MXPA00005138A - Preparacion especifica del sitio de conjugados de polietilenglicol-grf - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la preparación específica del sitio de conjugados de hGRF-PEG que contienen una o más unidades PEG (por mol de hGRF) covalentemente enlazadas a Lys12 y/o Lys21 y/o Nalfa, caracterizado porque la reacción de conjugados entre el péptido hGRF y la unidad PEG activada se lleva a cabo en solución y el conjugado hGRF-PEG deseado puede ser purificado mediante cromatografía. Los conjugados preparados mediante este método, asícomo su uso en el tratamiento, prevención o diagnostico de deficiencia de la hormona de crecimiento, son también un objetivo de la presente invención.

Description

PREPARACIÓN ESPECIFICA DEL SITIO DE CONJUGADOS DE POLIETILENGLICOL-GRF CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la preparación específica del sitio de conjugados de hGRF-PEG, que contienen una o más unidades PEG (por hGRF) covalentemente enlazadas a Lys12 y/o Lys21 y/o Na, caracterizado porque la reacción de conjugación entre el péptido hGRF y el PEG activado se lleva a cabo en solución y el conjugado de hGRF-PEG deseado es purificado mediante métodos cromatográficos. Los conjugados preparados mediante este método, así como su uso en el tratamiento, prevención V. o diagnóstico de desórdenes relacionados a la hormona del crecimiento, son también un objetivo de la presente invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Al principio de los años 1980 varios grupos aislaron y caracterizaron el factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF) .

GRF (también llamado Somatorelina) es un péptido secretado por el hipotálamo, que actúa sobre su receptor y puede promover la liberación de la hormona del crecimiento (GH) a partir de la pituitaria anterior. Éste existe como un péptido de 44, 40 o 37 aminoácidos; la forma de 44 aminoácidos puede ser convertida fisiológicamente a formas más cortas. Se reporta que todas estas tres formas son activas, radicando principalmente la actividad en los primeros 29 residuos de aminoácidos. Un péptido sintético correspondiente a la secuencia de 1 a 29 aminoácidos del GRF humano [hGRF ( 1-29) ] , también llamado Sermorelina, ha sido preparado mediante tecnología de ADN recombinante como se describe en la Patente Europea EP-105,759. La Sermorelina ha sido utilizada en la forma de acetato para el diagnóstico y tratamiento de la deficiencia de la hormona del crecimiento. GRF tiene por supuesto un valor terapéutico para el tratamiento de ciertos desórdenes relacionados a la hormona del crecimiento. El uso de GRF para estimular la liberación de GH es un método fisiológico en la promoción del desarrollo de huesos largos o anabolismo de proteínas.

Un problema asociado con el uso de GRF se refiere a su vida media biológica corta (aproximadamente 12 a 30 minutos) . El hGRF ( 1-29 ) -NH2 está sujeto a la degradación enzimática, y es rápidamente degradado en el plasma vía la escisión por la dipeptidilpeptidasa IV (DPP-IV) entre los residuos Ala2 y Asp3. Es por lo tanto ventajoso desarrollar análogos de GRF de acción prolongada, biológicamente estables, utilizando la modificación química específica de GRF, con el fin de prevenir o retardar la degradación enzimática. El polietilenglicol (PEG) es un polímero hidrofílico, biocompatible y no tóxico de la fórmula general H (0CH2CH2) nOH, en donde n _> 4. Su peso molecular podría variar de 200 a 20,000 daltones. Se ha demostrado que la configuración química de PEG en su forma monometoxilada a las proteínas y/o a los péptidos incrementa significativamente su duración de acción biológica. Como las porciones de carbohidrato en una glucoproteína, PEG proporciona un recubrimiento protector e incrementa el tamaño de la molécula, reduciendo de este modo su degradación metabólica y su velocidad de despejo renal.

