MXPA00005934A - Dispositivos y metodos para la determinacion de analitos en una solucion - Google Patents

Abstract

Método y dispositivos de prueba para detectar la presencia o cantidad de material biológico, analito(s) o microorganismo(s) en una muestra;el método incluye los pasos de licuar la muestra (de ser necesario) y distribuir la muestra licuada en la superficie de­dispositivo de prueba;el dispositivo puede comprender una placa de incubación, un dispositivo de varilla de inmersión u otros dispositivos;los dispositivos tienen por lo menos un reactivo provisto dentro de los dispositivos;algunos dispositivos tienen una superficie horizontal generalmente plana la cual se divide en una pluralidad de cavidades en depresiones;otros tienen una o m s superficies con islote(s) de reactivo inmovilizados;cada cavidad o islote de reactivo esta adaptada para contener una alícuota de líquido;las cavidades o islotes de reactivo se dimensionan, configuran y forman de un material adecuado, para contener una alícuota dentro de la cavidad o islote de reactivo mediante tensión de superficie;cualquier exceso de líquido de la muestra licuada se drena de la superficie del dispositivo;entonces, el método consiste en incubar el dispositivo de prueba hasta que se determine la presencia o cantidad de material biológico, analito o microorganismo.

Description

DISPOSITIVO Y MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE ANALITOS EN UNA SOLUCIÓN SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud provisional de E.U.A. 60/063,635, titulada MÉTODO PARA LA CUANTIFICACION DE METERIAL BIOLÓGICO EN UNA MUESTRA USANDO UNA PLACA DE INCUBACIÓN QUE CONTIENE REACTIVO, presentada el 27 de octubre de 1997.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de la tecnología de prueba, y en modalidades particulares, a dispositivos y métodos para la cuantificación de analitos, por ejemplo, material biológico, en una muestra. Muchas industrias requieren detectar y cuantificar la concentración y nivel de material biológico u otro analito en una muestra. Por ejemplo, la determinación de la concentración bacteriana en alimentos y agua es una parte esencial de la pruebas de calidad de alimentos y agua. Las regulaciones de la EPA requieren que no estén presentes bacterias coliformes tales como Escherichia coli en el agua potable. El formato de "presencia ausencia" de un medio de prueba, tal como la mezcla química Colilert® (IDEXX Laboratories, ME) la cual se usa con un medio de prueba para Escherichia coli y todas las bacterias coliformes, es muy útil para hacer esta determinación. La mezcla química Colilert® se basa en la Tecnología de Substrato Definido descrita en Edberg, "Method and Médium for use in Detecting Target Microbes In Situ in A Specimen Sample of A Possibly Contaminated Material", patentes de E.U.A. Nos. 4,925,789 y 5,492,933. Sin embargo, existen áreas en las que la cuantificación, no sólo la detección, de la concentración bacteriana es importante. Ejemplos de dichas áreas incluyen agua de desecho, agua de entrada en sistemas de purificación de agua, agua de superficie y pruebas de alimentos. Por ejemplo, numerosas cadenas de restaurantes sólo aceptarán carne molida de res o de aves cruda que contenga menos de cierta concentración de contaminación bacteriana. Por lo tanto, las plantas de procesamiento de alimentos deben llevar a cabo las pruebas microbiológicas necesarias para determinar la concentración bacteriana de estos alimentos antes de que puedan ser liberados a los consumidores. Los métodos clásicos de cuantificación de material biológico son el método de conteo en placa estándar o el método de fermentación en tubos múltiples (MTF). Una cantidad de la muestra que se está probando para contaminación microbiana se coloca primero en una caja de Petri. Después se vierten 15 ml del medio adecuado sobre la muestra. La caja de Petri es después centrifugada para mezclar la muestra en el medio y la caja de Petri se deja solidificar a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. El medio se incuba después a una temperatura específica durante un tiempo específico, y se cuenta cualquier colonia resultante. El método de fermentación de tubos múltiples se describe en Recles et al., "Most Probable Number Techniques" publicado en "Compendium of Methods for the Microgiological Examination of Foods", 3a. ed. 1992, en págs. 105-199, y en Greenberg et al., "Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater" 8va. ed. 1992). En este método, un volumen de muestra se coloca en varios tubos que representan esta etapa de dilución. Los tubos se incuban después a la temperatura adecuada para que puedan crecer las bacterias en cada tubo. Después de la incubación a una temperatura específica durante un tiempo específico, se cuenta el número de tubo positivos. El número más probable puede determinarse a partir de la fórmula descrita en Recles et al., supra. La prueba de agua se hace muy comúnmente mediante filtración por membrana, en donde cierto volumen de agua se pasa a través de la membrana y la membrana se incuba en un medio durante cierto periodo de tiempo. Después de la incubación adecuada se cuentan las colonias. En muchas industrias existe también la necesidad de detectar cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de una analito en una solución líquida. Por ejemplo, la detección de iones inorgánicos pueden ser importante en un procedimiento de fabricación usando la solución de prueba. Hasta la fecha, los métodos y dispositivos generalmente usados para medir un analito en solución han requerido remover todo un alícuota de la solución de prueba o exponer una varilla de inmersión a una solución de prueba. Aunque estos métodos y dispositivos pueden detectar un analito en solución, padecen de un número de desventajas. Los métodos relacionados con varillas de inmersión no son cuantitativos. Por ejemplo, en las modalidades generales de varilla de inmersión no hay capacidad para determinar o cuantificar la presencia de un analito en un volumen unitario de esa solución. En lugar de ello, el varilla de inmersión simplemente se pone en contacto con la solución de prueba. Otros métodos requieren que un usuario remueva manualmente una alícuota de una solución de prueba y la transfiera a un dispositivo separado para la detección o cuantificación del analito. Por lo tanto, a pesar de la capacidad de estos métodos y dispositivos para detectar un analito en solución, los métodos y dispositivos actualmente usados han probado tener una precisión limitada; y/o ser costosos, complicados, consumidores de tiempo; y/o tener una gama de usos limitada debido a la tecnología de prueba particular. De esta manera, existe la necesidad de un método simple, preciso y poco costoso para la determinación de un analito en solución sin las desventajas conocidas en la técnica anterior. En particular, existe la necesidad de dispositivos y métodos capaces de proveer una prueba cuantitativa de un analito en un volumen particular de una solución.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee dispositivos y métodos para detectar y enumerar la presencia o ausencia de materiales biológicos, analitos y microorganismos en soluciones de muestra. En un aspecto, la invención provee una placa de incubación estéril para determinar la presencia o cantidad de un material biológico en una muestra de prueba. La placa se describe generalmente por una superficie plana y horizontal que contiene cavidades hundidas. Cada cavidad está adaptada para retener una alícuota de líquido, y tiene un tamaño y forma, y está hecha de un material, adecuado para retener la alícuota de líquido dentro de la cavidad por medio de las fuerzas de tensión de superficie. Por lo menos una cavidad contiene por lo menos un reactivo para la detección del material biológico. No se genera respuesta positiva alguna en ausencia del material biológico objetivo. En una modalidad preferida, el reactivo se deposita en las cavidades mediante tratamiento por descarga de corona y secado. En otra modalidad, la placa también puede contener una tapa. La cavidad o cavidades pueden contener una pluralidad de reactivos, y diferentes cavidades pueden contener diferentes reactivos o diferentes combinaciones de reactivos, de manera tal que puedan llevarse a cabo numerosas pruebas en una sola placa. La placa está construida preferiblemente de plástico, sin embargo, puede construirse de otros materiales hidrofóbicos que sean adecuados para llevar a cabo la prueba. En una modalidad preferida, las placas de la presente invención tendrán una forma rectangular, sin embargo, también pueden tener una forma circular o cualquier otra forma. En una modalidad preferida las cavidades tienen un diámetro de aproximadamente 3.8 mm. En otra modalidad preferida, las cavidades de la placa retienen un total de aproximadamente 1 mililitro de solución. En otra modalidad preferida, cada cavidad de la placa retiene entre 0.1 y 100 µl de líquido. La cavidad o cavidades de la placa pueden estar biseladas para ayudar a la remoción del exceso de fluido. La placa puede comprender además una porción de manija para que el operador pueda manipular la placa y llevar a cabo la prueba sin el riesgo de hacer contacto con la muestra de prueba. En otro aspecto, la presente invención provee una placa de incubación estéril similar a la placa descrita arriba, y puede ser adaptada con cada uno de sus modalidades, con la característica adicional de que comprende una tapa que contiene por lo menos una saliente que cabe dentro de las cavidades. En este aspecto, el reactivo o combinación de reactivos es contenido en el extremo de las salientes, por lo que los reactivos se disolverán en la muestra de prueba después de cerrar o fijar la tapa a la placa. En una modalidad, las salientes pueden tener una cavidad. El reactivo o combinación de reactivos serán secados sobre el extremo de cada saliente o sobre la superficie de la cavidad. La superficie de la cavidad también puede tratarse por descarga de corona antes de depositar el reactivo. En este aspecto también, un reactivo o combinación de reactivos pueden secarse, o la saliente tratarse por descarga de corona, y una combinación de reactivos se puede utilizar entre salientes múltiples de manera tal que puedan llevarse a cabo varias pruebas sobre una sola placa. La porción de placa inferior puede ser adaptada a todas las modalidades con respecto a la placa descrita arriba. En otro aspecto, la invención describe un dispositivo para determinar la presencia o cantidad de un analito o microorganismo en una solución de prueba. El dispositivo incluye una estructura de soporte sustancialmente hidrofóbica con por lo menos una isleta de reactivo inmovilizada sobre la estructura de soporte que es capaz de absorber un volumen predeterminado de solución de prueba. El dispositivo comprende también un medio para determinar la presencia o cantidad del analito o microorganismo, el medio estando colocado sobre o dentro de la isleta de reactivo. Este aspecto de la invención puede tener la forma de un varilla de inmersión de plástico o polímero con una o más isletas de reactivo inmovilizadas sobre ésta. La isleta de reactivo pueda hacerse de cualquier material absorbente, por ejemplo celulosa. La estructura de soporte puede tener varias isletas de reactivo inmovilizadas sobre ésta. El medio para determinar la presencia o cantidad de microorganismos o analitos puede comprender un polvo que se incorpore sobre o dentro del material el cual se prepare la isleta de reactivo. El medio puede ser un reactivo o una combinación de reactivos que lleven a una producción de una señal detectable cuando estén presentes analitos o microorganismos de prueba. El dispositivo puede contener varias isletas de reactivo que pueden contener diferentes reactivos o combinaciones de reactivos para que puedan llevarse a cabo numerosas pruebas sobre un solo dispositivo. En una modalidad preferida, las isletas de reactivo comprenden celulosa. La estructura de soporte puede construirse de plástico, polímero o cualquier material adecuado sobre el cual pueda montarse una isleta de reactivo y el cual no interfiera con la prueba. En otra modalidad, el dispositivo comprende también un contenedor para retener la estructura de soporte antes, durante y después de llevar a cabo la prueba. El contenedor comprenderá típicamente un tubo de ensayo y puede comprender además una tapa para el tubo de ensayo para proteger más el dispositivo. En otro aspecto, la invención provee un dispositivo de prueba para determinar la presencia o cantidad de un analito o microorganismo en una muestra, que comprende una estructura de soporte sólida sustancialmente hidrofóbica con por lo menos una isleta de reactivo individual inmovilizada sobre la misma la cual sea capaz de absorber y retener un volumen predeterminado de solución de prueba. Colocado sobre o dentro de la isleta de reactivo se encuentra un medio para determinar la presencia o ausencia de un analito o microorganismo objetivo. Este aspecto del dispositivo comprende además un contenedor que está abierto en extremos opuestos. El contenedor puede tener típicamente la forma de una pipeta de laboratorio. Este aspecto de la invención puede comprender cualquiera de las diferentes modalidades descritas con respecto al dispositivo anterior. Las isletas de reactivo también pueden disponerse en zonas de manera tal que cada zona provea una prueba separada. Las isletas de reactivo pueden adaptarse para retener alícuotas de líquido mediante tensión de superficie o mediante absorción. El dispositivo puede comprender típicamente una tira alargada. El reactivo contenido en las isletas de reactivo puede ser un medio de crecimiento o un medio de crecimiento indicador. El reactivo puede ser también una enzima o un substrato de enzima. En otro aspecto, la invención provee un dispositivo de prueba para determinar la presencia o cantidad de un analito o microorganismo en una muestra, que comprende