍA: lineal {ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 378 ... 1799 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 147 GGATCCAAAG GACGCCCCCG CCGACAGGAG AATTGGTTCC CGGGCCCGCG GCGATGCCCC 60 CCCGGTAGCT CGGGCCCGTG GTCGGGTGTT TGTGAGTGTT TCTATGTGGG AGAAGGAGGA 120 GGAGGAGGAA GAAGAAGCAA CGATTTGTCT TCTCGGCTGG TCTCCCCCCG GCTCTACATG 180 TTCCCCGCAC TGAGGAGACG GAAGAGGAGC CGTAGCCGCC CCCCCTCCCG GCCCGGATTA 240 TAGTCTCTCG CCACAGCGGC CTCGGCCTCC CCTTGGATTC AGACGCCGAT TCGCCCAGTG 300 TTTGGGAAAT GGGAAGTAAT GACAGCTGGC ACCTGAACTA AGTACTTTTA TAGGCAACAC 360 CATTCCAGAA ATTCAGG ATG AAT GGG GAT ATG CCC CAT GTC CCC ATT ACT 410 Het Asn Gly Asp Met Pro H is Val Pro He Thr 1 5 10 ACT CTT GCG GGG ATT GCT AGT CTC ACA GAC CTC CTG AAC CAG CTG CCT 458 Thr Leu Al* G ly He Ata Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asn Gtn Leu Pro 15 20 25 CTT CCA TCT CCT TTA CCT GCT ACA ACT ACA AAG AGC CTT CTC TTT AAT 506 Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Leu Leu Phe Asn 30 35 40 GCA CGA ATA GCA GAA GAG GTG AAC TGC CTT TTG GCT TGT AGG GAT GAC 554 Ala Arg lie Ala Glu Glu Val Asn Cys Leu Leu Ala Cys Arg Asp Asp 45 50 55 AAT TTG GTT TCA CAG CTT GTC CAT AGC CTC AAC CAG GTA TCA ACA GAT 602 Asn Leu Vil Ser Gln Leu Val His Ser Leu Asn Gln Val Ser Thr Asp 60 65 70 75 CAC ATA GAG TTG AAA GAT AAC CTT GGC AGT GAT GAC CCA GAA GGT GAC 650 His lie Glu Leu Lys Asp Asn Leu Gly Ser Aep Asp Pro Glu Gly Asp 80 85 90 ATA CCA GTC TTG TTG CAG GCC GTC CTG GCA AGG AGT CCT AAT GTT TTC 698 He Pro Val Leu Leu Gln Ata Val Leu Ala Arg Ser Pro Asn Val Phe 95 100 105 AGG GAG AAA AGC ATG CAG AAC AGA TAT GTA CAÁ AGT GGA ATG ATG ATG 746 Arg Glu Lys Ser Met Gln Asn Arg Tyr Val Gln Ser Gly Met Met Met 110 115 120 TCT CAG TAT AAA CTT TCT CAG AAT TCC ATG CAC AGT AGT CCT GCA TCT 794 Ser Gln Tyr Lys Leu Ser Gln Asn Ser Met His Ser Ser Pro Ala Ser 125 130 135 TCC AAT TAT CAÁ CAÁ ACC ACT ATC TCA CAT AGC CCC TCC AGC CGG TTT 842 Ser Asn Tyr Gln Gln Thr Thr He Ser His Ser Pro Ser Ser Arg Phe 140 145 150 155 GTG CCA CCA CAG ACA AGC TCT GGG AAC AGA TTT ATG CCA CAG CAÁ AAT 890 Val Pro Pro Gln Thr Ser Ser Gly Asn Arg Phe Met Pro Gln Gln Asn 160 165 170 AGC CCA GTG CCT AGT CCA TAC GCC CCA CAÁ AGC CCT GCA GGA TAC ATG 938 Ser Pro Val Pro Ser Pro Tyr Ala Pro Gln Ser Pro Ala Gly Tyr Met 175 180 185 CCA TAT TCC CAT CCT TCA AGT TAC ACA ACA CAT CCA CAG ATG CAÁ CAÁ 986 Pro Tyr Ser His Pro Ser Ser Tyr Thr Thr His Pro Gln Met Gln Gln 190 195 200 GCA TCG GTA TCA AGT CCC ATT GTT GCA GGT GGT TTG AGA AAC ATA CAT 1034 Ala Ser Val Ser Ser Pro He Val Ala Gly Gly Leu Arg Asn He His 15 205 210 215 GAT AAT AAA GTT TCT GGT CCG TTG TCT GGC AAT TCA GCT AAT CAT CAT 1082 Asp Asn Lys Val Ser Gly Pro Leu Ser Gly Asn Ser Ala Asn His His 220 225 230 235 GCT GAT AAT CCT AGA CAT GGT TCA AGT GAG GAC TAC CTA CAC ATG GTG 1130 Ala Asp Asn Pro Arg His Gly Ser Ser Glu Asp Tyr Leu Hts Met Val 240 245 250 CAC AGG CTA AGT AGT GAC GAT GGA GAT TCT TCA ACA ATG AGG AAT GCT 1178 His Arg Leu Ser Ser Asp Asp Gly Asp Ser Ser Thr Met Arg Asn Ala 255 260 265 20 GCA TCT TTT CCC TTG AGA TCT CCA CAG CCA GTA TGC TCC CCT GCT GGA 1226 Ala Ser Phe Pro Leu Arg Ser Pro Gln Pro Val Cys Ser Pro Ala Gly 270 275 280 AGT GAA GGA ACT CCT AAA GGC TCA AGA CCA CCT TTA ATC CTA CAÁ TCT 1274 Ser Glu Gly Thr Pro Lys Gly Ser Arg Pro Pro Leu He Leu Gln Ser 285 290 _ 295 CAG TCT CTA CCT TGT TCA TCA CCT CGA GAT GTT CCA CCA GAT ATC TTG 1322 Gln Ser Leu Pro Cys Ser Ser Pro Arg Asp Val Pro Pro Asp He Leu 300 305 310 315 CTA GAT TCT CCA GAA AGA AAA CAÁ AAG AAG CAG AAG AAA ATG AAA TTA 1370 Leu Asp Ser Pro Glu Arg Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Met Lys Leu 25 320 325 330 GGC AAG GAT GAA AAA GAG CAG AGT GAG AAA GCG GCA ATG TAT GAT ATA 1418 Gly Lys Asp Glu Lys Glu Gln Ser Glu Lys Ala Ala Met Tyr Asp He 335 340 345 ATT AGT TCT CCA TCC AAG GAC TCT ACT AAA CTT ACA TTA AGA CTT TCT 1466 He Ser Ser Pro Ser Lys Asp Ser Thr Lys Leu Thr Leu Arg Leu Ser 350 355 360 CGT GTA AGG TCT TCA GAC ATG GAC CAG CAÁ GAG GAT ATG ATT TCT GGT 1514 Arg Val Arg Ser Ser Asp Met Asp Gln Gtn Gtu Asp Met He Ser Gly 365 370 375 GTG GAA AAT AGC AAT GTT TCA GAA AAT GAT ATT CCT TTT AAT GTG CAG 1562 Val Glu Asn Ser Asp Val Ser Glu Asn Asp He Pro Phe Asn Val Gtn 380 385 390 395 TAC CCA GGA CAG ACT TCA AAA ACA CCC ATT ACT CCA CAÁ GAT ATA AAC 1610 Tyr Pro Gly Gln Thr Ser Lys Thr Pro He Thr Pro Gln Asp He Asn 400 405 410 CGC CCA CTA AAT GCT GCT CAÁ TGT TTG TCG CAG CAÁ GAA CAÁ ACA GCA 1658 Arg Pro Leu Asn ?la Ala Gln Cys Leu Ser Gln Gln Glu Gln Thr Ala 415 420 425 TTC CTT CCA GCA AAT CAÁ GTG CCT GTT TTA CAÁ CAG AAC ACT TCA GTT 1 06 Phe Leu Pro Ala Asn Gln Val Pro Val Leu Gln Gln Asn Thr Ser Val 430 435 440 GCT GCA AAA CAÁ CCC CAG ACC AAT AGT CAC AAA ACC TTG GTG CAG CCT 1754 Ala Ala Lys Gtn Pro Gln Thr Asn Ser His Lys Thr Leu Val Gln Pro «45 450 455 GGA ACA GGC ATA GAG GTC TCA GCA GAG CTG CCC AAG GAC AAG ACC TAAGA 1804 Gly Thr Gly He Gtu Val Ser Ala Glu Leu Pro Lys Asp Lys Thr 460 465 470 TCCAGCAGGG AACTATGTAG TCACCCCGAG AGGCCCAGCT CTCTCCGTGA GCTCTGGGCC 1864 TAGGGTGGGG GTGGTTGTTG GTTCTGCGCG CACTGTTCCC CCTACATGAT GGGTCCATCC 1924 CAGTTGGCTT CTCTCACTCG CTTCCTCCTG TGGAGAAGCC TGTCCAGGTG TCACTGCCTC 1984 C?GGAAGCTG TCTCTGATTT CTCCAGTTGA ACAGTGAGAT TTGCCACACC TCACATGCAT 2044 CGCTCTTGTC CCTGGAATTG TAACCATAGG TTTTCCTGTC TCCTGGAGGA CAAGGATGAG 2104 GGCTTTCCAC TTGAGTCTCC CTGGTGGAGC CCAGCTCCTG ACATACCTGG TAAAAGTTCT 2164 CAAGAGAAGA ACATGGAGGA