MXPA00008892A - Deteccion de analitos mediante quelatos lantanidos fluorescentes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere:Se describe composiciones y métodos para determinar la presencia o concentración de un analito en una muestra mediante la exposición de la muestra a una molécula indicadora que comprende un complejo de quelato metálico lantánido fluorescente;la presencia o concentración del analito en la muestra se determina observando y/o midiendo los cambios en la intensidad de la fluorescencia emitida por el complejo de quelato metálico lantánido a la unión del analito a uno o más elementos de reconocimiento en el complejo;las moléculas indicadoras fluorescentes pueden usarse en diversos tipos de dispositivos de detección de fluorescencia y sonútiles en diversos campos, incluyendo energía, medicina y agricultura.

Description

DETECCIÓN DE ANALITOS MEDIANTE QUELATOS LANTANIDOS FLUORESCENTES INTERREFERENCIA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud No. de Serie 09/037,960, presentada el 1 1 de marzo de 1998.

DECLARACIÓN RESPECTO A INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE No aplicable.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a compuestos fluorescentes, útiles como moléculas indicadoras para detectar la presencia o concentración de un analito en un medio, tal como un líquido, y a métodos para lograr dicha detección. Más particularmente, la invención se refiere a complejos fluorescentes de quelato de metal lantánido que contienen ligandos, y a su uso como moléculas indicadoras para detectar la presencia o concentración de un analito tal como glucosa u otro compuesto cis-diol en un medio, incluyendo un medio líquido tal como un fluido biológico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ciertos quelatos de metales de tierras raras emiten luz visible por irradiación con luz UV y diferentes formas de luz visible (por ejemplo, luz violeta o azul), una emisión que es caracterizada por el catión quelatado. Algunos iones lantánidos, tales como los de europio (Eu3+), samario (Sm3+), terbio (Tb3+), y en un menor grado, disprosio (Dy3+) y neodimio (Nd3+), exhiben fluorescencia típica caracterizada por el ¡on, especialmente cuando están quelatados con ligandos orgánicos que median energía de excitación adecuada. Las propiedades fluorescentes de estos compuestos -cambio de Stokes grande, líneas estrechas de emisión de tipo banda y duraciones de fluorescencia inusualmente largas- los han hecho candidatos atractivos para inmunoensayos fluorescentes y técnicas fluorométricas de resolución de tiempo. Las principales líneas de emisión de estos quelatos fluorescentes de lantánido se forman de una transición denominada transición hipersensible y son de alrededor de 613-615 nm con Eu3+, 545 (y 490) nm con Tb3+, 590 y 643 nm con Sm3+, y 573 con Dy3+. Véase Hemmila, Application of Fluorescence in Immunoassavs, 140-42 (1991 ). Véase también Spectroscopy in Inorganic Chemistry, vol. 2 en 255-85 (Academic Press 1971 ). Típicamente, la radiación es absorbida por los quelatos a una longitud de onda característica del ligando orgánico y emitida como un espectro de línea característico del ion de metal, debido a una transferencia de energía intramolecular del ligando al ion metálico central. El ligando orgánico absorbe energía y es elevado o excitado de su estado singulete fundamental, So, a cualquiera de los multipletes vibracionales del primer estado singulete excitado, Si, en donde pierde rápidamente su exceso de energía vibracional. En este punto, hay dos posibilidades: relajamiento por medio de una transición S1-S0 (fluorescencia del ligando) o cruzamiento entre sistemas a uno de los estados triplete, T-i. Véase E.P. Diamandis y otros, Analytical Chemistry 62 (22), 1 149A (1990); véase también Spectroscopy in Inorganic Chemistrv. vol. 2 en pp 255-85 (Academic Press 1971 ). Se sabe que los quelatos fluorescentes de europio exhiben cambios de Stokes grandes (~ 290 nm) sin traslape entre los espectros de excitación y emisión, y espectros de emisión (10 nm de ancho de banda) a 615 nm. Además, las duraciones de fluorescencia largas (medibles en microsegundos en lugar de las duraciones en nanosegundos medibles para fluoróforos convencionales) de los quelatos ayudan a filtrar ruido y otra interferencia que tiene duración fluorescente corta. Las duraciones fluorescentes largas permiten así el uso de los quelatos para mediciones de fluorescencia de resolución de tiempo en microsegundos, lo cual reduce también las señales fundamentales observadas. Ventajas adicionales del uso de quelatos de europio incluyen que los quelatos de europio no son desactivados por el oxígeno. Las emisiones de línea de dos quelatos de europio (Eu), Eu-dibenzoilmetano y Eu-benzoilacetonato, han hecho a los quelatos candidatos atractivos para usar en láseres. Véase Samuelson y otros {J. Chem. Physics 39(1 ): 1 10-12 (1963)). Samuelson y otros estudiaron la fluorescencia y la absorción de ios dos anteriores quelatos de europio como sólidos y en solución. Samuelson y otros compararon las duraciones fluorescentes de los quelatos de europio bajo varias condiciones, con las duraciones de la fluorescencia de europio en otros compuestos. En base a esta comparación, Samuelson y otros sugirieron que la variación en duraciones entre los dos grupos de compuestos de europio es el resultado de la interacción ligando-Eu en los quelatos de europio. Específicamente, Samuelson y otros determinaron que varias líneas de emisión de Eu-dibenzoilmetano mostraron duraciones fluorescentes de 480 +/- 50 s, que fueron significativamente mayores que las duraciones fluorescentes en otros compuestos de europio. Crosby y otros, J. Chem. Physics 34: 743 (1961 ) habían estudiado previamente la función de la transferencia de energía intramolecular en la sensibilización de emisión iónica de quelatos de metales de tierras raras, incluyendo quelatos de dibenzoilmetano de europio y benzoilacetonato de europio. Whan y otros, J. Mol. Spectroscopy 8: 315-27 (1962), reportaron que la emisión de quelatos de un grupo de iones de metales lantánidos (Eu3+, Tb3+, Dy3+ y Sm3+) estaba dominada por líneas espectrales brillantes características de los iones de metales de tierras raras individuales. Whan y otros encontraron que tanto los benzoilacetonatos como los dibenzoilmetanos de Eu3+ y Tb3+ son emisores especialmente brillantes, y que las emisiones de línea brillante y los bajos rendimientos de fosforescencia de estos quelatos, indican que la transferencia de energía intramolecular de los ligandos a los iones Eu3+ y Tb3+ de estos quelatos ocurre eficientemente, Whan y otros, en pag. 324. N. Filipescu y otros, J. Physical Chem. 68(11):3324 (1964) reportó que los espectros de fluorescencia de quelatos ß-dicetona de europio y terbio se modifican cuando se cambian los sustituyentes en la porción de ligando orgánico de los quelatos. Filipescu y otros describieron la intensidad relativa, la distribución espectral, la desviación y división de las líneas de fluorescencia de los quelatos de europio y terbio en relación con la naturaleza de los sustituyentes, su posición, configuración molecular y la transferencia de energía intramolecular total. Filipescu y otros encontraron que la intensidad total de fluorescencia característica del ion, depende de dos factores: 1) la cantidad de energía disponible en el triplete orgánico, y 2) la eficiencia de transferencia de energía al ion. Filipescu y otros también encontraron que los dos factores anteriores variaron para sustituyentes diferentes. Por ejemplo, se encontró que la sustitución de quelatos de dibenzoilmetano de europio con grupos metoxi donadores de electrones en la posición meta sobre el quelato, incrementa la emisión fluorescente del ion europio, mientras que la sustitución para-metoxi reduce la fluorescencia de europio. Además, el efecto fue más pronunciado para los dibenzoil metanos di-metoxi sustituidos que para los dibenzoilmetanos mono-metoxi sustituidos. En contraste, se observó un efecto opuesto para dibenzoilmetanos de europio nitro-sustituidos. Se encontró que los grupos nitro atrayentes de electrones unidos en las posiciones para o meta, reducen la emisión iónica total del europio. Adicionalmente, el efecto fue más pronunciado para dibenzoilmetanos disustituidos que para dibenzoilmetanos monosustituidos. Fiiipescu y otros encontraron también que la fuerte fluorescencia iónica emitida por para-fenildibenzoilmetano de europio indicaba que aumentando el tamaño del sistema aromático se incrementaba la cantidad de energía transferida al ion europio. Este hecho fue confirmado por los resultados de emisión que se obtienen para dicetonas naftil-sustituidas de las cuales se encontró que tienen emisiones iónicas