una estructura de soporte sólida con por lo menos una isleta de reactivo inmovilizada sobre la misma. Cada isleta de reactivo está adaptada para retener una alícuota de líquido y tiene un tamaño y forma, y está hecha de un material adecuado para retener la alícuota dentro de la isleta de reactivo. Por lo menos una de las isletas de reactivo contiene por lo menos un reactivo para la detección del analito y/o microorganismo de interés. El dispositivo no provee una respuesta positiva para el analito o microorganismo cuando el analito o microorganismo no está presente en la muestra de prueba. En una modalidad preferida, las isletas de reactivo del dispositivo pueden recibir un volumen total preseleccionado. En una modalidad el dispositivo puede comprender una combinación de reactivos localizada en isletas de reactivo separadas. En otra modalidad, las isletas de reactivo están dispuestas en zonas, en donde cada zona provee una prueba separada para que puedan llevarse a cabo varias pruebas en un solo dispositivo. Las isletas de reactivo pueden adaptarse para retener alícuotas de muestras líquidas por tensión de superficie o por absorción. Las isletas de reactivo pueden adaptarse para que cada una reciba volúmenes iguales de líquido. Las isletas de reactivo también pueden existir en subconjuntos de isletas, en donde cada subconjunto consista de por lo menos una isleta, y cada subconjuto reciba diferentes volúmenes de los demás subconjuntos. El dispositivo puede construirse de manera tal que las isletas de reactivo sean inmovilizadas sobre más de una superficie. En modalidades diferentes, el dispositivo puede ser una placa o una tira alargada. En una modalidad preferida, la estructura de soporte puede construirse de un material hidrofóbico. En una modalidad, el por lo menos un reactivo puede ser un medio de crecimiento. En una modalidad específica, el medio de crecimiento puede ser un medio de crecimiento indicador. En varias modalidades, el por lo menos un reactivo puede ser células de por lo menos una cepa bacteriana, una enzima o un substrato de enzima. La invención provee también métodos para detectar la presencia o cantidad de material biológico en una muestra. En un aspecto, el método comprende los pasos de 1 ) proveer una placa de incubación con por lo menos una cavidad que contenga por lo menos un reactivo para detectar el material biológico, la placa comprende una superficie horizontal generalmente plana que define varias cavidades hundidas, cada cavidad estando adaptada para retener una alícuota de líquido, y teniendo un tamaño y forma, y estando construida de un material adecuado para retener la alícuota de líquido dentro de la cavidad mediante tensión de superficie, y en donde por lo menos una cavidad contiene por lo menos un reactivo para la detección del material biológico; 2) liquidificar la muestra de prueba si es necesario, y distribuir la muestra sobre la superficie de la placa de incubación; 3) drenar cualquier exceso de líquidos y 4) incubar la placa hasta que se determine la presencia o ausencia del material biológico en una o más cavidades para que pueda determinarse la cantidad de materiales biológicos. El paso de distribución puede comprender sumergir la placa en la muestra, o verter, y puede opcionalmente incluir centrifugar o sumergir. Este aspecto de la invención puede adaptarse para todas las modalidades separadas con respecto a los dispositivos de placa descritos anteriormente. En otro aspecto, la invención provee un método para detectar la presencia o cantidad de un material biológico en una muestra, que comprende los pasos de: 1) proveer una placa de incubación estéril con una porción inferior que sea una superficie horizontal generalmente plana y contenga varias cavidades hundidas adaptadas para retener una alícuota de líquido y tengan un tamaño y forma, y estén formadas de un material adecuado para retener el líquido dentro de la cavidad mediante tensión de superficie, y una tapa con por lo menos una saliente que contenga por lo menos un reactivo para la detección de materiales biológicos, en donde la saliente cabe en cavidades individuales cuando la tapa es cerrada sobre la porción de placa inferior; 2) líquidificar la muestra de prueba si es necesario, y distribuir la muestra sobre la superficie de la placa de incubación; 3) drenar cualquier exceso de líquidos de la placa; 4) cerrar la tapa sobre la porción de placa inferior para que el reactivo sobre la por menos una saliente haga contacto con alícuotas de líquido en las cavidades, permitiendo de esta manera la disolución de los reactivos; y 4) incubar la placa hasta que se determine la presencia o ausencia del material biológico en una o más cavidades para que pueda determinarse la cantidad de materiales biológicos. Este aspecto de la invención puede adaptarse con todas las modalidades con respecto a los métodos descritos previamente, y todas las modalidades con respecto al dispositivo de placa y tapa descrito previamente. En otro aspecto, la invención probó un método para hacer una placa de incubación con por lo menos un reactivo, el método comprende los pasos de: 1) proveer una placa con una superficie horizontal generalmente plana con cavidades hundidas que tengan un tamaño y forma, y estén formadas de un material adecuado para retener alícuotas de una muestra de prueba dentro de cada cavidad mediante tensión de superficie; y 2) secar por lo menos un reactivo en las cavidades. En modalidades preferidas por lo menos una cavidad puede tratarse por descarga de corona antes del paso de secado. En otra modalidad, la porción tratada por descarga de corona puede consistir esencialmente de una superficie interior de por lo menos una cavidad. En una modalidad preferida el reactivo puede ser un medio de crecimiento celular, o un medio de crecimiento bacteriano. La placa puede hacerse para adaptarse a todas las modalidades de las placas descritas anteriormente. En otro aspecto, la invención provee un método para hacer una placa de incubación que comprende los pasos de: 1) proveer una placa de incubación estéril con una porción inferior que es una superficie horizontal generalmente plana y contiene cavidades hundidas, cada cavidad estando adaptada para retener una alícuota de líquido y teniendo un tamaño y forma, y estando formada de un material adecuado para retener el líquido mediante tensión de superficie, y una tapa con por lo menos una saliente que se acopla dentro de las cavidades individuales cuando la tapa es cerrada sobre la porción de placa inferior; y 2) secar los reactivos sobre por lo menos una de dichas salientes. Este aspecto puede contener todas las modalidades de la invención descritas anteriormente con respecto a los demás métodos y dispositivos de placa. En otro aspecto, la invención provee un método para fabricar un dispositivo útil para detectar un analito o microorganismo en una solución de prueba, el método comprende los pasos de: 1 ) proveer un material capaz de absorber un volumen predeterminado de líquido por cantidad de material; 2) preparar por lo menos una isleta de reactivo a partir del material; 3) combinar el material con un medio para detectar la presencia o cantidad del analito o microorganismo y 4) asegurar la isleta de reactivo a una estructura de soporte sustancialmente hidrofóbica. En varias modalidades, el paso de preparación puede comprender preparar varias isletas de reactivo. En otra modalidad, las isletas de reactivo pueden ser capaces de absorber un volumen predeterminado de solución. En otro aspecto, la invención provee un método para detectar un analito o microorganismo en una muestra de prueba, que comprende los pasos de: 1 ) poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos una isleta de reactivo capaz de absorber un volumen predeterminado de solución de prueba e inmovilizada sobre una estructura de soporte, y la cual comprende un medio para determinar la presencia o ausencia de un analito o microorganismo colocado sobre o dentro de la isleta de reactivo; 2) separar la muestra de prueba de la isleta de reactivo después de que la isleta de reactivo haya absorbido una cantidad predeterminada de la muestra; 3) someter la isleta de reactivo a parámetros de reacción que permitan el desarrollo del reactivo y la generación de una señal sensible y 4) determinar la presencia o cantidad de un analito o microorganismo. En otro aspecto, la invención provee un método para detectar un analito o microorganismo en una muestra de prueba, que comprende los pasos de: 1 ) seleccionar una solución de prueba para la detección del analito o microorganismo; 2) proveer un dispositivo que comprenda una estructura de soporte sustancialmente hidrofóbica y por lo menos una isleta de reactivo inmovilizada sobre la estructura de soporte, y el cual sea capaz de absorber un volumen predeterminado de la solución de prueba y comprenda un medio para determinar la presencia o cantidad del analito o microorganismo; 3) poner en contacto el dispositivo con la solución de prueba durante un tiempo suficiente como para permitir que la isleta de reactivo absorba el volumen predeterminado; y 4) permitir que el medio para determinar la presencia o cantidad de un analito o microorganismo determine la presencia o cantidad del analito o microorganismo. En una modalidad, el paso de contacto puede incluir introducir el dispositivo en la solución de prueba y removerlo de la solución de prueba. En otra modalidad, el paso de provisión puede comprender proveer un medio de determinación que comprenda un reactivo que produzca una señal sensible que indique la presencia o cantidad de un analito o microorganismo. En otra modalidad, el paso de permitir comprende someter el dispositivo a parámetros de reacción suficientes como para permitir el desarrollo del reactivo. Se puede añadir otro paso al método que comprenda observar el medio de determinación, o un paso de determinar la presencia o cantidad de un analito o microorganismo, o un paso para determinar la cantidad del analito o microorganismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 A es una vista en planta de una primera modalidad del dispositivo para la determinación de un analito en solución de la presente invención; la figura 1B es una vista transversal ampliada de la figura 1A tomada en las líneas 1B-1B; la figura C es una vista lateral de la primera modalidad de la presente invención de la figura 1A; la figura 2A es una vista ampliada de la figura 1 B, que muestra una cavidad sin un bisel; la figura 2B es una vista ampliada de la figura 1 B que muestra una cavidad con un bisel; la figura 3A es una vista en planta de una tapa para el dispositivo de la primera modalidad de la figura 1A; la figura 3B es una vista lateral parcial y ampliada de la tapa de la figura 3A; la figura 3C es una vista lateral de la tapa de la figura 3A; la figura 3D es una vista en perspectiva, parcialmente expuesta, de la tapa de la figura 3A colocada sobre el dispositivo de la figura 1A; la figura 4A es una vista en planta de una segunda modalidad una tapa que tiene una pluralidad de salientes sobre la superficie interior de la misma; la figura 4B es una sección ampliada de la tapa de la figura 4A tomada en las líneas 4B-4B; la figura 4C es una vista lateral de la tapa de la figura 4A; la figura 4D es una vista en perspectiva ampliada y parcialmente expuesta de una porción de la tapa de la figura 4A, que muestra las salientes de la misma; la figura 5A es una vista en planta que muestra la tapa de la figura 4A colocada sobre el dispositivo de la figura 1 A; la figura 5B es una vista ampliada y expuesta de la figura 5A; la figura 5C es una vista lateral de la figura 5A; la figura 6A es una vista en planta de una segunda modalidad del dispositivo de la presente invención que tiene un manija; la figura 6B es una vista transversal de la figura 6A tomada en las líneas 6B-6B; la figura 6C es una vista lateral de la segunda modalidad del dispositivo de la figura 6A; la figura 7A es una vista en planta de la modalidad de la figura 6A que tiene una tapa colocada sobre la misma; la figura 7B es una vista transversal tomada en las líneas 7B-7B de la figura 7A; la figura 7C es una vista lateral de la figura 7A; la figura 8 es una vista en planta de una tercera modalidad de la presente invención, que puede emplearse como un solo dispositivo de varilla de prueba de inmersión; la figura 9 es una vista lateral de la figura 8; la figura 10 es una cuarta modalidad del dispositivo de la presente invención, que puede emplearse un dispositivo de varilla de prueba de inmersión que tiene varias isietas de reactivo, la figura 11 muestra el dispositivo de la figura 10, en el cual se han llevado a cabo varias pruebas; la figura 12 es una vista en perspectiva de la quinta modalidad del dispositivo de la presente invención, en el cual un dispositivo de varilla de inmersión que tiene dos planos con varias isletas de reactivo sobre el mismo puede insertarse en forma removible en un tubo con una tapa sobre el mismo; la figura 13 es una vista en perspectiva de una sexta modalidad del dispositivo de la presente invención, en el cual una pluralidad de islas de reactivo están localizadas en más de un plano sobre una varilla y son localizables en forma removible en un tubo que tiene una tapa removible sobre el mismo; y la figura 14 es una vista en perspectiva de una séptima modalidad del dispositivo de la presente invención, en el cual una pipeta de laboratorio contiene un bloque alargado que tiene una pluralidad de isletas de reactivo sobre uno o más lados del mismo.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Definiciones "Microorganismo" - microorganismos significa cualquier microbio, incluyendo bacterias, hongos o protistas. "Bacterias" - todos los organismos que pertenecen al Reino Monera. "Material biológico" - cualquier material derivado de un organismo biológico. "Organismos objetivo" - cualquier "microorganismo" de preferencia pero no limitado a E. coli, levadura y/o moho.

