MXPA00009440A - Uso de factor de dispersion para mejorar angiogenesis. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a un metodo para mejorar la curacion de heridas y a un metodo para mejorar el transplante de organos utilizando un factor de dispersion, ya sea solo o en combinacion con un factor de crecimiento.

Description

USO DE FACTOR DE DISPERSIÓN PARA MEJORAR ANGIOGENESIS DECLARACIÓN DE DERECHOS DEL GOBIERNO Esta invención se realizó con apoyo del gobierno bajo el número de cesión NIH CA50516. Por lo tanto, el gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un método para mejorar la curación de heridas y a un método para mejorar el transplante de órganos que comprende la administración de un factor de dispersión para promover la angiogénesis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de dispersión se ha descrito previamente como una citocina que es secretada por fibroblastos (véase Stoker et al., J. Cell Sci., Vol. 77, pp. 209-223 (1985) y Stoker et al., Nature (Londres), Vol. 327, pp. 238-242 (1987)) y por células de músculo liso vascular (véase Rosen et al., In Vitro Cell Dev. Biol., Vol. 25, pp. 163-173 (1989)). El factor de dispersión ha mostrado que dispersa las colonias epiteliales cohesivas y estimula la movilidad de las células. Además, el factor de dispersión ha mostrado ser idéntico al factor de crecimiento de hepatocito (HGF) (véase Weidner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA, Vol. 88, pp. 7001-7005 (1991 ) y Bhargava et al., Cell Growth Differ., Vol. 3, pp. 11-20 (1992)), que es un mitógeno de suero independientemente caracterizado (véase Miyazawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 169, pp. 967-973 (1989) y Nakamura et al., Nature (Londres), Vol. 342, pp. 440-443 (1989)). El factor de dispersión induce las células epiteliales del riñon en una matriz de colágeno para formar redes de ramificación de túbulos, sugiriendo que también puede actuar como un morfogén (véase Montesano et al., Cell, Vol. 67, 901-908 (1991)). El factor de dispersión (HGF) es una glucoproteína de unión a heparina básica que consiste en una subunidad pesada (58 kDa) y una subunidad ligera (31 kDa). Tiene 38% de identidad de secuencia de aminoácidos con el plasminógeno de proenzima (véase Nakamura et al., Nature (Londres), Vol. 342, pp. 440-443 (1989)) y por lo tanto se relaciona con la familia de coagulación de sangre de las proteasas. Su receptor en epitelio ha sido identificado como el producto de protooncogén c-met, una tirosina cinasa de transmembrana (véase Bottaro et al., Science, Vol. 251 , pp. 802-804 (1991) y Naldini et al., On8gene, Vol 6, pp. 501-504 (1991)). Se ha encontrado que el factor de dispersión estimula la quimiotáctica endotelial y la migración aleatoria en cámaras de Boyden (véase Rosen et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 195, pp. 34-43 (1990)); migración de esferas portadoras a superficies planas (véase Rosen et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 195, pp. 34-43 (1990)); formación de tubos de tipo capilar (véase Rosen et al., Cell Motility Factors, (Birkhauser, Basel) pp. 76-88 (1991 )) y síntesis de ADN (véase Rubin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. E.U.A., Vol. 88, pp. 415-419 (1991 )). Además, estudios preliminares han sugerido que el factor de dispersión induce la secreción endotelial de activadores de plasminógeno (véase. Rosen et al., Cell Motility Factors, (Birkhauser, Basel) pp. 76-88 (1991 )). El término "angiogénesis", como se utiliza en la presente, se refiere a la formación de vasos sanguíneos. Específicamente, la angiogénesis es un procedimiento de pasos múltiples en donde las células endoteliales se degradan de manera focal e invaden a través de su propia membrana de basamento, migran a través del estroma intersticial hacia un estímulo angiogénico, se proliferan próximas a la punta migratoria, se organizan en vasos sanguíneos, y vuelven a atacar a la membrana de basamento recientemente sintetizada (véase Folkman et al., Adv. Cáncer Res., Vol. 43, pp. 175-203 (1985)). Estos procedimientos son controlados por factores solubles y por la matriz extracelular (véase Ingber et al., Cell, Vol. 58, pp. 803-805 (1985)). Debido a que las proteasas, tales como activadores de plasminógeno (secreción endotelial que es inducida por factor de dispersión) se requieren durante las etapas tempranas de la angiogénesis, y debido a la migración de células endoteliales, la proliferación y la formación de tubos capilares ocurren durante la angiogénesis, los inventores creen que el factor de dispersión puede mejorar la actividad angiogénica in vivo. Además, es conveniente incrementar la actividad angiogénica para que pueda mejorarse la curación de heridas y el transplante de órganos.

