MXPA00009232A

MXPA00009232A - Lipopolisacarido alfa- 2,3 sialiltransferasa de campylobacter jejuni y sus usos

Info

Publication number: MXPA00009232A
Application number: MXPA/A/2000/009232A
Authority: MX
Inventors: Michel Gilbert; Warren W Wakarchuk
Original assignee: National Research Council Of Canada
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2002-07-25

Abstract

La presente invención se refiere a la estructura y especificidad de una alfa-2,3-sialiltransferasa recombinante de Campylobacter spp. También se proporcionan métodos para utilizar la alfa-2,3-sialiltransferasa en la producción de estructuras de carbohidrato yácidos nucleicos deseados que codifican la sialiltransferasa.

Description

LIPOPOLISACARIDA a-2,3 SIALILTRANSFERASA DE CAMPYLOBACTER JEJUNI Y SUS USOS.

• Campo del Invento 5 La presente invención se refiere al campo de la clonación y expresión de encimas de sialiltransferasa. En particular las sialiltransferasas preferidas son transferasas bacterianas obtenidas de, por ejemplo, Campylobacter jejuni. • 10 Antecedentes del Invento Ahora los carbohidratos se reconocen como de gran importancia en muchos eventos de reconocimiento célula-célula, de manera notable, la adhesión de bacteria y virus es a células mamíferas en patogénesis e interacción celular leucocito-endotelial a través de selectinas en inflamación (Varki (1993) Glycobiology 3: páginas 97 a 130) además, los glicoconjugados sialilatados que se • encuentran en bacterias (Preston y Asociados (1996) Crit, Rev. Microbiol, 22: páginas de la 139 a la 180; Reuter y Asociados (1996) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377: página 325 a la 342 ) están a través de las oligosacaridas semejantes que se encuentran en glicolípidos de mamífero para evadir la respuesta inmune huésped (Moran y Asociados (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol 16: páginas 105 a la 1 15). La similitud molecular de estructuras huésped mediante la porción sacarida de lipopolisacarida (LPS), se considera un factor virulento de varios patógenos mucosos, los cuales utilizan esta estrategia para evadir una respuesta inmune huésped (Moran y Asociados. (1996) FEMS Immunol 16: página 105 a la 1 15; Moran y Asociados ( 1996) J. Endotoxin Res, 3: página 521 a la 531 ). Uno de estos patógenos, Campylobacter jejuni, es una causa importante de la gastroenteritis aguda en humanos (Skirrow (1977) Brit, Med J. 2: páginas 9 a la 1 1 ). Estudios epidemiológicos, han mostrado que las infecciones Campylobacter son mas comunes en países desarrollados que las infecciones de Salmonella, y también son una causa importante de enfermedades diarreicas en países en desarrollo, (Ketley (1997) Microbiol, 143: página 5 a la 21 ). Además .la infección de, C. Jejuni ha sido implicada como un antecedente frecuente del desarrollo y síndrome de Guillain-Barré, una forma de neuropatía que es la causa mas común de parálisis generalizada (Ropper (1992) N . Engl. J . Med. 326: página 1 130 a la 1 136). El serotipo de C. jejuni mas comúnmente asociado con el síndrome Guillian-Barré es: 0: 19 (Kuroki y Asociados (1993) Ann. Neurol . 33: Página 243 a la 247. La oligosacaridas núcleo de LPS de bajo peso molecular de deformaciones 0: 19, exhiben una similitud molecular con varios gangleosidas (Aspinall y Asociados (1994) Bioquímica 33: Páginas 241 a la 249; Aspinall y Asociados ( 1994) Bioquímica 33: página 250 a la 255). Se han encontrado en varias deformaciones 0: 19, porciones de oligosacarida terminal idénticas a las de gangleosidas GD .a, GD3, G M Í Y GT-?a . El significado de la similitud molecular como un factor virulento, hace que la identificación de los genes se involucre en la síntesis LPS, y que el estudio de su regulación sea de interés considerable para una mejor comprensión de los mecanismos de patogénesis utilizados por estas bacterias. Las estructuras de oligosacarida comprendidas en éstos y otros procesos, son agentes terapéuticos potenciales, pero se lleva mucho tiempo y grandes costos hacerlos a través de medios químicos tradicionales. Una forma muy prometedora para la producción de estructura de oligosacarida específica, es a través del uso de las encimas que se elaboran in vivo, las glicosiltransferasas. Dichas encimas pueden ser utilizadas como catalizadores regio y esterioselectivas para las síntesis de oligosacaridas in vitro (Ichikawa y Asociados (1992) Anal. Biochem. 202: página 215 a la 238). Las sialiltransferasas son un grupo de glicosiltransferasas que transfieren ácido siálico desde un nucléotido de azúcar activado hasta las oligosacaridas aceptoras encontradas en glicoproteínas, glicolípidos o polisacaridas. El gran número de estructuras de oligosacaridas sialilatada, han conducido a la caracterización de muchas sialiltransferasas diferentes involucradas en la síntesis de varia estructuras. Con base en la especificidad de enlace y aceptora de las sialiltransferasas estudiadas durante mucho tiempo, se ha determinado de que por lo menos 13 distintos genes de sialiltransferasa están presentes en los mamíferos (Tsuji y Asociados (1996) Glycobiology 6; páginas v a vii). La síntesis enzimática de oligosacaridas a gran escala, depende de la disponibilidad de cantidades suficientes de las glicosiltransferasas requeridas. Sin embargo, has sido problemática la producción de glicosiltransferasasen cantidades suficientes para utilizarse en la preparación de estructuras de oligosacaridas. Se ha logrado la expresión de muchas glicosiltransferasas de mamíferos, involucrando la expresión en huéspedes eucarióticos, los cuales pueden comprender medios de cultivos de tejido muy caros y únicamente producciones moderadas de proteínas (Kleene y Asociados. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201 : páginas 160 a la 167; Williams y asociados (1995) Glucoconjugate J. 12: páginas 755 a la 761 ). Se ha logrado la expresión en E. Coli, en glicosiltransferasas de mamífero. Pero estos intentos han producido, principalmente formas insolubles de la encima, de la cual ha sido difícil recuperar la encima activa en grandes cantidades. (Aoki y Asociados (1990) EMBO. J. 9: páginas 3171 a la 3178; Nishiu y Asociados (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 59 (9): páginas 1750 ala 1752). Además, debido a la actividad biológica de sus productos, las sialiltransferasas de mamífero generalmente actúan en tejidos específicos, compartimentos celulares y/o etapas de desarrollo para crear sialiloglicanos precisos. Las sialiltransferasas bacterianas, no están sujetas a las mismas restricciones y pueden utilizar un rango de aceptores mas amplio que el de las sialiltransferasas de mamíferos. Por ejemplo, la a-2,6-sialiltransferasa procedente de photobacterium damsela, ha mostrado transferir ácido siálico a residuos de galactosa terminal los cuales, son fucosilados o sialilatados en la posición 2 ó 3, (Kajihara y Asociados (1996) J. Org. Chem. 61 : página 8632 a la 8635). Dicha especificidad aceptora, no ha sido reportada en gran medida para sialiltransferasas de mamífero. A pesar que ha sido probada su importancia o factores virulentos potenciales, así como su uso potencial en la sintetización de oligosacaridas sialilatadas de interés, se han clonado varias sialiltransferasas (Weisgerber y asociados. ( 1991 ) Glycobiol. 1 : páginas 357 a la 365; Frosch y asociados ( 1991 ) Mol. Microbiol. 5: páginas 1251 a la 1263; Gilbert y Asociados ( 1996) J . Biol. Chem. 271 : páginas 2871 a la 28276) o se han purificado (Yamamoto y asociados ( 1996) J . Biochem. 120: páginas 104 a la 1 10). Las a-2-8-sialiltransferasas involucradas en la síntesis de cápsulas de ácido polisiálico, han sido clonadas y expresadas a partir tanto de Escherichia coli (Weisgerber y asociados (1991 ) Glycobiol 1 :página 357 a la 365) y N. Meningitidis (Frosch y asociados (1991 ) Mol. Microbiol 5: página 1251 a la 1263). Se han clonado (Patente Nortemericana No. 5,545,553) glicosiltransferasas procedentes de N. Gonorrhoeae, las cuales han sido involucradas en la síntesis de lipopoligosacarida (LOS) Por lo tanto, las sialiltransferasas bacterianas serían útiles en un número de aplicaciones, tales como la síntesis de oligosacaridas deseadas con actividad biológica. La identificación y caracterización de nuevas sialiltransferasas bacterianas, sería por lo tanto útil en el desarrollo de estas tecnologías. La presente invención cumple con estas y otras necesidades.

Sumario del Invento La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que incluyen una secuencia polinucléotida que codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa. El polipéptido a2,3-sialiltransferasa tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente el 75% idéntica a una secuencia de aminoácido tal como la que se establece SEQ. I D. NO:2, sobre una región de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTP, con una longitud mundial (W) de 3 y la matriz de resultado BLOSUM62. La secuencias polinucleótidas, preferentemente son de aproximadamente por lo menos el 75% idénticas a una secuencia polinucleótida de un gen a a2,3-sialiltransferasa de un Campylobacter jejuni, tal como se establece en la SEQ. I D.NO: 1 sobre una región de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTN con una longitud mundial (W) de 1 1 , M=5, y N=-4. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, generalmente hibridarán a una secuencia polinucleótida de SEQ. ID-NO: 1 bajo condiciones estrictas. La presente invención, también proporciona polipéptidos a-2,3 sialiltransferasa aislados que han tenido una secuencia de aminoácido por lo menos aproximadamente el 75% idéntica a la secuencia de aminoácido de una a-2,3-sialiltransferasa Campylobacter jejuni, tal como se establece en la SEQ. ID. No:2, sobre una región de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTP con una longitud mundial (W) de 3, y la matriz de resultado BLOSUM62. La presente invención proporciona, en una modalidad, los polipéptidos de sialiltransferasa de longitud completa que han tenido aproximada 430 aminoácidos, también se proporcionan polipéptidos de sialiltransferasa truncados que son de por lo menos aproximadamente 328 aminoácidos de longitud, y también tienen actividad de sialiltransferasa. En otra modalidad, la presente invención proporciona células que tienen una cinta de expresión recombinante que contiene un promotor enlazado en forma operable a una secuencia polinucleótida la cual codifica un polipéptido a-2,3-sialiltransferasa tal como se describe en la presente invención, Se proporcionan células tanto procarióticas como eucarióticas que expresan el polipéptido sialiltransferasa. Otra modalidad de la presente invención, proporciona métodos para agregar un residuo de ácido siálico a una molécula aceptora que tiene un residuo de galactosa terminal. Los métodos comprenden el contacto de una molécula aceptora con una molécula de ácido siálico activado, y un polipéptido a-2,3-sialiltransferasa de la presente invención. El residuo de galactosa terminal del aceptor, normalmente está enlazado a través de un enlace ß a un segundo residuo en la molécula aceptora. En donde el enlace entre el residuo de galactosa terminal y el segundo residuo es enlace ß 1 ,4, el segundo residuo normalmente es un residuo Gle ó un GIcNac. En donde el enlace es un enlace ß 1 ,3, el segundo residuo puede ser un residuo gel GleNac o un GalNac.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 , muestra un mapa físico de la organización genética del locus C. jejuni cst-l . En la Figura 2, se muestra la secuencia nucleótida completa, y está disponible en GenBank como el número de acceso AF130466. El inserto de pCJ H 101 es 3.9 kb, mientras que el inserto de pCJH9 es de 5.3 kb. Únicamente se muestra el primer 1 .4 kb de pCJH9, debido a que se descubrió que la corriente descendente de la secuencia no es contigua en el genoma C. jejuni OH 4384. Están indicados los sitios Hindl l l ("H"). El gen prfB parcial, es similar a un factor de liberación de cadena de péptido (GenBank #AE000537) de Helicobacter pylori, mientras que el gen cysD y el gen cysN parcial son similares a genes E. coli, que codifican subunidades adeniltransferasa de sulfato (GenBank # AE000358). La Figura 2, muestra la secuencia nucleótida (SEQ I D NO. 1 ) y la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO.2) del C. jejuni cst-l . En esta Figura, únicamente se muestra la secuencia que codifica el gen cst-l . La Figura 3, muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas del gen C. jejuni OH4384 cst-l y ORF putativo de H. Influenzae (GenBank #U32720). La alineación se llevó a cabo utilizando el programa ALI NG (Generics Computer Group, Madison Wl). Las líneas verticales continuas entre las secuencias, muestran residuos idénticos.