La conjugación con PEG es una metodología ya establecida para la administración de péptidos y proteínas utilizadas primeramente por los estudios fundamentales de Davis y Abuchowsi (Abuchowski et al, 1977a y 1977b) . La conjugación de PEG a los péptidos o proteínas dio como resultado en general acoplamiento químico no específico de PEG a más de un residuo de aminoácidos. Uno de los asuntos clave con esta tecnología es por lo tanto el hallar métodos químicos apropiados para conjugar covalentemente la o las moléculas de PEG a los residuos de aminoácidos específicos . Por ejemplo, el PEG activado con triclorotriazina, el cual se encontró que es tóxico y que reaccionaba de una manera no específica, fue posteriormente reemplazado por diversos reactivos de PEG con enlazadores químicos que podían reaccionar específicamente a los grupos amino (Benchamp et al., 1983; Veronese et al., 1985; Zalipsky et al., 1983; Zlipski et al-, 1990; y Delgado et al., 1990), a grupos sulfhidrilo (Sartore et al., 1991; y Morpurgo et al., 1996) o a residuos guanidino (Pande et al., 1980) . Diversos conjugados PEG-proteína se encontró que eran protegidos de la proteólisis y/o tenían una inmunogenicidad reducida (Monfardini et al., 1995; y Yamsuki et al., 1988) . Otra dificultad técnica en la pegilación de proteínas surge del hecho de que los conjugados de PEG-proteína usualmente tienen diversos números de moléculas de PEG acoplados y dan como resultado una mezcla de conjugados con diferente estequiometría PEG:proteína . La pegilación específica del sitio permanece siendo un reto químico. La conjugación de PEG a GH representa un ejemplo típico de tal problema (Clark et al., 1996) . Se demostró que los residuos de Lys de GH eran pegilados en posiciones aleatorias. Para evitar o reducir la pérdida de actividad enzimática, el sitio activo podría ser protegido de antemano, permitiendo así que ocurra la pegílación enzimática en uno o varios sitios no activos (Caliceti et al., 1993) . Otro procedimiento fue recientemente propuesto para la conjugación específica del sitio de PEG a péptidos de bajo peso molecular, tales como GRF, que se preparó mediante síntesis de péptidos en fase sólida. En estos conjugados un aminoácido pegilado, preparado de antemano, se introdujo dentro de la secuencia peptídica durante la síntesis en fase sólida. Este procedimiento, no obstante, complica dramáticamente la purificación del producto que se sabe es el paso crítico en la síntesis en la fase sólida. La presencia de PEG, por su alto peso molecular y su polidispersión, es probable que produzca productos finales con impurezas y/o productos inaceptables, con aminoácidos faltantes, siendo los últimos considerados como que ocurren comúnmente en el procedimiento de Merrifield. La mono-pegilación, que significa que sólo una molécula de PEG es acoplada, utilizando síntesis en fase sólida a residuos de aminoácidos especlzficos de [Ala15] -hGRF(l-29) -NH2 ha sido reportada recientemente en la literatura (Félix et al., 1995) . Este estudio muestra que [Ala15] -hGRF ( 1-29 ) -NH2 pegilado en los residuos 21 ó 25 conserva la potencia in vi tro completa del [Ala15] -hGFR ( 1-29 ) -NH2 progenitor. No obstante, no existen datos in vi vo que muestren si estos conjugados pegilados exhiben una duración prolongada de acción con respecto a la contraparte no pegilada. Más recientemente, se ha demostrado (Campbell et al., 1997) que el acoplamiento de PEG con diferentes pesos moleculares al extremo C de diversos análogos de hGRF, utilizando nuevamente la síntesis de fase sólida, tuvo duración de acción aumentada en modelos en cerdo y en ratón, en comparación a la contraparte no pegilada.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En contraste a la preparación en fase sólida del hGRF monopegilado anteriormente mencionado, la presente invención se refiere a la pegilación específica del sitio de hGRF en fase de solución. Se encontró que hGRF tiene una baja solubilidad en una solución amortiguadora de neutro/alcalino, una condición química mediante la cual ocurre de manera más eficiente la reacción de pegilación. En una solución de hGRF diluida, la hidrólisis del PEG activado (tal como el éster de PEG) tiende a disminuir el rendimiento de la reacción de pegilación. El Solicitante descubrió que, en un solvente adecuado mediante el cual hGRF tiene una alta solubilidad, es posible llevar a cabo una reacción de pegilación específica del sitio en fase en solución. De esta manera, incluso si el péptido hGRF inicial está no protegido, las cadenas de PEG se enlazarán con altos rendimientos y casi