"Célula" - cualquier célula encontrada en una planta, animal, bacteria o cualquier otro organismo vivo. "Analito" - cualquier átomo o molécula o ion que esté implicado en el metabolismo celular en un organismo vivo. "Analito objetivo" - cualquier "analito", de preferencia pero no limitado a metabolitos y/o actividad de enzima. "Material proteináceo" - ptoteínas, péptidos, enzimas o aminoácidos. "Hidrofóbico" - que tiene un grado suficiente de hidrofobicidad como para evitar la "interferencia" o puenteo de líquidos, tales como muestras o reactivos, o celdas de incubación, cavidades o islas adyacentes.

Estructura La presente invención provee un método mas simple para la cuantificación precisa del número de microorganismos en una muestra, o para la cuantificación de cualquier otro tipo de analito, tal como material biológico en partículas individual, en una muestra. Dichos materiales biológicos incluyen hongos y otros organismos vivos, así como agregados de proteínas, tales como enzimas, o incluso co-factores, usando mezclas de reacción bien conocidas por los expertos en la técnica. La invención generalmente hace uso de un artículo novedoso que está diseñado para recibir y retener un volumen preseleccionado de una muestra de líquido y para proveer un reactivo o reactivos a dicho volumen de muestra. En modalidades preferidas, el volumen preseleccionado se divide en una pluralidad de alícuotas de prueba. La pluralidad de alícuotas de muestra pueden ser todos del mismo volumen o pueden estar en conjuntos de alícuotas, en donde cada conjunto contenga alícuotas de volúmenes diferentes. El dispositivo usado está generalmente en forma de una placa de incubación estéril que tiene una multitud de cavidades capaces de retener alícuotas de líquido separados. El dispositivo está construido para contener por lo menos un reactivo provisto a la por lo menos una cavidad y de preferencia a una pluralidad o todas las cavidades individuales. Ya que la placa, la cual puede incluir una tapa, contiene un reactivo o reactivos, el reactivo está presente antes de la introducción de una muestra. Por ejemplo, dicho reactivo puede ser un medio de crecimiento específico para bacterias. El reactivo es provisto antes de la adición de la muestra de una manera tal que el reactivo no se deslave o disuelva significativamente durante la adición de la muestra. La provisión del reactivo o reactivos dentro de la placa elimina la necesidad de que un analista prepare por separado el reactivo y después lo añada a una muestra o a la placa de prueba. Además, en muchas aplicaciones, la estructura de la placa de incubación está dispuesta preferiblemente de manera tal que no se requiera pipeteo alguno, la placa se sumerge simplemente en la muestra, o una cantidad aproximada de la muestra liquidificada se vierte sobre la superficie de la placa, y un volumen diseñado de muestra se retiene dentro de las cavidades. De este modo, la placa provee una función de auto-suministro.