Descripción Detallada del Invento. Definiciones Se considera que las oligosacaridas, tienen un extremo de reducción y un extremo de no reducción, ya sea o no que la sacarida en el extremo de reducción sea de hecho un azúcar de reducción. De acuerdo con una nomenclatura aceptada, las oligosacaridas que se muestran en la presente descripción, con el extremo de no reducción a la izquierda y el extremo de reducción a la derecha. Todas las oligosacaridas descritas en la presente descripción, se describen con el nombre o abreviación de la sacarida de no reducción (por ejemplo, Gal), seguida de la configuración del enlace glicosílico (a o ß), el enlace de anillo, la posición del anillo de la sacarida de reducción comprendida en el enlace, y posteriormente el nombre o abreviación de la sacarida de reducción (por ejemplo, GIcNAc). El enlace entre dos azúcares, se puede expresar, por ejemplo, como 2,3,2?3 ó (2,3). Cada sacárida es una piranosa o furanosa. Un "polipéptido sialiltransferasa" de la presente invención, es una proteína sialiltransferasa o fragmento de la misma, que tiene la capacidad de catalizar la transferasa de un ácido siálico desde un substrato donante (por ejemplo, CMP-NeuAc) hasta una molécula aceptora. Normalmente, dichos polipéptidos serán substancialmente similares a las proteínas ejemplificadas descritas en la presente invención. Generalmente, la adición de ácido siálico, tiene lugar en el extremo de no reducción de una porción de oligosacarida o carbohidrato en una biomolécula. En la presente descripción, las biomoléculas incluyen, pero no se limitan a moléculas biológicamente significativas, tales como carbohidratos, proteínas (por ejemplo, glicoproteínas), y lípidos (glicolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y ganliosidas). Las sialiltransferasas de la presente invención, se pueden utilizar para agregar residuos de ácido siálico de diferentes formas a moléculas aceptoras. Normalmente, el ácido siálico es ácido 5-N-acetilneuramínico (NeuAc) o ácido 5-N-glicolilneuraminico (NeuGe). Sin embargo, en su lugar se pueden utilizar otros ácidos siálicos. Para una revisión de las diferentes formas de ácido siálico adecuado en la presente invención, se debe ver la publicación de Schaur en Métodos y enzimología, 50: Páginas 64 a 89 ( 1987), y la publicación de Shaur, Avances en la Química and Bioquímica de Carbohidratos, 40: páginas 131 a 234. En la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaciones para los residuos de sacarida: Ara = arabinosilo; Fru = fructosilo; Fue = fucosilo; Gal = galactosilo; GalNAc = N-acetilgalactosaminilo; Gle = glucosilo; GIcNAc = N-acetilglucusaminilo Man = manosil; y NeuAc = sialil (N-acetilneuraminilo) Las abreviaciones adicionales que se utilizan en la presente descripción son: LPS, lipopolisacarida; LOS, lipooligosacarida; CMP-NeudAC, ácido monofosfato-N-acetilneuramínico de citidina; CE, electroforésis capilar; LIF, fluorescencia inducida por láser; FCHASE, éster succimidílico de ácido 6-(5-fluorescin-carboxamido)-hexanoico.

Los substratos donantes para glicosiltransferasas, son azúcares nucleótidos activados. Dichos azúcares activados, generalmente consisten de difosfato de uridina y guanosina y derivados de citidina de los azúcares en los cuales el difosfato o monofosfato de nucleosida sirven como un grupo de partida. El substrato donante para las sialiltransferasas de la presente invención, son nucleótidos de azúcar activada que comprenden el ácido siálico deseado. Por ejemplo, en el caso de NeuAc, el azúcar activado es CMP-NeuAc. El término "ácido nucleico", se refiere a un polímero desoxiribonucleótido o ribonucleótido, ya sea en forma trenzada simple o doble, y a menos que se limite de otra manera, comprende análogos conocidos de nucleótidos naturales que hibridan los ácidos nucleicos en forma similar a los nucleótidos que surgen de manera natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico en particular, incluye la secuencia complementaria de la misma. Una "subsecuencia", se refiere a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, que comprende una parte de una secuencia más grande de nucleótidos o aminoácidos (por ejemplo, polipéptidos), respectivamente. El término "enlazado en forma operable", se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como, un promotor, secuencia de señal o formación de sitios de enlace de factor de transcripción), y un segundo polinucleótido, en donde la secuencia de control de expresión afecta la transcripción y/o translación del segundo polinucleótido. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", tal como se usa en la presente descripción, es una que se origina de una fuente externa a la célula huésped particular, o, si es de la misma fuente, está modificada a partir de su forma original. Por lo tanto, un gen de glicosiltransferasa heterólogo en una célula huésped procariótica, incluye un gen de glicosiltransferasa que, aunque es endógeno para la célula huésped particular, ha sido modificado. La modificación de la secuencia heteróloga, puede ocurrir, por ejemplo, tratando el ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que tenga la capacidad de ser enlazado en forma operable al promotor. Técnicas tales como la mutagénesis dirigida al sitio, son útiles también para la modificación de un ácido nucleico heterólogo.

El término "recombinante", cuando se utiliza con relación a una célula, indica que la célula duplica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificada mediante un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes, también pueden contener genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, en donde los genes son modificados e introducidos nuevamente en la célula a través de medios artificiales. El término, también comprende células que tienen un endógeno de ácido nucleico para la célula que ha sido modificada, sin remover el ácido nucleico de la célula; dichas modificaciones incluyen las obtenidas mediante el reemplazo del gen, mutación específica del sitio, y técnicas relacionadas. Una "cinta de expresión recombinante" o simplemente una "cinta de expresión", es una construcción de ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, que tiene elementos de control que tienen la capacidad de efectuar la expresión de un gen estructural que está enlazado en forma operable a los elementos de control en huéspedes compatibles con dichas secuencias. Las cintas de expresión incluyen por lo menos promotores y opcionalmente, señales de terminación de transcripción. Normalmente, la cinta de expresión recombinante incluye por lo menos un ácido nucleico, que será transcrito (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado) y un promotor. Los factores adicionales o útiles para efectuar la expresión, también se pueden utilizar tal y como se describe en la presente descripción, por ejemplo, una cinta de expresión también puede incluir secuencias nucleótidas que codifican una secuencia de señal que dirige la secreción de una proteína expresada de la célula huésped. Las señales de terminación de transcripción, aumentadores y otras secuencias de ácido nucleico que influencian la expresión del gen, también pueden ser incluidas en una cinta de expresión. El término "aislado", se refiere a un material el cual está substancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan la enzima, tal como se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, cuando están aisladas, las enzimas de la presente invención no incluyen materiales normalmente asociados con su ambiente in situ. Normalmente, las sialiltransferasas aisladas o ácidos nucleicos que codifican sialiltransferasa de la presente invención, son por lo menos aproximadamente el 80% puras, normalmente por lo menos aproximadamente el 90% y preferentemente por lo menos aproximadamente el 95% puras, tal como se mide por la intensidad de banda en un gel manchado con plata u otro método de determinación de pureza. La pureza u homogeneidad de la proteína, puede ser indicada por un número de formas bien conocidas en el arte, tal como electrofóresis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguida de una visualización al momento del manchado. Para ciertos propósitos, se necesitará alta resolución y se utilizará HPLC o un medio similar para la purificación. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a 5 dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de nucleótidos o aminoácidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, tal como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante • 10 inspección visual. La frase "substancialmente idéntico", dentro del contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen por lo menos el 60%, preferentemente el 80%, más preferentemente del 90 al 95% de identidad de residuo de nucleótido o aminoácido, cuando se compara y alinea para una correspondencia máxima, tal como se mide • utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual . Preferentemente, la identidad substancial existe en una región de las secuencias que es por lo menos aproximadamente de 50 residuos de longitud, más preferentemente sobre una región de por lo menos aproximadamente 100 residuos, y más preferentemente las secuencias son substancialmente idénticas sobre por lo menos aproximadamente 120 o 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son substancialmente idénticas sobre toda la longitud de las regiones de codificación o polipéptidos. Para la comparación de secuencia, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia son ingresadas a una computadora, las coordenadas de subsecuencia son diseñadas, si es necesario, y se diseñan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Posteriormente, el algoritmo de comparación de secuencia calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia (s) de prueba, relativa a la secuencia de referencia con base en los parámetros del programa designado. Se puede llevar a cabo una alineación de secuencias óptima para comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: página 482 (1981 ), a través del algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. mol. Biol. 48: página 443 (1970), mediante la investigación para un método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85: página 2444 ( 1988) a través de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA, en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl), o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel y asociados, supra).