GGAATGTGGA TAACAACCCT GGCTGCCTGT GTGTTCCAAG 2224 CTAGGAAGAT GTAATGTCCC CACAAACGGG GTAAATGGCT TGCCTGCGTC ACAGCTGTCT 2284 CAAGCCCAGG CCCTGGGCGC CAGCCCAAGC CCAAGGACTA GGTCCAGAGC CACACAGCGC 2344 CAGGCCACAT CCGCCTCACC TGGGACCCTT TGTGGGGTAC AGTCTCCGGC CCCACCCAGA 2404 CCTCCTG?AG GAGAGACCCC ATGGCAAGGA CTCAGCCACC TGCAGTTTCA TAAGCCCCCA 2464 GTGGGTTCCT AGGCATGAAG ACCACCGGTT AGAGGCTGAA CTGGCAGGAA CCTGTCTCCA 2524 DCCCCTTCTC ACCCCAGCCG GGCCCTGCCT CAGAGGCAGC ACCCAGGACG TGGCCATGAC 2584 CCGTGGACTC CACTCAATCC CTCTTCTCCA GGAGCCATGC AAAGTGTCAG CCAGCCAGGC 2644 CCCTGGAAGG CAGTCATCAC CTCTTAAGGC ATTGTGGGTG TCGGTCCTGC AACTGCCAGG Z704 TGCAGCACAC GACCCGTGTC CGGTGTTCGA TAGCAGGGAG CCATGACCTG GCAACGATTC 2764 C?CGCTCA?A GGGGCACCCG GGGGGCCCTG GGTCGGGGCG GATCAGCTTT CCCTGGGCAC 2824 ATCTGCCTCA TTCCAGATCT CCAGGGCTCA TGTCTGTGAC AGGGAGGGAA GGCTCTGCCC 2884 TGGCCTTCCG TCAGCTCTGC CAGTGCAGGC TGGGCAGCCT GGGCTTTAGA GCTGGCTTCT 2944 GCCCACACTT TCTCCGTGAA AGGAAAACA? CTATGAGTCT GCCAAACGCA TCTCAGATGC 3004 GTTTTAAAAA ATTCTGGTCC CCGCTCTCTG TCCCATCATC CGCCTCGGGG ACTTCCTCTC 3064 TCCGTGGTTC TCACCCCATA CTCTGTCACT GCCACATTTT CACCTGGGCC TGGCCTTTGT 3124 CTCCACCTGA AACTCCTGAA AATCTTGAAA TGGATTTCTA GGTCACTGGG GACTCCGGCA 3184 GCACATTCGG CTTC?GAATA AAGGGCGCCC GCGGTCCCCC AGCACCTCCC CAAGCCACAC 3244 CCCTAGCTTC CCTCCCTATC CCTGCAGCCT GAGGGTCCCT TCAGCCACCC TTAAGTCCCC 3304 ACCTGGGCTC CTGCCCCGCC CCTGGCTAGC AGCGCCTTCT CCACCGGGGC CCCCTCTGCT 3364 CACAGAGCCC CCTCACCTCC CTGGGGATGA GGGGCCAGGC CATGACCCTG AAAGTCTAGC 3424 CCTGGCCTTG ACCTCCCAGG AGCGCCCTCC CCGCCCTCTC CCGGCCCCGG CCCCGTCCTC 3484 TGCTGCTGGC CTCTGGGTCG TGCCCCGCAG ACTGAGCTGC GCTTGGGGGT CCTGGCGGCC 3544 TGGGCCGTCC CGCACCGAAC CCAGGCGGTC GGAGCCCGGC GGGAAGGCGC GAGGTCCTTC 3604 TGGGGGCTCC TCCGACGCCT GAGGGCGCTG CTTCCCCGCG GCCGCCCCGG GTTTCTGCGG 3664 AGCCGGGGCC TCCGCTCTCG GGTGACCCGG TGAGACCCCC GGGGAGGCCG CTGGGGAGGC 3724 GCGGGCTCTG CTCCCGGGTC CCAAACGCAC TGGCTGCCCC TCAGGAGGGA CGGCGACCTC 3784 CACCCACGGC GCTGGCGCCC GCACGGCCGC TCCTCCCGCT CCCGCAGCCT GGACGCCTCC 3844 CGAGGCCGCC CCGCCGGGCC CCACGCGCGG CCCCATCCGC AGGCCAGGAC TGCCTTCCCG 3904 G?GCTGGCGG CCCCCAGCCT GGAGGAGCCG GCCCCAGACG CCCTCCCAGC CCTCCCCAGC 3964 CCACTCTGGC CCCGCAGCCC CCGCCTGGTC CGAGTGCGGG TCTCTGGCCC CGGCCTTTCC 4024 CGGGGAAGGA AAGCAAAAAG CTT 4047 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 148: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 474 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 148: Met Asn Gly Asp Met Pro His Val Pro He Thr Thr Leu Ala Gly He ,1 5 10 15 Ata Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asn Glp Leu Pro Leu Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Leu Leu Phe Asn Ala Arg He Ala Gtu 35 40 45 Glu Val ?sn Cys Leu Leu Ata Cys Arg ?sp ?sp ?sn Leu Val Ser Gln 50 55 60 Leu Val His Ser Leu Asn Gln Val Ser Thr ?sp His He Gtu Leu Lys 65 70 75 80 Asp Asn Leu Gly Ser ?sp Asp Pro Glu Gly ?sp He Pro Val Leu Leu 85 90 95 Gln Ata Val leu Ata Arg Ser Pro ?sn V--I Phe Arg Glu Lys Ser Met 100 105 110 Gln Asn Arg. Tyr Vat Gtn Ser Gty Met Met Met Ser Gln Tyr Lys Leu 115 120 125 Ser Gln Asn Ser Met His Ser Ser Pro ?ta Ser Ser Asn Tyr Gin Gln 130 135 140 Thr Thr He Ser His Ser Pro Ser Ser Arg Phe Val Pro Pro Gln Thr 145 150 155 160 Ser Ser Gly Asn Arg Phe Met Pro Gln Gln Asn Ser Pro Vat Pro Ser 165 170 175 Pro Tyr Ala Pro Gln Ser Pro Ala Gty Tyr Met Pro Tyr Ser His Pro 180 185 190 Ser Ser Tyr Thr Thr His Pro Gln Met Gln Gln Ala Ser Val Ser Ser 195 200 205 Pro He Val Ala Gly Gly Leu Arg Asn He His Asp Asn Lys Val Ser 210 215 220 Gty Pro Leu Ser Gty Asn Ser Ata Aen His His ?la ?sp ?sn Pro ?rg 225 230 235 240 His Gly Ser Ser Glu ?sp Tyr Leu His Met Val His Arg Leu Ser Ser 245 250 255 Asp Asp Gly Asp Ser Ser Thr Met ?rg ?sn ?la ?ta Ser Phe Pro Leu 260 265 270 ?rg Ser Pro Gln Pro Val Cys Ser Pro ?ta Gty Ser Glu Gty Thr Pro 275 280 285 Lys Gty Ser ?rg Pro Pro Leu He Leu Gln Ser Gtn Ser Leu Pro Cys 290 295 300 Ser Ser Pro Are ?sp Val Pro Pro Asp He Leu Leu ?sp Ser Pro Glu 305 310 315 320 ?rg Lys Gln Lys Lys Gtn Lys Lys Met Lys. Leu Gly Lys Asp Glu Lys 325 330 335 Glu Gln Ser Glu Lys ?ta ?la Met Tyr Aep He He Ser Ser Pro Ser 340 345 350 Lyß Asp Ser Thr Lys Leu Thr Leu Arg Leu Ser Arg Vat Arg Ser Ser 355 360 365 Asp Met Aep Gln Gtn Glu Asp Met He Ser Gly Val Glu Asn Ser Asn 370 375 380 Vat ser Glu ?sn ?sp He Pro Phe ?sn Vat Gln Tyr Pro Gty Gtn Thr 385 390 395 400 Ser Lys Thr Pro He Thr Pro Gtn ?sp He ?sn ?rg Pro Leu ?sn ?la 405 410 415 ?la Gln Cys Leu Ser Gln Gln Glu Gln Thr Ata Phe Leu Pro Ala Asn 420 425 430 Gln Val Pro Val Leu Gln Gln Asn Thr Ser Val Ala ?la Lys Gln Pro 435 440 445 Gtn Thr ?sn Ser His Lys Thr Leu Val Gln Pro Gly Thr Gly He Glu 450 455 460 Val Ser ?la Glu Leu Pro Lys ?sp Lys Thr «65 470 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 149; (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2998 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 26 ... 799 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 149: AAGCTTTTTG A?TTCGGCAC GAGAT GCT ACA CAG GCT ATA TTT GAA AT? CTG 52 Ala Thr Gln Ala He Phe Glu He Leu 1 5 GAG AAA TCC TGG TTG CCC CAG AAT TGT ACA CTG GTT GAT ATG A?G ?TT 100 Glu Lys Ser Trp Leu Pro Gtn ?sn Cys Thr Leu Val ?