sustancialmente más altas que los quelatos de dibenzoilmetano; Filipescu y otros, en 3328-29. E. Diamandis y otros, Analytical Chemistry 62(22): 1149A (1990), describieron cómo se pueden usar los quelatos de europio como marcas en inmunoensayos de fluorescencia y en ensayos de hibridación de ADN. Con respecto a los inmunoensayos fluorescentes, los autores describieron que se pueden usar quelatos de europio como marcas inmunológicas en varias configuraciones de prueba, incluyendo pruebas competitivas o no competitivas. La patente de E.U.A. No. 4,374,120 (Soini y otros) describe un método para detectar una sustancia usando como marcador un complejo fluorescente de quelato de lantánido. La patente de E.U.A. 4,374,120 también describe el uso de ß-dicetonas como ligandos incrementadores para promover promover las propiedades de fluorescencia fuerte de ciertos quelatos de lantánido, especialmente quelatos de europio y terbio. Wallac (Turku, Finlandia) desarrolló un quelato de metal lantánido para reemplazar marcas de radiación para realizar inmunoensayos, que tienen la estructura: La3+ Se encontró que la molécula de Wallac se comporta muy eficientemente en soluciones diluidas. Véase Hemmila, Applications of Fluorescence in Imunoassays, pág. 149 (1991 ). Se requieren ciertas condiciones para usar quelatos de metal lántanido en soluciones acuosas como los fluidos biológicos. Por ejemplo, se sabe que los quelatos deben, en primer lugar, disolverse en la solución acuosa, y en segundo lugar, librarse de ser inactivados por las moléculas de agua que tienden a llenar los sitios de coordinación vacíos del ion lantánido. Sin embargo, se han usado varios aductos o bases de Lewis como fosfinas, óxidos de fosfina o heterociclos de nitrógeno, además de la estructura del ligando, para formar una "lámina aislante" alrededor del ion lantánido, incrementando la fluorescencia al impedir que las moléculas de agua penetren en la esfera interior del complejo. Por ejemplo, las soluciones desarrolladas para determinaciones fluorométricas de lantánido en sistemas acuosos (por ejemplo inmunoensayos), han comprendido -dicetonas y óxido de trioctilfosfina ("TOPO") como agente sinergístico formador de aducto, y un detergente (por ejemplo Tritón X100) que forma micelas y ayuda a disolver el complejo coordinado. Véase Applications of Fluorescence in Immunoassavs, en pp. 146-47. No se han examinado ni diseñado previamente complejos de quelato de metal lantánido para detección activa de un analito, utilizando un elemento de reconocimiento discreto y específico, tal como un grupo boronato, para detectar glucosa y otros cis-dioles, mediante uno o más ligandos contenidos en el complejo de quelato. Como se mencionó arriba, los quelatos de metales lantánidos se han investigado principalmente para usarse como colorantes de láser, marcas sustitutas para radioisótopos y para su fijación en anticuerpos como marcas en inmunoensayos. Los quelatos de metales lantánidos se han usado también para procedimientos analíticos cualitativos para detectar tetraciclina. La glucosa es un compuesto orgánico indispensable para los organismos vivos y desempeña una función importante en la transmisión de información, metabolismo de energía y formación de estructura en tales organismos. Por ejemplo, la glucosa, y más particularmente la D-glucosa, es crucial como una fuente de energía para una variedad de células en construcción en varios órganos. La glucosa es almacenada en el hígado como glucógeno, que es liberado en los fluidos corporales según sea requerido para el consumo de energía. La producción y consumo de glucosa está bien balanceado en los fluidos corporales de un ser humano normal o sano, manteniéndose constante la concentración de glucosa en los fluidos. De esta manera, la detección de subniveles o supraniveles de glucosa en la sangre o en la orina, provee información valiosa para diagnosticar enfermedades tales como diabetes e insuficiencia adrenal. Un detector de glucosa que utiliza una enzima (por ejemplo el fabricado por Yellow Springs Instruments (YSI), Ohio) es la mejor medición práctica conocida para detectar glucosa. Esta técnica incluye descomponer glucosa con una enzima (glucosa oxidasa) y medir mediante un medio apropiado (por ejemplo por medio de un electrodo) la cantidad de peróxido de hidrógeno producido por la descomposición. Aunque este método se encuentra bien establecido, la calidad de la enzima, que se origina de un cuerpo vivo, cambiará irreversiblemente con el tiempo y no puede ser reciclada para su reutilización. Además, como la glucosa es consumida realmente en la reacción de detección, la capacidad intrínseca del detector de glucosa para medir niveles bajos del analito es, por consiguiente, limitada. Es bien conocido que los compuestos que contienen ácido borónico se unen a la glucosa. Se cree que el mecanismo ocurre mediante el enlace de los grupos hidroxilo adyacentes de la glucosa y los grupos hidroxilo de una porción de boronato, como se describe a continuación: Se conoce de mucho tiempo la formación de complejos de carbohidratos, incluyendo la glucosa, con ácido fenilborónico, y la reversibilidad de esa interacción ha servido como base para la separación cromatográfica de azúcares. Específicamente, en 1959 Lorand y Edwards reportaron constantes de asociación para asociaciones acuosas de ácido fenílborónico con muchos polioles saturados; las interacciones de enlace variaron desde muy débiles (por ejemplo, etilenglicol, Kd = 360 mM) a moderadamente fuertes (por ejemplo, glucosa, Kd = 9.1 mM). Véase J. Yoon y otros, Bioorganic and Medicinal Chemistry 1 (4): 267-71 (1993). La patente de E.U.A. 5,503,770 (James y otros) describe un compuesto fluorescente que contiene ácido borónico que emite fluorescencia de intensidad alta al unirse a sacáridos, incluyendo la glucosa. El compuesto fluorescente tiene una estructura molecular que comprende un fluoróforo, por lo menos una porción de ácido fenilborónico, y por lo menos un átomo de nitrógeno de amina, en donde el átomo de nitrógeno está dispuesto en la vecindad de la porción de ácido fenilborónico de tal manera que interacciona intermolecularmente con el ácido borónico. Dicha interacción causa así que el compuesto emita fluorescencia por unión con el sacárido. La patente de E.U.A. 5,503,770 describe que el compuesto es adecuado para detectar sacáridos. Véase T. James y otros, J. Am. Chem. Soc, 1 17(35): 8982-87 (1995). También se conocen en la técnica detectores fluorescentes que utilizan un compuesto que contiene ácido antrilborónico para detectar glucosa en sangre. Por ejemplo, J. Yoon y otros, J. Am. Chem. Soc. 1 14: 5874-5875 (1992), describen que se puede usar ácido antrilborónico como un quimosensor fluorescente para distinguir la unión de carbohidratos, incluyendo la unión de glucosa y fructosa. Un objeto de la presente invención es detectar la presencia o concentración de un analito en un medio tal como un líquido o un gas, midiendo cualquier cambio de la fluorescencia emitida por un complejo de quelato de metal lantánido, al unirse el analito con uno o más quelatadores del complejo de quelato a través de un elemento de reconocimiento específico de analito. Otro objeto de la presente invención es proveer un complejo de quelato de metal lantánido, que contiene un elemento de reconocimiento específico de analito como una molécula indicadora para detectar la presencia o concentración de un analito tal como glucosa u otro compuesto cis-diol, en un medio tal como un líquido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a una molécula indicadora para detectar la presencia o concentración de un analito, que comprende un complejo de quelato de metal lantánido fluorescente que tiene la fórmula: M(-Ch(-Rx))y en donde: M representa un ion de metal lantánido; Ch representa un quelatador que comprende un ligando, preferiblemente un ligando orgánico que puede comprender uno o más de una -dicetona o un análogo de nitrógeno de la misma, un dihidroxilo, un heterociclo de coordinación de carboxilo, un enol, un criptando macrobicíclico (es decir, un ligando de tipo jaula), un ácido fenilfosfónico o un ácido poliamino-policarboxílico. El ligando orgánico de Ch puede comprender también uno o más de un heterociclo de nitrógeno, azufre, y carboxilos ligados. Además, el ligando orgánico de Ch puede comprender uno o más de un grupo alcano o alqueno, conteniendo preferiblemente 1 a 10 átomos de carbono, así como también porciones aromáticas, carbocíclicas o heterocíclicas, incluyendo grupos bencilo, naftilo, antrilo, fenantrilo o tetracilo. Adicionalmente, uno o más quelatadores complejados con M pueden ser el mismo quelatador o una mezcla de diferentes quelatadores (denominados "ligandos mixtos" o "quelatos terciarios").