exclusivamente a los grupos amino primarios (grupos e-amino) de Lys12, Lys21 y/o Na, dependiendo de las condiciones de reacción. Los siguientes cuatro conjugados, los cuales también son cubiertos por la presente invención, fueron obtenidos, la proporción estequiométrica de hGRF: PEG en los conjugados depende principalmente de la proporción molar de PEG a hGRF: Conjugado hGRF-PEG, en el cual una molécula de PEG está covalentemente enlazada a Lys12, Conjugado hGRF-PEG, en el cual una molécula de PEG está covalentemente enlazada a Lys21, Conjugado hGRF-2PEG, en el cual 2 moléculas de PEG están covalentemente enlazadas a Lys12 y Lys21; y Conjugado hGRF-3PEG, en el cual 3 moléculas de PEG están covalentemente enlazadas a Lys12 y Lys21 y también a Na. ?%Na" a todo lo largo de la presente invención significa el grupo amino en la posición N-terminal del péptido (Tyr) . Además de este paso, es posible llevar a cabo un fraccionamiento cromatográfico simple de los conjugados obtenidos en la reacción, ya sea mediante filtración en gel o por aplicación directa de una columna de HPLC C18 eluida con gradiente de agua/acetonitrilo . El segundo método es preferido, ya que la preparación a gran escala y la purificación de los productos podría ser obtenida. Por lo tanto, la modalidad principal de la presente invención es un método para la preparación específica del sitio de diferentes conjugados de hGRF-PEG, que contienen una o más unidades PEG (por hGRF) covalentemente enlazado a Lys12 y/o Lys21 y/o Na, caracterizado porque la reacción de pegilación se lleva a cabo en solución y el conjugado deseado hGRF-PEG es purificado, por ejemplo, mediante métodos cromatográficos . Los conjugados de hGRF-PEG que contienen una o más unidades de PEG (por mol de hGRF) covalentemente enlazado a Lys12 y/o Lys21 y/o Na son también cubiertos por la presente invención. Los conjugados de hGRF-PEG, en los cuales 1 molécula de PEG está covalentemente enlazada a Lys12 o a Lys21, son los productos preferidos de la presente invención. De acuerdo con otra modalidad más de la presente invención, si uno o más de estos tres grupos amino a los cuales se enlazan las cadenas de PEG, son reversiblemente protegidos por ciertos grupos químicos de la pegilación, la reacción de pegilación dará directamente el conjugado deseado con sitios de pegilación específicos, los .cuales pueden ser luego aislados de la mezcla de reacción, por ejemplo, mediante ultrafiltración u otros métodos cromatográficos. En este caso, el método de preparación puede además, opcionalmente, comprender una reacción de desprotección. . La reacción de desprotección es preferentemente llevada a cabo de acuerdo a los métodos conocidos y dependiendo del grupo protector químico que se va a eliminar. De acuerdo a esta invención el término "hGRF", a no ser que se especifique de otro modo, se pretende que cubra cualesquiera péptidos GRF humanos, con referencia particular a los péptidos 1-44, 1-40, 1-29 y a las amidas correspondientes de los mismos (que contienen un grupo amida en el extremo N o en el extremo C) . El péptido hGRF preferido es hGRF (1-23)- NH2 cuya secuencia de aminoácidos es reportada en la SEQ ID NO. : 1. El "PEG activado" (o "agente de pegilación") es cualquier derivado de PEG, el cual puede ser utilizado como modificador de proteínas, debido a que éste contiene un grupo funcional capaz de reaccionar con algún grupo funcional en la proteína/péptido para producir los conjugados de PEG-proteína/péptido . Una revisión de los derivados de PEG útiles como modificadores de proteína se puede encontrar en Harris (1985) . El PEG activado puede ser un reactivo de alquilación, tal como aldehido de PEG, epóxido de PEG o tresilato de PEG, o éste puede ser un reactivo de acilación, tal como éster de PEG. El PEG activado es preferentemente utilizado en su forma mono-metoxilada . Éste tiene preferentemente un peso molecular entre 2,000 y 20,000. el PEGs,ooo mono-metoxilado es particularmente preferido para la preparación del PEG activado de acuerdo a la presente invención. Si el PEG activado es un agente de acilación, éste contiene preferentemente ya sea un residuo de norleucina o de ornitina enlazado a la porción PEG vía un enlace amida. Estos residuos permiten una determinación precisa de las unidades de PEG enlazadas por mol de péptido (ver por ejemplo Sartore et al., 1991) . Por lo tanto, más en particular, el PEG activado, preferido es el PEGs,ooo mono-metoxilado, enlazado por medio de un enlace de amida al grupo alfa-amino de norleucina, que está activado en el grupo carboxilado como éster de succinimidilo .