Por lo tanto un objeto de la invención es proveer un método para mejorar la actividad angiogénica. Otro objeto de la invención es proveer un método para mejorar la curación de heridas. Otro objeto más de la invención es proveer un método para mejorar el transplante de órganos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un método para promover la angiogénesis mediante la administración de un factor de dispersión. La promoción de angiogénesis puede utilizarse para promover la curación de heridas y tratar diversas condiciones en las que la promoción de angiogénesis es conveniente, incluyendo, pero no limitadas a, isquemia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La breve descripción anterior, así como otros objetos y características de la presente invención, se entenderán mejor con referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas e ilustrativas de la presente invención cuando se toman en conjunto con los dibujos que la acompañan, en donde: Las figuras 1A-1 C muestran los efectos de la transferencia de genes SF/HGF en miocardio de rata. La figura 1A muestra inmunotinción con anticuerpos monoclonales dirigidos contra SF/HGF de humano en tejido miocárdico 5 días después del infarto y la transfección de genes. Las figuras _1 B y 1C muestran tejidos miocárdicos de animales tratados con SF/HGF y de control, respectivamente, tratados con anticuerpo CD-34 anti-endotelial y teñidos utilizando inmunohistoquímica a base de peroxidasa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para promover la angiogénesis en un tejido o sujeto mediante la administración de factor de dispersión a un sujeto que necesite dicha promoción de angiogénesis. De manera específica, el método provisto por la presente invención involucra la administración de factor de dispersión para promover la angiogénesis en diversos tejidos y promover la curación de heridas. La administración de factor de dispersión puede efectuarse por administración de la propia proteína o por administración de un ácido nucleico que codifica para un factor de dispersión mediante el uso de técnicas de ADN estándares. La proteína de factor de dispersión puede administrarse a un tejido o sujeto tópicamente o por inyección intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal. La proteína de factor de dispersión se administra en cantidades suficientes para promover la angiogénesis en un sujeto, que es en la cantidad de alrededor de J-1000 ng/kg en peso corporal. La proteína de factor de dispersión puede administrarse como la proteína de factor de dispersión de tipo silvestre, o análogos de la misma, y puede producirse de manera sintética o recombinante, o puede aislarse de células nativas. Como se utiliza en la presente, "análogo" significa variantes funcionales de la proteína de tipo silvestre, e incluye proteína de factor de dispersión aislada de fuentes de mamífero diferentes que humano, tales como ratones, así como otras variantes funcionales de la misma. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para factor de dispersión administrado a un mamífero puede ser ADN o ADNc genómico. La secuencia de ácido nucleico puede administrarse utilizando un número de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como electroporación, DEAE Dextrano, fusión de liposomas monocatiónicos, fusión de liposomas policatiónicos, fusión de protoplastos, bombardeo de microproyectiles recubiertos con ADN, mediante la creación de un campo eléctrico in vivo, inyección con virus de replicación defectuosa recombinantes, recombinación homologa y transferencia de ADN desnudo. Deberá apreciarse por el experto en la técnica que cualquiera de los métodos anteriores de transferencia de ADN pueden ser combinados. Un ácido nucleico que codifica para factor de dispersión también puede administrarse a un mamífero utilizando terapia de genes, es decir por la administración de un vector recombinante que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para un factor de dispersión. La secuencia de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN o ADNc genómico. El vector recombinante que contiene el ácido nucleico que codifica para un factor de dispersión puede administrase a un mamífero utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, electroporación, transfección de DEAE Dextrano, transfección de fosfato de calcio, fusión de liposomas catiónicos, fusión de protoplastos, por creación de un campo eléctrico in vivo, bombardeo