R representa un elemento de reconocimiento específico de analito, uno o más de los cuales está unido a uno o más ligandos del complejo de quelato, pero no necesita estar enlazado con todos los ligandos del complejo de quelato. En una modalidad preferida de la presente invención, R puede ser un grupo boronato o un compuesto que contiene un grupo boronato para detectar glucosa u otro compuesto cis-diol. X representa el número de elementos de reconocimiento R enlazados a cada uno de los quelatadores. X puede ser un entero de 0 a 8, y en ciertas modalidades preferidas de la invención, X = 0 a 4 o X = 0 a 2. Adicionalmente, el número de elementos de reconocimiento R enlazados a cada uno de los quelatadores puede ser el mismo o diferente, siempre que para uno o más quelatadores, X > 0. Y representa el número de quelatadores complejados con M y puede ser un entero de 1 a 4. En ciertas modalidades preferidas de la invención, Y = 1 , Y = 3 o Y = 4. La presente invención está dirigida también a un complejo de quelato de metal lantánido fluorescente como se define arriba. La presente invención está dirigida también a métodos para detectar la presencia o concentración de un analito utilizando la molécula indicadora y el complejo fluorescente de quelato de metal mencionados arriba. El método comprende los pasos de exponer la muestra a una molécula indicadora que comprende un complejo de quelato de metal lantánido fluorescente que tiene la fórmula definida arriba, y medir cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el complejo de quelato de metal lantánido, y detectar con ello la presencia o concentración del analito. En la presente invención, la presencia o concentración del analito se detecta midiendo cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el complejo de quelato de metal lantánido al unirse el analito a uno o más quelatadores del complejo de quelato a través de uno o más elementos de reconocimiento específicos dé analito. Específicamente, la presencia o concentración de un analito como glucosa u otro compuesto cis-diol, se determina observando y/o midiendo el cambio en la intensidad o duración de la fluorescencia emitida por el ion metálico fluorescente (es decir, la fluorescencia es atenuada, incrementada o desviada en su longitud de onda) al unirse el analito al elemento de reconocimiento específico de analito del quelato que, para detectar glucosa u otro compuesto cis-diol, es un elemento de reconocimiento que contiene boronato. La presente invención ofrece la ventaja de que es capaz de detectar un analito como glucosa u otro compuesto cis-diol, de manera específica del analito, en un medio tal como un líquido o un gas, utilizando una molécula indicadora fluorescente que tiene una duración fluorescente de longitud suficiente (medible en microsegundos en lugar de nanosegundos); igualmente tiene un cambio de Stokes grande, disminuyendo con ello el efecto de cualquier ruido basal y otra interferencia que pudiera reducir la sensibilidad de la detección del analito, y no es extinguida su concentración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las modalidades preferidas de la molécula indicadora de la invención serán ilustradas con referencia a los dibujos anexos, en los cuales: La figura 1 ilustra un quelato de europio que contiene ácido borónico de conformidad con la presente invención (se muestra que tiene sólo un ligando para propósitos de claridad). La figura 2 también ilustra un quelato de europio que contiene ácido borónico de conformidad con la presente invención. La figura 3 ¡lustra un complejo de quelato de europio que contiene múltiples ligandos que contienen ácido borónico en solución acuosa en presencia de óxido de trioctilfosfina ("TOPO"). La figura 4 ilustra el efecto de la adición de catecol a una solución etanólica que contiene un quelato de europio que contiene ácido borónico de conformidad con la presente invención. La figura 5 ilustra el efecto de la adición de catecol a una solución etanólica que contiene -naftoiltrifluoroacetato de europio (Eu-bNTA). Las figuras 6-8 ¡lustran una titulación de NTA-boronato de Eu con glucosa en metanol. La figura 9 ilustra una comparación entre una titulación de dibenzoilmetano de europio (Eu(DBM)) y Eu(DBM boronado) con glucosa y fructosa en metanol.