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia, y la similitud de secuencia, es el algoritmo BLAST, el cual es descrito por Altschul y asociados, J . Mol. Biol. 215: páginas 403 a 410 ( 1990). El software para realizar el análisis BLAST, está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo comprende, primero la identificación de pares de secuencia de resultado superior (HSPs), identificando palabras cortas de la longitud W en la secuencia query, la cual ya sea que corresponda o satisfaga a algún resultado de valor de umbral valuado como positivo T, cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere a un valor de umbral de resultado de palabra contigua (Altschul y asociados, supra). Estos alcances de la palabra contiguo iniciales, actúan como semillas para iniciar la búsqueda para encontrar HSPs mas grandes que los contengan. Posteriormente, los alcances de las palabras, se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, tanto como el resultado de alineación acumulativo pueda ser incrementado. Los resultados acumulativos son calculados, utilizando, para las secuencias nucleótidas, los parámetros M (resultado de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre <0) y N (resultado de penalidad para residuos que no coinciden; siempre >0). Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de resultado para calcular el resultado acumulativo. La extensión de los alcances de la palabra en cada dirección, se detienen cuando: el resultado de alineación acumulativa cae fuera mediante la cantidad X de su valor máximo alcanzado; el resultado acumulativo va a 0 o más bajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de resultado negativo; se alcanza el final de cualquier secuencia. Para identificar si un ácido nucleico o polipéptido está dentro del alcance de la presente invención, son adecuados los parámetros de incomparescencia de los programas BLAST. El programa BLASTN (para secuencias nucleótidas), utiliza como incomparescencias una longitud mundial (W) de 1 1 , una expectación (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambos cabos. Para las secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como incomparescencias una longitud mundial (W) de 3, una expectación (E) de 10 y la matriz de resultado BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: página 10915 ( 1989)). Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST, también desempeña un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 90: páginas 5873 a 5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST, es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual podría ocurrir por elección, una coincidencia entre dos secuencias nucleótidas o de aminoácido. Por ejemplo, un ácido nucleico es considerado similar a una secuencia de referencia, si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia, es menor a aproximadamente 0.1 , más preferentemente menor a aproximadamente 0.01 , y aún más preferentemente menor a aproximadamente 0.001 . Otra indicación de que las dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas, es que las dos moléculas hibridan a la otra bajo condiciones estrictas. "Enlace (s) substancial", se refiere a una hibridación complementaria entre un ácido nucleico de muestra y un ácido nucleico objetivo, y comprende las faltas de coincidencia menores que pueden acomodadas reduciendo lo estricto del medio de hibridación para lograr la dirección deseada de la secuencia polinucleótida objetivo. La frase "hibrida específicamente a", se refiere al enlace, duplica o hibridación de una molécula únicamente para una secuencia nucleótida en particular bajo condiciones estrictas, cuando dicha secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total). El término "condiciones estrictas", se refiere a condiciones bajo las cuales, una muestra hibridará a su subsecuencia objetivo, pero no a otras secuencias, las condiciones estrictas son secuencias dependientes y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas, hibridan específicamente a temperaturas más altas. Generalmente, las condiciones estrictas son seleccionadas para ser aproximadamente de 5°C más bajas que el punto de ebullición térmica (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica y pH definido. El Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida, pH , y concentración de ácido nucleico) en la cual el 50% de las muestras complementarias para la secuencia objetivo, hibridan para la secuencia objetivo en equilibrio. (Ya que las secuencias objetivo, generalmente están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las pruebas están ocupadas en equilibrio). Normalmente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor a aproximadamente 1 .0 M Na a ion, normalmente aproximadamente desde una concentración de ion desde 0.01 hasta 1 .0 m Na (u otras sales) a un pH de desde 7.0 hasta 8.3, y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30°C para muestras cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos), y por lo menos aproximadamente 60°C para muestras largas (por ejemplo, mayores a 50 nucleótidos). Las condiciones estrictas, también se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización, tales como formamida. Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son substancialmente idénticos, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente de reacción cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describirá más adelante. Las frases "enlace específicamente a una proteína" o "específicamente inmunoreactivo con", cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere a una reacción de enlace la cual es determinante de la presencia de la proteína, en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Por lo tanto, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, un anticuerpo específico se enlaza preferentemente a una proteína en particular y no se enlaza en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El enlace específico a una proteína bajo dichas condiciones, requiere un anticuerpo que es seleccionado por su especificidad para una proteína en particular. Se puede utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo, para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida, son utilizados rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Anticuerpos, Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, en una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica. Un polipéptido, es normalmente idéntico de manera substancial a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente por las substituciones de conservación. Una "substitución conservadora", cuando describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de aminoácido de la proteína que no altera substancialmente la actividad de la proteína. Por lo tanto, "las variaciones conservadoramente modificadas" de una secuencia de aminoácido en particular, se refiere a substituciones de aminoácido de aquellos aminoácidos que no son importantes para la actividad de la proteína o substitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, acídico, básico, positiva o negativamente cargados, polar o no polar, etc.), de modo que las substituciones aún de aminoácidos críticos, no alteran substancialmente la actividad. Las tablas de substitución conservadora, que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares, son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Creighton (1984) Proteínas, W. H . Freeman and Company. Además, las substituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada, también son "variaciones conservadoramente modificadas".

Descripción Detallada del Invento. La presente invención proporciona una a-2,3-sialiltransferasa procedente de Campylobacter jejuni. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican la sialiltransferasa, y métodos para utilizar los ácidos nucleicos para producir la sialiltransferasa. Ácidos nucleicos que codifican a2,3-sialiltransferasas. La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que incluyen una secuencia polinucleótida que codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa, que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente 75% idéntica a una secuencia de aminoácido tal como se establece en SEQ. ID. NO: 1 . La región de identidad, normalmente es sobre una región de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTP con una longitud mundial (W) de 3, y la matriz de resultado BLOSUM62. La región de identidad se extiende más preferentemente sobre por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos, aún más preferentemente sobre por lo menos aproximadamente 328 aminoácidos, y más preferentemente sobre toda la longitud del polipéptido. • Las secuencias polinucleótidas, normalmente son por lo menos aproximadamente 75% idénticas a una secuencia polinucleótida de un gen a2,3-sialiltransferasa de Campylobacter jejuni, tal como el que se establece en la SEQ. ID. N : 1 . La región de similitud entre las moléculas de ácido nucleico de las presente invención y la secuencia de sialiltransferasa de C. jejuni, se extiende sobre por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos, preferentemente sobre por lo menos 500 nucleótidos y más preferentemente se extiende sobre toda la longitud de la región de codificación de sialiltransferasa. Para identificar los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede emplear un algoritmo de comparación de secuencia nucleótida, tal como los conocidos por los expertos en el arte. Por ejemplo, se puede utilizar el algoritmo BLASTN . Los parámetros adecuados para utilizarse en BLASTN, son una longitud mundial entre (W) de 1 1 , M=5, y N=-4. De manera alternativa, se puede identificar un ácido nucleico de la presente invención, hibridando, bajo condiciones estrictas, el ácido nucleico de interés para un ácido nucleico que incluye una secuencia polinucleótida de SEQ. ID. NO: 1 . Un ejemplo de un ácido nucleico de la presente invención, incluye una secuencia polinucleótida de una enzima a 2,3-sialiltransferasa de C. jejuni, tal como se establece en SEQ. I D. IMO: 1 . Los ácidos nucleicos de la presente invención , pueden codificar una encima de sialiltransferasa completa, o pueden codificar una subsecuencia de un gen de sialiltransferasa. Por ejemplo, la presente invención incluye ácidos nucleicos que codifican un polipéptido el cual no es una enzima de sialiltransferasa de longitud completa, pero sin embargo, tiene actividad de sialiltransferasa. Un ácido nucleico que codifica por lo menos 328 aminoácidos de terminal amino de una a2,3-sialiltransferasa de C. jejuni, tal como se establece en SEQ. ID. NO:2, por ejemplo, se proporciona en la presente invención, como los ácidos nucleicos que codifican los 430 de polipéptidos de sialiltransferasa de aminoácido completos. Los ácidos nucleicos que codifican una a2,3-sialiltransferasa que tiene substituciones conservadoras de aminoácidos dentro de la secuencia de SEQ. I D. NO:2, también se proporcionan en la presente invención. La práctica de la presente invención, comprende la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células huésped transfectadas. Las técnicas de clonación molecular para alcanzar estos fines, son conocidas en el arte. Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vitro, adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes tales como vectores de expresión, son bien conocidos por los expertos en el arte. Los ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a las personas expertas, a través de varios ejercicios de clonación se encuentran en las publicaciones de Sambrook y asociados (1989) Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, 2da. Edición, Volúmenes del 1 al 3, Cold Spring Hargor Laboratory; Berger y Kimmel, Guía para Técnicas de Clonación Molecular, Métodos en Enzimología, Volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; y Protocolos Normales en Biología Molecular, F.M . Ausubel y asociados, editores, Protocolos Normales, una iniciativa en conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. , (suplemento de 1994). Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de sialiltransferasa de la presente invención, se pueden preparar mediante cualquier método adecuado conocido en el arte, incluyendo, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas o dirección de síntesis química a través de métodos, tales como el método de fosfotriéster de Narag y asociados (1979) Meth. Enzymol. 68: páginas 90 a 99; el método fosfodiester de Brown y (1979) Meth. Enzymol. 68: páginas 109 a 151 ; el método de dietilfosforamidita de Beaucage y asociados (1981 ) Tetra. Lett. , 22: páginas 1859 a 1862; y el método de soporte sólido de la Patente Norteamericana No. 4,458,066. En una modalidad preferida, un ácido nucleico que codifica una sialiltransferasa es aislado a través de métodos de clonación de rutina. Una secuencia nucleótida de un gen o cADN que codifica sialiltransferasa, tal como se proporciona en la presente invención, se utiliza para proporcionar muestras que hibridan específicamente a un cADN de sialiltransferasa en una biblioteca cADN, un gel de sialiltransferasa en una muestra de ADN genómico, o a un mARN de sialiltransferasa en una muestra de ARN total. (Por ejemplo, en una mancha del Sur o del Norte). Una vez que se identifica el ácido nucleico de sialiltransferasa objetivo, puede ser aislado de acuerdo a métodos estándar conocidos por los expertos en el arte. Los ácidos nucleicos deseados, también pueden ser clonados utilizando técnicas de amplificación bien conocidas. Los ejemplos de suficientes protocolos para dirigir a las personas expertas a través de métodos de amplificación in vitro incluyendo la reacción en cadena de polimerasa (PCR), la reacción en cadena de ligasa (LCR), la Qß-replicasa y otras técnicas mediadas por polimerasa ARN, se encuentran en las publicaciones de Berger, Sambrook y Ausubel, así como Mullís y asociados (1987), Patente Norteamericana No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis y asociados editores) Academic Press Inc. San Diego, CA ( 1990) (Innis); Arnheim y Levinson (Octubre 1 de 1990) C&EN páginas 36 a 47; The Journal Of N IH Research (1991 ) 3: páginas 81 a 94; (Kwoh y asociados (1989) Proc. Nati . Acad Sci. EUA 86: página 1 173; Guatelli y asociados (1990) Proc Nati. Acad. Sci. EUA 87: página 1874 Lomell y asociados (1989) J. Clin. Chem. 35: página 1826 Landegren y asociados (1988) Science 241 : páginas 1077 a 1080 . Van Brunt (1990) Biotechnology 8: páginas 291 a 194; Wu y Wallace (1989) Gene 4: página 560; y Barringer y asociados ( 1990) Gene 89: página 1 17. Los métodos mejorados de clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro, son descritos por Wallace y 5 asociados en la Patente Norteamericana No. 5,426,039. Los primarios adecuados para utilizarse en la amplificación de los ácidos nucleicos de la presente invención, incluyen por ejemplo: CJ 18F: 5' primario de C. jejuni a-2.3-Stasa (41 mer. Ndel sitio en • 10 itálicas) (SEQ ID NO:3. 5' C TTA GGA GGT CAT ATG ACA AGG ACT AGA ATG GAA AAT GAA C 3' CJ40R: 3' primario de C. jejuni a-2.3-Stasa con 6 His cola (60 mer.