Los PEGs ramificados están también en uso común. Los PEGs ramificados pueden ser representados como R(-PEG-OH)ra en los cuales R representa una porción de núcleo central tal como pentaeritritol o glicerol, y m representa el número de brazos de ramificación. El número de brazos (m) de ramificación puede estar en el intervalo de tres a cien o más. Los grupos hidroxilo están sujetos a modificación química. Otra forma ramificada, tal como aquella descrita en la solicitud de patente de PCT WO 96/21469, tiene un extremo simple que está sujeto a la modificación química. Este tipo de PEG puede ser representado como (CH30-PEG- ) PR-X, con lo cual p es igual a 2 ó 3, R representa un núcleo central tal como lisina o glicerol, y X representa un grupo funcional tal como carboxilo que está sujeto a la activación química. Otra forma ramificada más, el "PEG sobresaliente" tiene grupos reactivos, tal como carboxilo, a lo largo de la columna vertebral de PEG en vez de en el extremo de las cadenas de PEG. Todos estos PEG ramificados pueden ser "activados" como se indicó anteriormente. "Métodos cromatográficos" significa cualquier técnica que sea utilizada para separar los componentes de una mezcla mediante su aplicación sobre un soporte (fase estacionaria) a través de la cual fluye un solvente (fase móvil) . Los principios de separación de la cromatografía están basados en la naturaleza física diferente de la fase estacionaria y la móvil. Algunos tipos particulares de métodos cromatográficos, los cuales son bien conocidos en la literatura, incluyen: cromatografía líquida, líquida de alta presión, de intercambio iónico, de absorción, de afinidad, de división, hidrofóbica, de fase inversa, de filtración en gel, de ultrafiltración o en capa delgada. "Pegilación" es la reacción mediante la cual un conjugado de PEG-proteína/péptido es obtenido comenzando a partir del PEG activado y la proteí a/péptido correspondiente. La proporción molar PEG:hGRF puede ser 1:1, 2:1 ó 3:1, dependiendo de qué conjugado se busque a altos rendimientos. El solvente de la reacción de pegilación se selecciona del grupo que consiste de una solución acuosa de nicotinamida altamente concentrada, una solución acuosa amortiguada de un agente de desplegamiento (tal como urea) o un solvente orgánico polar seleccionado entre sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida/amortiguador o acetonitrilo/ amortiguador . El pH de la solución es usualmente mantenido entre 7 y 9. Una lista no limitante de los grupos químicos protectores para Lys12 y Lys21 incluye: Alloc (aliloxicarbonilo), Dde ( 1- ( 4 , 4-dimetil-2 , 6-dioxociclohex-1-iliden) etilo ) , Adpoc (1-(1'-adamantil ) -1-metil-etoxicarbonilo ) o 2-C1-Z (2-clorobenciloxicarbonilo) . Alloc es el grupo protector preferido para el grupo lisina. Después de la pegilación Alloc puede ser eliminado de acuerdo a uno de los métodos descritos en Greene T. W. Et al., 1991. Dde puede ser eliminado con 2% de hidrazina en DMF (ver W.C. Chan et al., 1995) . Adpoc puede ser eliminado similarmente a Alloc (ver también Dick F. et al., 1997) . 2-C1-Z puede requerir una desprotección con ácido más fuerte (HF, TFMSA, HBr) o hidrogenación (ver también Ta et al., 1987) . Los grupos protectores para Na pueden ser un grupo alquilo, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, t-butilo, bencilo o ciclohexilo. El isopropilo es uno de los preferidos. Estos grupos alquilo pueden ser introducidos mediante alquilación reductiva (ver Murphy et al., 1988 o Hocart et al., 1987) . [Na- isopropil-Tyr1, Lys (Alloc) 12] -hGRF y [Lys (Alloc)12'21] son también cubiertos por la presente invención, como intermediarios nuevos y útiles de la reacción de pegilación. Se ha descubierto también que la pegilación de la presente invención: 1. no modifica la conformación del péptido, 2. incrementa la resistencia a la degradación proteolítica, 3. no afecta, o sólo disminuye ligeramente la actividad biológica, dependiendo del grado de pegilación y 4. permite obtener productos (los conjugados), que son más solubles en soluciones amortiguadas acuosas . Otro objetivo de la presente invención es proporcionar los conjugados de hGRF-PEG en forma sustancialmente purificada con el fin de hacerlos más adecuados para el uso en las composiciones farmacéuticas como ingredientes activos. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de los conjugados de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o diagnóstico de desórdenes relacionados a la hormona de crecimiento, tales como por ejemplo deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD) , en particular deficiencia de la hormona de crecimiento pediátrica. El medicamento es preferentemente presentado en la forma de una composición farmacéutica que comprende los conjugados de la invención junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas forman un aspecto adicional de la presente invención. Una modalidad de la invención es la administración de una cantidad farmacológicamente activa de los conjugados de la invención a sujetos en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada a la hormona del crecimiento o a sujetos que ya muestran tal patología. Un objetivo adicional de esta invención es un método de tratamiento, prevención o diagnóstico de desórdenes relacionados a la hormona del crecimiento, que comprenden el administrar una cantidad efectiva de los conjugados de la invención, en presencia de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar el curso y la celeridad de los desórdenes descritos anteriormente, conduciendo a la reducción o a la remisión de tal patología. La cantidad efectiva dependerá de la ruta de administración y de la condición del paciente. "Farmacéuticamente aceptable" se entiende que abarca cualquier portador, el cual no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente y que no es tóxico para el huésped al cual se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, los ingredientes activos anteriormente mencionados pueden ser formulados en forma de dosis unitaria para la inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina sérica y solución de Ringer. Además del portador farmacéuticamente aceptable, las composiciones de la invención pueden también comprender cantidades menores de aditivos, tales como estabilizadores, excipientes, amortiguadores y conservadores. Cualquier ruta de administración compatible con el principio activo puede ser utilizada. La preferida es la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa. La dosis del ingrediente activo que va a ser administrado depende de la base de las prescripciones médicas de acuerdo a la edad, el peso y la respuesta individual del paciente. La dosis del ingrediente activo para la terapia humana puede estar entre 5 y 6,000 µg/kg de peso corporal y la dosis preferible está entre 10 y 300 µg/kg de peso corporal. La presente invención ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas, pero el contenido de la descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que puedan ser originadas por una persona experta en la técnica, sin extenderse más allá del significado y propósito de las reivindicaciones . La invención será ahora descrita por medio de los siguientes Ejemplos, los cuales no deben ser considerados de ningún modo limitantes de la presente invención. Los Ejemplos se referirán a las Figuras especificadas enseguida.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de hGRF ( l-29-NH2. Las flechas indican el o los posibles sitios de pegilación. La Figura 2 muestra la cromatografía de HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) de fase inversa de la mezcla obtenida después de la reacción de pegilación en DMSO, llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Los dos primeros picos mayores son los conjugados que contienen 1 cadena de PEG por mol de hGRF. El siguiente pico menor es el conjugado hGRF:2PEG y el último pico menor es el conjugado hGRF:3PEG. La Figura 3a reporta la degradación de hGRF(l-29) y de los conjugados de PEG de la presente invención por subtilisina. La Figura 3b reporta la degradación de hGRF(l-29) y de los conjugados de PEG de la presente invención por quimotripsina . La Figura 4 muestra la caracterización espectroscópica de [Lys (MPEG5, ooo-CH2-CO-Nle-CO) 12'21-hGRF ( 1-29) -NH2] llevada a cabo mediante dicroismo circular. Los espectros son superponibles con aquellos del hGRF "nativos".