La figura 10 ilustra una titulación de NTA-boronato de Eu con glucosa en metanol. La figura 1 1 ¡lustra una titulación de DBM-boronato de Eu con glucosa y fructosa en metanol. La figura 12 ¡lustra una titulación de Eu(ácido teonil-4-benzoilmetanoborónico) con glucosa y fructosa en metanol. La figura 13 ilustra una titulación de Eu(ácido benzoil-trifluorometilacetonaborónico) con glucosa y fructosa en metanol.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se indicó arriba, en la presente invención se determina la presencia o concentración de un analito observando y/o midiendo el cambio en la intensidad o duración de la fluorescencia emitida por la molécula indicadora fluorescente después de unirse a un analito a través de uno o más elementos de reconocimiento específicos de analito en la molécula indicadora. La molécula indicadora fluorescente comprende un complejo de quelato de metal lantánido que tiene la fórmula: M(-Ch(Rx))y en donde: M representa un ion de metal lantánido; Ch representa un quelatador que comprende un ligando, preferiblemente un ligando orgánico que puede comprender cualquiera (uno o más) de una -dicetona o un análogo de nitrógeno de la misma, un dihidroxilo, un heterociclo de coordinación de carboxilo, un enol, un criptando macrobicíclico (es decir, un ligando de tipo jaula), un ácido fenilfosfónico, un cicleno (carboxilatos o fosfonatos tetraalifáticos de 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano) o un ácido poliamino-policarboxílico. El ligando orgánico de Ch puede comprender también cualquiera (uno o más) de un heterociclo de nitrógeno, azufre, y carboxilos ligados. R representa un elemento de reconocimiento específico de analito, uno o más de los cuales se une a uno o más ligandos del complejo de quelato, pero no necesita estar enlazado con todos los ligandos del complejo de quelato. En una modalidad preferida de la presente invención, R puede ser un grupo para detectar glucosa u otro compuesto cis-diol o que actúa como cis-diol. Dichos grupos ¡ncluyen boronatos, arsenitos y germanatos, y compuestos que contienen estos grupos. Compuestos representativos que contienen boronato incluyen los que tienen las siguientes estructuras generales (en cada estructura, R' y R" son cada uno independientemente un arilo fusionado, un grupo alifático, amina primaria, secundaria o terciaria, amida, carboxilo, cetona, éster, alcohol o aldehido; y Y y Z son cada uno independientemente un grupo alifático, alcoxi o arilo): en donde n es 0 o 1 en la estructura izquierda y 0, 1 o 2 en la estructura derecha; en donde n es 1; en donde n es 0 o 1; en donde n es 2; en donde m es 0-5 y n es 1 o 2; y en donde n es 0 o 1, y los sustituyentes de ácido borónico y amina están localizados como un par sobre las posiciones 1 y 10, 3y4, 6y7, 7y8o9y 10. Algunos compuestos específicos que contienen boronato incluyen: Objetivo A Objetivo B Objetivo B-MeO Objetivo C-MeO Objetivo D 10 Objetivo E Objetivo E-MeO Objetivo EE-MeO Objetivo F-MeO 15 Objetivo F-Phe Objetivo G Objetivo G-MeO Objetivo H Objetivo H-MeO Ejemplos de compuestos analitos cis-diol, aparte de la glucosa, ¡ncluyen otros azúcares como fructosa y glicerol. Los catecoles (o-dihidroxibencenos) y catecolaminas, incluyendo hormonas como dopamina, epinefrina y norepinefrina, contienen (o fo)hidroxilos adyacentes que imitan a los cis-dioles con respecto a su reactividad con elementos de reconocimiento de boronato. El ion de metal lantánido M puede ser el de europio (Eu3+), samario (Sm3+), terbio (Tb3+), disprosio (Dy3+) o neodimio (Nd3+), y preferiblemente es un ion de europio (Eu3+) o terbio (Tb3+). El ligando del quelatador Ch puede ser también un ligando orgánico que comprende uno o más de un grupo alcano o alqueno, que contenga preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono, así como también porciones aromáticas, carbocíclicas o heterocíclicas, incluyendo grupos bencilo, naftilo, antrilo, fenantrilo o tetracilo. El ligando puede comprender también grupos tales como -CF3 y C2F5, siempre que e! ligando comprenda además una porción a la cual pueda unirse un elemento R de reconocimiento _ específico de analito, si se desea. Además, cualquier ligando de un complejo de quelato puede ser inorgánico en lugar de orgánico. X representa el número de elementos de reconocimiento R unidos a cada quelatador (uno o más). X puede ser un entero de 0 a 8, y en ciertas modalidades preferidas de la invención, X = 0 a 4 o X = 0 a 2. Adicionalmente, el número de elementos de reconocimiento R unidos a los quelatadores (uno o más), puede ser el mismo o diferente, con la condición de que para uno o más quelatadores, X > 0. Y representa el número de quelatadores complejados con M y puede ser un entero de 1 a 4. En ciertas modalidades preferidas de la invención, Y = 1 , Y = 3 o Y = 4. En ciertas modalidades de la presente invención, el complejo de quelato de metal lantánido puede comprender una mezcla de quelatadores diferentes en donde uno o más de los quelatadores no contienen un elemento de reconocimiento R específico de analito. Las ventajas de usar dicho quelato de ligando mixto, también conocido como quelato de ligando terciario, incluye que algunos ligandos orgánicos, tales como ácidos poliamino-policarboxílicos, son más solubles, en agua que otros ligandos tales como una ß-dicetona. Por lo tanto, por lo menos en una modalidad de la invención, el complejo de quelato de metal lantánido puede comprender, primero, una o más ß-dicetonas que contienen uno o más elementos de reconocimiento específico de analito, y segundo, uno o más de otros ligandos tales como un ácido poliamino-policarboxílico, que promueve la solubilidad en agua del complejo de quelato. En otras modalidades de la presente invención, uno o más quelatadores del complejo de quelato pueden comprender además un grupo -NH2 o -OH, o cualquier otro sustituyente mediante el cual el complejo de quelato puede unirse covalentemente a un enlazador o polímero tal como una polilisina u otro soporte sólido. Para lograr la transferencia de energía de la porción absorbente de luz del complejo al ion de metal lantánido, la energía de estado triplete de la porción absorbente de luz es preferiblemente mayor de aproximadamente 230 kJ/mol. Las porciones absorbentes de luz preferidas incluyen fenantridina (258 kJ/mol), psoralen (262 kJ/mol), fenoxazina (261 kJ/mol), fenantreno (258 kJ/mol), trifenileno (280 kJ/mol), benzofenona (287 kJ/mol), carbazol (293 kJ/mol) y cumarina (258 kJ/mol). La fluorescencia del complejo de quelato de metal lantánido de la presente invención es modulada de manera específica de analito mediante la unión de un analito a uno o más quelatadores del complejo de quelato a través de uno o más elementos de reconocimiento R. Las moléculas indicadoras fluorescentes de la presente invención se pueden usar para detectar una variedad de analitos químicos posibles que son reactivos con las mismas y por lo tanto pueden ser detectados de manera específica por un elemento de reconocimiento R específico de analito. Los analitos preferidos para detección usando la presente invención, son analitos tales como glucosa, fructosa y otros compuestos cis-diol. Sin embargo, dependiendo de la elección del elemento de reconocimiento, las moléculas indicadoras de la presente invención también son útiles para detectar muchos otros analitos. Por ejemplo, la siguiente molécula tiene un elemento de reconocimiento que lo hace útil como un indicador de pH (véase Lippitsch y otros, Sensors and Actuators B 38-39 (1997) 96-102): Además, el siguiente es uno de los muchos compuestos posibles que contienen un elemento de reconocimiento que se puede usar para unir a un analito de zinc (véase, por ejemplo, Huston y otros, JACS 1988, 110, 4460).

La unión del zinc como se muestra, incrementará la fluorescencia de esa molécula indicadora y otras como ella que contengan un elemento de reconocimiento similar. Además, el siguiente es uno de los muchos compuestos posibles que contiene un elemento de reconocimiento que se puede usar para detectar un analito de potasio (véase, por ejemplo, Sousa y otros, ACS Symposium Series 538, 1992, pp. 10-24): En ese compuesto, el ion potasio está coordinado dentro de la porción de corona de éter, ocasionando un cambio de configuración tridimensional de tal manera que la porción de anilina de la molécula se pliega sobre la porción de fenantridina, dando como resultado la extinción de fluorescencia. Los analitos químicos detectables usando las moléculas indicadoras de la presente invención pueden existir en varias formas sólidas, gaseosas y líquidas diferentes. Adicionalmente, los analitos se pueden detectar usando las moléculas indicadoras de la presente invención en varios medios, incluyendo medios tanto líquidos como gaseosos. Existen varios usos posibles para los compuestos fluorescentes de la presente invención, incluyendo usos como moléculas indicadoras en los campos de energía, medicina y agricultura. Por ejemplo, los compuestos fluorescentes se pueden usar como moléculas indicadoras para detectar subniveles o supraniveles de glucosa en sangre u orina, dando así valiosa información para diagnosticar enfermedades como la diabetes y la insuficiencia adrenal. La producción médica/farmacéutica de glucosa para aplicación terapéutica humana requiere monitoreo y control. Los posibles usos de la presente invención en la agricultura incluyen la detección de niveles de analitos como glucosa en soyas y otros productos agrícolas. La glucosa se debe monitorear cuidadosamente para decisiones críticas de cosecha de productos altamente valiosos como las uvas de vino. Como la glucosa es la fuente de carbono y materia prima más cara en los procesos de fermentación, es importante el monitoreo de la glucosa para un control óptimo de la velocidad de alimentación del reactor en la producción de alcohol concentrado. El mezclado en el reactor y el control de la concentración de glucosa también son críticos para el control de la calidad durante la producción de bebidas no alcohólicas y bebidas fermentadas, para cuya producción se consumen internacionalmente las cantidades más grandes de glucosa y (cis-diol)-azúcares fermentables. También se conocen varias técnicas de detección que pueden hacer uso de los compuestos fluorescentes de la presente invención. Por ejemplo, los compuestos fluorescentes de la invención se pueden usar en dispositivos detectores fluorescentes (por ejemplo, véase la patente de E.U.A. No. 5,517,313) o se les puede unir a un material polimérico tal como papel de prueba para inspección visual. Esta última técnica permitiría, por ejemplo, la medición de glucosa de una manera análoga a la determinación del pH con una tira de papel tornasol. Las moléculas fluorescentes descritas en la presente, también se pueden utilizar como simples reactivos con instrumentación analítica estándar de laboratorio tal como espectrofluorómetros o analizadores clínicos como los fabricados por Shimadzu, Hitachi, Jasco, Beckman y otros. Estas moléculas también proveerían traducción de señal química/óptica específica del analito para detectores a base de fibra óptica y fluorómetros analíticos como los fabricados por Ocean Optics (Clearwater, Florida), o Oriel Optics.