ßp Met Lys He 10 15 20 25 GAA TTT GGT GTT GAT GTA ACC ACC A?? GA? ?TT GTT CTT GCT GAT GTT 148 Glu Phe Gly Vat Asp Val Thr Thr Lys Glu He Vat Leu Ata Asp Val 30 35 40 ATT GAC A?T GAT TCC TGG AG? CTC TGG CC? TCA GGA GAT CGA AGC CAÁ 196 He Asp Asn ?sp Ser Trp ?rg Leu Trp Pro Ser Gly ?sp ?rg Ser Gln 45 50 55 CAG AAA GAC A?? CAG TCT TAT CGG GAC CTC A?? G?A GTA ACT CCT GAA 244 Gln Lye ?sp Lys Gln Ser Tyr ?rg ?sp Leu Lys Glu Val Thr Pro Gtu 60 65 70 GGG CTC CAÁ ATG GTA A?G AAA ??C TTT GAG TGG GTT GC? GAG AG? GT? 292 Gly Leu Gln Met Val Lys Lys ?sn Phe Glu Trp Val Ala Gtu Arg Vat 75 80 85 GAG TTG CTT TTG AAA TCA GAA AGT CAG TGC ?GG GTT GTA GTG TTG ATG 340 Glu Leu Leu Leu Lys Ser Gtu Ser Gtn Cys ?rg Val Vat Val Leu Met 90 95 100 105 GGC TCT ACT TCT GAT CTT GGT CAC TGT GAA A?? ATC ?AG ?AG GCC TGT 388 Gly Ser Thr Ser Asp Leu Gly His Cys Glu Lys He Lys Lys Ala Cys 110 115 120 GGA A?T TTT GGC ?TT CCA TGT G?A CTT CGA GT? ACA TCT GCG CAT AAA 436 Gly ?sn Phe Gly He Pro Cys Glu Leu ?rg Val Thr Ser Ala His Lys 125 130 135 GGA CCA GAT GAA ?CT CTG AGG ATT AAA GCT GAG TAT GA? GGG G?T GGC 484 Gty Pro Asp Glu Thr Leu ?rg He Lys ?ta Glu Tyr Glu Gly ?sp Gly 140 145 150 ATT CCT ?CT GTA TTT GTG GC? GTG GCA GGC ?G? AGT ??T GGT TTG GGA 532 He Pro Thr Vat Phe Vat ?ta Vat Ata Gly Arg Ser ?sn Gly Leu Gly 155 160 165 CCA GTG ?TG TCT GGG A?C ?CT GC? T?T CC? GTT ATC ?GC TGT CCT CCC 580 Pro Val Met Ser Gly ?sn Thr Ata Tyr Pro Vat He Ser Cys Pro Pro 170 175 180 185 CTC ACA CCA GAC TGG GGA GTT CAG G?T GTG TGG TCT TCT CTT CGA CTA 628 Leu Thr Pro ?sp Trp Gly Val Gln ?sp Val Trp Ser Ser Leu Arg Leu 190 195 200 CCC AGT GGT CTT GGC TGT TCA ACC GT? CTT TCT CCA GAA GGA TC? GCT 676 Pro Ser Gly Leu Gly Cys Ser Thr Val Leu Ser Pro Glu Gly Ser ?la 205 210 215 CA? TTT GCT GCT C?G ?TA TTT GGG TT? AGC AAC CAT TTG GT? TGG ?GC 724 Gln Phe ?la ?la Gtn He Phe Gty Leu Ser Asn His Leu Val Trp Ser 220 225 230 AAA CTG CGA GCA AGC ATT TTG AAC AC? TGG ATT TCC TTG AAG CAG GCT 772 Lys Leu Arg Ala Ser He Leu Asn Thr Trp He Ser Leu Lys Gln Ala 235 240 245 GAC A?G ??A ATC AGA GAA TGT AAT TTA TA?GAAAGAA TGCCATTGAA TTTTTTA 826 Asp Lys Lys He Arg Glu Cys Asn Leu 250 255 GGGG?????C T?C???TTTC T?ATTT?GCT G??GGA???T C??GC?AG?T G??AAGGT?? 886 TTTT?AATTA G?G??C?C?? ATA?AATGT? TTAGTG??TA A?TGGTG?GG GTAGGCCTAT 946 TCAGATGCAA GGCCAGCAAT GGGGCTCCCC ATTATCCCC? CCCCTTTGGT CCCAGTCCCC 1006 TTCTCTGC?? TGGGCACGCA TAGAGGAGAG ?C???GGGT? TTAGACGC?? CATCATTGGC 1066 CC?GGGG?GT CCG?G??G?G CTGCCATTGG CTGACAGGGC ATTTTCAGGC TCTGTCATTG 1126 GTCAGGGAGC AC?CCCC?GC CTGAAGAGTG ATGCCATTGG CCAGGG?GTG GTTTTGTCAT 1186 AGCCGTTGGC TGTGA?GTGG ??GGA??AG? TCTGGGAATG A?GCCCTGTG GCC?GGAAGA 1246 TAGACAGGGC AGCAACTTCT GGGCCTCCAG GCCCTCTTCC CACC?T?GC? ATGTGGGC?? 1306 ?ACTGGTGTC AGGCCCC?GC C?GAAAAAGG ?GCCC??GCC AGAGGGC??G TG?C?AAGG? 1366 TGTACC?TGT CCMTCTCCC ACACCCTGGG GCTGCCCTTC CCA?TGTCTT TCTTGATAGC 1426 C?AGTTGGGC TGGG?GC?GC TC?CTGCTCC TCTAGCC?GG ?GGGTTTCTC AGCTCCTGG? 1486 GGCCGCAGCT TGATGTTGAA CTGCTGC?GG GTCTGCTCCA GCTGTTTCTG GTTCCC?GC? 1546 AAGT?GGCGG AC?C?GC?TT GTGGAAGAGC ?GC?GCTGCT TGTGC?TC?C CTTG?TCTTG 1606 TTTTCTTCCA GGA?CTTGAG CTTGATGGCC ?C?TCTCCCC GC?GCTTCTC ?T?CTTGTCC 1666 CGATGGGCCT GGAA?GTGGC CTGGGCACTC TC??GTCG?C C?CGTGTCCC TGCATCCCGG 1726 GGGCCTAGAC TC?GCTCCTC TAAGTCTGTT CGGTAGGCAT CATATTCCAG CCTGGCAGCC 1786 TCATACTGTT TCAC?GTCAT GAGCGTGTCT TCCATGGTCT TGGTGACCAA TGTGTTGATG 1846 CTAGAGACAA AGA?GTTCAC GGCTCCT?GC AGCGTTTCCC CATTCTTGCA TAGTAGTTTC 1906 TGTGTCTCTG CATTGTAGCC AAATTCCTCC TGAAGCTCTG GGGACTTCTG GCTGAGGTCA 1966 GGA?AGGCAT CACCCAGTGC ATGCTGGGTC TGCAGC?GGC TGTAGAGGTG GGCTGTCAGT 2026 GCCCGGCCCA GCTGCAGG?C ?CTCTC?T?C TTGCGCTTCG TCTCACGCAG CAACTCAATC 2086 TGCAGCTCT? GCTCCAGG?T TCCGGCGCCT CC?CTCCGTC CCCCGCGGGT CTGCTCTGTG 2146 TGCCATGGAC GGCATTGTCC C?GATAT?GC CGTTGGTACA A?GCGGGGAT CTGACGAGCT 2206 TTTCTCTACT TGTGTC?CTA ?CGG?CCGTT T?TC?TGAGC AGC??CTCGG CTTCTGCAGC 2266 AAACGGAAAT GACAGCAAGA AGTTCA??GG TGACAGCCGA ?GTGC?GGCG TCCCCTCTAG 2326 AGTGATCCAC ATCCGGAAGC TCCCC?TCG? CGTCACGGAG GGGG??GTCA TCTCCCTGGG 2386 GCTGCCCTTT GGGAAGGTCA CC?ACCTCCT G?TGCTGAAG GGGAAAAACC ?GGCCTTC?T 2446 CG?GATGAAC ACGGAGGAGG CTGCCAATAC C?TGGTGAAC T?CT?C?CCT CGGTGACCCC 2506 TGTGCTGCGC GGCCAGCCCA TCTACATCCA GTTCTCCAAC CACAAGGAGC TGAAGACCGA 2566 CAGCTCTCCC ??CCAGGCGC GGGCCCAGGC GGCCCTGCAG GCGGTGAACT CGGTCCAGTC 2626 GGGG?ACCTG GCCTTGGCTG CCTCGGCGGC GGCCGTGGAT GCAGGGATGG CGATGGCCGG 2686 GCAG?GCCCC GTGCTCAGGA TCATCGTGG? GA?CCTCTTC TACCCTGTG? CCCTGGATGT 2746 GCTGC?CC?G ATTTTCTCC? ?GTTCGGC?C AGTGTTG?AG ATC?TCACCT TCACCAAGAA 2806 CAACC?GTTC C?GGCCCTGC TGCAGTATGC GGACCCCGTG AGCGCCC?GC ?CGCC?AGCT 2866 GTCGCTGGAC GGGC?G?ACA TCTACA?CGC CTGCTGCACG CTGCGCATCG ACTTTTCC?? 2926 GCTC?CCAGC CTCAACGTCA ?GT?CA?C?? TGAC??G?GC CGTG?CT?CC TCGTGCCGAA 2986 TTCTTTGGAT CC 2998 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 150: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 258 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 150 Ata Thr Gin Ala He Phe Glu He Leu Glu Lye Ser Tf Leu Pro Gln 1 5 10 15 ?sn Cys Thr Leu Val Asp Met Lys He Glu Phe Gly Val Asp Val Thr 20 25 30 Thr Lys Gtu He Val Leu ?la ?sp Val He Asp Asn Asp Ser Trp ?rg 35 40 45 Leu Trp Pro ser Gly ?ep ?rg Ser Gln Gln Lys Asp Lye Gln Ser Tyr 50 55 60 Arg ?sp Leu Lys Glu Val Thr Pro Glu Gty Leu Gln Met Val Lys Lys 65 70 75 80 Asn Phe Gtu Trp Vat ?la Glu ?rg Val Glu Leu Leu Leu Lys Ser Glu 85 90 95 Ser Gln Cys ?rg Val Vat Val Leu Met Gly Ser Thr Ser ?sp Leu Gly 100 105 110 His Cys Glu Lys He Lys Lys ?la Cys Gly Asn Phe Gty He Pro Cys 115 120 125 Glu Leu ?rg Val Thr Ser ?ta His Lys Gly Pro ?sp Glu Thr Leu Arg 130 135 140 He Lys ?la Gtu Tyr Glu Gly ?sp Gty He Pro Thr Val Phe val Ala 145 150 155 160 Val Ala Gly ?rg Ser ?sn Gty Leu Gly Pro Vat Met Ser Gly Asn Thr 165 10 175 Ala Tyr Pro Val He Ser Cys Pro Pro Leu Thr Pro ?sp Trp Gly Vat 180 185 190 Gln ?sp Vat Trp Ser Ser Leu Arg Leu Pro Ser Gly Leu Gty Cys Ser 195 200 205 Thr Val Leu Ser Pro Glu Gly Ser Ala Gln Phe ?ta ?la Gln 1 le Phe 210 215 220 Gty Leu Ser ?sn His Leu Val Trp Ser Ly- ..eu Arg ?la Ser He Leu 225 230 235 240 Ain Thr Trp He Ser Leu Lys Gln Ata ?sp Lys Lys I le ?rg Glu Cys 245 250 255 Asn Leu (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 151: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1038 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA:' lineal (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 151 He Gln ?rg Phe Gty Thr Ser Gty His He Met ?sn Leu Gtn ?ta Gtn 1 5 10 15 Pro Lys ?la Gln ?sn Lys ?rg Lys ?rg Cys Leu Phe Gty Gly Gln Gtu 20 25 30 Pro Ala Pro Lys Glu Gln Pro Pro Pro Leu Gln Pro Pro Gln Gln Ser 35 40 45 He ?rg Val Lys Glu Glu Gln Tyr Leu Gly His Glu Gly Pro Gly Gly 50 55 60 ?la Val Ser Thr Ser Gln Pro Val Gtu Leu Pro Pro Pro Ser Ser Leu 65 70 75 80 ?la Leu Leu ?sn Ser Val Val Tyr Gly Pro Glu Arg Thr Ser ?la ?la 85 90 95 Met Leu Ser Gln Gtp Vat Ala Ser Val Lys Trp Pro Asn Ser Vat Met 100 105 110 Ala Pro Gly Arg Gly Pro Glu Arg Gty Gly Gly Gly Gly Val Ser Asp 115 120 125 Ser Ser Trp Gln Gln Gtn Pro Gty Gln Pro Pro Pro Hií Ser Thr Trp 130 135 140 Asn Cys His Ser Leu Ser Leu Tyr Ser Ala Thr Lys Gty Ser Pro Hiß 145 150 155 160 Pro Gly Val Gly Val Pro Thr Tyr Tyr Asn His Pro Gtu Ala Leu Lys 165 170 175 Arg Gtu Lys Ala Gly Gly Pro Gln Leu ?sp ?rg Tyr Vat ?rg Pro Met 180 185 190 Met Pro Gtn Lys Val Gln Leu Gtu Val Gly ?rg Pro Gln ?la Pro Leu 195 200 205 Asn Ser Phe His Ala Ala Lys Lys Pro Pro Asn Gln Ser Leu Pro Leu 210 215 220 Gln Pro Phe Gln Leu Ala Phe Gly His Gtn Vat Asn ?rg Gln Val Phe 2-5 230 235 240 Arg Gln Gty Pro Pro Pro Pro Asn Pro Val Ala Ala Phe Pro Pro Gln 245 250 255 Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gtn Gln Gln 260 265 270 Ala Ala Leu Pro Gln Met Pro Leu Phe Gtu ?sn Phe Tyr Ser Met Pro 275 280 285 Gln Gln Pro Ser Gln Gln Pro Gln Asp Phe Gly Leu Gln Pro Ala Gly 290 295 300 Pro Leu Gly Gln Ser His Leu ?la Hie His Ser Met ?ta Pro Tyr Pro 305 310 315 320 Phe Pro Pro Asn Pro Asp Met Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ala Leu Leu 325 330 335 Gln Asp Ser Ata Pro Gln Pro ?la Leu Pro Gtn Vat Gln He Pro Phe 340 345 350 Pro Arg Arg Ser Arg Arg Leu Ser Lys Glu Gly He Leu Pro Pro Ser 355 360 365 ?la Leu Asp Gly Ala Gty Thr Gln Pro Gly Gln Glu ?ta Thr Gly Asn 370 375 380 Leu Phe Leu His His Trp Pro Leu Gln Gln Pro Pro Pro Gly Ser Leu 385 390 395 400 Gty Gln Pro His Pro Glu Ala Leu Gty Phe Pro Leu Glu Leu Arg Glu 405 410 415 Ser Gln Leu Leu Pro Asp Gly Glu Arg Leu Ala Pro ?sn Gty ?rg Glu 420 425 430 Arg Glu Ala Pro Ala Met Gly Ser Gtu Glu Gty Het Arg Ata Val Ser 435 440 445 Thr Gly Asp Cys Gly Gtn Val Leu ?rg Gly Gly Val He Gln Ser Thr 450 455 460 Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ser Gln Glu ?la Asn Leu Leu Thr Leu ?la 465 470 475 480 Gln Lys Ala Val Gtu Leu Ala Ser Leu Gln Asn Ala Lys Asp Gty Ser 485 490 495 Gly Ser Glu Glu Lys ?rg Lys Ser Val Leu Ala Ser Thr Thr Lys Cys 500 505 510 Gly Val Glu Phe Ser Glu Pro Ser Leu ?la Thr Lys Arg Ala ?rg Glu 515 520 525 ?sp Ser Gly Met Val Pro Leu He He Pro Val Ser Val Pro Val ?rg 530 535 540 Thr Vat ?sp Pro Thr Glu ?ta ?ta Gln Ala Gly Gly Leu Asp Glu ?sp 545 550 555 560 Gly Lys Gly Leu Glu Gln ?sn Pro ?la GU.< His Lys Pro Ser Val He 565 570 575 Val Thr ?rg Arg Arg Ser Thr ?rg He Pro Gly Thr ?sp ?ta Gtn ?la 580 585 590 Gln ?la Glu Asp Met ?sn Val Lys Leu Glu Gly Glu Pro Ser Val ?rg 595 600 605 He Pro Thr Lys 20 25 Ala Val Lys ?la Thr Gln Thr Leu Gln Ala Asn Glu Ser Ala Ser Asp 980 985 990 He Leu He Leu Arg Ser His Glu Ser Asn Ala Pro Gly Ser Ala Gly 995 1000 1005 Gly Gln Ala Ser Glu Lys Pro Arg Glu Gly Thr Gly Lys Ser Arg Arg 1010 1015 1020 Ala Leu Pro Phe Ser Glu Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Ala 1025 1030 1035 NFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 152 ; (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 849 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 152 He Arg Hi s Glu Val Ser Phe Leu Trp Asp Thr Glu Ata Ala Cys Pro 1 5 10 15 - He Gln Thr Thr Thr Asp Thr Aßp Gln Ala Cyß Ser He Arg Asp Pro 20 25 30 Aßn Ser Gly Phe Val Phe Asn Leu Asn Pro Leu ?sn Ser Ser Gln Gly 35 40 45 Tyr ?sn Val Ser Gly He Gly Lys He Phe Met Phe ?ep Val Cye Gty Thr Met Pro Vat Cys Gly Thr He Leu Gly Lys Pro ?t. Ser G.y Cys Hu Al. Glu Thr Gtn Thr Gtu Glu Leu Lys 2n Tf Lye Pro ?t. ?rg >ro val Gty H, atu Ly. Ser Leu G.n Ser Thr Gtu Gty ll Ue 105 110 Thr Leu Thr Tyr Lyß Gty Pro Leu Ser ?la Lyß Gly Thr ?ta ?sp Ala 115 120 125 Phe He Vat ?rg Phe Vat Cyß ?sn ?sp ?sp Val Tyr Ser Gly Pro Leu 130 135 140 Lys Phe Leu His Gtn ?sp He ?sp Ser Gly Gln Gly He ?rg Asn Thr 145 150 155 160 Tyr Phe Glu Phe Glu Thr ?lß Leu Ala Cys Val Pro Ser Pro Val Asp 165 170 175 Cys Gln Val Thr ?sp Leu ?ta Gly Asn Glu Tyr ?sp Leu Thr Gty Leu 180 185 190 Ser Thr Val Arg Lys Pro Trp Thr Ata Val Aßp Thr Ser Val Aep Gly 195 200 205 ?rg Lys Arg Thr Phe Tyr Leu Ser Val Cys Aßn Pro Leu Pro Tyr He 210 215 220 Pro Gly Cys Gtn Gly Ser ?la Val Gty Ser Cys Leu Val Ser Glu Gty 2-5 230 235 240 ?sn Ser Trp ?sn Leu Gly Vat Val Gtn Met Ser Pro Gln ?la Ata ?ta 245 250 255 Asn Gly Ser Leu Ser He Met Tyr Val Asn Gly Asp