MXPA00009801A - Metodos y composiciones para el diagnostico y tratamiento de trastornos de neurosiquiatricos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al gen Hcen-2 de mamífero. La invención serefiere a métodos para la identificación de compuestos que modulan la expresión de Hcen-2 y el uso de tales compuestos como agentes terapéuticos en el tratamiento de trastornos de Hcen-2. La invención se refiere también a métodos para el diagnóstico, evaluación, prueba genética y pronóstico de trastornos mediados por Hcen-2, y a métodos y composiciones para el tratamiento de estos trastornos. La invención se refiere también al uso del gen Hcen-2 y/o productos de gen como marcadores para el mapeo de estructura fina de una región del cromosoma humano 18, incluyendo una región del cromosoma involucrada en la mediación de trastornos neuropsiquitricos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE TRASTORNOS NEUROPSIQUIÁTRICOS 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere ensayos de tamizado para fármacos asi como a métodos de diagnóstico y terapéuticos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos mediados por la expresión de la forma mutante del gen de centrina humana (Hcen-2) o bien por niveles aberrantes de expresión de Hcen-2. La invención se basa en el descubrimiento por parte del solicitante que el gen Hcen-2 está unido al brazo corto del cromosoma 18 en una región del cromosoma involucrada en la mediación de trastornos neuropsiquiátricos tales como trastorno afectivo bipolar (BAD) . Asi, la invención se refiere al uso de gen Hcen-2 y/o producto de gen como marcadores para el mapeo de estructura fina de una región del cromosoma 18 humano, incluyendo una región del cromosoma involucrada en la mediación de trastornos neuropsiquátricos . La invención se refiere también a métodos para la identificación de compuestos que modulan la expresión, sintesis y actividad de la proteina/gen Hcen-2 y al uso de compuestos tales como los identificados como agentes terapéuticos en el tratamiento de un trastorno mediado por Hcen-2; un trastorno neuropsiquiátrico, incluyendo, a titulo de ejemplo y no limitativo, trastorno afectivo bipolar. La invención se refiere también a métodos para el diagnóstico, evaluación, prueba genética y pronostico de trastornos mediados por Hcen-2. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existen solamente algunos trastornos psiquiátricos en los cuales las manifestaciones clínicas del trastorno pueden ser correlacionadas con defectos demostrables de la estructura y/o función del sistema nervioso. Ejemplos bien conocidos de tales trastornos incluyen enfermedad de Huntington, que puede ser rastreada a una mutación en un gen único y en donde neuronas de la estria degeneran, y enfermedad de Parkinson, en donde neuronas dopaminérgicas degeneran en la via nigro-estriatal. La gran mayoria de los trastornos psiquiátricos sin embargo involucran probablemente cambios sutiles y/o indetectables, a niveles celulares y/o moleculares, en la estructura y función del sistema nervioso. Esta falta de efectos neurológicos detectables distingue las enfermedades "neuropsiquiátricas" como por ejemplo esquizofrenia, trastornos de déficit de atención, trastornos esquizoafectivo, trastornos afectivos bipolares, o bien trastorno afectivo unipolar, de los trastornos neurológicos en los cuales patologías anatómicas o biológicas son evidentes. Por consiguiente, la identificación de los defectos causantes y de las neuropatologias de los trastornos neuropsiquiátricos se requieren para poder permitir a los médicos evaluar y prescribir cursos apropiados de tratamiento para curar o mejorar los síntomas de estos trastornos. Uno de los trastornos neuropsiquiátricos más común y potencialmente devastador es el trastorno afectivo bipolar (BAD) , que se conoce también como trastorno bipolar del humor (BP) o bien enfermedad maniaco-depresiva, que se caracteriza por episodio de humor elevado (mania) y depresión (Goodwin, et al., 1990, Manic Depressive Illness, Oxford University Press, Nueva York) . Las formas más severas y clínicamente distintivas de BAD son BP-I (trastorno afectivo (humor) bipolar severo) , que afecta de 2 a 3 millones de personas en un los Estados Unidos de América, y SAD-M (trastorno esquizoafectivo de tipo maniaco) . Se caracterizan por lo menos, un episodio completo de mania, con o sin episodio de depresión mayor (que se define por un humor bajo, o depresión, con trastornos asociados en cuanto comportamiento rítmico tales como sueño, alimentación y actividad sexual) . BP-I seco segrega frecuentemente en familias con síndromes más etiológicamente heterogéneos, tales como trastorno afectivo unipolar como por ejemplo trastorno depresivo mayor unipolar (MDD) , que es un fenotipo más ampliamente definido (Freimer and Reus, 1992, en The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease (La Base Molecular y Genética de la Enfermedad Neurológica), Rosenberg, et al., eds., Butter orths, New York, páginas 951-965; Mclnnes and Freimer, 1995, Curr. Opin. Genet. Develop., 5, 376- 381). BP-I y SAD-M son trastornos severos del humor que son frecuentemente difíciles de distinguir entre ellos de manera cruzada, siguen evoluciones químicas similares, y se segregan juntos en estudios familiares (Rosenthal, et al., 1980, Arch. General Psychiat. 37, 804-810; Levinson and Levitt, 1987, Am. J. Psychiat. 144, 415-426; Goodwin, et al., 1990, Manic Depressive Illness, Oxford University Press, New York) . Por consiguiente, se requieren de métodos para distinguir trastornos neuropsiquiátricos tales como estos con el objeto de diagnosticar efectivamente y tratar los individuos que padecen de dichos trastornos. Hoy en dia se evalúan tipicamente las personas en cuanto a BAD empleando los criterios presentados en la versión más actualizada del manual de diagnóstico y estadística de trastornos mentales (DSM) de la American Psychiatric Association (Asociación Psiquiátrica Americana) . Mientras muchos fármacos han sido empleados para tratar a personas diagnosticadas con BAD, incluyendo sales de litio, carbamazepina y ácido valproico, ningunos de los fármacos actualmente disponibles es adecuado. Por ejemplo, tratamientos farmacéuticos son efectivos solamente en aproximadamente 60-70% de las personas diagnosticadas con BP-I. Además, actualmente es imposible predecir qué tratamientos farmacológicos serán efectivos, por ejemplo, para tratar individuos afectados por BP-I particulares.

Comúnmente, al efectuarse el diagnóstico, a los individuos afectados se les prescribe un fármaco tras otro hasta encontrar el fármaco efectivo. Una prescripción temprana de un tratamiento farmacológico efectivo, por consiguiente, es critica por varias razones, incluyendo para evitar la ocurrencia de episodios maniacos extremadamente peligrosos y el riesgo de deterioro progresivo sino se encuentra un tratamiento efectivo. La existencia de un componente genético para BAD es fuertemente apoyado por análisis de segregación y estudios con gemelos (Bertelson, et al., 1977, Br, J. Psychiat. 130, 330-351; Freimer and Reus, 1992, en The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease (La Base Molecular y Genética de la Enfermedad Neurológica), Rosenberg, et al., eds., Butterworths, New York, páginas 951-965; Pauls, et al., 1992, Are. G. Psychiat. 49, 703-708). Esfuerzos para identificar la ubicación en el cromosoma de los genes que pueden estar involucrados en BP-I, sin embargo, han producido resultados desalentadores en la medida en que no se pudieron replicar de manera independiente ni confirmar en re-análisis de las genealogías originales la relación entre BP-I y los marcadores en cromosomas XI11, io que indica que en estudios de relación con BAD aún resultados lod extremadamente altos en un locus único pueden ser positivos falsos (Barón, et al., 1987, Nature 326, 289-292; Egeland, et al., 1987, Nature 325, 783-787; Kelsoe, et al., 1989, Nature 342, 328-243; Barón, et al., 1993, Nature Genet. 3, 49-55) . Investigaciones resientes han sugerido ubicaciones posibles de genes de BAD en los cromosomas 18p y 21q, pero en ambos casos la región candidata propuesta no es bien definida ni existe un soporte inequívoco para cualesquiera de estas ubicaciones (Berrettini, et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 5918-5921, Murray, et al., 1994, Science 265, 2049-2054; Pauls, et al., 1995 Am. J. Hum. Genet. 57, 636-643; Maier, et al., 1995, Psych. Res. 59, 7-15; Straub, et al., 1994, Nature Genet. 8, 291-296). El mapeo de genes para enfermedades comunes causadas supuestamente por genes múltiples, como por ejemplo BAD , puede ser complicado debido a la definición tipicamente imprecisa de genotipos, por heterogeneidad etiológica, y por incertidumbre en cuanto al modo de trasmisión genética del rasgo de la enfermedad. En el caso de trastornos neuropsiquiátricos existe una ambigüedad aún mayor en la distinción de individuos que llevan probablemente un genotipo afectado de los individuos que no son genéticamente afectados. Por ejemplo, se puede definir un genotipo afectado para BAD mediante la inclusión de uno o varios del agrupamiento amplio de clasificaciones de diagnóstico que constituyen los trastornos del humor: BP-I, DAS-M, MDD, y trastorno afectivo bipolar (humor) con hipomania y depresión mayor (BP-II) . Asi, una de las dificultades principales a las cuales se enfrentan los especialistas en genética psiquiátrica es ciertamente la validez de designaciones de fenotipo, puesto que los diagnósticos clínicos se basan solamente en observación clínica y reportes subjetivos. Así mismo, con rasgos complejos tales como trastornos neuropsiquiátricos, es difícil mapear genéticamente los genes que provocan el rasgo porque: (1) los fenotipos de trastornos neuropsiquiátricos no presentan patrones de herencia recesivos o dominantes Mendelianos clásicos atribuibies a un locus genético único, (2) puede existir una penetrancia incompleta, es decir, individuos que heredan un alelo de predisposición puede no manifestar la enfermedad; (3) puede ocurrir un fenómeno de fenocopia, es decir, individuos que no heredan un alelo de predisposición puede sin embargo desarrollar una enfermedad debido a causas ambientales o aleatorias; (4) puede existir heterogeneidad genética, en dicho caso mutaciones en cualesquiera de varios genes pueden resultar en fenotipos idénticos. A pesar de estas dificultades, sin embargo, la identificación de la ubicación cromosomal consecuencia y función de genes y producto de genes responsables de provocar trastornos neuropsiquiátricos como por ejemplo trastornos afectivos bipolares es de gran importancia para asesoría genética, diagnóstico y tratamiento de individuos en familias afectadas. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención identificar bases genéticas para trastornos neuropsiquiátricos, proporcionan métodos para el tratamiento y diagnóstico de trastornos neuropsiquiátricos, y proporcionan métodos para identificar compuestos para su uso como parte de métodos terapéuticos y/o diagnósticos. La invención se refiere además a métodos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos mediados por Hcen-2, donde tales métodos comprenden la administración de un compuesto que modula la expresión de un gen Hcen-2 de mamífero y/o la síntesis o actividad de un producto de gen Hcen-2 de mamífero de tal manera que se mejoren síntomas del trastorno. La invención se refiere además a métodos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos mediados por Hcen-2 de mamífero que resultan a partir de mutaciones de gen Hcen-2, donde tales métodos comprenden el suministro al mamífero de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto de gen Hcen-2 no afectado de tal manera que el producto de gen Hcen-2 no afectado es expresado y se mejoran los síntomas del trastorno.

La invención se refiere además a métodos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos mediados por Hcen-2 de mamífero que resultan de mutaciones de gen Hcen-2, donde tales métodos comprenden el suministro al, mamífero de una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un producto de gen Hcen-2 no aceptado de tal manera que la célula exprese el producto de gen Hcen-2 no afectado si se mejoran síntomas del trastorno. Además, la presente invención se enfoca hacia método que emplean el gen Hcen-2 y/o secuencias de producto de gen para la evaluación de diagnóstico, prueba genética y pronóstico de un trastorno mediado por Hcen-2. Por ejemplo, la invención se refiere a métodos para diagnosticar trastornos neuropsiquiátricos mediados por Hcen-2, donde tales métodos comprenden la medición de expresión de gen Hcen-2 en una muestra de paciente o bien la detección de una mutación de Hcen-2 en el genoma del mamífero del cual se sospecha que presenta dicho trastorno. La invención se refiere además a métodos para identificar compuestos capaces de modular la expresión del gen Hcen-2 de mamífero y/o la síntesis o actividad de producto de gen Hcen-2 de mamífero, donde tales métodos comprenden la puesta en contacto de un compuesto con una célula que expresa un gen Hcen-2, medir el nivel de expresión de gen Hcen-2, expresión de producto de gen o bien actividad de producto de gen, y comparar el nivel con el nivel de expresión de gen Hcen-2, expresión de producto de gen o bien actividad de producto de gen producida por la célula en ausencia del compuesto, de tal manera que si el nivel obtenido en presencia del compuesto difiere del nivel obtenido en ausencia del compuesto, se ha identificado un compuesto capaz de modular la expresión del gen Hcen-2 de mamífero y/o la síntesis o actividad de los productos de gen Hcen-2 de mamífero. La invención se basa, en parte, en el mapeo genético y fisico del gen Hcen-2 en una porción especifica del cromosoma 18 humano, y específicamente en el brazo corto del cromosoma 18 humano entre el telómero y D185481, descrito en el ejemplo presentado a continuación en la sección 6. Así, la invención se refiere también al uso del gen Hcen-2 y/o productos de gen como marcadores para el mapeo de estructura fina de esta región del cromosoma 18 humano. El término "trastorno mediado por Hcen-2" como se emplea aqui se refiere a un trastorno que involucra un nivel aberrante de expresión de gen Hcen-2, sintesis de producto de gen y/o actividad de producto de gen con relación a niveles encontrados en individuos normales, no afectados, niveles encontrados en individuos clínicamente normales, y/o niveles encontrados en una población cuyo nivel representa una línea basal, nivel de Hcen-2 promedio. 3.1 DEFINICIONES Como se emplea aquí, los siguientes términos serán abreviados de la siguiente manera. BAC, cromosomas artificiales bacterianos BAD, trastorno (s) afectivo (s) bipolar (es) BP, trastorno de humor bipolar BP-I, trastorno afectivo (humor) bipolar severo BP-II, trastorno afectivo (humor) bipolar con hipomanía y depresión mayor bp, par (es) de base(s) EST, marcador de secuencia expresado lod, logaritmo de probabilidades MDD, trastorno depresivo mayor unipolar ROS, especie de oxígeno reactivo RT-PCR, reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa reversa SSCP, polimorfismo conformacional de cadena única SAD-M, tipo maniaco de trastorno esquizoafectivo STS, secuencia de marcador corto YAC, cromosoma artificial de levadura. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Secuencia de gen Hcen-2 humana (SEQ ID NO:l) . Se indican las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:2). Figuras 2A-C. Secuencia genómica del gen Hcen-2 humano (SEQ ID NO: 3). Exones en negritas. Los UTRs de extremos 3' y 5' están subrayados y en negritas. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa en el mapeo genético y físico del gen Hcen-2 en una porción específica, estrecha del cromosoma 18, que se describe también en el ejemplo presentado a continuación en la sección 6. La invención descrita en las subsecciones abajo abarca método de tamizado (por ejemplo, ensayos) para la identificación de compuestos que pueden emplearse para tratar individuos que padecen de un trastorno mediado por Hcen-2. La invención abarca también agonistas y antagonistas del producto de gen Hcen-2, incluyendo pequeñas moléculas, grandes moléculas, y anticuerpos, así como secuencias de nucleótidos que pueden ser empleadas para inhibir la expresión de gen Hcen-2 (por ejemplo, moléculas de antisentido y ribozima) , y gen o constructos de reemplazo de secuencia regulatoria designados para incrementar la expresión de gen Hcen-2 (por ejemplo, constructos de expresión que colocan el gen Hcen-2 bajo el control de un sistema de promotor fuerte) . Particularmente, ensayos celulares y no celulares se describen que pueden emplearse para identificar compuestos que interactúan con el producto de gen Hcen-2, por ejemplo, modular la actividad del Hcen-2 y/o enlazarse con el producto de gen Hcen-2. Tales ensayos basados en células de la presente invención emplean células, lineas celulares, o bien células manipuladas o líneas de células manipuladas que expresan el producto de gen Hcen-2. La invención abarca también el uso de ensayos basados en células o ensayos de lisados de células (por ejemplo, ensayos de traslación o transcripción in vitro) para tamizar compuestos o composiciones que modulan la expresión de gen Hcen-2. Para este propósito, constructos que contienen una secuencia reportera enlazada a un elemento regulatorio del gen Hcen-2 pueden emplearse en células manipuladas, o bien en extractos de lisados de células para tamizar para determinar la presencia de compuestos que modulan la expresión del producto de gen reportero a nivel de transcripción. Por ejemplo, tales ensayos podrían emplearse para identificar compuestos que modulan la expresión o actividad de factores de transcripción involucrados en la expresión de gen Hcen-2, o bien para probar la actividad de polinucleótidos de triple hélice. Alternativamente, células manipuladas o bien extractos de translación pueden emplearse para tamizar para compuestos (incluyendo constructos de antisentido y ribozimas) que modulan la translación de transcriptos de ARNm de Hcen-2, y por consiguiente afecta la expresión del producto de gen Hcen-2.

