MXPA00008809A - Expresion de genes biosinteticos de trehalosa en plantas - Google Patents

Abstract

La invención proporciona novedosas plantas transgénicas que expresan gene biosintéticos de trehalosa, por ejemplo bajo el control de un promotor inducible, que son de un desarrollo normal, junto con métodos para mejorar la tolerancia a la tensión en estas plantas, métodos para mejorar la calidad del alimento, y otros métodos para hacer y utilizar las plantas de la invención. La invención también proporciona novedosas enzimas biosintéticas de trehalosa codificadas por las secuencias de nucleótidos.

Description

EXPRESIÓN DE GENES BIOSINTETICOS DE TREHALOSA EN PLANTAS La invención se refiere a la expresión de genes biosintéticos de trehalosa, y a la resistencia a la sequedad en plan-tas. En particular, esta invención resuelve la cuestión de la acumulación de trehalosa y la resistencia a la sequedad en plantas superiores, y las maneras novedosas de diseñar este rasgo. También resuelve la necesidad de propiedades de almacenamiento mejoradas de las plantas cosechadas, la vida de ana-quel mejorada de frutas y flores, así como la estabilización de proteinas extrañas expresadas en plantas transgénicas . En una modalidad preferida, la invención describe la* expresión de los genes biosintéticos de trehalosa en plantas, de preferencia bajo el control de un promotor inducible, que permitan la resis-tencia a la sequedad sin el efecto perjudicial asociado con la acumulación incontrolada de trehalosa. La trehalosa (a-D-glucopiranosil- [1, 1] -a-D-glucopirano-sida) es un disacárido comúnmente encontrado en los organismos inferiores, tales como bacterias, hongos, e insectos, en donde con frecuencia se acumula en las células y órganos en fase de reposo o estacionaria. Se requieren dos actividades enzimáticas para la biosíntesis de trehalosa: una trehalosa- 6-fosfato sintasa cataliza la condensación de UDP-glucosa y glucosa-6-fosfato para obtener trehalosa-6-fosfato, y una trehalosa-6-fosfato fosfatasa fosforila la trehalosa-6-fosfato para obte-ner trehalosa . Aunque la trehalosa puede servir como una forma de almacenamiento para el carbono reducido, puede tener un papel más significativo como un protector contra los efectos perjudicia-les de diferentes tensiones abióticas, notoriamente calor y desecación. Tanto in vivo como in vi tro, la acumulación de trehalosa está correlacionada con la protección de las macromoléculas biológicas (particularmente las membranas y las proteínas) de la desecación, los extremos de temperatura, y el choque osmótico. La trehalosa producida mediante fermentación se utiliza comercialmente en la conservación de enzimas y en la estabilización de los alimentos deshidratados y procesados. Aunque durante mucho tiempo se ha reconocido que la trehalosa puede presentarse en plantas como un producto de los mi-croorganismos simbióticos, como regla, se pensaba que los vertebrados y las plantas superiores no eran capaces de sintetizar trehalosa. La presentación casi ubícuita de las enzimas cata-bolizadoras de trehalosa (trehalasas) en las familias de las plantas superiores era una curiosidad biológica adscrita prin-cipalmente a la presencia de la trehalosa exógena que entra a las células de plantas a partir de fuentes microbianas y fúngicas simbióticas o epifíticas . Son excepciones notorias las plantas inferiores y las angiospermas agrupadas en la categoría de "plantas de resurrección" que son capaces de sobrevivir a períodos de desecación extraordinariamente prolongados . Estas plantas, incluyendo las especies de Selaginella y Myrothamnus, pueden acumular tanto como el 10 por ciento de trehalosa en peso seco enseguida del establecimiento de la sequedad. En vista de la asociación de la trehalosa con la resistencia a la sequedad, y a la economía históricamente pobre de la fermentación de trehalosa microbiana, también se han hecho intentos por diseñar plantas transgénicas para acumular este disacárido. Aunque estas plantas se han obtenido con éxito (utilizando genes de síntesis de trehalosa tanto bacterianos como de levadu-ra) , se ha llegado a observar que la producción de trehalosa constitutiva en el citosol de la planta está acompañada por efectos perjudiciales significativos. Estos fenotipos (crecimiento detenido, hojas anormales, raíces no desarrolladas) son particularmente severos cuando la expresión de trehalosa se presenta en el tejido de la raíz o durante el desarrollo temprano, así como el uso de los promotores de plantas específicos del tejido verde para impulsar los genes productores de trehalosa aminora algunos de, si no es que todos, estos efectos. Dados estos hechos, un sistema de expresión inducible para los genes biosintéticos de trehalosa, que permita la acumulación de trehalosa, y que dé como resultado resistencia a la sequedad pero sin efectos perjudiciales para la planta, es de gran uso práctico e interés económico. Por consiguiente, la presente invención se refiere a la expresión de genes biosintéticos de trehalosa y de resistencia a la sequedad en plantas. En una modalidad preferida, la invención describe la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa en plantas, de preferencia bajo el control de un promotor inducible, que per-mita la resistencia a la sequedad sin el efecto perjudicial asociado con la acumulación incontrolada de trehalosa. Un promotor preferido es un promotor químicamente inducible, tal como el promotor PR-la de tabaco, que se puede activar mediante la aplicación foliar de un inductor químico. Adicionalmente, la invención describe la expresión de genes biosintéticos de trehalosa expresados en diferentes compartimentos celulares. En una primera modalidad, los genes biosintéticos de trehalosa se expresan en el citoplasma de planta. En una modalidad adicional, los genes biosintéticos de trehalo-sa se expresan a partir del genoma nuclear de la planta, y las enzimas biosintéticas de trehalosa codificadas de los mismos, se dirigen hacia los plástidos, por ejemplo, mediante la utilización de un péptido de tránsito de plástido. En una modalidad adicional, los genes biosintéticos de trehalosa se expresan a partir del genoma del plástido de la planta. En una modalidad preferida, los vectores que contienen los genes biosintéticos de trehalosa fusionados con un promotor capaz de dirigir la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa en los plástidos de plantas, se transforman en el genoma del plástido. En una modalidad preferida, los vectores contienen un promotor de fago fusionado con los genes biosintéticos de trehalosa, se transforman en el genoma del plástido. La línea resultante se cruza con una línea transgénica que contiene una región de codificación nuclear para una ARN polimerasa del fago, complemen-tada con una secuencia de dirección al plástido, y operativamente enlazada con un promotor de planta, tal como un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo. En otra modalidad preferida, un promotor capaz de dirigir la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa en los plástidos de plantas, es un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en los plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido. Estos promotores son, por ejemplo, pero no se limitan a, un promotor clpP, un promotor del gen de ARN-r 16S, un promotor psbA, o un promotor rbcL. En la presente invención, de preferencia se utilizan genes biosintéticos de trehalosa a partir de E. coli, pero también se pueden utilizar genes de otros organismos, incluyendo, pero no limitándose a, levadura, otros organismos inferiores, u orga-nismos superiores. Por ejemplo, los genes OtsA de E. coli y/o OtsB de E. coli ; los genes TPS1, TSL1, ó TSL2 de levadura (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,792,921), el gen para la trehalosa sintasa de Arabidopsis (TPS1, número de acceso Y08568, Blazquez y colaboradores, Plant J. (1998) 13:685-9), las fosfato de trehalosa fosfatasas de Arabidop- ßis (Vogel y colaboradores, Plant J. (1998), 13:673-83) o un gen de Selaginella. lepidophylla que codifique una fosfato de trehalosa sintasa/fosfatasa difuncional (Número de Acceso U96736) . En una modalidad preferida, una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfato de trehalos sintasa, y una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfato de trehalos fosfatasa, se expresan ambas en la planta. En otra modalidad preferida, se expresa en la planta una secuencia de nucleótidos que codi-fica una fosfato de trehalosa sintasa, o se expresa en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfatasa de fosfato de trehalosa. La presente invención también se refiere a la expresión a partir del genoma de plástido de dos genes biosintéticos de trehalosa transcritos desde un solo promotor en un gen policistrónico de tipo operón. La presente invención también da a conocer secuencias de nucleótidos novedosas que codifican enzimas biosintéticas de trehalosa a partir de cultivos económicamente importantes, en particular derivadas de maíz. Estas secuencias de nucleótidos se transforman en las plantas para incrementar su contenido de trehalosa y su resistencia a la sequedad. La invención también proporciona métodos para utilizar estas secuencias de nucleótidos como marcadores para la producción de líneas con mejor resistencia a las tensiones, mediante técnicas de reproducción convencionales .

Por consiguiente, la invención proporciona: Una planta que expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa, por ejemplo una planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la trehalosa-6-fosfato sintasa y/o la trehalosa-6-fosfato fosfatasa, por ejemplo, los genes OtsA de E. coli y/u OtsB de E. coli . Estas secuencias de nucleótidos, por ejemplo, se integran establemente en su ADN nuclear o del plástido, de preferencia bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible por herida o químicamente inducible, o bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa en los plástidos de plantas, por ejemplo, un promotor regulado por transactivador, en donde el transactivador correspondiente está bajo el control de un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa con instrucciones para su uso. En particular, la invención proporciona: La planta de acuerdo con la invención, que comprende en su genoma un primer cásete de expresión heterólogo o partes del mismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato sintasa bajo el control de un promo-tor inducible, o bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta, por ejemplo, un promotor regulado por transactivador, en donde el transactivador correspondiente de pre-ferencia está bajo el control de un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, y un segundo cásete de expresión heterólogo o partes del mismo, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una treha-losa-6-fosfato fosfatasa, bajo el control de un promotor indu-cible, o bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta, por ejemplo, un promotor regulado por transactivador, en donde el transactivador correspondiente de preferencia está bajo el control de un promotor inducible, un promotor específi-co del tejido, o un promotor constitutivo. Incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) , y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa con instrucciones para su uso. La invención proporciona además : Un cásete de expresión en plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato sintasa, de preferencia bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamen-te inducible; un vector que comprende este cásete expresable en plantas; una planta transformada con este vector. La invención proporciona además : Un cásete de expresión en plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato fosfatasa, de preferencia bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible; un vector que comprende este cásete expresable en plantas ; y una planta transformada con este vector. La invención proporciona además : Un cásete de expresión en plantas que comprende una se-cuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa- 6 -fosfato sintasa, de preferencia bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, y que además comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato fosfatasa, de prefe-rencia bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible; un vector que comprende este cásete expresable en plantas; y una planta transformada con este vector. En una modalidad adicional, la invención abarca la expre-sión de secuencias de nucleótidos que codifican enzimas biosintéticas de trehalosa en plástidos bajo el control de un promotor regulado por transactivador, y el gen para el transactivador es el ADN nuclear, bajo el control de un promotor de plan-tas. Por ejemplo, los vectores de transformación de plástidos normalmente se construyen utilizando un promotor de fago, tal como el promotor del gen 10 del fago T7, cuya activación de transcripción depende de una ARN polimerasa de ARN, tal como la ARN polimerasa del fago T7. La línea resultante se cruza con una línea transgénica que contiene una región de codificación nuclear para una polimerasa de ARN de fago, complementada con una secuencia de dirección al cloroplasto, y operativamente enlazada con un promotor de plantas, de preferencia un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, de preferencia un promotor químicamente inducible, tal como el promotor PR-la de tabaco. Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente: Un planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que comprende de preferencia un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, más preferiblemente un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, por ejemplo el promotor PR-la de tabaco, operativamente enlazado con una se-cuencia de ADN que codifica para un transactivador (de prefe-rencia un transactivador que no se presente naturalmente en las plantas, de preferencia una ARN polimerasa o una proteína de enlace de ADN, por ejemplo la polimerasa de ARN de T7) , estando este transactivador opcionalmente fusionado con una secuencia de dirección al plástido, por ejemplo una secuencia de dirección al cloroplasto (por ejemplo, un cásete de expresión expresable en plantas como se describió anteriormente) ; y un cásete de expresión de plástido heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador re-guiado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es ARN polimerasa de T7) , y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codificaba cuando menos una enzima biosintética de trehalosa, tal como, por ejemplo, una trehalosa-6-fosfato sintasa; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones para su uso. La invención proporciona además : Una planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que comprende de preferencia un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, más preferiblemente un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, por ejemplo el promotor PR-la de tabaco, operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica para un transactivador (de preferencia un transactivador que no se presente naturalmente en las plantas, de preferencia una polimerasa de ARN o una proteína de enlace de ADN, por ejemplo la ARN polimerasa de T7) , estando este transactivador opcionalmente fusionado con una secuencia de dirección al plástido, por ejemplo una secuencia de dirección al cloroplasto (por ejemplo, un cásete de expresión expresable en plantas como se describió anteriormente) ; y un cásete de expresión de plástido heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es ARN polimerasa de T7) , y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato fosfatasa; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones para su uso. La invención proporciona además : Una planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que comprende de preferencia un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, más preferiblemente un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, por ejemplo el promotor PR-la de tabaco, operativamente enlazado con una secuencia de ADN que codifica para un transactivador (de prefe-rencia un transactivador que no se presente naturalmente en las plantas, de preferencia una ARN polimerasa o una proteína de enlace de ADN, por ejemplo la ARN polimerasa de T7) , estando este transactivador opcionalmente fusionado con una secuencia de dirección al plástido, por ejemplo una secuencia de direc-ción al cloroplasto (por ejemplo, un cásete de expresión expresable en plantas como se describió anteriormente) ,- y un cásete de expresión de plástido heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuan-do el transactivador es ARN polimerasa de T7) , y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa- 6-fosfato sintasa, y un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es ARN polimerasa de T7) , y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato fosfatasa; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones pa-a su uso.

En una modalidad adicional, la invención abarca la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican trehalosa biosintética en el plástido bajo el control de un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear, o una polimerasa codificada por el plástido. Estos promotores son, por ejemplo, pero no se limitan a, un promotor clpP, un promotor del gen de ARN-r 16S, un promotor psbA, o un promotor rbcL. Por consiguiente, la invención proporciona adicionalmente: Una planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo que comprende de preferencia un promotor capaz de expresar una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas biosintéticas de trehalosa en plástidos de plantas, por ejemplo un pro-motor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, operativamente enlazada con cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa, tal como, por ejemplo, una trehalosa-6-fosfato sintasa; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instruc-cíones para su uso. La invención proporciona además Una planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo que comprende de preferencia un promotor capaz de expresar una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas biosinté-ticas de trehalosa en plástidos de plantas, por ejemplo un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalo-_ sa-6-fosfato fosfatasa; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones para su uso. La invención proporciona además : Una planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo que comprende de preferencia un promotor capaz de expresar una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas biosintéticas de trehalosa en plástidos de plantas, por ejemplo un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato sintasa, y un promotor transcrito por una poli-merasa de ARN normalmente presente en plástido, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-6-fosfato fosfatasa; incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones para su uso. En una modalidad adicional, la invención abarca la expre-sión a partir de un solo promotor, de dos o más genes en plástidos de plantas, en un gen policistrónico de tipo operón. En una modalidad preferida, un gen policistrónico de tipo operón comprende los dos o más genes, por ejemplo los genes que comprendan una secuencia de nucleótidos que codifique una enzima biosintética de trehalosa, operativamente enlazada con un promotor capaz de dirigir la expresión del gen policistrónico de tipo operón en plástidos, y se inserta en el genoma del plástido. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende una secuencia de ADN que interviene entre dos genes en el gen policistrónico de tipo operón, de preferencia una secuencia de ADN que no esté presente en el genoma del plástido. En otra modalidad preferida, la secuencia de ADN que interviene se deriva a partir de la región 5 ' -no traducida (UTR) de un gen no eucariótico de preferencia una 5 'UTR viral, de preferencia una 5' UTR derivada a partir de un fago bacteria-no, tal como un fago T7, T3 , ó SP6. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se modifica para impedir la formación de estructuras secundarias que inhiban o repriman la traducción del g^n localizado inmediatamente corriente abajo de la secuen-cia de ADN que interviene. En una modalidad preferida, se incrementa la expresión, de preferencia la traducción, de los genes localizados inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. Por lo tanto, la invención proporciona además: Una planta que comprende: un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes_ del mismo, que comprende de preferencia un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, más preferiblemente un promotor inducible por ejemplo un promotor induci-ble por herida o químicamente inducible, por ejemplo el promotor PR-la de tabaco, operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador (de preferencia un transactivador que no se presenta naturalmente en las plantas, de preferencia una ARN polimerasa o una proteína de enlace de ADJSr, por ejemplo polimerasa de ARN de T7) , estando este transactivador opcionalmente fusionado con una secuencia de dirección al plástido, por ejemplo una secuencia de dirección al cloroplasto (por ejemplo, un cásete de expresión expresable en plantas como se describió anteriormente) ; y un cásete de expresión de plástido heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es ARN polimerasa de T7) , y operativamente enlazado con un gen policistrónico de tipo operón que comprende cuando menos un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un enzima biosintética de trehalosa. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato sintasa, y un gen que codifica una se-cuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato fosfatasa. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende una secuencia de ADN que interviene entre dos genes en el gen policistrónico de tipo operón, de preferencia una secuencia de ADN que no esté presente en el genoma del plástido. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se deriva a partir de la región 5 ' -no traducida (UTR) de un gen no eucariótico de preferencia una 5 'UTR viral, de preferencia una 5'UTR derivada a partir de un fago bacteriano, tal como un fago T7, T3 , ó SP6. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se modifica para impedir la formación de estructuras secundarias que inhiban o repriman la traducción del gen localizado inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. En una modalidad preferida, se incrementa la expresión, de preferencia la traducción, de los genes lo-calizados inmediatamente corriente abajo de la se-cuencia de ADN que interviene. incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se 'recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones para su uso. La invención proporciona además : Una planta que comprende : un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que de preferencia comprende un promotor capaz de expresar una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa en plástidos de plantas, por ejemplo un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, operativamente enlazada con un gen policistrónico de tipo operón que comprende cuando menos un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato sintasa y un gen que codifica una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato fosfatasa. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende una secuencia de ADN que interviene entre dos genes en el gen policistrónico de tipo operón, de preferencia una secuencia de ADN que no esté presente en el plástido. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se~ deriva a partir de la región 5 ' -no traducida (UTR) de un gen no eucariótico de preferencia una 5 'UTR viral, de preferencia una 5 'UTR derivada a partir de un fago bacteriano, tal como un fago T7, T3 , ó SP6. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se modifica para impedir la formación de estructuras secundarias que inhiban o repriman la traducción del gen localizado inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. En una modalidad preferida, se incrementa la expre-sión, de preferencia la traducción, de los genes localizados inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. incluyendo también la progenie y la semilla para esta planta, cuya semilla opcionalmente se trata (por ejemplo, se ceba o se recubre) y/o se empaca, por ejemplo se coloca en una bolsa u otro recipiente con instrucciones para su uso. La invención proporciona además : Un cásete de expresión expresable en plantas que de preferencia comprende un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, por ejemplo el promotor PR-la de tabaco, operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador (de preferencia un transactivador que no se presente naturalmente en plantas, de preferencia una ARN polimerasa o una proteína de enlace de ADN, por ejemplo una ARN polimerasa de T7) , fusio-nándose este transactivador con una secuencia de dirección al plástido, por ejemplo una secuencia de dirección al cloroplasto; un vector que comprende este cásete expresable en plantas; y una planta transformada con este vector, o una planta transgénica cuyo genoma comprenda este cásete de expresión expresable en plantas. La invención también proporciona: Un cásete de expresión de plástido heterólogo que comprende un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es ARN polimerasa de T7) , y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica cuando menos un enzima biosintética de trehalosa, tal como, por ejemplo, una trehalo-sa-6-fosfato sintasa de y/o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa. La invención también proporciona: Un cásete de expresión de plástido heterólogo que comprende un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica cuando menos una enzima biosintética de trehalosa, tal como, por ejemplo, una trehalosa-6-fosfato sintasa y/o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa.

La invención también proporciona : Un cásete de expresión de plástido heterólogo que comprende un promotor capaz de expresar un gen biosintético de trehalosa en plástidos de plantas, por ejemplo un promotor transcri-to por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, o un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es ARN polimerasa de T7) , operativamente enlazado con un gen policistrónico de tipo operón que comprende secuencias de nucleótidos que codifican ambas enzimas biosintéticas de trehalosa. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende una secuencia de ADN que interviene entre dos genes en el gen policistrónico de tipo operón, de preferencia una secuencia de ADN que no esté presente en el genoma del plástido. En otra modalidad preferida, la secuencia de ADN comprende una porción de la región 5'-no traducida (UTR) de un gen no eucariótico de preferencia una 5 'UTR viral, de preferencia una 5 ' UTR derivada a partir de un fago bacteriano, tal como un fago T7, T3 , ó SP6. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se modifica para impedir la formación de estructuras secundarias que inhiban o repriman la traducción del gen localizado inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. En una modalidad prefe-rida, se incrementa la expresión, de preferencia la traducción, de los genes localizados inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. La invención también comprende : Un método para producir una planta como se describe anteriormente, el cual comprende: polinizar una planta que comprende un cásete de expresión de plástido heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador regulado o operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos de interés, pero de preferencia una secuencia de nucleótidos que codifique cuando menos una enzima biosintética de trehalosa, tal como, por ejemplo, una trehalosa-6-fosfato sintasa y/o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa, con polen de una planta que comprenda un ca-sete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que comprenda un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo, más preferiblemente un promotor inducible, operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifique un transactivador capaz de regular al promotor mediado por transactivador; recuperar la semilla de la planta así polinizada; y cultivar una planta como se describe anteriormente, a partir de esta semilla. La invención proporciona además: Un método para producir trehalosa en plantas, mediante la expresión en esta planta de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el control de cualquiera de los promotores descritos anteriormente, por ejemplo un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida por químicamente inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta, bajo el control de un promotor capaz de expresar esta secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta, o en cualquiera de los casetes de expresión descritos anteriormente . Un método para proteger a la planta contra la sequedad, la alta salinidad, la tensión osmótica, y los extremos de temperatura, mediante la expresión en esta planta de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta, bajo el control de un promotor capaz de expresar la secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta. Un método para incrementar las propiedades de almacenamiento de las plantas cosechadas mediante la expresión en esta planta de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nu-clear de la planta, bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta, bajo el control de un promotor capaz de expresar esta secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta. Un método para mejorar la vida de anaquel de frutas y verduras, y para conservar las flores, mediante la expresión en estas frutas, verduras, y flores, de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta, bajo el control de un promotor capaz de expresar la secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta. Un método para estabilizar las proteínas expresadas en plantas transgénicas mediante la expresión en esta planta de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta bajo el control de un promotor capaz de expresar la secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta. La presente invención proporciona además : Un método para expresar dos o más genes a partir de un so-lo promotor en los plástidos de una planta, el cual comprende introducir en el genoma del plástido de la planta un gen policistrónico de tipo operón que comprende estos dos o más genes operativamente enlazados con un promotor capaz de expresar el gen policistrónico de tipo operón en los plástidos de la planta, en donde el gen policistrónico de tipo operón comprende además una secuencia de ADN que interviene entre dos genes . En una modalidad preferida, una secuencia de ADN no presente en el genoma del plástido. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN comprende una porción de la región 5 ' -no traducida (UTR) de un gen no eucariótico de preferencia una 5 'UTR viral, de preferencia una 5 'UTR derivada a partir de un fago bacteriano, tal como un fago T7, T3 , ó SP6. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN se modifica para impedir la formación de es-tructuras secundarias que inhiban o repriman la traducción del gen localizado inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. En una modalidad preferida, se incrementa la expresión, de preferencia la traducción, de los genes localizados inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende cuando menos un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen biosintético de trehalosa. En otra modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende un gen que comprende una secuencia de núcleo-tidos que codifica una trehalosa-fosfato sintasa, y un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato fosfatasa. La invención proporciona además : Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica o sustancialmente similar a cualquiera de las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 45, 47, 49, ó 51. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente similar a cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 46, 48, 50, ó 52. En una modalidad preferida, la molécula de ADN es idéntica o sustancialmente similar a cualquiera de las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 45, 47, 49, ó 51, o codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente similar a cualquiera de las secuencias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NOs: 46, 48, 50, ó 52. En una modalidad preferida, la molécula de ADN se deriva a partir de una monocotiledónea, de preferencia de maíz. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos codifica un gen biosintético de trehalosa o una porción del mismo, de preferencia una trehalosa-6-fosfato sintasa o una fosfatasa de trehalosa-6-fosfato. La invención proporciona además : Una proteína aislada que comprende un polipéptido codifi-cado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 45, 47, 49, ó 51, o que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente similar a cualquiera de las secuencias de ami-noácidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 46, 48, 50, ó 52. En una modalidad preferida, la proteína es codificada por cualquiera de las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 45, 47, 49, ó 51, o es idéntica o sustancialmente similar a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuen-cias de aminoácidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 46, 48, 50, ó 52. En una modalidad preferida, el polipéptido de preferencia se deriva a partir de una monocotiledónea, de preferencia de maíz. En una modalidad preferida, el polipéptido comprende una enzima biosintética de trehalosa o una porción de la misma, de preferencia una trehalosa- 6-fosfato sintasa o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa. La invención proporciona además : Una planta que comprende un cásete de expresión que comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NOs : 45, 47, 49, ó 51, o una porción de las mismas, en donde esta molécula de ADN se puede expresar en la planta. En una modalidad preferida, el cásete de expresión se integra establemente en el genoma de la planta. En una modalidad preferida, la planta es resistente a las tensiones, de pre-ferencia a la tensión por sequedad, osmótica, y de temperatura.

La invención proporciona además : Un método para reproducir plantas que tienen mayor resistencia a las tensiones, de preferencia a la tensión por sequedad, osmótica, y de temperatura, el cual comprende los pasos de: a) utilizar cualquiera de las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NOs: 45, 47, 49, ó 51, o una porción de las mismas, para identificar un polimorfismo molecular en diferentes variedades de especies de plantas, y b) correlacionar este polimorfismo con una variedad de estas especies de plantas que muestren mayor resistencia a las tensiones, de preferencia a la tensión por sequedad, osmótica, y de temperatura, y c) utilizar este polimorfismo para introducir la resis-tencia a la tensión en una línea deseada de las especies deplantas, mediante técnicas de reproducción convencionales. La invención proporciona además : Una planta obtenida mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en donde la planta es resistente a las tensiones, de preferencia a la tensión por sequedad, osmótica, y de temperatura .