La Figura 5 muestra el efecto biológico de diversos conjugados hGRF-PEG (a partir de una primera preparación con DMSO) en el ensayo in vi tro de CHO-hGRFR-LUC. Los datos representan el promedio de tres experimentos independientes. La Figura 6 reporta el efecto biológico de varios conjugados hGRF-PEG (a partir de una segunda preparación con DMSO) en el ensayo in vi tro CHO-hGRFR-LUC. Los datos representan el promedio de dos experimentos independientes. La Figura 7 muestra el efecto biológico de diversos conjugados hGRF-PEG (a partir de una preparación con nicotinamida) en el ensayo i n vi tro CHO-hGRFR-LUC . Los datos representan el promedio de dos experimentos independientes. La Figura 8 ilustra el efecto biológico de los diversos conjugados hGRF-PEG (primera preparación con DMSO) sobre la liberación de GH a partir de células de pituitaria de rata in vi tro . La Figura 9 muestra el efecto biológico de diversos conjugados de hGRF-PEG (a partir de una segunda preparación en DMSO) sobre la liberación de GH a partir de células de pituitaria de rata in vi tro .

La Figura 10 muestra la curva tiempo-respuesta de hGRF plasmático y los niveles de GH en suero después de la inyección intravenosa de hGRF (400 µg/rata) en ratas macho. Cada punto representa la media +_ el valor de SEM obtenido a partir de nueve ratas . La Figura HA (ver el primer párrafo en la página) muestra la curva tiempo-respuesta de los niveles de GH en suero después de la inyección intravenosa de 400 µg/rata de conjugados hGRF-PEG (preparación en DMSO) en ratas macho. Cada punto representa el valor medio obtenido para tres ratas. La Figura 11B (ver el segundo párrafo en la página) muestra la curva tiempo-respuesta de los niveles plasmáticos de hGRF después de la inyección intravenosa de 400 µg/rata de conjugados hGRF-PEG (preparación en DMSO) en ratas macho. Cada punto representa el valor medio obtenido para tres ratas. La Figura 12 representa el mapa de restricción del plásmido pcDNA3-hGRF-R utilizado en el ensayo del gen reportero para la evaluación de la actividad de GRF. La Figura 13 muestra el mapa de restricción del plásmido pTF5-53 LUC utilizado en el ensayo del gen reportero para la evaluación de la actividad de GRF.