En una modalidad preferida de la presente invención, varios quelatadores posibles, uno o más de los cuales pueden estar complejados con un ion de metal lantánido, comprenden un ligando orgánico que tiene unido uno o más grupos boronato como el grupo de reconocimiento R específico de analito, ejemplos de los cuales se muestran enseguida.

A. ß-Dicetonas El quelatador Ch del complejo de quelato de metal lantánido de la presente invención puede ser un ligando basado en ß-dicetona, ejemplos del cual se dan enseguida.

B. Criptandos macrobicíclicos (ligandos de tipo ¡aula) El quelatador Ch en otras modalidades de la presente invención puede ser un criptando macrobicíclico (o ligando de tipo jaula), un ejemplo del cual se muestra enseguida y tiene la forma: El quelatador Ch en otra modalidad de la presente invención puede ser un criptando macrobicíclico que tiene la siguiente estructura.

C. Ligandos de heterociclos de nitrógeno y coordinados de carboxilato Las modalidades del quelatador Ch de los complejos de quelato de metal lantánido de la presente invención, también incluyen los siguientes ligandos de heterociclos de nitrógeno y coordinados de carboxilato.

H Algunos de los quelatos fluorescentes de lantánido que contienen elemento de reconocimiento de boronato muy preferidos de la presente invención, incluyen los siguientes quelatos de europio (se muestra que tienen solo un ligando para propósitos de claridad) que comprenden las siguientes estructuras: p-boronatodibenzoilmetano de europio (II) di-p-boronatodibenzoilmetano de europio (lll) Eu3+ benzoiletilenmetano-2-boronato de europio (IV) En una modalidad preferida de la presente invención, se fijó un elemento de reconocimiento que contiene boronato que es específico de analito para glucosa u otro compuesto cis-diol, a un quelato fluorescente de (tetraquis)beta-naftoiltrifluoroacetato de europio (Eu-bNTA). Se sabe que la porción de ligando orgánico del quelato forma una cubierta alrededor del ion de metal lantánido (por ejemplo, europio), como se indica enseguida: Adicionalmente, también se sabía que diferentes solventes afectan el tiempo de la caída fluorescente del ion de metal lantánido (por ejemplo, el agua extingue la fluorescencia del ion europio). Se investigó así si modificar los ligandos orgánicos de la cubierta exterior con un elemento de reconocimiento específico de analito (por ejemplo, un elemento de reconocimiento que contiene boronato) perturba el tiempo de inactivación del ion europio hasta un grado notable. Se sintetizó y probó el siguiente quelato de europio, boronato de (tetraquis)naftoiltrifluorometano de europio (Eu-bNTA).

Se encontró que el bNTA-boronato de Eu tiene una longitud de onda de excitación de aproximadamente 340 nm y una longitud de onda de emisión que fue la misma que para otros quelatos de europio, aproximadamente 613 nm. Otros compuestos preferidos para la detección de cis-dioles incluyendo glucosa, comprenden los siguientes.

Objetivo A Objetivo B-1 Objetivo B-2 Objetivo B-MeO-1 Objetivo B-MeO-2 Objetivo C-1 Objetivo C-2 Objetivo C-MeO-1 Objetivo C-MeO-2 Objetivo D Objetivo E Objetivo E-MeO Objetivo EE Objetivo EE-MeO Objetivo F Objetivo F-MeO Objetivo F-Phe Objetivo G Objetivo G-MeO Objetivo H Objetivo H-MeO Membrana de Membrana de Como se muestra en las figuras 4-5, las ventajas de la presente invención fueron demostradas mediante una modalidad preferida midiendo el efecto de catecol (o-dihidroxibenceno) tanto en la intensidad como en la duración fluorescente de Eu-bNTA en una solución de etanol. En la figura 5 se muestran los cambios de intensidad fluorescente detectados y medidos después de agregar catecol a la solución de etanol en presencia de Eu-bNTA. La duración fluorescente de Eu-bNTA sin un elemento de reconocimiento que contiene boronato, fue de 362 µs ± 1 µs, mientras que la duración fluorescente de bNTA-boronato de Eu disminuyó a 270 µs ± 4 µs. Después de exponer el bNTA-boronato de europio al catecol, la duración fluorescente de la molécula disminuyó adicionalmente a 209 µs ± 15 µs. El efecto del catecol en la intensidad y duración fluorescente de bNTA-boronato de Eu se midió también en agua y se observó que extinguía la fluorescencia del ion europio del quelato. Se agregó entonces trioctilfosfina ("TOPO") para proteger los sitios de coordinación localizados sobre la cubierta interna del complejo de quelato de europio de los efectos de inactivación del agua. En la figura 3 se representa la adición de TOPO a la solución acuosa conteniendo bNTA-boronato de Eu. El NTA-boronato de Eu también fue capaz de detectar la presencia de glucosa en metanol. Específicamente, se realizó en metanol una titulación de glucosa con NTA-boronato de Eu. En las figuras 6-8 se muestran los datos obtenidos de la titulación de la glucosa. La figura 6 representa una titulación de NTA-boronato de Eu contra una concentración creciente de glucosa. La figura 7 representa una expansión de la escala baja de los puntos datos mostrados en la figura 6. Los resultados mostrados en la figura 7 demuestran que el NTA-boronato de Eu puede detectar la presencia de glucosa a concentraciones bien por debajo de los niveles fisiológicos normales de aproximadamente 4.7 mMoles. Mostradas por la gráfica de datos en la figura 7, las diferencias en las concentraciones de glucosa pueden ser discriminadas dentro de la escala fisiológica de menos de aproximadamente 0.5 mMoles. Aunque la figura 7, debido a la estrecha proximidad de puntos datos por abajo de 0.001 mMoles de glucosa, no muestra la sensibilidad del extremo inferior de bNTA-boronato de Eu a los cambios de concentración de glucosa, la figura 8 gráfica la escala inferior de la figura 7 como la gráfica semilogarítmica de concentración de glucosa contra I/lo. La figura 9 muestra los resultados de la titulación de dibenzoilmetano de europio (Eu(DBM)) y Eu (DBM boronado) separadamente con glucosa y fructosa en metanol. Específicamente, las concentraciones de glucosa y fructosa se variaron como 0.0005, 0.005, 0.05, 1 , 5, 10 y 20 mM. Las gráficas de datos para la glucosa B y la fructosa B en la figura 9 representan titulaciones de glucosa y fructosa de Eu(DBM boronado). Se ve fácilmente de los resultados en la figura 9 que la intensidad fluorescente del dibenzoilmetano de europio boronado aumenta significativamente cuando se expone a concentraciones de glucosa y fructosa por arriba de aproximadamente 0.01 mM, mientras que la intensidad fluorescente del Eu(DBM) no boronado no cambia e ningún grado notable después de la adición de glucosa y fructosa. Sin un elemento de reconocimiento específico (por ejemplo un boronato), el complejo de quelato de metal lantánido no es sensible a la presencia de glucosa, fructosa u otros compuestos cis-diol. Consecuentemente, con un elemento de reconocimiento específico de analito, en este ejemplo un grupo boronato, el complejo de quelato lantánido de esta invención es sensible a la presencia de glucosa, fructosa y otros compuestos cis-diol, y por lo tanto puede ser utilizado para detectar la presencia o concentración de estos y otros analitos. Las figuras 10-13 demuestran además la capacidad de los complejos de quelato de metal lantánido de conformidad con la presente invención, para detectar la presencia o concentración de glucosa y/o fructosa en una muestra. Como se indicó arriba, las moléculas indicadoras fluorescentes de la presente invención se pueden usar en muchos tipos diferentes de sensores fluorescentes. Las moléculas indicadoras fluorescentes se pueden usar en los sensores para detectar la presencia o concentración de un analito tal como glucosa u otro compuesto cis-diol en una muestra tal como una muestra líquida, incluyendo un fluido biológico, y más específicamente un fluido humano. Por ejemplo, se pueden dispersar moléculas indicadoras fluorescentes de conformidad con la presente invención en una matriz de polímero que sea permeable a la glucosa o a otro compuesto cis-diol. Entonces se puede determinar la presencia o concentración de glucosa u otro compuesto cis-diol en un medio tal como un medio líquido, midiendo el cambio de intensidad o duración de la fluorescencia emitida por la molécula indicadora después de unirse a la glucosa o a otro compuesto cis-diol a través de uno o más elementos de reconocimiento que contienen boronato. La patente de E.U.A. No. 5,517,313, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia, describe un dispositivo sensor de fluorescencia en el cual se pueden usar las moléculas indicadoras fluorescentes de la presente invención para determinar la presencia o concentración de un analito tal como glucosa u otro compuesto cis-diol en un medio líquido. El dispositivo sensor comprende una disposición en capas de una matriz que contiene una molécula indicadora fluorescente (en adelante "matriz fluorescente"), un filtro de alto paso y un fotodetector. En este dispositivo, está localizada una fuente de luz, preferiblemente un diodo emisor de luz ("LED") por lo menos parcialmente dentro del material indicador, para que la luz incidente de la fuente de luz ocasione la fluorescencia de las moléculas indicadoras. El filtro de alto paso permite a la luz emitida alcanzar el fotodetector, eliminando la luz incidente dispersada de la fuente de luz. La fluorescencia de las moléculas indicadoras empleadas en el dispositivo descrito en la patente de E.U.A. No. 5,517,313 es modulada, por ejemplo, atenuada o incrementada, por la presencia local de un analito como glucosa u otro compuesto cis-diol. En el sensor descrito en la patente de E.U.A. No. 5,517,313, el material que contiene la molécula indicadora es permeable al analito. De esta manera, el analito se puede difundir hacia el material del medio de prueba circundante, afectando así la fluorescencia emitida por las moléculas indicadoras. La fuente de luz, el material que contiene ia molécula indicadora, el filtro de alto paso y el fotodetector, están configurados de tal manera que por lo menos una porción de la fluorescencia emitida por las moléculas indicadoras choca con el fotodetector generando una señal eléctrica que es indicativa de la concentración del analito (por ejemplo glucosa) en el medio circundante. De conformidad con otras modalidades posibles para usar las moléculas indicadoras fluorescentes de la presente invención, también se describen dispositivos sensores de fluorescencia en las solicitudes de patente copendientes de E.U.A. Nos. 08/855,234, 08/855,235 y 08/855,236, todas incorporadas aquí como referencia. Las moléculas indicadoras fluorescentes de la presente invención pueden ser preparadas por personas expertas en la materia sin mayor experimentación, usando mecanismos de reacción y reactivos conocidos fácilmente, incluyendo los mecanismos de reacción que son consistentes con los procedimientos generales que a continuación se describen.