DEFINICIONES Con el objeto de asegurar un entendimiento claro y consis-tente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones: "Resistencia a la sequedad" es un estado fisiológico en donde una planta puede sostener períodos prolongados de tiempo recibiendo menos agua de la que requeriría normalmente o sin regarse, y sin mostrar marchitamiento de sus hojas u otras características de desecación. "Genes" como se utiliza en la presente, comprende una secuencia de nucleótidos opcionalmente enlazada operativamente con las secuencias de ADN precedentes o siguientes a la secuen-cia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos normalmente se puede transcribir en el ARN, tal como por ejemplo, el ARNm (ARN en sentido o ARN anti-sentido) , ARNr, ARNt, ó ARNsn. Una secuencia de nucleótidos en un gen comprende opcionalmente una secuencia de codificación, que se puede traducir en un polipép-tido. Los ejemplos de las secuencias de ADN precedentes o siguientes a la secuencia de nucleótidos son las secuencias no traducidas 5 ' y 3 ' , las señales de terminación, y los sitios de enlace de ribosoma (rbs) , o porciones de los mismos. Los elementos adicionales que también pueden estar presentes en un gen son, por ejemplo, intrones. "Cásete de expresión" , como se utiliza en la presente, significa una construcción de ADN diseñada de tal manera que una secuencia de nucleótidos insertada en la misma se pueda transcribir y, opcionalmente traducir, en una célula hospedera apropiada. El cásete de expresión normalmente comprende ele-mentos reguladores, tales como un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos operativamente enlazado con la secuencia de nucleótidos, el cual está por si mismo opcionalmente enlazado operativamente con las secuencias 3 ' , tales como las secuencias reguladoras 3 ' ó las señales de terminación. El cásete de expresión también puede comprender las secuencias requeridas para una traducción apropiada de una secuencia de codificación comprendida en la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos normalmente comprende la secuencia de codificación de una proteína, pero también puede codificar un ARN funcional de interés, por ejemplo, ARN anti-sentido, o un ARN no traducido que, en la dirección en sentido o anti-sentido, inhiba la expresión de un gen particular, por ejemplo, ARN anti-sentido. El cásete de expresión que compren-de la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, significando que cuando menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a cuando menos otro de sus componentes . El cásete de expresión también puede ser uno que se presente naturalmente, pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Sin embargo, normalmente el cásete de expresión es heterólogo con respecto al hospedero, es decir, la secuencia de ADN particular del cásete de expresión no se presenta naturalmente en la célula hospedera, y debe haberse introducido en la célula hospedera o en un ancestro de la célula hospedera. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el cásete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicie la transcripción solamente cuando se exponga a la célula hospedera a algún estímulo externo particular. En el caso de un organis-mo multicelular, tal como una planta, el promotor también puede ser específico para un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular. Un cásete de expresión nuclear normalmente se inserta en el genoma nuclear de una planta, y es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular a partir del genoma nuclear de la planta. Un cásete de expresión del plástido normalmente se inserta en el genoma del plástido o de una planta, y es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular a partir del genoma del plástido de la planta, por ejemplo, un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, o un promotor mediado por transactivador. Un cásete de expresión de plástido como se describe en la presente, puede comprender opcionalmente un gen policistrónico de ti-po operón. "Elementos reguladores" se refieren a las secuencias de ADN involucradas en la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor operativamente enlazado con la secuencia de nucleótidos de interés, y también pueden incluir regiones no traducidas 5 ' y 3 ' (UTR) , o señales de terminación. También abarcan normalmente las secuencias requeridas para una traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos, tales como, en el caso de la expresión en plástidos, los sitios de enlace de ribosoma (rbs) . "Heterólogo" como se utiliza en la presente, significa "de diferente origen natural", o representa un estado no natural. Por ejemplo, si una célula hospedera se transforma con una secuencia de nucleótidos derivada a partir de otro organismo, particularmente a partir de otra especie, esa secuencia de nucleótidos es heteróloga con respecto a esa célula hospedera, y también con respecto a los descendientes de la célula hospedera que lleven ese gen, de una manera similar, heterólogos se refiere a una secuencia de nucleótidos derivada a partir de, e insertada en, el mismo tipo de célula original natural, pero que está presente en un estado no natural, por ejemplo un número diferente de copias, o bajo el control de diferentes elementos reguladores. Una secuencia de nucleótidos transformante puede comprender una secuencia de codificación heteróloga, o elementos reguladores heterólogos. De una manera alternativa, la secuencia de nucleótidos transformante puede ser completamente heteróloga, o puede comprender cualquier posible combinación de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas y endógenas. "Expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo un gen endógeno o un gen heterólogo, en un organismo hospedero, por ejemplo mi-crobios o plantas. En el caso de las construcciones anti-sentido, por ejemplo, la expresión puede referirse a la transcripción del ADN anti-sentido solamente. Un "gen policistrónico de tipo operón" comprende dos o más genes de interés bajo el control de un solo promotor capaz de dirigir la expresión de este gen policistrónico de tipo operón en plástidos de plantas. Cada gen en un gen policistrónico de tipo operón opcionalmente comprende un sitio de enlace de ribo-soma (rbs) operativamente enlazado con el extremo 5 ' de la se-cuencia de nucleótidos. De preferencia, cada rbs en el gen po-" licistrónico de tipo operón es diferente. El gen policistrónico de tipo operón también comprende normalmente una 5 'UTR operativamente enlazada con el extremo 5 ' del sitio de enlace de ribosoma del primer gen en el gen policistrónico de tipo ope-ron, y una 3 ' UTR operativamente enlazada con el extremo 3' del último gen en el gen policistrónico de tipo operón. Dos genes de un gen policistrónico de tipo operón también pueden comprender varios ácidos nucleicos que se traslapen entre los dos genes . "Ho oplastídico" se refiere a una planta, tejido de planta, o célula de planta en donde todos los plástidos son genéticamente idénticos. Este es el estado normal en una planta cuando los plástidos no se han transformado, mutado, o alterado genéticamente de otra manera. En diferentes tejidos o etapas de desarrollo, los plástidos pueden tomar formas diferentes, por ejemplo cloroplastos, proplástidos, etioplastos, amiloplastos, cromoplastos, etcétera. "Gen marcador" : un gen que codifica un rasgo seleccionable o rastreable. "Promotor inducible" : Un "promotor inducible" es un promotor que inicia la transcripción solamente cuando la planta se expone a algún estímulo externo particular, como se distingue de los promotores constitutivos o los promotores específicos para un tejido u órgano o etapa de desarrollo específica. Se prefieren particularmente para la presente invención los promotores químicamente inducibles y los promotores inducibles por herida. Los promotores químicamente inducibles incluyen promotores derivados de plantas, tales como los promotores en la senda de resistencia sistémica adquirida, por ejemplo los pro-motores PR, por ejemplo los promotores PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, Y PR-5, especialmente el promotor PR-la de tabaco y el promotor PR-1 de Arabidopsis que inician la transcripción cuando se expone la planta a BTH y productos químicos relacionados. Ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,614,395, incorporada a la presente como referencia, y la Publicación Internacional Número WO 98/03536, incorporada a la presente como referencia. Los promotores químicamente inducibles también incluyen sistemas mediados por el receptor, por ejemplo aquéllos derivados de otros organismo, tales como la expresión genética dependiente de esteroide, la expresión genética dependiente de cobre, la expresión genética dependiente de tetraciclina, y particularmente el sistema de expresión que utiliza al receptor USP de Drosophila mediada por hormona de crecimiento juvenil y sus agonistas, descritos en la Patente Europea Número EP-A 0,859,851, incorporada a la presente como referencia, así como los sistemas que utilizan combinaciones de receptores, por ejemplo, como se describen en la Patente Europea Número EP-A 0,813,604 incorporada a la presente como referencia. Los promotores inducibles por herida incluyen promotores para inhibí-dores de proteinasa, por ejemplo el promotor de inhibidor de proteinasa II de papa, y otros promotores derivados de plantas involucrados en las senda de respuesta a heridas, tales como los promotores para las polifeniloxidasas, LAP, y TD. Ver en general C. Gatz, "Chemical Control of Gene Expression", Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. (1997) 4=.: 89-108, cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia. "Operativamente enlazada a/asociada con" : se dice que una secuencia de ADN, por ejemplo que comprenda un elemento regulador, está "operativamente enlazada a" o "asociada con" una se-cuencia de nucleótidos, si las dos secuencias están situadas de tal manera que la secuencia de ADN afecta la expresión de la secuencia de nucleótidos. "Rasgo fenotípico" : una propiedad detectable resultante de la expresión de uno o más genes. "Planta" : Una "planta" se refiere a cualquier planta o parte de una planta en cualquier etapa de desarrollo. En algunas modalidades de la invención, las plantas pueden herirse le-talmente para inducir la expresión, o se pueden inducir para expresar niveles letales de una proteína deseada, y de este mo-do, el término "planta", como se utiliza en la presente, se pretende específicamente para abarcar plantas y material de plantas que se hayan dañado seriamente o se hayan aniquilado, así como plantas viables, recortes, cultivos celulares o de tejido, y semillas. De preferencia, las plantas de la presente invención se distinguen porque son de un desarrollo normal hasta el- punto de la inducción del gen biosintético de trehalosa.

"Célula de planta" : una unidad estructural y fisiológica de la planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula de planta puede estar en la forma de una sola célula aislada o de una célula cultivada, o como una parte de una unidad organizada superior, tal como, por ejemplo, un tejido de planta o un órgano de planta . "Material de planta" : se refiere a las hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutas, polen, tubos políni-cos, óvulos, sacos embriónicos, células de huevo, cigotos, embriones, semillas, plástidos, mitocondrias, recortes, cultivos celulares o de tejido, o cualquier otra parte o producto de una planta . "Promotor" : una secuencia de ADN que inicia la trans-cripción de una secuencia de ADN asociada. La región promotora también puede incluir elementos que actúen como reguladores de la expresión genética, tales como activadores, potenciadores, y/o represores. "Protoplasto" : la célula de la planta aislada, en donde la pared celular se ha removido total o parcialmente. "Molécula de ADN recombinante" : una combinación de secuencias de ADN que se unen entre sí utilizando tecnología de ADN recombinante . "Tecnología de ADN recombinante" : procedimientos utilízados para unir entre sí las secuencias de ADN, como se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. "Gen marcador rastreable" : un gen cuya expresión no confiere una ventaja selectiva a una célula transformada, pero cu-ya expresión hace que la célula transformada sea fenotípicamen-te distinta de las células no transformadas. "Gen marcador seleccionable" : un gen cuya expresión en una célula de planta da a la célula una ventaja selectiva. La ventaja selectiva poseída por las células transformadas con el gen marcador seleccionable puede deberse a su capacidad para crecer en la presencia de un agente selectivo negativo, tal como un antibiótico o un herbicida, comparándose con el crecimiento de las células no transformadas. La ventaja selectiva poseída por las células transformadas, comparándose con las células no transformadas, también puede deberse a su capacidad mejorada o novedosa para utilizar un compuesto agregado como un nutriente, factor de crecimiento, o fuente de energía. El gen marcador seleccionable también se refiere a un gen o a una combinación de genes cuya expresión en una célula de planta da a la célula tanto una ventaja selectiva negativa como positiva. En su sentido más amplio, el término "sustancialmente similar" , cuando se utiliza en la presente con respecto a una secuencia de nucleótidos, significa una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos de referencia, en donde la secuencia correspondiente codifica un polipéptido que tiene sustancialmente la misma estructura y función que el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia, por ejemplo, en donde solamente se presentan cambios en los aminoácidos que no afectan a la función del polipéptido. Deseablemente, la secuencia de nucleótidos sustancialmente similar codifica el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. El porcentaje de identidad entre la secuencia de nucleótidos sustancialmente similar y la secuencia de nucleótidos de referencia deseablemente es cuando menos del 80 por ciento, más deseablemente de cuando menos el 85 por ciento, de preferencia de cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 95 por ciento, y todavía más preferiblemente de cuando menos el 99 por ciento. Se realizan comparaciones de secuencias utilizando un algoritmo de alinea-miento de secuencia de Smith-Waterman (ver, por ejemplo, Water-man, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps sequences and genomes. Chapman & Hall. Londres: 1995. ISBN 0-412-99391-0, o en http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/iridex.html. ) . Se utiliza el programa locáis, versión 1.16, con los siguientes parámetros: concordan-cia: 1, pena por mala concordancia: 0.33, pena por hueco abierto: 2, pena por hueco extendido: 2. Una secuencia de nucleótidos "sustancialmente similar" a la secuencia de nucleótidos de referencia, se híbrida en la secuencia de nucleótidos de referencia en dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS) , Na3P04 0.5 M, EDTA lmM a 50 °C, con lavado en SSC 2X, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, más deseablemente en dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), Na3P0 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en IX SSC, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, más deseablemente todavía en dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS) , Na3P04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50 °C, con lavado en SSC 0.5X, SDS al 0.1 por ciento a 50 °C, de preferencia en dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), Na3P04 0.5 M, EDTA lmM a 50°C, con lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, más preferiblemente en dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), Na3P04 0.5 M, EDTA 1 mM al 50°C, con lavado en SSC 0. IX, SDS al 0.1 por ciento a 65°C. El término "sustancialmente similar", cuando se utiliza en la presente con respecto a una proteína, significa una proteína correspondiente a una proteína de referencia, en donde la pro-teína tiene sustancialmente la misma estructura y función que la proteína de referencia, por ejemplo, en donde solamente se presentan cambios en los aminoácidos que no afectan a la función del polipéptido. Cuando se utiliza para una proteína o una secuencia de aminoácidos, el porcentaje de identidad entre la proteína o la secuencia de aminoácidos sustancialmente similar y la de referencia, deseablemente es de cuando menos el 80 por ciento, más deseablemente del 85 por ciento, de preferencia de cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 95 por ciento, y todavía más preferiblemente de cuando menos el 99 por ciento. "Transactivador" : Un "transactivador" es una proteína que, por sí misma o en combinación con una o más proteínas adicionales, es capaz de ocasionar la transcripción de una región codificadora bajo el control de un promotor mediado por tran-sactivador correspondiente. Los ejemplos de los sistemas transactivadores incluyen al promotor del gen 10 del fago T7, cuya activación de transcripción depende de una ARN polimerasa específica, tal como ARN la polimerasa del fago T7. El transactivador es normalmente una ARN polimerasa o una proteína de enla-ce de ADN capaz de interactuar con un promotor particular para iniciar la transcripción, ya sea mediante la activación del promotor directamente, o mediante la inactivación de un gen represor, por ejemplo, mediante la supresión de la expresión o acumulación de una proteína represora. La pro-teína de enlace de ADN puede ser una proteína quimérica que comprenda una región de enlace (por ejemplo, la región de enlace GAL4) enlazada con un dominio activador de transcripción apropiado. Algunos sistemas transactivadores pueden tener múltiples transactivadores, por ejemplo, promotores que requieran no solamente de una polimerasa, sino también de una subunidad específica (factor sigma) para el reconocimiento del promotor, el enlace del ADN, o la activación de la transcripción. El transactivador de preferencia es heterólogo con respecto a la planta. "Transformación" : La introducción de una secuencia de nucleótidos en una célula. En particular, la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés . "Enzimas biosintéticas de trehalosa" , son polipéptidos in-volucrados en la biosíntesis de trehalosa a partir de glucosa, por ejemplo, como se describe en la presente, particularmente la sintasa de trehalosa-6-fosfato que cataliza la condensación de UDP-glucosa y glucosa-6-fosfato en trehalosa-6-fosfato o fosfatasa de trehalosa-6-fosfato, que fosforila la trehalosa-6-fosfato para obtener trehalosa. Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas biosintéticas de trehalosa están comprendidas en los genes biosintéticos de trehalosa. "Trehalosa" es una D-glucopiranosil- [1, 1] -D-glucopiranosida. La forma preferida de la trehalosa en la presente in-vención es a, a-trehalosa (a-D-glucopiranosil- [1, 1] -a-D-glucopiranosida) La presente invención también abarca células que comprenden una molécula de ADN de la presente invención, en donde la molécula de ADN no está en su medio ambiente celular natural. En una modalidad preferida, estas células son células de plantas. En otra modalidad preferida, una molécula de ADN de la presente invención se puede expresar en estas células, y está comprendida en un cásete de expresión que permite su expresión en estas células. En una modalidad preferida, el cásete de expresión se integra establemente en el ADN de la célula hospedera. En otra modalidad preferida, el cásete de expresión está comprendido en un vector, que es capaz de replicarse en la célula, y permanece en la célula como una molécula extracromosó-mica. La presente invención también abarca una planta que comprende las células de planta descritas anteriormente. En una modalidad adicional, las moléculas de ADN de la presente invención se pueden expresar en la planta, y la expresión de cual-quiera de las moléculas de ADN de la presente invención, o de una porción funcional o derivado de la misma, en plantas transgénicas, confiere la producción de trehalosa, y conduce a tolerancia a la sequedad, mejor calidad del alimento, altos niveles de trehalosa útiles para la producción industrial, y otras ca-racterísticas como se describen en la presente. La presente invención, por consiguiente, también abarca plantas transgénicas que expresan trehalosa debido a la expresión de cualquiera de las moléculas de ADN de la presente invención, o de una porción funcional o derivado de las mismas . Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas, e incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, cebada, centeno, camote, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, col, coliflor, bróco-li, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, chayóte, calabaza, cáñamo, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, chabacano, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, pina, aguacate, papaya, mango, plátano, frijol de soya, jitomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, papa, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana, y plantas leñosas, tales como árboles coniferos y deciduos . Se prefieren las plantas monocotiledóneas seleccionadas a partir del grupo que consiste en maíz, trigo, cebada, centeno, sorgo, y arroz. Además se prefieren las plantas dicotiledóneas seleccionadas a partir del grupo que consiste en achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, pimiento, chayóte, calabaza, calabacín, melón, frijol de soya, jitomate, caña de azúcar, remolacha azuca-rera, girasol, semilla de colza, algodón, y alfalfa.

Una vez que se ha transformado una secuencia de nucleótidos deseada en una especie de planta particular, se puede propagar en esa especie, o se puede mover hacia otras variedades de la misma especie, incluyendo particularmente las variedades comerciales, utilizando técnicas de reproducción tradicionales, por ejemplo mediante reproducción de selección recurrente, como la retrocruza. En este caso, el progenitor recurrente en donde se va a introducir el transgen deseado se cruza primero con el progenitor no recurrente que lleve el transgen en cuestión. Luego la progenie de esta cruza se acopla de regreso con el progenitor recurrente, seguido por selección en la progenie resultante del transgen que se va a transferir desde el progenitor no recurrente. Después de 3 , y de preferencia 4, más preferiblemente 5 ó más generaciones de retrocruzas con el proge-nitor recurrente, con selección del transgen, la progenie será heterocigótica para el transgen que se esté transfiriendo, pero será como el progenitor recurrente para la mayoría o casi todos los demás genes . Para su expresión en plantas transgénicas, las moléculas de ADN pueden requerir de una modificación y optimización, particularmente cuando las moléculas de ADN sean de origen procariótico. En la técnica se sabe que todos los organismos tienen preferencias específicas para el uso de codones, y los codones en la secuencia de nucleótidos comprendida en las moléculas de ADN de la presente invención se pueden cambiar para conformarse con las preferencias específicas de la planta, mientras que se mantengan los aminoácidos codificados por la misma. Además, se logra mejor una alta expresión en plantas a partir de secuencias de codificación que tengan cuando menos un contenido del 35 por ciento de GC, y de preferencia más del 45 por ciento. Las secuencias de nucleótidos que tienen bajos contenidos de GC, pueden expresarse pobremente, debido a la existencia de motivos ATTTA, que pueden desestabilizar los mensajes, y motivos AATAAA que pueden ocasionar una poliadenilación inapropiada. Aunque se pueden expresar adecuadamente las secuencias genéticas preferidas en especies de plantas tanto en monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para tomar en cuenta las preferencias de codones específicas y las preferencias de contenido de GC de las monocotiledóneas o las dicotiledóneas, como se ha mostrado que difieren estas preferencias (Murray y colaboradores, Nucí. Acids Res. 17:477-498 (1989) ) . En adición, las secuencias de nucleótidos se rastrean para determinar la existencia de sitios de empalme ilegítimos que ocasionen truncamiento de mensajes. Todos los cambios que se requieran hacer adentro de las secuencias de nucleótidos, tales como aquéllos descritos anteriormente, se hacen utilizando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, reacción en cadena de la polimerasa, y construcción genética sintética, utilizando los métodos descritos en las Solicitudes de Patente Publicadas Números EP 0,385,962 (a Monsanto), EP 0,359,472 (a Lubrizol), y WO 93/07278 (a Ciba-Geigy). Para un inicio eficiente de la traducción, las secuencias adyacentes a la metionina de inicio pueden requerir modificación. Por ejemplo, se pueden modificar mediante la inclusión de secuencias que se sepan que son efectivas en plantas. Joshi ha sugerido un consenso apropiado para plantas (NAR 15: 6643-6653 (1987) ) y Clontech sugiere un iniciador de traducción en consenso adicional (catálogo de 1993/1994, página 210). Estos consensos son adecuados para utilizarse con las secuencias de nucleótidos de esta invención. Las secuencias se incorporan en construcciones que comprendan a la secuencia de nucleótidos, hasta e incluyendo el ATG (mientras que se deja el segundo aminoácido sin modificar) , o alternativamente hasta e incluyendo el GTC subsecuente al ATG (con la posibilidad de modificar el segundo aminoácido del transgen) . En las plantas transgénicas, las moléculas de ADN de la presente invención, por ejemplo los genes biosintéticos de trehalosa, o los genes que codifican un transactivador, se im-pulsan mediante un promotor que se muestre que es funcional en plantas . La elección del promotor variará dependiendo de los requerimientos temporales y espaciales para la expresión, y también dependiendo de la especie blanco. Aunque se ha demostrado que muchos promotores a partir de dicotiledóneas son operativos en monocotiledóneas y viceversa, idealmente se selec-cionan los promotores dicotiledóneos para la expresión en di-cotiledóneas, y los promotores monocotiledóneos para la expresión en monocotiledóneas. Sin embargo, no hay restricción alguna sobre de dónde provengan los promotores seleccionados; es suficiente que operen para impulsar la expresión de las molécu-las de ADN en la célula deseada. Los promotores preferidos que se expresan constitutivamente incluyen los promotores 35S y 19S de CaMV, los promotores a partir de genes que codifican actina o ubiquitina, y los promotores derivados a partir de Agrobacterium, por ejemplo los pro-motores sintéticos descritos en la Publicación del TCP Número PCT/US94/12946. Sin embargo, las moléculas de ADN de esta invención de preferencia se expresan bajo la regulación de promotores que se regulen químicamente. Esto hace posible que se sintetice la trehalosa solamente cuando las plantas de cultivo se traten con los productos químicos inductores, eliminando de esta manera las anormalidades de desarrollo en las plantas jóvenes. La tecnología preferida la inducción química de la expresión genética se detalla en la Solicitud Publicada Número EP-A-0,332, 104 (a Ciba-Geigy), y la Patente de los Estados Uni-dos de Norteamérica Número 5,614,395. Un promotor preferido para la inducción química es el promotor PR-la de tabaco. Una segunda categoría preferida de promotores inducibles es aquélla que es inducible por herida, que permite la expresión de las enzimas biosintéticas de trehalosa cuando se lesio-na la planta, por ejemplo en la cosecha, o en el ensilaje, o en otro procesamiento. Se han descrito numerosos promotores que se expresan en los sitios de la herida. Los promotores preferidos de esta clase incluyen aquéllos descritos por Stanford y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu y cola-boradores Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann y colaboradores Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek y colaboradores, Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), y Warner y colaboradores, Plant J. 3: 191-201 (1993) . Los patrones de expresión específicos del tejido preferidos incluyen el específico del tejido verde, el específico de la raíz, el específico del tallo y el específico de la flor. Los promotores adecuados para la expresión en el tejido verde incluyen muchos que regulan los genes involucrados en la foto-síntesis, y muchos de éstos se han clonado tanto a partir de monocotiledóneas como de dicotiledóneas. Un promotor preferido es el promotor PEPC de maíz a partir del gen de fosfoenol-carboxilasa (Hudspeth y Gruía, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989) ) . Un promotor preferido para la expresión específica de la raíz es aquél descrito por de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991); Patente Europea Número EP- 0,452,269 a Ciba-Geigy), y un promotor específico de la raíz preferido adicional es aquél a partir del gen T-l proporcionado por esta invención. Un promotor específico del tallo preferido es aquél descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,625,136 (a Ciba-Geigy) , y que impulsa la expresión del gen trpA de maíz. En adición a la selección de un promotor adecuado, las construcciones para la expresión de la proteína en las plantas ocasionalmente requieren de un terminador de transcripción apropiado, para unirse corriente abajo de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Hay varios de estos terminadores disponibles que se conocen en la técnica (por ejemplo, tml a partir de CaMV, E9 a partir de rbcS) . Se puede utilizar cualquier terminador disponible que se sepa que funcione en plantas en el contexto de esta invención. Se pueden incorporar otras numerosas secuencias en los casetes de expresión para las moléculas de ADN de esta invención. Estas incluyen secuencias que hayan mostrado mejorar la expresión, tales como secuencias de intro-nes (por ejemplo a partir de Adhl y bronzel) , y secuencias líder virales (por ejemplo, a partir de TMV, MCMV y AMV) . Puede ser preferible dirigir la expresión de las moléculas de ADN hacia diferentes localizaciones celulares en la planta. En algunos casos, puede ser deseable la localización en el ci-tosol, mientras que en otros casos, se puede preferir la localización en algún organelo subcelular. La localización subce-lular de las enzimas codificadas por el transgen se puede emprender utilizando técnicas bien conocidas en este campo. Normalmente, se manipula el ADN que codifica el péptido blanco a partir de un producto genético dirigido al organelo conocido, y se fusiona corriente arriba de la secuencia de nucleótidos. Se conocen muchas de estas secuencias blanco para el cloroplasto, y se ha demostrado su funcionamiento en las construcciones heterólogas. Una clase preferida de secuencias de dirección es la de las secuencias de dirección a la vacuola, por ejemplo, como se encuentran en las quitinasas y proteasas de plantas. Los vectores adecuados para la transformación de plantas se describen en cualquier otra parte de esta memoria descriptiva. Para la transformación mediada por Agrobacterium, son ade-cuados los vectores binarios o los vectores que lleven cuando menos una secuencia límite de ADN-T, mientras que para la transferencia genética directa, es adecuado cualquier vector, y se puede preferir el ADN lineal que contenga solamente la construcción de interés. En el caso de la transferencia genética directa, se puede utilizar la transformación con una sola especie de ADN, o una co-transformación (Schocher y colaboradores, Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)). Tanto para la transferencia genética directa como para la transferencia mediada por Agrobacterium, la transformación normalmente (pero no necesa-riamente) se emprende con un marcador seleccionable que pueda proporcionar resistencia a un antibiótico (Kanamicina, higromicina, o metotrexato) , o a un herbicida (Basta) . Sin embargo, la elección del marcador seleccionable no es crítica para la invención. En otra modalidad preferida, las moléculas de ADN de esta invención se transforman directamente en el genoma del plástido. La tecnología de transformación del plástido se describe extensamente en las Patentes de Estados Unidos de Norteamérica Números 5,451,513; 5,545,817; 5,545,818, y 5,576,198; en las Solicitudes del TCP Números WO 95/16783 y WO 97/32977; y en McBride y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 7301-7305 (1994) , todos los cuales se incorporan a la presente como referencia. La transformación del plástido por medio de bio-lística se logró inicialmente en el alga verde unicelular Chla-mydomonas reinhardtii (Boynton y colaboradores (1988) Science 240: 1534-1537, incorporado a la presente como referencia), y este planteamiento, utilizando la selección para los lugares de resistencia antibióticos de acción cis (resistencia a la espec-tinomicina/estreptomicina) , o el complemento de los fenotipos mutantes no fotosintéticos, se extendió pronto hasta Nicotiana tabacum (Svab y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci.

EUA, 87: 8526-8530, incorporado a la presente como referencia) .