EJEMPLOS Abreviaturas Acetonitrilo (ACN) , aliloxicarbonilo (Alloc) , Bencilo (BZL) , ter-butiloxicarbonilo (Boc) , diclorometano (DCM) , diisopropiletilamina (DIEA) , dimetilformamida (DMF) , sulfóxido de dimetilo (DMSO) , 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), hexafluorofosfato de 2- [IH-benzotriazol-l-il] -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU) , 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) , éter t-butílico de metilo (MTBE) , norleucina (Nle) , N-metilpirrolidona (NMP), 2 , 2 , 5, 7 , 8-pentametil-croman-6-sulfonilo (Pmc), ter-butilo (tBu), ácido trifluoroacético (TFA) , trifenilmetilo (Trt) .

EJEMPLO 1 : Pegilación en fase en solución de hGRF En estos experimentos el PEGs,ooo monometoxilado (MPEG5,ooo) enlazado por medio de un enlace amida al grupo alfa-amino de la norleucina, que es activado en el grupo carboxilo como éster de succinimidilo, fue utilizado como reactivo de pegilación. Éste puede ser preparado por ejemplo como se describe en Lu et al., 1994. GRF?-2?hGRF ( 1-29) -NH2 humano suministrado por Bachem se utilizó como el péptido hGRF. Dada la baja solubilidad de hGRF(l-29) en solución acuosa a pH neutro o ligeramente alcalino necesario para la pegilación, han sido adoptadas las condiciones de reacción alternativas A a E: A. Sulfóxido de dimetilo: 20 mg de péptido se disolvieron en 1 ml de DMSO y se agregaron de una sola vez cantidades apropiadas de reactivo de - pegilación . B . Dimetilformamida/amortiguador de borato 0.2 M, pH 8.0 en una proporción volumétrica de 1:1: se agregaron de una sola vez cantidades apropiadas de péptido y de reactivo de pegilación. C . Solución acuosa de nicotinamida altamente concentrada (200 mg/ml) : se agregaron 200 mg de nicotinamida a una solución de 40 mg de hGRF (1-29) en 1 ml de ácido acético 10 mM . Se agregó 1 ml de amortiguador de borato 0.2 M a pH 8.0 a la solución acida para alcanzar el pH deseado, antes de la adición de cantidades apropiadas de reactivo de pegilación . D. Acetonitrilo/amortiguador de borato 0.2 M pH 8.0 en una proporción volumétrica de 1:1 y cantidades apropiadas de reactivo de pegilación fueron agregadas de una sola vez. E . Amortiguador de borato 0.2 M, urea 5 M, pH 8.0 y cantidades apropiadas de reactivo de pegilación fueron agregadas de una sola vez. El reactivo PEG anhidro fue agregado bajo agitación para alcanzar las proporciones molares finales de PEG: hGRF de 1:1, 2:1 ó 3:1. Una proporción de 2:1 es la preferida. El uso de diferentes proporciones molares de PEG:hGRF permitió que la preparación de una mezcla de reacción con un conjugado predominante fuera el conjugado deseado. La solución de reacción se dejó reposar por 5 horas á temperatura ambiente antes de la purificación. Se obtienen los siguientes 4 conjugados de hGRF-PEG (A1-A4) : Al [Lys (MPEG5,ooo-CH2-CO-Nle-CO) 12-hGRF ( 1-29) -NH2] , A2 [Lys (MPEG5,ooo-CH2-CO-Nle-CO) 21-hGRF ( 1-29 ) -NH2] , A3 [Lys (MPEG5/0oo-CH2-CO-Nle-CO) 12' 21-hGRF ( 1-29 ) -NH2] y A4: Na- (MPEG5,ooo-CH2-CO-Nle-CO) [Lys (MPEG5, ooo~CH2-CO-Nle-CO) 12'21-hGRF (1-29) -NH2] • El exceso de DMSO, dimetilformamida, acetonitrilo o urea y el producto colateral de reacción (hidroxisuccinimida) fueron eliminados mediante ultrafiltración en gel utilizando una membrana de corte de 1,000 D. El volumen fue llevado a 10 ml con ácido acético 10 mM y luego se redujo hasta 1 ml . El procedimiento se repitió tres veces. Los conjugados de hGRF-PEG fueron aislados mediante cromatografía de filtración en gel o alternativamente mediante cromatografía en fase inversa .