Salí sitio en itálicas. (His .« tag in bold) (SEQ ID NO:4) 5' CC TAG GTC GAC TCA TTA GTG GTG ATG GTG GTG ATG TTC • CCC TTT CTC AAA CTC TCT CTT C 3' (Checar traducción de negritas) Los ácidos nucleicos de sialiltransferasa, también pueden ser clonados detectando sus productos expresados a través de medios de ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de las proteínas expresadas. Por ejemplo, se puede identificar un ácido nucleico de sialiltransferasa clonado, mediante la capacidad de un polipéptido codificado por el ácido nucleico, para catalizar la transferencia de un ácido siálico de una porción donante a una porción aceptora. En una modalidad preferida, se emplea electrofóresis capilar para detectar los productos de reacción. Este ensayo altamente sensible, comprende el uso de derivados cualquiera aminofenil de monosacarida o disacarida, los cuales estén etiquetados con fluorescencia, tal como se describe más adelante por Wakarchuk y asociados (1996) J. Biol. Chem. 271 (45): páginas 28271 a 28276. En algunas modalidades, puede ser deseable modificar los ácidos nucleicos de sialiltransferasa de la presente invención. Un experto en el arte reconocerá muchas formas de generar alteraciones en una construcción de ácido nucleico determinada. Dichos métodos bien conocidos, incluyen mutagénesis dirigidas por sitio, amplificación PCR utilizando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que tienen el ácido nucleico para agentes mutagénicos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por ejemplo, en conjunto con ligación y/o clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y otras técnicas bien conocidas. Ver por ejemplo, Gíliman y Smith (1979) Gene 8: páginas 81 a 97, Roberts y asociados (1987) Nature 328: páginas 731 a 724. Enzimas 2,3-sial i Itra nsf erasa La presente invención, también proporciona enzimas a2,3-sialiltransferasa. Los polipéptidos de a2,3-sialiltransferasa de la presente invención, normalmente tienen una secuencia de aminoácido, que es por lo menos aproximadamente 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una a2,3-sialiltransferasa C. jejuni tal como se establece en la SEQ. ID. NO:2. La región de similitud entre una sialiltransferasa C. jejuni y un polipéptido de interés, normalmente se extiende sobre una región de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos, aún más preferentemente sobre de por lo menos aproximadamente 328 aminoácidos y lo más preferente sobre toda la longitud del polipéptido. Un ejemplo de un algoritmo que es útil para comparar un polipéptido con una secuencia de aminoácido de una a2,3-sialiltransferasa C. jejuni es el algoritmo BLASTP, los parámetros adecuados incluyen una longitud mundial (W) de 3, y la matriz de resultado BLOSUM62. Un ejemplo de un polipéptido de sialiltransferasa de la presente invención, tiene una secuencia de aminoácido tal como se establece en SEQ. I D. NO:2. Los polipéptidos de la presente invención, incluyen enzimas de sialiltransferasa de longitud completa, así como polipéptidos truncados que retienen la actividad de sialiltransferasa. Por ejemplo, la presente invención proporciona polipéptidos que incluyen por lo menos 328 aminoácidos de terminal amino de una a2,3-sialiltransferasa C. jejuni tal como se establece en SEQ. I D. NO:2; así como polipéptidos de longitud de hasta e incluyendo 430 aminoácidos completos del polipéptído a2,3-sialiltransferasa C. jejuni. La presente invención, también incluye polipéptidos que tienen substituciones conservadoras de aminoácidos dentro de las secuencia SEQ. I D. NO:2.

Expresión de cintas que codifican sialiltransferasas de la presente invención. Para obtener los polipéptidos de a2,3-sialiltransferasa de la presente invención, se pueden incorporar polinucleótidos que codifican sialiltransferasa de la presente invención, en cintas de expresión para la expresión de nivel superior de una célula huésped deseada. Una cinta de expresión típica, contiene un promotor enlazado en forma operable a la secuencia de ADN deseado. Se puede expresar más de un polipéptido de sialiltransferasa, en una célula procariótica simple, colocando múltiples cintas de transcripción en un vector de expresión simple, construyendo un gen que codifica una proteína de fusión que consiste de más de una sialiltransferasa o utilizando diferentes marcadores seleccionables para cada uno de los vectores de expresión, los cuales se emplean en la estrategia de clonación. En una modalidad preferida, las cintas de expresión son útiles para la expresión de sialiltransferasas en células huésped procarióticas. Las secuencias de control procarióticas comúnmente utilizadas, las cuales están definidas en la presente invención para incluir promotores para la iniciación de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de enlace de ribosomas, incluyen dichos promotores comúnmente utilizados, tal como sistemas promotores beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Change y asociados (1977), Nature 198: página 1056), el sistema promotor triptofan (trp) (Goeddel y asociados (1980) Nucleic Acids Res. 8: página 4057), el promotor tac (DeBoer y asociados (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80: páginas 21 a 25); y el promotor PL derivado de lambda y el sitio de enlace de ribosoma de N-gen (Shimatake y asociados ( 1981 ), Nature 292: página 128. El sistema promotor en particular no es importante para la presente invención, se puede utilizar cualquier promotor disponible que funcione en procariotas. En la presente invención, se pueden utilizar promotores ya sean constitutivos o regulados. Los promotores regulados, pueden ser convenientes debido a que las células huésped pueden desarrollarse en altas densidades antes de que se induzca la expresión de los polipéptidos de sialiltransferasa. La expresión de alto nivel de proteínas heterólogas, hace lento el crecimiento celular en algunas situaciones. Los promotores regulados especialmente adecuados para utilizarse en E. coli, incluyen el promotor PL lambda bacteriófago, el promotor trp-lac híbrido (Amann y asociados (1983) Gene 25: página 167; de Boer y asociados (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80: página 21 , y el promotor T7 bacteriófago (Studier y asociados 81986) J. Mol. Biol. ; Tabor y asociados ( 1985). Estos promotores y su uso, se mencionan en Sambrook y asociados, supra.

Para la expresión de polipéptidos de sialiltransferasa en células procarióticas diferentes a E. coli, se requiere un promotor que funcione en las especies procarióticas particulares. Dichos promotores pueden ser obtenidos a partir de genes que han sido clonados de las especies, o se pueden utilizar promotores heterólogos. Por ejemplo, el promotor trp-lac híbrido, funciona en Bacillus además de E. coli. Los promotores adecuados para utilizarse en células huésped eucarióticas son bien conocidos por los expertos en el arte. Un sitio de enlace de ribosomas (RBS), está incluido convenientemente en las cintas de expresión de la presente invención, que pretenden utilizarse en las células huésped procarióticas. Por ejemplo, un RBS en E. coli, consiste de una secuencia nucleótida de 3 a 9 nucleótidos de longitud, corriente ascendente de 3 a 1 1 nucleótidos localizados del codón de iniciación (Shine y Dalgarno (1975) Nature 254, página 34; Steitz, In Biological regulation and Development: Gene expression (Ed. R. F. Goldberger), vol. 1 , página 349, 1979, Plenum Publishing, NY). Se puede utilizar acoplamiento translacional para aumentar la expresión. La estrategia utiliza una estructura de lectura abierta de corriente ascendente corta, de un nativo de gen altamente expresado para el sistema translacional, el cual es colocado en la corriente descendente del promotor, y un sitio de enlace de ribosoma seguido de algunos codones de aminoácidos mediante un codón de terminación. Justo antes del codón de terminación, está un segundo sitio de enlace de ribosoma, y el siguiente codón de terminación, es un codón de partida para la iniciación de la translación. El sistema disuelve la estructura secundaria permitiendo eficiente de translación. Ver, Squires y asociados (1988) J. Biol. Chem. 263: páginas 16297 a 16302.

Los polipéptidos de sialiltransferasa se pueden expresar intracelularmente, o pueden ser segregados de la célula. La expresión ¡ntracelular, a menudo da como resultado altos • rendimientos. Si es necesario, la cantidad de polipéptido de 5 sialiltransferasa activo, soluble, puede ser incrementada llevando a cabo procedimientos de redoblado (ver por ejemplo, Sambrook y asociados, supra. ; Marston y asociados (1984) Bio/Technology 2: página 800; Shoner y asociados ( 1985) Bio/Technology 3: página 151 ). En modalidades en las cuales los polipéptidos de • 10 sialiltransferasa son segregados de la célula, ya sean en el periplasma o dentro del medio extracelular, la secuencia de ADN está enlazada a una secuencia de péptido de señal que se puede dividir. La secuencia de señal dirige la translocación del polipéptido de sialiltransferasa a través de la membrana celular. Un ejemplo de un vector adecuado para utilizarse en E. coli que contiene una unidad de secuencia de señal del promotor, es pTA1529, la cual tiene el promotor E. coli phoA y una secuencia de señal (ver, por ejemplo, Sambrook y asociados, supra. ; Oka y asociados (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: página 7212; Talmadge y asociados (1980) Proc Nati. Acad. Sci. EUA 77: página 3988; Takahara y asociados (1985) J. Biol. Chem. 260: página 2670). Un experto en el arte, reconocería que se pueden hacer modificaciones a las sialíltransferasas, sin disminuir su actividad biológica. Se pueden realizar algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión o incorporación del campo catalítico en una proteína de fusión. Dichas modificaciones son bien conocidas para los expertos en el arte e incluyen, por ejemplo, la adición de codones en cualquier término del polinucleótido que codifique el campo catalítico para proporcionar, por ejemplo una metionina agregada al término amino para proporcionar un sitio de iniciación, o nucleótidos adicionales colocados en cualquier término para crear de manera conveniente sitios de restricción localizada o codones de terminación o secuencias de purificación. Los polipéptidos de la sialiltransferasa de la presente invención, también pueden ser producidos como proteínas de fusión.