La técnica básica para la transformación del plástido de tabaco involucra el bombardeo con partículas de la hoja o del tejido del cayo, o recuperación mediada por PEG del ADN del plásmido en protoplastos con regiones de ADN del plástido clonado flanqueando un marcador de resistencia a antibiótico seleccionable. Las regiones de flanqueo de 1 a 1.5 kb, denominadas secuencias de dirección, facilitan la recombinación homólo-ga con el genoma del plástido, y por lo tanto, permiten el re-emplazo o la modificación de regiones específicas del genoma del plástido de tabaco de 156 kb . Inicialmente, se utilizaron mutaciones puntuales en el ADNr del plástido 16S, y los genes rpsl2 que confieren resistencia a espectinomicina y/o estrepto-micina, como marcadores seleccionables para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87, 8526-8530; Staub, J. M. , y Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45, incorporados a la presente como referencia) . Esto dio como resultado transformantes homoplásticos es-tables a una frecuencia de aproximadamente 1 por 100 bombardeos de hojas blanco. La presencia de sitios de clonación entre estos marcadores permitió la creación de un vector de dirección al plástido para la introducción de genes extraños (Staub, J.M. y Maliga, P., EMBO J. 12: 601-606 (1993), incorporado a la pre-senté como referencia) . Se obtuvieron incrementos sustanciales en la frecuencia de transformación mediante el reemplazo del ARNr recesivo o de los genes de resistencia a antibióticos de proteína-r con un marcador seleccionable dominante, el gen aadA bacteriano que codifica la enzima destoxificante de espectino-micina, aminoglicósido-3 ' -adeniltransferasa (Svab, Z., y Maliga P. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90, 913-917, incorporado a la presente como referencia) . Anteriormente, este marcador se había utilizado con éxito para la transformación de alta frecuencia del genoma del plástido del alga verde Chl mydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont . M. (1991) Nucí. Acids Res. 19, 4083-4089, incorporado a la presente como referencia) . Recientemente, se ha obtenido la transformación del plástido de protoplastos a partir de tabaco y del moho Physcomi trella pa-tens, utilizando la recuperación del ADN mediada por polieti-lenglicol (PEG) (O'Neill y colaboradores (1993) Plant J. 3: 729-738; Koop y colaboradores (1996) Planta 199: 193-201, ambos de los cuales se incorporan a la presente como referencia) . Tanto el bombardeo de partículas como la transformación del protoplasto son apropiados en el contexto de la presente inven-ción. Se inserta una molécula de ADN de la presente invención en un cásete de expresión del plástido que comprenda un promotor capaz de expresar la molécula de ADN en plástidos de plantas. Un promotor preferido capaz de expresarse en un plástido de planta, es un promotor aislado a partir de la región de flanqueo 5' corriente arriba de la región codificadora de un gen del plástido, que puede provenir de la misma o de una especie diferente, y cuyo producto nativo normalmente se encuentra en la mayoría de los tipos de plástidos, incluyendo aquéllos pre-sentes en los tejidos no verdes. La expresión genética en el plástido difiere de la expresión genética nuclear, y está relacionada con la expresión genética en procariotes (descrita en Stern y colaboradores (1997) Trends in Plant Sciences 2: 308-315, incorporado a la presente como referencia) . Los promotores de plástidos generalmente contienen los elementos -35 y -10 tí-picos de los promotores procarióticos, y algunos promotores de plástido son reconocidos por una polimerasa de ARN de tipo E. coli en su mayor parte codificada en el genoma del plástido, y se denominan promotores PEP (ARN polimerasa codificada por el plástido) , mientras que otros promotores de plástido son reconocidos por una ARN polimerasa de codificación nuclear (promotores NEP) . Ambos tipos de promotores del plástido son adecuados para la presente invención. Los ejemplos de los promotores de plástido son los promotores de los genes clpP, tales como el promotor de gen clpP de tabaco (Publicación Internacional Número WO 97/06250, incorporada a la presente como referencia), y el promotor del gen clpP de Arabidopsis . Otro promotor que es capaz de expresar una molécula de ADN en plástidos de plantas proviene de la región reguladora del operón del ARN ribosomal del plástido 16S (Harris y colaboradores, Microbiol, Rev. 58:700-754 (1994), Shinozaki y colaboradores, EMBO J. 5:2043-2049 (1986), ambos de los cuales se incorporan a la presente como referencia) . Otros ejemplos de promotores que son capaces de expresar una molécula de ADN en plás-tidos de plantas, son un promotor psbA o un promotor rbcL. Un cásete de expresión del plástido también de preferencia comprende además una secuencia no traducida 3 ' (3 ' UTR) del gen del plástido, operativamente enlazada con una molécula de ADN de la presente invención. El papel de las secuencias no tradu-cidas de preferencia es dirigir el procesamiento 3 ' del ARN transcrito, en lugar de la terminación de la transcripción. De preferencia, la 3 'UTR es una secuencia no traducida 3' del gen rpsl6 del plástido, o la secuencia no traducida 3 ' del gen psbA del plástido de Arabidopsis . En una modalidad preferida adi-cional, un cásete de expresión del plástido comprende un tramo poli-G en lugar de una secuencia no traducida 3' . Un cásete de expresión del plástido también comprende de preferencia además una secuencia no traducida 5' (5 'UTR) funcional en plástidos de plantas, operativamente enlazada con una molécula de ADN de la presente invención. — Un cásete de expresión del plástido está comprendido en un vector de transformación de plástido, que de preferencia comprende además regiones de flanqueo para integrarse el genoma del plástido mediante recombinación homologa. El vector de transformación del plástido opcionalmente puede comprender cuando menos un origen de réplica del plástido. La presente invención también abarca un plástido de planta transformado con este vector de transformación del plástido, en donde la molécula de ADN se puede expresar en el plástido de la planta. La invención también abarca una planta o célula de planta, incluyendo su progenie, que comprenda este plástido de planta. En una modalidad preferida, la planta o la célula de planta, incluyendo su progenie, es homoplásmica para los plástidos transgénicos . Otros promotores que son capaces de expresar una molécula de ADN en plástidos de plantas, son los promotores regulados por transactivador, de preferencia heterólogos con respecto a la planta o al organelo subcelular o componente de la célula de planta en donde se efectúe la expresión. En estos casos, la mo-lécula de ADN que codifica el transactivador se inserta en un cásete de expresión nuclear apropiado que se transforma en el ADN nuclear de la planta. El transactivador se dirige a los plástidos utilizando un péptido de tránsito del plástido. El transactivador y la molécula de ADN impulsada por el transacti-vador, se junta, ya sea cruzándose con una línea transformada por el plástido seleccionada, una línea transgénica que contenga una molécula de ADN que codifique el transactivador complementado con una secuencia de dirección al plástido y operativamente enlazada con un promotor nuclear, o mediante la transfor-mación directa de un vector de transformación del plástido que contenga la molécula de ADN deseada en una línea transgénica que contenga una molécula de ADN que codifique el transactivador complementado con una secuencia de dirección al plástido, y operativamente enlazada con un promotor nuclear. Si el promo-tor nuclear es un promotor inducible, en particular un promotor químicamente inducible, se activa la expresión de la molécula de ADN en los plástidos de las plantas mediante aplicación foliar de un inductor químico. Este sistema de expresión del plástido mediada por el transactivador inducible de preferencia se puede regular estrechamente, sin una expresión detectable antes de la inducción, y una expresión y acumulación excepcio-nalmente altas de la proteína enseguida de la inducción. Un transactivador preferido es, por ejemplo, la ARN polimerasa viral. Los promotores preferidos de este tipo son los promotores reconocidos por una sola subunidad de ARN polimerasa, tal como el promotor del gen 10 de T7, que es reconocido por la ARN polimerasa dependiente del ADN del bacteriófago T7. El gen que codifica la polimerasa T7 de preferencia se transforma en el genoma nuclear, y la polimerasa T7 se dirige hacia los plásti-dos utilizando un péptido de tránsito del plástido. Los promotores adecuados para la expresión nuclear de un gen, por ejemplo un gen que codifique una ARN polimerasa viral, tal como la polimerasa T7, se describen anteriormente o posteriormente. La expresión de las moléculas de ADN en los plástidos puede ser constitutiva o puede ser inducible. La expresión de las moléculas de ADN en los plástidos también puede ser específica del órgano o del tejido. Estas diferentes modalidades se describen extensamente en la Publicación Internacional Número WO 98/11235, incorporada a la presente como referencia. Por con-siguiente, en un aspecto, la presente invención ha acoplado la expresión en el genoma nuclear de una ARN polimerasa del fago T7 dirigida al cloroplasto bajo el control del promotor PR-la químicamente inducible (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,614,395 incorporada como referencia) de ta-baco, con un transgen reportero del cloroplasto regulado por las secuencias promotora/terminadora del gen 10 de T7. Por ejemplo, cuando los transformantes del plástido, homoplásmicos para los genes de biosíntesis de trehalosa maternamente heredados, se polinizan con líneas que expresan la polimerasa T7 en el núcleo, se obtienen las plantas Fl que llevan ambas construcciones del transgen, pero que no las expresan. Se desencadenan la síntesis de grandes cantidades de proteína enzimáticamente activa en plástidos de estas plantas solamente después de la aplicación foliar del compuesto inductor PR-la, S-metiléster del ácido benzo (1, 2 , 3) tiadiazol-7-carbotioico (BTH) . En una modalidad preferida, se transcriben dos o más genes, por ejemplo genes biosintéticos de trehalosa, a partir del genoma del plástido de un solo promotor en un gen policistrónico de tipo operón. En una modalidad preferida, el gen policistrónico de tipo operón comprende una secuencia de ADN que interviene entre dos genes en el gen policistrónico de tipo operón. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN no está presente en el genoma del plástido para evitar la recombinación homologa a conse-cuencia del plástido. En otra modalidad preferida, la secuencia de ADN se deriva a partir de la región no traducida 5 ' (UTR) de un gen no eucariótico, de preferencia a partir de una 5 'UTR viral, de preferencia a partir de una 5 'UTR derivada de un fago bacteriano, tal como un fago T7, T3 ó SP6. En una mo-dalidad preferida, la secuencia de ADN se modifica para impedir la formación de estructuras secundarias de ARN en una transcripción de ARN del gen policistrónico de tipo operón, por ejemplo, entre la secuencia de ADN y el sitio de enlace a ribo-soma del gen corriente abajo. Estas estructuras secundarias inhibirían o reprimirían la expresión del gen corriente abajo, particularmente el inicio de su traducción. Estas estructuras secundarias de ARN se predicen determinando sus temperaturas de fusión, utilizando modelos y programas de computación, tales como el programa "mfoíd" , versión 3 (por Zuker y Turner, Wa-shington University School of Medicine, St-Louis, MO) , y otros métodos bien conocidos por un experto en la materia. Esta secuencia de ADN se ejemplifica más adelante. La presencia de la secuencia de ADN que interviene en el gen policistrónico de tipo operón, incrementa la accesibilidad del sitio de enlace de ribosoma del gen corriente abajo, dando como resultado de esta manera más altos índices de expresión.-Esta estrategia es aplicable a cualesquiera dos o más genes que se vayan a transcribir desde el genoma del plástido a partir de un solo promotor en un gen quimérico de tipo operón. Estos genes pueden ser parte de una senda metabólica, o son genes que codifican rasgos de entrada o de salida. Los ejemplos de las sendas metabólicas son, por ejemplo, las rutas biosintéticas del azúcar, tales como trehalosa o fructanos. En una modalidad adicional, las moléculas de ADN de la presente invención se modifican mediante la incorporación de mutaciones aleatorias en una técnica conocida como recombinación in vi tro, o mezcla del ADN. Esta técnica se describe en Stemmer y colaboradores, Nature 370: 389-391 (1994) y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,605,793, incorporados a la presente como referencia. Se producen millones de copias mutantes de las secuencias de nucleótidos basándose en la secuencia de nucleótidos original descrita en la presente, y se recuperan las variantes con propiedades mejoradas, tales como una mayor actividad o una especificidad altérada. El método abarca formar un polinucleótido de doble cadena mutagenizado a partir de un polinucleótido de doble cadena de plantilla que comprenda a la secuencia de nucleótidos de esta invención, en donde el polinucleótido de doble cadena de plantilla se haya disociado en fragmentos de doble cadena aleato-rios de un tamaño deseado, y comprende los pasos de agregar a la población resultante de fragmentos aleatorios de doble cadena uno o más oligonucleótidos de una sola cadena o de doble cadena, en donde estos oligonucleótidos comprenden un área de identidad y un área de heterología con el polinucleótido de plantilla de doble cadena; desnaturalizar la mezcla resultante de fragmentos aleatorios de doble cadena y oligonucleótidos en fragmentos de una sola cadena; incubar la población resultante de fragmentos de una sola cadena con una polimerasa bajo condiciones que den como resultado el templado de los fragmentos de una sola cadena en las áreas de identidad, para formar pares de fragmentos templados, siendo estas áreas de identidad suficientes para que un miembro de un par cebe la réplica del otro, formando de esta modo un polinucleótido de doble cadena mutage-nizado; y repetir los segundo y tercer pasos por cuando menos dos ciclos adicionales, en donde la mezcla resultante en el segundo paso de un ciclo adicional incluya al polinucleótido de doble cadena mutagenizado desde el tercer paso del ciclo anterior, y el ciclo adicional forma un polinucleótido de doble cadena mutagenizado adicional. En una modalidad preferida, la concentración de una sola especie de fragmento aleatorio de doble cadena en la población de fragmentos aleatorios de doble cadena, es menor del 1 por ciento en peso del ADN total. En una modalidad preferida adicional, el polinucleótido de doble cadena de plantilla comprende cuando menos 100 especies de po-linucleótidos . En otra modalidad, el tamaño de los fragmentos aleatorios de doble cadena es de aproximadamente 5 pares de ba--ses a 5 kilobases. En una modalidad adicional, el cuarto paso del método comprende repetir el segundo y el tercer paso por cuando menos 10 ciclos. Hay numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas, y los genes de esta invención se pueden utilizar en conjunto con cualquiera de estos vectores. La selección del vector a utilizar dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie blanco para la trans-formación. Para ciertas especies blanco, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibiótico o de herbicida. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen al gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados (Messing & Vie-rra, Gene 19: 259-268 (1982) ; Bevan y colaboradores, Nature 304 : 184-187 (1983) ) , el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y colaboradores, Nucí. Acids Res 18.: 1062 (1990) , Spencer y colaboradores Theor Appl Genet 79.: 625-631 (1990) ) , el gen hpt que confiere resistencia al an-tibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931) , y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis y colaboradores, EMBO J. 2 (7) : 1099-1104 (1983) ) . Hay muchos vectores disponible para la transformación uti-lizando Agrobacterium tumefaci ens . Estos llevan normalmente cuando menos una secuencia límite de ADN-T, e incluyen los vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids Res (1984)) y pXYZ . Más adelante se describe la construcción de dos vectores típicos. Construcción de pCIB200 y pCIB2001: Los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 se utilizan para la construcción de vectores recombinantes para utilizarse con Agrobacterium, y se construyeron de la siguiente manera. Se creo pTJS75kan mediante digestión con NarI de pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol 164 : 446-455 (1985) ) permitiendo la separación del gen de resistencia a tetraciclina, seguido por inserción de un fragmento Accl a partir de pUC4K que lleva un NPTII (Messing & Viera, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan y colaboradores, Nature 304: 184-187 (1983) ; McBride y colaboradores, Plant Molecular Biology 14.: 266-276 (1990) ) . Los enlazadores Xhol se ligaron con el fragmento EcoRV de pCIB7, que contiene los límites de ADN-T izquierdo y derecho, un gen quimérico nos/nptll y seleccionable en la planta, y el polienlazador pUC (Rothstein y colaboradores, Gene 5_3: 153-161 (1987)), y el fragmento digerido con Xhol se clonó en pTJS75kan digerido con Salí para crear el pCIB200 (ver también la Patente Europea Número EP 0,332,104, ejemplo 191) . pCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción de polienlazador únicos: EcoRI , Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal, y Salí. pCIB2001 es un derivado de pCIB200, que se creo mediante la inserción en el polienlazador de sitios de restricción adicionales. Los sitios de restricción únicos en el polienlazador de pCIB2001 son EcoRI, Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal, Salí, Mlul, BcII, Avrll, Apal , Hpal, y Stul. pCIB2001, en adición a contener estos sitios de restricción únicos, también tiene selección de kanamicina en plantas y en bacterias, los límites de ADN-T izquierdo y derecho para la transformación mediada por Agrobacterium, la función trfA derivada de RK2 para la movilización entre E. coli y otros hospederos, y la funciones OriT y OriV también a partir de RK2. El polienlazador pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión en plantas que contengan sus propias señales reguladoras . Construcción de pCIBlO y Derivados de Selección de Higromicina del Mismo : El vector binario pCIBlO contiene un gen que codifica resistencia a la kanamicina para la sección en plan-tas, las secuencias límite de derecha a izquierda del ADN-T, e incorpora secuencias a partir del plásmido de amplio rango de hospederos pRK252, que le permiten replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su construcción es descrita por Rothstein y colaboradores (Gene 53: 153-161 (1987)). Se han construido diferentes derivados de pCIBlO que incorporan al gen para la fosfotransferasa de higromicina B descrita por Gritz y colaboradores (Gene 25.: 179-188 (1983)). Estos derivados hacen posible la selección de células de plantas transgénicas solamente sobre higromicina (pCIB743) , o sobre higromicina y kana-micina (pCIB715, pCIB717) . La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens circunviene el requerimiento de secuencias de ADN-T en el vector de transformación seleccionado, y en consecuencia, se pueden utilizar vectores que carezcan de estas secuencias en adi-ción a vectores tales como aquéllos descritos anteriormente, que contengan secuencias de ADN-T. Las técnicas de transformación que no se apoyan en Agrobacterium incluyen transformación mediante bombardeo de partículas, recuperación del protoplasto (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende en gran parte de la selección pre-ferida para la especie que se esté transformando. Más adelante se describe la construcción de algunos vectores típicos. Construcción de pCIB3064: pCIB3064 es un vector derivado de pUC adecuado para las técnicas de transferencia genética di-recta en combinación con la selección por el herbicida Basta (o fosfinotricina) el plásmido pCIB246 comprende al promotor 35S de CaMV en fusión operativa con el gen GUS de E. coli y el terminador de transcripción 35S de CaMV, y se describe en la Solicitud Publicada del TCP Número WO 93/07278. El promotor 35S de este vector contiene dos secuencias de ATG 5' del sitio de inicio. Estos sitios se mutaron utilizando técnicas convencionales de reacción en cadena de la polimerasa, como para remover los ATGs, y generar los sitios de restricción SspI y PvuII. Los nuevos sitios de restricción estuvieron a 96 y a 37 pares de bases desde el sitio Salí único, y 101 y 42 pares de bases desde el sitio de inicio real. El derivado resultante de pCIB246 se designó como pCIB3025. Luego se separó el gen GUS a partir de pCIB3025 mediante digestión con Salí y Sacl, los términos se hicieron romos y se volvieron a ligar para generar el plásmido pCIB3060. El plásmido pJIT82 se obtuvo en el John Innes Centre, Norwich, y el fragmento Smal de 400 pares de bases que contenía al gen bar a partir de Streptomyces viridochromogenes , se separó y se insertó en el sitio Hpal de pCIB3060 (Thompson y colaboradores, EMBO J 6 2529-2523 (1987)). Esto generó pCIB3064, que comprende al gen bar bajo el control del promotor 35S de CaMV, y el terminador para la selección del herbicida, un gen para la resistencia a la ampicilina (para la selección en E. coli) , y un polienlazador con los sitios únicos Sphl, PstI, HindIII, y BamHI . Este vector es adecuado para la clona-ción de casetes de expresión en plantas que contengan sus propias señales reguladoras. Construcción de pS0G19 y pS0G35: pSOG35 es un vector de transformación que utiliza la dihidrofolato reductasa del gen de E. coli (DHFR) como un marcador seleccionable que confiere resistencia al metotrexato. Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el promotor 35S (de aproximadamente 800 pares de bases) , al intrón 6 del gen Adhl de maíz (de aproximadamente 550 pares de bases) , y 18 pares de bases de la secuencia líder no traducida GUS a partir de pSOGlO. También se amplificó un fragmento de 250 pares de bases que codificaba el gen tipo II de hidrofolato reductasa de E. coli mediante reacción en cadena de la polimerasa, y estos dos fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa se ensamblaron con un fragmento SacI-PstI a partir de pBI221 (Clontech) , que compren-día la estructura base del vector pUC19, y el terminador de no-palina sintasa. El ensamble de estos fragmentos generó pSOG19, que contiene al promotor 35S en fusión con la secuencia del intrón 6, el líder GUS, y el gen DHFR, y el terminador de nopali-na sintasa. El reemplazo del líder GUS en pS0G19 con la se-cuencia líder del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) generó el vector pSOG35. pS0G19 y pSOG35 llevan al gen pUC para la resistencia a la ampicilina, y tienen los sitios HindIII, Sphl, PstI, y EcoRI disponibles para la clonación de secuencias extrañas . Primero se ensamblan las secuencias genéticas pretendidas para la expresión en plantas transgénicas, en casetes de expresión detrás de un promotor adecuado, y corriente arriba de un terminador de transcripción adecuado. Estos casetes de expresión se pueden entonces transferir fácilmente a los vectores de transformación de plantas descritos anteriormente. La selección del promotor utilizado en los casetes de expresión determinará el patrón de expresión espacial y temporal del transgen en la planta transgénica. Los promotores seleccionados expresarán los transgenes en tipos de células especí-fieos (tales como las células epidérmicas de la hoja, las células del mesófilo, las células de la corteza de la raíz) , o en tejidos u órganos específicos (raíces, hojas, o flores, por ejemplo), y esta selección reflejará la localización deseada de biosíntesis de la enzima. De una manera alternativa, el promo-tor seleccionado puede impulsar la expresión del gen bajo un promotor inducido por luz o regulado de otra manera temporalmente. Una alternativa adicional (y preferida) es que el promotor seleccionado sea inducible por un estímulo externo, por ejemplo la aplicación de un inductor químico específico o una herida. Esto proporcionaría la posibilidad de inducir la transcripción genética biosintética de trehalosa solamente cuando se desee. Hay una variedad de terminadores de transcripción disponibles para utilizarse en los casetes de expresión. Estos son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgen y su poliadenilación correcta. Los terminadores de transcripción apropiados, y aquéllos que se sabe que funcionan en plantas, incluyen al terminador 35S de CaMV, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa, el terminador rbcS E9 de chícharo. Estos se pueden utilizar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Se ha encontrado que numerosas secuencias mejoran la expresión genética desde adentro de la unidad de transcripción, y estas secuencias se pueden utilizar en conjunto con los genes de esta invención para incrementar su expresión en plantas transgénicas . Se ha demostrado que diferentes secuencias de intrones mejoran la expresión, particularmente en las células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Adhl de maíz mejoran de una manera significativa la expresión del gen de tipo silvestre bajo su promotor conocido cuando se introducen en células de maíz. Se encontró que el intrón 1. era particularmente efectivo, y mejoraba la expresión en construcciones de fusión con el gen para cloranfenicol acetiltrans-ferasa (Callis y colaboradores. Genes Develep .1: 1183-1200 (1987)) . En el mismo sistema experimental, el intrón a partir del gen bronzel de maíz tuvo un efecto similar para mejorar la expresión. Se incorporado rutinariamente secuencias de intrones en vectores de transformación de plantas, normalmente den-tro del líder no traducido. También se sabe que un número de secuencias líder no traducidas derivadas a partir de virus mejoran la expresión, y éstas son particularmente efectivas en células de dicotiledóneas. Específicamente, se ha demostrado que las secuencias líder a partir del virus de mosaico de tabaco (TMV, la "secuencia-O" ) , virus moteado clorótico de maíz (MCMV) , y virus de mosaico de alfalfa (AMV) , son efectivas para mejorar la expresión (por ejemplo Gallie y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987) ; Skuzeski y colaboradores Plant Molec. Biol 15 : 65-79 (1990) ) . Se sabe que existen diferentes mecanismos para dirigir los productos genéticos en las plantas, y se ha caracterizado con algún detalle las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos. Por ejemplo, la dirección de los productos genéticos hacia el cloroplasto es controlada por una secuencias de señal que se encuentra en el extremo amino-terminal de diferentes proteínas, y que se disocia durante la importación al cloroplasto, produciendo la proteína madura (por ejemplo, Comai y colaboradores. J. Biol. Chem 263 : 15104-15109 (1988)). Estas secuencias de señal se pueden fusionar con los productos gene-ticos heterólogos para efectuar la importación de los productos heterólogos hacia adentro del cloroplasto (van den Broeck y colaboradores, Nature 313 : 358-363 (1985)). El ADN que codifique las secuencias de señal apropiadas se puede aislar desde el ex-tremo 5 ' de los ADNcs que codifiquen la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima EPSP sintasa, la proteína GS2 , y muchas otras proteínas que se sabe que se localizan en el cloroplasto. Otros productos genéticos se localizan en otros organelos, tales como la mitocondria y el peroxisoma (por ejemplo Unger y colaboradores, Plant Molec. Biol 13: 411-418 (1989)). Los ADNcs" que codifican estos productos, también se pueden manipular para efectuar la dirección de los productos genéticos heterólogos hacia estos organelos. Los ejemplos de estas secuencias son las ATPasas de codificación nuclear, y las isoformas de aspartato aminotransferasa específicas para las mitocon-drias . La dirección hacia los cuerpos de proteína celulares ha sido descrita por Rogers y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82 : 6512-6516 (1985)). En adición, se han caracterizado secuencias que ocasionan la dirección de los productos genéticos hacia otros compartimentos celulares. Las secuencias amino-terminales son responsables de la dirección hacia el retículo endoplásmico, el apo-plasto, y la secreción extracelular desde las células de aleu-rona (Koehler & Ho, Plant Cell 2 : 769-783 (1990)). Adicional-mente, las secuencias amino-terminales, en conjunto con las secuencias carboxi-terminales, son responsables de la dirección vacuolar de los productos genéticos (Shinshi y colaboradores, Plant Molec. Biol 14.: 357-368 (1990)). Mediante la fusión de las secuencias de dirección apropiadas descritas anteriormente hacia las secuencias transgénicas de interés, es posible dirigir el producto transgénico hacia cualquier organelo o compartimento celular. Para la dirección al cloroplasto, por ejemplo, la secuencia de señal de cloróplasto a partir del gen RUBISCO, el gen CAB, el gen de EPSP sintasa, o el gen GS2 , se fusiona adentro del marco con el ATG amino-terminal del transgen. La secuencia de señal seleccionada debe incluir el sitio de disociación conocido, y la fusión construida debe tomar en cuenta cualesquiera aminoácidos des-pues del sitio de disociación que se requieran para la disociación. En algunos casos, este requerimiento se puede satisfacer mediante la adición de un pequeño número de aminoácidos entre el sitio de disociación y el ATG del transgen, o alternativamente el reemplazo de algunos aminoácidos adentro de la secuen-cia transgénica. Las fusiones construidas para la importación al cloroplasto se pueden probar para determinar la eficacia de recuperación del cloroplasto mediante traducción in vi tro de construcciones transcritas in vi tro, seguida por recuperación del cloroplasto in vi tro, utilizando las técnicas descritas por (Bartlett y colaboradores. En: Edelmann y colaboradores (edito-res) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, páginas 1081-1091 (1982); Wasmann y colaboradores, Mol. Gen. Genet 205 : 446-453 (1986) ) . Estas técnicas de construcción son bien conocidas en la materia, y son igualmente aplicables a las mi-tocondrias y a los peroxisomas. La elección de la dirección que se puede requerir para los genes biosintéticos de trehalosa, dependerá de la local zación celular del precursor requerido como el punto de partida para una ruta dada. Estas normalmente será citosólica o cloroplástica, aunque en algunos casos puede ser mitocondrial o peroxisomal . Los mecanismos anteriormente descritos para la dirección celular se pueden utilizar no solamente en conjunto con sus promotores conocidos, sino también en conjunto con promotores heterólogos, para efectuar una meta de dirección celular espe-cífica bajo la regulación de transcripción de un promotor que tenga un patrón de expresión diferente de aquél del promotor a partir del cual se derive la señal de dirección. La presente invención abarca la expresión de genes biosintéticos de trehalosa bajo la regulación de cualquier promotor que se pueda expresar en plantas, independientemente del origen del promotor. Además, la invención abarca el uso de cualquier promotor expresable en plantas en conjunto con cualesquiera secuencias adicionales requeridas o seleccionadas para la expresión del gen biosintético de trehalosa. Estas secuencias incluyen, pero no están restringidas a, terminadores de transcripción, secuencias extrañas para mejorar la expresión (tales como intrones [por ejemplo el intrón Adh 1], secuencias virales [por ejemplo TMV-O] ) , y secuencias pretendidas para la dirección del produc-to genético hacia organelos y compartimentos celulares específicos. Los promotores expresables en plantas adecuados son aquéllos que se expresan constitutivamente, tales como el promotor 35S de CaMV, el promotor de actina, o el promotor de ubiquiti-na. La construcción del plásmido pCGN1761, que contiene al promotor 35S "doble" se describe en la Solicitud de Patente Publicada Número EP 0,392,225 (Ejemplo 23). pCGN1761 contiene al promotor 35S "doble", y al terminador de transcripción tml con un sitio EcoRI único entre el promotor y el terminador, y tiene una estructura has de tipo pUC. Se construyó un derivado de pCGN1761 que tiene un polienlazador modificado que incluye los sitios Notl y Xhol en adición al sitio EcoRI existente. Este derivado se designó como pCGN1761ENX. El pCGN1761ENX es útil para la clonación de secuencias de ADNc o de secuencias genéticas (incluyendo las secuencias de marco de lectura abierta microbiano) adentro de su polienlazador, para los propósitos de su expresión bajo el control del promotor 35S en plantas transgénicas. Se puede separar todo el cásete de promotor 35S-secuencia genética-terminador tml de esta construcción, me-diante los sitios HindIII, Sphl, Salí, y Xbal a 5' para el promotor, y los sitios Xbal, BamHI , y Bgll a 3' para el terminador, para transferirse a los vectores de transformación, tales como aquéllos descritos anteriormente. Además, el fragmento del promotor 35S doble se puede remover mediante separación 5' con HindIII, Sphl, Salí, Xbal, ó PstI, y separación 3' con cualquiera de los sitios de restricción del polienlazador (EcoRI, Notl ó Xhol) para su reemplazo con otro promotor. Para cualquiera de las construcciones descritas en esta sección, se pueden hacer modificaciones alrededor de los sitios de clonación mediante la introducción de secuencias que puedan potenciar la traducción. Esto es particularmente útil cuando se vayan a introducir genes derivados de microorganismos en los casetes de expresión en plantas, debido a que estos genes pueden no contener secuencias adyacentes a su metionina de inicio, lo cual puede ser adecuado para el inicio de la traducción en plantas. En los casos en donde los genes derivados de microorganismos se vayan a clonar en casetes de expresión en plantas en su ATG, puede ser útil modificar el sitio de su inserción para Optimizar su expresión. La modificación de pCGN1761ENX mediante optimización del sitio de inicio de traducción se describe, a manera de ejemplo, para incorporar una de varias secuencias optimizadas para la expresión en plantas (por ejemplo, Joshi, supra) . Los promoto-res expresables en plantas adicionales que se pueden utilizar adecuadamente dentro del alcance de la presente invención, son los promotores químicamente regulables, tales como aquéllos descritos posteriormente en la presente. Por ejemplo, esta sección describe el reemplazo del promotor 35S doble en pCGN1761ENX con cualquier promotor de elección; a manera de ejemplo, el promotor PR-la químicamente regulable se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,614,395, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, y el promotor PR-1 de Arabidopsis químicamente regulable. El promotor de elección de preferencia se separa de su fuente mediante enzimas de restricción, pero de una manera alternativa, se puede amplificar con reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores que lleven los sitios de res-tricción terminales apropiados. Si se emprende la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa, entonces se debe volver a secuenciar el promotor para verificar los errores de amplificación después de la clonación del promotor amplificado en el vector blanco. El promotor PR-la de tabaco químicamente regulable se disocia del plásmido pCIB1004 (ver la Patente Europea Número EP- 0,332,104 Ejemplo 21, para la construcción), y se transfiere al plásmido pCGN1761ENX. El pCIB1004 se disocia con Ncol, y la colgadura 3' resultante del fragmento lineariza-do se hace roma mediante su tratamiento con ADN polimerasa de T4. Luego se disocia el fragmento con HindIII, y el promo-tor PR-la resultante que contiene al fragmento se purifica en gel y se clona en pCGN1761ENX, de donde se ha removido el promotor 35S doble. Esto se hace mediante disociación con Xhol y haciendo romo con polimerasa T4 seguido por disociación con HindIII y aislamiento del terminador del vector más grande que contenga al fragmento en donde se clone el fragmento del promotor pCIB1004. Esto genera un derivado de pCGN1761ENX con el promotor PR-la y el terminador tml, y un polienlazador que interviene, con sitios EcoRI y Notl únicos. En este vector se pueden insertar los genes biosintéticos de trehalosa seleccionados, y los productos de la fusión (es decir, promotor-gen-terminador) subsecuentemente se pueden transferir al cualquier vector de transformación seleccionado, incluyendo aquéllos descritos en esta solicitud) . Se pueden emplear diferentes reguladores químicos para inducir la expresión de la secuencia de codificación biosintética de trehalosa en las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención. En el contexto de la presente divulgación, "reguladores químicos" incluyen los productos químicos que se sepa que son inductores para el promotor PR-la en plantas, o estrechos derivados del mismo. Un grupo preferido de reguladores para los genes biosintéticos de trehalosa químicamente inducibles de esta invención, se basa en la estructura de benzo-1, 2, 3-tiadiazol (BTH) , e incluye, pero no se limita a, los si-guientes tipos de compuestos: ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazolcarbo-xílico, ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazoltiocarboxílico, cianobenzo-1, 2 , 3-tiadiazol, amida del ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazolcarboxí-lico, hidrazida del ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazolcarboxílico, ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxílico, ácido benzo-1,2,3-tiadiazol-7-tiocarboxílico, 7-ciano-benzo-l , 2 , 3 -tiadiazol , amida del ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxílico, hidrazida del ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxílico, benzo-1, 2 , 3-tiadia-zolcarboxilato de alquilo en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxilato de metilo, benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxilato de propilo normal, benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxilato de bencilo, sec-butilhidra-zida del ácido benzo-1, 2 , 3-tiadiazol-7-carboxílico, y sus derivados adecuados. Otros inductores químicos pueden incluir, por ejemplo, ácido benzoico, ácido salicílico (SA) , ácido poliacrí-lico y sus derivados sustituidos; los sustituyentes adecuados incluyen alquilo inferior, alcoxilo inferior, tioalquilo inferior, y halógeno. Todavía otro grupo de reguladores para las secuencias de ADN químicamente inducibles de esta invención, se basa en la estructura del ácido piridincarboxílico, tal como la estructura del ácido isonicotínico, y de preferencia la estructura del ácido haloisonicotínico . Se prefieren los ácidos di-cloroisonicotínicos y sus derivados, por ejemplo, los alquiles-teres inferiores. Los reguladores adecuados de esta clase de compuestos son, por ejemplo ácido 2 , 6-dicloroisonicotínico (INA), y sus alquilésteres inferiores, especialmente el meti-léster. La expresión constitutiva también se puede lograr mediante el promotor de actina. Se sabe que varias isoformas de actina se expresan en la mayoría de los tipos de células, y en conse-cuencia, el promotor de actina es una buena elección para un promotor constitutivo. En particular, se ha clonado y caracterizado el promotor del gen Actl de arroz (McElroy y colaboradores, Plant Cell 2 : 163-171 (1990)). Se encontró que un fragmento de 1.3 kb del promotor contiene todos los elementos reguladores requeridos para la expresión en los protoplastos de arroz. Además, se han construido numerosos vectores de expresión basados en el promotor Actl específicamente para utilizarse en monocotiledóneas (McElroy y colaboradores, Mol. Gen. Genet 231: 150-160 (1991) ) . Estos incorporan el Actl-intrón 1, la secuencia de flanqueo 5' de Adhl y Adhl-intrón 1 (del gen de deshidrogenasa de alcohol de maíz) , y la secuencia del promotor 35S de CaMV. Los vectores que mostraron la más alta expresión fueron fusiones de 35S y el intrón Actl, o la secuencia de flanqueo 5' de Actl y el intrón Actl. La optimización de las secuencias alrededor del ATG de inicio (del gen reportero GUS) también mejoró la expresión. Los casetes de expresión del promotor descritos por McElroy y colaboradores (Mol Gen. Genet 231: 150-160 (1991)) se pueden modificar fácilmente para la expresión de genes biosintéticos de trehalosa, y son particular-mente adecuados para utilizarse en hospederas monocotiledóneas.