EJEMPLO 2 Cromatografía de Filtración en Gel Mediante cromatografía de filtración en gel, los productos fueron fraccionados con base en los diferentes pesos moleculares de los componentes (en este caso, los conjugados de hGRF-PEG 1:1 PM = 8,358, hGRF-PEG 1:2 PM = 13,358, y hGRF-PEG 1:3 PM = 18,358, hGRF no conjugado PM = 3358) . La separación se realizó mediante el uso de un sistema de columna en serie de resina Superdex 75-Superose 12 (Biotech, Pharmacia) eluida con 10 ml de ácido acético a una velocidad de flujo de 1.5 ml/minuto. Las fracciones recolectadas de 1 ml fueron analizadas mediante densidad óptica a 280 nm para el contenido de proteínas y por la prueba de yodo para el contenido de PEG (Sims et al., 1980) . Después de la pegilación en DMSO utilizando una proporción molar de hGRF: PEG de 1:1, se obtuvieron tres picos: un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 132 ml (pico mayor) ; un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 108 ml (pico mayor) ; y hGRF no conjugado a un volumen de elución de 108 ml (pico menor) . Después de la pegilación en DMSO utilizando una proporción molar de hGRF: PEG de 1:2, se obtuvieron tres picos.: un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 108 ml (pico mayor); un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 132 ml (pico menor) ; y un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 73 ml (pico menor) .

Después de la pegilación en DMSO utilizando una proporción molar hGRF: PEG de 1:3, se obtuvieron dos picos : un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 73 ml (pico mayor) ; y un conjugado de hGRF-PEG a un volumen de elución de 108 ml (pico menor) . Los picos eluidos fueron recolectados, concentrados mediante ultrafiltración utilizando una membrana de corte de 1,000 D, liofilizados , disueltos en ácido acético 10 mM y caracterizados como se reporta más adelante en la presente para su identificación y cuantificación. El pico al volumen de elución de 73 ml se encontró que correspondía al compuesto A4. El pico al volumen de elución de 132 ml se encontró que correspondía al compuesto A3. El pico al volumen de elución de 108 ml se encontró que correspondía a una mezcla de los compuestos A2 y Al. El pico que eluyó a 232 ml se encontró que era hGRF no conjugado. No obstante, este método de purificación no permite separar los conjugados hGRF-PEG que tienen el mismo peso molecular pero diferente sitio de pegilación (isómeros posicionales ) .

EJEMPLO 3 Cromatrografía en Fase Inversa Se llevó a cabo un fraccionamiento más específico mediante cromatografía hidrofóbica utilizando una columna C18 de RP-HPLC. Este procedimiento puede separar isómeros eventuales que tienen el mismo peso molecular. De hecho, con este método el pico simple correspondiente a los conjugados con un PEG covalentemente enlazado obtenido mediante filtración en gel se encontró que se divide en dos picos. La cromatografía en fase inversa fue llevada a cabo utilizando una columna preparativa C18 DE RP-HPLC (Vydac) eluida con un gradiente de: H2O/0.05% de TFA (Eluyente A) y Acetonitrilo/=0.05% de TFA (Eluyente B), como sigue: 0-5 min. 35% A 5-35 min. 35% A - 2% A 35-38 min. 2% A 38-40 min. 2% A -» 35% A Velocidad de flujo: 10 ml/min.; ciclo de 1 µl; Detector de UV-Vis a 280 nm.