Cada cavidad a la cual se provee un reactivo o reactivos puede recibir el mismo o diferentes reactivos. De esta manera, cuando se usa una pluralidad de reactivos, cavidades separadas pueden recibir diferentes reactivos individuales, diferentes combinaciones de reactivos o combinaciones de estas posibilidades. La frase "por lo menos una cavidad es provista con por lo menos un reactivo" significa que uno o más reactivos están contenidos en la placa antes de la adición de la muestra de manera tal que el reactivo o reactivos estén presentes en una cantidad significativa en por lo menos una de las cavidades individuales durante la incubación. De esta manera, la frase se distingue de situaciones en las que el usuario añade el reactivo junto con la muestra o de una manera tal que el reactivo sea sustancialmente diluido o disueito en la muestra antes de drenar cualquier exceso de muestra de líquido de la placa. En algunas modalidades, no cada cavidad contendrá cada reactivo o puede incluso no contener reactivo. De esta manera, preferiblemente el reactivo o reactivos están presentes de manera tal que una cantidad individual de reactivo o reactivos se suministre individualmente a cada cavidad receptora deseada. Aunque es posible que un usuario prepare una placa depositando un reactivo en las cavidades de una placa antes de la adición de la muestra, preferiblemente la placa es provista al usuario con el reactivo ya depositado y preferiblemente secado en su lugar. En general, las cavidades están diseñadas para formar cámaras de incubación separadas para cada alícuota de muestra. Las cavidades pueden tener el mismo tamaño o diferentes tamaños y formas para incrementar la escala de conteo y/o simular efectos de dilución. De esta manera, en un primer aspecto, la invención incluye una placa de incubación estéril que tiene una superficie horizontal generalmente plana. La superficie define una pluralidad de cavidades hundidas (en modalidades preferidas se proveen por lo menos 40, 60, 90 o incluso 200 cavidades hundidas) y cada cavidad está adaptada para retener alícuotas de líquido mediante tensión de superficie. Cualquier exceso de líquido de la muestra de líquido se drena de la superficie de la placa al exterior de las cavidades gracias a la hidrofobicidad del material usado para formar la placa. La placa puede construirse de plástico u otro material hidrofóbico. En otras modalidades, la placa puede tener una forma generalmente circular, o tener cualquier forma. La placa es construida para contener por lo menos un reactivo, por ejemplo, un medio de crecimiento, y para proveer por lo menos un reactivo individualmente a por lo menos una cavidad. De esta manera, el reactivo se provee dentro de la placa en lugar de ser añadido por separado. En general, el reactivo o reactivos se proveen directamente a cavidades individuales. En otras modalidades, diferentes cavidades pueden contener diferentes reactivos o diferentes combinaciones de reactivos para proveer una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la provisión de diferentes reactivos o diferentes combinaciones de reactivos a diferentes cavidades puede proveer una pluralidad en diferentes pruebas sobre una sola placa. El reactivo se provee 2 de manera tal que no se deslave apreciablemente durante la formación de alícuotas o el procedimiento automático de formación de alícuotas (como el descrito abajo). En otras modalidades preferidas, se provee también una tapa para evitar la combinación del líquido en las cavidades; y la placa se provee en una forma estéril para que no se noten alícuotas positivos a menos que esté presente por lo menos un material biológico en la muestra. En modalidades en las cuales está presente una tapa, la tapa es considerada parte de la placa de incubación, ya sea que esté unida o separada de la porción de la placa que contenga las cavidades. En este contexto, la tapa es la "porción de tapa" y la porción de la placa que contiene las cavidades es la "porción de placa inferior". La tapa puede ser una cubierta superior, pero también puede construirse como un contenedor, tal como en una disposición de concha de almeja, para que la porción de la placa que contiene las cavidades pueda ser contenida completamente dentro de la tapa/contendedor. En otra modalidad preferida, la tapa está diseñada como un tubo rectangular, para que la porción de placa sea insertada en el extremo abierto del tubo; generalmente una porción alargada de la placa cerrará el extremo abierto de la tapa en forma de tubo. En una modalidad preferida, el reactivo es recubierto en cavidades individuales de manera tal que el reactivo no se deslave o disuelva apreciablemente de la cavidad durante el proceso de distribuir la muestra en las cavidades. Como un ejemplo, la superficie interior de las cavidades puede ser tratada por descarga de corona para que el reactivo se adhiera firmemente a la placa cuando se seque y por lo tanto se disuelva sólo lentamente cuando haga contacto con la muestra líquida. Pueden añadirse agentes adicionales al medio o recubrirse sobre el medio en las cavidades para controlar más la velocidad de disolución. En otras modalidades preferidas, la placa incluye una tapa que tiene una estructura diseñada y adaptada para proveer el agente a la cavidad individual. Por ejemplo, la tapa puede construirse con una proyección o protuberancia que retenga al reactivo, y preferiblemente una pluralidad de dichas proyecciones o protuberancias, tales como una proyección para cada cavidad. La tapa puede ser unida a la porción inferior de la placa o puede estar separada. Cuando la tapa sea cerrada, o colocada sobre la porción inferior de la placa después de formar alícuotas de la muestra, el reactivo hará contacto con la muestra de líquido en la cavidad y después se disolverá en la muestra de líquido. El reactivo puede recubrirse sobre la proyección, tal como mediante el uso de tratamiento por descarga de corona de la superficie de la proyección para adherir el reactivo a la proyección. El reactivo también puede secarse sobre la saliente o salientes de la tapa. La proyección también puede tener una cavidad para retener el reactivo, la superficie de la cual pueda tratarse para mejorar la adhesión del reactivo. Diferentes reactivos o diferentes combinaciones de reactivos pueden recubrirse sobre cada una de las proyecciones. En otras modalidades más, la placa tiene una porción de suministro de reactivo. La porción de suministro de reactivo está construida para retener una cantidad o cantidades seleccionadas de uno o más reactivos y para proveer ese reactivo individualmente a una o más cavidades. Por ejemplo, la porción de suministro de reactivo puede ser un armazón unido al lado inferior de una porción de tapa con anillos o cilindros que retengan el reactivo o reactivos. Cuando la tapa sea cerrada después de la distribución de la muestra, el reactivo o reactivos harán contacto con las alícuotas de muestra individuales y se dispersarán en el líquido. También pueden diseñarse otras configuraciones. La superficie horizontal generalmente plana está diseñada para permitir que el líquido se distribuya en alícuotas fácilmente entre las cavidades y después el exceso de líquido sea drenado de la placa manteniendo al mismo tiempo una alícuota de muestra líquida dentro de cada una de las cavidades. Los expertos en la técnica reconocerán que la profundidad y forma de la cavidades, así como el material usado para hacer las cavidades y la placa, se eligen de manera tal que pueda usarse tensión de superficie para retener las alícuotas contra la gravedad dentro de cada cavidad, dependiendo dei tipo de líquido usado en la muestra liquidificada; los expertos en la técnica entenderán los factores para seleccionar los materiales de la placa y los tamaños de cavidad adecuados para los diferentes líquidos. De preferencia, la muestra es una solución acuosa, muy preferiblemente una solución o suspensión acuosa diluida. En una modalidad preferida, la cavidad tiene un diámetro de aproximadamente 3.8 ó 3.9 milímetros. De preferencia, una cavidad retiene entre 5 y 100 µl. También en modalidades preferidas, la cavidad puede tener una forma diseñada para mejorar la retención de una alícuota de muestra, y/o la retención de reactivo dentro de la cavidad. Un ejemplo de dicha forma de cavidad alternativa es generalmente una cavidad circular con costillas que se proyectan hacia el centro de la cavidad, pero también se pueden usar otros diseños. En una modalidad preferida las cavidades están biseladas para permitir que el líquido que esté sobre el plano horizontal sea vertido fácilmente (véase figura 2B). Las dimensiones de las cavidades y el número de cavidades sobre una placa se pueden seleccionar de manera tal que un volumen total particular se retenga sobre una placa. De preferencia, una placa retiene un total de entre aproximadamente 0.1 y 10 ml, muy preferiblemente alrededor de 0.5, 1 ó 2 ml, dentro de las cavidades. La placa de incubación puede formarse de cualquier material deseado, pero en particular es deseable que se use un plástico que permita que alícuotas separadas de la muestra liquidificada se retengan mediante tensión de superficie dentro de cada cavidad sin la contaminación cruzada de las cavidades. De preferencia, el material es hidrofóbico. La superficie puede ser no tratada o tratarse química o físicamente para mejorar la retención de líquido dentro de las cavidades, incluso cuando la placa sea invertida o inclinada en cualquier ángulo desde el horizontal. La placa también puede tratarse para mejorar la adhesión de un reactivo o reactivos dentro de una cavidad o sobre otra superficie deseada de la placa, por ejemplo, tratarse por descarga corona. En general, el reactivo será secado sobre la superficie de la placa. En otras modalidades preferidas, la placa se incubación es transparente o con color, por ejemplo, blanca o amarilla (para mejorar la apariencia del color (por ejemplo, azul)) dentro de la placa de incubación), y la placa tiene dimensiones rectangulares de aproximadamente 3.8 por 6.3 centímetros o 2.5 por 10 centímetros, o para placas circulares, un diámetro de aproximadamente 7.6 ó 12.7 centímetros. En aspectos relacionados, la invención incluye métodos para la detección de un material biológico en una muestra usando una placa de incubación que tiene por lo menos un reactivo como el descrito arriba. Los métodos incluyen los pasos de liquidificar la muestra (si es necesario) y distribuir la muestra liquidificada sobre la superficie de una placa de incubación como la descrita para el aspecto anterior, de preferencia sumergiendo la placa en la muestra. En una modalidad alternativa, la muestra se vierte en la placa y la placa es inclinada o girada según se requiera para distribuir la muestra; en esta modalidad, el área que contiene cavidades de la placa es rodeada por una cavidad que retiene la muestra sobre la placa durante la distribución de la muestra. Como se describió arriba, cada cavidad está adaptada para retener una alícuota de líquido y tiene un tamaño y forma, y está formada de un material adecuado, para retener la alícuota dentro de la cavidad por tensión de superficie. Las alícuotas de líquido entran en las cavidades individuales sin ser aplicadas individualmente, y por lo tanto el método incorpora la formación automática de alícuotas (o auto-formación de alícuotas). Cualquier exceso de líquido de la muestra liquidificada se drena de la superficie de la placa al exterior de las cavidades gracias la hidrofobicidad del material usado para formar la placa. En un método la placa tiene por lo menos un reactivo en por lo menos una cavidad antes de la adición de la muestra, de manera tal que después de la formación de alícuotas de la muestra de líquido en las cavidades, el reactivo o reactivos se disuelvan en el líquido. En un método relacionado, el reactivo o reactivos están contenidos en la tapa, tal como sobre o en salientes en la tapa que se proyectan dentro de cavidades cuando la tapa es cerrada sobre la porción de placa inferior. De esta manera, cuando la tapa es cerrada, los reactivos hacen contacto con la alícuota de líquido en la cavidad individual o cavidades, y después se dispersa o disuelve en el líquido. En el contexto de esta invención, el término "sumergir" se refiere a una breve inmersión de por lo menos una porción de la placa de incubación en un líquido. De preferencia, el periodo de inmersión es de menos de aproximadamente 3 segundos, muy preferiblemente menos de aproximadamente 2 segundos y todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 1 segundo. Como se describió, la placa está construida para contener por lo menos un reactivo, tal como un medio de crecimiento, y preferiblemente todos los reactivos necesarios para la prueba particular en donde el reactivo esté en la placa antes de la distribución de la muestra. En otras modalidades, diferentes cavidades pueden contener diferentes reactivos para proveer una variedad de aplicaciones, por ejemplo, para proveer una pluralidad de pruebas diferentes sobre una sola placa. Los reactivos se proveen de manera tal que no se deslaven apreciablemente durante el procedimiento de auto-formación de alícuotas. Cualquier reactivo necesario no provisto directamente en el dispositivo puede proveerse en la muestra o directamente en la placa en el momento de uso. El método incluye entonces incubar esa placa de incubación hasta que se determine la presencia o ausencia del material biológico. También en modalidades preferidas, la placa está provista con una porción de manija mediante la cual el usuario puede sujetar la placa evitando al mismo tiempo el contacto con la porción de aplicación de muestra de la placa. Para aplicaciones en las que la muestra sea distribuida sobre la superficie de la placa sumergiendo la placa en la muestra, por lo menos una porción de la manija no es sumergida en la muestra, ayudando de esta manera a evitar la contaminación de la placa y/o la muestra por el contacto con la mano del usuario. La forma de la placa de incubación no es crítica, pero en modalidades preferidas es una forma generalmente rectangular. Otro ejemplo una forma generalmente circular (tal como la de una caja de Petri). De hecho, la placa de incubación puede usarse para tomar el lugar de una caja de Petri. Específicamente, el método de esta invención puede usarse para reemplazar las pruebas ya existentes que se llevan acabo generalmente en cajas de Petri para determinar el número de colonias microbianas. Ya que se proveen en la placa alícuotas individuales de la muestra, un experto en la técnica solamente requiere determinar un número de cavidades positivas en la placa para definir la cantidad de material biológico dentro de la muestra original, al igual que con la prueba MPN descrita arriba. En modalidades preferidas, las placas de incubación de estos métodos están construidas de plástico, u otros materiales hidrofóbicos. Como se mencionó arriba, el material biológico que puede detectarse es cualquier material que forme una partícula individual, tal como un microorganismo, la cual pueda cuantificarse determinando la presencia o ausencia de dicho material biológico dentro de cada cavidad de la placa de incubación. La muestra puede ser cualquier muestra biológica o muestra ambiental tal como agua de desecho, alimento, una torunda de superficie o torundas de otras superficies, tales como una garganta, u otras muestras bien conocidas en la técnica. Esta muestra puede ser una muestra líquida, o puede ser disuelta en un líquido para formar la muestra liquidificada. De esta manera, el término "liquidificación" se refiere a proveer la muestra en un líquido que pueda ser rápidamente distribuido en alícuotas dentro de la placa de incubación. La muestra liquidificada puede permanecer como un líquido o puede ser solidificada, por ejemplo, gelificada, en las cavidades después de que se haya removido el exceso de líquido. Esta invención provee un dispositivo y método extremadamente útiles que permiten que personal no entrenado determine rápidamente la cantidad de material biológico dentro de una muestra. Ya que la muestra es fácilmente liquidificada por gente sin entrenamiento significativo en mibrobiología, y que los materiales para cualquier prueba específica pueden proveerse por el fabricante, dicha gente puede fácilmente llevar a cabo las pruebas con precisión. La placa de incubación es provista generalmente en forma estéril para que no pueda ocurrir una detección inadecuada de material biológico. Aunque se conoce proveer contenedores de plástico que pueden retener líquido dentro de una pluralidad de cavidades, este dispositivo y método provee un método de formación automática de alícuotas (o auto-formaicón e alícuotas) en el cual los pasos que serán llevados a cabo por el analista se reducen y simplifican removiendo la necesidad de una adición manual de un reactivo y preferiblemente eliminando también la necesidad de pipetear una muestra u otro líquido sobre la placa. Esto es una mejora sobre los productos existentes usados para detectar y cuantificar microorganismos porque se reducen el potencial de contaminación del reactivo o errores en la dilución. El presente dispositivo puede usarse particularmente en el análisis de alimentos y para probar muestras clínicas. La separación de las cavidades del presente dispositivo evita la interferencia o contaminación entre cada alícuota. Gracias a esto, muchas de las pruebas pueden llevarse a cabo observando flourescencia (la cual no se lleva a cabo fácilmente en una caja de Petri que contiene). El dispositivo es particularmente útil cuando hay una gran cantidad de microorganismos presentes en una muestra, tal como más de un 3 microorganismo por un ml por diez ml. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma, y de las reivindicaciones. En referencia a las figuras 1A-1 D, se muestra una placa de incubación 10 que tiene una pluralidad de cavidades 12 cada una con un diámetro de aproximadamente 4 milímetros. La placa de incubación 10 tiene dimensiones rectangulares de aproximadamente 6.8 x 3.5 centímetros. La placa de incubación está hecha de plástico formado. Las cavidades 12 están separadas suficientemente para evitar la interferencia entre las cavidades. Estas cavidades pueden tener un bisel (figura 2B) si se desea para evitar que permanezca líquido en el borde superior de la cavidad. Las superficies interiores de las cavidades pueden tratarse por descarga de corona y un reactivo, tal como un medio de crecimiento, puede secarse sobre esas superficies. El reactivo puede ser un solo reactivo o una combinación de reactivos. Los expertos en ia técnica reconocerán que la placa de incubación 10 se puede formar fácilmente mediante procedimientos estándares y fabricarse con o sin pared de perímetro, y con o sin una tapa 14 (figuras 3A-3C). Dicha tapa se provee con orificios 16 para evitar el contacto de la tapa con la placa 10. Mediante referencia a las figuras 4A-4D y 5A-5C, se muestra una placa de incubación rectangular 10 con una tapa correspondiente 20. La tapa se construye con una serie de proyecciones o protrusiones 32 que se proyectan en las cavidades 12 de la placa cuando la tapa se cierra en la placa. El reactivo se puede aplicar en los extremos de dichas protrusiones de manera que cuando la tapa se coloca en la placa, las protrusiones se proyectan en la cavidad y el reactivo se disuelve en la muestra de prueba. La tapa se puede separar de la placa inferior o se puede formar como una parte integral. Por ejempio, la porción de tapa se puede unir a la porción de placa inferior con una "porción de gozne" de plástico delgado, lo cual permitirá que la tapa se cierre en la porción de placa inferior. En dicha modalidad ejemplar, cada una de las protrusiones de la tapa tiene una cavidad 34 en la punta, en la que se deposita un reactivo. La superficie interna de la cavidad puede ser tratarse por descarga de corona para impulsar la adhesión del reactivo, y el reactivo entonces se puede secar en la región tratada con descarga de corona. En el uso, la muestra se colocaría por sí misma en alícuotas en las cavidades, después el cierre de la tapa colocará a las puntas de las protrusiones en contacto con el líquido en las cavidades. Dicho contacto resultará en la disolución del reactivo contenido en las cavidades en las puntas de las protrusiones en cada una de las alícuotas de muestra. En el caso en donde el reactivo es un medio de cultivo bacteriano y la muestra contiene bacterias capaces de cultivarse en dicho medio, el cultivo bacteriano entonces puede ocurrir en las cavidades en las que existen bacterias viables. Mediante referencia a las figuras 6A-6C, se muestra una placa de incubación rectangular 10 que es similar en construcción a la placa de las figuras 1A-1C, excepto porque tiene una porción de manija 18. Un usuario puede sujetar la porción de manija, evitando de esta forma el contacto accidental posible con el área de aplicación de muestra de la placa. Además, en aplicaciones en donde la placa se sumerge en una muestra de líquido, mediante la sujeción de la porción de manija, se pueden evitar el contacto de los dedos del usuario o un dispositivo de sujeción con la muestra de volumen, reduciendo de esta forma la posibilidad de contaminación accidental de la muestra. La placa 10 de las figuras 6A-6C también se muestra en las figuras 7A-7C, junto con una tapa 20. Dicha tapa ejemplar se forma para cerrar totalmente la placa, y de esta forma es capaz de evitar la contaminación del lado inferior de una placa sumergida, y para evitar la contaminación de superficies de mesa u otros objetos con muestra licuada desde el lado inferior de una placa sumergida. De esta forma, en el uso, la porción que contiene una cavidad de la placa se sumerge en una muestra licuada, el exceso de líquido se drena de la placa, y la placa se inserta en la tapa/contenedor para incubación. La tapa/contenedor 20 se puede mantener cerrada utilizando las depresiones de acoplamiento de fricción-ajuste 22 en las porciones superior e inferior de la tapa. Las cavidades de la placa se pueden biselar.