Por ejemplo, los fragmentos que contengan al promotor se pueden remover de las construcciones de McElroy, y se pueden utilizar para reemplazar al promotor 35S doble en pCGN1761ENX, que luego está disponible para la inserción o para secuencias genéticas específicas. Los genes de fusión así construidos se pueden transferir entonces a vectores de transformación apropiados. En un reporte separado, también se ha encontrado que el promotor Actl de arroz con su primer intrón, dirige una alta expresión en células de cebada cultivadas (Chibbar y colaboradores, Plant. Cell Rep 12: 506-509 (1993)) . La ubiquitina es otro producto genético que se sabe que se acumula en muchos tipos de células, y su promotor se ha clonado a partir de varias especies, para utilizarse en plantas transgénicas (por ejemplo, girasol - Binet y colaboradores, Plant Science 79.: 87-94 (1991) , maíz - Christensen y colaboradores, Plant Molec Biol. 12: 619-632 (1989)) para la expresión constitutiva. El promotor de ubiquitina de maíz se ha desarrollado en sistemas monocotiledóneos transgénicos, y su secuencia y los vectores construidos para la transformación de monocotiledóneas se dan a conocer en la Publicación de Patente Europea Número 0,342,926 (a Lubrizol) . Además, Taylor y colaboradores (Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)) describen un vector (pAHC25) que comprende al promotor de ubiquitina de maíz y el primer intrón y su alta actividad en suspensiones celulares de numerosas mo-nocotiledóneas, cuando se introduce por medio de bombardeo de microproyectiles. El promotor de ubiquitina es adecuado para la expresión de genes biosintéticos de trehalosa en plantas transgénicas, especialmente monocotiledóneas. Los vectores adecuados son derivados de pAHC25 o cualquiera de los vectores de transformación de descritos en esta solicitud, modificados mediante la introducción del promotor de ubiquitina apropiado y/o las secuencias de intrones apropiadas. Otro patrón de expresión para la enzimas de la presente invención es la expresión en la raíz. Un promotor de raíz ade-cuado es el descrito por de Framond (FEBS 290 : 103-106 (1991)) y también en la Solicitud de Patente Europea Publicada Número EP 0,452,269 (a Ciba-Geigy) . Este promotor se transfiere a un vector adecuado, tal como pCGN1761ENX, para la inserción de un gen biosintético de trehalosa, y la transferencia subse-cuente de todo el cásete de promotor-gen-terminador, hasta un vector de transformación de interés. Los promotores inducibles por herida también son adecuados para la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa. Se han descrito numerosos de estos promotores (por ejemplo, Xu y colaboradores, Plant Molec. Biol. 22.: 573-588 (1993), Logemann y colaboradores Plant Cell 1 : 151-158 (1989) , Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993) , Firek y colaboradores Plant Molec Biol. 22: 129-142 (1993) , Warner y colaboradores Plant J. 3.: 191-201 (1993)), y todos son adecuados para utilizarse con la presente invención. Logemann y colaboradores describen las secuencias corriente arriba 5 ' del gen unl de la papa dicotiledónea. Xu y colaboradores muestran que un promotor inducible por herida a partir de la papa dicotiledónea (pin2) es activo en el arroz monocotiledóneo. Además, Rohrmeier & Lehle describen la clonación del ADNc de Wipl de maíz, que se induce por herida, y que se puede utilizar para aislar el promotor conocido utilizando técnicas convencionales. De una manera similar, Firek y colaboradores, y Warner y colaboradores, han descrito un gen inducido por herida a partir de la monocotiledónea Asparagus officinalis , que se expresa en los sitios de herida local y de invasión de patógenos. Utilizando técnicas de clonación bien conocidas en este campo, estos promotores se pueden transferir a los vectores adecuados, se pueden fusionar con los genes biosintéticos de trehalosa de es-ta invención, y se pueden utilizar para expresar estos genes en_ los sitios de herida de la planta. La Solicitud de Patente WO 93/07278 (a Ciba-Geigy) describe el aislamiento del gen trpA de maíz que se expresa de preferencia en las células de la savia. Se presentan la se-cuencia genética y el promotor extendiéndose hasta -1726 desde el inicio de la transcripción. Utilizando técnicas biológicas moleculares convencionales, este promotor o partes del mismo, se puede transferir a un vector, tal como pCGN1761, en donde puede reemplazar al promotor 35S, y se puede utilizar para im-pulsar la expresión de un gen extraño de una manera preferida por la savia. De hecho, los fragmentos que contengan al promotor preferido por la savia o partes del mismo, se pueden transferir al cualquier vector, y se pueden modificar para su utilidad en plantas transgénicas . Un gen de maíz que codifica fosfoenol-carboxilasa (PEPC) ha sido descrito por Hudspeth & Gruía (Plant Molec Biol 12 : 579-589 (1989) ) . Utilizando técnicas biológicas moleculares convencionales, se puede utilizar el promotor para este gen, con el fin de impulsar la expresión de cualquier gen de una mañera específica de la hoja en plantas transgénicas. Chen y Jagendorf (J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993)) han descrito el uso con éxito de un péptido de tránsito del cloroplasto para la importación de un transgen heterólogo. Este péptido utilizado es el péptido de tránsito a partir del gen rbcS de Nicotiana plumbagini folia (Poulsen y colaboradores, Mol. Gen Genet 205: 193-200 (1986)). Utilizando las enzimas de restricción Dral y Sphl, o Tsp509I y Sphl, se puede separar la secuencia de ADN que codifica este péptido de tránsito a partir del plásmido prbcS-8B, y se puede manipular para utilizarse con cualquiera de las construcciones descritas anteriormente. El fragmento Dral-Sphl se extiende desde -58 en relación con el ATG de rbcS de inicio, hasta, e incluyendo, el primer aminoácido (también una metionina) del péptido maduro inmediatamente después del sitio de disociación de importación, mientras que el fragmento Tsp509I-SphI se extiende desde -8 en relación con el ATG de rbcS de inicio hasta, e incluyendo, el primer aminoá-cido de péptido maduro. Por consiguiente, estos fragmentos se pueden insertar apropiadamente en el polienlazador de cualquier cásete de expresión elegido, generando una fusión de transcripción con el líder no traducido del promotor elegido (por ejem-pío, 35S, PR-la, actina, ubiquitina, etcétera) , mientras que se hace posible la inserción de un gen biosintético de trehalosa en fusión correcta corriente abajo del péptido de tránsito. Las construcciones de esta clase son una rutina en la técnica, por ejemplo, mientras el extremo Dral ya es romo, el sitio 5' Tsp509I se puede hacer romo mediante un tratamiento con polimerasa T4, o alternativamente se puede ligar con una secuencia enlazadora o adaptadora, para facilitar su fusión con el promotor seleccionado. El sitio 3' Sphl se puede mantener como tal, o alternativamente se puede ligar con las secuencias adaptado-ras o enlazadoras para facilitar su inserción en el vector seleccionado, de tal manera que se ponen a disposición sitios de restricción apropiados para la subsecuente inserción de un gen biosintético de trehalosa seleccionado. Idealmente, se mantiene el ATG del sitio Sphl, y comprende el primer ATG del gen biosintético de trehalosa seleccionado. Chen y Jagendorf proporcionan secuencias en consenso para la disociación ideal para la importación al cloroplasto, y en cada caso, se prefiere una metionina en la primera posición de la proteína madura. En las siguientes posiciones, hay más variación, y el aminoácido puede no ser tan crítico. En cualquier caso, se pueden evaluar las construcciones de fusión para determinar la eficiencia de la importación in vi tro, utilizando los métodos descritos por Bar-tlett y colaboradores (En: Edelmann y colaboradores (editores) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, páginas 1081-1091 (1982)) y Wasmann y colaboradores, (Mol. Gen. Genet 205 : 446-453 (1986) ) . Normalmente, el mejor planteamiento pue-de ser generar fusiones utilizando el gen biosintético de trehalosa seleccionado sin modificaciones en el término amino, y solamente incorporar modificaciones cuando se pueda ver que estas fusiones no son importadas al cloroplasto con una alta eficiencia, en cuyo caso, se pueden hacer modificaciones de acuerdo con la literatura establecida (Chen & Jagendorf; Wasman y colaboradores; Ko & Ko, J Biol. Chem. 267: 13910-13916 (1992) ) . Se construye un vector preferido transfiriendo el fragmento que codifica el péptido de tránsito de Dral -Sphl a partir de prbcS-8B hasta el vector de clonación pCGN1761ENX/Sph- . Este plásmido se disocia con EcoRI, y los términos se hacen romos mediante su tratamiento con ADN polimerasa de T4. El plásmido prbcS-8B se disocia con Sphl, y se liga con un adaptador molecular templado. El producto resultante se fosforila 5'-terminalmente mediante su tratamiento con cinasa T4. La subsecuente disociación con Dral libera el fragmento que codifica el péptido de tránsito, que se liga en los sitios ex-EcoRI de extremos romos del vector modificado descrito anteriormente.

Los clones orientados con el extremo 5 ' del inserto adyacente al extremo 3 ' del promotor 35S, se identifican mediante secuen-ciamiento. Estos clones llevan una fusión de ADN de la secuencia líder 35S con la secuencia del promotor-péptido de tránsito rbcS-8A que se extiende desde -58 en relación con el ATG del rbcS hasta el ATG de la proteína madura, e incluyendo esa posición un sitio Sphl único, y un sitio EcoRI recién creado, así como sitios Notl y Xhol existentes de pCGN1761ENX. Este nuevo vector está designado como pCGN176l/CT. Las secuencias de ADN se transfieren al pCGN1761/CT adentro del marco mediante amplificación utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa, y la incorporación de un sitio Sphl, NSphl , ó NIalII en el ATG amplificado, que, enseguida de la disociación de la enzima de restricción con la enzima apropiada, se liga en el pCGN176l/CT disociado con Sphl. Para facilitar la construcción, se puede requerir cambiar el segundo aminoácido del gen clonado; sin embargo, en casi todos los casos, el uso de reacción en cadena de la polimerasa, junto con mutagénesis dirigida al sitio convencional, hará posible la construcción de cual-quier secuencia deseada alrededor del sitio de disociación y la primera metionina de la proteína madura. Se construye un vector preferido adicional reemplazando el promotor 35S doble de pCGN1761ENX con el fragmento BamHI-Sphl de prbcS-8A, que contiene al promotor rbcS-8A regulado por luz de longitud completa desde -1038 (en relación con el sitio de inicio de transcripción) hasta la primera metionina de la proteína madura. El pCGN1761 modificado con el sitio Sphl destruido, se disocia con PstI y EcoRI , y se trata con ADN polimerasa T4, para hacer los términos romos. prbcS-8A se disocia con Sphl, y se liga con el adaptador molecular templado de la secuencia descrita anteriormente. El producto resultante se fosforila 5 ' -terminalmente mediante su tratamiento con cinasa T4. La subsecuente disociación con BamHI libera al fragmento que contiene al promotor-péptido de tránsito, el cual se trata con ADN polimerasa de T4 para hacer romo el término BamHI . El fragmento de promotor-péptido de tránsito así generado se clona en el vector pCGN1761ENX preparado, generando una construcción que comprende al promotor rbcS-8A y al péptido de tránsito con un sitio Sphl localizado en el sitio de disociación para la in-serción de genes heterólogos. Además, corriente abajo del sitio Sphl están los sitios de clonación EcoRI (re-creado) , Notl, y Xhol. Esta construcción está designada como pCGN1761rbcS/CT.

Se pueden emprender manipulaciones similares para utilizar otras secuencias de codificación del péptido de tránsito del cloroplasto GS2 a partir de otras fuentes (monocotiledóneas y dicotiledóneas), y a partir de otros genes. En adición, se pueden seguir procedimientos similares para lograr la dirección hacia otros compartimento subcelulares, tales como la mitocon-drias .

Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la materia, e incluyen las técnicas basadas en Agrobacterium, y las técnicas que no requieren de Agrobacterium . Las técnicas sin Agrobacterium involucran la recuperación del material genético exógeno directamente por los protoplastos o las células. Esto se puede realizar mediante recuperación mediada por PEG o electroporación, suministro mediado por bombardeo de partículas, o microinyección. Los ejemplos de estas técnicas son descritos por Paszkowski y colaboradores, EMBO J 3_: 2717-2722 (1984), Potrykus y colaboradores, Mol. Gen Genet. 199: 169-177 (1985) , Reich y colaboradores, Biotechnology 4.: 1001-1004 (1986), y Klein y colaboradores, Nature 327: 70-73 (1987) . En cada caso, las células transformadas se regeneran hasta plantas enteras utilizando técnicas convencionales cono-cidas en este campo. La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de las dicotiledóneas, debido a su alta eficiencia de transformación, a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. Las muchas especies de cultivo que se pueden transformar rutinariamente mediante Agrobacterium incluyen tabaco, jitomate, girasol, algodón, colza de semilla de aceite, papa, frijol de soya, alfalfa, y álamo (Patente Europea Número 0,317,511 (algodón [1313]), Patente Europea Número EP-0,249,432 (jitomate, a Calgene) , Publicación Internacional Número WO 87/07299 (Brassica, a Calgene) , Patente de los Esta-dos Unidos de Norteamérica Número US 4,795,855 (álamo)) . La transformación con Agrobacterium normalmente involucra la transferencia del vector binario que lleva el ADN extraño de interés (por ejemplo pCIB200 ó pCIB2001) hasta una cepa de Agrobacterium apropiada, que puede depender del complemento de los genes vir llevados por la cepa hospedera de Agrobacterium, ya sea en un plásmido Ti-residente, o cromosómicamente (por ejemplo la cepa CIB542 para pCIB200 y pCIB2001 (Uknes y colaboradores, Plant Cell 5: 159-169 (1993))). La transferencia del vector binario recombinante hasta Agrobacterium se realiza mediante un procedimiento de acoplamiento triparental, utilizando JE?, coli que lleva al vector binario recombinante, una cepa de E. coli auxiliar que lleva un plásmido tal como pRK2013, y que puede movilizar el vector binario recombinante hasta la cepa de Agrobacterium blanco. De una manera alternativa, el vector binario recombinante se puede transferir a Agrobacterium mediante transformación del ADN (H?fgen & Willmitzer, Nucí. Acids Res. 16: 9877 (1988) ) . La transformación de la especie de planta blanco mediante Agrobacterium recombinante, normalmente involucra el co-cultivo de Agrobacterium con explantes de la planta, y siguen los protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera sobre un medio seleccionable que lleve al marcador de resistencia a antibiótico o herbicida presente entre los lí-mites de ADN-T del plásmido binario.

La transformación de la mayoría de las especies monocotiledóneas también ha llegado a ser ahora una rutina. Las técnicas preferidas incluyen transferencia genética directa hacia los protoplastos utilizando técnicas de PEG o electroporación, y bombardeo de partículas hacia el tejido del cayo. Las transformaciones se pueden emprender con una sola especie de ADN, o con múltiples especies de ADN (es decir, co-transformación) , y ambas técnicas son adecuadas para utilizarse con esta invención. La co-transformación puede tener la ventaja de evitar la compleja construcción del vector, y de generar plantas transgénicas con lugares no enlazados para el gen de interés y el marcador seleccionable, haciendo posible la remoción del marcador seleccionable en las siguientes generaciones, si esto se considera deseable. Sin embargo, un inconveniente del uso de la co-transformación, es la frecuencia menor del 100 por ciento con la que se integran las especies separadas de ADN el genoma (Schocher y colaboradores, Biotechnology 4.: 1093-1096 (1986)) . Las Solicitudes de Patente Números EP 0,292,435 (a Ciba-Geigy), EP 0,392,225 (a Ciba-Geigy) y WO 93/07278 (a Ciba-Geigy), des-criben técnicas para la preparación de cayo y protoplastos a partir de una línea endógama élite de maíz, la transformación de protoplastos utilizando PEG o electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon-Kamm y colaboradores (Plant Cell 2.: 603-618 (1990)) y Fromm y colaboradores (Biotechnology 8.: 833-839 (1990) ) han publicado técnicas para la transformación de la línea de maíz derivada de A188, utilizando bombardeo de partículas. Además, la Solicitud Número WO 93/07278 (a Ciba-Geigy) y Koziel y colaboradores (Biotechnology 11.: 194-200 (1993)) des-criben técnicas para la transformación de líneas endógamas élite de maíz mediante bombardeo de partículas. Esta técnica utiliza embriones de maíz inmaduros de 1.5 a 2.5 milímetros de longitud, separados de una mazorca de maíz de 14 a 15 días después de la polinización, y un dispositivo Biolistics PDS-lOOOHe para el bombardeo . La transformación de arroz también se puede emprender mediante técnicas de transferencia genética directa, • utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por el protoplasto ha sido descrita para los tipos Japo-nica y los tipos Indica (Zhang y colaboradores, Plant Cell Rep 1_: 379-384 (1988); Shimamoto y colaboradores Nature 338: 274-277 (1989) ; Datta y colaboradores Biotechnology 8.: 736-740 (1990) ) . Ambos tipos también se pueden transformar rutinariamente utilizando bombardeo de partículas (Christou y colabora-dores, Biotechnology 9.: 957-962 (1991)). La Solicitud de Patente Número EP 0,332,581 (a Ciba Geigy) describe técnicas para la generación, transformación, y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de Dactylis y trigo. Además, la transformación de trigo fue descrita por Vasil y colaboradores (Biotechnology 10 : 667-674 (1992) ) utilizando bombardeo de partículas hacia células de cayo regenerable a largo plazo tipo C, y también por Vasil y colaboradores (Biotechnology 11.: 1553-1558_ (1993)) y Weeks y colaboradores (Plant Physiol 102 : 1077-1084 (1993)) utilizando bombardeo con partículas de embriones inmaduros y de cayo derivado de embrión inmaduro. Sin embargo, una técnica preferida para la transformación de trigo involucra la transformación de trigo mediante bombardeo con partículas de embriones inmaduros, e incluye un paso alto en sacarosa o bien alto en maltosa antes del suministro del gen. Antes del bombardeo, se aplican cualquier número de embriones (de 0.75 a 1 milímetro de longitud) sobre un medio MS con sacarosa al 3 por ciento (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15.: 473-497 (1962)) y 3 miligramos/litro de 2,4-D para la inducción de embriones so-máticos, que se permite proceder en la obscuridad. En el día elegido del bombardeo, se remueven los embriones del medio de inducción, y se colocan sobre el osmótico (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa agregada en la concentración deseada, normalmente al 15 por ciento) . Los embriones se dejan plasmolizar durante 2 a 3 horas, y luego se bombardean. Es típico 20 embriones por placa blanco, aunque no es crítico. Se precipita un plásmido que lleve al gen apropiado (tal como pCIB3064 ó pSG35) sobre partículas de oro de tamaño en mieras utilizando procedimientos convencionales. Cada placa de embriones se dispara con el dispositivo de helio DuPont Biolistics®, utilizando una presión de ráfaga de aproximadamente 70 kg/cm2, utilizando una malla 80 estándar. Después del bombardeo, los embriones se colocan de regreso en la obscuridad para recuperarse durante aproximadamente 24 horas (todavía sobre el osmó-tico) . Después de 24 horas, los embriones se remueven del osmótico, y se colocan de regreso sobre el medio de inducción, en donde se quedan durante aproximadamente 1 mes antes de la regeneración. Aproximadamente 1 día después, los explantes de embrión con cayo embriogénico en desarrollo se transfieren al me-dio de regeneración (MS + 1 miligramos/litro de NAA, 5 miligramos/litro de GA) , que contiene además el agente de selección apropiado (10 miligramos/litro de Basta en el caso de pCIB3064, y 2 miligramos/litro de metotrexato en el caso de pSOG35) . Después de aproximadamente 1 mes, los retoños desarrollados se transfieren a recipientes estériles más grandes conocidos como "GA7s", que contienen MS a media concentración, sacarosa al 2 por ciento, y la misma concentración de agente de selección. La Solicitud de Patente Europea Número 0,674,715, describe métodos para la transformación de trigo, y se incorpora a la pre-senté como referencia. Se describen tres secuencias de nucleótidos derivadas de maíz (Ejemplo 32) . Estas secuencias de nucleótidos muestran altas calificaciones de concordancia y una homología significativa con otras trehalosa-fosfato sintasas al nivel del ADN y de la proteína, al compararse en una búsqueda BLAST (BLASTN 2.0.7 [Dec-21-1998] Altschul y colaboradores (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El fragmento Be3 , que se utilizó como una sonda para rastrear una biblioteca de ADN-c de maíz, muestra, por ejemplo, una identidad del 60 por ciento con la trehalosa-fosfato sintasa de levadura (TPS1, número de acceso Q00764) , al nivel de los aminoácidos, entre las bases 519 y 1, y una identidad del 58 por ciento entre las bases 831 y 463, ambas en orientación opuesta al gen de levadura. Be3 también muestra una identidad del 89 por ciento con la trehalosa-fosfato sintasa de Arabi dopsis (número de acceso Y08568) al nivel de los aminoácidos, entre las bases 471 y 1, y una identidad del 84 por ciento entre las bases 830 y 462, ambas en orientación opuesta al gen de Arabidopsi s . El clon 4.11 es casi idéntico a Be3 (4 malas concordancias) al nivel de los nucleótidos entre las bases 4 y 129 en el clon 4.11 (bases 706 a 831 en Be3) . El clon 6 es casi idéntico a Be3 (9 malas concordancias) al nivel de los nucleótidos entre las bases 4 y 218 en el clon 6 (bases 10 a 224 en Be3) en orientación opuesta, comparándose con Be3. El clon 9 es casi idéntico a Be3 (una mala concordancia) al nivel de los nucleótidos entre las bases 4 y 95 en el clon 9 (bases 447 a 568 en Be3) . El clon 4.11 es de 1686 pares de bases de largo, y com-prende una secuencia de codificación parcial predicha de 1413 pares de bases. El clon 6 es 1558 pares de bases de largo, y comprende una secuencia de codificación de longitud completa predicha de 1092 pares de bases. El clon 9 es de 735 pares de bases de largo, y comprende una secuencia de codificación par-cial predicha de 735 pares de bases. El clon 4.11 y el clon 6 son casi idénticos al nivel de los nucleótidos entre las posiciones 448 y 1600 (clon 4.11), y 300 y 1439 (clon 6) . El clon 4.11 tiene, por ejemplo una identidad de aminoáci-dos del 55 por ciento (bases 4 a 279) con TPS1 de levadura, una identidad del 44 por ciento (bases 4 a 282) con OtsA de E. coli , y una identidad de aminoácidos de 76 por ciento (bases 4 a 1047) y una identidad de aminoácidos del 59 por ciento (bases 1240 a 13^1) con la trehalosa-fosfato sintasa de Arabidopsis . Por ejemplo, el clon 6 tiene una identidad de aminoácidos del 63 por ciento (bases 3 a 311 en orientación opuesta) con la trehalosa-fosfato sintasa de Aspergillus, una identidad de ami-- noácidos del 46 por ciento (bases 293 a 3 en la orientación opuesta) con TPS1 de levadura, y una identidad de aminoácidos del 67 por ciento (bases 300 a 998) y una identidad de aminoácidos del 86 por ciento (bases 3 a 302 en la orientación opuesta) con la trehalosa-fosfato sintasa de Arabidopsis . El clon 9 tiene una identidad de aminoácidos del 61 por ciento (bases 4 a 96) con el gen TPS1 de levadura, y una identidad de aminoácidos del 80 por ciento (bases 4 a 96) con la trehalosa-fosfato sin-tasa de Arabidopsis . La invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan para propósitos de ilustración solamente, y no pretenden ser limitantes, a menos que se especifique de otra manera .