La invención abarca también productos de gen Hcen-2, polipéptidos (incluyendo polipéptidos de Hcen-2 solubles o bien péptidos) así como proteínas de fusión de Hcen-2 para su uso en ensayo de tamizado no basados en células, para su uso en la generación de anticuerpos, para diagnósticos y propósitos terapéuticos. Tales péptidos o polipéptidos pueden ser fusionados sobre una proteína heteróloga, por ejemplo, reportero, una región Fc de Ig, etc., para proporcionar una proteína de fusión. Tales péptidos, polipéptidos y proteínas de fusión pueden emplearse en los ensayos no basados en células para tamizar compuestos que interactúan con la actividad del producto de gen Hcen-2 y/o se unen con el producto de gen Hcen-2, por ejemplo, modulan dicha actividad. Las proteínas de Hcen-2 pueden emplearse para tratar trastornos. Tales productos de gen Hcen-2 incluyen, sin limitarse a ellos, derivados solubles tales como péptidos o polipéptidos que corresponden a uno o varios dominios del producto de gen Hcen-2. Alternativamente, anticuerpos de la proteína de Hcen-2 o bien anticuerpos anti-idiotípicos que imitan el producto de gen Hcen-2 (incluyendo fragmentos Fab), antagonistas o agonistas pueden emplearse para tratar trastornos neuropsiquiátricos que involucran Hcen-2. En otro enfoque, constructos de nucleótidos que codifican tales productos de gen Hcen-2 pueden emplearse para manipular genéticamente células huéspedes para expresar tales productos de gen Hcen-2 in vivo; estas células genéticamente manipuladas pueden funcionar como "bioreactores" en el cuerpo entregando un suministro continuo de producto de gen Hcen-2, péptidos de Hcen-2, polipéptidos de Hcen-2 solubles. Además, esta invención presenta métodos para la evaluación de diagnóstico y pronóstico de trastornos mediados por Hcen-2. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican Hcen-2 pueden emplearse como sondas de hibridación de diagnóstico o bien como iniciadores para análisis de diagnóstico de reacción en cadena de polimerasa para la identificación de mutaciones de gen Hcen-2, variaciones alélicas y defectos de regulación en el gen Hcen-2. Los enfoques de "terapia genética" para la modulación de la expresión de gen Hcen-2 y/o actividad en el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, constructos de nucleótidos que codifican gen Hcen-2 funcional, gen Hcen-2 mutante, así como moléculas de antisentido y ribozima pueden emplearse para modular la expresión de gen Hcen-2. La invención abarca también formulaciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos que involucran el gen Hcen-2. La presente invención presenta métodos para seleccionar un fármaco efectivo para su administración a una persona que tiene un trastorno mediado por Hcen-2. Tales métodos se basan en la detección de polimorfismos genéticos en el gen Hcen-2 o variaciones en la expresión del gen Hcen-2 provocados por metilación alterada, rotación diferencial, o modificación post-transduccional del producto de gen Hcen-2 que pueden afectar la seguridad y eficacia del agente terapéutico. 5.1. EL GEN Hcen-2 Con relación a las secuencias de gen Hcen-2 de conformidad con lo divulgado en la figura 1, tales secuencias pueden, por ejemplo, obtenerse fácilmente mediante la utilización de tecnologias estándares para secuenciación y cromosoma artificial bacteriano (BAC) con relación a BAC54 (Referencia de identificación EpHS996, No. de acceso ATCC 98363) . Por ejemplo, se pueden efectuar bibliotecas a partir de BAC54. Fragmentos de un tamaño conveniente como por ejemplo, en el rango de tamaños de aproximadamente 1 kb, se clonan en un plásmido estándar, y se secuencian. Secuencias adicionales de Hcen-2 pueden después identificarse fácilmente mediante alineación de la secuencia de BAC con las secuencias de Hcen-2 presentadas en la figura 1 (SEQ ID N0:1). Alternativamente, subclones de BAC que contienen secuencias de Hcen-2 adicionales pueden identificarse mediante la identificación de los subclones que se hibridan con sondas derivadas de las secuencias de Hcen-2 representadas en la figura 1. Con relación a la clonación de variantes alélicas del gen Hcen-2 humano y homólogos de otras especies (por ejemplo, ratón) , las secuencias de gen Hcen-2 aisladas divulgadas aquí pueden ser marcadas y empleadas para tamizar una biblioteca de ADNc construida a partir de ARNm obtenido de células o tejidos apropiados (por ejemplo, tejidos cerebrales) derivados del organismo (por ejemplo, ratón) de interés. Las condiciones de hibridación empleadas deben ser de bajo nivel de estrictez cuando la biblioteca de ADNc se deriva de un organismo diferente del tipo de organismo a partir del cual se derivó la secuencia marcada. Alternativamente, el fragmento marcado puede ser empleados para tamizar una biblioteca genómica derivada del organismo de interés, otra vez, empleando condiciones apropiadamente estrictas. Condiciones con bajo nivel de estrictez son bien conocidas por parte de los expertos en la materia y varían de manera predecible según los organismos específicos a partir de los cuales se derivan la biblioteca y las secuencias marcadas. Para una guía en cuanto a estas condiciones, véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación molecular, un manual de laboratorio) , segunda edición, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular) , Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. Además, una variante alélica de gen Hcen-2 puede ser aislada por ejemplo de ácido nucleico humano mediante la realización de reacción en cadena de polimerasa empleando dos conjuntos de iniciadores de oligonucleótidos degenerados diseñados con base en las secuencias de aminoácidos dentro del producto de gen Hcen-2 divulgado aqui. El templado para la reacción puede ser ADNc obtenido por transcripción reversa de ARNm preparado por ejemplo a partir de líneas de células o tejidos humanos o no humanos de los cuales se sabe o se sospecha que expresan un alelo de gen Hcen-2 (como por ejemplo línea de células de leucemia humana, por ejemplo, K562, B1A, H630 y H630-1, por ejemplo, Dolnick et al., 1996, Cáncer Research 56:1207-3260; Dolnick et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21:1747-1752; Black et al., 1996, Cáncer Res. 56:700-705). De preferencia, la variante alélica será aislada de una persona que tiene un trastorno mediado por Hcen-2. El producto de reacción en cadena de polimerasa puede ser subclonado y secuenciado para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una secuencia de ácido nucleico de gen Hcen-2. El fragmento de reacción en cadena de polimerasa puede ser empleado después para aislar un clon de ADNc de longitud total a través de varios métodos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede ser marcado y empleado para tamizar una biblioteca de ADNc de bacteriófagos. Alternativamente, el fragmento marcado puede ser empleado para aislar clones genómicos a través del tamizado de una biblioteca genómica.

Se puede emplear también tecnología de reacción en cadena de polimerasa para aislar secuencias de ADNc de longitud completa. Por ejemplo, se puede aislar ARN después de procedimientos estándares, a partir de una fuente de tejido o de célula apropiada (es decir, una fuente de la cual se sabe o se sospecha que expresa el gen Hcen-2 como por ejemplo muestras de tejido cerebral obtenidas a través de biopsia o post-mortem) . Una reacción de trascripción reversa puede llevarse a cabo en el ARN empleando un iniciador de oligonucleótido específico para el extremo 5' del fragmento amplificado para la iniciación de la síntesis de primera cadena. El híbrido AR?/AD? resultante puede después ser "recibir una cola" de guaninas empleando una reacción de transferasa terminal estándar, el hibrido puede ser digerido con AR?asa H y una síntesis de segunda cadena puede después ser iniciada con un iniciador poli-C. Así, secuencias de AD?c corriente arriba del fragmento amplificado pueden ser fácilmente aisladas. Para una reseña de las estrategias de clonación que pueden emplearse, véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra. Como arriba mencionado, las secuencias de gen Hcen-2 pueden ser empleadas para aislar alelos de gen Hcen-2 mutantes, de preferencia a partir de un paciente humano. Tales alelos mutantes pueden ser aislados de individuos de los cuales se sabe o se sospecha que tienen un genotipo que contribuye a los síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Alelos mutantes asi como productos de alelos mutantes pueden ser empleados en los sistemas terapéuticos y de diagnóstico descritos abajo. Además, tales secuencias de gen Hcen-2 pueden emplearse para detectar defectos de regulación de gen Hcen-2 (por ejemplo, promotor) que pueden estar asociados con un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2. Un ADNc de una variante alélica mutante del gen Hcen-2 puede aislarse, por ejemplo, mediante el uso de reacción en cadena de polimerasa, una técnica bien conocida por parte de los expertos en la materia. En este caso, la primera cadena de ADNc puede ser sintetizada mediante la hibridación de un oligonucleótido oli-dT sobre ARNm aislado de tejido del cual se sabe o se sospecha que es expresado en un individuo que lleva putativamente el alelo de Hcen-2 mutante, y mediante la extensión de la nueva cadena con transcriptasa reversa. La segunda cadena del AD?c es después sintetizada empleando un oligonucleótido que se hibrida específicamente con el extremo 5' del gen normal. Empleando dos iniciadores, el producto es después amplificado a través de una reacción en cadena de polimerasa, clonado en un vector adecuado y después sometido a análisis de secuencia de AD? mediante métodos bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Comparando la secuencia de AD? de un alelo de Hcen-2 mutante con la secuencia del alelo de Hcen-2 normal, se puede (n) determinar la(s) mutación (es) responsable (s) de la pérdida o alteración de la función del producto de gen Hcen-2 mutante. Alternativamente, se puede construir una biblioteca genómica empleando ADN obtenido de un individuo del cual se sospecha o se sabe que lleva el alelo de Hcen-2 mutante, o bien se puede construir una biblioteca de ADNc empleando ARN proveniente de un tejido del cual se sabe o se sospecha que expresa un alelo de Hcen-2 mutante. El gen Hcen-2 no afectado o bien cualquier fragmento adecuado del mismo puede después ser marcado y empleado como sonda para identificar el alelo de Hcen-2 mutante correspondiente en tales bibliotecas. Clones que contienen las secuencias de gen Hcen-2 mutante pueden purificarse y someterse a análisis de secuencia de conformidad con métodos bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Además, se puede construir una biblioteca de expresión empleando AD?c sintetizado, por ejemplo, a partir de ARN aislado de un tejido del cual se sabe o se sospecha que expresa un alelo de Hcen-2 mutante en un individuo del cual se sabe o se sospecha que lleva un alelo mutante de este tipo. De esta forma, productos de gen elaborados por el tejido putativamente mutante pueden ser expresados y tamizados empleando técnicas de tamizado de anticuerpos estándares en combinación con anticuerpos preparados contra el producto de gen Hcen-2 normal, de conformidad con lo descrito a continuación en la sección 5.3. (Para técnicas de tamizado, véanse, por ejemplo, Harlow y Lañe, eds., 1988, "Antibodies : A Laboratory Manual" (Anticuerpos: un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor.) En casos en los cuales una mutación de Hcen-2 resulta en un producto de gen expresado con una función alterada (por ejemplo, como resultado de una mutación de sentido erróneo o cambio de cuadro) , un conjunto policlonal de anticuerpos de producto de gen anti-Hcen-2 reaccionarán probablemente de manera cruzada con el producto de gen Hcen-2 mutante. Clones de bibliotecas detectados a través de su reacción con tales anticuerpos marcados pueden ser purificados y sometidos a análisis de secuencia de conformidad con métodos bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Mutaciones de Hcen-2 pueden ser detectadas adicionalmente empleando técnicas de amplificación por reacción en cadena de polimerasa. Se pueden diseñar rutinamente iniciadores para amplificar regiones de empalme sobre la totalidad de la secuencia de Hcen-2 incluyendo la región de promotor. En una modalidad, se diseñan iniciadores para cubrir los límites exón-intrón de tal manera que, las regiones de codificación puedan ser exploradas para mutaciones (ver, figura 2A-2C) . Varios iniciadores para el análisis de varios exones de Hcen-2 se proporcionan en los ejemplos. El ADN genómico aislado de linfocitos de individuos normales y afectados se emplea como templado para reacción en cadena de polimerasa. Se comparan los productos de reacción en cadena de polimerasa provenientes de individuos normales y de individuos afectados, ya sea por técnicas de detección de mutación de polimorfismo conformacional de cadena única (SSCP) y/o por secuenciamiento. Las mutaciones responsables de la pérdida o alteración de la función del producto de gen Hcen-2 mutante pueden después determinarse. 5.2. PRODUCTOS DE PROTEINA DEL GEN Hcen-2 Los productos de gen Hcen-2, o fragmentos de péptido de los mismos, pueden prepararse para varios usos. Por ejemplo, tales productos de gen, o bien fragmentos de péptidos de los mismos, pueden emplearse para la generación de anticuerpos en ensayo de diagnóstico, o bien para la identificación de otros productos de gen celulares o extracelulares involucrados en la regulación de los trastornos mediados por Hcen-2. La secuencia de aminoácidos presentada en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) representa un producto de gen Hcen-2. El producto de gen Hcen-2, conocido a veces como una "proteína de Hcen-2", incluye los productos de genes codificados por las secuencias de gen Hcen-2 ilustradas en la figura 1 (SEQ ID N0:1), asi como otras variantes alélicas humanas de Hcen-2 que pueden ser identificadas por los métodos descritos aquí. Además, productos de gen Hcen-2 pueden incluir proteínas que representan productos de gen funcionalmente equivalentes. Tal producto de gen Hcen-2 equivalente puede contener remociones, incluyendo remociones internas, adiciones, incluyendo adiciones que proporcionan proteínas de fusión, o bien sustituciones de residuos de aminoácidos dentro y/o adyacentes a la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de gen Hcen-2 descritas, arriba, en la sección 5.1, pero que resultan en un cambio "silencioso", en la medida en que el cambio produce un producto de gen Hcen-2 funcionalmente equivalente. Sustituciones de aminoácidos pueden efectuarse con base en similaridad de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Alternativamente, cuando se desea alterar la función, se puede manejar remoción o alteraciones no conservadoras para producir productos de gen Hcen-2 alterados, incluyendo productos de gen reducidos. Tales alteraciones pueden ser, por ejemplo, la alteración de una o varias de las funciones biológicas del producto de gen Hcen-2. Además, tales alteraciones pueden seleccionarse con el objeto de generar productos de gen Hcen-2 más adecuados para expresión, amplificación, etc., en las células huéspedes seleccionadas. Por ejemplo, residuos de cisteína pueden ser removidos o bien sustituidos por otro residuo de aminoácido con el objeto de eliminar puentes disulfuro. Los productos de gen Hcen-2, fragmentos de péptido de los mismos y proteínas de fusión de los mismos pueden ser producidos por tecnología de ADN recombinante empleando técnicas bien conocidas en el arte. Así, métodos para la preparación de productos de gen Hcen-2, polipéptidos, péptidos, péptido de fusión y polipéptidos de fusión de la presente invención mediante la expresión de ácido nucleico que contiene secuencias de gen Hcen-2 se describen aquí. Métodos bien conocidos por parte de los expertos en la materia pueden emplearse para construir vectores de expresión que contienen producto de gen Hcen-2 que codifica secuencias y señales de control de transcripción y translación apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989, supra, y, Ausubel et al., 1989, supra. Alternativamente, ARN capaz de codificar secuencias de producto de gen Hcen-2 pueden sintetizarse químicamente empleando, por ejemplo, sintetizadores. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis" (síntesis de oligonucieótidos) , 1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford. Varios sistemas de huésped-vector de expresión pueden emplearse para expresar las secuencias de codificación de productos de gen Hcen-2 de la presente invención. Tales sistemas huésped-vector de expresión representan vehículos mediante los cuales las secuencias de codificación de interés pueden producirse y subsecuentemente purificarse, pero representan también células que pueden, cuando están transformadas o transfectadas con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, presentar el producto de gen Hcen-2 de la invención in situ. Incluyen, sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. Subtilis), transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN de cósmido o ADN de plásmido que contienen las secuencias de codificación de productos de gen Hcen-2; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen las secuencias de codificación de productos de gen Hcen-2; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación de producto de gen Hcen-2; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o bien transformadas con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido de Ti) que contienen secuencias de codificación de productos de gen Hcen-2; o bien sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que contienen constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o bien a partir de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de vaccinia virus 7.5K). En sistemas bacterianos, numerosos vectores de expresión pueden seleccionarse de manera provechosa según el uso previsto para el producto de gen Hcen-2 que se está expresando. Por ejemplo, cuando se debe de producir una gran cantidad de una proteína de este tipo, para la generación de composiciones farmacéuticas de producto de gen Hcen-2 o bien para preparar anticuerpos para producto de gen Hcen-2, por ejemplo, vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son fácilmente purificados pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, sin limitarse a ellos, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2, 1791), en donde la secuencia de codificación de producto de gen Hcen-2 puede ser ligada individualmente en el vector en cuadro con la región de comunicación lac Z de tal manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509); y similares. Se pueden emplear también vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutation-S-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser purificadas fácilmente a partir de células usadas mediante adsorción en perlas de glutation-agarosa seguido por elusión en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX son diseñados para incluir trombinas o bien sitios de disociación de proteasa de factor Xa de tal manera que el producto de gen blanco clonado pueda ser liberado de la porción de GST. En un sistema de insecto, Autographa californica, se emplea un virus de polihedrosis nuclear (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación de producto de gen Hcen-2 puede ser clonada individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocadas bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el vector de polihedrina) . Una inserción exitosa de secuencia de codificación de producto de gen Hcen-2 resultará en la desactivación del gen de polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que no tienen el revestimiento de proteina codificado por el gen de polihedrina) . Estos virus recombinantes son empleados después para infectar células de Spodoptera frugiperda en donde el gen insertado es expresado. (Ver, por ejemplo, Smith, et al., 1983, J. Virol. 46, 584; Smith, Patente Norteamericana No. 4,215,051). En células huéspedes de mamífero, se pueden emplear varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los cuales se emplea un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de codificación de producto de gen Hcen-2 de interés puede ser ligada sobre un complejo de control de transcripción/translación de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia lider tripartita. Este gen quimérico puede después ser insertado en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en la región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o bien E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar productos de gen Hcen-2 en huéspedes infectados. (Véase, por ejemplo, Logan y Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81, 3655-3659) . Señales de iniciación específicas pueden también ser requeridas para una translación eficiente de secuencias de codificación de producto de gen Hcen-2 insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los cuales un gen Hcen-2 completo, incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, es insertado en el vector de expresión apropiado, puede no ser necesario introducir señales de control de translación adicionales. Sin embargo, en casos en los cuales solamente una parte de la secuencia de codificación de gen Hcen-2 es insertada, se deben proporcionar señales de control de translación exógenas, incluyendo, tal vez, el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el cuadro de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar una translación del inserto entero. Estas señales de control de translación exógenas y codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede ser realzada mediante la inclusión de elementos realzadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc., (ver Bittner, et al., 1987, Methods in Enzymol. 153, 516-544) . Además, se puede seleccionar una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas o bien modifica y procesa el producto de gen en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, disociación) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Células huéspedes diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-translacional y modificación de proteínas y productos de gen. Líneas de células apropiadas o sistemas huéspedes apropiados pueden seleccionarse para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada. Para este propósito, células huéspedes eucarióticas que poseen la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto de gen pueden emplearse. Tales células huéspedes de mamífero incluyen, sin limitarse a ellas, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, y WI38. Para la producción de alto rendimiento, de largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, líneas de células que expresan de manera estable el producto de gen Hcen-2 pueden manipularse. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, células huéspedes pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, realzador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN foráneo, se puede permitir que células manipuladas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después sean conmutadas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permiten que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar foci que, a su vez, pueden ser clonados y expandidos en líneas de células. Este método puede emplearse de manera provechosa para manipular líneas de células que expresan el producto de gen Hcen-2. Tales líneas de células manipuladas pueden ser particularmente útiles en el tamizado y en la evaluación de compuestos que afectan la actividad endógena del producto de gen Hcen-2. Se pueden emplear numerosos sistemas de selección, incluyendo, sin limitarse a ellos, los genes de timidinquinasa de virus • de herpes simples (Wigler, et al., 1977, Cell 11, 223) , de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48, 2026), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22, 817) pueden emplearse en células tk", hgprt" o bien aprt~, respectivamente. Así mismo, resistencia antimetabolito puede emplearse como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77, 3567; O'Hare, et al, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 1527); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150, 1); e hygro, que confiere la resistencia a la higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30, 147) . Alternativamente, una proteína de fusión puede ser fácilmente purificada mediante el uso de un anticuerpo específico para la proteína de fusión que se está expresando. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht, permite la purificación fácil de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas de células humanas (Janknecht, et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976). En este sistema, el gen de interés es subclonado en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal manera que el cuadro de lectura abierta del gen sea fusionado translacionalmente y sobre un marcador de terminal amino que consiste de seis residuos de histidina. Extractos de células infectados con virus de vaccinia recombinante se cargan en columnas de ácido Nit • nitrilo acético-agarosa y proteínas marcadas con histidina son eluidas selectivamente con amortiguadores que contienen imidazol. Los productos de gen Hcen-2 pueden también ser expresados en animales transgénicos. Animales de cualquier especie, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, ratones, ratas, conejos, conejillos de la India, cerdos, microcerdos, cabras, ovejas, y primates no humanos, por ejemplo babuinos, monos, y chimpancés, pueden emplearse para generar los animales transgénicos para Hcen-2. El término "transgénicos", como se emplea aqui, se refiere a animales que expresan secuencias de gen Hcen-2 a partir de una especie diferente (por ejemplo, ratones que expresan secuencias de gen Hcen-2 humanos) , así como animales que han sido genéticamente manipulados para sobreexpresar secuencias de Hcen-2 endógenas (es decir, de la misma especie) o bien animales que han sido genéticamente manipulados de tal manera que ya no expresen secuencias de gen Hcen-2 endógenas (es decir, animales "noqueados") , y su progenia. Cualquier técnica conocida puede emplearse para introducir un transgen de gen Hcen-2 en animales para producir las líneas de fundamento de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen, sin limitarse a estos, la microinyección pronuclear (Hoppe y Wagner, 1989, Patente Norteamericana No. 4,873,191); transferencia de gen mediada por retrovirus en líneas de gérmenes (Van der Putten, et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 82, 6148-6152); enfoque de gen en células precursoras embriónicas (Thompson, et al., 1989, Cell 56, 313-321); electroporación de embriones (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814); y transferencia de gen mediada por esperma (Lavitrano et al., 1989, Cell 57, 717-723) (para una reseña de estas técnicas, véase Gordon, 1989, Transgenic Animáis, Intl. Rev. Cytol. 115, 171-229) .

Cualquier técnica conocida puede emplearse para producir clones de animales transgénicos que contienen un transgen Hcen-2, por ejemplo, transferencia nuclear en oocitos enucleados de núcleos provenientes de células embriónicas, fetales o adultas cultivadas inducidas a la quiescencia (Campbell, et al., 1996, Nature 380, 64-66; Wilmut, et al., Nature 385, 810-813) . La presente invención ofrece animales transgénicos que llevan un transgen Hcen-2 en todas sus células, así como animales que llevan el transgen en algunos pero no la totalidad de sus células, es decir, animales mosaicos. El transgen puede también ser introducido selectivamente y activado en un tipo particular de células siguiendo por ejemplo las enseñanzas de Lasko et al. (Lasko et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6232-6236) . Las secuencias regulatorias requeridas para dicha activación específica según el tipo de células dependen del tipo de células particular de interés y serán aparentes a los expertos en la materia. Cuando se desea que el transgen Hcen-2 se integre en el sitio cromosomal del gen Hcen-2 endógeno, se prefiere el enfoque de genes. Brevemente, cuando se debe de emplear una técnica de este tipo, vectores que contienen algunas secuencias de nucleótidos homologas con el gen Hcen-2 endógeno se diseñan con el propósito de integrarse, a través de recombinación homologa con secuencias cromosomales, en la secuencia de nucleótidos y trastornar la función de la secuencia de nucleótidos del gen Hcen-2 endógeno. El transgen puede también ser introducido selectivamente en un tipo particular de células, desactivando asi el gen Hcen-2 endógeno solamente en este tipo de células, siguiendo por ejemplo las enseñanzas de Gu, et al., (Gu, et al., 1994, Science 265, 103-106). Las secuencias regulatorias requeridas para dicha desactivación específica según el tipo de células dependerán del tipo de células particular de interés y serán aparentes a los expertos en la materia. Una vez generados animales transgénicos, la expresión del gen Hcen-2 recombinante puede ensayarse empleando técnicas estándares. Un tamizado inicial puede ser logrado mediante análisis Southern blot o bien mediante técnicas de reacción en cadena de polimerasa para analizar tejidos de animal para ensayar si la integración del transgen se ha llevado a cabo. El nivel de expresión de ARNm del transgen en el tejido de los animales transgénicos puede también evaluarse empleando técnicas que incluyen, sin limitación, el análisis Northern blot de muestras de tejido obtenidas a partir de los animales, análisis de hibridación in situ, y RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa transcriptasa reversa) . Muestras de tejido que expresan gen Hcen-2 pueden también evaluarse inmunocitoquímicamente empleando anticuerpos específicos para el producto de transgen Hcen-2. 5.3. ANTICUERPOS PARA PRODUCTOS DE GEN Hcen-2 A continuación describimos métodos para la producción de anticuerpos capaces de reconocer específicamente uno o varios epítopos de productos de gen Hcen-2 o bien epítopos de variantes o fragmentos de péptido conservados de los productos de gen Hcen-2. Además, la presente invención abarca anticuerpos que reconocen específicamente formas mutantes de Hcen-2. Tales anticuerpos pueden incluir, sin limitación, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs) , anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos de Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) , y fragmentos de enlace con epitopo de cualesquiera de los anteriores. Tales anticuerpos pueden emplearse, por ejemplo, para detectar un producto de gen Hcen-2 en una muestra biológica y pueden por consiguiente emplearse como parte de una técnica de diagnóstico o pronóstico a través de la cual se pueden probar pacientes para niveles anormales de productos de gen Hcen-2, y/o para determinar la presencia de formas anormales de tales productos de gen. Tales anticuerpos pueden también ser empleados en combinación, por ejemplo, con esquemas de tamizado de compuestos como se describe a continuación en la sección 5.8 para la evaluación de los efectos de compuestos de prueba sobre niveles y/o actividad de producto de gen Hcen-2. Además, tales anticuerpos pueden emplearse en combinación con las técnicas de terapia de genes descritas a continuación en la sección 5.9.2 por ejemplo para evaluar las células normales y/o manipuladas que expresan Hcen-2 antes de su introducción en el paciente. Anticuerpos de productos de gen anti-Hcen-2 pueden emplearse además en métodos para inhibir la actividad anormal de producto de gen Hcen-2. Así, tales anticuerpos pueden emplearse por consiguiente como parte de métodos de tratamiento para un trastorno mediado por Hcen-2. Para la producción de anticuerpos contra un producto de gen Hcen-2, varios animales huéspedes pueden ser inmunizados por inyección con un producto de gen Hcen-2, o una porción del mismo. Tales animales huéspedes pueden incluir, sin limitarse a ellos, conejos, ratones, y ratas, solamente para nombrar algunos de ellos. Se pueden emplear varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, según la especie huésped, incluyendo, sin limitar a este, adyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas como por ejemplo lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles como por ejemplo BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno, como por ejemplo producto de gen Hcen-2, o bien de un derivado funcional antigénico del mismo. Para la producción de anticuerpos policlonales, animales huéspedes tales como los descritos arriba, pueden ser inmunizados mediante inyección con productos de gen Hcen-2 complementado con adyuvantes también descritos arriba. Anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antigen particular, pueden obtenerse por cualesquiera de las técnicas que proporcionan la producción de moléculas de anticuerpo por lineas de células continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, sin limitarse a ellas, la técnica de hibridoma de Kohier y Milstein, (1975, Nature 256, 495-497; y Patente Norteamericana No. 4,376,110), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72; Colé et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030), y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R . Liss, Inc., páginas 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb de esta invención puede ser cultivado in vitro o in vivo. La producción de títulos altos de mAbs in vivo hace que este sea el método preferido actualmente de producción.