de microproyectiles recubiertos con ADN, inyección con virus de replicación defectuosa recombinantes, recombinación homologa, terapia de genes, y transferencia de ADN desnudo. También deberá apreciarse por los expertos en la técnica que cualquiera de los métodos anteriores de transferencia de ácido nucleico pueden ser combinados. Asimismo, una célula, tal como una célula madre o una célula tumoral que expresa el factor de dispersión introducido en la misma a través de transducción viral, recombinación homologa, o transfección también se provee por la presente invención. Esta célula puede administrarse a un sujeto para promover la angiogénesis. El vector recombinante puede comprender un ácido nucleico de o correspondiente a por lo menos una porción del genoma de un virus, en donde esta porción es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para factor de dispersión, enlazada de manera operativa al ácido nucleico viral y capaz de expresarse como un producto de gen funcional en el mamífero sujeto. Los vectores recombinantes pueden derivarse de una variedad de ácidos nucleicos virales conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los genomas de HSV, adenovirus, virus adenoasociados, virus Semiliki Forest, virus de vaccinia, y otros virus, incluyendo virus de ARN y ADN. rx Los vectores recombinantes también pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para elementos reguladores adecuados para efectuar la expresión de la construcción de vector en una célula hospedero adecuada. Como se utiliza en la presente, "expresión" se refiere a la capacidad del vector de transcribir la secuencia de ADN insertada en ARNm para que pueda ocurrir la síntesis de la proteína codificada por el ácido nucleico insertado. Los expertos en la técnica apreciarán que una variedad de mejoradores y promotores • 10 son adecuados para usarse en las construcciones de la invención, y que las construcciones comprenderán la secuencias necesarias de inicio, terminación y /'""N control para transcripción y procesamiento adecuados de la secuencia de ácido nucleico que codifica para un factor de dispersión cuando la construcción de vector recombinante se introduce en un mamífero. 15 Vectores adecuados para la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un factor de dispersión son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen pMEX, pRSX24 (provistos por Dr. George Vande Woude, Frederick Cáncer Center, Frederick, Maryland), pSV2neo (Clonetech), pET-3d (Novagen), pProEx-1 (Life Technologies), pFastBac 1 (Life Technologies), pSFV (Life Technologies), pADNc II (Invitrogen), pSL301 (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pSE380 (Invitrogen), pSE420 (Invitrogen), pTrcHis A,B,C (Invitrogen), pRSET A,B,C (Invitrogen), pYES2 (Invitrogen), pAC360 (Invitrogen), pVL1392 y pVL1392 (invitrogen), pCDM8 (Invitrogen), pADNc I (Invitrogen), pADNc I (amp) (Invitrogen), pZeoSV (Invitrogen), pADNc 3 (Invitrogen), pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), "\ pREP7 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen), pREPIO (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pEBVHis (Invitrogen), y ?Pop6. Otros vectores serán evidentes para los expertos en la técnica. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores constitutivos, promotores específicos de tejido y promotores inductores. La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para factor de dispersión puede controlarse y afectarse por el vector particular en el cual se ha introducido la secuencia de ácido nucleico. Algunos vectores eucarióticos han sido manipulados para que sean capaces de expresar ácidos x nucleicos insertados a altos niveles dentro de la célula objetivo. Dichos vectores utilizan uno de los tantos promotores poderosos para dirigir el alto nivel de expresión. Los vectores eucarióticos utilizan secuencias promotoras- 15 incrementadoras de genes virales, especialmente aquellos de virus tumorales. Una modalidad particular de la invención provee la regulación de expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para factor de dispersión utilizando promotores inductores. Ejemplos no limitativos de promotores inductores incluyen, pero no se limitan a, promotores de metalotionina y promotores de virus tumorales mamarios de ratón. Dependiendo del vector, la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para factor de dispersión será inducida en el mamífero mediante la adición de