Preparación de complejos de tetraauis-ß-dicetona de europio boronado 1. Se disuelve en tolueno ácido naftalen-1 -borónico, tal cual se obtiene de Frontier Scientific (Logan, Utah). 2. Primero se debe proteger (bloquear) el ácido borónico haciéndolo reaccionar con 2,2-dimetil-1 ,3-propanodiol (Aldrich Chemical Company) mientras se remueve azeotrópicamente agua usando una trampa de Dean-Stark, para proveer 1-naftilboronato de 2,2-dimetilpropano-1 ,3-diilo, 3. El ácido borónico bloqueado puede ser a iado entonces mediante acetilación de Friedel-Crafts haciendo reaccionar el ácido borónico con anhídrido acético y tricloruro de aluminio en disulfuro de carbono anhidro para producir 5-acetil-1-naftilboronato de 2,2-dimetilpropano-1,3-diilo. Generalmente se obtiene un rendimiento de aproximadamente 70% del producto de reacción, que aparece como un líquido viscoso, según se muestra a continuación: 4. Se puede formar entonces la -dicetona y desbloquearse el boronato por medio de una condensación de Claisen entre (3) y trifl uoro a cetato de etilo (Aldrich), usando metóxido de sodio (en éter seco) como el agente condensador, como se muestra abajo: . Después, se puede purificar el producto intermediario (4), ácido 5-naftoil-trifluoroacetonaborónico, por medio de CCF preparativa en gel de sílice, eluyendo con cloruro de metileno. Por lo menos en una preparación, se recuperó de la placa la tercera banda de elución (Rf = 0.70-0.85) y se analizó mediante RMN de protones a 400 MHz. El espectro de RMN exhibió un patrón que era característico de la forma enol de la -dicetona, específicamente, mostrando picos en sigma 6.69 (singulete) y en sigma 15.28 (singulete amplio). 6. El complejo indicador final de tetraquis europio que contiene un grupo boronato como el elemento de reconocimiento específico de analito, es producido haciendo reaccionar la -dicetona (4) con tricloruro de europio hexahidratado (Aldrich) y piperidina en etanol absoluto, como se muestra abajo: La solución se calienta entonces a 70°C durante tres horas. Después de calentar, la solución resultante muestra una emisión rojo naranja característica después de irradiación con una fuente manual de UV de onda larga. Adicionalmente, un barrido de fluorescencia con un fluorómetro Shimadzu muestra una longitud de onda de pico de excitación de 340 nanómetros y una longitud de onda de pico de emisión característico del complejo de europio de 613 nanómetros. A continuación se representan otros esquemas de síntesis para preparar los compuestos útiles de la presente invención.

Resumen de Intermediarios para el Objetivo A.

Síntesis de Intermediarios para Objetivos B-1 , C-1.

Síntesis de intermediarios para Objetivos B-2, C-2. para el objetivo B-2 R= Me, MeO, Ph igual para el objetivo en el grupo C-2 R= Me, OMe, Ph Síntesis de Intermediario para el Objetivo E.

R = Me, OMe, Ph Síntesis de intermediarios para el Objetivo EEE Síntesis de Intermediarios para el Objetivo F del objetivo A R= Me, OMe, Ph Objetivo H - Síntesis Aldrich Chemical Co. St. Louis, Mo. 1) HNMe2, NaCNBH3, EtOH 2) BH, ' Esquemas de Síntesis para el Enfoque 3 BHj HjN-hidrogel, EDC. NHS Para detalles adicionales respecto a los esquemas de síntesis representados anteriormente, véanse las siguientes publicaciones, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia: 1. Walls, LP. , JCS, (1934), 104-109 2. Reese, C. B., JCS, (1958), 895-901 3. Muth, C. W. y otros, J. Medicinal Chem, (1973), vol 16, No. 3, 1973 4. Badger, G. M., y otros, J.C.S., (1951), 3207-3211 5. Ishiyama, T. y otros, J. Org. Chem. (1995), 60, 7508-7510 6. Forrester, A. R. y otros, J.C.S. Perkin I, 612-615 7. Petterson, R.C. y otros, J. Org. Chem., (1974), Vol. 39, No. 13, 1841-1845 8. Nagarajan, K. y otros, Indian Journal of Chemistry, Vol. 11 , Feb. 1974, 112- 114 9. Hollingsworth, B. L y otros, J. Chem. Soc, (1961), 3771-3773 10. Frinkelstein, J. y otros, J. Amer. Chem. Soc, (1951), Vol. 73, 302-304 11. Parker, D. y otros, J. Chem. Soc, Chem. Commun., (1997) 1777-78 12. Stille, J. K. Angew, Chem. Int. Ed. Engl., (1986), Vol. 25, 508-524 13. Sherry, A.D. y otros, Inorgánica Chimica Acta, (1987), Vol. 139, 137-139 14. Bansal, N. y otros, J. Magnetic resonance Imaging, ( 992) Vol. 2, 385-391 15. Sherry, A. D. y otros, J. Magnetic Resonance, (1988), Vol. 76, 528-833 La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos para mayor comprensión de la misma.