Además, técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison, et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci., 81, 6851-6855; Neuberger, et al., 1984, Nature 312, 604-608; Takeda, et al., 1985, Nature, 314, 452-454) mediante el empalme de los genes provenientes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes provenientes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada pueden emplearse. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de especies animales diferentes, como por ejemplo las que tienen una región variable derivada de un mAb de murina y una región constante de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, Cabilly et al., Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Boss et al., Patente Norteamericana No. 4,816397, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad ) . Además, se han desarrollado técnicas para la producción de anticuerpos humanizados. (Ver, por ejemplo, Queen, Patente Norteamericana No. 5,585,089, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste de una región de "estructuras" interrumpida por tres regiones hipervariables, conocidas como regiones complementariamente determinantes (CDRs) . La magnitud de la región de estructura y de las CDRs han sido definidas con precisión (ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (secuencias de proteínas de interés inmunológico), Kabat et al., Departamento Norteamericano de Servicios de Salud (1983) . En resumen, los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo provenientes de especies no humanas que tienen una o varias CDRs provenientes de la especie no humana y una región de estructura proveniente de una molécula de inmunoglobulina humana. Alternativamente, se pueden adaptar técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente Norteamericana No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242, 423-426; Huston, et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883; y Ward, et al., 1989, Nature 334, 544-546) para la producción de anticuerpos de cadena única contra productos de gen Hcen-2. Anticuerpos de cadena única se forman mediante el enlace de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv a través de un puente de aminoácido, lo que resulta en un polipéptido de cadena única. Fragmento de anticuerpo que reconocen epítopos específicos pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, sin limitarse a ellos: los fragmentos F(ab')2, que pueden ser producidos por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab, que pueden ser generados mediante la reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, bibliotecas de expresión de Fab pueden ser construidas (Huse, et al., 1989, Science, 246, 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. 5.4. USOS DE SECUENCIAS DE GEN Hcen-2 PRODUCTOS DE GEN Y ANTICUERPOS Aqui se describen varias aplicaciones de secuencias de gen Hcen-2, productos de gen Hcen-2, incluyendo fragmentos de péptidos y proteínas de fusión de los mismos, y de anticuerpos dirigidos contra productos de gen Hcen-2 y fragmentos de péptidos de los mismos. Tales aplicaciones incluyen, por ejemplo, evaluación de pronóstico y diagnóstico de un trastorno BAD mediado por Hcen-2, y la identificación de pacientes con una predisposición para tales trastornos, de conformidad con lo descrito a continuación en la sección 5.5. Además, tales aplicaciones incluyen métodos para el tratamiento de un trastorno mediado por Hcen-2 de conformidad con lo descrito a continuación en la sección 5.9, y para la identificación de compuestos que modulan la expresión del gen Hcen-2 y/o la síntesis o actividad del producto de gen Hcen-2, de conformidad con lo descrito a continuación, en la sección 5.8. Tales compuestos pueden incluir, por ejemplo, otros productos celulares involucrados en trastornos mediados por Hcen-2. Estos compuestos pueden ser empleados, por ejemplo, para mejorar los trastornos mediados por Hcen-2. .5. DIAGNOSTICO DE ANORMALIDADES DE UN TRASTORNO MEDIADO POR Hcen-2 Varios métodos pueden emplearse para la evaluación de diagnóstico y pronóstico de trastornos mediados por Hcen-2 y para la identificación de pacientes que tienen una predisposición para tales trastornos. Tales métodos pueden emplear, por ejemplo, reactivos tales como las secuencias de nucleótidos de gen Hcen-2 descritas en las secciones 5.1, y anticuerpos dirigidos contra productos de gen Hcen-2, incluyendo fragmentos de péptidos de los mismos, de conformidad con lo descrito arriba, en la sección 5.3. Específicamente, tales reactivos pueden emplearse, por ejemplo, para: (1) la detección de la presencia de mutaciones de gen Hcen-2, o bien la detección de la sobreexpresión o de la subexpresión de proteína de Hcen-2; (2) la detección de la sobreabundancia o subabundancia de productos de gen Hcen-2; y (3) la detección de un nivel aberrante de la actividad de producto de gen Hcen-2. La secuencia de nucleótidos de gen Hcen-2 pueden emplearse, por ejemplo para diagnosticar un trastorno mediado por Hcen-2 empleando, por ejemplo, las técnicas para la detección de mutación de Hcen-2 descritas arriba en la sección 5.1. Mutaciones en loci genéticos diferentes pueden llevar a genotipos relacionados con trastornos mediados por Hcen-2. De manera ideal, el tratamiento de pacientes que padecen de un trastorno mediado por Hcen-2 de este tipo será diseñado para enfocarse hacia los loci genéticos particulares que contienen la mutación que media la enfermedad. Polimorfismos genéticos han sido relacionados con diferencias en cuanto a la efectividad de los fármacos. Asi, la identificación de alteraciones en el gen Hcen-2 o proteína puede emplearse para optimizar los tratamientos farmacológicos terapéuticos. En una modalidad de la presente invención, polimorfismos en la secuencia de gen Hcen-2, o variaciones en la expresión de gen Hcen-2 debido a la metilación alterada, empalme diferencial, o bien modificación post-traslación del producto de gen Hcen-2, puede emplearse para identificar un individuo que tiene una enfermedad o condición que resulte de un trastorno mediado por Hcen-2 y definir por consiguiente el tratamiento farmacológico más efectivo y más seguro. Ensayos tales como los descritos aquí pueden emplearse para identificar estos polimorfismos o variaciones en cuanto a la actividad de expresión de gen Hcen-2. Una vez identificado el gen Hcen-2, o una variación en la expresión de gen Hcen-2 en un individuo, se puede prescribir a la persona con tratamiento farmacológico apropiado. Los métodos descritos aquí pueden efectuarse, por ejemplo, mediante el uso de conjuntos de elementos de diagnóstico pre-empacados que comprenden por lo menos un reactivo de anticuerpos de producto de gen anti-Hcen-2 o bien ácido nucleico de gen Hcen-2 especifico descrito aquí, que puede emplearse convenientemente, por ejemplo, en entornos clínicos, para diagnosticar pacientes que presentan anormalidades de un trastorno mediado por Hcen-2. Para la detección de mutaciones de gen Hcen-2, se puede emplear cualquier célula nucleada como fuente inicial para ácido nucleico genómico. Para la detección de expresión de gen Hcen-2 o bien productos de gen Hcen-2, se puede emplear cualquier tipo de célula o tejido en el cuál se expresa un gen Hcen-2. A continuación, en la Sección 5.6, se describen técnicas de detección basadas en ácido nucleido. En la Sección 5.7, abajo, se describen técnicas de detección de péptidos. 5.6 DETECCIÓN DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE Hcen-2 Se pueden emplear varios métodos para tamizar para determinar la presencia de mutación especifica de gene Hcen-2 y para detectar y/o ensayar niveles de secuencia de ácido nucleico de Hcen-2. Mutaciones dentro del gen Hcen-2 pueden detectarse mediante el uso de varias técnicas. El ácido nucleico proveniente de cualquier célula nucleada puede emplearse como el punto inicial para dichas técnicas de ensayo, y puede aislarse de conformidad con los procedimientos estándares de preparación de ácido nucleico o bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Secuencias de ácido nucleico de Hcen-2 pueden emplearse en ensayos de hibridación o amplificación de muestra biológicas para detectar anormalidades que involucran la estructura de gen Hcen-2, incluyendo mutaciones de puntos, inserciones, remociones, inversiones, translocalizaciones así como de arreglos cromosómicos. Para terminar de incluir, sin limitarse a ellos, análisis Southern, análisis de polimorfismo conformacional de cadena única (SSCP) y análisis de reacción en cadena de polimerasa. Métodos de diagnóstico para la detección de mutaciones específicas para gen Hcen-2 pueden involucra, por ejemplo, la puesta en contacto y la incubación de ácidos nucleicos que incluyen moléculas de ADN recombinante, genes clonados o bien variantes degeneradas de los mismo, obtenidos a partir de una muestra, por ejemplo, derivados a partir de una muestra del paciente o bien otra fuente celular apropiada, por ejemplo linfocitos, con uno o varios reactivos de ácido nucleico marcados incluyendo moléculas de ADN recombinante, genes clonados o bien variantes degeneradas de los mismos, como se describe en la sección 5.1, en condiciones favorables para la condición específica de estos reactivos sobre sus secuencias complementarias dentro del gen Hcen-2. Los métodos y el diagnóstico de la presente invención abarcan además la puesta en contacto y la incubación de ácidos nucleicos para la detección de mutaciones de nucleótidos individuales con polimorfismos del gen Hcen-2. De preferencia, las longitudes de estos reactivos de ácido nucleico son de por lo menos de 15 a 30 nucleótidos. Después de incubación, se remueven todos los ácido nucleicos no fusionados del híbrido ácido nucleico: molécula híbrida de gen Hcen-2. La presencia de ácidos nucleicos que han sido hibridados, si existen moléculas de este tipo, se detecta entonces. Empleando un esquema de detección de este tipo, el ácido nucleico proveniente del tipo de célula o tejido de interés puede ser inmovilizado, por ejemplo, sobre un soporte sólido, por ejemplo una membrana, o una superficie de plástico, por ejemplo sobre una placa de microtitulación o bien en perlas de poliestireno. En este caso, después de la incubación, los reactivos de ácido nucleico marcados del tipo descrito en la sección 5.1, no fusionados, son fácilmente removidos. La detección de los reactivos de ácido nucleico de Hcen-2 marcados, fusionados, restantes, se logra mediante técnicas estándares bien conocida por parte de los expertos en la materia. Las secuencias de gen Hcen-2 sobre las cuales se han fusionado los reactivos de ácido nucleico pueden compararse con el patrón de fusión esperado a partir de una secuencia de gen Hcen-2 normal con el objeto de determinar si una mutación de gen Hcen-2 está presente.

En una modalidad preferida, mutaciones de Hcen-2 o polimorfismos pueden detectarse mediante el uso de un microensayo de secuencia de ácido nucleico de Hcen-2 inmovilizadas sobre un sustrato o "masca de gen" (ver, por ejemplo, Cronin, et al., 1996, Human Mutation 7:244-255). Métodos de diagnóstico alternativos para la detección de moléculas de ácido nucleico específica para gen Hcen-2, en muestra de pacientes o bien otras fuentes apropiadas de células, pueden involucrar su amplificación, por ejemplo, por reacción en cadena de polimerasa (la modalidad experimental en Mullís, 1987, Patente Norteamericana No. 4,683,202), seguido por la detección de las moléculas amplificadas empleando técnicas bien conocidas por parte del experto en la materia. Las secuencias amplificadas resultantes pueden ser comparadas con las secuencias que se esperarían si el ácido nucleico anticipado contuviera solamente copias normales de gen Hcen-2 con el objeto determinar si existe una mutación de gen Hcen-2. Además, técnicas de genotipificación bien conocidas pueden llevarse a cabo para identificar individuos que llevan mutaciones de gen Hcen-2. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, el uso de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) , que involucran variaciones de secuencia en uno de los sitios de reconocimiento para la enzima de restricción específica empleada.

Además, métodos mejorados para analizar polimorfismos de ADN, que pueden emplearse para identificación de mutaciones específicas para gen Hcen-2, han sido descritos los cuales se basan en la presencia de números variables de secuencia ADN repetidas en tándem, cortas entre los sitios de enzima de restricción. Por ejemplo, Weber (Patente Norteamericana No. 5,075,217) describe un marcador de ADN basada en polimorfismos de longitud en bloques de repeticiones en tándem cortas (dC-dA) n- (dG-dT) . La separación promedio de los bloque (dC-dA) n- (dG-dT) se estima en 30 000 - 60 000 pares de bases. Marcadores tan estrechamente espaciados presentan una coherencia de alta frecuencia, y son extremadamente útiles en la identificación de mutaciones de genéticas, por ejemplo mutaciones dentro del gen Hcen-2, y en diagnóstico de enfermedades y trastornos relacionados con mutaciones de Hcen-2. Caskey et al. (Patente Norteamericana No. 5,364,759) describen también un ensayo de determinación de perfil de ADN para detectar secuencia de repetición de tri y tetra nucleótidos cortos. El procedimiento incluye la extracción de ADN de interés, por ejemplo en Hcen-2, la amplificación Del ADN extraído, y el marcado de la secuencia de repetición para formar un mapa genotípico de ADN del individuo. El nivel de expresión de gen Hcen-2 puede también ser ensayado. Por ejemplo, el RNA proveniente de un tipo de células del cuál se sabe o se sospecha que expresa un gen Hcen-2, por ejemplo, cerebro, puede ser aislado y probado empleando técnicas de hibridación o de reacción en cadena de polimerasa tales como las descritas arriba. Las células originales pueden ser derivadas de cultivo celular o bien de un paciente. El análisis de las células tomadas de un cultivo puede ser un paso necesario en la evaluación de las células a emplear, aparte de una técnica de terapia genética basada en células o bien alternativamente, para probar el efecto de compuestos sobre la expresión del gen Hcen-2. Tales análisis pueden revelar tanto aspectos cuantitativos como aspectos cualitativos del patrón de expresión del gen Hcen-2, incluyendo activación o desactivación de la expresión del gen Hcen-2. En una modalidad de un esquema de detección de este tipo, una molécula de ADNc es sintetizada a partir de una molécula de RNA de interés (por ejemplo, por transcripción reversa de la molécula de AR? en la molécula de D?Ac) . Una secuencia de AD?c es después empleada como el templada para una reacción de amplificación de ácido nucleico, como por ejemplo reacción de amplificación por reacción en cadena de polimerasa, o similar. Los reactivos de ácido nucleico empleados como reactivos de iniciación de síntesis (por ejemplo, iniciadores) en los pasos de transcripción en reversa y amplificación de ácido nucleico de este método se seleccionan entre los reactivos de ácido nucleico de Hcen-2 descritos en la sección 5.1. Las longitudes preferidas de tales reactivos de ácido nucleico son de por lo menos 9-30 nucleótidos. Para seleccionar el producto amplificado, la amplificación de ácido nucleico puede efectuarse empleando nucleótidos marcados de manera radioactiva o no radioactiva. Alternativamente, se puede preparar una cantidad suficiente de producto amplificado de tal manera que el producto pueda ser visualizado por tinción de bromuro de etidio estándar o bien mediante el uso de otro método de tinción de ácido nucleico adecuado. Además, es posible efectuar dichos ensayos de expresión de gen Hcen-2 "in situ", es decir, directamente en secciones ed tejido (fijadas y/o congeladas) de tejido de paciente obtenido de biopsias o recepciones, de tal manera que no se requiere de purificación de ácido nucleico. Reactivos de ácido nucleico tales como los descritos en la sección 5.1 pueden emplearse como sondas y/o iniciadores para tales procedimientos in situ (ver, por ejemplo, Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications, Raven Press, NY) . Alternativamente, si una cantidad suficiente de células apropiadas puede obtenerse, se puede efectuar un análisis Northern estándar para determinar el nivel de expresión de ARNm del gen Hcen-2. .7. DETECCIÓN DE PRODUCTOS DE GEN Hcen-2 Anticuerpos dirigidos contra productos de gen Hcen-2 no afectado o mutantes o bien variantes conservadas o bien fragmentos de péptido de los mismo, que se comentan arriba en la sección 5.3, pueden también emplearse como diagnósticos y pronósticos para un trastorno mediado por Hcen-2. Tales métodos pueden emplearse para detectar anormalidades en el nivel de síntesis de expresión de producto de gen Hcen-2 o bien anormalidades en la estructura, expresión temporal y/o ubicación física de producto de gen Hcen-2. Los anticuerpos y métodos del mismo ensayo descritos aquí tienen, por ejemplo, aplicaciones importantes in vitro para evaluar la eficacia de los tratamientos para trastornos mediados por Hcen-2. Anticuerpos o fragmento de anticuerpos tales como los descritos a continuación pueden emplearse para atomizar compuestos potencialmente terapéuticos in vitro para determinar sus efectos sobre la expresión de gen Hcen-2 y producción de producto de gen Hcen-2. Los compuesto tienen efectos benéficos sobre un trastorno mediado por Hcen-2. Se pueden emplear también inmunoensayos in vitro, por ejemplo, para evaluar la eficacia de terapia genética basada en células para un trastorno mediado por Hcen-2. Anticuerpos dirigidos contra productos de gen Hcen-2 pueden emplearse in vitro para determinar, por ejemplo, el nivel de expresión de gen Hcen-2 logrado en células genéticamente manipuladas para producir productos de gen Hcen-2. En el caso de productos de gen Hcen-2 intracelulares, dicha evaluación se efectúa de preferencia empleando lisados o extractos de células. Dicho análisis permitirá una determinación del número de células transformadas necesaria para lograr una eficacia terapéutica in vivo, así como la optimización del protocolo de reemplazo de genes . El tejido o tipo de células analizar incluirá generalmente de los cuáles se sabe o se sospecha que expresan el gen Hcen-2. Los métodos de aislamiento de proteina empleados aquí pueden ser, por ejemplo, los descritos en Harlow y Lañe (1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . Las células aisladas pueden ser derivadas de cultivo celular o bien de un paciente. El análisis de células tomadas de cultivo puede ser un paso necesario en la evaluación de células a emplear como parte de una técnica de terapia genética basada en células o bien, alternativamente, para probar el efecto de compuestos sobre la expresión del gen Hcen-2. Métodos de diagnóstico preferidos para la detección de productos de gen Hcen-2, variantes conservadas por fragmentos repetitivos de los mismos pueden involucrar, por ejemplo, inmunoensayos donde los productos de gen Hcen-2 o variantes conservadas o fragmentos de péptidos se detectan mediante su interacción con anticuerpo específico para producto anti-gen Hcen-2.