Lys Cys Gty ?sn 260 265 270 Gln ?rg Phe Ser Thr ?rg He Thr Phe Glu Cys Ala Gtn He Ser Gty 275 280 285 Ser Pro ?la Phe Gln Leu Gln Asp Gly Cys Glu Tyr Vat Phe He Trp 290 295 300 Arg Thr Val Glu Ata Cys Pro Val Val Arg Val Glu Gty ?sp ?en Cys 305 310 315 320 Glu Val Lys ?sp Pro ?rg His Gly Asn Leu Tyr Asp Leu Lys Pro Leu 325 330 335 Gly Leu ?sn ?sp Thr He Val Ser ?ta Gly Glu Tyr Thr Tyr Tyr Phe 340 345 350 Arg Vat Cys Gly Lys Leu Ser Ser ?sp Val Cyß Pro Thr Ser ?sp Lys 355 360 365 Ser Lys Vat Vat Ser Ser Cys Gtn Glu Lys ?rg Gtu Pro Gln Gly Phe 370 375 380 His Lys Vat ?la Gty Leu Leu Thr Gln Lys Leu Thr Tyr Gtu ?sn Gty 385 390 395 400 Leu Leu Lys Met ?sn Phe Thr Gty Gty ?sp Thr Cys His Lys Val Tyr 405 410 415 Gln Arg Ser Thr ?ta He Phe Phe Tyr Cys ?sp ?rg Gly Thr Gln ?rg 420 425 430 Pro Vat Phe Leu Lys Glu Thr Ser ?sp Cyß Ser Tyr Leu Phe Glu Trp 435 440 445 Arg Thr Gln Tyr ?ta Cys Pro Pro Phe ?sp Leu Thr Glu Cys Ser Phe 450 455 460 Lys Asp Gly ?la Gty ?sn Ser Phe ?ep Leu Ser Ser Leu Ser ?rg Tyr 465 470 475 480 Ser ?sp Asn Trp Glu Ala He Thr Gly Thr Gly ?sp Pro Glu His Tyr 485 490 495 Leu He Asn Vat Cys Lys Ser Leu ?la Pro Gtn Ata Gly Thr Glu Pro 500 505 510 Cys Pro Pro Glu Ata Ata ?la Cys Leu Leu Gty Gly Ser Lys Pro Val 515 520 525 ?sn Leu Gty Arg Val Arg Asp Gty Pro Gln Trp Arg ?ep Gly He He 530 535 540 20 Val Leu Lys Tyr Val Asp Gty ?sp Leu Cys Pro Asp Gty He ?rg Lys 545 550 555 560 Lys Ser Thr Thr He Arg Phe Thr Cys Ser Glu Ser Gln Val ?sn Ser 565 570 575 •?rg Pro Met Phe He Ser ?ta Val Glu ?sp Cys Gtu Tyr Thr Phe ?la 580 585 590 Trp Pro Thr Ala Thr ?la Cys Pro Met Lyi Ser ?sn Glu His ?sp ?sp 595 600 605 Cyß Gln Val Thr Asn Pro Ser Thr Gly His Leu Phe ?sp Leu Ser Ser 610 615 620 Leu Ser Gty Arg Ala Gly Phe Thr ?la ?la Tyr Ser Glu Lys Gly Leu 625 63o 635 64o Val Tyr Met Ser He Cys Gly Gtu Asn Glu Asn Cys Pro Pro Gty Vat W5 650 655 Gly Ata Cys Phe Gly Gln Thr Arg He Ser Val Gly Lys Ala Asn Lys 660 665 670 Arg Leu ?rg Tyr Val ?sp Gln Vat Leu Gln Leu Val Tyr Lys ?sp Gly 675 680 685 Ser Pro Cys Pro Ser Lys Ser Gly Leu Ser Tyr Lye Ser Val He Ser 690 695 700 Phe Val Cyß ?rg Pro Glu ?la Gly Pro Thr ?sn ?rg Pro Met Leu He 705 710 715 720 Ser Leu ?sp Lys Gln Thr Cys Thr Leu Phe Phe Ser Tf His Thr Pro 725 730 735 Leu Ala Cys Glu Gln ?la Thr Glu Cys Ser Val ?rg Asn Gly Ser Ser 740 745 750 He Val ?ep Leu Ser Pro Leu He His ?rg Thr Gly Gly Tyr Glu ?la 755 760 765 Tyr Asp Glu Ser Glu ?sp ?sp ?la Ser ?sp Thr ?sn Pro ?ep Phe Tyr 770 775 780 He ?sn He Cys Gln Pro Leu Asn Pro Het Hie Gly Val Pro cys Pro 785 790 . 795 800 ?la Gly ?la ?la Vat Cys Lys Val Pro I le ?sp Gly Pro Pro He ?sp 805 810 815 ?la ?sn Glu 830 Phe Ser Cys (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 153 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 852 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 153; Met Ala ?rg Leu Ser ?rg Pro Glu ?rg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu 1 5 10 15 Glu ?sp Leu Pro Tyr Glu Gtu Glu Ue Met ?rg ?sn Gln Phe Ser Val 20 25 30 Ly» Cys Trp Leu Hiß Tyr He Glu Phe Lyß Gln Gly Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Arg Leu Asn Gtn Leu Tyr Glu ?rg ?la Leu Lyß Leu Leu Pro Cyß Ser 50 55 60 Tyr Lys Leu Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala ?rg ?rg Al. Gln Val Lyí 65 70 75 80 His ?rg Cys Val Thr ?sp Pro ?la Tyr Gtu Asp Vat Asn Asn Cys His 85 90 95 Glu Arg Ala Phe Val Phe Met Hiß Lys Met Pro Arg Leu Tf Leu Asp 100 105 110 Tyr Cys Gln Phe Leu Met ?sp Gln Gly ?rg Vat Thr His Thr Arg Arg 115 120 125 Thr Phe Asp Arg Ala Leu ?rg ?la Leu Pro He Thr Gln His Ser Arg 130 135 140 He T Pro Leu Tyr Leu Arg Phe Leu ?rg Ser His Pro Leu Pro Glu 145 150 155 160 Thr Ala Vat Arg Gly Tyr Arg ?rg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser 165 170 175 ?la Glu Glu Tyr He Glu Tyr Leu Ly» Ser Ser ?ßp ?rg Leu ?sp Glu 180 185 190 Ala Ala Gln Arg Leu Ata Thr Val Vat ?sn ?sp Glu ?rg Phe Val Ser 195 200 205 Lys ?la Gty Lys Ser ?sn Tyr Gtn Leu Trp His Glu Leu Cys ?sp Leu 210 215 220 He Ser Gtn ?sn Pro ?sp Lys Val Gln Ser Leu ?sn Val ?sp ?t. He 225 230 235. 2*0 He ?rg Gty Gly Leu Thr ?rg Phe Thr ?sp Gln Leu Gty Lys Leu Trp 245 250 255 Cys Ser Leu ?la ?sp Tyr Tyr I le ?rg Ser Gly His Phe Glu Lyß ?la 260 265 270 Arg Asp Val Tyr Glu Glu Al. He Arg Thr Val Met Thr Val ?rg ?sp 275 280 285 Phe Thr Gtn Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu Ser Het He 290 . 295 300 ?la ?la Lys Met Glu Thr ?la Ser Glu Leu Gly ?rg Glu Glu Glu Asp 305 310 315 320 Asp Val ?ßp Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu He Ser 325 330 335 Arg ?rg Pro Leu Leu Leu ?ßn Ser Vat Leu Leu Arg Gln Asn Pro His 340 345 350 10 Hiß Val His Glu Trp His Lys ?rg Val Ala Leu His Gtn Gty Arg Pro 355 360 365 ?rg Gtu He He Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr Val Aßp Pro 370 375 380 Phe Lys Ala Thr Gly Lys Pro Hiß Thr Leu Trp Val Ala Phe Ala Lys 385 390 395 400 Phe Tyr Glu Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala ?rg Val Ue Leu Glu 405 410 415 Lys Ala Thr Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu Ala Ser Val 420 425 430 Tf Cys Gln Cys Gty Gtu Leu Glu Leu ?rg His Glu ?sn Tyr ?sp Glu 435 440 445 Ata Leu Arg Leu Leu Arg Lys Ala Thr ?la Leu Pro ?la ?rg ?rg ?la 450 455 460 15 Glu Tyr Phe Asp Gly Ser Glu Pro val Gtn ?sn ?rg Val Tyr Lys Ser 465 470 475 480 Leu Lys Val Trp Ser Met Leu ?la ?sp Leu Glu Glu Ser Leu Gty Thr 485 490 495 Phe Gln