EJEMPLOS A. Expresión de los genes de trehalosa.- 6- fosfato sintasa y de trehalosa-6- fosfato fosfatasa de en el citosol de la planta . Eiemplo 1: Preparación de un gen quimérico que contiene el gen de trehalosa-6-fosfato sintasa de E. coli fusionado con el promotor PR-la de tabaco. El plásmido pCGN4467 (recibido de Calgene, Davis, CA) , que contiene la secuencia de codificación del gen de trehalosa-6-fosfato sintasa de E. coli (OtsA, Kaasen y colaboradores (1994) Gene 145 (1) , 9-15, Número de Acceso EMBL/Genbank X69160) bajo el control de un promotor 35S doble, y fusionado con las seña-les de poliadenilación 3 ' de tml (pCGN4467 es un derivado de pCGN1761, Patente Europea Número EP 0392225) , se utiliza como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa, con un inicador de la "cadena superior" de izquierda a derecha que incluye el ATG precedido por el codón GCC, y seguido por un codón GCA recién agregado, creando de esta manera un si-tio de restricción Ncol en el ATG, y las primeras 24 bases del gen OtsA (iniciador TREA +: GTC AGC CAT GGC AAG TCG TTT AGT CGT AGT ATC TAA C, SEQ ID No:l), y un iniciador de la "cadena inferior" de derecha a izquierda homólogo a las posiciones 392 a 416 corriente abajo del ATG nuevo (iniciador TREA-: GCA AAT GGC AAC AGG TGA TAA TCG, SEQ ID No:2) . Esta reacción en cadena de la polimerasa se emprende con ADN polimerasa AmpliTaq de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) por cinco ciclos a 90 °C (30 segundos) , a 40°C (60 segundos) , y 72 °C (30 segundos) , seguidos por 25 ciclos a 94°C (30 segundos) , a 55°C (60 segundos) , y 72°C (30 segundos) , y esto generó un producto de 423 pares de bases que contenía un sitio Ncol en su extremo izquierdo, y un sitio BamHI en su extremo derecho. El fragmento se purifica en gel utilizando pro-cedimientos convencionales, se disocia con Ncol y BamHI (todas las enzimas de restricción se adquieren en Promega, Madison, Wl) , y se liga en los sitios Ncol y BamHI de pUC21, que es un derivado de pUC que contiene un polienlazador con los siguientes sitios de restricción: Spel/Stul/-Xhol/BglIl/Clal/Nsil/Sphl/Ncol/Kpnl/Xmal/Smal/Sacl/EcoRl/BstlBI /HindlIl/Pstl/Mlul/Sall/Aatll/Ndel/BamHl/EcoRV/Notl/Eagl/Xbal/S peí para obtener pUCOTSA. Luego se digiere el plásmido pUCOTSA con Spel y BamHI , y el fragmento de 400 pares de bases que contenía el extremo 5' del gen OtsA se purifica en gel y se liga con pCGN4467, que previamente se había digerido con Xbal y BamHI, para obtener pCGNOTSA, que contiene el gen OtsA entero. El plásmido pCGNOTSA se digiere con Ncol y Sacl, y el fragmento de 1.4 kb de largo que contiene al gen OtsA se purifica en gel, y se liga en los sitios Ncol y Sacl de pJG203 entre un promotor PR-la de tabaco de 903 pares de bases de largo, y las señales de terminación del gen nos (Uknes y colaboradores (1993) , The Plant Cell 5, 159-169) . El plásmido pJG203 es un derivado de pBSGus 1.2 (Uknes y colaboradores (1993), The Plant Cell 5, 159-169), que comprende un promotor PR-la de tabaco de 903 pares de bases de largo fusionado con el gen GUS y las señales de poliadenilación nos. En pJG203, se ha removido el segundo sitio Sacl en el extremo de las señales de poliadenilación nos mediante digestión parcial con Sacl, rellenando los extremos sobresalien-tes, y religando. De esta manera se obtiene el plásmido pPRIOTSA que contiene el gen OtsA fusionado con el promotor PR-la de tabaco. Eiemplo 2; Preparación de un gen quimérico que contiene el gen de trehalosa-6- fosfato fosfatasa de E. coli fusionado con el promotor PR-la de tabaco .

El plásmido pCGN4452 (recibido de Calgene, Davis, CA) que contiene la secuencia de codificación del gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa de E. coli (OtsB, Kaasen y colaboradores 81994) Gene 145 (1) , 9-15, Número de acceso EMBL/Genbank X69160) bajo el control de un promotor 35S doble, y fusionado con las señales de poliadenilación 3 ' de tml (pCGN4452 es un derivado de pCGN1761, Patente Europea Número EP 0,392,225), se utiliza como plantilla para la reacción en cadena de la polime-rasa, con un iniciador de la "cadena superior" de izquierda a derecha que incluye un codón ATG recién creado antes del codón de inicio GTG original, precedido por un codón GCC, creando de esta manera un sitio de restricción Ncol en el ATG, y las primeras 23 bases del gen OtsA (cebador TREB+ : GTC AGC _CAT GGT GAC AGA ACC GTT AAC CGA AAC, SEQ ID No .3 ) , y un iniciador de la "cadena inferior" de derecha a izquierda homólogo a las posiciones 181 a 205 corriente abajo del ATG nuevo (cebador TREB-; GTG CGT CA GCT CCA CCA TTG AGC, SEQ ID No.4) . Esta reacción en cadena de la polimerasa se emprende con ADN polimerasa AmpliTaq de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin El-mer/Roche, Branchburg, NJ) por cinco ciclos a 94°C (30 segundos) , a 40°C (60 segundos) , y a 72°C (30 segundos) , seguidos por 25 ciclos a 94°C (30 segundos) , a 55°C (60 segundos) , y a 72°C (30 segundos), y esto generó un producto de 212 pares de bases conteniendo un sitio Ncol en su extremo izquierdo, y un sitio EcoRV en su extremo derecho. El fragmento se purifica en gel utilizando procedimientos convencionales, se disocia con Ncol y EcoRV y se liga en los sitios Ncol y EcoRV de pUC21 para obtener pUCOTSB. Luego el plásmido pUCOTSB se digiere con Spel y EcoRV, y el fragmento de 210 pares de bases que contiene el extremo 5' del gen OtsB se purifica en gel y se liga con pCGN4467, que previamente se había digerido con Xbal y EcoRV, para obtener pCGNOTSB que contiene el gen OtsB entero. El plásmido pCGNOTSB se digiere con Ncol y Sacl, y el fragmento de 0.8 kb de largo que contiene al gen OtsB se purifica en gel y se liga en los sitios Ncol y Sacl de pJG203 entre un promotor PR-la de tabaco de 903 pares de bases de largo, y las señales de terminación del gen nos, produciendo pPRIOTSB que contiene al gen OtsB fusionado con el promotor PR-la de tabaco.

Eiemplo 3 : Preparación de un vector binario que contiene el gen OtsA fusionado con el promotor PR-la de tabaco, y el gen OtsB fusionado con el promotor PR-la de tabaco . El plásmido pPRIOTSA se digiere con Xhol, y los extremos sobresalientes se rellenan con ADN polimerasa Klenow (Promega, Madison, Wl) y luego se digiere adicionalmente con Spel . El fragmento de 2.6 kb de largo resultante se purifica en gel y se liga en el sitio EcoRI rellenado, y en el sitio Spel de pPRIOTSB, para obtener pPRIOTSAB, que contiene al gen OtsA fusionado con el promotor PR-la de tabaco, y al gen OtsB fusionado con el promotor PR-la de tabaco. El plásmido pPRIOTSB se digiere con Apal y Xbal, el fragmento de 4.6 kb de largo que contiene al gen OtsA fusionado con el promotor PR-la de tabaco y el gen OtsB fusionado con el pro-motor PR-la de tabaco se purifica en gel y se liga en los sitios Apal y Xbal de pBHYGM para obtener el vector binario pEGL502 (pBHYGM es un vector pGPTV-Hyg modificado (Becker y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 20, 1195-1197) producido mediante la inserción de un polienlazador que contiene los sitios de restricción Bfrl/Apal/Clal/Smal/Bfrl/Xbal/Sall/Pstl/-Sphl/HindlII en los sitios EcoRI y Xbal de pGPTV-Hyg) .

Eiemplo 4: Preparación de un vector binario que contiene al gen OtsA fusionado con el iniciador PR-la de tabaco. El plásmido pPRIOTSA se digiere con Apal y Xbal, y el fragmento de 2.6 kb de largo que contiene al gen OtsA fusionado con el promotor PR-la de tabaco se purifica en gel y se liga en los sitios Apal y Xbal de pBHYGM para obtener un vector binario que contiene al gen OtsA fusionado con el promotor PR-la de tabaco.

Eiemplo 5; Preparación de un vector binario que contiene al gen OtsB fusionado con el promotor PR-la de tabaco. El plásmido pPRIOTSB se digiere con Apal y Xbal, y el fragmento de 2.0 kb de largo que contiene al gen OtsB fusionado con el promotor PR-la de tabaco se purifica en gel y se liga en los sitios Apal y Xbal de pBHYGM, para obtener un vector binario que contiene al gen OtsB fusionado con el promotor PR-la de tabaco .

Eiemplo 6; Transformación de discos de hoja de tabaco mediante A. tumefaciens Las construcciones del vector binario se transforman en la cepa GV3101 de A. tumefaciens (Bechtold, N. y colaboradores (1993), CR Acad. Sci. París, Sciences de la vie, 316:1194-1199) mediante electroporación (Dower, W.J. (1987), Mol. Biol. Rep 1:5) . Los discos de hoja de Nicotiana tabacum variedad 'Xanthi nc ' y de la línea transgénica "NahG" que sobreexpresa un gen de hidroxilasa de salicilato (Gaffney y colaboradores (1993) Science 261: 754-756) se cocultivan con clones de Agrobacterium que contienen las construcciones anteriormente mencionadas (Horsch y colaboradores (1985), Science 227: 1229-1231) y se seleccionan transformantes para determinar la resistencia a 50 miligramos/mililitro de higromicina B. Se seleccionan aproximadamente 50 líneas de higromicina independientes (líneas T0) para cada construcción, y se arraigan sobre un medio exento de hormonas .

Eiemplo 7; Selección de lineas transgénicas con la expresión del gen biosintético de trehalosa inducible Para cada línea transgénica, se incuba una perforación de hoja de aproximadamente de 2 a 3 centímetros cuadrados durante 2 días en 3 mililitros de S-metiléster del ácido ben-zo (1, 2 , 3) tiadiazol-7-carbotioico (BTH, 5.6 miligramos/milili-tro), bajo irradiantes de aproximadamente 300 mmol/m^s"1. El material de hoja se cosecha, se congela por evaporación, y se muele en nitrógeno líquido. Se extrae el ARN total (Verwoerd y colaboradores (1989) NAR 17, 2362), y se realiza el análisis Northern blot como se describe (Ward y colaboradores (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) utilizando sondas radiomarcadas específicas para los genes OtsA y OtsB. Se seleccionan las líneas transgénicas con una alta expresión inducible de los genes biosintéticos de trehalosa en la presencia del inducto químico, y baja expresión de fondo en ausencia del inductor químico. En particular, se seleccionan dos líneas transgénicas N5 y N6, y se auto-polinizan, y se utiliza su progenie para una análisis adicional .

Eiemplo 8; Transformación de maíz El método utilizado para la transformación de maíz ha sido descrito por Koziel y colaboradores (Biotechnology 11, 194-200, 1993) utilizando bombardeo de partículas hacia células de embriones inmaduros. La transformación de maíz con cuando menos uno de los plásmidos descritos en la presente se logra mediante bombardeo de microproyectiles de embriones cigóticos inmaduros o cayo embriogénico tipo I propagable en serie. Los cultivos de cayo embriogénico tipo I (Green y colaboradores Miami Winter Symposium 20, 1983) del genotipo propieta-rio CG00526 y CG00714 se inician a partir de embriones inmadu-ros, de 1.5 a 2.5 milímetros de longitud, de material cultivado en invernadero. Los embriones se cortan asépticamente de las mazorcas esterilizadas superficialmente, aproximadamente 14 días después de la polinización. Los embriones de CG00526 se co-locan sobre un medio de inicio de cayo D con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de clorambeno (Duncan y colaboradores, Planta 165: 322-332, 1985) mientras que aquéllos de CG00714 se colocan sobre un medio de inicio de cayo KM con sacarosa al 3 por ciento y 0.75 miligramos/litro de 2, 5-d (Kao y Michayluk, Planta 126: 105-110, 1975) . Los embriones y los cultivos embriogénicos subsecuentemente se cultivan en la obscuridad. Se remueven las respuestas embriogénicas de los explantes después de aproximadamente 14 días. Las respuestas de CGO0526 se colocan sobre un medio de mantenimiento de cayo D con sacarosa al 2 por ciento y 0.5 miligramos/litro de 2,4-d, mientras que aquéllas de CG00714 se colocan sobre un medio de mantenimiento de cayo KM con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de Dicamba. Después de 3 a 8 semanas de su cultivo selectivo semanal hacia un medio de mantenimiento fresco, se establecen cultivos embriogénicos compactos de alta calidad. Se seleccionan las piezas de cayo embriogénico que crecen activamente como el tejido blanco para el suministro del gen. Las piezas de cayo se aplican sobre placas blanco que contienen medio de mantenimiento con sacarosa al 12 por ciento aproximada-mente 4 horas antes del suministro del gen. Las piezas de cayo se arreglan en círculos, con radios de 8 y 10 milímetros desde el centro de la placa blanco. El ADN del plásmido se precipita sobre microportadores de oro como se describe en el manual de DuPont Biolistics. Se utilizan de dos a tres microgramos de cada plásmido en cada preparación de microportadores de 6 disparos. Los genes se suministran a las células de tejido blanco utilizando el dispositivo Biolistics PDS-lOOOHe. Las posiciones del dispositivo Biolistics son como sigue: 8 milímetros entre el disco de rup-tura y el macroportador, 10 milímetros entre el macroportador y la malla de paro, y 7 centímetros entre la malla de paro y el blanco. Cada placa blanco se dispara dos veces utilizando discos de ruptura de 45.5 kg/cm2. Se coloca una malla de acero inoxidable 200 x 200 (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) entre la malla de paro y el tejido blanco. Siete días después del suministro del gen, las piezas de tejido blanco se transfieren desde el medio altamente osmótico hasta el medio de selección de nivel alto. Todos los aminoácidos se remueven del medio de selección. Después de 5 a 8 sema-ñas sobre este medio de selección de alto nivel, cualquier cayo en crecimiento de CGO0526 se subcultiva hacia el medio de nivel bajo a mediano. La selección sobreviviente del tejido a partir de una pieza de tejido blanco original se subcultiva como una sola colo-nia, y se designa como un evento de transformación independien-te. En ese punto, las colonias seleccionadas sobre el medio de selección se transfieren a un medio MS modificado (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962) que contiene sacarosa al 3 por ciento (MS3S) sin agente de selección, y se coloca en la luz. Para CG00526, se agregan 0.25 miligramos/litro de an-cimidol y 0.5 miligramos/litro de cinetina a este medio para inducir la germinación del embrión, mientras que para CGO0714, se agregan 2 miligramos/litro de benciladenina. Las colonias en regeneración de transfieren a un medio MS3S sin ancimidol y cinetina o benciladenina después de 2 semanas. Los retoños en regeneración con o sin raíces de todas las colonias se transfieren a cajas Magenta que contiene medio MS3S, y las plantas pequeñas con raíces eventualmente se recu-peran y se transfieren a la tierra en el invernadero. También se han creado eventos de transformación utilizando cayo tipo I obtenido de embriones cigóticos inmaduros utilizando técnicas de cultivo convencionales. Para el suministro del gen, se preparan aproximadamente 300 miligramos de cayo tipo I me-diante subcultivo en medio fresco 1 a 2 días antes del suministro del gen, seleccionando las piezas de tejido blanco, y colocándolas en un patrón de anillo de 10 milímetros desde el centro de la placa blanco sobre el medio que contiene nuevamente sacarosa al 12 por ciento. Después de aproximadamente 4 horas, el tejido se bombardea utilizando el dispositivo Biolistic PDS-1000/He de DuPont. Los plásmidos se precipitan sobre partículas de oro de 1 miera utilizando el protocolo convencional de DuPont. Los genes se suministran utilizando dos disparos por placa blanco a 45.5 kg/cm2. Aproximadamente 16 horas después del suministro del gen, el cayo se transfiere a un medio de cultivo estándar que contiene sacarosa al 2 por ciento, sin agente de selección. A los 12 ó 13 días después del suministro del gen, las piezas de tejido blanco se transfieren al medio de selección que contiene 40 miligramos/litro de fosfinotricina, ya sea como Basta o bialafos. El cayo se subcultiva sobre selección durante 12 a 16 semanas, después de lo cual, el cayo sobreviviente y en crecimiento se transfiere a un medio de regeneración estándar. _ Eiemplo 9; Transformación de trigo La transformación de embriones inmaduros y de cayo derivado de embrión inmaduro utilizando bombardeo de partículas ha sido descrita por Vasil y colaboradores (Biotechnology 11: 1553-1558, 1993) y Weeks y colaboradores (Plant Physiology 102: 1077-1084, 1993) . Una técnica preferida para la transformación de trigo involucra el bombardeo con partículas de embriones de trigo inmaduros, e incluye ya sea un paso alto en sacarosa o bien alto en maltosa antes del suministro del gen. Antes del bombardeo, se aplican cualquier número de embriones (de 0.75 a 1 milímetro de longitud) sobre un medio MS con sacarosa al 3 por ciento (Murashige y Skoog, 1962), y 3 miligramos/litro de 2,4-D para la inducción de embriones somáticos, la cual se permite proceder en la obscuridad. En el día elegido del bombardeo, se remueven los embriones del medio de inducción, y se colocan sobre el osmótico (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa agregada en la concentración deseada, normalmente al 15 por ciento) . Los embriones se dejan plasmolizar durante 2 a 3 horas, y luego se bombardean. Es típico 20 embriones por placa blanco, aunque no es crítico. Se precipita un plásmido portador del gen apropiado sobre partículas de oro de tamaño en mieras utilizando procedimientos convencionales. Cada placa de embrión se dispara con el dispositivo de helio DuPont Biolistics utilizando una presión de ráfaga de aproximadamente 70 kg/cm2, y utilizando una malla 80 estándar. Después del bombardeo, los embriones se regresan a la obscuridad para recuperarse durante aproximadamente 24 horas (todavía sobre el osmótico) . Después de 24 horas, se remueven los embriones del osmótico, y se colocan de regreso sobre el medio de inducción, en donde se quedan durante aproximadamente 1 mes antes de la regeneración. Aproximadamente 1 día después, los explantes de embrión con cayo embriogénico en desarrollo se transfieren al medio de regeneración (MS + 1 miligramo/litro de NAA, 5 miligramos/litro de GA) , que contiene además el agente de selección apropiado. Después de aproximadamente 1 mes, los retoños desa-rrollados se transfieren a recipientes estériles más grandes conocidos como GA7s, que contienen MS a media concentración, sacarosa al 2 por ciento, y la misma concentración de agente de selección. La transformación estable de trigo se describe con detalle en la Solicitud de Patente Europea Número EP 0,674,715.

Eiemplo 10; Transformación de arroz Las espiguillas inmaduras con endosperma lechoso de la variedad de arroz Japónica "Taipei 309", se descascaran y se es-terilizan superficialmente con etanol al 70 por ciento (volumen/volumen) durante 1 minuto, e hipoclorito de calcio al 6 por ciento durante 20 minutos, seguido por tres lavados con agua destilada estéril. Los embriones inmaduros aislados se cultivan a 28 °C sobre un medio MS solidificado con agarosa al 0.35 por ciento (Murashige y Skoog, 1962) , que contiene sacarosa al 3 por ciento, 2 miligramos/litro de ácido 2 , 4-diclorofenoxiacético (2,4-D), pH de 5.8. Después de una semana, el material de cayo producido a partir del escutelo se divide y se cultiva mediante trans-ferencia semanales sobre un medio fresco. 4 semanas después del inicio, se transfieren de 3 a 4 cayos hacia un recipiente de cultivo de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de medio R2 (sales R2 y vitaminas [Ohira y colaboradores 1973] , 1 miligramo/litro de 2,4-D, 500 miligramos/litro del ácido 2-morfolinoetansulfónico [MES] , sacarosa al 3 por ciento, pH de 5.8) . Los cultivos se mantienen en luz suave a 28°C sobre un agitador giratorio a 220 rpm, y el medio se reemplaza semanalmente por una cantidad igual de medio fresco. Dividiendo rápidamente, los cayos frágiles se seleccionan y se subcultivan en un recipiente fresco transfiriendo 2 mililitros de suspensión de cayo fino hacia 20 mililitros de medio R2. Los cultivos en suspensión de dos a tres meses de edad que se han subcultivado con tres a cuatro días de anticipación, sirven como células blanco para los bombardeos. 4 horas antes del bombardeo de partículas, se extienden aproximadamente 500 miligramos de células como una sola capa de 2 centímetros de diámetro sobre un medio de plasmólisis solidificado con agarosa al 0.35 por ciento (sales R2 y vitaminas 1 miligramo/litro de 2,4-D, sacarosa al 3 por ciento, sacarosa 0.5 M, pH de 5.8) contenido en una caja Petri de 5.5 centímetros. Se utiliza una pistola de influjo de partículas (Finer y colaboradores, 1992) para suministrar las partículas de oro recubiertas con ADN (Aldrich Cat # 32,658-5, polvo de oro esférico de -1.5 a 3.0 mieras) hacia adentro de la células embriogéni-cas en suspensión. El recubrimiento de partículas se realiza esencialmente como es descrito por Vain y colaboradores (1993) : se distribuyen alícuotas de 5 microlitros de la solución del plásmido en tubos de reacción de 0.5 mililitros, y se colocan sobre hielo. Las partículas se suspenden en etanol al 96 por ciento a 100 miligramos/mililitro, y se ponen en agitación en vortex durante 2 minutos. El etanol es reemplazado por un volumen igual de ddH20 estéril, y la suspensión se agita vortex durante 1 minuto. Este paso de lavado se tiene que repetir una vez. Las partículas se vuelven a suspender finalmente en ddH20 estéril a 100 miligramos/mililitro. Se agregan 25 microlitros de la suspensión de partículas a cada una de las alícuotas de ADN, y los tubos se agitan en vortex durante 1 minuto, seguido por la adición inmediata de 25 microlitros de CaCl2 helado estéril (2.5 M en ddH20) , y se agitan adicionalmente en vortex durante 1 minuto. Se agregan 10 microlitros de espermidina estéril (0.1 M en ddH20) , la suspensión se agita en vortex nuevamente, y se coloca sobre hielo durante 5 minutos, durante lo cual se sedimentan las partículas. Se remueven 50 microlitros del sobrenadante exento de partículas, y la suspensión restante (15 microlitros) se utiliza para 5 bombardeos. Antes de cada bombardeo, se necesita volver a suspender las partículas mediante paso por pipeta intenso. Las células se cubren con una pantalla de malla de 500 mieras, y se colocan a 14 centímetros debajo de la unidad de fil-tro que contiene las partículas. Las partículas se liberan mediante un solo impulso de una presión de 8 bar de 50 milisegundos en un vacío parcial (2 x 104 Pa) . 24 horas después del bombardeo con uno de los vectores de transformación mencionados, las células se transfieren a un me-dio R2I creciente en cayo selectivo, solidificado con agarosa al 0.3 por ciento (sales R2 , 1 miligramo/litro de 2,4-D 1 miligramo/litro de tiamina-HCl, 500 miligramos/litro de MES, sacarosa al 6 por ciento, pH de 5.8) , que contiene un agente de selección adecuado, tal como, por ejemplo, 30 miligramos/litro de paromomicina y se mantiene a 28°C en la obscuridad durante 3 semanas, hasta que llegan a ser visibles las colonias resistentes a paromomicina (PamR) bajo el estereomicroscopio. Las colonias PamR se transfieren a un medio R2I fresco que contiene 40 miligramos/litro de paromomicina, y se cultivan en la obscu-ridad (subcultivo semanal) . Después de 2 semanas, las colonias PamR se transfieren a R2I solidificado con agarosa al 0.5 por ciento que contiene 40 miligramos/litro de paromomicina, y se cultivan durante 1 semana en la obscuridad. Para la regeneración, las colonias se transfieren entonces a un medio de induc-ción de retoños solidificado con agarosa al 0.8 por ciento (R2R: sales R2 , vitaminas MS, sacarosa al 2 por ciento, sorbitol al 3 por ciento, 1 miligramo/litro de zeatina, 0.5 miligramos/litro de IAA, 40 miligramos/litro de paromomicina) , y se cultivan en la luz hasta que se forman los retoños. En parale-lo, el material de cayo se mantiene sobre un medio R2I que contiene 40 miligramos/litro de paromomicina, y se cultiva en la obscuridad con subcultivos semanales, con el objeto de obtener las líneas celulares homoplásmicas .

B. Expresión de los genes de trehalosa -6- fosfato sintasa y de trehalosa- 6- fosfato fosfatasa de en el plástido de la planta . Bl. Expresión Inducible Eiemplo 11; Construcción del vector pAT236 para la recombi-nación homologa en el genoma del plástido. La región intergénica de trnV y rpsl2/7 del genoma del plástido de tabaco se modifica para la inserción de genes quiméricos mediante recombinación homologa. Una región de 1.78 kb (posiciones 139255 a 141036, Shinozaki y colaboradores (1986) EMBO J. 5:2043-2049) se amplifica con reacción en cadena de la polimerasa a partir del genoma del plástido de tabaco, y se inserta un sitio PstI después de la posición 140169, produciendo 915 pares de bases y 867 pares de bases del ADN del plástido de flanqueo, 5' y 3' del sitio de inserción PstI . La amplificáción con reacción en cadena de la polimerasa (ADN polimerasa PfuTurbo, Stratagene, La Jolla, CA) se realiza con un par ini-ciadore que inserta un sitio BsiEI antes de la posición 139255 (5' -TAA CGG CCG CGC CCA ATC ATT CCG GAT A-3, SEQ ID No: 5) y un sitio PstI después de la posición 140169 (5 ' -TAA CTG CAG AAA GAA GGC CCG GCT CCA A-3 ' , SEQ ID No: 6) la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa también se realiza con un par iniciador que inserta un sitio PstI antes de la posición 140170 (5' -CGC CTG CAG TCG CAC TAT TAC GGA TAT G-3 ' , SEQ ID No.7) y un sitio BsiWI después de la posición 141036 (5' -CGC CGT ACG AAA TCC TTC CCG ATA CCT C-3', SEQ ID N?:8) . el fragmento Pstl-BsiEI se inserta en los sitios PstI-SacII de pbluescript SK+ (Stratagene) , produciendo pAT216, y el fragmento PstI-BsiWI se inserta en los sitios PstI-Acc65I de pbluescript SK+, produciendo pAT215. PAT218 contiene 1.78 kb del ADN del plástido con un sitio PstI para la inserción de los genes quiméricos y los marcadores seleccionables, y se construyen mediante ligamiento del fragmento PstI-Scal de 2.0 kb de pAT215, y la banda PstI-Scal de 2.7 kb de pAT216.

I. Amplificación del promotor de ARNr de 16S de tabaco, y del sitio de enlace de ribosoma del gen rbcL. El promotor de ARNr de 16S se amplifica con reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN de tabaco (N. tabacum, variedad Xanthi) , y se fusiona con un sitio de enlace de ribosoma (rbs) sintético del gen rbcL del plástido de tabaco. El iniciador de la "cadena superior" inserta un sitio EcoRI en el extremo 5 ' del promotor de AR?r de 16S antes de la posición 102568 (5' -GCC AGA ATT CGC CGT CGT TCA ATG AGA ATG-3 ' , SEQ ID ?o:9). El amplificador de la "cadena inferior" se amplifica hasta la posición 102675 del promotor de AR?r de 16S, remueve dos ATG corriente arriba cambiando las posiciones 102661 (A a C) y 102670 (A a C) , agrega el sitio de enlace de ribosoma del gen rbcL (posiciones 57569-57584) como una extensión 5' del iniciador, e inserta un sitio BspHI en el extremo 3 ' del sitio de en-lace de ribosoma (5 ' -GCC TTC ATG ATC CCT CCC TAC AAC TAT CCA GGC GCT TCA GAT TCG-3 ' , SEQ ID No. 10) . El producto de la amplificación de 142 pares de bases se purifica en gel, y la disociación con EcoRI y BspHI produce un fragmento de 128 pares de bases que contiene al promotor de ARNr de 16S de tabaco fusionado con el sitio de enlace de ribosoma del gen rbcL.