Por ejemplo, anticuerpo, o fragmentos de anticuerpos, tales como los descritos arriba en la sección 5.3, pueden emplearse para detectar cuantitativa o cualitativamente la presencia de productos de gen Hcen-2 o variantes conservadas por fragmentos de péptidos de los mismos. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado de manera fluorescente (a continuación, esta sección) , junto con detección fluorimétrica, citométrica de flujo, o microscópica de luz. Tales técnicas son especialmente preferidas para productos de gen Hcen-2 expresados en la superficie de la célula. Los anticuerpos (o bien fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden emplearse, además histológicamente, como en la microscopía de inmunoflurescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de productos de gen Hcen-2, variantes conservadas por fragmentos de péptidos de los mismos. La detección in situ puede acompañarse de la remoción de una muestra histológica a partir de un paciente, y la detección de anticuerpo marcado que se une con un polipéptido rTs . El anticuerpo (o fragmento) se aplica de preferencia mediante la colocación del anticuerpo marcado (o fragmento) en la muestra biológica. A través del uso de un procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de productos de gen Hcen-2, variantes conservados o fragmentos de péptico, sino también su distribución en el tejido examinado. Empleando la presente invención, las personas con conocimientos normales en la técnica reconocerán fácilmente que cualesquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) pueden ser modificados con el objeto de lograr la detección in situ de un producto de gen Hcen-2. Inmunoensayos para productos de gen Hcen-2, variantes conservadas, o fragmentos de péptidos de los mismos comprenderán tipicamente la incubación de una muestra, por ejemplo un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién cosechadas o lisados de células en presencia de un anticuerpo marcado de manera detectable capaz de identificar productos de gen Hcen-2, variantes conservadas o fragmentos de péptidos de los mismos, y detectar el anticuerpo unido a través de cualesquiera de varias técnicas bien conocidas. La muestra biológica puede entrar en contacto con un soporte de fase sólida o vehículo, como por ejemplo nitrocelulosa, que • puede inmovilizar células, partículas de células o proteínas solubles, e inmovilizarse en dicho soporte o vehículo de fase sólida. El soporte puede ser después lavado por amortiguadores adecuados seguido por tratamiento con el anticuerpo específico de producto de gen Hcen-2 marcado de manera detectable. El soporte de fase sólida puede después ser lavado con el amortiguador una segunda vez para remover el anticuerpo no unido. La cantidad de anticuerpo unido sobre el soporte sólido puede después ser detectada por medios convencionales. Por "soporte o vehículo de fase sólida" entendemos cualquier soporte capaz de unir un antígeno o un anticuerpo. Soportes o vehículos bien conocido incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, garbos, y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser ya sea soluble hasta cierto punto o bien insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible en la medida en que la molécula acoplada puede unirse con un antígeno o anticuerpo. Así, la configuración de soporte puede ser esférica, como en el caso de una pero, o cilindrica, como en el caso de la superficie interna de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana, por ejemplo una hoja, tira de prueba, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los expertos en la materia conocerán muchos de estos vehículos adecuados para unir anticuerpo o antígeno, o bien podrán determinar estos soportes o vehículos mediante el uso ed experimento de rutina. Una de las formas mediante las cuales el anticuerpo es escrito para productos dé gen Hcen-2 puede ser marcad de manera detectable es mediante el enlace de dicho anticuerpo con una enzima, por ejemplo para su uso en un inmunoensayo de enzima (IEA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2, 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD) ; Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31, 507-520; Butler, J. E., 1981, Meth. Enzymol. 73, 482-523; Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, FL, ; Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio) . La enzima unida sobre el anticuerpo reacciona con un sustrato apropiado, de preferencia un sustrato cromogénico, de tal manera que se produzca una porción química que puede ser detectada, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétrico o visuales. Enzimas que pueden ser empleadas para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen, sin limitarse a ellas, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, deshidrogenasa de alcohol de levadura, a-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosafosfatoisomerasa, peroxidasa de rábano agrio, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, ß-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucos-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección puede acompañarse por métodos calorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección puede también lograrse por comparación visual de la magnitud de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar. La detección puede también lograrse empleando cualesquiera de varios otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante el marcado radioactivo de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es posible detectar producto de gen Hcen-2 mediante el uso de un radioinmunoensayo (RÍA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986) . El isótopo radiactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de contador gamma o bien contador de centelleo o bien mediante autoradiografía. Es también posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado de manera fluorescente se encuentra expuesto a la luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede ser detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcado fluorescente más comúnmente empleados se encuentran el isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. El anticuerpo puede ser marcado de manera detectable empleando metales que emiten fluorescencia tales 152Eu, o bien otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden ser fijados sobre el anticuerpo empleando grupos de quelación de metal como ácido dietilentriaminpenta acético (DTPA) o bien ácido etilendiamintetraacético (EDTA) . El anticuerpo puede también ser marcado de manera detectable mediante su acoplamiento con un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscencia se determina después mediante la detección de la presencia de la luminiscencia que ocurre durante el transcurso de una reacción química. Ejemplo de compuestos de marcado quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. De la misma manera, un compuesto bioluminiscente puede emplearse para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioiuminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los cuales una proteina catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteina bioluminiscente es determinada mediante la detección de la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para los propósitos de marcado son luciferina, luciferaza y aequorina. 5.8 ENSAYOS DE TAMIZADO PARA CIOMPUESTOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE GEN Hcen-2 Los siguientes ensayos son diseñados para identificar compuestos que se unen con un producto de gen Hcen-2, compuestos que se unen con proteínas intracelulares o bien porciones de proteínas que interactúan con un producto de gen Hcen-2, compuestos que interfiere con la interacción de un producto de gen Hcen-2 con proteínas intracelulares y compuestos que modulan la actividad del gen Hcen-2 (es decir, que modulan el nivel de expresión del gen Hcen-2 y/o modulan el nivel de actividad de producto de gen Hcen-2). Ensayos pueden emplearse adicionalmente los cuales identifican compuestos que se unen con secuencias regulatorias de gen Hcen-2 (por ejemplo, secuencias de promotor; véase por ejemplo, Platt, 1994, J. Biol. Chem. 269, 28558-28562), y que pueden modular el nivel de expresión de gen Hcen-2. Tales compuestos pueden incluir, sin limitarse a ellos, moléculas orgánicas pequeñas tales como las moléculas que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, penetrar en una célula apropiada y afectar la expresión del gen Hcen-2 o bien algún otro gen involucrado en una vía de regulación de Hcen-2, o proteínas intracelulares. Métodos para la identificación de proteínas intracelulares de este tipo se describen a continuación en la sección 5.8.2. Tales proteínas intracelulares pueden estar involucradas en el control y/o regulación del humor. Además, entre estos compuestos se encuentran compuestos que afectan el nivel de expresión de gen Hcen-2 y /o actividad de producto de gen Hcen-2 y que pueden emplearse en el tratamiento terapéutico de trastornos mediados por Hcen-2 como se describe a continuación en la sección 5.9. Compuestos que pueden incluir, sin limitarse a ellos, péptidos tales como, por ejemplo, péptidos solubles, incluyendo, sin limitarse a ellos, péptidos de fusión con cola de Ig, y miembros de bibliotecas de péptidos aleatorios; (ver, por ejemplo, Lam, et al., 1991, Nature 354, 82-84; Houghten, et al., 1991, Nature 354, 84-86), y biblioteca molecular derivada de química de combinación elaborada de aminoácidos en configuración D y/o L fosfopéptidos (incluyendo, sin limitarse a ellos, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos, aleatorios o parcialmente degenerados; ver, por ejemplo, Songyang, et al., 1993, Cell 72, 767-778), anticuerpos (incluyendo, sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o de cadena simple, Fab, F(ab')2 y fragmentos de biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de enlace con epítopos de los mismos) , así como pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas. Tales compuestos pueden comprender además compuesto en particular fármacos o miembros de clases o familias de fármacos, de los cuales se sabe que mejoran o exacerban los síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Tales compuestos incluyen antidepresivos tales como sales de litio, carbamazepina, ácido valproico, dietilamida de ácido lisérgico (LSD) , p-clorofenilalanina, derivados de ditiocarbamato de p-propildopacetamida, por ejemplo, FLA 63; fármacos antiansiedad, por ejemplo, diazepam; inhibidores de la monoaminoxidasa (MAO) , por ejemplo, iproniazida, clorgilina, fenelzina, e isocarboxazida; bloqueadores de la absorción de amina biogénica, por ejemplo, antidepresivos tricíclicos tales como desipramina, imipramina y amitriptilina; inhibidores de la reabsorción de serotonina, por ejemplo fluoxetina; fármacos antipsicóticos tales como derivados de fenotiazina (por ejemplo, clorpromazina (torazina) y trifluoropromazina) ) , butirofenonas (por ejemplo, haloperidol (Haldol)), derivados de tioxanteno (por ejemplo, clorprotixeno) , y dibenzodiazepinas (por ejemplo clozapina) ; benzodiazepinas; agonistas y antagonistas dopaminérgicos, por ejemplo, L-DOPA, cocaína, anfetamina, alfa-metil-tirosina, reserpina, tetrabenazina, benzotropina, pargilina; agonistas y antagonistas noradrenérgicos por ejemplo, clonidina, fenoxibenzamina, fentolamina, tropolona. Compuestos identificados a través de ensayos tales como los descritos aquí pueden ser útiles, por ejemplo, para elaborar la función biológica del producto de gen Hcen-2 y para mejorar trastornos mediados por Hcen-2. Ensayos para probar la efectividad de compuestos identificados, por ejemplo, por técnicas tales como las descritas en las secciones 5.8.1-5.8.3, se comentan abajo en la sección 5.8.4. .8.1 ENSAYOS DE TAMIZADO IN VITRO PARA COMPUESTOS QUE SE UNEN CON EL PRODUCTO DE GEN Hcen-2 Se pueden diseñar sistemas in vitro para identificar compuestos capaces de unir los productos de gen Hcen-2 de la invención. Compuesto identificados pueden ser útiles, por ejemplo, en la modulación de la actividad de productos de gen Hcen-2 no afectado y/o mutantes, pueden ser útiles para elaborar la función biológica del producto de gen Hcen-2, pueden emplearse en ensayos de tamizados para identificar compuestos que trastornan las interacciones normales de productos de gen Hcen-2 o bien pueden en si trastornar tales interacciones . El principio de los ensayos para identificar compuestos que se unen con el producto de gen Hcen-2 incluye la preparación de una mezcla de reacción del producto de gen Hcen-2 y del compuesto de prueba bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interactúen y se unan, formando así un complejo que puede ser removido y/o detectado en la mezcla de la reacción. Estos ensayos pueden efectuarse de varias maneras. Por ejemplo, un método para efectuar un ensayo de este tipo incluye el anclaje de un producto de gen Hcen-2 o una sustancia de prueba sobre un soporte sólido y la detección de los complejos producto de gen Hcen-2/compuestos de prueba formados en el soporte sólido al final de la reacción. En una modalidad de un método de este tipo, el producto de gen Hcen-2 puede estar anclado en un soporte sólido, y el compuesto de prueba no anclado, puede ser marcado ya sea directa o indirectamente. • En la practica, placas de microtitulación se emplean de manera cómoda como el soporte sólido. El componente anclado puede estar inmovilizado por fijaciones covalentes o no covalentes. Una fijación no covalente puede lograrse revistiendo simplemente la superficie sólida con la solución de la proteína y mediante secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, de preferencia un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína a inmovilizar puede emplearse para anclar la proteina sobre la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse de antemano y almacenarse. Con el objeto de llevar a cabo el ensayo el componente no inmovilizado es agregado a la superficie revestida que contiene el componente anclado. Después de terminar la reacción, se remueven componentes sin reaccionar (por ejemplo mediante lavado) en condiciones en las cuales cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida puede lograrse de varias maneras. Cuando el componente no inmovilizado previamente se encuentra pre- marcado, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica la formación de complejos. Cuando el componente no inmovilizado previamente no es pre-marcado, se puede emplear una etiqueta indirecta para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, empleando un anticuerpo marcado especifico para el componente no inmovilizado previamente (el anticuerpo, a su vez, puede ser marcado directamente o marcado indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado) . Alternativamente, se pueden efectuar una reacción en una fase líquida, los productos de la reacción pueden separarse de los componentes sin reaccionar, y se pueden detectar los complejos; por ejemplo, empleando un anticuerpo inmovilizado específico para producto de gen Hcen-2 o bien el compuesto de prueba anclar cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo marcado especifico para el ctro componente del complejo posible para detectar complejos anclados. 5.8.2 ENSAYOS PARA PROTEÍNA INTRACELULAR?S QUE INTERACTÚAN CON PRODUCTOS DE GEN Hcen-2 Cualquier método adecuado para detectar interacciones proteína-proteína puede emplearse para identificar interacciones producto de gen Hcen-2-proteína. Entre los métodos tradicionales que pueden emplearse se encuentran la co-inmunoprecipitación, reticulación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . La utilización de procedimiento de estos tipos permite la identificación de proteínas, incluyendo proteínas intracelulares, que interactúan con productos de gen Hcen-2. Una vez aislada una proteína de este tipo puede ser identificada y puede emplearse en combinación con técnicas estándares, para identificar proteínas con las cuales interactúa. Por ejemplo, por lo menos una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína que interactúa con el producto de gen Hcen-2 puede determinarse empleando técnicas bien conocidas por parte de los expertos en la materia, como por ejemplo mediante la técnica de degradación de Edman (ver, por ejemplo, Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principies," W.H. Freeman & Co., N.Y., pp.34-49). La secuencia de aminoácidos obtenida puede emplearse como una guía para la generación de mezclas de oligonucleótidos que pueden emplearse para tamizar secuencias de gen que codifican tales proteínas. El tamizado puede obtenerse, por ejemplo, mediante hibridación estándar o bien técnicas de reacción en cadena de polimerasa. Técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y el tamizado son bien conocidas. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, y 1990, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications," Innis, et al., eds. Academic Press, Inc., New York): Además, se pueden emplear métodos que resultan en la identificación simultánea de genes que codifican una proteína que interactúa con un producto de gen Hcen-2. Estos métodos incluyen, por ejemplo, el hecho de sondear bibliotecas de expresión c un producto de gen Hcen-2 marcado, empleando un producto de gen Hcen-2 en forma similar a la técnica bien conocida de sondear con anticuerpos bibliotecas ?gtll. Un método que detecta interacciones de proteína in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe con detalles solamente para ilustración y no para limitar la presente invención. Una versión de este sistema ha sido descrita (Chien, et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 9578-9582) y se encuentran comercialmente disponibles en Clontech (Palo Alto, CA) . En resumen, usando un sistema de este tipo, se construyen plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: una cosiste del dominio de enlace de ADN de una proteína de activadores transcripción fusionadas sobre el producto de gen Hcen-2 y la otra cosiste del dominio de activación de proteína de activador de activación fusionado sobre una proteína desconocida modificada por un ADNc que ha sido recombinado en este plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión de dominio de enlace de ADN y la biblioteca de ADNc se transforman en una cepa de la levadura Saccharomyces que contiene un gen reportero (por ejemplo, HBS o lacZ) cuya región de regulación contiene el sitio de enlace de activador de transcripción. Cualesquiera de las proteínas de híbrido solas no pueden activar la transcripción del gen reportero: el híbrido de dominio de enlace de ADN no puede porque no proporciona función de activación y el híbrido de dominio de activación no puede porque no puede localizar los sitios de enlace de activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituyen la proteína de activador funcional y resulta en una expresión del gen reportero, que es detectado por medio de un ensayo para el producto de gen reportero. El sistema de dos híbridos o metodologías relacionadas puede emplearse para tamizar bibliotecas de dominios de activación para proteínas que interactúan con el producto de gen "carnada". A título de ejemplo, y no a título limitativo, productos de gen Hcen-2 pueden emplearse como el producto de gen "carnada". Secuencias genómicas totales o secuencias de ADNc se fusionan sobre el ADN que codifica un dominio de activación. Esta biblioteca y un plásmido que codifica un híbrido de un producto de gen Hcen-2 "carnada" fusionada sobre el dominio de enlace de ADN son co-transformados en una cepa reportera de levadura, y los transformantes resultantes son tamizados para determinar los transformantes que expresan el gen reportero. Por ejemplo, una secuencia de gen Hcen-2 "carnada", como por ejemplo el cuadro de lectura abierta del gen Hcen-2 puede clonarse en un vector de tal manera que se fusione de manera translacional sobre el ADN que codifica el dominio de enlace de ADN de la proteina GAL . Estas colonias son purificadas y los plásmidos de bibliotecas responsables de la expresión de gen reportero son aislados. La secuenciación de ADN se emplea después para identificar las proteínas codificadas por los plásmidos de biblioteca. Una biblioteca de ADNc de la línea de células a partir de las cuales proteínas que interactúan con productos de gen Hcen-2 "carnada" deben detectarse pueden elaborarse empleando métodos practicados de manera rutinaria en la técnica. Según el sistema de partícula descrito aquí, los fragmentos de ADNc pueden estar insertados en un vector de tal manera que se fusionen de manera translacional sobre el dominio de activación de transcripción GAL4. Dicha biblioteca puede ser co-transformada junto con el plásmido de fusión gen Hcen-2 "carnada" GAL4 en una cepa de levadura que contiene un gen lacZ impulsado por un promotor que contiene una secuencia de activación GAL4. Una proteína codificada por ADNc, fusionada sobre un dominio de activación de transcripción GAL4 que interactúa con un producto de gen Hcen-2 "carnada" reconstituirá una proteína GAL4 activa y por consiguiente impulsara la expresión del gen HIS3. Colonias que expresan HIS3 pueden detectarse mediante su crecimiento en cajas de petrí que contienen un medio basado en agar semi-sólido que no tiene histidina. El ADNc puede ser después modificado a partir de estas cepas, y empleado para producir y aislar la proteína que interactúa con productos de gen Hcen-2 "carnada" se emplea en las técnicas practicadas de manera rutinaria en el arte. .8.3 ENSAYOS PARA COMPUESTOS QUE INTERFIEREN CON LA INTERACCIÓN DE MACROMOLÉCULAS DE PRODUCTO DE GEN Hcen~2 Los productos de gen Hcen-2, in vivo, interactuar con una o varias macromoléculas, incluyendo las macromoléculas intracelulares, como por ejemplo proteínas. Tales macromoléculas pueden incluir, sin limitarse a ellas, moléculas de ácido nucleico y las proteínas identificadas a través de métodos tales como los descritos arriba en las secciones 5.8.1 - 5.8.2. Para propósitos de este comentario, las macromoléculas se conocen aqui como "socios de enlace". Los compuestos que trastornan el enlace de producto de gen Hcen-2 sobre un socio de enlace pueden ser útiles para regular la actividad del producto de gen Hcen-2, especialmente productos de gen Hcen-2 mutantes. Tales compuestos pueden incluir, sin limitarse a ellos, moléculas tales como péptidos, y similares, según lo descrito, por ejemplo, en la sección 5.8.2 arriba. El principio básico de un sistema de ensayo empleado para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre el producto de gen Hcen-2 y un socio de enlace o socios de enlace incluye la preparación de una mezcla de reacción que contiene el producto de gen Hcen-2 y el socio de enlace en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos interactúen y se unan, formando así un complejo. Con el objeto de probar un compuesto para determinar su actividad de inhibición, la mezcla de reacción es preparada en presencia y ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede estar incluido inicialmente en la mezcla de reacción, o bien puede agregarse subsecuentemente a la adición de producto de gen Hcen-2 y su socio de enlace. Mezclas de reacción de control son incubadas sin el compuesto de prueba o bien con un compuesto del cuál se sabe que no bloquee la formación de complejos. La formación de complejos entre el producto de gen Hcen-2 y el socio de enlace es detectada después. La formación de un complejo en la reacción de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que un compuesto interfiere con la interacción del producto de gen Hcen-2 y el socio de enlace. Además, la producción de complejos con mezclas de r4eacción que contienen el compuesto de prueba y producto de gen Hcen-2 normal puede también compararse con la formación de complejo dentro de mezclas de reacción que contienen el compuesto de prueba y el producto de gen Hcen-2 mutante. Esta comparación puede ser importante en los casos en los cuales es deseable identificar compuesto que trastornan interacciones de producto de gen Hcen-2 mutante pero no normal . El ensayo para compuesto que interfiere con la interacción de los productos de gen Hcen-2 y socios de enlace puede efectuarse en un formato heterogéneo o bien homogéneo.