Revestimiento de superficie de placa con reactivo Se puede utilizar una variedad de métodos diferentes para proveer un reactivo o reactivos dentro de una placa de incubación. Por ejemplo, se puede proveer un reactivo de manera que el reactivo se puede disolver fácil y rápidamente en contacto con un regulador de pH o solución, de preferencia una solución acuosa. En dicha modalidad, la cantidad de líquido agregado se debe controlar de manera que la concentración resultante del reactivo distribuido en las cavidades sea adecuada. De esta manera, en este caso, el reactivo se puede colocar dentro de la placa de incubación en cualquier forma y ubicación que pueda mantener al reactivo durante el manejo pero que pueda permitir la disolución rápida en la adición del líquido. En esta invención, sin embargo, se provee el reactivo en una forma y/o ubicación en la placa, de manera que no es necesario medir el volumen de la muestra licuada con la que se pone en contacto la placa con el fin de obtener una concentración adecuada de reactivo dentro de las alícuotas de muestras retenidas en las cavidades. Lo anterior se logra mediante la provisión de una cantidad discreta del reactivo directamente a cada cavidad en la que se desea la presencia del reactivo. Dichas cantidades individuales se pueden proveer en una variedad de formas, incluyendo las modalidades particulares descritas en la presente. Dichas modalidades usan un reactivo adherido a la superficie de la cavidad de tal manera que la cantidad del reactivo que se disuelve durante el procedimiento de autoformación de alícuotas es insignificante, o provee un reactivo en una ubicación de manera que no se pone en contacto con el líquido hasta después de que se complete el procedimiento de autoformación de alícuotas. Por ejemplo, la superficie interna de una o más cavidades se puede tratar con descarga corona y secado de reactivo en la superficie tratada, tal como desde una solución de reactivo altamente concentrada. El reactivo depositado de esta manera se disolverá lentamente, de manera que la cantidad perdida durante el procedimiento de autoformación de alícuotas será insignificante. La mayor parte del reactivo entonces se disolverá durante la parte inicial del periodo de incubación. La velocidad de disolución también se puede controlar mediante selección de los componentes medios. En otro ejemplo, el reactivo se puede depositar en protrusiones desde la superficie de la tapa de la placa. Las protrusiones se colocan de tal manera que las puntas de las protrusiones se proyectarán en cavidades individuales cuando la tapa se cierra en la placa. El reactivo se puede depositar en la superficie externa de las protrusiones, pero de preferencia se deposita en cavidades en la punta de las protrusiones. El reactivo se puede depositar en cualquier forma que resultará en el reactivo que se mantiene sustancialmente en posición durante el uso previo del controi de la placa. De esta manera, por ejemplo, el reactivo se puede mantener por los medios de barrera físicos, pero de preferencia se adhiere a la superficie de la protrusión y/o la superficie de una cavidad en la punta de la protrusión, tal como mediante un procedimiento que involucra el tratamiento con descarga corona y el secado del reactivo en la superficie tratada.