II. Amplificación de la secuencia de ARN no traducida 3 ' (3 'UTR) del gen rpslß del plástido de tabaco. La 3 'UTR de rpsl6 del plástido de tabaco se amplifica con reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN de tabaco (N. tabacum variedad Xanthi) , utilizando el siguiente par de oligonucleótidos: se agrega un sitio Spel inmediatamente después del codón de paro del gen rpsl6 del plástido que codifica la proteína ribosómica S16 con el iniciador de la "cadena superior" (5' -CGC GAC TAG TTC AAC CGA AAT TCA AT-3 ' , SEQ ID ?o.ll) y se agrega un sitio PstI en el extremo 3 ' de la 3 ' UTR de rpsl6 con el iniciador de la "cadena inferior" (5' -CGC TCT GCA GTT CAÁ TGG AAG CAÁ TG-3 ' , SEQ ID ?o . 12). El producto de la amplificación se purifica en gel, y se digiere con Spel y PstI, produciendo un fragmento de 163 pares de bases que contiene la 3'UTR-de rpsl6 de tabaco (posiciones 4941 a 5093 del genoma del plástido de tabaco, Shinozaki y colaboradores, 1986) , flaqueada 5' por un sitio Spel, y 3' con un sitio PstI.

III. Construcción de un cásete de promotor de ARNr de 16S: :gen aadA: :3 'UTR de rpslß , para la selección de transformación del plástido . La secuencia de codificación del gen aadA, un gen bacte-riano que codifica la enzima aminoglicósido-3 ' ' -adenil-transferasa que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina, se aisla a partir de pRL277 (Black y colaboradores (1993), Molecular Microbiology 9:77-84 y Prentki y colaboradores (1991) Gene 103: 17-23) . La porción mayor 5' de la se-cuencia de codificación aadA se aisla como un fragmento BspHI-BssHII de 724 pares de bases a partir de pRL277 (el codón de inicio está en el sitio BspHI) , y el resto 3' del gen aadA se modifica mediante la adición de un sitio Spel 20 pares de bases después del codón de paro mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizando pRL277 como plantilla, y el siguiente par de oligonucleótidos: el iniciador de la "cadena superior" (5 ' -ACC GTA AGG CTT GAT GAA-3 ' , SEQ ID No : 13), y el iniciador de la "cadena inferior" que agrega un sitio Spel (5' -CCC ACT AGT TTG AAC GAA TTG TTA CAG-SEQ ID No : 14 ) . El pro-ducto de la amplificación de 658 pares de bases se purifica en gel, se digiere con BssHII, Spel, y el fragmento de 89 pares de bases se liga a la porción 5 ' del gen aadA llevado sobre un fragmento BspHI-BssHII de 724 pares de bases, el promotor de ARNr de 16S, y el sitio de enlace de ribosoma de rbcL llevado sobre un fragmento amplificado con reacción en cadena de la po-limerasa EcoRI-BspHI de 128 pares de bases, y el vector pLIT-MUS28 digerido con EcoRI-Spel (New England Biolabs) , produciendo el pAT223. El ligamiento de tres vías se realiza sobre un fragmento EcoRI-Spel de 0.94 kb de pAT223 que contiene al gen aadA impulsado por el promotor de ARNr de 16S-sitio de enlace de ribosoma, un fragmento de la reacción en cadena de la polimerasa digerido con Spel, PstI de 163 pares de bases que contiene la 3 ' UTR de rpsl6, y pucl9 (New England Biolabs) cortado con EcoRI, PstI, para obtener el pAT229 que contiene al promotor de ARNr de 16S que impulsa al gen aadA con la 3 ' UTR de rps 16.

IV. Amplificación del promotor de gen 10 del bacteriófago T7.

El promotor del gen 10 del bacteriófago T7 se amplifica con reacción en cadena de la polimerasa a partir de pET-3d (Stratagene) utilizando el siguiente par de oligonucleótidos: el iniciador de la "cadena superior" insertó un sitio EcoRI en el extremo 5' del promotor T7 (5' -CCC GAA TTC ATC CCG CGA AAT TAA TA-31, SEQ ID No: 15), y el iniciador de la "cadena inferior" insertó un sitio Ncol en el extremo 3' (5 ' -CGG CCA TGG GTA TAT CTC CTT CTT AAA GTT AAA-3 ' , SEQ ID No:16) . El producto de la amplificación se purifica en gel, y la disociación con EcoRI, en Ncol produce un fragmento de 96 pares de bases que contiene al promotor T7.

V. Amplificación del terminador del gen 10 del bacteriófago ti. El terminador del gen 10 del bacteriófago T7 se amplifica con reacción en cadena de la polimerasa a partir de pET-3d (Stratagene), utilizando el siguiente par de oligonucleótidos: el iniciador de la "cadena superior" inserta un sitio HindIII en el extremo 5' del terminador (5 ' -GCG AAG CTT GCT GAG CAÁ TAA CTA GCA TAA-3 ' , SEQ ID No: 17), y el iniciador de la "cadena in-ferior" inserta un sitio PstI en el extremo 3 ' del terminador (5' -GCG CTG CAG TCC GGA TAT AGT TCC TCC T-3 ' -SEQ ID No: 18). El producto de la amplificación se purifica en gel, y la disociación con HindIII-PstI produce un fragmento de 86 pares de bases que contiene el terminador T7.

VJ. ha amplificación de la secuencia de ARN no traducida 3 ' del plástido psbA de Arabidopsis thaliana La 3 'UTR del plástido psbA de A. thaliana se amplifica con reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN de A. thaliana (ecotipo Landsburg) , utilizando el siguiente par de oligonucleótidos: el iniciador de la "cadena superior" agrega un sitio Spel al extremo 5' de la 3 'UTR, y elimina un sitio Xbal en la secuencia nativa, mutando una G a una A (subrayada) (5' -GCG ACT AGT TAG TGT TAG TCT AAA TCT AGT T-3, SEQ ID No:19) , y el iniciador de la "cadena inferior" agrega un sitio HindIII al extremo 3' de la UTR (5' -CCG CAÁ GCT TCT AAT AAA_ AAA TAT ATA GTA-3 ' , SEQ ID NO:20) . La región amplificada se extiende desde la posición 1350 hasta 1552 del número de acceso GenBank X79898. El producto de la reacción en cadena de la polimerasa de 218 pares de bases se purifica en gel, se digiere con Spel y HindIII, y se liga con el fragmento de TLa reaccionen cadena de la polimerasa cortado HindIII-PstI que lleva el terminador T7, hacia los sitios Spel-PstI de pbluescript skistratagene) , produciendo pPH171. El análisis de secuencia de la región 3 ' -UTR de psbA del pPH171, comparándose con el número de acceso GenBank X79898, revela una supresión de una A en la posiciones 1440 y 1452.

VII. Preparación de un gen quimérico que contiene el gen reportero GUS fusionado con un promotor y terminador del gen 10 del bacteriófago T7, y la 3 'UTR de psbA del plástido de Arabidopsis en un vector de transformación del plástido. Se construye un cásete del promotor del gen 10 del bacteriófago T7::gen GUS: :3 'UTR de psbA de A. thaliana : : terminador T7, con un ligamiento de 4 vías del fragmento de reacción en cadena de la polimerasa EcoRI, Ncol de 96 pares de bases que contiene al promotor T7, un fragmento Ncol, Xbal de 1.86 kb a partir de pC8 que contiene al gen GUS, y el fragmento Xbal, PstI de 295 pares de bases de pPH171 que contiene la 3 'UTR de psbA de A. thaliana y el terminador T7 en los sitios EcoRI , PstI de pGEM-3Z (Stratagene), produciendo el plásmido pAT221. El cásete del gen GUS impulsado por el promotor T7 se liga con el cásete del marcador seleccionable aadA clonando el fragmento HindIII, EcoRI de 1.1 kb de pAT229 que contiene el cásete de promotor de ARNr de 16S-sitio de enlace de riboso-ma: :aadA: :3 'UTR de rpsl6, y el fragmento EcoRI , PstI de 2.26 kb de pAT221 que lleva el cásete de promotor T7 : :GUS : : 3 'UTR de psbA:: terminador T7, hacia los sitios HindIII, PstI de pbluescript sk+ (Stratagene), produciendo el plásmido pAT232. El vector de transformación del plástido pAT236 se construye li-gando la banda PstI de 3.36 kb a partir de pAT232 que contiene los casetes de GUS y marcador seleccionable, hacia en el sitio PstI de pAT218, y rastreando una orientación de inserto en donde se transcriba el gen GUS en la misma dirección que el marco de lectura abierta rpsl2/7.

Eiemplo 12; Construcción de un vector utilizando un tramo de poliguanosina como un sustituto para una 3' UTR. Se ha demostrado que un tramo de políguanosina sustituye la 3 'UTR del gen del plástido atpB in vivo (Drager y colabora-dores (1996) RNA 2:652-663) . Un tramo de poli G que contiene 18 residuos consecutivos de guanosina flanqueados por los extremos pegajosos Spel, HindIII sobre los extremos 5' y 3' respectivamente, se ensambla templando los siguientes dos oligonucleótidos cinasados: (5 ' -CTA GTG GGG GGG GGG GGG GGG GGA-3 ' , SEQ ID No:21) y (5'-AGC TTC CCC CCC CCC CCC CCC CCA-3 ' , SEQ ID No.22).

El tramo poliG?8 que contiene los extremos pegajosos Spel, Hin-dlll, se liga con el fragmento de reacción en cadena de la polimerasa digerido con HindIII, PstI que contiene el terminador T7, en los sitios Spel, PstI de pbluescript SK+ (Stratagene) .

Eiemplo 13 ; Preparación de un gen quimérico que contiene el gen de trehalosa-6 -fosfato sintasa de E. coli (OtsA) fusionado con el promotor del gen 10 del fago T7 en un vector de transformación del plástido. Se utiliza ADN genómico a partir de E. coli , cepa DH5-alfa como plantilla para al amplificación con reacción en cadena de la polimerasa de la porción 5 ' del gen OtsA, con un cebador de la cadena superior que incorpora el codón de inicio ATG seguido por un codón GCA recién agregado, creando de esta manera un si-tio de restricción Ncol (cebador pOTSAN+ : 5 ' -TGA CCA TGG CA GTC GTT TAG TCG TAG T- ' -SEQ ID NO: 23), y un iniciador de la cadena inferior corriente abajo del sitio de restricción único Sful en OtsA (pOTSAN- : 5 ' -AGC AAC GCT TCA TAG^3'-SEQ ID NO:24). Las reacciones en cadena de la polimerasa se emprenden en volú-menes de 50 microlitros utilizando polimerasa de ADN PFU (Pro-mega) , como es recomendado por el fabricante, en un Termocicla-dor de ADN 480 (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) por cinco ciclos a 94°C (30 segundos) , 40°C (60 segundos) , y 72°C (30 segundos) , seguidos por 25 ciclos a 94°C (30 segundos) , 55°C (60 segundos), y 72°C (30 segundos) . El producto de la reacción en cadena de la polimerasa de 850 pares de bases se purifica en gel utilizando procedimientos convencionales, y se disocia con Ncol ' (todas las enzimas de restricción se obtienen en New England Biolabs, excepto en donde se observe de otra manera) , y Sful (Boehringer Mannheim, Corp., Indianapolis) para liberar un fragmento de ADN de 661 pares de bases. La porción 3' de OtsA se obtiene de una manera similar a la descrita anteriormente, utilizando un iniciador de la cadena superior (pOTSAX+ : 5 ' -GCG TTC CTG GAT TGT C-3 ' -SEQ ID No:25), localizado corriente arriba del sitio Sful en OtsA, y un iniciador de la cadena inferior (pOTSAX. :5'-GGG TCT AGA GAT TCA CGC GAG CTT TGG AAA GGT AGC A-3', SEQ ID No:26) . que introduce un sitio de restricción Xbal corriente abajo del codón de paro, y destruye el sitio de restricción HindIII presente en el extremo 3 ' de OtsA, cambiando el codón CTT Leu a CTC. El producto de la amplificación de 861 pares de bases se purifica en gel, se digiere con Sful y Xbal, y el fragmento de ADN de 772 pares de bases resultante se liga con el fragmento Ncol/Sful de OtsA 5' en pLitmus28 (Promega) digerido con Ncol y Xbal, para crear el pOTSA. El ADN del plásmido a partir de pAT236 (Ejemplo 11) , que contiene un cásete del promotor del gen 10 del fago T7 a partir de pET3a (Novagen) en un vector de transformación del plástido, se digiere con Ncol y Sphl (para crear un fragmento de 1646 pares de bases) , y Sphl y Xbal (para crear un fragmento de 4514 pares de bases) . Estos fragmentos de vector se ligan en una re-acción de tres vías con el fragmento Ncol/Xbal de 1433 pares de bases de pOTSA, que contiene el gen OtsA completo, para crear el vector de transformación de plástido pT7-0TSA.

Eiemplo 14; Preparación de un gen quimérico que contiene el gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa de E. coli (OtsB) fusionado con el promotor del gen 10 del fago T7 en un vector de transformación del plástido. La porción 5 ' del gen OtsB se amplifica a partir del ADN genómico de E. coli como se describe anteriormente, utilizando el iniciador de la cadena superior pOTSBN+ : 5 ' -GTC GCC ATG GTG ACÁ GAA CCG TTA ACC-3 ' SEQ ID No.27, que convierte el codón de inicio GTG de OtsB a ATG, y agrega un codón GTG Val en la segunda posición, y el iniciador de la cadena inferior pOTSBN- : 5' -GTT CGC CCG ATA AAG GGA G-3 ' , SEQ ID No:28, localizado corriente abajo del sitio Bglll único de OtsB. El producto de 584 pares de bases se purifica en gel, y se digiere con Ncol y Bglll, y se aisla el fragmento de 459 pares de bases resultante. La porción 3' de OtsB se amplifica de una manera similar utilizando el iniciador de la cadena superior pOTSBX+ : 5 ' -TAG CGC AAC GTA TTA CTC-3 ' -SEQ ID NO:29, localizado corriente arriba del sitio Bglll de OtsB, y el iniciador de la cadena inferior pOTSBX-5' -GCC TCT AGA CTC ATC ATT AGA TAC TAC GAC TAA AC-3', SEQ ID No.30, que incorpora un sitio de restricción Xbal corriente abajo del codón de paro de OtsB. El producto de 381 pares de bases purificado en gel se digiere con Bglll y Xbal, y el fragmento de restricción Bglll/Xbal de 354 pares de bases resultante se liga con el fragmento de restricción NcoI/BglII de OtsB 5', en el vector pLitmus28 digerido con Ncol y Xbal, para crear el pOTSB. Luego el plásmido pOTSB se digiere con Ncol y Xbal, y el fragmento de 820 pares de bases resultante que contiene el gen OtsB completo, se liga en una reacción de 3 vías con los fragmentos Ncol/Sphl y Sphl/Xbal del plásmido pAT236, como se describe anteriormente, para crear el vector de transformación de plástido pT7_OTSB.

Eiemplo 15; Preparación de un vector de transformación de plástido que contiene una construcción de gen quimérico de tipo operón que contiene los genes OtsA y OtsB fusionados con un promotor y terminador del bacteriófago T7. El plásmido pOTSB se digiere con Ncol y Spel, y se aisla el fragmento de la estructura base del vector/OtsB de 3534 pares de bases, y se desfosforila. Este fragmento se liga con un enlazador de oligonucleótidos sintético que contiene una porción de la 5 'UTR del gen 10 del fago T7, y un sitio de enlace de ribosoma del plástido en consenso quimérico preparado mediante templado, y luego fosforilando con cinasa T4 el oligonucleótido de la cadena superior 5 'CTA GTG GGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAG TTT AAG AAG GGG AGA GAA T-3', SEQ ID NO:31 (colgadura del sitio de restricción Spel subrayada) , y el oligonucleótido de la cadena inferior 5 ' -CAT GAT TCT CTC CCC TTC TTA AAC TTA AAC AAA ATT ATT TCT AGA GGG AAA CCG TTG TGG TCT CCC A-3 ' , SEQ ID NO: 32 (colgadura del sitio de restricción BspHI subrayada) . El plásmido resultante pOTSBL se digiere con Spel, y se liga con un fragmento Spel/Xbal de 1516 pares de bases de pOTSA seleccionado para la orientación Spel--OtsA: : enlazador :: OtsB, para crear pOTSABL. Luego el plásmido pOTSABL se digiere con Ncol y Xbal (parcial) , y el fragmento de 2313 pares de bases resultante que contiene el cásete OtsA: :T75 ' /RBS :: OtsB completo, se liga en una reacción de tres vías con los fragmentos Ncol/Sphl y Sphl/Xbal del plásmido pAT236 como se describió anteriormente, para crear el vector de_-transformación del plástido pT7_OTSAB. También se crea un vector de transformación de plástido similar, que comprende omitir la porción de la 5 'UTR del gen 10 del fago T7, utilizando métodos convencionales en biología molecular.

B2. Expresión constitutiva Eiemplo 16; Amplificación del Promotor del Gen clpP del Plástido de Tabaco, y ARN no Traducido 5 ' Completo (5'UTR). Se utiliza ADN total a partir de N. tabacum variedad "Xanthi NC" como la plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa, con un iniciador de la "cadena superior" de izquierda a derecha que comprende un sitio de restricción EcoRI introducido en la posición -197 en relación con el codón de inicio ATG del gen clpP del plástido constitutivamente expresado (iniciador Pclp Pía: 5' -GCG GAA TTC ATA CTT ATT TAT CAT TAG AAA G-3 ' (SEQ ID No:33); sitio de EcoRI subrayado), y un iniciador de la "cadena inferior" de derecha a izquierda homólogo a la región desde -21 a -1 en relación con el codón de inicio ATG del promotor clpP que incorpora un sitio de restricción Ncol introducido al inicio de la traducción (iniciador Pclp_P2b: 5 ' -GCG CCA TGG TAA ATG AAA GAA AGA ACT AAA-3 ' (SEQ ID NO:34) ; sitio de restricción Ncol subrayado) . Esta reacción en cadena de la polimerasa se emprende con ADN polimerasa termoestable de Pfu (Stratagene, La Jolla CA) en un Ciclador Térmico Perkin Elmer 480 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 7 minutos a 95°C, seguidos por 4 ciclos de 1 minuto a 95°C/2 minutos a 43°C/l minuto a 72 °C, luego 25 ciclos de 1 minuto a 95°C/2 minutos a 55°C/l minuto a 72 °C. El producto de la amplificación de 213 pares de bases que comprende al promotor y la región no traducida 5 ' del gen clpP que contiene un sitio EcoRI en su extremo izquierdo y un sitio Ncol en su extremo derecho, y que corresponde a los nucleótidos 74,700 a 74505 de la secuencia de ADN del plástido de N. tabacum (Shinozaki y colaboradores, EMBO J, 5: 2043-2049 (1986) ) , se purifica en gel utilizando procedimientos conven-cionales, y se digiere con EcoRI y ?col (todas las enzimas de restricción se adquieren en New England Biolabs, Beverly, MA) Eiemplo 17; Amplificación de la Secuencia de ARN no Traducida 3 ' del Gen rpslß del Plástido de Tabaco Se utiliza ADN total de N. tabacum variedad "Xanthi NC" como la plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa como se describió anteriormente, con un iniciador de la "cadena superior" de izquierda a derecha que comprende un sitio de restricción Xbal introducido inmediatamente enseguida del codón de paro TAA del gen rpsl6 del plástido que codifica la proteína ribosomal S16 (iniciador rpsl6P_la (5 ' -GCG TCT AGA TCA ACC GAA ATT CA TTA AGG-3 ' (SEQ ID NO:35); sitio de restricción Xbal subrayado) , y un iniciador de la "cadena inferior" de derecha a izquierda homólogo a la región desde +134 hasta +151 en rela-ción con el codón de paro TAA de rpsl6, que incorpora un sitio de restricción HindIII introducido en el extremo 3' de la 3' UTR de rpsl6 (iniciador rpsl6S_lb (5 ' -CGC AAG CTT CAÁ TGG AAG CA TGA TAA-3 ' (SEQ ID NO: 36); sitio de restricción HindIII subrayado) . El producto de la amplificación de 169 pares de bases que contiene la región no traducida 3 ' del gen rpsl6, que contiene un sitio Xbal en su extremo izquierdo, y un sito Hin-dlll en su extremo derecho, y que contiene la región correspondiente a los nucleótidos 4943 a 5093 de la secuencia de ADN del plástido de N. tabacum (Shinozaki y colaboradores, 1986) se pu-rifica en gel, y se digiere con Xbal y HindIII.

Eiemplo 18; Preparación de un vector de transformación de plástido que contiene un fragmento del gen reportero GUS ligado con el promotor del gen clpP y las 5 ' y 3 ' UTRs . Se produce un fragmento de gen reportero de ß-galacturonidasa (GUS) de 1864 pares de bases a partir del plásmido pRAJ275 (Clontech) , que contiene un sitio de restricción Ncol en el codón de inicio ATG, y un sito Xbal enseguida de la 3 'UTR nativa, mediante digestión con Ncol y Xbal. Este frag-mentó se liga en una reacción de 4 vías al fragmento del promotor clpP EcoRl/NcoI de 201 pares de bases, al fragmento de la 3 'UTR de rpsl6 Xbal/HindIII de 157 pares de bases, y a un fragmento EcoRl/HindIII de 3148 pares de bases a partir del vector de clonación pGEM3Zf(-) (Promega, Madison Wl), para construir el plásmido pPH138. Se construye el vector de transformación de plástido pPH140 mediante digestión del plásmido pPRVllla (Zou-benko y colaboradores, (1994) Nucleic Acids Res 22:3819-24) con EcoRI y HindIII y ligando el fragmento resultante de 7287 pares de bases con un fragmento EcoRl/HindIII de 2222 pares de bases de pPH138.

Eiemplo 19; Preparación de un vector de transformación de plástido que contiene al gen OtsA ligado con el promotor de gen clpP y las 5" y 3 • UTRs. Un fragmento Ncol/Xbal de 1433 pares de bases de pOTSA que contiene el gen OtsA completo, se liga en una reacción de 4 vías al fragmento del promotor clpP EcoRl/NcoI del 201 pares de bases, al fragmento de la 3 'UTR de rpsl6 Xbal/HindIII de 157 pares de bases, y a un fragmento EcoRl/HindIII de 3148 pares de bases a partir del vector de clonación pGEM3Zf (-) (Promega, Madison Wl) para construir el plásmido pclpOtsA. Se construye un vector de transformación del plástido mediante digestión del plásmido pPRVllla con EcoRI y HindIII, y ligando el fragmento resultante de 7287 pares de bases con un fragmento Eco-Rl/HiñdlII de 1791 pares de bases de pclpOtsA.

Eiemplo 20; Preparación de un vector de transformación de plástido que contiene al gen OtsB ligado con el promotor de gen clpP y las 5' y 3'UTRs. El plásmido pOTSB se digiere con Ncol y Xbal, y el fragmento de 820 pares de bases resultante que contiene el gen OtsB completo, se liga en una reacción de cuatro vías al fragmento del promotor clpP EcoRl/NcoI de 201 pares de bases, a fragmento de la 3'UTR de rpsl6 Xbal/HindIII de 157 pares de bases, y a un fragmento EcoRl/HindIII de 3148 pares de bases a partir del vector de clonación pGEM3Zf(-) (Promega, Madison Wl) , para construir el plásmido pclpOtsB. Se construye un vector de transformación de plástido mediante digestión del plásmido pPRVllla con EcoRI y HindIII, y ligando el fragmento de 7287 pares de bases resultante con un fragmento EcoRl/HindIII de 1178 pares de bases de pclpOtsB.

Eiemplo 21; Preparación de un vector de transformación de plástido que contiene una construcción de gen quimérico de tipo operÓn que contiene el gen OtsA y el gen OtsB ligados al promotor del gen clpP y a las 5" y 3 'UTRs. El plásmido pOTSABL se digiere con Ncol y Xbal (parcial) , y el fragmento resultante de 2313 pares de bases que contiene el cásete OtsA: :T75 ' /RBS :: OtsB completo, se liga en una reacción de 4 vías al fragmento del promotor clpP EcoRl/NcoI de 201 pares de bases, al fragmento de la 3'UTR de rpsl6 Xbal/HindIII de 157 pares de bases, y a un fragmento EcoRl/HindIII de 3148 pares de bases a partir del vector de clonación pGEM3Zf (-) (Promega, Madison Wl) , para construir el plásmido pclpOtsAB. Se construye el vector de transformación de plástido pPH140 mediante digestión del plásmido pPRVllla (Zoubenko y colaboradores, (1994) con ?coRI y HindIII, y ligando el fragmento resultante de" 7287 pares de bases con un fragmento EcoRl/HindIII de 2671 pares de bases de pclpOtsAB.

Eiemplo 22; Transformación biolística del genoma del plástido de tabaco . Se germinan semillas de Nicotiana tabacum variedad ' Xanthi nc ' , siete por placa, en un arreglo circular de 2.54 centímetros so-bre un medio de ágar T, y se bombardean de 12 a 14 días después de la siembra con partículas de tungsteno de 1 miera (MÍO, Biorad, Hercules, CA) recubiertas con ADN de los plásmidos pC8E5 y pC+E5 esencialmente como se describe (Svab, Z, y Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917) . Las plántulas bombardeadas se incu-ban en un medio T durante 2 días, después de lo cual se cortan las hojas y se colocan con el lado abaxial hacia arriba en luz brillante (350-500 micromoles-fotones/m2/s) sobre placas del medio RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. y Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) conteniendo 500 microgramos/mililitro de di-clorhidrato de espectinomicina (Sigma St. Louis MO) . Los retoños resistentes que aparecen debajo de las hojas blanqueadas de 3 a 8 semanas después del bombardeo, se subclonan sobre el medio selectivo, se dejan formar cayo, y los retoños secundarios se aislan y se subclonan. La segregación completa de las co-pias del genoma del plástido transformados (homoplasmicidad) en los subclones independientes, se evalúa mediante técnicas convencionales de Southern blotting (Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) . El ADN celular total dige-rido con BamHl/EcoRI (Mettier, I. J. (1987) Plant Mol Biol Repórter 5, 346-349) se separa sobre geles de agarosa de Tris-borato- (TBE) , se transfieren a membranas de nailon (Amersham) , y se sondean con secuencias de ADN cebadas aleatorias marcadas con 32 p correspondientes a un fragmento de ADN de Ba-mHl/HíndIII de 0.7 kb a partir de pC8 que contiene una porción de la secuencia de dirección al plástido rps7/12. Los retoños homoplásmicos se arraigan asépticamente sobre un medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride, K.E. y colaboradores (1994) PNAS 91, 7301-7305) , y se transfieren al invernadero.