Ser Thr Lys ?la Val Tyr ?sp Arg He Leu Asp Leu Arg He 500 505 510 ?la Thr Pro Gln He Val He ?sn Tyr ?la Het Phe Leu Glu Glu His 515 520 525 Lyß Tyr Phe Glu Glu Ser Phe Lys ?la Tyr Gtu ?rg Gly He Ser Leu 530 535 540 Phe Lys Trp Pro ?sn Vat Ser ?sp He T Ser Thr Tyr Leu Thr Lyß 545 550 555 560 Phe He ?la ?rg Tyr Gty Gly ?rg Lys Leu Glu ?rg ?la ?rg ?sp Leu 565 570 575 Phe Gtu Gln ?la Leu ?sp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr ?la Lys Thr Leu 580 585 590 Tyr Leu Leu Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu ?la ?rg His 595 600 605 Ala Met Ata Vat Tyr Gtu ?rg ?la Thr ?rg ?t. Val Glu Pro ?la Gln 610 615 620 Gln Tyr ?sp Het Phe ?sn He Tyr He Lys ?rg ?la ?ta Glu He Tyr 625 630 635 640 Gty Val Thr His Thr ?rg Gly He Tyr Gtn Lys ?la He Glu Val Leu 645 650 655 Ser ?sp Glu Hit Ala Arg Gtu Het Cys Leu ?rg Phe Ala ?sp Het Glu 660 665 670 Cys Lys Leu Gly Gtu He ?sp ?rg ?la ?rg ?la He Tyr Ser Phe Cyß 675 680 685 Ser Gtn He Cys ?sp Pro ?rg Thr Thr 25 Gly ?t. Phe Trp Gtn Thr Trp 690 695 700 Lys ?sp Phe Glu Val ?rg His Gly ?sn Glu ?sp Thr He Lys Glu Het 705 no 715 720 Leu ?rg He ?rg ?rg Ser Vat Gln ?ta Thr Tyr ?sn Thr Gln Vat ?sn 725 730 735 Phe Met ?la Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser ?la Thr Gly Thr 740 745 750 Val Ser ?sp Leu ?t. Pro Gly Gln Ser Gly Met ?sp Asp Het Lye Leu 755 760 765 Leu Gtu Gtn ?rg ?ta Glu Gln Leu Ala Ata Gtu ?ta Glu ?rg ?sp Gln 770 775 780 Pro Leu ?rg ?ta Gtp Ser Lys He Leu Phe V.l ?rg Ser ?sp ?l. Ser 785 790 795 800 ?rg Glu Glu Leu ?l. Glu Leu ?la Gln Glr. Val ?sn Pro Gtu Gtu lie 805 810 815 Gln Leu Gly Glu ?ep Glu ?sp Glu ?sp Glu Het ?sp Leu Glu Pro Asn 820 825 830 Glu V.l ?rg Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gty Ser 835 840 845 Leu Lys Glu ?sp 850 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 154 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 693 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 154 Met Phe Ser Ala Leu Lyß Lys Leu Val Gly Ser ?sp Gln ?la Pro Gly 1 5 10 15 Arg Asp Lys Asn He Pro ?la Gly Leu Gln Ser Met ?sp Gln Ata Leu 20 25 30 Gtn Arg Arg Phe ?la Lyß Gly Val Gln Tyr ?sn Met Lys He Vat He 35 40 45 Arg Gty Asp ?rg ?ßn Thr Gly Lys Thr ?la Leu 50 Trp His ?rg Leu Gtn 55 60 Gly ?rg Pro Phe Val Glu Glu Tyr He Pro Thr 65 Gln Glu He Gtn Val 70 75 Thr Ser 80 He Hiß Trp Ser Tyr Lyß Thr Thr ?sp ?sp He Val Lyß Vat 85 90 Glu Val 95 Trp ?ßp Val Val Aßp Lyß Gly Lyß Cyß Lys Lyß ?rg Gly ?sp 100 105 Gly Leu 110 Lys Met Gtu ?ßn Aep Pro Gln Glu Xaa Glu Ser Gtu Met ?la 115 120 125 Leu Asp Ala Glu Phe Leu Asp Val Tyr Lys ?sn Cys ?sn Gly Vat Vat 130 135 140 Met Met Phe ?sp He Thr Lys Glp Trp Thr Phe ?sn Tyr He Leu ?rg 145 150 155 160 Glu Leu Pro Lys Val Pro Thr His Val Pro Val Cys Val Leu Gly ?en 165 170 175 Tyr Arg Asp Het Gly Glu His Arg Vat lie Leu Pro ?sp ?sp Val ?rg 180 185 190 Aßp Phe He ?sp ?sn Leu ?sp ?rg Pro Pro Gly Ser Ser Tyr Phe ?rg 195 200 205 Tyr Ata Glu Ser Ser Het Lys Asn Ser Phe Gly Leu Lys Tyr Leu His 210 215 220 Lys Phe Phe Asn He Pro Phe Leu Gtn Leu Gln ?rg Glu Thr Leu Leu 225 230 235 240 ?rg Gln Leu Glu Thr Asn Gtn Leu Asp Het Asp ?la Thr Leu Glu Glu 245 250 255 Leu Ser Val Gln Gln Glu Thr Gtu Asp Gln Aen Tyr Gly He Phe Leu 260 265 Z70 Glu Het Met Glu Ata Arg Ser Arg Gty Hiß Ala Ser Pro Leu Ala Ala 275 280 285 ?sn Gty Gln Ser Pro Ser Pro Cly Ser Cln Ser Pro Val Leu Pro Ala 290 295 300 Pro ?la Val Ser Thr Gty Ser Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gln Pro ?la 305 310 315 320 Pro Gln Leu Pro Leu ?sn ?la Ala Pro Pro Ser Ser Val Pro Pro Val 325 330 335 Pro Pro Ser Glu Ala Leu Pro Pro Pro Ala Cys Pro Ser Ata Pro ?la 340 345 350 Pro Arg Arg Ser He He Ser Arg Leu Phe Gly Thr Ser Pro Ala Thr 355 360 365 Glu Ala AU Pro Pro Pro Pro Glu Pro Vat Pro Ala Ata Gtn Gly Pro 370 375 380 Ala Thr Val Gln Ser Vat Glu Aep Phe Val Pro Asp Asp Arg Leu ?sp 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu Gtu Asp Thr Thr Pro Ata Arg Asp Glu Lye Lys Val 405 410 415 Gty Ala Lys Ala ?ta Gtn Gln Asp Ser Asp Ser ?sp Gly Gtu ?la Leu 420 425 430 Gly Gly Asn Pro Met Val Ata Gty Phe Gtp Atp ?sp Vat ?sp Leu Glu 435 440 445 Asp Gln Pro Arg Gty Ser Pro Pro Leu Pro Ala Gly Pro Val Pro Ser 450 455 460 — Gln Asp He Thr Leu Ser Ser Gtu Glu Glu Ala Glu Val ?ta ?ta Pro 465 470 475 480 Thr Lys Gty Pro Ala Pro Ala Pro Gln Gln Cys Ser Gtu Pro Glu Thr 485 490 495 Lys Trp Ser Ser He Pro ?la Ser Lys Pro Arg ?rg Gty Thr ?ta Pro 500 505 510 Thr Arg Thr Ala ?la Pro Pro Trp Pro Gly Gly Val Ser Val ,?rg Thr 515 520 525 Gly Pro Gtu Lys Arg Ser Ser Thr ?rg Pro Pro ?ta Clu I *et i Glu Pro 530 535 540 20 Gly Lys Gly Glu Gtn Ata Ser Ser Ser Glu Ser / Up Pro Gtu i Sly Pro 545 550 555 560 He Ala Ala Gln Het Leu Ser Phe Val Met , Asp Aßp Pro ?sp 1 'he Glu 565 570 575 Ser Glu Gly Ser ?sp Thr Gtn ?rg ?rg ?t. i p ?ep Phe Pro Vat ?rg 580 585 590 Asp Aßp Pro Ser ?sp Val Thr Asp Gtu Asp 1 -lu Gly Pro ?la Glu Pro 595 600 605 Pro Pro Pro Pro Lyß Leu Pro Leu Pro ?l. Phe ?rg Leu Lys ?sn ?sp 610 615 . .20 Ser Aßp Leu Phe Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ala Gly Pro Lys Glu Ser 625. 630 635 640 Ser GLu Glu Cly Lys Glu Gty Lyß Thr Pro Ser Lyß Glu Lyß Lys Lyß «5 650 55 Lyß Thr Lye Ser Phe Ser Arg Val Leu Leu Glu Arg Pro Arg Ala His 660 665 670 Arg Phe Ser Thr Arg Val Gly Tyr Gtn Val Ser Vat Pro Asn Ser Pro 675 680 685 Tyr Ser Glu Ser Tyr 690 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (36)

BEIVINPICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos expresada al nivel del ARNm en los leucocitos mononucleares humanos que tienen el receptor de TNF de la superficie de la célula, por lo cual se incrementa la segmentación y la liberación del receptor de la superficie de la célula.

2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos está contenida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: a) la SEC. ID. NO:l; b) la SEC. ID. NO:2 y la SEC. ID. NO:3; c) la SEC. ID. NO: 4; d) la SEC. ID. NO: 5; e) la SEC. ID. NO: 6; f) la SEC. ID. NO: 7; g) la SEC. ID. NO: 8; h) la SEC. ID. NO: 9; e i) la SEC. ID. NO:10.

3. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende al menos 30 nucleótidos consecutivos en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia lineal de al menos 50 nucleótidos consecutivos al menos 90% idénticos a una secuencia contenida en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

5. Un polinucleótido aislado de al menos 50 nucleótidos, caracterizado porque es capaz de hibridizarse específicamente a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 a 68 °C en una solución amortiguadora de fosfato 0.5 M, de pH 7, al 7% de SDS, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, seguido por el lavado en una solución amortiguadora que contiene 3X SSC.

6. Un polinucleótido antisentido o ribozima, caracterizado porque comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, el cual inhibe la expresión de un modulador de TRRE.

7. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC. ID NOS: 147-154.

9. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende al menos 10 residuos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8.

10. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende al menos 15 aminoácidos consecutivos los cuales son al menos 80% idénticos a una secuencia contenida en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8.

11. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7-10, caracterizado porque cuando se incuba con las células COS-1 que expresan el receptor de TNF, promueve la segmentación y la liberación enzimática del receptor.

12. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7-11, caracterizado porque ya sea: a) carece de una secuencia que se extiende sobre la membrana; o b) es producido por un proceso que comprende la expresión recombinante en una célula huésped seguido por la purificación del polipéptido a partir del medio en el cual la célula es cultivada.

13. Un método de producción del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque comprende los pasos de: a) cultivar las células huésped alteradas genéticamente para expresar el pollnucleótido de conformidad con la reivindicación 3; y subsiguientemente b) purificar el polipéptido a partir de las células.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende colectar el medio de cultivo a continuación del paso a); y purificar el polipéptido a partir del medio de cultivo por un proceso que comprende la cromatografía de afinidad.

15. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9.

16. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque es específico para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-11.

17. Un método para producir el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende inmunizar a un mamífero o poner en contacto a una célula o partícula inmunocompetente con un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10.

18. Un método de ensayo para determinar la actividad de TRRE alterada en una célula o muestra de tejido, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra con el polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5 bajo las condiciones que permitan que el polinucleótido se hibridice específicamente con el ácido nucleico que codifica un modulador de la actividad de TRRE, si está presente en la muestra; y b) determinar el polinucleótido que se ha hibridizado como un resultado del paso a) , como una medida de la actividad de TRRE alterada en la muestra.

19. Un método de ensayo para determinar la expresión alterada de un modulador de la actividad de TRRE en una muestra de la célula o del tejido, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16 bajo las condiciones que permitan que el anticuerpo se una al modulador si está presente en la muestra, por lo cual se forma un complejo del anticuerpo-antígeno; y b) determinar el complejo formado en el paso a) , como una medida del modulador.

20. Un método para evaluar una condición de enfermedad asociada con la actividad de TRRE alterada en un sujeto, caracterizado porque comprende determinar la actividad de TRRE alterada en la muestra del sujeto de conformidad con la reivindicación 18, o determinar la expresión alterada de un modulador de TRRE de conformidad con la reivindicación 19, y luego correlacionar la extensión de la alteración con la condición de la enfermedad.

21. Un método para reducir la transducción de la señal desde una citocina hacia una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8 y 11-12, o con un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 15.

22. Un método para incrementar la transducción de la señal desde una citocina hacia una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, o con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16.

23. El método de conformidad con la reivindicación 21 y la reivindicación 22, caracterizado porque la citocina es el TNF.

24. Un método para seleccionar polinucleótidos 'para verificar la capacidad para modular la actividad de TRRE, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proveer células que expresan tanto el TRRE como el receptor de TNF; b) alterar genéticamente las células con los polinucleótidos que van a ser seleccionados; y c) clonar las células alteradas genéticamente en el paso b) ; y d) identificar los clones que liberan enzimáticamente el receptor a una velocidad alterada.

25. Un método para seleccionar las substancias en base a su capacidad para afectar la actividad del TRRE, caracterizado porque comprende los pasos de: a) incubar las células que expresan el receptor de TNF con un polipéptido de conformidad con la reivindicación 9 en la presencia de la substancia; b) incubar las células que expresan el receptor de TNF con un polipéptido de conformidad con la reivindicación 9 en la ausencia de la substancia; c) medir cualquier receptor de TNF liberado de las células en los pasos a) y b) ; y d) correlacionar un incremento o reducción del receptor liberado en el paso a) con relación a aquel en el paso b) con una capacidad de la substancia para mejorar o reducir la actividad de TRRE.

26. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8 u 11-12, en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o animal por cirugía o terapia.

27. El uso de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 6, o 15 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o animal por cirugía o terapia.

28. El uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o animal por cirugía o terapia.

29. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8 y 11-12, un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 15 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de falla cardiaca, caquexia, inflamación, choque endotóxico, artritis, esclerosis múltiple, y sepsis.

30. Un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende incrementar la transducción de la señal desde el TNF hacia las células en el sitio del cáncer en el sujeto, de conformidad con las reivindicaciones 22 o 23.

31. Un método de tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de falla cardiaca, caquexia, inflamación, choque endotóxico, artritis, esclerosis múltiple, y sepsis, caracterizado porque comprende reducir la transducción de la señal desde el TNF hacia las células en el sitio de la enfermedad en el sujeto, de conformidad con las reivindicaciones 21 o 23.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8 u 11-12.

33. El polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos no está contenida en ninguna de las secuencias de los siguientes Accesos del GenBank Nos: AJ003355, AA806165; AI002979; T33896; U52522; AA779203; C06247; AA707194; AA599596; 5453538; U13169 y J03528.

34. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizado porque la secuencia del mismo no está codificada completamente por una secuencia de polinucleótidos contenida en cualquiera de las secuencias de los siguientes Accesos del GenBank Nos: AJ003355, AA806165; AI002979; T33896; U52522; AA779203; C06247; AA707194; AA599596; 5453538; U13169 y J03528.

35. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia del mismo no está contenida en ninguna de las secuencias de los siguientes Accesos del GenBank Nos: AJ003355, AA806165; AI002979; T33896; U52522; AA779203; C06247; AA707194; AA599596; 5453538; U13169 y J03528.

36. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos es expresada al nivel del ARNm en las células T Jurkat; y cuando las células COS-1 que expresan el receptor de TNF son alteradas genéticamente para expresar la secuencia, las células tienen una actividad enzimática incrementada para segmentar y liberar el receptor.