Tratamiento con descarga de corona v deposición de reactivo Los plásticos típicos se hacen de cadenas largas de subunidades enlazadas, por ejemplo, ei poiietileno está compuesto de cadenas largas de subunidades de etileno. En general, las soluciones acuosas y los solutos en soluciones acuosas no se atraen a las subunidades de cadena interiores y por lo tanto no se enlazan de manera efectiva a dichas ubicaciones. En contaste, con frecuencia existe una mayor afinidad entre dicho solutos y los extremos de cadena, particularmente en donde el extremo de cadena tiene un carácter relativamente polar. Como se entiende por aquellos expertos en la técnica, ei tratamiento con descarga de corona es un método que incrementa el carácter hidrofílico de una superficie de plástico tratada. El procedimiento de tratamiento con corona generalmente permite el paso del plástico a través de un arco eléctrico. La energía impartida por el arco eléctrico introduce un número significativo de rompimientos de cadena, incrementando de esta manera el número de extremos relativamente hidrofílicos disponibles para interacción. Además, el arco eléctrico también genera ozono, el cual, como un agente fuerte de oxidación genera aún rompimientos de cadena adicionales y grupos laterales polares mediante enlaces de oxidación dentro de las cadenas de polímero. Como se indica, dicho procedimiento de tratamiento incrementa el enlace de los compuestos polares, tales como los componentes de solución acuosa. Por lo tanto, para el uso de tratamiento con descarga de corona en placas de preparación de esta invención, siguiendo ei tratamiento con descarga de corona de la superficie de la cavidad, una solución concentrada de reactivo se coloca en las cavidades. Ya que las superficies tratadas con descarga de corona son ahora humectables (por ejemplo, hidrofílicas) el reactivo líquido forma un revestimiento uniforme sobre la superficie de la cavidad. La placa entonces se seca, generalmente en un homo de secado, expulsando el agua líquida y dejando un revestimiento duro de reactivo sólido en las cavidades. Como se afirmó con anterioridad, se pueden suministrar diferentes reactivos a cavidades diferentes, y/o algunas cavidades pueden no recibir ningún reactivo. Las cavidades que no reciben ningún reactivo pueden también usualmente no tratarse con descarga de corona. Otros métodos conocidos en la técnica también se pueden utilizar para incrementar la adhesión de reactivo a las superficies de placa adecuadas.

Uso En el uso, una muestra de prueba se puede licuar o diluir con un regulador de pH estéril o solución salina adecuada. Una cantidad de la muestra licuada entonces se puede distribuir sobre la superficie de la placa. En un modo de uso preferido, se espera que la muestra licuada contenga o se diluya para contener alrededor de 1-40 unidades del material biológico que se va a cuantificar, por ejemplo, células bacterianas viables. Una placa de incubación 10 de por ejemplo las figuras 1A-1C se sumerge de manera suficiente en la muestra líquida para llenar las cavidades, retirarse, y poderse drenar de manera breve mediante la sujeción alrededor de 90° de la horizontal. En este modo de uso, la placa provee una función de autoformación de alícuota y una función de auto-dispensación. De manera alternativa, en el caso de una placa que tiene una pared de perímetro, un exceso de la muestra licuada se coloca en la placa de incubación 10 y dicho líquido sometido a remolino dentro de la placa de incubación 10 para distribuir al líquido inoculado a cada una de las cavidades 12. La placa de incubación 10 entonces se mantiene en un ángulo de aproximadamente 90 grados para permitir que el exceso de líquido se drene de la placa. Como se muestra en las figuras 3A-3C, una placa 14 entonces se puede colocar en la placa de incubación y dicha placa se sujeta en un incubador durante un periodo adecuado, por ejemplo 18-48 horas. Después de dicho periodo, la presencia o ausencia de un resultado positivo se puede registrar en cada cavidad 12 de la placa.

EJEMPLO 1 Uso de placa de incubación para prueba de volumen Para el conteo de placa total, se usa una placa como se describe con anterioridad para la detección y cuantificación de la concentración bacteriana total de alimentos. Lo anterior se puede basar en una tecnología de enzima múltiple que correlaciona la actividad de enzima con la presencia de bacterias viables en alimentos. Lo anterior utiliza sustratos de enzima múltiples que producen un color fluorescente azul cuando se metaboliza por las bacterias. El reactivo de enzima múltiple se reviste en las superficies interiores de cavidades de la placa. Cuando una muestra de alimento preparada licuada se distribuye en las cavidades de una placa como se describe en la presente, la concentración bacteriana viable de dicho producto alimenticio se puede determinar después de 24 horas de incubación. El medio real utilizado en la presente no es importante para la invención, pero se provee solamente para propósitos ilustrativos.

Almacenamiento v disposición Las placas de prueba no utilizadas se almacenan a temperatura ambiente (4° a 25°C) lejos de la luz. Después del uso, el dispositivo de placa de incubación contendrá bacterias viables que se pueden manejar y descargar de manera adecuada.

Procedimiento de prueba - Aplicación de muestra de método de inmersión 1.- Obtener una muestra mediante la remoción de una cantidad adecuada de un material de volumen que se va a probar. Si se requiere, la muestra se licúa o se diluye en un volumen suficiente para permitir que una placa se sumerja en la muestra. 2.- Sujetar una placa de incubación sin contactar la superficie de aplicación de muestra (de preferencia sujetar la placa por la porción de manija si la placa incluye dicha porción). Sumergir la porción inferior de una placa de incubación abierta en la muestra, retirar la placa inmediatamente, y sujetar a aproximadamente 90 grados de la horizontal para permitir que el exceso de liquido se drene en la placa. De preferencia el exceso de liquido se permite drenar en un receptáculo de desperdicio en lugar de drenarse de nuevo en el contenedor de muestra con el fin de reducir la deposición posible de reactivo en el contenedor de la muestra. Asegurarse de que todos los "puentes cruzados" de líquido entre las cavidades se remuevan golpeando suavemente la placa. Expulsar el exceso de liquido de manera adecuada. 3.- Colocar la tapa de nuevo en la placa (o cerrar una tapa anexa). 4.- Colocar la placa en un incubador durante 24 horas. Las placas se pueden invertir si se desea. 5.- Contar el número de cavidades fluorescentes después de 24 horas mediante la colocación de una luz UV de 6 wats, 365 nm dentro de 12.7 cm de ia placa. No leer la placa antes de 24 horas. Los resultados son estables después de 48 horas. 6.- Comparar el número de cavidades fluorescentes a un diagrama de MPN para determinar el número más probable de bacterias presentes en la placa.