un compuesto específico en un cierto punto en el ciclo de crecimiento de las células del mamífero. Otros ejemplos de promotores e incrementadores efectivos para usarse en los vectores recombinantes incluyen, pero no se limitan a, promotores e incrementadores CMV (citomegalovirus), SV40 (virus de simio 40), HSV (virus de herpes simple), EBV (virus de Epstein-Barr), retrovirales, adenovirales, y promotores e incrementadores específicos de células tumorales. Está dentro de los confines de la invención que el factor de dispersión puede administrarse en combinación con un factor de crecimiento para promover la angiogénesis, incluyendo, pero no limitados a TGF-a, FGF y PGDF. El factor de dispersión, en la forma de una proteína, ácido nucleico, o un vector recombinante que contiene ácido nucleico que codifica para factor de dispersión, puede administrarse a un sujeto antes de, simultáneamente con o subsecuente a la administración de un factor de crecimiento. Para los propósitos de transferencia de genes en un tejido o sujeto, un vector recombinante que contiene ácido nucleico que codifica para factor de dispersión puede combinarse con una solución acuosa estéril que es preferiblemente isotónica con la sangre del recipiente. Dichas formulaciones pueden prepararse suspendiendo el vector recombinante en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles tales como cloruro de sodio, glicina, y similares, y teniendo un pH regulado compatible con condiciones fisiológicas para producir una solución acuosa, y hacer dicha solución estéril. En una modalidad preferida de la invención, el vector recombinante se combina con una sacarosa al 20-25% en solución salina en la preparación para introducción en un mamífero.

Las cantidades de ácido nucleico que codifica para factor de dispersión, o ácido nucleico que codifica para factor de dispersión contenido en '"X un vector se administran en cantidades suficientes para promover la angiogénesis en un sujeto. Sin embargo, la dosis exacta dependerá de dichos 5 factores como el propósito de administración, el modo de administración, y la eficacia de la composición, así como los parámetros farmacocinéticos individuales del sujeto. Dichas terapias pueden administrarse tan frecuentemente como sea necesario y durante el periodo de tiempo juzgado como necesario por un experto en la técnica. • 10 Ejemplos no limitativos de tejidos en los que puede introducirse el ácido nucleico que codifica para factor de dispersión para promover la ^ angiogénesis incluyen tejidos fibrosos, endoteliales, epiteliales, vesiculares, cardiacos, cerebrovasculares, musculares, vasculares, trasplantados y tejidos heridos. 15 Los tejidos trasplantados son, por ejemplo, tejidos de corazón, riñon, pulmón, hígado y tejidos oculares. Los tejidos en los que puede introducirse el ácido nucleico que codifica para factor de dispersión para promover la angiogénesis incluyen a los asociados con enfermedades o condiciones seleccionadas del grupo que consiste en isquemia, trastornos circulatorios, trastornos vasculares, trastornos isquémicos miocárdicos, enfermedades miocárdicas, enfermedad pericárdica o enfermedad del corazón congénita. Ejemplos no limitativos de isquemia son isquemia al miocardio, isquemia cerebrovascular y trastornos veno-oclusivos. Un ejemplo de isquemia miocárdica es la enfermedad de arteria coronaria. *\ En otras modalidades de la invención, el factor de dispersión se utiliza para mejorar la curación de heridas, la regeneración de órganos y el transplante de órganos, incluyendo el transplante de órganos artificiales. Además, el factor de dispersión puede utilizarse para acelerar la cobertura de células endoteliales de injertos vasculares para poder evitar la falla de injerto debido a la reoclusión, y para mejorar los injertos de piel. Además, los anticuerpos para el factor de dispersión puede utilizarse para tratar tumores y evitar el crecimiento de • 10 tumores. La presente invención se describe en los siguientes ejemplos que se presentan para ayudar a entender la invención, y no deberán construirse para limitar de ninguna manera el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones que siguen posteriormente. 15 Detalles experimentales • Preparación del plásmido pRSX24 El plásmido pRSX24 se construyó por ligación de 2.3 kb SF ADNc 20 de longitud total en el sitio BamHI-Kpnl del vector pMEX, y se proveyó por el Dr. George Vande Woude (Frederick Cáncer Center, Frederick, MD).