Este método a menudo da como resultado altos rendimientos, debido a que las secuencias de control procariótico normal dirigen la transcripción y traslación. En E. coli, las fusiones lacZ a menudo se utilizan para expresar proteínas heterólogas. Los vectores adecuados, tales como las series pUR, pEX y pMR100 a menudo están disponibles (ver, por ejemplo, Sambrook y asociados, supra.). Para ciertas aplicaciones, puede ser deseable dividir los aminoácidos sin sialiltransferasa de la proteína de fusión después de la purificación. Esto se puede lograr, mediante cualquiera de varios métodos conocidos en el arte, incluyendo división por bromo de cianógeno, una proteasa, o un Factor Xa (ver, por ejemplo, Sambrook y asociados, supra. ; Itakura y asociados, Science ( 1977), 198, página 1056; Goeddel y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979), 76, página 106; Nagai y asociados, Nature (1984), 309, página 810; Sung y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986), 83, página 561 ). Los sitios de división pueden ser construidos en el gen para la proteína de fusión, en el punto de división deseado. Para facilitar la purificación de los polipéptidos de sialiltransferasa de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de sialiltransferasa también pueden incluir una secuencia de codificación para un epítope o "etiqueta" para la cual es disponible un reactivo de afinidad de enlace. Los ejemplos de epítopes adecuados incluyen los genes reporteros myc y V-5; los vectores de expresión útiles para la producción recombinante de los polipéptidos de fusión que tienen estos epítopes, están disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad CA) vectores pcADN3.1 /Myc-His y pcADN3.1 /V5-His son adecuados para la expresión en células de mamíferos). Los vectores de expresión adicionales adecuados para adherir una etiqueta a las proteínas de fusión de la presente invención, y que corresponden a sistemas de detección son conocidos por los expertos en el arte, y muchos de ellos están disponibles en el mercado (por ejemplo, FLAG ™ (Kodak, Rochester NY). Otro ejemplo de una etiqueta adecuada es una etiqueta de polihistidina, la cual tiene la capacidad de enlazarse a ligantes de afinidad de quelato metal. Normalmente, se utilizan seis histidinas adyacentes, aunque se pueden utilizar más o menos de seis. Los ligantes de afinidad de quelato de metal que pueden servir como porción enlazadora para una etiqueta de polihistidina, incluyen ácido nitrilo-tri-acético (NTA) (Hochuli, E. (1990) "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" en Genetic Engeenering: Principies and Methods, J .K. Setlow, Ed. , Plenum Press, NY; comercialmente disponibles por Qiagen (Santa Clarita, CA)). La proteína de enlace de maltosa codificada por el gen malE de E. coli, proporciona otra etiqueta adecuada para utilizarse en la purificación de sialiltransferasa de la presente invención; los vectores de expresión para expresar polipéptidos que incluyen esta etiqueta, así como resinas de amilosa adecuadas por su purificación, están disponibles en el mercado (por ejemplo, pMAL, New England Biolabs). Un sistema adecuado para obtener proteínas recombinantes de E. coli, el cual mantiene la integridad de su término-N , lo ha descrito Miller y asociados, Biotechnology, 7, páginas 698 a 704 (1989). En este sistema, el gen de interés es producido como una función de terminal-C para los primeros 76 residuos del gen ubiquitín de levadura que contiene un sitio de división de peptidasa. La división en la unión de dos porciones, da como resultado la producción de una proteína que tiene un residuo de terminal-N auténtico intacto. Expresión de Sialiltransferasas de la Presente Invención Las sialiltransferasas de la presente invención , pueden ser expresadas en una variedad de células huésped, incluyendo E. coli, otros huéspedes bacterianos, levaduras y varias células eucarióticas superiores, tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y las líneas celulares de mieloma. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen, pero no se limitan a, Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsielia, Proteus, Salmonella, Serrantia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus. El gen de proteína recombinante, estará enlazado en forma operable a las secuencias de control de expresión adecuada para cada huésped. Para E. coli, esto incluye un promotor tal como promotores T7, trp o lambda, un sitio de enlace de ribosoma y preferentemente una señal de terminación de transcripción. Para las células eucarióticas, las secuencias de control incluirá un promotor y preferentemente un aumentador derivado de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovírus, etc. , y una secuencia de poliadenilación, y puede incluir secuencias donantes de empalme y aceptoras. Los vectores de expresión de la presente invención, pueden ser transferidos en la célula huésped elegida a través de métodos bien conocidos tales como, transformación de cloruro de calcio para E. coli y tratamiento de fosfato de calcio o electroporación para células de mamífero. Las células transformadas por los plasmas, pueden ser seleccionadas mediante resistencia a antibióticos conferidos por genes contenidos en los plásmidas, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg. Una vez expresados, los polipéptidos de sialiltransferasa recombinante pueden ser purificados de acuerdo con procedimientos estándar del arte, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electrofóresis de gel y similares (ver, de manera general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods ¡n Enzimology, Vol. 182; Guide to Protein Purification. , Academic Press, Inc. N .Y. (1990)). Las composiciones substancialmente puras de por lo menos aproximadamente del 90 al 95% de homogeneidad son las preferidas, y las más preferidas son del 98 al 99% o más de homogeneidad. Una vez purificados, de manera parcial o hasta una homogeneidad según se desee, posteriormente los polipéptidos pueden ser utilizados (por ejemplo, como inmunogenes para producción de anticuerpos). Usos de Sialiltransferasas La presente invención proporciona métodos para utilizar sialiltransferasas producidas utilizando los métodos descritos en la presente invención , para prepara oligosacaridas deseadas (las cuales están compuestas de dos o más sacaridas). Las reacciones de sialiltransferasa de la presente invención, tienen lugar en un medio de reacción que tiene por lo menos una sialiltransferasa, un substrato donante, un azúcar aceptor y normalmente un catión de metal divalente soluble. El método, depende de una sialiltransferasa para catalizar la adición de un residuo de ácido siálico a una sacarida de substrato. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos para agregar ácido siálico en un enlace a2,3 a un residuo de galactosa, contactando una mezcla de reacción que tiene un ácido siálico activado (por ejemplo, CMP-NeuAc, CMP-NeuGc, y similares) con una porción aceptora que comprende un residuo Gal en la presencia de una sialiltransferasa que ha sido preparada de acuerdo a los métodos descritos en la presente invención. Las sialiltransferasas derivadas de C. jejuni de la presente invención, tienen la capacidad de agregar un residuo de ácido siálico en un enlace a a2,3 a aceptores de sacárida que contienen un residuo Gal terminal. Los ejemplos de aceptores adecuados incluyen un Gal terminal que está enlazado a GIcNAc o Gle mediante un enlace ß1 ,4, y un Gal terminal que es ß1 ,3 enlazado a cualquier GIcNAc o GalNAc. El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de la familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia de ácido siálico es ácido N-acetil-neu ram ínico (ácido 2-queto-5-acetamindo-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1 -ónico (a menudo abreviado como NeudAc, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es ácido N-glicolil-neuramínico (NeudGc, NeuGc), en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc es hidroxilado. Un tercer miembro de la familia de ácido siálico es ácido 2-queto-3-deoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano y asociados (1986) J. Biol. Chem. , 261 , páginas 1 1550 a 1 1557; Kanamori y asociados (1990) J. Biol. Chem. , 265, páginas 2181 1 a 21819. También están incluidos los ácidos siálicos 9-substituidos, tales como 9-0-C .-C6-acil-Neu5Ac similar a 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-0-acetil-NeudAc, 9-deoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-deoxi-Neu5Ac. Para la revisión de la familia de ácido siálico, ver, por ejemplo, Varki (1992) Glicobiología, 2, páginas 25 a 40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nueva York ( 1992). La síntesis y uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación, se describe en la solicitud internacional WO92/16640, publicada el 1 o de Octubre de 1992. La sialiltransferasa preparada tal y como se describe en la presente invención, se puede utilizar en combinación con glicosiltransferasas adicionales. Por ejemplo, se puede utilizar una combinación de sialiltransferasa y galactosiltransferasas. Se conocen una cantidad de métodos para utilizar glicosiltransferasas para sintetizar estructuras de oligosacarida deseadas. Por ejemplo, se describen métodos de ejemplo en WO 96/32491 , Ito y asociados (1993) Puré Appl. Chem. , 65, página 753, y en las Patentes Norteamericanas No. 5,352,670, 5,374,541 y 5,545,553. En este grupo de modalidades, las enzimas y substratos pueden ser combinados en una mezcla de reacción inicial, o preferentemente, las enzimas y reactivos para un segundo ciclo de glicosiltransferasa pueden ser agregadas al medio de reacción una vez que el primer ciclo de glicosiltransferasa se ha acercado a su término. Conduciendo dos ciclos de glicosiltransferasa en secuencia en un recipiente simple, los rendimientos generales se mejoran con respecto a procedimientos en los cuales se aisla una especie intermedia. Además, se reduce la limpieza y deshecho de solventes y sub-productos extras. Los productos producidos a través de los métodos anteriores, pueden utilizarse sin purificación. Sin embargo, a veces se prefiere recuperar los productos. Las técnicas estándar, bien conocidas para la recuperación de sacaridas glicosiladas, tales como cromatografía de capa delgada o gruesa, o cromatografía de intercambio de ion. Es preferible utilizar filtración de membrana, más preferentemente utilizar una membrana osmótica inversa, o una o más técnicas de cromatografía de columna para la recuperación. Por ejemplo, la filtración de membrana en donde las membranas tienen cortes de peso molecular de aproximadamente desde 3000 hasta aproximadamente 10,000, pueden utilizarse para remover proteínas. También se puede utilizar la nanofiltración u osmosis inversa. El ejemplo siguiente se ofrece a manera de ilustración, pero no para limitar la presente invención.

EJEMPLO Este ejemplo describe la clonación y caracterización de un gen que codifica la sialiltransferasa a2,3 C. jejuni de la presente invención, así como la caracterización de la sialiltransferasa. La sialiltransferasa está involucrada en la adición de ácido siálico a la lipopolisacarida de Campylobacter jejuni OH4384. La clonación se alcanzó mediante el uso de un procedimiento de selección altamente sensible, basado en la expresión de la actividad de la enzima. Se obtuvieron dos clones de codificación de la actividad de sialiltransferasa, uno que codifica un polipéptido de 430 aminoácidos, y un segundo que codifica únicamente los residuos de los primeros 328 aminoácidos del mismo polipéptido. La a-2,3- sialiltransferasa truncada fue activa, ya que podríamos detectar la actividad cuando fue expresada en Escherichia coli. La actividad de la enzima, se encontró en la fracción de la membrana de los extractos celulares en C. jejuni, así como en el E. coli recombinante. La forma truncada de la proteína, fue más soluble que en la proteína de longitud completa. Con el objeto de facilitar la purificación de la enzima para caracterización, construimos y purificamos una forma soluble de la proteína de longitud completa mediante la fusión para la proteína de enlace de maltosa E. coli (MPB). Estudiamos la especificidad aceptora con la fusión de MBP purificada, utilizando varias oligosacaridas marcadas por cromoforo y fluoroforo. La a-2,3-sialiltransferasa C. jejuni utilizó aceptores Gal terminal que fueron ß1 ?4 enlazado a cualquier Gle o a GIcNAc. La enzima también utiliza un Gal aceptor terminal que es ß1 - 3 enlazado a cualquier GIcNAc o GalNAc. Las estructuras con los aceptores Gal, tanto ß1 ?4 y ß1 -»3 enlazados, se encontraron en el núcleo exterior de C. jejuni OH4384 LPS. La a-2,3-sialiltransferasa recombinante, se utilizó para sintetizar 1 mg de un derivado de sialillactosa, el cual fue analizado mediante NMR para confirmar la posición y configuración del enlace, entre el ácido siálico y los residuos de galactosa.