EJEMPLO 2 Uso de placa de incubación para prueba de dosis de unidad La placa que contiene a los medios descritos en al ejemplo 1 se utiliza para esta prueba.

Procedimiento de prueba 1.- Agregar 10 ml de regulador de pH estéril (o solución salina) a un tubo. Si es mayor a 0.1 ml de muestra alimenticia se debe inocular en la prueba, reducir el volumen de regulador de pH estéril adecuadamente para alcanzar un volumen final de 10 ml en el tubo. 2.- Inocular el regulador de pH con la muestra alimenticia que se está probando. 3.- Agitar el tubo varias veces para mezclar completamente el regulador de pH y la muestra alimenticia inoculada. 4.- Si el tubo es de tamaño suficiente, sumergir la placa en la muestra o verter alternativamente el reguJador de pH/suspensión de muestra sobre la superficie de aplicación de muestra de una placa de incubación conforme sea adecuado, cuidando que se llenen todas las cavidades. Después de aplicar la muestra, sujetar inmediatamente la placa a aproximadamente 90 grados de la horizontal para permitir que el exceso de liquido se drene de la placa. De preferencia el exceso de liquido se puede drenar en un receptáculo de desperdicio. Asegurarse de que todos los "puentes cruzados" de líquido entre las cavidades se remuevan golpeando suavemente la placa Expulsar el exceso de liquido de manera adecuada. 5.- Colocar la tapa de nuevo en la placa (o cerrar una tapa anexa). 6.- Colocar la placa en un incubador durante 24 horas. Las placas se pueden invertir si se desea. 7.- Contar el número de cavidades fluorescentes después de 24 horas mediante la colocación de luz UV de 6 wats, 365 nm dentro de 12.7 cm de la placa. No leer la placa antes de 24 horas. Los resultados son estables durante 48 horas. 8.- Comparar el número de cavidades fluorescentes en un diagrama de MPN para determinar el número más probable de bacterias presentes en la placa. Los documentos de patente y otras referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en la misma extensión como si cada uno se hubiera incorporado por separado por referencia en su totalidad.

Dispositivo de prueba con varilla de inmersión para detección v enumeración de microorganismos Haciendo referencia a continuación a las figuras 8-13, el concepto es utilizar materiales absorbentes individuales pequeños que contengan reactivo liofilizado o "sumergido-secado" en un armazón que permita la distribución de muestra automática y la enumeración del microorganismo objetivo. Un número de materiales (hidrofílicos) absorbentes ("isletas de reactivo") que contiene un reactivo se inmovilizan en una estructura de soporte hecha de un material hidrofóbico para formar las isletas de reactivo individuales. Las isletas de reactivo se pueden incrustar, por ejemplo, en la estructura de soporte. Sin embargo, lo anterior no se debe considerar como limitante ya que cualquier forma de aseguramiento de isleta de reactivo a la estructura de soporte se puede utilizar en tanto a que no interfiera con el ensayo. La velocidad de absorción del liquido de cada isleta de reactivo en esta modalidad es la misma debido a que las isletas de reactivo se hacen del mismo material y tienen ei mismo tamaño. Se puede hacer una configuración adicional de manera que haya dos o más grupos de isletas de reactivo en diferentes tamaños para formar un armazón que se pueda utilizar para trazar una cualificación de microorganismos mayor sin dilución en serie con base en los principios del método de número más probable (MPN). En una modalidad preferida, el reactivo es aquel que se desarrolla al probar la presencia de microorganismos objetivo en un uso de muestra, pero que no se limita a la tecnología de sustrato definida (DST) y/o tecnología de enzima múltiple (MET). Una detección positiva de microorganismos objetivo en tales activos provocará un cambio de color del reactivo y/o provocará la emisión de una señal fluorescente del reactivo cuando se observa bajo una lámpara UV de onda larga. Ejemplos de dichos reactivos son Colilert®, Enterolert™, Simplate TPC™, y Símpate CEc™. Un inoculo de muestras se precalcula con base en la velocidad de absorción máxima (punto de saturación) de una isleta de reactivo y el número total de isleta de reactivo en un dispositivo. Cuando la cantidad predeterminada de muestra de liquido (por ejemplo agua, leche, jugo y alimentos homogéneos) se inocula en dicho dispositivo, cada isleta de reactivo absorbe la misma cantidad de muestra. La muestra se puede distribuir en cada isleta de reactivo mediante el movimiento simple del dispositivo en un movimiento de atrás hacia adelante y circular. El área entre cada isleta de reactivo es hidrofóbica y cuando cada isleta de reactivo absorbe la muestra hasta su punto de saturación, no quedará ninguna muestra entre las isletas de reactivo y se evitará la contaminación cruzada entre la isleta de reactivo. La muestra de liquido absorbida por las isletas de reactivo también vuelve a hidrolizar al reactivo en las isletas de reactivo para soportar el cultivo de microorganismos en la muestra. Después de incubar el dispositivo que contiene una muestra a una temperatura predeterminada, las isletas de reactivo que contienen a los microorganismos objetivo de la muestra tendrán un cambio de color y/o emitirán señales fluorescentes (positivas); las isletas de reactivo que carecen de microorganismos objetivo de la muestra no exhibirán cambio de color y no emitirán señales fluorescentes (un resultado negativo). La concentración de microorganismos objetivo en la muestra bajo prueba se puede calcular con base en el número de isletas de reactivo positivas o negativas observadas utilizando el método de números más probables (MPN). Otra aplicación de este concepto es tener isletas negativas liofilizadas con diferentes tipos de reactivos. Cada reactivo se diseña para probar un aspecto específico de la muestra, tales como microorganismos, químicos o cualquier otro analito detectable de interés. La combinación de dichas isletas de reactivo en el mismo dispositivo forma un equipo de prueba que provee una prueba de un paso para químicos, analitos o materiales biológicos múltiples. Haciendo referencia específicamente a las figuras 8 y 9, se muestra otro aspecto de la invención que comprende una varilla de inmersión 100 que contiene una isleta de reactivo 101. La varilla generalmente se hará de plástico, pero su composición no es importante y se puede construir de cualquier material hidrofóbico que no se lixiviará en la muestra de prueba o no interferirá con el ensayo. Las figuras 8 y 9 muestran a la varilla con una isleta de reactivo única. La figura 10 muestra una modalidad preferida de la varilla de inmersión que contiene isletas de reactivo múltiples 102. Las zonas de isleta de reactivo se pueden establecer en la varilla de inmersión con cada zona teniendo isletas de reactivo que contienen diferentes reactivos o diferentes combinaciones de los reactivos a las otras zonas, permitiendo de esta manera que se lleven cabo ensayos múltiples en una varilla de inmersión única, cada zona probando un analito o microorganismo diferente. La figura 11 muestra al dispositivo de ensayo de varilla de inmersión de la figura 10 que ha sufrido el procedimiento de ensayo e ilustra las isletas de reactivo que muestran resultados positivos (isletas de reactivo obscuras) y resultados negativos (isletas de reactivo blancas). La figura 12 muestra una modalidad preferida de este aspecto de la invención. Se muestra una varilla de inmersión 100 con isletas de reactivo múltiples 101 que se pliegan e insertan en un tubo de prueba 103. En esta modalidad, el tubo de prueba también tiene una tapa 104 que además protege a las isletas de reactivo contra factores ambientales. Evidentemente, el dispositivo se puede colocar en otros tipos de contenedores tales como un manguito de plástico o cualquier contenedor que sirva para proteger al dispositivo. El reactivo colocado en la isleta de reactivo puede ser cualquier reactivo o combinación de reactivos que se pueda distribuir dentro o en el material de la isleta de reactivo.

Aplicación de muestra de prueba para dispositivo de varilla de inmersión Los métodos de aplicación de muestra al dispositivo son variados. La varilla de inmersión se puede sumergir en la muestra de prueba, y se deja en contacto el tiempo suficiente para que las isletas de reactivo absorban una cantidad predeterminada de fluido. Lo anterior generalmente será menor a 3 segundos, pero puede además depender del material del que se construyen las isletas de reactivo. En una modalidad preferida, las isletas de reactivo están construidas de celulosa. Sin embargo, estos se pueden construir de cualquier material que sea capaz de absorber y mantener un volumen de fluido. La muestra de prueba también se puede tomar mediante pipeta desde la solución de prueba en las isletas de reactivo con una pipeta de transferencia. La estructura de soporte puede también comprender una caja hecha de plástico u otro material hidrofóbico adecuado. Las isletas de reactivo se pueden colocar dentro de la caja y la caja se puede abrir y la solución de prueba se puede aplicar utilizando una pipeta o mediante vertido, o cualquier medio adecuado. La caja puede tener una tapa para proteger adicionalmente al dispositivo asegurado en la misma o como una pieza separada. Haciendo referencia ahora a la figura 13, la estructura de soporte puede también comprender un soporte de centro 104 en el cual las "hojas" 105 se unen y soportan a las isletas de reactivo 106. Las hojas se pueden disponer en una estructura tridimensional como se muestra en la figura 13, maximizando de esta forma el número de hojas que se pueden acomodar en el dispositivo. El dispositivo se puede colocar en un contenedor circular 108 y en una tapa 107 colocada en el mismo para proveer protección adicional para el dispositivo antes, durante y después del desarrollo del ensayo.