EJEMPLO 1 Detección de glucosa y fructosa con Eu.ácido 4- dibenzoilmetanoborónico) Se agregaron 25 µl de Eu(ácido 4-dibenzoilmetanoborónico)4 6.5 mM en PyCI a 525 µl de metanol y se mezcló formando vórtice. De soluciones de abastecimiento en metanol (4 µM, 400 µM, 4 mM y 40 mM), se prepararon separadamente muestras de glucosa y fructosa a concentraciones de 0.5 DM, 5 µM, 50 µM, 1 µM, 5 µM, 10 µM y 20 µM para cada uno de los dos azúcares. Los resultados se muestran en la figura 9; la intensidad de emisión de fluorescencia del complejo de quelato de Eu a 613 nm se monitoreó para cada una de las muestras separadas de glucosa y fructosa después de excitar el complejo de quelato de Eu a la longitud de onda de excitación requerida de 365 nm.

EJEMPLO li Síntesis del ácido de tetraquis europio-5-naftoil-trífluoroacetonaborónico l. Preparación de 1 -naftilboronato de 2,2-dimetilpropano-1 ,3-diilo (1) El grupo boronato del precursor se protegió de cualquier efecto adverso potencial ocasionado por condiciones subsecuentes de reacción durante la síntesis del complejo de quelato de europio de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se pusieron a reflujo en tolueno (200 ml), ácido naftalen-1-borónico (15.2 gramos, 0.0884 moles) y 2,2-dimetil-1,3-propanodiol (10.0 gramos, 0.0960 moles, 1.1 equivalentes), mientras se removía agua azeotrópicamente usando una trampa de Dean-Stark durante 28 horas. Después se evaporó el tolueno por destilación simple, seguida por destilación a presión de aspirador calentando durante 2 horas hasta alcanzar una temperatura de aproximadamente 80°C. Después se removió al vacío (0.5 mm) el 2,2-dimetil-1 ,3-propanodiol que no reaccionó, calentando hasta 60°C durante 1 hora. Se obtuvo un sólido blanco (20.94 gramos, 99% de pureza) de 1 -naftilboronato de 2,2-dimetilpropano-1 ,3-diilo. El producto se verificó mediante 1HNMR (CDCI3, 400 MHz).

II. Acetilación de Friedel-Crafts: Preparación de 5-acetil-1 -naftilboronato de 2.2-dimetilpropano-1 ,3-diilo (2) Se introdujo un grupo acetilo en la estructura aromática del precursor para formar una dicetona, de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se disolvió 1 -naftilboronato de 2,2-dimetilpropano-1 ,3-diilo (1) (21.0 gramos, 0.0878 moles) en 150 ml de disulfuro de carbono seco, agitando en un matraz de fondo redondo de 250 ml en un baño de hielo y agua. Se le agregaron porciones separadas de tricloruro de aluminio (28.7 gramos, 0.215 moles) durante un período de dos horas. Después, se agitó la mezcla y se calentó lentamente a temperatura ambiente durante un período de una hora. Se observó que se depositó dentro del matraz un semisólido oscuro, pegajoso. La mezcla se enfrió nuevamente en un baño de hielo y agua, después de lo cual se le adaptó al matraz un condensador de reflujo. Se le agregó entonces anhídrido acético (8.93 gramos, 0.0875 moles) durante un período de 2 horas. La mezcla se calentó después a 40°C para iniciar la reacción. Durante la adición del anhídrido acético fue necesario agitar la mezcla de reacción (arremolinando manualmente) ocasionalmente, de manera de controlar cualquier reacción exotérmica que ocurriera durante la reacción. Después de dejar agitando la mezcla de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente, se calentó lentamente a 50°C durante un período de 1 hora y se mantuvo a esa temperatura durante tres horas. Se observó la formación de un sólido oscuro en la mezcla de reacción. Después se usaron juntos 800 ml de agua de hielo, 15 ml de cloruro de hidrógeno concentrado y 250 ml de cloruro de metileno, para descomponer y extraer la mezcla de reacción en dos capas claras. Después, la capa orgánica inferior se recolectó, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a presión reducida hasta 80°C durante tres horas para producir 19.39 g de 5-acetil-1 -naftilboronato de dimetilpropano-1 ,3-diilo (2) en una forma semisólida, teniendo un rendimiento de 78%. lll. Condensación de Claisen: Preparación de ácido 5-naftoil-trifluoroacetonaborónico (3) Se formó un ligando de ß-dicetona, de la siguiente manera: Se hizo reaccionar una mezcla de hidruro de sodio con 2 ml de metanol (0.313 gramos, 0.01302 moles) en 10 ml de éter seco. La solución resultante se secó bajo presión reducida hasta 100°C durante dos horas para producir metóxido de sodio en una forma sólida. El metóxido de sodio se trató entonces con 45 ml de éter seco y se enfrió en un baño de agua de hielo. Después se le agregó trifl uoroacetato de etilo (1.763 gramos, 0.0124 moles), seguido 10 minutos después por la adición de una solución de 5-acetíl-1-naftilboronato de dimetilpropano-1 ,3-diilo (2) (3.50 gramos, 0.0124 moles) en 20 ml de éter seco; cuya solución se agregó gota a gota durante un período de otros 10 minutos. La mezcla se agitó entonces durante 30 minutos a temperatura ambiente y se calentó a reflujo durante 70 horas. Agitando la mezcla en un baño de hielo y agua, se le agregaron 25 ml de agua y 8 ml de cloruro de hidrógeno al 10% para acidificar la capa de agua a un pH de 1. Aparecieron después en el matraz dos capas claras. Después, se recolectó la capa etérea superior, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó bajo presión reducida hasta 60°C durante 1 hora para producir la ß-dicetona en una forma de líquido oscuro (4.36 gramos). La ß-dicetona resultante se purificó mediante CCF preparativa en gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno. Se recuperó de la placa de CCF la tercera banda (Rf = 0.70-0.85), de ácido 5-naftoil-trifluoroacetonaborónico (3) en un rendimiento de 25% (1.20 gramos).

El producto se verificó mediante espectro de RMN de protones (400 MHz), teniendo un patrón característico de la forma enol de la ß-dicetona, con picos en sigma 6.69 (singulete) y en sigma 15.28 (singulete amplio).