Métodos Métodos básicos de ADN recombinante El aislamiento de ADN genómico de C. jejuni OH4384, se llevó a cabo tal y como se describió anteriormente (Gilbert y asociados (1996) J. Biol . Chem. , 271 , páginas 28271 a 28276). El aislamiento de ADN de plásmida, las digestiones de enzima de restricción, la purificación de fragmentos de ADN para clonación, las ligaciones y transformaciones, se llevaron a cabo tal como se recomienda por parte del abastecedor de la enzima, o el fabricante del equipo utilizado para el procedimiento en particular. Se realizó PCR con polimerasa de ADN de AmpliTaq ™ (Perkin Elmer, Branchburg NJ) o polimerasa de ADM Pwo (Boehringer Mannheim, Montreal, QB), tal como se describe por parte de los fabricantes. Las enzimas de restricción y de modificación de ADN, fueron comprados en New England Biolabs Ltd. (Mississauga, ON). La secuenciación de ADN se llevó a cabo utilizando un secuenciador de ADN automático modelo 370A (Applied Bioystems) (Montreal, QB), y el equipo de secuenciación de ciclo del fabricante. Clonación y secuenciación de a-2,3-sialiltransf erasa de C. jejuni Se preparó una biblioteca genómica utilizando una digestión Hindl l l parcial del ADN cromosomal de C. jejuni OH4384. La digestión parcial fue purificada en una columna rápida QIA (QIAGEN Inc. , Chatsworth, CA) y ligada con pBluescript SK- digerida por Hind l l l. La mezcla de ligación, se utilizó para electroporar células DH5a Escherichia coli, las cuales fueron plaqueadas en un medio LB con 150 µg/mL de ampicilina, 0.05 mM I PTG y 100 µg/mL de X-Gal (5-bromo-4-cloro-indolil-ß-D-galactopiranosida). Se recogieron colonias blancas en grupos de 100, y fueron resuspendidas en 1 mL de medio con 15% de glicerol. Veinte µL de cada grupo se utilizaron para inocular 1 .5 mL de medio LB suplementado con 150 µg/mL de ampicilina. Después de 2 horas de crecimiento a una temperatura de 37°C, se agregó IPTG a 1 mM y los cultivos fueron desarrollados durante otras 4 horas 30 minutos. Las células fueron recuperadas mediante centrifugación, resuspendidas en 0.5 mL de 50 mM MOPS (pH 7, 10 mM MgCL2) y sonicadas durante 1 minuto (energía mínima, ciclo al 50%). Los extractos fueron ensayados para actividades sialiltransferasa tal como se describirá más adelante, excepto que el tiempo de incubación y la temperatura fue de 18 horas y 32°C. Los grupos positivos fueron plaqueados, y se recogieron 200 colonias y se probó su actividad en grupos de 10. Finalmente, las colonias de grupos positivos fueron probados de manera individual. Esto condujo al aislamiento de dos clones positivos, pCJH9 (inserto 5.3 kb) y pCJH 101 (inserto 3.9 kb). Utilizando varios fragmentos sub-clonados y primarios realizados en forma acostumbrada, los insertos de dos clones fueron completamente secuenciados en ambos cabos. Los clones con fragmentos Hindl l l individuales también fueron probados para actividad de sialiltransferasa y el inserto del único positivo (un fragmento Hind 111 de 1 .1 kb clonado en pBluescript SK-) fue transferido a pUC1 18 utilizando sitios Kpnl y Pstl , con el objeto de obtener el inserto en la orientación opuesta, con respecto al promotor plac. Ensayos La concentración de proteína se determinó utilizando el equipo de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL). Para todos los ensayos enzimáticos, se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima que generó una µmol de producto por minuto. Se prepararon oligosacaridas marcadas como FCHASE, tal como lo describe Gilbert y asociados (1997) Eur. J. Biochem. , 249, páginas 187 a 194, se obtuvieron p-Nitrofenol-glicosidas (p-NP-glicosidas) de Sigma-Aldrich. La actividad a-2,3-sialiltransferasa, fue ensayada a una temperatura de 37°C utilizando 1 mM Lac-FCHASE (éster succimidilo de ácido 6-(5-fluorescein-carboxamido)-hexanóico), 0.2 mM CMP-NeudAc, 50 mM MOPS pH 7, 10 mM MnCI2 y 10 mM MgCI2, en un volumen final de 10 µL. Después de 5 minutos las mezclas de reacción con aceptores fluorogénicos fueron diluidas con 10 mM NaOH, y analizadas mediante electrofóresis capilar realizada utilizando las condiciones de separación descritas anteriormente (Gilbert y asociados (1997) supra.). Los análisis cinéticos de aceptores, se llevaron a cabo a una temperatura de 37°C, con p-NP-glicosidas en concentraciones de 0.1 a 10 mM , con CMP-Neu5Ac a 1 mM. Los análisis cinéticos de CMP-NeudAc donante, se llevó a cabo a una concentración de 20 una µM a 1000 una µM, con p-NP-lactosa a 5 mM . Se tuvo cuidado de asegurar que el nivel de conversión aceptora estuviera entre desde 5 hasta 10% para ensayos cinéticos aceptores.

Para cinéticas donantes, la cantidad de conversión de CMP-NeudAc se calculó a partir de la cantidad de producto formada comparada con un estándar interno de 10 µM p-NP-glucosa agregada después de la reacción. Este pico estuvo bien resuelto a partir de los picos aceptores y de producto. Las reacciones con p-NP-glicosidas se detuvieron mediante la adición de un volumen igual de 2% SDS, 20 mM EDTA y calentadas a una temperatura de 75°C durante 3 minutos y posteriormente diluidas a 1 : 1 (o de manera máxima 1 : 10 para concentraciones de 10 mM) con agua. Posteriormente las muestras fueron analizadas mediante CE utilizando un escaneo detector de formación de diodos de entre 260 y 300 nm, se analizaron los picos de los electroferogramas, utilizando una integración de pico manual con el software P/ACE Estación ™ . Para una rápida detección de la actividad de la enzima, las muestras de las mezclas de reacción de transferasa fueron examinadas, mediante cromatografía de capa delgada sobre placas TLC de sílice-60 (E. Merck), tal como lo describe Gilbert y asociados (1996) supra. Determinación de la especificidad de enlace de la sialiltransferasa La reacción de sialiltransferasa de preparación, se realizó utilizando un extracto de E. Coli BMH/pCJH9G y 1 mg de Lac-FCHASE como el aceptor. Las condiciones de reacción fueron tal como se describió anteriormente (Gilbert y asociados ( 1997) Eur. J . Biochem. , supra.). La muestra para NMR fue secada por congelación y disuelta en D20 tres veces antes de la recolección del espectro. La recolección de datos NMR, se realizó con un espectómetro Bruker AMX 600. Los espectros fueron registrados a 340 K en tubos de 5 mm a una concentración de un mg de Lac-FCHASE sialilada en 0.6 mL de D20. Todos los experimentos NMR y análisis espectrales, se realizaron tal como se describió anteriormente (Pavliak y asociados (1993) J. Biol. Chem. , 268, páginas 14146 a 14152). Construcción y purificación de fusiones de proteína de enlace de maltosa de cst-l El gen malE (GenBank #AE000476) sin su péptido de señal, se obtuvo mediante amplificación PCR a partir de ADN genómico de E. Coli BMH , utilizando primarios que agregaron un sitio de restricción BamH I en el extremo 5' y un sitio Ndel en el extremo 3'. Estos dos sitios de restricción permitieron que el gen fuera insertado en el vector de restricción pCW (Wakarchuk y asociados (1994) Protein Sci. , 3, páginas 467 a 475), inmediatamente enfrente del gen cst-l con el enlazador Gly-Gly-Gly-His entre los dos campos. Las proteínas de fusión fueron purificadas en resina de amilosa disponible en el mercado (New England Biolabs), utilizando un protocolo sugerido por el fabricante. La maltosa fue removida mediante diálisis de la proteína eluida contra 50mM HEPES-NaOH pH 7.5.

RESULTADOS Clonación y secuenciación de a-2,3-sialiltransferasa de C. jejuni La biblioteca de plásmida que se elaboró utilizando una digestión Hind 111 parcial no fraccionada de ADN cromosómico de C. jejuni OH4384 produjo 2,600 colonias blancas las cuales fueron recogidas en grupos de 100. Dos grupos con actividad de sialiltransferasa se obtuvieron cuando se seleccionaron cultivos inducidos por extractos de IPTG, para la actividad de enzima utilizando Lac-FCHASE como el aceptor y la separación TLC para la detección del producto. Utilizamos el mismo protocolo para grupos de selección de 10, y posteriormente clones individuales hasta que obtuvimos dos clones positivos, los cuales fueron designados pCJH9 (inserto 5.3 kb) y pCJH 101 (inserto 3.9 kb). Estos dos clones fueron completamente secuenciados en ambos cabos, utilizando una combinación de primarios de sub-clonación y elaborados en forma acostumbrada. La secuencia nucleótida indicó que pCJH9 contiene tres sitios Hindl l l internos, mientras que pCJH 101 contiene cuatro sitios Hindl l l internos. El análisis de estructura de lectura abierta (ORF) y las reacciones PCR con ADN cromosómico C. jejuni OH4384, indicaron que las secuencias nucleótidas de cualquier parte del sitio Hind 111 en el nucleótido #1440 en pCJH9 no fue contigua en el ADN cromosómico. La corriente descendente de la secuencia del nucleótido #1440 en pCJH9 no se estudió adicionalmente, aunque los primeros 1439 nucleótidos se encontraron completamente comprendidos dentro de la secuencia de pCJ H 101 (Figura 1 ). El análisis ORF y las reacciones PCR con ADN cromosómico, indicaron que todos los fragmentos pCJH 101 Hindl l l fueron contiguos en ADN cromosómico C. jejuni OH4384. Se encontraron cuatro ORFs, dos parciales y dos completas, en la secuencia nucleótida de pCJH 101 (Figura 1 ), los primeros 812 nucleótidos codificaron un polipéptido que es 69% idéntico con los últimos 260 residuos de aminoácido del factor de liberación de cadena de péptido RF-2 (gen prfB, GenBank #AE000537) de Helicobacter pylori. La última base del codón de detención TAA del factor de liberación en cadena, también es la primera base del codón de partida ATG de una estructura de lectura abierta que abarca los nucleótidos del #812 al #2104 en pCJH 101 . Este ORF se designó como cst-l (Campylobacter sialyltransferase I ) y codifica un polipéptido de 430 aminoácidos (Figura 2), que tiene alguna similitud a un ORF putativo procedente de Haemophilus influenzae (GeneBank #U32720, Figura 3). El ORF H . influenzae putativo, codifica un polipéptido de 231 aminoácidos que es 39% idéntico a la región media del polipéptido Cst-l (residuos de aminoácido del #80 al #330). La corriente descendente de la secuencia nucleótida de cst-l , incluye un ORF y un ORF parcial que codifican polipéptidos que son similares (>60% idénticos) a las dos sub-unidades de adeniltransferasa de sulfato E. Coli (GenBank #AE000358). Con el objeto de confirmar que el ORF cst-l (nt #812-2104) codifica la actividad de sialiltransferasa, sub-clonamos el fragmento Hindl l l de 1 .1 kb, que abarca del nt#727 al 1791 en pUC1 1 18. Esta construcción (pCJH9G) incluye por lo menos 83 nucleótidos del gen prfB y los primeros 979 nucleótidos del gen cst-l , y por lo tanto codifica una forma truncada de la proteína Cst-l (328 aminoácidos). Se detectó actividad en cultivos inducidos por IPTG de E. Coli, únicamente cuando el gen cst-l truncado estuvo en la misma orientación que el promotor plac del vector. Esta construcción se utilizó para expresar la enzima que se utilizó en la determinación de la especificidad de enlace, y el estudio del substrato de la sialiltransferasa. Determinación de la especificidad de enlace de la sialiltransferasa El producto de una reacción de preparación utilizando Lac-FCHASE como aceptor, se examinó mediante NMR con el objeto de determinar la especificidad de enlace de la sialiltransferasa codificada mediante cst-l . La asignación completa de los espectros NMR del producto sialitado se logró mediante experimentos de correlación de cambio químico 1 H-1 H y 1 H-13C (Tabla 1 ). Los datos del cambio químico, son consistentes con la estructura propuesta (Gilbert y asociados (1996) supra.), el campo descendente cambió los valores para las resonancias Gal-ß C-3 y H-3, comparadas con los análogos no substituidos, lo que es un indicativo del enlace Neu5Ac-a-(2?3)-Gal-.