Expresión de factor de dispersión en tejido isquémico normal Para poder lograr la expresión potencial de HGF utilizando el :"\ plásmido PRSX24 en tejido isquémico normal, se anestesiaron ratas Sprague- tf Dawley que pesaban entre 210-300, se entubaron y se colocaron en un respirador de presión positiva. La arteria coronaria izquierda se ligó 3-4 milímetros de su origen para producir infarto al miocardio, y al mismo tiempo, los ápices del corazón se inyectaron con 40 microgramos del plásmido PRSX24 (HSF). El análisis de expresión se llevó a cabo utilizando anticuerpos 10 monoclonales HGF antihumanos analizando secciones transversales del ápice de corazones de rata utilizando técnicas de inmunoquímica. Cinco días después de la inyección del plásmido, se observó tensión positiva en el miocardio lo que apoya la expresión de HSF en el tejido.

Efectos de transferencia de genes SF/HGF en miocardio de ratas Para poder determinar el efecto de transferencia de genes SF/HGF en miocardio de rata, se trataron ratas Sprague-Dawley macho para inducir isquemia miocárdica por ligación de la arteria coronaria izquierda, y 40 µg de control o plásmido SF/HGF se inyectó en el ápice del corazón. La figura 1A muestra la inmunotinción con anticuerpos monoclonales dirigidos contra SF/HGF de humano en tejido de miocardio 5 días después del infarto y la trasfección de genes; los patrones de tinción fueron significativamente más densos en el grupo tratado con plásmido SF/HGF que los controles (no se muestra). Las figuras 1 B y 1C muestran tejido miocárdico de animales tratados con SF/HGF y de control, respectivamente, tratados con anticuerpo CD-34 anti-endotelial (Becton •\ Dickenson) y teñidos utilizando inmunohistoquímica a base de peroxidasa (Ventana Medical Systems); se observó vascularidad incrementada en el 5 miocardio de animales tratados con SF/HGF 20 días después de la cirugía y la transfección. Aunque la invención en la presente se ha descrito con referencia a modalidades particulares, deberá entenderse que esas modalidades son meramente ilustrativas de varios aspectos de la invención. De esta manera, 10 deberá entenderse que pueden realizarse numerosas modificaciones en las modalidades ilustrativas y otras disposiciones pueden contemplarse sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (6)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
2. \ •• REIVINDICACIONES • 5 1.- El uso de un ácido nucleico que codifica para factor de dispersión para la elaboración de una composición con el fin de promover la angiogénesis en un tejido. 2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el ácido nucleico es introducido por un método seleccionado del grupo que 10 consiste en electroporación, transfección de DEAE Dextrano, transfección de fosfato de calcio, fusión de liposomas catiónicos, fusión de protoplastos, por r^ creación de un campo eléctrico in vivo, bombardeo de microproyectiles recubiertos con ADN, recombinación homologa y transferencia de ADN desnudo.
3. 3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde 15 el tejido se selecciona del grupo que consiste en tejidos fibrosos, endoteliales, epiteliales, vesiculares, cardiacos, cerebrovasculares, musculares, vasculares, transplantados o heridos.
4. 4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el tejido se asocia con enfermedades o condiciones seleccionadas del grupo que 20 consiste en isquemia, trastornos circulatorios, trastornos vasculares, trastornos isquémicos del miocardio, enfermedad miocárdica, enfermedad pericárdica o enfermedad del corazón congénita.
5. 5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde la isquemia es isquemia miocárdica, isquemia cerebrovascular o enfermedad r veno-oclusiva.
6. 6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde 5 la isquemia miocárdica es enfermedad de arteria coronaria. ^