Eiemplo 23; Preparación de tabaco transgénico que expresa una ARD polimerasa de T7 dirigida al plástido, químicamente inducible. Un enlazador de oligonucleótido sintético que comprende un sitio de restricción Ncol y el codón de inicio ATG, seguido por los primeros siete codones del péptido de tránsito del plástido a partir del gen rbcS (que codifica la subunidad pequeña de carboxilasa de ribulosa-bisfosfato) , y el sitio de restricción endógeno PstI (cadena superior: 5' -CAT GGC TTC CTC AGT TCT TTC CTC TGC A-3 ' , SEQ ID NO: 37; cadena inferior: 5 ' -GAG GAA AGA ACT_ GAG GAA GC-3', SEQ ID NO: 38), un fragmento de ADN Pstl/Sacl de 2.8 kb de pCGN4205 (McBride, K.E. y colaboradores (1994) PNAS 91, 7301-7305) que contiene el gen de ARN polimerasa del bacteriófago T7 (Pol T7) fusionada adentro del marco con la porción 3 ' de la secuencia de codificación del péptido de tránsito del gen rbcS, y un fragmento de ADN Ncol/Kpnl de 0.9 kb de pCIB296 que contiene al promotor PR-la de tabaco con un sitio de restricción Ncol introducido en- el codón de inicio (Uknes y colaboradores (1993), Plant Cell 5, 159-169) y los fragmentos Sfil/Kpnl de 4.9 kb y Sacl/Sfil de 6.6 kb del vector de trans-formación binario de Agrobacterium pSGCGCl (un derivado de pGPTV-Hyg que contiene al polienlazador a partir de pGEM4 (Pro-mega, Madison Wl) clonado en los sitios Sacl/HindIII) se ligan para construir pPHHO . Las plantas de tabaco NT-pPHllO resistentes a higromicina se regeneran como se describe, a partir de los retoños obtenidos enseguida del co-cultivo de discos de hoja de N. tabacum 'Xanthi ' y "?ahG" con GV3101 de Agrobacterium que lleva el vector binario pPHUO. Por cada línea transgénica, se incuban perforaciones de hoja duplicadas de aproximadamente 2 a 3 centímetros cuadrados durante 2 días en 3 mililitros de BTH (5.6 miligramos/10 mililitros) , o agua destilada estéril bajo aproximadamente 300 micromoles/m2/s de irradiación. El material de hoja se cosecha, se congela por evaporación, y se muele en ni-trógeno líquido. Se extrae AR? total (Verwoerd y colaboradores (1989) ?AR 17, 2362) , y se realiza el análisis Northern blot como se describe (Ward y colaboradores (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) utilizando una sonda del gen de ARN polimerasa de T7 radiomarcada. Las plantas de 19 líneas TI NT-110X (fondo gené-tico Xanthi) y 7 NT-110N (fondo genético NahG) que muestran un rango de expresión de pol T7 se transfieren al invernadero y se auto-polinizan. La progenie que segrega 3:1 para el marcador de resistencia a higromicina enlazado se auto-cruza, y se seleccionan las líneas homocigóticas T2. Ejemplo 24; Transformación del plástido de maíz Se inician cultivos de cayo embriogénico tipo I (Green y colaboradores (1983) en A. Fazelahmad, K. Downey, J. Schultz, R.W. Voellmy, editores Advances in Gene Technology: Molecular Genetics of Plants and Animáis. Miami Winter Symposium Series, volumen 20, Academic Press, N.Y.) de los genotipos propietarios CG00526 y CG00714, a partir de embriones inmaduros, de 1.5 a 2.5 milímetros de longitud, del material cultivado en el invernadero. Los embriones se cortan asépticamente de las mazorcas esterilizadas superficialmente aproximadamente 14 días des-pues de la polinización. Los embriones de CG00526 se colocan sobre medio de inicio de cayo D con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de clorambeno (Duncan y colaboradores (1985) Planta 165: 322-33) mientras que aquéllos de CG00714 se colocan sobre medio de inicio de cayo KM con sacarosa al 3 por ciento y 0.75 miligramos/litro de 2,4-d (Kao y Michayluk (1975) Planta 126, 105-110) . Los embriones y los cultivos embriogénicos se cultivan subsecuentemente en la obscuridad. Se remueven las respuestas embriogénicas de los explantes después de aproximadamente 14 días. Las respuestas de CG00526 se colocan sobre medio de mantenimiento de cayo D con sacarosa al 2 por ciento y 0.5 miligramos/litro de 2,4-d, mientras que aquéllas de CG00714 se colocan sobre medio de mantenimiento de cayo KM con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de Dicamba. Después de 3 a 8 semanas de subcultivo selectivo semanal hacia el medio de mantenimiento fresco, se establecen los cultivos embriogénicos compactos de alta calidad. Las piezas de cayo embriogénico que crecen activamente se seleccionan como el tejido blanco para el suministro del gen. Las piezas de cayo se recubren sobre placas blanco que contienen medio de mantenimiento con sacarosa al 12 por ciento aproximadamente 4 horas antes de suministro del gen. Las piezas de cayo se arreglan en círculos, con radios de 8 y 10 milímetros desde el centro de la placa blanco. El ADN del plásmido se precipita sobre microportadores de oro, como se describe en el manual de DuPont Biolistics. Se utilizan de 2 a 3 microgramos de cada plásmido en cada preparación de microportador de 6 disparos. Los genes se suministran a las células de tejido blanco utilizando el dispositivo Biolistics PDS-lOOOHe. Las posiciones del dispositivo Biolistics son como sigue: 8 milímetros entre el disco de ruptura y el macroportador, 10 milí-metros entre el macroportador y la malla de paro, y 7 centímetros entre la malla de paro y el blanco. Cada placa blanco se dispara dos veces utilizando discos de ruptura de 45.5 kg/cm2. Se coloca una malla de acero inoxidable de 200 x 200 (McMasterCarr, New Brunswick, NJ) entre la malla de paro y el tejido blanco. Cinco días después, las piezas de cayo bombardeadas se transfieren al medio de mantenimiento con sacarosa al 2 por ciento y 0.5 miligramos/litro de 2,4-d, pero sin aminoácidos, y conteniendo 750 ó 1000 mM de la fórmula XVII. Las piezas de cayo se colocan durante 1 hora en el anaquel de luz de 4 a 5 horas después de la transferencia o al día siguiente, y se almacenan en la obscuridad a 27°C durante 5 a 6 semanas. Enseguida de_ la etapa de selección primaria de 5 a 6 semanas, el tejido amarillo a blanco se transfiere a placas frescas que contie-nen el mismo medio complementado con 500 ó 750 nM de la fórmula XVII. Cuatro a cinco horas después de la transferencia o al. día siguiente, los tejidos se colocan durante 1 hora en el anaquel de luz, y se almacenan en la obscuridad a 27°C durante 3 a 4 semanas . Enseguida de la etapa de selección secundaria de 3 a 4 semanas, los tejidos se transfieren a placas que contienen el mismo medio complementado con 500 nM de la fórmula XVII. El tej ido en crecimiento saludable se coloca durante 1 hora en el anaquel de luz, y se almacena en la obscuridad a 27°C. Se subcultiva cada 2 semanas, hasta que las colonias son suficiente-mente grandes para la regeneración. En ese punto, las colonias se transfieren a un medio MS modificado (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant 15: 473-497) que contiene sacarosa al 3 por ciento (MS3S) sin agente de selección, y se colocan en la luz. Para CGO0526, se agregan 0.25 miligramos/litro de ancimidol y 0.5 miligramos/litro de cinetina a este medio, para inducir la germinación del embrión, mientras que para CG00714, se agregan 2 miligramos/litro de benciladenina. Las colonias en regeneración se transfieren a un medio MS3S sin ancimidol y cinetina o benciladenina, para CG00526 ó CG00714, respectivamente, después de dos semanas.

Los retoños en regeneración con o sin raíces, se transfieren a cajas que contienen medio MS3S, y eventualmente se recuperan pequeñas plantas con raíces, y se transfieren a la tierra en el invernadero .

C. Inducción química de genes biosintéticos de trehalosa, y medición del contenido de trehalosa en plantas.

Eiemplo 25; Inducción química de los genes biosintéticos de trehalosa. Se germinan semillas, y las plantas se cultivan durante 3 a 6 semanas en el invernadero. Luego se rocían con BTH 1.2 mM (o como se ilustra adicionalmente en Friedrich y colaboradores (1996) Plant J. 10, 61-70) o con polvo humectable. Se cosechan-muestras del material de la planta en diferentes puntos del tiempo, y se congelan por evaporación. Se realiza el análisis Northern Blot para monitorear la inducción de la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa después de su tratamiento con BTH.

Eiemplo 26; Extracción de azúcares solubles y polioles a partir del tejido de tabaco liofilizado Se extraen de 10 a 20 miligramos de tejido liofilizado tres veces con 400 mililitros de metanol al 80 por ciento a 65°C durante 10 minutos después de la adición de 40 miligramos de manoheptulosa (estándar interno) . El sobrenadante combinado (después de la centrifugación 13,000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga superior de mesa Eppendorff) se seca al vacío en un Speedvac a 25°C. Luego el extracto seco se vuelve a suspender en 700 mililitros de agua Millipore, y se desala agregando 50 mililitros de una resina de intercambio de iones de lecho mixto (Serdolit micro-azul y -rojo, 2:1 [volumen/volumen]) . La resina de intercambio de iones se sedimenta mediante centrifugación al 13,000 rpm, y se lava con 300 mililitros de agua Millipore. El sobrenadante combinado nuevamente se seca al vacío en un Speedvac a 25°C. El residuo que contiene principalmente azúcares y polioles está ahora listo para el análisis mediante cromatografía de líquidos de alta presión, o para la derivación para el análisis subsecuente mediante cromatografía de gas capilar.

Eiemplo 27; Análisis de cromatografía de líquidos de alta presión. El residuo seco se vuelve a suspender en 200 mililitros de agua, y se centrifuga durante 15 minutos a 15,000 rpm. Se separa una alícuota de 10 mililitros isocráticamente con una solución de NaOH 100 mM sobre una columna de intercambio de iones Dionex PlOO utilizando un sistema de cromatografía de líquidos de alta presión de Dionex equipado con un detector amperométri-co impulsado.

Eiemplo 28; Cromatografía de Gas Capilar El residuo seco se vuelve s suspender en 200 mililitros de metanol al 50 por ciento, y se centrifuga durante 15 minutos a 15,000 rpm. Se transfieren 80 mililitros del sobrenadante a frascos de inyección de cromatografía de gas de 200 mililitros. Los azúcares y los polioles se secan al vacío en un Speedvac. Luego el residuo se hace anhidro mediante evaporación repetida del metanol agregado sobre un bloque de calentamiento a 80°C. Ahora el residuo anhidro se sella con septos que contienen tapas de rosca. Luego las muestras se disuelven en piridina anhidra conteniendo 625 miligramos de hidroxilamina y 50 miligramos de fenil-b-glucopiranosida. Esta mezcla se incuba a 80°C durante 30 minutos. Después de la adición de 50 milili-tros de N-metil-N-trimetilsilil-heptafluoro-butiramida conteniendo trimetilclorosilano al 1 por ciento (volumen/volumen) , se realiza la reacción de derivación durante 30 minutos a 80°C. Ahora los derivados de TMS- (trimetilsililo) de los azúcares y polioles están listos para el análisis mediante cromatografía de gas. Se realiza la separación de 1 a 3 mililitros de esta mezcla de reacción con un cromatógrafo de gas Cario Erba equipado con un detector FID utilizando las condiciones mencionadas enseguida: Capilaridad: SW Scientific, 30 m, ID 0.323 milímetros, fase líquida DB-17. Programa de temperatura: 70°C, 2 mi-ñutos, 25°C/minuto a 170°C, 70°C/minuto a 340°C, 340°C 5 minu-tos .

Eiemplo 29; Determinación del contenido de trehalosa en plantas transgénicas mediante cromatografía de líquidos de alta presión. La progenie de 2 líneas transgénicas independientes (N5/3 y N5/4 para la línea transgénica N5, N6/1, N6/2, N6/7, y N6/8 para la línea transgénica N6) se cultiva y se trata con BTH como se describe en el Ejemplo 25. Se cosechan muestras, y se ex-traen como se describe en el Ejemplo 26. Se determina el contenido de trehalosa mediante cromatografía de líquidos de alta presión (Ejemplo 27) . La Tabla 1 muestra el contenido de trehalosa de las muestras después del tratamiento con BTH, o después del tratamiento con polvo humectable (WP) como un control. También se muestran las mediciones del contenido de trehalosa de Xanthi de tipo silvestre. Los valores se expresan en miligramos/gramo en peso seco (DW) de la muestra medida. Aunque no se detecta trehalosa en Xanthi de tipo silvestre y en las plantas transgénicas en el día cero o después del tratamiento con BTH, se detecta trehalosa después del tratamiento con BTH. trehalosa glucosa fructosa sacarosa (mg/g PS) (mg/g PS) (mg/g PS) (mg/g PS) Xanthi día 18.1 3.7 17.6 BTH Xanthi 3 días 6.7 1.5 9.1 BTH Xanthi 7 días 11.9 2.2 16.4 BTH N5/3 día 0 BTH 0.6 8.2 N5/3 3 días traza 2.4 0.2 BTH N/3 7 días BTH 0.5 8.4 1.6 19.5 N5/3 7 días PS 6.9 1.5 12.9 N5/4 día 0 BTH 7.3 16.7 N5/4 3 días traza 1.3 0.4 7.7 BTH N5/4 7 días 0.6 9.5 2.2 19.7 BTH - N5/4 22 días 2.3 24 4.7 17.6 BTH N5/ 7 días PS 24.9 10.1 N6/1 día 0 BTH 9.7 1.9 18.1 N6/1 3 días 1.7 0.5 10.3 BTH N6/1 7 días traza 10.7 2.4 23.6 BTH N6/1 22 días 0.7 31.7 6.2 13.2 BTH N6/2 día 0 BTH 3.6 0.6 11.1 N6/2 días 1.1 8.6 BTH N6/2 7 días traza 6.1 1.3 20.1 BTH N6/7 día 0 BTH 2.1 0.4 13.6 N6/7 3 días 0.1 1.5 0.4 9.1 BTH N6/7 7 días 1.2 12.7 2.9 25.8 BTH N6/7 22 días 2.6 37 6.5 17.1 BTH N6/8 día 0 BTH 0.8 10.4 Eiemplo 30; Determinación del contenido de trehalosa en plantas transgénicas mediante cromatografía de líquidos de alta presión/cromatografía de gases La progenie de dos líneas transgénicas independientes (N5/3 y N5/4 para la línea transgénica N5 , N6/1, N6/2, N6/7, y N6/8 para la línea transgénica N6) se cultiva y se trata coa BTH como se describe en el Ejemplo 25. Las muestras se cosechan y se extraen como se describen en el Ejemplo 26. El contenido de trehalosa se determina mediante cromatografía de líquidos de alta presión/cromatografía de gases (Ejemplo 28) .

La Tabla 2 muestra el contenido de trehalosa de las muestras después del tratamiento con BTH o después del tratamiento con polvo humectable (WP) como un control. También se muestran las mediciones del contenido de trehalosa de Xanthi de tipo silvestre. Los valores se expresan en miligramos/gramo en peso seco (DW) de la muestra medida. Se observa la inducción de la acumulación de trehalosa en la planta transgénica después del tratamiento con BTH.

Ejemplo 31; Determinación de la resistencia a la sequedad de plantas transgénicas . Siete días después del tratamiento con BTH o polvo humectable (ver el Ejemplo 25) , las plantas se quitan del sistema de irrigación y ya no se riegan. Se hacen crecer adicionalmente, y se monitorea su fenotipo. Catorce días después de que las plantas tratadas con BTH han crecido más, parecen como las plantas de control irrigadas, mientras que las plantas tratadas con polvo humectable se desecan completamente. Las plantas tratadas con BTH se hacen crecer más y se dejan tener semillas.

Por consiguiente, la resistencia a la sequedad se correlaciona con la expresión de los genes biosintéticos de trehalosa y la acumulación de trehalosa.

Eiemplo 32; Aislamiento de genes de trehalosa- 6- fosfato sintasa a partir de maíz. Se seleccionan los oligonucleótidos degenerados AFOR, BFOR, y EREV, debido a que se localizan en secuencias conservadas entre una trehalosa-6-fosfato sintasa de Arabidopsis y una trehalosa-6-fosfato sintasa de levadura. El oligonucleótido degenerado AFOR: 5 ' -TIT GGC CIT(A/C) TIT TT (C) C AC(T)T AC(T)-3' SEQ ID NO: 39, (I por inosina, las bases entre paréntesis repre-sentan bases adicionales en la posición antes del paréntesis en los oligonucleótidos degenerados) que codifica el péptido L(I) WPL (I) FHY, SEQ ID NO:40, (los aminoácidos entre paréntesis representan aminoácidos adicionales en la posición antes del paréntesis en el péptido) , y el oligonucleótido degenerado EREV: 5 * -CCA IGG G (A) TT IAC IC (A) T (G) T(G/A)AT IGC ICC-3 ' , SEQ ID NO: 41, complementario para las secuencias de ADN que codifican el péptido GAIR(I)VNPW, SEQ ID NO: 42, se utilizan en una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar una treha-losa-6-fosfato sintasa a partir de una biblioteca de ADNc de maíz separada (Stratagene, La Jolla, CA, Cat. Nr. 937005) . Las condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa son de acuerdo con el fabricante (Perkin Elmer) con MgCl2 4 mM durante 25 ciclos a 30 segundos/94 °C, 2 minutos/-60°C, 2 minutos/72°C. Un fragmento de aproximadamente 1000 pa-res de bases, se amplifica, se purifica a partir de un gel de agarosa utilizando técnicas convencionales, y se clona en un vector utilizando el estuche de clonación TOPO TA (Invitrogen) . Se realiza una reacción similar con el oligonucleótido degenerado BFOR: 5' -TGG G (A) TI CAÍ GAC (T) TAC (T) CAC (T) T (C) TI ATG-3', SEQ ID NO: 43, que codifica el péptido WV (I) H (Q) DYHLM, SEQ ID NO: 44. Se amplifica un fragmento de ADN de aproximadamente 850 pares de bases, se purifica a partir de un gel de agarosa utilizando técnicas convencionales, se clona en un vector utilizando el estuche de clonación TOPO TA (Invitrogen) . El frag-mentó obtenido de la reacción con los iniciadores BFOR y EREV se denomina BE3 , y se secuencia (SEQ ID NO: 45) . Un polipéptido traducido predicho (SEQ ID NO: 46) basado en la secuencia de nucleótidos de BE3 , contiene los dominios de aminoácidos conservados . Se utiliza la sonda BE3 para rastrear la biblioteca de ADNc de maíz de acuerdo con las técnicas convencionales (por ejemplo, Sambrook y colaboradores Molecular Cloning, editores, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . La biblioteca se aplica en una densidad de aproximadamente 10,000 placas sobre cajas de Petri, y se hacen levantamientos de filtro de las pía-cas después de un crecimiento durante la noche a 37 °C. Los levantamientos de placas se sondean con una de las sondas BE3 marcada con 32P-dCTP mediante el método de iniciación aleatorio. Las condiciones de hibridación son dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), Na3P0 0.5 M, pH de 7.0 EDTA 1 mM a 50 °C. Después de la hibridación durante la noche, los filtros se lavan con SSC 0.2X, SDS al 1 por ciento. Las placas que se hibridan positivamente se detectan mediante autorradiografía. Después de la purificación hasta placas individuales, los insertos de ADNc se aislan, y se determinan sus secuencias. Se aislan tres clones de ADNc independientes, y comprenden las secuencias de nucleótidos estipuladas en las SEQ ID NO: 47 (clon 4.11), SEQ ID NO:49 (clon 6), y SEQ ID NO:51 (clon 9).

Eiemplo 33; Análisis southern blot de los genes de trehalo-sa-6-fosfato sintasa de maíz. El ADN genómico de maíz se purifica a partir de plántulas cultivadas bajo condiciones estériles utilizando procedimientos convencionales. El ADN purificado se digiere con EcoRI, Hin-dlll, y Spel, se pasa sobre un gel de agarosa, y se transfiere a una membrana. La membrana se sondea con un fragmento BE3 radioactivamente marcado. Se detectan varias bandas que muestran que BE3 corresponde a cuando menos un gen de maíz.