Dispositivo de pipeta Haciendo referencia ahora a la figura 14, en otro aspecto, la invención provee un dispositivo que comprende una estructura de soporte 109 que está contenida dentro de la pipeta de laboratorio 111. Las isletas de reactivo múltiples 110 están contenidas en o dentro de ia estructura de soporte 109. De preferencia, la estructura de soporte 109 tiene más de un lado con isletas de reactivo 110 en la misma. La estructura de soporte 109 se forma más preferiblemente de un polímero sintético, tal como plástico, y se inserta en una pipeta de laboratorio 111 que de preferencia está comprendida de vidrio o plástico y tiene un extremo ahusado para la toma de la muestra. La muestra se puede retirar meramente en la pipeta mediante un aparato de aspiración conocido en la técnica, pudiendo permanecer durante un tiempo suficiente para que las isletas de reactivo absorban un volumen predeterminado de la muestra de prueba, y se expulsen del dispositivo. El dispositivo entonces se incuba durante un tiempo suficiente para llevar a cabo el ensayo, y se determinan los resultados. La pipeta misma comprende ambos medios simples de aplicación de muestra al dispositivo de prueba, así como una función protectora.

EJEMPLO 1 Sistema de detección bacteriana para coliformes y E. coli en la leche utilizando el dispositivo de varilla de inmersión El siguiente es un ejemplo acerca de como la presente invención provee un método fácil de detección coliforme en la leche, que no comprende muchos pasos, y provee resultados que son fáciles de interpretar. El ensayo se puede llevar a cabo utilizando un dispositivo de prueba con isletas de reactivo múltiples, cada una de las cuales absorbe .033 ml de leche. La leche se agregó al dispositivo de prueba y formó por sí misma alícuotas para todas las isietas de reactivo. La muestra se incubó durante 24 horas y proveyó el número de coliformes presentes mediante la examinación acerca de como varias de las isletas de reactivo cambian de color. El número de coliformes presentes se determina con base en el diagrama de MPN. Los datos obtenidos del ensayo se muestran en el cuadro 1. Sé enfatiza la flexibilidad de la capacidad de toma del dispositivo de prueba ya que la entrada de volumen se puede ajustar fácilmente mediante el ajuste del número y/o tamaños de las isletas de reactivo. El dispositivo también tiene la capacidad de tener pruebas múltiples en el mismo dispositivo, mediante la impregnación de las isletas de reactivo con diferentes medios.

CUADRO 1 Muestra de leche Dispositivo de varilla de inmersión (cfu/ml) #7197A 10.3 #7197B 11.8 #7197C 16.4 #710 56.3 #713 18 #3B1 0 #3B2 37 #2B2 0 #2B1 9.3 #618 69.1 #618A A11 + #622A 12 #622B 36 #622C 3 #7697A 56 #7697B 22 #7697C 16 #7697D 31 #811 3 #815 16 #813 6.2 Media 23.41 Desviación estándar 20.75 La invención se ha descrito en detalle con referencia particular a ciertas modalidades preferidas de la misma, pero se entenderá que se pueden efectuar variaciones y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN R E I V I N D I C A C I O N E S

1.- Una placa de incubación estéril para la determinación de la presencia o cantidad de un material biológico, dicha placa teniendo una superficie horizontal generalmente plana, dicha superficie definiendo una pluralidad de cavidades deprimidas, cada una de dichas cavidades estando adaptada para contener una alícuota de líquido estando dimensionada, configurada y formada de un material adecuado para contener una alícuota dentro de dichas cavidades por tensión superficial, al menos una de dichas cavidades conteniendo por lo menos un reactivo para la detección de un material biológico, de manera que dicha placa de incubación no proveerá ninguna respuesta positiva para el material biológico en ausencia de material biológico presente en una muestra aplicada a dicha placa.

2.- La placa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho reactivo se deposita en dichas cavidades mediante tratamiento por descarga de corona y secado.

3.- La placa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende una tapa.

4.- La placa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende una pluralidad de reactivos diferentes.

5.- La placa de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque se proveen diferentes reactivos a diferentes cavidades entre la pluralidad de dichas cavidades.

6.- La placa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque al menos algunos de dichos reactivos diferentes proveen diferentes ensayos.

7.- La placa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque al menos un reactivo comprende células de al menos una cepa bacteriana.

8.- La placa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la placa se forma de un material hidrofóbico.

9.- La placa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque cada una de dichas cavidades se bisela para ayudar en la remoción de exceso de líquido.

10.- La placa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha placa comprende además una porción de manija.

11.- Una placa de incubación estéril para la determinación de la presencia o cantidad de un material biológico, dicha placa teniendo una superficie horizontal generalmente plana, dicha superficie definiendo una pluralidad de cavidades deprimidas, cada cavidad estando adaptada para contener una alícuota de líquido y estando dimensionada, configurada y formada de un material adecuado para contener dicha alícuota dentro de cada cavidad por tensión superficial, y una tapa que tiene al menos una protrusión ajustable en al menos una de dichas cavidades y que contiene al menos un reactivo para la detección de material biológico, de manera que dicha placa de incubación no proveerá ninguna respuesta positiva para dicho material biológico en ausencia de dicho material biológico presente en una muestra aplicada a dicha placa.

12.- La placa de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque al menos un reactivo se seca en al menos una protrusión.

13.- La placa de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la punta de al menos una protrusión se trata por descarga de corona previo a la deposición de dicho reactivo.

14.- La placa de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque al menos una protrusión tiene una cavidad, y dicho reactivo está contenido dentro de dicha cavidad.

15.- La placa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la superficie de dicha cavidad se trata por descarga de corona.

16.- La placa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque comprende una pluralidad de reactivos diferentes.

17.- La placa de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque se proveen reactivos diferentes a cavidades diferentes entre la pluralidad de dichas cavidades.

18.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque al menos un reactivo comprende células de al menos una cepa bacteriana.

19.- La placa de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque al menos algunos de dichos reactivos diferentes proveen ensayos diferentes.

20.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicha placa se forma de un material hidrofóbico.

21.- La placa de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque cada una de dichas cavidades se bisela para ayudar en la remoción de exceso de líquido.

22.- La placa de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha placa además comprende una porción de manija.

23.- Un método para detectar la presencia o cantidad de un material biológico en una muestra, comprendiendo los pasos de: proveer una placa de incubación que comprende al menos una cavidad que contiene al menos un reactivo para la detección de material biológico, dicha placa teniendo una superficie horizontal generalmente plana, dicha superficie definiendo una pluralidad de cavidades deprimidas, cada una de dichas cavidades estando adaptada para contener una alícuota de líquido y estando dimensionada, configurada y formada de un material adecuado para contener dicha alícuota dentro de cada una de dichas cavidades mediante tensión superficial, al menos una cavidad conteniendo al menos un reactivo para la detección de dicho material biológico; distribuir una muestra de líquido sobre la superficie de dicha placa de incubación; drenar cualquier exceso de líquido de dicha placa de incubación, e incubar dicha placa de incubación hasta que se determine la presencia o cantidad de dicho material biológico en una o más de dichas cavidades, de manera que la presencia o cantidad de dicho material biológico se pueda determinar.

24.- Un método para la detección de la presencia o cantidad de un material biológico en una muestra, comprendiendo los pasos de: proveer una placa de incubación estéril que comprende una porción de placa que tiene una superficie horizontal generalmente plana, dicha superficie definiendo una pluralidad de cavidades deprimidas, cada una de dichas cavidades estando adaptada para contener una alícuota del líquido y estando dimensionada, configurada y formada de un material adecuado para contener dicha alícuota dentro de cada una de dichas cavidades mediante tensión superficial, y una tapa que tiene al menos una protrusión que contiene al menos un reactivo para la detección de dicho material biológico; donde cada protrusión se ajusta en una de dichas cavidades cuando dicha tapa se cierra en dicha porción de placa inferior; distribuir una muestra de líquidos sobre la superficie de dicha placa de incubación; drenar cualquier exceso de líquido de dicha placa de incubación; cerrar dicha tapa en dicha porción de placa de manera que al menos un reactivo en al menos una protrusión se ponga en contacto con las alícuotas de líquido en dichas cavidades individuales, permitiendo de esta forma la disolución de al menos un reactivo; e incubar dicha placa de incubación hasta que se determine la presencia o cantidad de dicho material biológico en una o más de dichas cantidades, de manera que la presencia o cantidad de dicho material biológico se pueda determinar.

25.- Un método para hacer una placa de incubación que comprende al menos un reactivo, dicho método comprende los pasos de: a) proveer una placa de incubación estéril que tiene una porción de placa con una superficie horizontal generalmente plana, dicha superficie horizontal definiendo una pluralidad de cavidades deprimidas, cada una de dichas cavidades estando adaptada para contener una alícuota de líquido y estando dimensionada, configurada y formada de un material adecuado para contener dicha alícuota dentro de cada una de dichas cavidades mediante tensión superficial, y una tapa que comprende al menos una protrusión, en donde dicha protrusión se ajusta en una de dichas cavidades cuando dicha tapa se cierra en dicha porción de placa inferior; y b) secar al menos un reactivo de una suspensión o solución líquida en al menos una protrusión.