Tabla 1 : cambios químicos 1 H y 13C N MR para la porción de oligosacarida de Neu5Ac-a-(2?3)-Gal-ß-(1 ?4)-Glc-FCHASE preparado utilizando la a-2,3>-sialiltransferasa recombinante procedente de Campylobacter jejuni OH4384.

Azúcar Posición ¡ C Gle 1 5.01 101.3 2 3.58 73.7 3 3.74 7d.3 4 3.74 79.1 5 3.70 76.1 6 3.81 60.8 6' 3.96 Gal 1 4.5d 103.8 2 3.60 70.4 3 4.1d 76.d 0 4 3.98 68.d d 3.72 76.1 6 3.76 62.0 6' 3.76 NeudAc »Jax 1.81 40.6 «->eq 2.77 4 3.70 69.4 d 3.86 d2.d 6 3.6d 73.9 5 7 3.69 69.2 8 3.90 72.8 9 3.87 63.d 9' 3.64 Nac 2.04 22.8 En la Tabla 1 , los cambios químicos de primer orden, medidos 0 a una temperatura de 37°C en D20, son referenciados para la resonancia de metilo de acetona (2.22d ppm para 1 H y 31 .07 ppm para 13C). Para cada residuo de azúcar se registran los datos 1 H en la columna de la izquierda y los datos 13C en la columna de la derecha. Dentro del error experimental, los datos del cambio d químico para la porción de amida de ácido aminofenil-(6-5- (fluorescein-carboxamido)-hexanóico), son los mismos que los reportados anteriormente (Gilbert y asociados ( 1996) J. Biol. Chem. , 271 , páginas 28271 a 28276). Expresión de las proteínas recombinantes 5 Se examinó cada clon para las cinéticas de inducción óptima de experimentos en frascos de agitación de 200 mL (Tabla 2). Los experimentos se llevaron a cabo, tomando pequeñas porciones después de la inducción de expresión con IPTG, y midiendo la actividad de sialiltransferasa utilizando Lac-FCHASE como el aceptor 0 y CMP-NeudAc como el donante. Las muestras también fueron analizadas mediante SDS-PAGE. Los clones originales CST-01 y CST-03 produjeron actividad de sialiltransferasa inducible. Para incrementar los niveles de expresión de la sialiltransferasa y para reducir la cantidad de actividad de enzima asociada con la fracción d de la membrana, elaboramos y probamos las fusiones del gen de proteína de enlace de maltosa con el gen cst-l truncado y de longitud completa. Estas proteínas de fusión, exhibieron cantidades significativas de actividad de sialiltransferasa. La actividad observada fue menor a lo se había anticipado en base al nivel de 0 proteína observado mediante manchado azul coomassie, lo cual puede indicar que la actividad de sialiltransferasa adicional, puede obtenerse, sometiendo las preparaciones a procedimientos para resolubilización de anticuerpos ya agregados de inclusión.

Tabla 2: Datos de expresión procedentes de varias construcciones de a-2,3-sialiltransferasa C. jejuni.

Designación Longitud de Nivel de expresión Actividad específica de gen la prateína (U/L) en tiempo de de extractos crudos (peso aa y mol.) inducción máxima (mU/ g) CST-01 328 + (His). 1.8 (6 h) ~6 m/v 39,289 CST-03 430 + (His)6 2.9 (-16 h) 8 ?tw51,219 CST-05 703 + (His)6 21.7 (4 h) 53 0 (CST-01 + MalE) mw 80,418 puro = 160 CST-06 805 + (His)6 31.5 (CVN + 4 h) 41 (CST-03 + MalE) ?t 92,348 puro = 56 Los cultivos en frascos de agitación fueron desarrollados en la presencia de I PTG y la inducción máxima de la enzima se determinó, d ensayando extractos a pequeña escala para la actividad de sialiltransferasa. Estudio de aceptores de oligosacarida para la a-2,3- sialiltransferasa, y comparación con otra a-2,3-sialiltransferasa bacteriana 0 La especificidad aceptora de a-2,3-sialiltransferasa C. jejuni, se examinó con un panel de p-NP-glicosidas que tiene enlaces tanto ß1 ?4 como ß1 ?3. Los datos cinéticos para todos los aceptores, fueron recolectados utilizando la proteína de fusión-MBP de sialiltransferasa de longitud completa. Los datos para la d especificidad aceptora fueron recolectados, primero, ensayando la enzima en una concentración de aceptor de 2.0 mM . El aceptor con la actividad más baja, proporcionó el valor de 1 durante la comparación de la actividad. Estas condiciones de reacción, se utilizaron en una comparación (Tabla 3) de la enzima C. jejuni, con la proteína Lst procedente de N. meningitidis (Gilbert y asociados (1996) J. Biol. Chem. , 271 , páginas 28271 a 28276). La proteína Lst N. meníngitidis, también fue una fusión de proteína MBP la cual es soluble y purificada mediante cromatografía de afinidad.

Tabla 3: Comparación de actividad enzimática de malE-cst y malE-Ist en p-nitrofenil-glicosidas.

ND, no determinado Conclusiones Para clonar la a-2,3-sialiltransferasa de C. jejuni OH4384, este experimento empleó una estrategia de selección de actividad, que se utilizó previamente para clonar la a-2,3-sialiltransferasa de Neisseria meningitidis (Gilbert y asociados (1996) supra.). Sin d embargo, en este caso, se construyó una biblioteca de plásmida, utilizando fragmentos Hind 111 no fraccionados procedentes de una digestión de ADN cromosomática. Este procedimiento, simplificó de manera conveniente la construcción de la biblioteca, pero llevó el riesgo de clonar un gen incompleto, si un sitio Hindl l l estuvo 0 presente en forma interna. Debido a que el tamaño del genoma de C. jejuni es relativamente pequeño, aproximadamente 1 .7 MB (Taylor (1992) Ann. Rev. Microbiol. , 46, páginas 3d a 64), se requiere de un número relativamente pequeño de clones para proporcionar una biblioteca representativa. d La selección de actividad produjo dos clones, los cuales codificaron la actividad de sialiltransferasa (Figura 1 ). El análisis » ORF sugirió que un polipéptido de 430 aminoácidos es responsable de la actividad de sialiltransferasa, mientras que la sub-clonación de un fragmento Hindl l l 1 .1 , indicó que una forma truncada (328 0 aminoácidos) retuvo la actividad enzimática. Aunque los 104 aminoácidos en el término-C, son prescindibles para la actividad enzimática in vitro, deben interactuar con otros componentes celulares in vivo, ya sea para propósitos de regulación o para la localización de la célula adecuada.