Las modalidades anteriormente dadas a conocer son ilustra-tivas. Esta divulgación de la invención podrá a un experto en la técnica en posesión de muchas variaciones de la invención. Se pretende que todas las variaciones obvias y previsibles sean abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Novartis AG <120> Expresión de genes biosintéticos de trehalosa en plantas . <130> S-30427/A/CGC 1990 <140> <141> <150> ÜS 60/077665 <151> 1998-03-11 <160> 52 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencias Artificial: oligonucleótido <400> 1 gtcagccatg gcaagtcgtt tagtcgtagt atctaac 37 <210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencias Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 2 gcaaatggca acaggtgata atcg 24 <210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 3 gtcagccatg gtgacagaac cgttaaccga aac 33 <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 4 gtgcgtcaag ctccaccatt gagc 24 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 5 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cgcgactagt tcaaccgaaa ttcaat 26 <210 > 12 <211> 26 <212 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 12 cgctctgcag ttcaatggaa gcaatg 26 <210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucledtido <400> 13 accgtaaggc ttgatgaa 18 <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 14 cccactagtt tgaacgaatt gttagac 27 <210> 15 <211> 26 <212 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 15 cccgaattca tcccgcgaaa ttaata 26 <210> 16 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 16 cggccatggg tatatctcct tcttaaagtt aaa 33 <210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 17 gcgaagcttg ctgagcaata 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Xaa is Leu or lie <400> 40 Xaa Trp Pro Xaa Phe His Tyr 1 5 <210> 41 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <220 > <221> base_modificada <222> (4) <223> i <220> <221> base_modificada <222> (10) <223> i <220> <221> base_modificada <222> (13) <223> i <220> <221> base_modificada <222> (19) <223> i <220> <221> base_modificada <222> (22) <223> i <400> 41 ccanggrttn acnmkdatng cncc 24 <210> 42 <211> 8 <212> PET <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido <220> <221> PEPTIDO <222> (4) <223> Xaa is Arg or lie <400> 42 Gly Ala lie Xaa Val Asn Pro Trp <210 > 43 <211> 24 <212 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <220> <221> base_modificada <222> (6) <223> i <220> <221> base_modificada <222> (9) <223> i <220> <221> base_modificada <222> (21) <223> i <400> 43 tggrtncang aytaycayyt natg 24 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido <220> <221> PEPTIDO <222> (2) <223> Xaa is Val or He <220> <221> PEPTIDO <222> (3) <223> Xaa is His or Gln <400> 44 Trp Xaa Xaa Asp Tyr His Leu Met 1 _ 5 <210> 45 <211> 831 <212> ADN <213> Zea mays <220> <221> caracteristicas_varias <222> (1) .. (24) <223> motivo conservado en el cebador BFOR (secuencia de aminoácidos en BE3: VQDYHLM) <220> <221> características_varias <222 > (808 ) . . (831) <223> motivo conservado en el cebador BFOR (secuencia de aminoácidos en B?3 : GAILVNP ) <220> <221> CDS <222> (1) . (831) <400> 45 tgg gtg cag gac tac cac ctg atg ttt ctg ccc aag tgc etc aag gac 48 Trp Val Gln Asp Tyr His Leu Met Phe Leu Pro Lys Cys Leu Lys Asp 1 5 10 15 sat gac ate aat atg aag gtc ggg tgg ttc ctg cac acg ccg ttc ccg 96 His Asp lie Asn Met Lys Val Gly Trp Phe Leu His Thr Pro Phe Pro 20 25 30 tea tea gag att tac cgg acá ctg ccg tcc cgc ttg gag ctg ctt cgg 144 Ser Ser Glu He Tyr Arg Thr Leu Pro Ser Arg Leu Glu Leu Leu Arg 35 40 45 tcg gfcg ctg tgt gcc gat tta gtt gga ttt cat act tac gac tat gcg 192 Ser Val Leu Cys Ala Asp Leu Val Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala 50 55 60 agg cat ttt gtg agt gct tgc act aga ata ctt gga ctt gag ggt acc 240 Arg His Phe Val Ser Ala Cys Thr Arg lie Leu Gly Leu Glu Gly Thr 65 70 75 80 ect gag ggc gtt gaa gat caá gga agg cta acc agg gtt gca gcg ttt 288 Pro Glu Gly Val Glu Asp Gln Gly Arg Leu Thr Arg Val Ala Ala Phe 85 90 95 ect att ggg ata gac tet gat cgt ttc aag cga gca ttg gag ctt cea 336 Pro lie Gly He Asp Ser Asp Arg Phe Lys Arg Ala Leu Glu Leu Pro 100 105 110 gca gtg aaa agg cac gtc agt gaa ttg acá gaa cgt ttt gcc ggt cga 384 Ala Val Lys Arg His Val Ser Glu Leu Thr Glu Arg Phe Ala Gly Arg 115 120 125 aag gta atg ctt ggt gtt gac cga etc gac atg att aag gga att ccg 432 Lys Val Met Leu Gly Val Asp Arg Leu Asp Met He Lys Gly He Pro 130 135 140 caá aag att ttg gcc ttt gaa aag ttt ctt gag gaa aac cea gac tgg 480 Gln Lys He Leu Ala Phe Glu Lys Phe Leu Glu Glu Asn Pro Asp Trp 145 150 155 160 aac aac aaa gtt gtt cta ctg cag att gct gtg cea acá aga act gac 528 Asn Asn Lys Val Val Leu Leu Gln He Ala Val Pro Thr Arg Thr Asp 165 170 175 gtc ect gaa tat caá aag cta acg age caá gtg cat gaa att gtt ggg 576 Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu He Val Gly 180 185 190 cgc ata aac ggt cga ttt gga acg ttg act gct gtc ect att cat cat 624 Arg He Asn Gly Arg Phe Gly Thr Leu Thr Ala Val Pro He His His 195 200 205 ctg gac cga tet ctt gat ttc cat gcc ttg tgt gct ctt tat gca gtc 672 Leu Asp Arg Ser Leu Asp Phe His Ala Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Val 210 215 220 act gat gtt gct ctt gta acá tea ctg aga gat ggg atg aac ctt gtg 720 Thr Asp Val Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val 225 230 235 240 age tat gaa tat gtt gca tgc caá ggg tet aag aaa gga gtt ctg ata 768 Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser Lys Lys Gly Val Leu He 245 250 255 ctt age gag ttt gct ggg gca gca caá tea ctt gga gct ggc gcc att 816 Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser Leu Gly Ala Gly Ala He 260 265 270 etc gtc aac ccc tgg 831 Leu Val Asn Pro Trp 275 <210> 46 <211> 277 <212> PE.T <213> Zea mays <400> 46 _ Trp Val Gln Asp Tyr His Leu Met Phe Leu Pro Lys Cys Leu Lys Asp 1 5 10 15 His Asp He Asn Met Lys Val Gly Trp Phe Leu His Thr Pro Phe Pro 20 25 30 Ser Ser Glu He Tyr Arg Thr Leu Pro Ser Arg Leu Glu Leu Leu Arg 35 40 45 Ser Val Leu Cys Ala Asp Leu Val Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala 50 55 60 Arg His Phe Val Ser Ala Cys Thr Arg He Leu Gly Leu Glu Gly Thr 65 70 75 80 Pro Glu Gly Val Glu Asp Gln Gly Arg Leu Thr Arg Val Ala Ala Phe 85 90 95 Pro He Gly He Asp Ser Asp Arg Phe Lys Arg Ala Leu Glu Leu Pro 100 105 110 Ala Val Lys Arg His Val Ser Glu Leu Thr Glu Arg Phe Ala Gly Arg 115 120 125 Lys Val Met Leu Gly Val Asp Arg Leu Asp Met He Lys Gly He Pro 130 135 140 — Gln Lys He Leu Ala Phe Glu Lys Phe Leu Glu Glu Asn Pro Asp Trp 145 150 155 160 Asn Asn Lys Val Val Leu Leu Gln He Ala Val Pro Thr Arg Thr Asp 165 170 175 Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu He Val Gly 180 185 190 Arg He Asn Gly Arg Phe Gly Thr Leu Thr Ala Val Pro He His His 195 200 205 Leu Asp Arg Ser Leu Asp Phe His Ala Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Val 210 215 220 Thr Asp Val Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val 225 230 235 240 Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser Lys Lys Gly Val Leu He_ 245 250 255 Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser Leu Gly Ala Gly Ala He 260 265 270 Leu Val Asn Pro Trp 275 <210> 47 <211> 1753 <212> ADN <213> Zea mays <220> <221> características_varias <222> (106) .. (129) <223> motivo conservado en el cebador EREV <220> <221> CDS <222> (1) .. (1413) <223> secuencia de codificación predicha parcial <400> 47 cgg ggg tg aac ctt gtg age tat gaa tat gtt gca tgc caá ggg tet 48 Arg Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser 1 5 10 15 aag aaa gga gtt ctg ata ctt age gag ttt gct ggg gca gca caá tea 96 Lys Lys Gly Val Leu He Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser 20 25 30 ctt gga gct ggt gcc att cta gta aac ect tgg aat att acá gaa gtt 144 Leu Gly Ala Gly Ala He Leu Val Asn Pro Trp Asn He Thr Glu Val 35 40 45 gca gac tea ata cgg cat gct tta acg atg cea tcc gat gag aga gag 192 Ala Asp Ser He Arg His Ala Leu Thr Met Pro Ser Asp Glu Arg Glu 50 55 60 aaa cga cac aga cac aac tac gca cat gtc acá act cac acg gct caá 240 Lys Arg His Arg His Asn Tyr Ala His Val Thr Thr His Thr Ala Gln 65 70 75 80 gat tgg gct gaa act ttt gta ttt gag cta aat gac acg gtt gct gaa 288 Asp Trp Ala Glu Thr Phe Val Phe Glu Leu Asn Asp Thr Val Ala Glu 85 90 95 gca cta ctg agg acá aga caá gtt ect ect ggt ctt ect agt caá atg 336 Ala Leu Leu Arg Thr Arg Gln Val Pro Pro Gly Leu Pro Ser Gln Met 100 105 110 gca att cag caá tat ttg cgc tet aaa aat cgt ctg etc ata ttg ggt 384 Ala He Gln Gln Tyr Leu Arg Ser Lys Asn Arg Leu Leu He Leu Gly 115 120 125 ttc aat tcg acá ttg act gag cea gtc gaa tcc tet ggg aga agg ggt 432 Phe Asn Ser Thr Leu Thr Glu Pro Val Glu Ser Ser Gly Arg Arg Gly 130 135 140 ggt gac caá ate aag gaa atg gaa etc aag ttg cat ect gac tta aag 480 Gly Asp Gln He Lys Glu Met Glu Leu Lys Leu His Pro Asp Leu Lys 145 150 155 160 ggt ect ctg aga gcc etc tgt gag gat gag cgc act acá gtt att gtt 528 Gly Pro Leu Arg Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr Thr VaX Xle Val_ _ 165 170 175 ctt age ggc agt gac agg agt gtt ctt gat gaa aat ttt gga gaa ttt 576 Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn Phe Gly Glu Phe 180 185 190 aaa atg tgg ttg gcg gca gag cat ggg atg ttt tta cgc ccg act tac 624 Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu Arg Pro Thr Tyr 195 200 205 gga gaa tgg atg acá acá atg ect gag cat ctg aac atg gat tgt gtt 672 Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met Asp Cys Val 210 215 220 gac age gta aag cat gtt ttt gaa tac ttt acá gaa aga acc cea aga 720 Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu Arg Thr Pro Arg 225 230 235 240 tcc cat ttc gaa cat cgt gaa acá tea ttt gtg tgg aac tat aag tat 768 Ser His Phe Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp Asn Tyr Lys Tyr 245 250 255 gct gat gtt gag ttc gga agg cta caá gca aga gat atg ctg cag cac 816 Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp Met Leu Gln His 260 265 270 ttg tgg acá ggt ccg ate tea aat gca gct gtt gat gtt gtt caá ggg 864 Leu Trp Thr Gly Pro He Ser Asn Ala Ala Val Asp Val Val Gln Gly 275 280 285 agt cga tea gtt gaa gtt cgg tet gtt gga gtt acc aag ggt gct gca 912 Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr Lys Gly Ala Ala 290 295 300 att gat cgt att tta ggg gag ata gtt cac age gaa aac atg att act__ 960 He Asp Arg He Leu Gly Glu He Val His Ser Glu Asn Met He Thr 305 310 315 320 cea att gac tat gtc ctg tgc ata ggg cat ttc ctt ggg aag gat gag 1008 Pro He Asp Tyr Val Leu Cys He Gly His Phe Leu Gly Lys Asp Glu 325 330 335 gac ate tac gtc ttc ttt gat ccc gag tac ect tet gaa tcc aaa gta 1056 Asp He Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu Ser Lys Val 340 345 350 aag cea gag ggc ggc tea gca tea ctt gac cgg agg ccg aac ggg agg 1104 Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg Pro Asn Gly Arg 355 360 365 cea cea tcg aat ggc agg agt aac tcc agg aac cea cag tcc agg acá 1152 Pro Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro Gln Ser Arg Thr 370 375 380 cag aag gcg cag cag gct gca tcc gag agg tea tcc tea tea agt cac 1200 Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ser His 385 390 395 40Q age age acg age age aac cac gac tgg cgc gaa ggg tcc tcg gtc ctt 1248 Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly Ser Ser Val Leu 405 410 415 gat etc aag ggc gag aac tac ttc tcc tgc gcc gtc ggg agg aag cgg 1296 Asp Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly Arg Lys Arg 420 425 430 tet aac gcc cgc tac ttg ctg age tcg tcg gag gag gtt gtc tcc ttc 1344 Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu Val Val Ser Phe 435 440 445 etc aaa gag ttg gcg acá gcg acá gct ggc ttc cag gcc acc tgt gct 1392 Leu Lys Glu Leu Ala Thr Ala Thr Ala Gly Phe Gln Ala Thr Cys Ala 450 455 460 gac tac atg cat gtt ctt gga taggcagtaa atagactgaa gttgaagcct 1443 Asp Tyr Met His Val Leu Gly 465 470 ccgtgcttta ccagagacag agagaagaag aatatteatt cctcgtatgc gcgacagagc 1503 tacacccgta gctagtcagc gtgetgtaca atcatgtaca aaatttatgc tegtgataaa 1563 actgcgagag gggagctagc aaatgggaaa ggataaagga gtttagttgc ttctggtacg 1623 agacacaatc gcctgatttt gagttetett taaaaaaaaa cccaaaaaaa aaaaaaaaaa 1683 aaactcgagg gggggcccgg taancnttcg cggttttgcg aaatgattte aacgnngatn 1743 ngcctccgct 1753 <210> 48 <211> 471 <212> PRT <213> Zea mays <400> 48 Arg Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser 1 5 10 15 Lys Lys Gly Val Leu He Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser 20 25 30 Leu Gly Ala Gly Ala He Leu Val Asn Pro Trp Asn He Thr Glu Val 35 40 45 Ala Asp Ser He Arg His Ala Leu Thr Met Pro Ser Asp Glu Arg Glu 50 55 60 Lys Arg His Arg His Asn Tyr Ala His Val Thr Thr His Thr Ala Gln 65 70 75 80 Asp Trp Ala Glu Thr Phe Val Phe Glu Leu Asn Asp Thr Val Ala Glu 85 90 95 Ala Leu Leu Arg Thr Arg Gln Val Pro Pro Gly Leu Pro Ser Gln Met 100 105 110 Ala He Gln Gln Tyr Leu Arg Ser Lys Asn Arg Leu Leu He Leu Gly 115 120 125 Phe Asn Ser Thr Leu Thr Glu Pro Val Glu Ser Ser Gly Arg Arg Gly 130 135 140 - Gly Asp Gln He Lys Glu Met Glu Leu Lys Leu His Pro Asp Leu Lys 145 150 155 160 Gly Pro Leu Arg Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr Thr Val He Val 165 170 175 Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn Phe Gly Glu Phe 180 185 190 Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu Arg Pro Thr Tyr 195 200 205 Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met Asp Cys Val 210 215 220 Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu Arg Thr Pro Arg 225 230 235 240 Ser His Phe Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp Asn Tyr Lys Tyr 245 250 255 Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp Met Leu Gln His 260 265 270 Leu Trp Thr Gly Pro He Ser Asn Ala Ala Val Asp Val Val Gln Gly 275 280 285 Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr Lys Gly Ala Ala 290 295 300 He Asp Arg He Leu Gly Glu He Val His Ser Glu Asn Met He Thr 305 310 315 320 Pro He Asp Tyr Val Leu Cys He Gly His Phe Leu Gly Lys Asp Glu 325 330 335 Asp He Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu Ser Lys Val 340 345 350 Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg Pro Asn Gly Arg 355 360 365 Pro Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro Gln Ser Arg Thr 370 375 380 Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ser His 385 390 395 400 Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly Ser Ser Val Leu 405 410 415 Asp Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly Arg Lys Arg 420 425 430 Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu Val Val Ser Phe 435 440 445 Leu Lys Glu Leu Ala Thr Ala Thr Ala Gly Phe Gln Ala Thr Cys Ala 450 455 460 Asp Tyr Met His Val Leu Gly 465 470 <210> 49 <211> 1558 <212> ADN <213> Zea mays <220> <221> CDS <222> (177) .. (1268) <223> secuencia de codificación predicha <400> 49 cggagtattc tagtgcaagc actcacaaaa tgcctcgcat agtcgtaagt atggaatcca 60 actaaatcag cacatagcac cgaccgaagc agctccaagc gggaeggaag tgtccggtaa 120 atctctgatg acgggaatgg tgtgtgcagg aaccacccga ccttcatatt gatgtc atg 179 Met 1 gtc ctt gag gca ctt ggg cag gaa cat gag gtg gta gtc atg acá cea 227 Val Leu Glu Ala Leu Gly Gln Glu His Glu Val Val Val Met Thr Pro 5 10 15 gat tac ate ccc etc ctg gta gtg ctg gta cac gac ate age gaa cat 275 Asp Tyr He Pro Leu Leu Val Val Leu Val His Asp He Ser Glu His 20 25 30 ctg gtt age acg ctt ata cgc gtc gaa atg gaa etc aag ttg cat ect 323 Leu Val Ser Thr Leu He Arg Val Glu Met Glu Leu Lys Leu His Pro 35 40 45 gac tta aag ggt ect ctg gga gcc etc tgt gag gat gag cgc act acá 371 Asp Leu Lys Gly Pro Leu Gly Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr Thr 50 55 60 65 gtt att gtt ctt agt ggc agt gac agg agt gtt ctt gat gaa aat ttt 419 Val He Val Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn Phe 70 75 80 gga gaa ttc aaa atg tgg ttg gca gca gag cat ggg atg ttt tta cgc 467 Gly Glu Phe Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu Arg 85 90 95 ccg act tat gga gaa tgg atg acá acá atg ect gag cat ctg aac atg 515 Pro Thr Tyr Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met 100 105 110 gat tgg gta gac age gta aag cat gtt ttc gaa tac ttt acá gaa aga 563 Asp Trp Val Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu Arg 115 120 125 acc cea aga tcc cat ttt gaa cat cgt gaa acá tea ttt gtg tgg aac 611 Thr Pro Arg Ser His Phe Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp Asn 130 135 140 145 tac aag tat gct gat gtt gaa ttt gga agg cta caá gca aga gat atg 659 Tyr Lys Tyr Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp Met 150 155 160 ctg cag cac ttg tgg acá ggt ccg ate tea aat gca gct gtt gat gtt 707 Leu Gln His Leu Trp Thr Gly Pro He Ser Asn Ala Ala Val Asp Val 165 170 175 gtt caá ggg agt cgg tea gtt gaa gtc cgg tet tt gtt acá aag 755 Val Gln Gly Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr Lys ?ao 185 190 ggt gct gca att gat cgt att tta ggg gag ata gtt cac age gaa aac 803 Gly Ala Ala He Asp Arg He Leu Gly Glu He Val His Ser Glu Asn 195 200 205 atg gtt act cea att gat tat gtc ctg tgt ata ggg cat ttc ctt ggg 851 Met Val Thr Pro He Asp Tyr Val Leu Cys He Gly His Phe Leu Gly 210 215 220 225 aag gat gag gac ate tat gtc ttt ttt gat ccg gaa tac ect tet gaa 899 Lys Asp Glu Asp He Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu 230 235 240 tcc aaa gta aaa cea gag ggt ggg tea gca tea ctt gac cgg agg cea 947 Ser Lys Val Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg Pro 245 250 255 aat gga agg ccg gca tcg aat ggc aga age aat tea agg aac cea cag 995 Asn Gly Arg Pro Ala Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro Gln 260 265 270 tcc agg cea cag aag gcg cag cag gct gca tcc gag agg tcg tcc tea 1043 Ser Arg Pro Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser Ser 275 280 285 tea agt cac age age act age age aac cac gac tgg cgc gaa ggg tcc 1091 Ser Ser His Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly Ser 290 295 300 305 tcg gtc etc gat etc aag gcc gag aac tac ttc tcc tgc gcc gtc gga 1139 Ser Val Leu Asp Leu Lys Ala Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly: 310 315 320 agg aag^ cgg tcc aac gcc cgt tac ctg ctg agt tcg tcg gag gag gtc 1187 Arg Lys Arg Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu Val 325 330 335 gtc tcc ttc etc aaa gag ttg gca acg gaa acá gct ggc ttc cag tcc 1235 Val Ser Phe Leu Lys Glu Leu Ala Thr Glu Thr Ala Gly Phe Gln Ser 340 345 350 age tgt gct gat tac atg ttc ttg gat agg cag taaatagatt ggagcctccg 1288 Ser Cys Ala Asp Tyr Met Phe Leu Asp Arg Gln 355 360 tgctttgcca gacaageaca ctggaggggg ggaaaaccca ttcattcctc aaatgcgcga 1348 cggagttaca cccagcgtgt tgtacaatcc tgtacaaaat ttatgctcgt gataaaactg 1408 cgagagggtg gagcaaatgg aaaaggataa aattagttta gatttagggt ctgttcgtcg 1468 caccaaaaat tgttccagtt gatcaaaatt tatacaaatt agagaagtaa tccgactcgg 1528 aacagttccg gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1558 <210> 50 <211> 364 <212> PRT <213> Zea mays <400> 50 Met Val Leu Glu Ala Leu Gly Gln Glu His Glu Val Val Val Met Thr 1 5 10 15 Pro Asp Tyr He Pro Leu Leu Val Val Leu Val His Asp He Ser Glu 25 30 His Leu Val Ser Thr Leu He Arg Val Glu Met Glu Leu Lys Leu His 35 40 45 Pro Asp Leu Lys Gly Pro Leu Gly Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr 50 55 60 Thr Val He Val Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn 65 _ 70 75 80 Phe Gly Glu Phe Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu 85 90 95 Arg Pro Thr Tyr Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn 100 105 110 Met Asp Trp Val Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu 115 120 125 Arg Thr Pro Arg Ser His Phe Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp 130 135 140 - - Asn Tyr Lys Tyr Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp 145 150 155 160 Met Leu Gln His Leu Trp Thr Gly Pro He Ser Asn Ala Ala Val Asp 165 170 175 Val Val Gln Gly Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr 180 185 190 Lys Gly Ala Ala He Asp Arg He Leu Gly Glu He Val His Ser Glu 195 200 205 Asn Met Val Thr Pro He Asp Tyr Val Leu Cys He Gly His Phe Leu 210 215 220 Gly Lys Asp Glu Asp He Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser 225 230 235 240 Glu Ser Lys Val Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg 245 250 255 Pro Asn Gly Arg Pro Ala Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro 260 265 270 Gln Ser Arg Pro Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser 275 280 285 Ser Ser Ser His Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly 290 295 300 Ser Ser Val Leu Asp Leu Lys Ala Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val 305 310 315 320 Gly Arg Lys Arg Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu 325 330 335 Val Val Ser Phe Leu Lys Glu Leu Ala Thr Glu Thr Ala Gly Phe Gln 340 345 350 Ser Ser Cys Ala Asp Tyr Met Phe Leu Asp Arg Gln 355 360 <210> 51 <211> 935 <212> ADN <213> Zea mays <220> <221> CDS <222> (1) .. (735) <223> secuencia de codificación parcial predicha <400> 51 cgg tgg aac aac aaa gtt gtt cta ctg cag att gct gtg cea acá aga 48 Arg Trp Asn Asn Lys Val Val Leu Leu Gln He Ala Val Pro Thr Arg 1 5 10 15 act gac gtc ect gaa tat caá aag cta acg age caá gtg cat gaa atg 96 Thr Asp Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu Met 20 25 30 gcc act gtc acc gag etc cag cgt ccc tea cgc gtc cag gcg gtg tcc 144 Ala Thr Val Thr Glu Leu Gln Arg Pro Ser Arg Val Gln Ala Val Ser 35 40 45 gcc tac ttg tgg aag gtc etc gcc gcc gtc gtg gcc gcg tgc cgc gtg 192 Ala Tyr Leu Trp Lys Val Leu Ala Ala Val Val Ala Ala Cys Arg Val 50 55 60 ccc gag gag cgg tgc tgc atg ggc tgg atg gtg gac gct cgg cgg cgg 240 Pro Glu Glu Arg Cys Cys Met Gly Trp Met Val Asp Ala Arg Arg Arg 65 70 75 80 gtg aag tcg ccc gag ctg ate ccc gcg atg cgc aac tac ttc ggc aac 288 Val Lys Ser Pro Glu Leu He Pro Ala Met Arg Asn Tyr Phe Gly Asn 85 90 95 gtc acg gcc tac gcg ctg ggc ggc gcg gcc gtg gag gag ate cgg cgg 336 Val Thr Ala Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Ala Val Glu Glu He Arg Arg 100 105 110 aag ccg ctg gcc gag gtg gcg gcc atg gtg cgg gat acc ate acg tcc 384 Lys Pro Leu Ala Glu Val Ala Ala Met Val Arg Asp Thr He Thr Ser 115 120 125 ata gac tac gac gag tac ctg cag gag ctg gtg gac tgg gtg gag gtg 432 He Asp Tyr Asp Glu Tyr Leu Gln Glu Leu Val Asp Trp Val Glu Val 130 135 140 _ cac aag acg gag cac gtg atg gag aag ggc gtc etc ggg ctg ggc tcg 480 His Lys Thr Glu His Val Met Glu Lys Gly Val Leu Gly Leu Gly Ser 145 150 155 160 ccg acg ttg aac cag acc gtg ttc gcg tcg ttc ccg etc gac acg aac 528 Pro Thr Leu Asn Gln Thr Val Phe Ala Ser Phe Pro Leu Asp Thr Asn 165 170 175 ttc ggc ttc ggc gac gcc gcg etc gcg ctg ccc ate tgc gac tat ggg_ 576 Phe Gly Phe Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Pro He Cys Asp Tyr Gly 180 185 190 agg ctt tgt tcg ggc tac ctg tcc gtc gga gcg cgg ect gga ggc gac 624 Arg Leu Cys Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Ala Arg Pro Gly Gly Asp 195 200 205 ggc tcc tgg etc etc age gcc tac att tgg ccg cag atg gcg gcg gcg_ 672 Gly Ser Trp Leu Leu Ser Ala Tyr He Trp Pro Gln Met Ala Ala Ala 210 215 220 ctg gag tcg gac ggc gtc ttt aag ect etc acg gcg gag tat etc ggt 720 Leu Glu Ser Asp Gly Val Phe Lys Pro Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Gly 225 230 235 240 etc acá gtc acá ccc tagcggcgac gtggtcgatc tacatgeget geatgeata 775 Leu Thr Val Thr Pro 245 cagatcagaa teagatateg ttcgtattgc tcattgttga ttgcatgatt gcgcgctacc 835 ttgtattgtg tacgtcgttc gtgtaataat gttgcatggt ctcgggcca_g tgctaaataa 895 aaatctctgt taattttctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 935 <210> 52 <211> 245 <212> PRT <213> Zea mays <400> 52 Arg Trp Asn Asn Lys Val Val Leu Leu Gln He Ala Val Pro Thr Arg 1 5 10 15 Thr Asp Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu Met 20 25 30 Ala Thr Val Thr Glu Leu Gln Arg Pro Ser Arg Val Gln Ala Val Ser 35 40 45 Ala Tyr Leu Trp Lys Val Leu Ala Ala Val Val Ala Ala Cys Arg Val 50 55 60 Pro Glu Glu Arg Cys Cys Met Gly Trp Met Val Asp Ala Arg Arg Arg 65 70 75 80 Val Lys Ser Pro Glu Leu He Pro Ala Met Arg Asn Tyr Phe Gly Asn 85 90 95 Val Thr Ala Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Ala Val Glu Glu He Arg Arg 100 105 110 Lys Pro Leu Ala Glu Val Ala Ala Met Val Arg Asp Thr He Thr Ser 115 120 125 He Asp Tyr Asp Glu Tyr Leu Gln Glu Leu Val Asp Trp Val Glu Val 130 135 140 His Lys Thr Glu His Val Met Glu Lys Gly Val Leu Gly Leu Gly Ser 145 150 155 160 Pro Thr Leu Asn Gln Thr Val Phe Ala Ser Phe Pro Leu Asp Thr Asn 165 170 175 Phe Gly Phe Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Pro He Cys Asp Tyr Gly 180 185 190 Arg Leu Cys Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Ala Arg Pro Gly Gly Asp 195 200 205 Gly Ser Trp Leu Leu Ser Ala Tyr He Trp Pro Gln Met Ala Ala Ala 210 215 220 Leu Glu Ser Asp Gly Val Phe Lys Pro Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Gly 225 230 235 240 Leu Thr Val Thr Pro 245

Claims (44)

1. REIVINDICACIONES 1. Una planta que expresa un gen heterólogo para una enzima biosintética de trehalosa.
2. 2. La planta de la reivindicación 1, la cual comprende, en su genoma nuclear, un cásete de expresión heterólogo o partes del mismo, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa bajo el control de un promotor inducible .
3. 3. La planta de acuerdo con la reivindicación 2, la cual comprende, en un primer cásete de expresión heterólogo o partes del mismo, una secuencia de nucleótidos que codifica una sintasa de trehalosa-6-fosfato bajo el control de un promotor inducible, y un segundo cásete de expresión heterólogo o partes del mismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfatasa de trehalosa-6-fosfato bajo el control de un promotor inducible .
4. 4. La planta de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el promotor es un promotor inducible químicamente o por herida.
5. 5. La planta de la reivindicación 1, la cual comprende en su genoma de plástido, un cásete de expresión heterólogo o partes"* del mismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucledtidos en los plástidos de esta planta.
6. 6. La planta de acuerdo con la reivindicación 5, la cual comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una sintasa de trehalosa-6-fosfato bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta, y una secuencia de nucleótidos que codifican una fosfatasa de trehalosa-6-fosfato bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en los plástidos de esta planta.
7. 7. La planta de la reivindicación 6, en donde la se-cuencia de nucleótidos que codifica una sintasa de trehalosa-6-fosfato y la secuencia de nucleótidos que codifica una fosfatasa de trehalosa-6-fosfato se transcriben desde un solo promotor en un gen policistrónico de tipo operón, en donde este promotor es capaz de dirigir la expresión del gen policistrónico de tipo operón en los plástidos de esta planta.
8. 8. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el promotor comprende un promotor regulado por transactivador, en donde la expresión del transactivador correspondiente está bajo el control de un promotor capaz de di-rigir la expresión de este transactivador en la planta.
9. 9. Una planta de acuerdo con la reivindicación 8, la cual comprende : (a) un cásete de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica un transactiva-dor, en donde el promotor es capaz de dirigir la expresión del transactivador en la planta, en donde este transactivador se fusiona con una secuencia de dirección al plástido; y (b) un cásete de expresión de plástido heterólogo o par-tes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador, regulado por el transactivador, y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica cuando menos una enzima biosintética de trehalosa.
10. 10. La planta de las reivindicaciones 8 ó 9, en donde el promotor regulado por el transactivador comprende un promotor del gen 10 de T7, y el transactivador correspondiente comprende una ARN polimerasa de T7.
11. 11. La planta de las reivindicaciones 8 ó 9, en donde el promotor capaz de dirigir la expresión del transactivador en la planta es un promotor inducible, un promotor específico del tejido, o un promotor constitutivo.
12. 12. La planta de la reivindicación 11, en donde el promotor inducible es inducible químicamente o por herida.
13. 13. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en donde el promotor es transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en los plástidos de esta planta.
14. 14. La planta de la reivindicación 13 , en donde la ARN polimerasa es una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido.
15. 15. La planta de la reivindicación 14, en donde el promo-tor es un promotor clpP, un promotor de gen de ARN-r de 16S, un promotor psbA o un promotor rbcL.
16. 16. Una planta que comprende en su genoma de plástido, dos o más genes transcritos a partir de un solo promotor en un gen policistrónico de tipo operón, en donde éster promotor es capaz de dirigir la expresión del gen policistrónico de tipo operón en los plástidos de la planta, en donde este gen policistrónico de tipo operón comprende además una secuencia de ADN que interviene entre dos genes del gen policistrónico de tipo operón.
17. 17. Una planta de acuerdo con la reivindicación 16, en donde se incrementa la expresión de un gen localizado inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene.
18. 18. La planta de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la secuencia de ADN que interviene no está presente en el genoma del plástido de esta planta.
19. 19. La planta de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la secuencia de ADN que interviene comprende una porción de una 5' UTR no eucariótica.
20. 20. La planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde el ADN que interviene se modifica para impedir la formación de estructuras secundarias de ARN en una transcripción del gen policistrónico de tipo operón.
21. 21. La planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicado-nes 16 a 20, en donde el gen policistrónico de tipo operón com-prende un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cuando menos una enzima biosintética de trehalosa.
22. 22. La planta de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el gen policistrónico de tipo operón comprende un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato sintasa, y un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una trehalosa-fosfato fosfatasa.
23. 23. La semilla para una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
24. 24. Un método para producir una planta de acuerdo con la reivindicación 7, el cual comprende: (a) polinizar una planta que comprende un cásete de expresión de plástido heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor mediado por transactivador operativamente enla-zado con una secuencia de nucleótidos, o un gen policistrónico de tipo operón que codifica cuando menos una enzima biosintética de trehalosa, con polen de una planta que comprende un case-te de expresión nuclear heterólogo o partes del mismo, que comprende un promotor operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador capaz de regular el promotor mediado por transactivador, en donde este promotor operativamente enlazado con una secuencia de ADN que codifica un transactivador, es capaz de dirigir la expresión de este transactivador en la planta; (b) recuperar la semilla de la planta así polinizada; y (c) cultivar una planta como se describe anteriormente, a partir de esta semilla.
25. 25. Un método para producir trehalosa en plantas mediante la expresión de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta, bajo el control de un promotor inducible, o a partir de un genoma del plástido de esta planta bajo el control de un promotor capaz de expresar esta secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta.
26. 26. Un método para proteger a una planta contra la sequedad, la alta salinidad, la tensión osmótica, y los extremos de temperatura, mediante la expresión de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el con-trol de un promotor inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta bajo el control de un promotor capaz de expresar esta secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta.
27. 27. Un método para incrementar las propiedades de almace-namiento de las plantas cosechadas mediante la expresión de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta, bajo el control de un promotor inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta bajo el control de un pro-motor capaz de expresar esta secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta.
28. 28. Un método para mejorar la vida de anaquel de frutas y verduras, y para conservar las flores, mediante la expresión de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica un gen biosintético de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el control de un promotor inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta bajo el control de un promotor capaz de expresar este gen los plástidos de esas frutas, verduras, o flores.
29. 29. Un método para estabilizar las proteínas expresadas en plantas transgénicas mediante la expresión de cuando menos una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa a partir del genoma nuclear de la planta bajo el control de un promotor inducible, o a partir del genoma del plástido de la planta bajo el control de un promotor capaz de expresar este gen en los plástidos de la planta.
30. 30. Un método para expresar dos o más genes a partir de un solo promotor en los plástidos de una planta, el cual comprende introducir en el genoma del plástido de la planta, un gen poli-cistrónico de tipo operón, que comprende esos dos o más genes operativamente enlazados con un promotor capaz de expresar el gen policistrónico de tipo operón en los plástidos de la planta en donde este gen policistrónico de tipo operón comprende además una secuencia de ADN que interviene entre dos genes .
31. 31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde se incrementa la expresión de un gen localizado inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ADN que interviene.
32. 32. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa o una porción de la misma.
33. 33. Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una trehalosa-6-fosfato sintasa de o una porción de la misma.
34. 34. Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una trehalo-sa-6-fosfato fosfatasa o una porción de la misma.
35. 35. Una molécula de proteína que comprende una enzima biosintética de trehalosa o una porción de la misma.
36. 36. Una molécula de proteína de acuerdo con la reivindi-cación 35, en donde esta proteína comprende una trehalosa-6-fosfato sintasa o una porción de la misma.
37. 37. Una molécula de proteína de acuerdo con la reivindicación 35, en donde esta proteína comprende una trehalosa-6-fosfato fosfatasa o una porción de la misma.
38. 38. Una planta que comprende un cásete de expresión o una parte del mismo, que comprende la molécula de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en donde este cásete de expresión se integra establemente en el genoma de la planta .
39. 39. Una planta de acuerdo con la reivindicación 38, en donde esta planta es resistente a las tensiones, tales como la tensión a la sequedad, osmótica o de temperatura.
40. 40. Un cásete de expresión en plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa, tal como una trehalosa-6-fosfato sintasa y/o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente inducible.
41. 41. Un cásete de expresión en plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima biosintética de trehalosa, tal como una trehalosa-6-fosfato sintasa y/o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa, bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de esta secuencia de nucleótidos en los plástidos de la planta.
42. 42. Un cásete de expresión de plástido que comprende un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear o una polimerasa codificada por el plástido, y operativamente enlazado con una secuencia de nucleótidos que codifica cuando me-nos una enzima biosintética de trehalosa, tal como, por ejemplo, una trehalosa-6-fosfato sintasa y/o una trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
43. 43. Un cásete de expresión de plástido que comprende un promotor capaz de expresar un gen biosintético de trehalosa en plástidos de plantas, por ejemplo un promotor transcrito por una ARN polimerasa normalmente presente en plástidos, tal como una polimerasa de codificación nuclear, o una polimerasa codificada por el plástido, o un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es polimerasa de ARN de T7) , operativamente enlazado con un gen policistrónico de tipo operón que comprende secuencias de nucleótidos que codifican ambas enzimas biosintéticas de trehalosa.
44. 44. Un vector que comprende un cásete de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43.