Ensayos heterogéneos involucran el anclaje ya seas de producto de gen Hcen-2 o el socio de enlace en un soporte sólido y la detección de complejos formado en el soporte sólido al final de la reacción. En ensayos homogéneos, la totalidad de la reacción se lleva a cabo en una fase líquida. En cualquier enfoque, el orden de adición de los reactivos puede variar para obtener información diferente en cuanto a los compuestos probados. Por ejemplo, los compuestos de prueba que interfieren con la interacción entre los productos de gen Hcen-2 y los socios de enlace, por ejemplo, mediante competición, pueden ser identificados llevando a cabo la reacción en presencia de la sustancia de prueba; es decir, mediante la adición de la sustancia de prueba a la mezcla de la reacción antes o simultáneamente con el producto de gen Hcen-2 y socio de enlace intracelular interactivo. Alternativamente, compuesto de prueba que trastornan los complejos formados previamente, por ejemplo, compuestos son unas constantes de enlace más altas que desplazan uno de los componentes del complejo, pueden probarse mediante la adición del compuesto de prueba a la mezcla de la reacción después de la formación de complejos. Los varios formatos se describen brevemente a continuación. En un sistema de ensayo heterogéneos, ya sea el producto de gen Hcen-2 o el socio de enlace interactivo, es anclado en una superficie sólida, mientras que la especie no anclada es marcada ya sea directa o indirectamente. En la práctica, placas de microtitulación se emplean de manera conveniente. La especie anclada puede ser inmovilizada por fijaciones no covalentes o covalentes. Una fijación no covalente puede lograrse simplemente mediante el revestimiento de la superficie sólida con una solución de producto de gen Hcen-2 o socio de enlace y secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado específico para la especie a anclar puede enfriarse para anclar la especie sobre la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse de ante mano y almacenarse. Con el objeto de llevar a cabo el ensayo, el socio de la especie inmovilizada es expuesto a la superficie revestida con o sin el compuesto de prueba. Después de terminada la reacción, se remueven los componentes sin reaccionar (por ejemplo lavado) y los complejos formados permanecerán inmovilizados en la superficie sólida. La detección de complejos anclados en la superficie sólida puede lograrse de varias maneras. Cuando la especie no movilizada es premarcada, la detección de marcador inmovilizado en la superficie indica que se formarán complejos. Cuando la especie no inmovilizada no se encuentra premarcada, se puede emplear un marcador - indirecto para detectar complejos anclados sobre la superficie, por ejemplo, empleando un anticuerpo marcado específico para la especie no movilizada inicialmente (el anticuerpo, a su vez, puede ser marcado directamente o marcado indirectamente con el anticuerpo anti-Ig marcado) . Según el orden de adición de los componentes de reacción, se pueden detectar compuestos de prueba que inhiben la formación de complejos o que trastornan los complejos reformados. Alternativamente, la reacción puede llevarse a cabo en una fase líquida en presencia o ausencia de un compuesto de prueba, los productos de la reacción se separan de los componentes sin reaccionar y se detectan los complejos; por ejemplo, empleando el anticuerpo inmovilizado específico para uno de los componentes de enlace para anclar cualquier complejo formado de solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro socio para detectar complejos anclados. Otra vez, según el orden de adición de los reactivos a la fase liquida, se pueden identificar compuestos de prueba que inhiben la formación de complejos o que trastornan complejos previamente formados. En una modalidad alternativa de la invención, se puede emplear un ensayo homogéneo. En este enfoque, un complejo preformado del producto de gen Hcen-2 y el socio de enlace interactivo se prepara en el cual ya sea el producto de gen Hcen-2 o bien sus socios de enlace son marcados, pero la señal generada por el marcador es apagada debido a la formación de complejos (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,109,496 de Rubenstein que emplea este enfoque para inmunoensayos) . La adición de una sustancia de prueba que compite con una de las especies del complejo preformado y que desplaza dicha especie resultará en la generación de una señal arriba del fondo. De esta manera, se pueden identificar sustancias de prueba que interrumpen la interacción producto de gen Hcen-2/socio de enlace. En otra modalidad de la invención, se pueden emplear las mismas técnicas usando fragmentos de péptido que corresponden a los dominios de enlace del producto de Hcen-2 y/o el socio de enlace (en casos en los cuales el socio de enlace es una proteina) , en lugar de una o ambas proteínas de longitud completa. Se puede emplear cualquier método practicado de manera rutinaria en la técnica para identificar y aislar los sitios de enlace. Estos métodos incluyen, sin limitarse a ellos, la mutagénesis del gen que codifica una del as proteínas y el tamizado para determinar el trastorno de enlace en un ensayo de co-inmunoprecipitación. La compensación de mutaciones en el gen que codifica la segunda especie en el complejo puede después seleccionarse. Una análisis de secuencia de los genes que codifican las proteínas respectivas indicará las mutaciones que corresponden a la región de la proteína involucrada en el enlace interactivo. Alternativamente, una proteina puede ser anclada sobre una superficie sólida empleando métodos descritos en esta Sección arriba, y que pueden interactuar con su socio de enlace marcado y unirse con dicho socio de enlace marcado, que ha sido tratado con una enzima proteolítica como, por ejemplo, tripsina. Después del lavado, un péptido marcado, corto que comprende el dominio de enlace puede permanecer asociado con el material sólido, que puede ser aislado e identificado por secuenciación de aminoácidos. Así mismo, una vez que el gen que codifica para los segmentos es manipulado para expresar fragmentos de péptidos de la proteína puede después ser probado para determinar de enlace de codificado o sintetizado. Por ejemplo, y no a título limitativo, un producto de gen Hcen-2 puede, ser anclado sobre un material sólido de conformidad con lo descrito arriba, en esta sección, elaborando una proteína de fusión GST-Hcen-2 y permitiendo que se una sobre perlas de glutation agarosa. El socio de enlace puede ser marcado con un isótopo radiactivo, por ejemplo JDS, y disociado con una enzima proteolitica, por ejemplo tripsina. Productos de disociación pueden agregarse a la proteína de fusión GST-Hcen-2 anclada y se puede permitir la unión. Después de remover por lavado los péptidos no unidos, el material unido marcado que representa el dominio de socio de enlace puede ser eluído, purificado y analizado para secuencia de aminoácidos por métodos bien conocidos. Los péptidos identificados de esta forma pueden ser producidos sintéticamente o producidos empleando una tecnología de ADN recombinante. 5.8.4 ENSAYOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE MEJORAN UN TRASTORNO MEDIADO POR Hcen-2 Compuestos, incluyendo sin limitación compuestos de enlace identificados a través de técnicas de ensayo tales como las descritas arriba en las secciones 5.8.1 - 5.8.4, pueden probarse para determinar su capacidad de mejorar los síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Se observara que los ensayos descrito aquí pueden identificar compuesto que afectan la actividad Hcen-2 ya sea afectando la expresión de gen Hcen-2 o bien afectando el nivel de actividad de producto de gen Hcen-2. Por ejemplo, se pueden identificar compuesto involucrados en otro paso en la vía en la cual el gen Hcen-2 y/o producto de gen Hcen-2 está involucrado y, mediante la afectación de esta misma vía modular el efecto de Hcen-2 en cuanto al desarrollo de un trastorno mediado por Hcen-2. Tales compuestos deben emplearse, de un método terapéutico para el tratamiento del trastorno. A continuación describimos ensayos basados en células y ensayos basados en modelo animal para la identificación de compuestos que presentan dicha capacidad de mejorar síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Primero, se pueden emplear sistemas basados en células para identificar compuestos que pueden actuar para mejorar síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Tales sistemas de células pueden incluir, por ejemplo, célula recombinantes o no recombinante, como por ejemplo líneas de células que expresan en gen Hcen-2. Al utilizar tales sistemas de células, células que expresan Hcen-2 pueden estar expuestas a un compuesto del cuál se sospecha que inhibe la capacidad de mejorar síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2, en una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar dicha mejora de dichos síntomas en las células expuestas. Después de la exposición, se pueden ensayar las células para medir alteraciones en cuanto a la expresión del gen Hcen-2, por ejemplo, mediante el ensayo de lisados de células para transcriptos de ARNm de Hcen-2 (por ejemplo, por análisis Northern) , o bien para productos de gen Hcen-2 expresados por la célula; compuestos que modulan la expresión del gen Hcen-2 son candidatos buenos como agentes terapéuticos. Además, sistemas basados en animales o modelos para un trastorno mediado por Hcen-2, por ejemplo, ratones transgénicos que contienen una forma humana o alterada de gen Hcen-2, pueden emplearse para identificar compuestos capaces de mejorar síntomas de la enfermedad. Tales modelos de animal pueden emplearse como sustratos de prueba para la identificación de fármacos, agentes farmacéuticos, terapias e intervenciones. Por ejemplo, modelos de animal pueden estar expuestos a unos compuestos del cual se sospecha que presenta la capacidad de mejorar síntomas en una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar dicha mejora que los síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. La respuesta de los animales a la exposición puede ser monitoreada. mediante la elaboración de la inversión de los síntomas del trastorno. En cuanto a la intervención, cualquier tratamiento que invierte cualquier aspecto de síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2 debe considerarse como candidato para intervención terapéutica humana en un trastorno de este tipo. Las dosificaciones de los agentes de prueba pude determinarse derivando curvas de dosis-respuesta, de conformidad con lo comentado en la sección 5.10.1, abajo. 5.9 COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS MEDIADOS POR Hcen-2 A continuación describimos métodos y composiciones a través de los cuales se puede tratar un trastorno mediado por Hcen-2. Por ejemplo, dichos métodos pueden comprender la administración de compuesto que modulan la expresión de un gen Hcen-2 de mamífero y/o la síntesis o actividad de un producto de gen Hcen-2 de mamífero de tal manera que se puedan mejorar síntomas del trastorno. Alternativamente, en los casos en los cuales los trastornos mediados por Hcen-2 de mamífero resultan de mutaciones de gen Hcen-2, tales métodos pueden comprender el suministro al mamífero de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto de gen Hcen-2 no afectado de tal manera que un producto de gen Hcen-2 no afectado sea expresado y de tal manera que se mejoren los síntomas de la enfermedad. En otra modalidad de métodos para el tratamiento de trastornos mediados por Hcen-2 de mamífero que resultan de mutación de g en Hcen-2, tales métodos pueden comprender el suministro al mamífero de una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un producto de gen Hcen-2 no afectado de tal manera que la célula exprese el producto de gen Hcen-2 no afectado y de tal manera que se mejoren los síntomas del trastorno. En casos en los cuales una perdida de la función normal de producto de gen Hcen-2 resulta en el desarrollo de una enfermedad mediada por Hcen-2, un incremento de la actividad de producto de gen Hcen-2 debería facilitar el progreso hacia un estado asintomático en individuos que presentan un nivel deficiente de expresión de gen Hcen-2 y/o actividad de producto de gen Hcen-2. Métodos para incrementar la expresión o síntesis de Hcen-2 pueden incluir, por ejemplo, métodos tales como los descritos a continuación en la sección 5.9.2. Alternativamente, síntomas de trastornos mediados por Hcen-2, pueden ser mejorados mediante la administración de un compuesto que disminuye el nivel de expresión de gen Hcen-2 y/o actividad de producto de gen Hcen-2. Métodos para inhibir o reducir el nivel de síntesis o expresión de producto de gen Hcen-2 pueden incluir, por ejemplo, métodos tales como los descritos en la sección 5.9.1 5.9.1 ENFOQUE INHIBITORIOS DE ANTISENTIDO, RIBOZIMA Y TRIPLE HÉLICE En otra modalidad, síntomas de trastornos mediados por Hcen-2 pueden ser mejorados mediante la disminución del nivel de expresión de gen Hcen-2 y/o actividad de producto de gen Hcen-2 mediante el uso de secuencia de gen Hcen-2 en combinación con método bien conocidos de antisentido, "noqueado" de gen, ribozima y/o triple hélice para disminuir el nivel de expresión de gen Hcen-2. Entre los compuestos que pueden presentar la capacidad de modular la actividad, expresando síntesis del gen Hcen-2, incluyendo la capacidad de mejorar para los síntomas de trastorno mediado por Hcen-2, se encuentran moléculas de antisentido, ribozima y triple hélice. Tales moléculas pueden ser diseñadas para reducir o inhibir la actividad de gen no afectado, o bien, en caso apropiado la actividad de gen blanco mutante. Técnicas para la producción y uso de tales moléculas son bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Moléculas de ARN y ADN de antisentido actúan para bloquear directamente la traslación de ARNm mediante hibridación sobre ARNm enfocado y mediante la prevención de la traslación de proteína. Enfoque de antisentido involucran el diseño de oligonucleótidos que son complementario con un ARNm de gen blanco. Los oligonucleótidos de antisentido se unirán sobre los transcriptos de ARNm de gen blanco complementario y eviten la traslación. Una complementariedad absoluta, si bien se prefiere, no es requerida. Una secuencia "complementaria" de una porción de un ARN, como se entiende aquí, se refiere a una secuencia que tiene una complementariedad suficiente para poder hibridarse con un AR? formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos de antisentido de cadena doble, se puede probar una cadena única de AD? de dúplex o bien se puede ensayar la formación de triples. La capacidad de hibridación dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico de antisentido. Generalmente, entre más largo el ácido nucleico que se hibrida, mayor es el número de faltas de correspondencia entre bases con un ARN que puede contener y sigue forman un dúplex estable (o bien triples, según el caso) . Un experto en la materia puede determinar un grado tolerable de faltas de correspondencia mediante el uso de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. En una modalidad oligonucleótidos complementarios para unas regiones no codificadoras del gen Hcen-2 podrían emplearse en un enfoque de antisentido para inhibir la traslación de AR?m de Hcen-2 endógeno. Ácidos nucleicos de antisentido deben tener por lo menos seis nucleótidos de longitud, y son de preferencia oligonucleótidos que tienen de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos 17 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos o por lo menos 50 nucleótidos. Independientemente de la elección de la secuencia blanco, se prefiere que se efectúen estudios in vitro para cuantificar la capacidad del oligonucleótido de antisentido para inhibir la expresión del gen. Se prefiere que estos estudios empleen controles que distinguen entre la inhibición de gen de antisentido y efectos biológicos específicos de oligonucleótidos. Se prefiere también que estos estudios comparen niveles de ARN blanco o proteina con los niveles de un ARN de control o proteína de control interna. Además, se contempla que los resultados obtenidos empleando el oligonucleótido de antisentido se comparen con los resultados obtenidos empleando un oligonucleótido de control. Se prefiere que el oligonucleótido de control tenga aproximadamente la misma longitud que el oligonucleótido de prueba y que la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido difieran de la secuencia de antisentido en no más de lo que es necesario para evitar una hibridación específica con la secuencia blanco.

Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o bien mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de hebra única o de hebra doble. El oligonucleótido puede ser modificado en la porción de base, porción de azúcar, o estructura de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, y mediación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupo anexos tales como péptidos (por ejemplo, para enfocar receptor de célula in vivo) o bien agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger, et al., 1989, Proc Nati. Acad. Sci. USA. 86, 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 84, 648-652; Publicación PCT No. W088/09810, publicada el 15 de Diciembre de 1988) o bien barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, Krol et al., Publicación PCT No. w089/10134, publicada el 25 de Abril de 1988), agentes de disociación activados por hibridación (ver, por ejemplo, Krol et al, . 1988, BioTechniques 6, 958-976) o bien agentes de intercalado (ver, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5, 539-549). Para este propósito, el oligonucleótido puede ser conjugado con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de reticulación activado por hibridación, agente de transporte, agente de disociación activado por hibridación, etc. El oligonucleótido de antisentido puede comprender por lo menos una porción de base modificada seleccionada dentro del grupo que incluye, sin limitación, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminómeti1-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopentiladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acpJ)w, y 2, 6-diaminopurina. El oligonucleótido de antisentido puede comprender también por lo menos una porción azúcar modificada seleccionada dentro del grupo que incluye, sin limitación, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa. En otra modalidad, el oligonucleótido de antisentido comprende por lo menos una estructura de fosfato modificada seleccionada dentro del grupo que consiste de un fosforotioato, una fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un alquilfosfotriéster, y un formacetal o análogo de los mismos. En otra modalidad, el oligonucleótido de antisentido es un oligonucleótido a-anomérico. Un oligonucieótido a-anomérico forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario en los cuales, a diferencia de las unidades ß habituales, las cadenas son paralelas entre ellas (Gautier, et al., 1987, Nucí.. Acids. Res. 15, 6625-6641). El oligonucleótido es un 2' -metilribonucleótico (Inoue, et. al., 1987, Nucí. Acids Res. 15, 6131-6148), o bien un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue, et al., 1987, FE3S Lett. 215, 327-330) . Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser sintetizados mediante métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (por ejemplo el equipo comercialmente disponible en Biosearch, Applied Biosystems, etc) . Como ejemplo, se pueden sintetizar oligonucleótidos de fosforotiato mediante el método de Stein, et al. (1988, Nucí. Acids Res. 16, 3209), oligonucleótidos de metilfosfonato pueden prepararse mediante el uso de soportes de polímero de vidrio con poros controlados (Sarin, et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 85, 7448-7451), etc. Mientras nucleótidos de antisentido conole entarios de la secuencia de región de codificación de gen blanco podrían ampliarse, se prefieren especialmente los que son complementarios de la región no trasladada, transcrita. Moléculas de antisentido podrían ser suministradas a células que expresan el gen blanco in vivo. Varios métodos han sido desarrollados para suministrar ADN o ARN de antisentido a células; por ejemplo, moléculas de antisentido que pueden ser inyectadas directamente en el sitio del tejido, o bien moléculas de antisentido modificadas, diseñadas para enfocarse hacia las células deseadas (por ejemplo, moléculas de antisentido enlazadas a péptidos o anticuerpos que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados en la superficie de la célula blanco) pueden administrarse de manera sistémica. Sin embargo, es frecuentemente difícil lograr concentraciones intracelulares del antisentido suficientes para suprimir la traslación de ARNm endógenos. Por siguiente, un enfoque preferido emplea un constructo de AD? recombinante en donde el oligonucleótido de antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol III o pol II. El uso de un constructo de este tipo para transceptar células blanco en el paciente resultará en la transcripción de cantidades suficientes de AR?s de hebra única que formarán pares de bases complementarios con los transcriptos de gen blanco endógenos y por consiguiente evitarán la traslación del AR?m de gen blanco. Por ejemplo, se puede introducir un vector, por ejemplo, de tal manera que sea absorbido por una célula y dirija la transcripción de un ARN de antisentido. Dicho vector puede permanecer episomal o bien puede volverse cromosomalmente integrado en la medida en que puede ser transcrito para producir el AR? de antisentido deseado. Tales vectores pueden ser construidos mediante métodos de tecnología de AD? recombinante estándares en la técnica. Los vectores pueden ser plásmido, viral, o bien otros conocidos en la técnica, empleados para replicación y expresión en células de mamíferos. La expresión de la secuencia que codifica a AR? de antisentido puede efectuarse a través de cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en células de mamíferos, de preferencia de seres humanos. Tales promotores pueden ser inducibles o bien constitutivos. Tales promotores se incluyen, sin limitarse a ellos: la región de promotor temprana SV40 (Bernoist and Chambón, 1981, ?ature 290, 304-310) , el promotor contenido en la repetición de extremo de 3' de virus de Rous sarcoma (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22, 787-797), el promotor de timidinquinasa de herpes (Wagner, et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1441-1445) , las secuencias regulatorias del gen de metalotioneina (Brinster, et al., 1982, Nature 296, 39-42), etc. Se puede emplear cualquier tipo de plásmido, cósmido, YAC o vector viral para preparar el constructo de ADN recombinante que puede ser introducido directamente en el sitio del tejido. Alternativamente, se pueden emplear vectores virales que afectan selectivamente el tejido deseado, en dicho caso la administración puede efectuarse por otra vía (por ejemplo, sistémica) . Moléculas de ribozima diseñadas para disociar catalíticamente el transcripto de ARNm de gen blanco pueden también emplearse para evitar la traslación de ARNm de gen blanco, y por consiguiente, la expresión de producto de gen blanco. (Ver, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT w090/11634, publicada el 4 de Octubre de 1990; Sarver, et al., 1990, Science 247, 1222-1225) . Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la disociación específica de AR?. (Para una reseña, ver Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471) . El mecanismo de acción de ribozima incluye la hibridación específica de secuencias de la molécula de ribozima sobre AR? blanco complementario, seguido por un evento de disociación endonucleolítica. La composición de las moléculas de ribozima debe incluir una o varias secuencias complementarias del AR?m de gen blanco y debe incluir la secuencia catalítica bien conocida responsable de la disociación de AR?m. Para esta secuencia, ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5, 093, 246, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Cuando se pueden emplear ribozimas que disocian el ARNm en secuencia de reconocimiento especificas de sitio para describir AR?m de gen blanco, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo disocian AR?m en ubicaciones indicadas por las regiones de flanco que forman pares de bases complementarios con el ARNm blanco. El único requisito es que el AR?m blanco tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozima de cabeza de martillo se conoce bien en la técnica y se describe con mayores detalles en Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VHC Publishers, ?ew York, (véase especialmente la figura 4, página 833) y en Haseloff y Gerlach, 1988, ?ature, 334, 585-591, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. De preferencia, la ribozima es manipulada de tal manera que el sitio de reconocimiento de disociación se encuentra cerca del extremo 5' del ARNm de gen blanco, es decir, para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcrito de AR?m no funcionales. Las ribozimas de la presente invención incluyen también ARN endoribonucleasa (a continuación "ribozimas de tipo Cech") como la que ocurre naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como IVS, o bien L-19 IVS R?A) y que ha sido ampliamente descrita por Thomas Cech y colegas (Zaug, et al., 1984, Science, 224, 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231, 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324, 429-433; Solicitud de Patente Internacional publicado No. w088/04300 por University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47, 207-216) . Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que se hibridan con una secuencia de ARN blanco después de los cuales se efectúa la disociación de ARN blanco. La invención abarca las ribozimas de tipo Cech que enfocan ocho secuencias de sitio activo de pares de bases presentes en el gen blanco. Como en el enfoque de antisentido, las ribozimas pueden componerse de oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para mayor estabilidad, enfoque, etc.) y deben administrarse a las células que expresan el gen blanco in vivo. Un método preferido para la administración incluye el uso de un constructo de AD? "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte pol III o pol II, de tal manera que las células transfectadas produzcan cantidades suficientes de la ribozima para destruir mensajes de gen blanco endógenos e inhibir la traslación. Puesto que las ribozimas, a diferencia de las moléculas de antisentido, son catalíticas, se requiere de una menor concentración intracelular para deficiencia. La expresión de gen blanco endógeno puede también ser reducida mediante la desactivación o bien "noqueado" del gen blanco o su promotor empleando recombinaciones homologa enfocada (por ejemplo, verse Smithies, et al., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson, et al., 1989, Cell 5, 313-321; cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Por ejemplo, un gen blanco no funcional, mutante (o bien una secuencia de ADN totalmente no relaciona!) flanqueado por análogo de ADN hacía el gen blanco endógeno (es decir las regiones de codificación o regiones regulatorias del gen blanco) puede emplearse, con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo para transfectar células que expresan el gen blanco in vivo. La inserción del constructo de ADN, a través de recor-binación homologa enfocada, resulta en la desactivación del gen blanco. Tales enfoques son especialmente habituados en ei campo agrícola en donde modificaciones a células ES (embriónica-precursora) pueden emplearse para generar progenie con un gen blanco inactivo (por ejemplo, verse Thomas y Capecchi, 1987 y Thompson, 1989, supra) . Este enfoque puede ser adaptado para su uso en seres humanos a condición que los constructos de ADN recombinantes sean administrados directamente o enfocados hacía el sitio requerido in vivo empleando vectores virales. Alternativamente, la expresión de gen blanco endógeno puede ser reducida por el enfoque de secuencias desoxirribonucleótidos complementarias de la región regulatoria del gen blanco (es decir, el promotor de gen blanco y/o realzadores) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen blanco en células blanco en el cuerpo. (Ver generalmente, Helen, 1991, Anti-cáncer Drug Des., 6(6), 569-584; Helene, et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-36; y Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807-815) . Moléculas de ácido nucleico a emplear en la formación de hélice triples para la inhibición de la transcripción deben ser de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos . La composición de base de estos oligonucleótidos debe ser diseñada para promover la formación de triple hélice a través de las reglas de formación de pares de bases de Hoogsteen, que requieren generalmente de segmentos considerables ya sea de purinas o bien de pirimidinas en una hebra de un dúplex. Secuencias de nucleótidos pueden basarse en pirimidinas, lo que resulta en tripletes TAT CGC+ a través de las tres de las tres cadenas asociadas de la triple hélice resultante. Las moléculas ricas en pirimidina proporcionan una complementariedad de bases a una región en purina de una cadena única de dúplex en una orientación paralela a esta cadena. Además, moléculas de ácido nucleico pueden seleccionarse las cuales son ricas en purina, por ejemplo contienen un segmento de residuos de G. Estas moléculas formarán una triple hélice con un dúplex de ADN rico en pares GC, en donde la mayoría de los residuos de purina se localizan en una cadena única del dúplex enfocado, lo que resulta en tripletes GGC en las tres cadenas en el triples. Alternativamente, las secuencias potenciales que pueden ser enfocadas para formación de triple hélice pueden ser incrementadas por medio de la creación de lo que se conoce como una molécula de ácido nucleico de tipo "zigzag". Las moléculas de zigzag se sintetizan alternando 3' -5', 3' -5', de tal manera que forman pares de bases con primero una cadena de un dúplex y después la otra, eliminando la necesidad de la presencia de un segmento de gran tamaño ya sea de purinas o de piridinas en una cadena de un dúplex. En casos en los cuales las moléculas de antisentido, ribozima, y/o de hélice triple descritas aquí se emplean para inhibir la expresión de gen mutante, es posible que la técnica pueda reducir o inhibir de manera tan eficiente la transcripción (hélice triple) y/o traslación (antisentido, ribozima) de ARNm producido por alelos de gen blanco normales que puede surgir la posibilidad que la concentración de producto de gen blanco normal puede ser menor de lo que es necesario para un fenotipo normal. En tales casos, para asegurar que se mantienen niveles no sustancialmente normales de actividad de gen blanco, por consiguiente, se puede introducir moléculas de ácido nucleico que codifican y expresan polipéptidos de gen blanco que presentan una actividad de gen blanco normal en células a través de métodos de terapia genética tales como los descritos, a continuación, en la sección 5.9.2 que no contienen secuencias susceptibles a tratamientos de hélice triple, antisentido, ribozima. Alternativamente, en casos en los cuales el gen blanco codifica una proteína extracelular, puede ser preferible coadministrar una proteína de gen blanco normal con el objeto de mantener el nivel requerido de actividad de gen blanco. Moléculas de ARN y ADN de antisentido, ribozima, y de hélice triple de la presente invención pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica para la sintesis de moléculas de ADN y ARN, según lo comentado arriba. Estas técnicas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxiribonucleótidos y oligoribonucleótidos bien conocidos en el arte como por ejemplo síntesis química de fosforamidita de fase sólida. Alternativamente, se pueden generar moléculas de ARN mediante la transcripción in vitro e in vivo de secuencias de AD? que codifican la molécula de AR? de antisentido. Tales secuencias de AD? pueden ser incorporadas en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores adecuados de AR? polimerasa tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, constructos de AD?c de antisentido que sintetizan ARN de antisentido constitutiva o induciblemente, según el promotor empleado, pueden ser introducidos de manera estable en líneas de células. 5.9.2 TERAPIA DE REEMPLAZO DE GENES Secuencias de ácido nucleico de gen Hcen-2, descritas arriba en la sección 5.1, pueden emplearse para el tratamiento de un trastorno mediado por Hcen-2. Dicho tratamiento puede tener la forma de una terapia de reemplazo de genes. Específicamente, una o varias copias de un gen Hcen-2 normal o una parte del gen Hcen-2 que dirige la producción de un producto de gen Hcen-2 que presenta una función de gen Hcen-2 normal, puede insertarse en las células apropiadas dentro de un paciente, empleando vectores que incluyen, sin limitarse a ellos, adenovirus, virus asociado con adeno y vectores de retrovirus, además de otras partículas que introducen ADN en célula, como por ejemplo liposomas. Puesto que el gen Hcen-2 es expresado en el cerebro, dichas técnicas de terapia de reemplazo de gen deben poder suministrar las secuencias de gen Hcen-2 a estos tipos de células dentro de los pacientes. Así, en una modalidad, técnicas que son bien conocidas por parte de los expertos en la materia (ver, por ejemplo, Publicación PCT WO89/10134, publicada en día 25 de abril de 1988) pueden emplearse para permitir que secuencias de gen Hcen-2 atraviesen la barrera hematoencefálica fácilmente y proporcionen las secuencias a las células en el cerebro. En cuanto a la administración capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, se prefieren vectores virales tales como, por ejemplo, los descritos arriba. En otra modalidad, técnicas para la administración incluyen, la administración directa de dicha secuencias de gen Hcen-2 en el sitio de las células en las cuales se deben de expresar las secuencias de gen Hcen-2. Métodos adicionales que pueden emplearse para incrementar el nivel global de expresión de gen Hcen-2 y/o actividad de producto de gen Hcen-2 incluyen la introducción de células que expresan Hcen-2 apropiado, de preferencia células autólogas, en un paciente en ubicaciones y en números suficiente para mejorar los síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Tales células pueden ser ya sea recombinantes o no recombinantes. Entre las células que pueden ser administradas para incrementar el nivel global de expresión de gen Hcen-2 en un paciente se encuentran células normales, de preferencia células cerebrales que expresan el gen Hcen-2. Alternativamente, células de preferencia células autólogas, pueden ser manipulas para expresar secuencias de gen Hcen-2 y pueden después introducirse en una paciente en ubicaciones apropiadas para la mejorar de los síntomas de un trastorno mediado por Hcen-2. Alternativamente, células que expresan un gen Hcen-2 no afectado y que provienen de un individuo con MHC correspondido pueden emplearse, y pueden incluir, por ejemplo, células cerebrales. La expresión de las secuencias de gen Hcen-2 es controlada por las secuencias regulatorias de gen apropiadas para permitir dicha expresión en los tipos de células necesarios. Tales secuencias regulatorias de genes son bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Tales técnicas de terapia genética basada en células son bien conocidas por parte de los expertos en la materia, véase, por ejemplo, Anderson, patente Norteamericana No. 5,399,349. Cuando las células a administrar no son células autólogas, pueden administrarse empleando técnicas bien conocidas para evitar una respuesta inmune del huésped contra el desarrollo de las células introducidas. Por ejemplo, las células pueden ser introducidas en forma encapsulada que, si bien permite un intercambio de componentes con el entorno extracelular inmediato, no permiten que las células introducidas sean reconocidas o el sistema inmune del huésped. Además, compuestos tales como los identificados a través de técnicas tales como las descritas arriba en la sección 5.8, pueden modular la actividad de producto de gen Hcen-2 pueden ser administrados empleando técnicas estándares bien conocidas por parte de los expertos en la materia. En casos en los cuales los compuestos a administrar incluyen una interacción con células del cerebro, las técnicas de administración deben incluir técnicas bien conocidas para permitir el cruce de la barrera hematoencefálica. .10 PREPARACIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN Los compuestos determinados por afectar la expresión de gen Hcen-2 o actividad de producto de gen pueden administrarse a un paciente en dosis terapéuticamente efectivas para tratar o mejorar un trastorno mediado por Hcen-2 una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del compuesto suficiente para resultar en una mejora de síntomas de dicho trastorno. 5.10.1 DOSIS EFECTIVA La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse a través de procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es lo como se conoce como el Índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED5:. Compuestos que presentan grandes índices terapéuticos se prefieren. Mientras compuestos que presentan efectos colaterales tóxicos pueden emplearse, se debe tomar cuidado de diseñar un sistema de administración que dirige tales compuestos hacia en sitio del tejido afectado con el objeto de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por consiguiente, con el objeto de reducir los efectos colaterales.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo de células y a partir de estudios con animales pueden emplearse para formular un rango de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra de preferencia dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango según la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto empleado en el método de la invención, la dosis terapéutica efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos de animales para lograr una concentración plasmática circulante dentro de un rango que incluye la IC ED50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba se logra una inhibición semi-máxima de síntoma) de conformidad con lo dictaminado en el cultivo celular. Dicha información puede emplearse para determinar con mayor precisión dosis útiles en seres humanos. Se pueden medir los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquido de alto desempeño. 5.10.2 FORMULACIÓN Y USO Composiciones farmacéuticas para su uso de conformidad con la presente invención pueden ser formulas de manera convencional empleando uno o varios vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables.