IV. Quelación/Formación del complejo tetraquis europiofácido beta-dicetonaborónico) (4) Se produjo después el complejo de quelato de lantánido para usar como una molécula indicadora fluorescente, de la siguiente manera: Se agregó una solución de tricloruro de europio hexahidratado (0.7 mg, 0.0019 mmoles) en 0.5 ml de etanol absoluto a una solución de ácido 5-naftoil-trifluoroacetonaborónico (3) (2.2 mg, 0.0058 mmoles) y piperidina (130 mg) en 0.5 ml de etanol absoluto. Esta mezcla se calentó lentamente a 70°C durante un período de 2 horas y se mantuvo a esa temperatura durante 3 horas más para formar el complejo de tetraquis europio (4). La solución resultante exhibió una emisión rojo naranja característica después de irradiación con una fuente manual de UV de onda larga. Adicionalmente, un espectro de fluorescencia, medido con un fluorómetro Shimadzu, mostró una longitud de onda de excitación pico de 340 nanómetros y un patrón de emisión característico de un complejo de quelato de europio, de 613 nanómetros. Se ha descrito la invención con relación a ciertas modalidades preferidas. Los expertos en la materia reconocerán que se pueden hacer modificaciones y mejoramientos sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula indicadora para detectar la presencia o concentración de un anaiito, que comprende un complejo de quelato de metal lantánido fluorescente que tiene la fórmula: en donde: M es un ¡on de metal lantánido; Ch es un quelatador que comprende un ligando; R es un elemento de reconocimiento específico de analito y X representa el número de elementos de reconocimiento R unidos a cada quelatador; X = 0 a 4, y Y = 1 a 4; y el número de elementos de reconocimiento R puede ser el mismo o diferente, con la condición de que para uno o más quelatadores, X > 0; y en donde la presencia o concentración del analito es detectada midiendo cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el complejo de quelato de metal lantánido, después de la unión del analito a uno o más quelatadores del complejo a través del elemento de reconocimiento.

2.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque M en el complejo de quelato de metal lantánido, es un ion europio o un ion terbio.

3.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el ligando del quelatador (uno o más) es un ligando orgánico que comprende uno o más de una ß-dicetona o un análogo de nitrógeno de la misma, un dihidroxilo, un heterociclo de coordinación de carboxilo, un enol, un criptando macrobicíclico, un ácido poliamino-policarboxílico, un ácido fenilfosfónico, un grupo alcano o alqueno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, porciones aromáticas, porciones carbocíclicas y porciones heterocíclicas.

4.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el ligando del quelatador (uno o más) comprende una porción seleccionada del grupo que consiste de una ß-dicetona y un cicleno.

5.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el elemento de reconocimiento R del complejo de quelato de metal lantánido comprende un grupo boronato, arsenito o germanato, y el analito es glucosa.

6.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el quelatador (uno o más) comprende un sustituyente para unir el complejo de quelato a un soporte sólido.

7.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el sustituyente para unir el complejo de quelato al soporte sólido, es un grupo carboxilo, -NH2 o -OH.

8.- La molécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el elemento de reconocimiento se selecciona del grupo que consiste de: en donde n es 0, 1 o 2 en la estructura derecha y 0 o 1 en la estructura izquierda; en donde n es 1 ; en donde n es 0 o 1 ; en donde n es 2; en donde m es 0-5 y n es 1 o 2; y en donde n es 0 o 1, y los sustituyentes ácido borónico y amina están localizados como un par sobre las posiciones 1 y10, 3y4, 6y7, 7y8o9y 10; y todas las estructuras en donde sea aplicable, R' y R" son cada uno independientemente arilo fusionado, un grupo alifático, amina primaria, secundaria o terciaria, amida, carboxilo, cetona, éster, alcohol o aldehido; y Y y Z son cada uno independientemente un grupo alifático, alcoxi o arilo; y derivados de los mismos.

9.- Un complejo de quelato de metal lantánido fluorescente para detectar la presencia o concentración de un analito, que tiene la fórmula: en donde: M es un ion de metal lantánido; Ch es un quelatador que comprende un ligando; R es un elemento de reconocimiento específico de analito y X representa el número de elementos de reconocimiento R unidos a cada quelatador; X = 0 a 4, y Y = 1 a 4; y el número de elementos de reconocimiento R puede ser el mismo o diferente, con la condición de que para uno o más quelatadores, X > 0; y en donde la presencia o concentración del analito es detectada midiendo cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el complejo de quelato de metal lantánido después de la unión del analito a uno o más quelatadores del complejo a través del elemento de reconocimiento específico de analito.

10.- El complejo de quelato de metal lantánido fluorescente de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque M es un ion europio o un ¡on terbio.

11.- El complejo de quelato de metal lantánido fluorescente de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el ligando del quelatador (uno o más) es un ligando orgánico que comprende uno o más de una ß-dicetona o un análogo de nitrógeno de la misma, un dihidroxilo, un heterociclo de coordinación de carboxilo, un enol, un criptando macrobicíclico, un ácido poliamino-policarboxílico, un ácido fenilfosfónico, un grupo alcano o alqueno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, porciones aromáticas, porciones carbocíclicas y porciones heterocíclicas.

12.- El complejo de quelato de metal lantánido fluorescente de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el ligando del quelatador (uno o más) comprende una D-dicetona o un cicleno.

13.- El complejo de quelato de metal lantánido fluorescente de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el elemento de reconocimiento del complejo de quelato de metal lantánido comprende un grupo boronato, arsenito o germanato, y el analito es glucosa.

14.- El complejo de quelato de metal lantánido fluorescente de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el elemento de reconocimiento se selecciona del grupo que consiste de: en donde n es 0, 1 o 2 en la estructura derecha y 0 o 1 en la estructura izquierda; en donde n es 1; en donde n es 0 o 1; en donde n es 2; en donde m es 0-5 y n es 1 o 2; y en donde n es 0 o 1 , y los sustituyentes ácido borónico y amina están localizados como un par sobre las posiciones 1 y 10, 3 4, 6 y 7, 7 y 8 o 9 y 10; y todas las estructuras en donde sea aplicable, R' y R" son cada uno independientemente arilo fusionado, un grupo alifático, amina primaria, secundaria o terciaria, amida, carboxilo, cetona, éster, alcohol o aldehido; y Y y Z son cada uno independientemente un grupo alifático, alcoxi o arilo; y derivados de los mismos.

15.- Un método para detectar la presencia o concentración de un analito en una muestra, que comprende los pasos de: (a) exponer la muestra a una molécula indicadora que comprende un complejo de quelato de metal lantánido fluorescente que tiene la fórmula: M(-Ch(-Rx))y en donde: M es un ion de metai lantánido; Ch es un quelatador que comprende un ligando; R es un elemento de reconocimiento específico de analito y X representa el número de elementos de reconocimiento R unidos a cada quelatador; X = 0 a 4, y Y = 1 a 4; y el número de elementos de reconocimiento R puede ser el mismo o diferente, con la condición de que para uno o más quelatadores, X > 0; y (b) medir cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el complejo de quelato de metal lantánido, después de ia unión del analito a uno o más quelatadores del complejo a través del elemento de reconocimiento específico de analito, detectando así la presencia o concentración del analito.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque M en el complejo de quelato de metal lantánido, es un ion europio o un ion terbio.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el ligando del quelatador (uno o más) del complejo de quelato de metal lantánido es un ligando orgánico que comprende uno o más de una ß-dicetona o un análogo de nitrógeno de la misma, un dihidroxilo, un heterociclo de coordinación de carboxilo, un criptando macrobicíclico, un ácido poliamino-policarboxílico, un enol, un ácido fenilfosfónico, un grupo alcano o alqueno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, porciones aromáticas, porciones carbocíclicas y porciones heterocíclicas.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el ligando del quelatador (uno o más) comprende una ß-dicetona o un cicleno.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el elemento de reconocimiento R del complejo de quelato de metal lantánido comprende un grupo boronato, arsenito o germanato, y el analito es glucosa.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el elemento de reconocimiento se selecciona del grupo que consiste de: en donde n es 0, 1 o 2 en la estructura derecha y 0 o 1 en la estructura izquierda; en donde n es 1 ; en donde n es 0 o 1 ; en donde n es 2; en donde m es 0-5 y n es 1 o 2; y en donde n es 0 o 1, y los sustituyentes ácido borónico y amina están localizados como un par sobre las posiciones 1 y10, 3y4, 6y7, 7y8o9y 10; y todas las estructuras en donde sea aplicable, R' y R" son cada uno independientemente arilo fusionado, un grupo alifático, amina primaria, secundaria o terciaria, amida, carboxilo, cetona, éster, alcohol o aldehido; y Y y Z son cada uno independientemente un grupo alifático, alcoxi o arilo; y derivados de los mismos.