La especificidad de la enzima Cst-l que medimos con p-NP- glicosidas, fue consistente con los tipos de aceptores que se encontraron en el LOS de C. jejuni OH4384. La actividad de la galactosa, tanto ß1 ?3 como ß1 — >4 enlazada, fue casi idéntica (Tabla d 3), lo cual sugiere que esta enzima puede ser responsable de los enlaces de tipo, tanto sialil-lactosa como el GM 1 en el LOS. La especificidad de aceptor de esta enzima, fue comparada con la a- 2,3-sialiltransferasa de N . meningitidis, la cual ha sido caracterizada extensamente (Gilbert y asociados ( 1996) supra. , Gilbert y asociados 0 (1997) Eur. J. Biochem. , 249, páginas 187 a 194). La comparación confirma nuestra observación anterior de que la enzima de N. meningitidis, tiene una marcada preferencia para los enlaces ß1 - 4, y que la actividad de esta enzima en galactosa a-enlazada fue única, ya que la enzima Cst-l no mostró actividad detectable sobre este d aceptor. La carencia de homología de secuencia primaria entre estas enzimas, sugiere que las estructuras se han desarrollado para reconocer específicamente los aceptores presentes dentro de su género respectivo. Una investigación BLASTX en GenBank con la secuencia cst-l 0 reveló alguna similitud con un ORF de Haemophilus influenzae putativo (GeneBank #U32720) sin función definida. La alineación en pares entre las secuencias de aminoácido inducidas, indicó el 39% de identidad sobre la ventana de alineación. Los residuos de los primeros 80 aminoácidos y los últimos 100 aminoácidos de a-2,3-d sialiltransferasa cst-l , están ausentes en el homólogo H . influenzae, pero el resto de las dos secuencias se señaló sin tener que introducir cualquier brecha importante. La función del ORF H. influenzae es conocida, basándose en su similitud con la secuencia cst-l , el ORF H . influenzae podría codificar una sialiltransferasa, posiblemente con una especificidad diferente u otro tipo de glicosiltransferasa que reconoce un aceptor similar. La a-2,3-sialiltransferasa codificada por cst-l , demostró tener una especificidad de aceptor diferente de a-2,3-sialiltransferasa 1 st N . meningitidis, por su capacidad casi igual para substratos de sialilato con un Gal terminal, el cual es ß-(1 ?4)-enlazado para cualquier Gle o GIcNAc, y también substratos con un Gal terminal que es ß-(1 ?3)- enlazado a cualquier GIcNAc o GalNAc. Esta amplia especificidad de aceptor, demuestra su utilidad y lo hace una herramienta atractiva para la síntesis quimio-enzimática de oligosacaridas sialilatadas. Queda entendido que los ejemplos y modalidades descritos en la presente invención, son únicamente con propósitos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios, a la luz de las mismas, serán sugeridas para los expertos en el arte, y están incluidas dentro del espíritu y alcance de la presente solicitud y alcance de las Reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente invención, están incorporadas a la misma como referencia para todos los propósitos.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Gilbert, Michel Wakarchuk, Warren W. d <120> LIPOPOLISACARIDA ALFA-2.3-SIALILTRANSFERASA DE CAMPYLOBACTER JEJUNI Y SUS USOS <130> 014137-013210us <140> aun no asignada <141> 1999-03-18 0 <150> 60/078,891 <151> 1998-03-20 <160> 4 <170> Patente en Ver. 2.0 <210> 1 d <211> 1293 <212> ADN <213> Campylobacter jejuni <400> 1 atgacaagga ctagaatgga aaatgaactc attgttagta aaaatatgca aaatataatc 60 0 atagcaggaa atggacctag cctaaaaaat attaattata aaagactgcc tagagaatat 120 gatgttttta ggtgtaacca gttttatttt gaagataagt attatttagg aaaaaagatt 180 aaagcagtat tttttaatcc tggtgtcttt ttacaacagt atcacactgc aaaacaactt 240 atactaaaaa atgagtatga aataaaaaat attttttgct ctacatttaa tttacctttt 300 attgaaagca atgatttttt acatcaattt tataattttt tccccgatgc aaaacttggc 360 6 tatgaagtta ttgaaaacct taaagaattt tatgcttata taaaatacaa tgaaatttat 420 ttcaataaaa gaattacttc gggcgtctat atgtgtgcaa ttgctattgc attaggatat 480 aaaaccatct atttatgtgg cattgatttt tatgaaggag atgttattta tccttttgaa 540 gctatgagta caaatataaa aacaatcttt cctggaataa aagatttcaa accttcaaat 600 tgtcattcta aggaatacga tatagaagca ttaaaattgt taaaatcaat atacaaagtt 660 aatatctacg cattgtgtga tgattctatt ttggcaaatc attttccttt atcaattaat 720 attaataaca atttcacttt agaaaataag cataataatc ctataaatga tattttattg 780 d actgataata ctcctggcgt aagtttttat aaaaatcaac ttaaagctga taataaaatt 840 atgcttaatt tttataatat tcttcattct aaagataatt taattaaatt tttaaacaaa 900 gaaattgcgg tattaaaaaa acaaaccact caacgagcta aagcaagaat ccaaaaccat 960 ctatcctata aactaggaca agctttgatt ataaattcta aaagtgtatt aggtttttta 1020 tctttacctt ttataatatt aagtatcgtt atttcacata aacaagaaca aaaggcttat 1080 0 aaatttaaag taaagaaaaa tccaaattta gctttacctc ctttagaaac ttatcctgat 1140 tataatgaag ctttaaaaga aaaagaatgt tttacttata aattaggaga agaatttata 1200 aaagctggta agaattggta tggggagggg tatatcaaat ttatattcaa agatgttcct 1260 aggttgaaga gagagtttga gaaaggggaa taa 1293 d <210> 2 <211> 430 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni <400> 2 0 Met Thr Arg Thr Arg Met Glu Asn Glu Leu lie Val Ser Lys Asn Met 1 5 10 15 Gln Asn lie lie lie Ala Gly Asn Gly Pro Ser Leu Lys Asn lie Asn 20 25 30 Tyr Lys Arg Leu Pro Arg Glu Tyr Asp Val Phe Arg Cys Asn Gln Phe 5 35 40 45 Tyr Phe Glu Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Lys Lys He Lys Ala Val Phe Phe Asn Pro Gly Val Phe Leu Gln Gln Tyr His Thr Ala Lys Gln Leu 65 70 75 80 He Leu Lys Asn Glu Tyr Glu He Lys Asn He Phe Cys Ser Thr Phe 85 90 95 Asn Leu Pro Phe He Glu Ser Asn Asp Phe Leu His Gin Phe Tyr Asn 100 105 110 Phe Phe Pro Asp Ala Lys Leu Gly Tyr Glu Val He Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Glu Phe Tyr Ala Tyr He Lys Tyr Asn Glu He Tyr Phe Asn Lys Arg 130 135 140 He Thr Ser Gly Val Tyr Met Cys Ala He Ala lie Ala Leu Gly Tyr 145 150 155 160 Lys Thr He Tyr Leu Cys Gly He Asp Phe Tyr Glu Gly Asp Val He 165 170 175 Tyr Pro Phe Glu Ala Met Ser Thr Asn He Lys Thr He Phe Pro Gly 180 185 190 He Lys Asp Phe Lys Pro Ser Asn Cys His Ser Lys Glu Tyr Asp He 195 200 205 Glu Ala Leu Lys Leu Leu Lys Ser lie Tyr Lys Val Asn He Tyr Ala 210 215 220 Leu Cys Asp Asp Ser He Leu Ala Asn His Phe Pro Leu Ser He Asn 225 230 235 240 He Asn Asn Asn Phe Thr Leu Glu Asn Lys His Asn Asn Ser He Asn 245 250 255 Asp He Leu Leu Thr Asp Asn Thr Pro Gly Val Ser Phe Tyr Lys Asn 260 265 270 Gln Leu Lys Ala Asp Asn Lys He Met Leu Asn Phe Tyr Asn He Leu 275 280 285 His Ser Lys Asp Asn Leu He Lys Phe Leu Asn Lys Glu He Ala Val 290 295 300 Leu Lys Lys Gln Thr Thr Gln Arg Ala Lys Ala Arg He Gln Asn His 305 310 315 320 Leu Ser Tyr Lys Leu Gly Gln Ala Leu He He Asn Ser Lys Ser Val 325 330 335 Leu Gly Phe Leu Ser Leu Pro Phe He He Leu Ser He Val He Ser 340 345 350 His Lys Gln Glu Gln Lys Ala Tyr Lys Phe Lys Val Lys Lys Asn Pro 355 360 365 Asn Leu Ala Leu Pro Pro Leu Glu Thr Tyr Pro Asp Tyr Asn Glu Ala 370 375 380 Leu Lys Glu Lys Glu Cys Phe Thr Tyr Lys Leu Gly Glu Glu Phe He 385 390 395 400 Lys Ala Gly Lys Asn Trp Tyr Gly Glu Gly Tyr He Lys Phe lie Phe 405 410 415 Lys Asp Val Pro Arg Leu Lys Arg Glu Phe Glu Lys Gly Glu 420 425 430 <210> 3 <211 > 41 <212 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 > Desc ripciói p de Secuencia Artificia I: Primario <400> 3 cttaggaggt catatgacaa ggactagaat ggaaaatgaa c 41 <210> 4 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Primario <400> 4 cctaggtcga ctcattagtg gtgatggtgg tgatgttccc ctttctcaaa ctctctcctc 60

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES: 1 . Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia polinucleótida que codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa, que tiene una secuencia de aminoácido por lo menos aproximadamente 7d% idéntica a una secuencia de aminoácido que se establece en SEQ. ID. NO:2, sobre una región por lo menos aproximadamente de dO aminoácidos de longitud cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTP con una longitud mundial (W) de 3, y la matriz de resultado BLOSUM62.
2. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia polinucleótida codifica una a-2,3-sialiltransferasa que tiene una secuencia de aminoácido tal como se muestra en SEQ. ID. NO:2.
3. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia polinucleótida codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa que tiene por lo menos aproximadamente 328 aminoácidos.
4. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 3, caracterizado además porque la secuencia polinucleótida codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa que tiene aproximadamente 430 aminoácidos.
5 d. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia polinucleótida es por lo menos aproximadamente 7d% idéntica a una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ. ID. NO: 1 , sobre una región de por lo 0 menos aproximadamente de 120 nucleótidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTN con una longitud mundial (W) de 1 1 , M=d, y N = -4.
6. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 1 , d caracterizado además porque la secuencia polinucleótida hibrida a un ácido nucleico que tiene una secuencia como se muestra en SEQ. I D. NO: 1 , bajo condiciones estrictas.
7. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 1 , 0 caracterizado además porque la secuencia polinucleótida es como se muestra en SEQ. ID. NO: 1 .
8. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia polínucleótida está d derivada de especies Campylobacter.
9. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque la especie Campylobacter es C. jejuni. 5
10. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 9, caracterizado además porque C. jejuni es una deformación OH4384.
1 1 . El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 0 1 , caracterizado además porque la secuencia polinucleótida está enlazada en forma operable a una segunda secuencia polinucleótida que codifica un segundo polipéptido.
12. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación d 1 1 , caracterizado además porque el segundo polipéptido comprende una etiqueta adecuada para purificación de afinidad de una proteína de fusión producida mediante la expresión del ácido nucleico.
13. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 0 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente una secuencia promotora enlazada en forma operable a la secuencia polinucleótida.
14. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 13, caracterizado además porque el promotor está activo en células eucarióticas. 16.
El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 13, caracterizado además porque el promotor está activo en células procarióticas.
16. El ácido nucleico, tal y como se describe en la Reivindicación 15, caracterizado además porque el promotor está activo en E. coli.
17. Una molécula de ácido nucleico aislada, la cual codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ. ID. No. 2.
18. Una célula que comprende una cinta de expresión recombinante que contiene un promotor enlazado en forma operable a una secuencia polinucleótida, la cual codifica un polipéptido a2,3-sialiltransferasa, y la cual es por lo menos aproximadamente 7d% idéntica a una secuencia polinucleótida tal como se establece en SEQ. ID. NO: 1 , sobre una región de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTN con una longitud mundial (W) de 1 1 , M=d, y N = -4.
19. La célula, tal y como se describe en la Reivindicación 18, caracterizada además porque el polinucleótido hibridiza a un ácido nucleico que tiene una secuencia como se muestra en SEQ. ID. No. • 1 , bajo condiciones estrictas.
20. La célula, tal y como se describe en la Reivindicación 18, caracterizada además porque la célula es una célula procariótica.
21 . La célula, tal y como se describe en la Reivindicación 20, • 10 caracterizada además porque la célula es E. coli.
22. La célula, tal y como se describe en la Reivindicación 18, caracterizada además porque la célula es una célula eucariótica. 15
23. La célula, tal y como se describe en la Reivindicación 18, caracterizada además porque la secuencia polinucleótída es como se muestra en SEQ. ID. No. 1 .
24. Un polipéptido a2,3-sialiltransferasa, que tiene una secuencia 20 de aminoácido por lo menos aproximadamente 75% idéntica a una secuencia de aminoácido como se establece en SEQ. I D. NO:2, sobre una región de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, cuando se compara utilizando el algoritmo BLASTP con una longitud mundial (W) de 3, y la matriz de resultado BLOSUM62. 25
25. El polipéptido a2,3-sialiltransferasa, tal y como se describe en la Reivindicación 24, caracterizado además porque tiene por lo menos aproximadamente 328 aminoácidos. • 5
26. El polipéptido a2,3-sialiltransferasa, tal y como se describe en la Reivindicación 24, caracterizado además porque tiene aproximadamente 430 aminoácidos.
27. El polipéptido a2,3-sialiltransferasa, tal y como se describe en 10 la Reivindicación 24, caracterizado además porque tiene una secuencia como se muestra en SEQ. ID. NO:2.
28. Un método para agregar un residuo de ácido siálico a una molécula aceptora que comprende un residuo de galactosa terminal, 16 comprendiendo el método el contacto de la molécula aceptora con una molécula de ácido siálico activada y una a2,3-sialiltransferasa, que tiene una secuencia de aminoácido por lo menos aproximadamente 76% idéntica, sobre una región de por lo menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, cuando se compara 20 con la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ. I D. No. 2, utilizando el algoritmo BLASTP con una longitud mundial (W) de 3, y . la matriz de resultado BLOSUM62.
29. El método, tal y como se describe en la Reivindicación 28, 25 caracterizado además porque el residuo de galactosa terminal está enlazado a través de un enlace ß a un segundo residuo en la molécula aceptora.
30. El método, tal y como se describe en la Reivindicación 29, caracterizado además porque el enlace es un enlace ß 1 ,4.
31 . El método, tal y como se describe en la Reivindicación 30, caracterizado además porque el segundo residuo es un Gle o un GIcNAc.
32. El método, tal y como se describe en la Reivindicación 29, caracterizado además porque el enlace es un enlace ß1 ,3.
33. El método, tal y como se describe en la Reivindicación 32, caracterizado además porque el segundo residuo es un GIcNAc o un GalNAc.
34. El método, tal y como se describe en la Reivindicación 28, caracterizado además porque el ácido siálico activado es CMP-NeudAc.