Por consiguiente, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden ser formulados para administración por inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o de la nariz, o bien mediante administración oral, bucal, parenteral, o rectal. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma, por ejemplo, de tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de aglomeración (por ejemplo almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o bien hidroxipropilmetilcelulosa) ; rellenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o bien hidrogenfosfato de calcio) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o bien glicolato de almidón de sodio); o bien agentes de humedecimiento (por ejemplo, laurilsulfato sódico) . Las tabletas pueden ser revestidas a través de métodos bien conocidos en el arte. Preparaciones de líquidos para administración oral pueden tomar la forma, por ejemplo, de soluciones, jarabes, o suspensiones, o bien pueden tener la presentación como un producto seco para constitución con agua o bien otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o bien grasas comestibles hidrogenadas) ; agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres aceitosos, alcohol etílico o bien aceites vegetales fraccionados) y conservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las preparaciones pueden contener también sales amortiguadores, saborizantes, colorantes, agentes endulzantes según lo apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse de manera adecuada para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo. En el caso de administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional. Para administración por inhalación, los compuestos para su uso de conformidad con la presente invención se administran de manera conveniente en forma de una presentación de rocío de aerosol a partir de empaques bajo presión o atomizadores, con el uso de un agente propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono o bien otro gas adecuado. En el caso de un aerosol bajo presión, la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para su uso en in inhalador o insuflador pueden formularse las cuales contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada como por ejemplo lactosa o almidón. Los compuestos pueden ser formulados para administración' parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de bolos o bien infusión continua. Formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o bien en recipientes de dosis múltiples con un conservador agregado. Las composiciones pueden también tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógeno, antes de su uso. Los compuestos pueden también ser formulados en composiciones rectales tales como supositorios o bien enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases conv4encionales para supositorios tales como manteca de cocoa o bien otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos pueden también ser formulados como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implante (por ejemplo de manera subcutánea o intramuscular) o bien mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o bien resinas de intercambio de iones, o bien como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un empaque o un dispositivo surtidor que puede contener una o varias formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El empaque puede comprender por ejemplo una hoja de metal o plástico, como por ejemplo un empaque de tipo blister. El empaque o dispositivo surtidor puede estar acompañado por instrucciones para la administración. 6. EJEMPLO: LOCALIZACIÓN DEL GEN Hcen-2 EN EL CROMOSOMA 18 En el ejemplo presentado -en esta sección, se describen estudios que definen, primero, un intervalo de aproximadamente 310 kb en el brazo corto del cromosoma humano 18 dentro del cual se localiza una región asociada con un trastorno neuropsiquiátrico y, segundo, la identificación del gen Hcen-2, como el mapeo dentro de esta región. 6.1. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1.1.' DESEQUILIBRIO DE ENLACE Se efectuaron estudios de desequilibrio de enlace (LD) empleando ADN a partir de una muestra de población de pacientes con trastornos neuropsiquiátricos (BP-I) . La muestra de población y técnicas de LD fueron según lo descrito en Freimer et al., 1996, Nature Genetics 12: 436-441. El estudio de LD actual aprovecha los marcadores físicos adicionales identificados a través de las técnicas de mapeo físico descritas abajo. 6.2.MAPEO DE CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA (YAC) Para el mapeo físico, cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contienen secuencias humanas fueron mapeados sobre la región en proceso de análisis con base en mapas públicamente disponibles (Cohén et al., 1993, C.R. Acad. Sci. 316, 1484-1488) . Los YACs fueron después ordenados y se reconstruyeron contig mediante la realización de un mapeo de contenido de secuencias de marcadores cortos estándares (STS) con marcadores de microsatélite y STSs no polimórficas disponibles en bases de datos que rodean la región candidata genéticamente definida. 6.3. MAPEO DE CROMOSOMA ARTIFICIAL BACTERIANO (BAC) STSs provenientes del brazo corto del cromosoma humano 18 fueron empleadas para tamizar una biblioteca de BAC humana (Research Genetics, Huntsville, AL) . Los extremos de BACs fueron clonados o secuenciados directamente. Las secuencias de extremo fueron empleadas para amplificar los siguientes BACs de empalme. A partir de cada BAC, se identificaron microsatélites adicionales. Específicamente, se prepararon bibliotecas cortadas de manera aleatoria a partir de BACs de empalme dentro del intervalo genético definido. Se cortó el ADN de BAC con un nebulizador (CIS-US Inc., Bedford, MA) . Fragmentos dentro de un rango de 600 a 1,000 pares de bases fueron empleados para la producción de subbibliotecas . Secuencias de microsatélite provenientes de las subbibliotecas fueron identificadas por sondas de microsatélite correspondiente. Se obtuvieron secuencias alrededor de tales repeticiones que permitieron el desarrollo de iniciadores de reacción en cadena de polimerasa para ADN genómico. 6.4. MAPEO DE HÍBRIDO DE RADIACIÓN (RH) Técnicas estándares de mapeo de RH fueron aplicadas a un panel de mapeo Stanford G3 RH (Research Genetics, Huntsville, AL) con el objeto de analizar todos los marcadores de microsatélite y STSs no polimórficas en la región. 6.1.5. SECUENCIACION DE MUESTRA Se prepararon bibliotecas cortadas aleatoriamente a partir de todos los BACs dentro de la región genética definida. Se secuenciaron aproximadamente 9,000 subclones dentro de la región de aproximadamente 310 kb con iniciadores de vector con el objeto de mantener una cobertura de secuencia de 8 veces de la región. Todas las secuencias fueron procesadas a través de un ducto de análisis de secuencias automatizado que evaluó la calidad, secuencias de vector removidas y secuencias repetitivas enmascaradas. Las' secuencias resultantes fueron después comparadas con bases de datos de ADN y proteína públicas empleando algoritmos BLAST (Altschul, et al., 1990, J. Molec. Biol., 215, 403-410). 6.2. RESULTADOS Regiones genéticas involucradas en genes humanos de trastorno afectivo bipolar (BAD) habían sido previamente reportadas como encontrándose en porciones de los brazos largo (18q) y corto (18p) del cromosoma 18 humano, incluyendo una región genética de 18q ancha de aproximadamente 6-7 cM entre los marcadores D18S469 y D18S554 (Solicitudes Provisionales Norteamericanas Nos. de Serie 60/014,498 y 60/023,438, presentadas el día 28 de Marzo de 1996 y el día 23 de Agosto de 1996, respectivamente, cuyo contenido entero se incorpora aquí por referencia ; Freimer, et al., 1996, Neuropsychiat . Genet. 67, 254-263; Freimer, et al., 1996, Nature Genetics 12, 436-441), el contenido entero de cada una de estas referencias se incorpora aquí por referencia. Desequilibrio de enlace. Antes de intentar identificar secuencias de genes, se efectuaron estudios para estrechar todavía más la región de trastorno neuropsiquiátrico. Específicamente, se efectuó un análisis de desequilibrio de enlace (LD) empleando muestras de población y técnicas de conformidad con lo descrito en la sección 6.1, arriba, que aprovechan los marcadores físicos adicionales identificados a través de las técnicas de mapeo físico descritas abajo. Mapeo físico de alta resolución empleando técnicas de YAC, BAC y RH. Con el objeto de ofrecer el orden preciso de marcadores genéticos que se requiere para mapeo de LD y enlace, y para guiar el desarrollo de marcadores de microsatélite novedosos para un mapeo más fino, se desarrolló un mapa físico de alta resolución de la región candidata 18q23 empleando técnicas YAC, BAC y RH. Para dicho mapeo físico, se mapearon primero YACs sobre la región de cromosoma 18 en proceso de análisis. Empleando el contig de YAC mapeado como estructura, la región desde los marcadores públicamente disponibles D18S1161 y D18S554, que abarca la mayoría de la región D18S469-D18S554 arriba descrita, fue también mapeada y se establecieron contig con BACs. Se construyeron subbibliotecas a partir de los BACs contigados, a partir de las cuales se identificaron y secuenciaron secuencias de marcadores de microsatélites. Para asegurar el desarrollo de un mapa físico preciso, la técnica de mapeo de híbrido de radiación (RH) fue aplicada independientemente a la región en proceso de análisis. Se empleó RH para ordenar todos los marcadores de microsatélite y STSs no polimórficos en la región. Así, el mapa físico de alta resolución finalmente construido fue obtenido empleando datos a partir de mapeo de RH y mapeo de contenido de STS. Clones de BAC dentro de la región de trastorno neuropsiquiátrico de 310 kb recién identificada fueron analizados para identificar genes específicos dentro de la región. Una combinación de secuenciación de muestra, selección de ADNc y análisis de mapeo de transcripción se combinó para ordenar secuencias en unidades de transcripción tentativas es decir, delineación tentativa de las secuencias de codificación de genes dentro de esta región genómica de interés. Una de las unidades de transcripción identificadas fue llamada Hcen-2. La presente invención no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades específicas descritas aquí que tienen simplemente el propósito de ilustrar aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la invención. De hecho, varias modificaciones a la invención, además de las ilustradas y descritas aquí serán aparentes a un experto en la materia a partir de la descripción anterior y de los dibujos anexos. Tales modificaciones tienen el propósito de caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia en la misma medida que si cada publicación individual o cada solicitud de patente individual estuviese específica e ' individualmente indicada como incorporándose por referencia.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES ' Un método para determinar si un ser humano tiene un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2 o bien está en peligro de desarrollar un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2, que comprende el paso de detectar la presencia o ausencia de una mutación genética en el gen Hcen-2 (SEQ ID No.l) de dicha persona, donde dicha mutación genética se selecciona dentro del grupo que consiste de una sustitución de nucleótidos, inserción de nucleótidos y remoción de nucleótidos y resulta en la producción de una proteína de Hcen-2 que tiene una secuencia de aminoácidos otra que la secuencia de aminoácidos de Hcen-2 de tipo salvaje y la presencia de dicha mutación genética identifica una persona que tiene un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2 o bien está en peligro de desarrollar un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además los pasos de: a) obtener una muestra que comprende moléculas de ácido nucleico provenientes de dicha persona; b) amplificar moléculas de ácido nucleico en dicha muestra que codifican una proteína de Hcen-2 empleando iniciadores de amplificación que se fusionan selectivamente con moléculas de ácido nucleico y amplifican moléculas de ácido nucleico que codifican dicha proteína de Hcen-2; y c) determinar si dicha mutación genética está presente.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, donde dicho paso de determinación c) comprende la secuenciación de dicha molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína de Hcen-2.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, donde la secuencia de nucleótidos de dicha molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína de Hcen-2 se determina.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además los pasos de: a) obtener una muestra que comprende moléculas de ácido nucleico de dicha persona; b) detectar las moléculas de ácido nucleico en dicha muestra que codifican dicha proteína de Hcen-2 empleando una sonda de ácido nucleico que se hibrida selectivamente con dichas moléculas de ácido nucleico que codifican dicha proteína de Hcen-2; y c) determinar si dicha mutación genética está presente.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además los pasos de: a) obtener una muestra que comprende moléculas de ácido nucleico a partir de dicha persona; b) detectar las moléculas de ácido nucleico en dicha muestra que codifican dicha proteína de Hcen-2 empleando una digestión de endonucleasa de restricción de dichas moléculas de ácido nucleico y una sonda de ácido nucleico que se hibrida selectivamente con dichas moléculas de ácido nucleico que codifican dicha proteína de Hcen-2, o un fragmento de la misma; y c) determinar si dicha mutación genética está presente .
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, donde dicha mutación genética es un cambio de base.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, donde dicha mutación genética se detecta determinando si se produce una proteína de Hcen-2 alterada en dicha persona.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, que comprende además los pasos de: a) obtener una muestra que comprende moléculas de proteína provenientes de dicha persona; b) detectar las proteínas de Hcen-2 en dicha muestra empleando un anticuerpo que se une con dicha proteína de Hcen-2; c) determinar si dicha proteína de Hcen-2 está codificada por una molécula de ácido nucleico que contiene dicha mutación genética.
10. 10. Un método para identificar un compuesto que puede emplearse para tratar el trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una proteína de Hcen-2; b) determinar si dicho compuesto de prueba se une con dicha proteína de Hcen-2; y c) seleccionar un compuesto de prueba que se une con dicha proteína de Hcen-2 como un compuesto que puede emplearse para tratar un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde se emplea un Hcen-2 que tiene una actividad de tipo salvaje.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde se emplea un Hcen-2 que tiene una actividad alterada.
13. 13. Un método para identificar compuestos que pueden emplearse para tratar un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2, que comprende los pasos de: a) incubar una célula que expresa un gen Hcen-2 en presencia y ausencia de un compuesto de prueba; b) determinar la actividad del producto de gen Hcen-2 en presencia y ausencia de dicho compuesto de prueba; y c) seleccionar un compuesto de prueba que altera la actividad de dicho producto de gen Hcen-2 como un compuesto que puede emplearse para tratar un trastorno neuropsiquiátrico mediado por Hcen-2.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, donde se emplea un Hcen-2 que tiene una actividad de tipo salvaje.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, donde se emplea un Hcen-2 que tiene una actividad alterada.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, donde dicho trastorno neurospiquiátrico mediado por Hcen-2 es un trastorno afectivo bipolar.