Después de la pegilación en DMSO utilizando una proporción molar de hGRF: PEG de 1:1, se obtuvieron 4 picos: 1 13.2 min . pico mayor; 2 13.7 min . pico mayor; 3 14.4 min. pico menor; y 4 8.9 min . pico menor. Después de la pegilación en DMSO utilizando una proporción molar de hGRF: PEG de 1:2, se obtuvieron 4 picos: 1 13.2 min . pico menor; 2 13.7 min . pico menor; 3 14.4 min. pico mayor; y 4 15.5 mi . pico menor. Después de la pegilación en DMSO utilizando una proporción molar de hGRF: PEG de 1:3, se obtuvieron 2 picos: 1 14.4 min. pico menor; y 2 15.5 min. pico mayor. Los picos eluidos se recolectaron, se evaporaron para eliminar el acetonitrilo y el TFA y luego se liofilizaron. El producto seco se disolvió en solución de ácido acético 10 mM y se analizó como se reporta en la presente posteriormente, para identificación y cuantificación de las especies aisladas . El conjugado hGRF-PEG eluyó a 13.2 min., y se encontró que era el compuesto Al (GRF-1PEG, ler. pico) . El conjugado hGRF-PEG eluyó a 13.7 min., y se encontró que era el compuesto A2 (GRF-1PEG, 2° pico) . El conjugado hGRF-PEG eluyó a 14.4 min., y se encontró que era el compuesto A3 (GRF-2PEG) . El conjugado hGRF-PEG eluyó a 15.5 min., y se encontró que era el compuesto A4 (GRF-3PEG) . El pico eluido a 8.9 min., se encontró que era hGRF no conjugado. Como un ejemplo típico, la cromatografía en fase inversa de los productos de pegilación obtenidos utilizando una proporción molar PEG-hGRF de 2:1 se reporta en la Figura 2. Los productos secos fueron obtenidos mediante evaporación de solvente/liofilización .

EJEMPLO 3a: Pegilación de hGRF en fase en solución, utilizando PEGX0,000 En este ejemplo se utilizó un PEG monometoxilado, ramificado, que tiene un peso molecular de 10,000 Daltones con lisina como espaciador (suministrado por Shearwater Polymers, Inc.) . Este PEG ramificado ha sido obtenido mediante enlace a cada grupo amino, de la lisina, de un PEG5,ooo. El grupo carboxilo de la lisina espadadora, activado como un éster de succinimidilo, se hizo reaccionar en DMSO a los grupos amino de hGRF (1-29)-NH2 utilizando una proporción molar de 0.9 moles de PEG a 1 mol de GRF. El solvente se eliminó y el residuo se dividió mediante cromatografía de exclusión en gel en una columna preparativa Superóse 12 MR. Se eluyeron dos picos, correspondientes a dos conjugados hGRF-PEG. El primer pico menor correspondió al conjugado que tiene dos unidades PEG?o,ooo enlazadas a hGRF, el segundo pico mayor correspondió al conjugado que contenía una unidad PEG?o,ooo por hGRF.

EJEMPLO 3b: Pegilación de hGRF en fase en solución, utilizando PEG20,000 En este ejemplo se utilizó un PEG monometoxilado, ramificado, que tiene un peso molecular de 20,000 Daltones con lisina como espaciador (suministrado por Shearwater Polymers, Inc . ) . Este PEG ramificado ha sido obtenido mediante enlace a cada grupo amino, de la lisina, de un PEG10, 000 • El grupo carboxilo de la lisina espaciadora, activado como un éster de succinimidilo , se hizo reaccionar en DMSO a los grupos amino de hGRF (1-29)-NH2 utilizando una proporción molar de 0.9 moles de PEG a 1 mol de GRF. El solvente , fue eliminado mediante liofilización y el residuo se fraccionó mediante cromatografía de exclusión en gel en una columna preparativa Separóse 12 MR. Se obtuvo un pico simple, correspondiente al conjugado que contenía una unidad de PEG2o,ooo por hGRF.

EJEMPLO 4 Caracterización Analítica de los conjugados de hGRF-PEG Los productos, obtenidos como se reportó previamente, fueron examinados para las cadenas de PEG enlazadas con base en los siguientes ensayos: 1. El método colorimétrico basado en sulfonato de trinitrobenceno se utilizó para la determinación de los grupos amino libres (como se describe en Habeed et al., 1966); 2. El método colorimétrico basado en el ensayo de yodo se utilizó para la determinación del contenido de PEG (como se describe en Sims et al. , 1980) ; 3. Se utilizó el número de cadena de PEG basado en la norleucina como un reportero de cadena en el análisis de aminoácidos (como se describe en Sartore et al., 1991); 4. Se utilizó la espectroscopia de masa para determinar el peso molecular de los conjugados. La espectrometría de masa MALDI se utilizó para revelar el peso molecular de los conjugados y su polidispersividad resultante de la polidispersividad del PEG inicial.

El análisis de sitio de acoplamiento a PEG de los conjugados hGRF-PEG fue evaluado mediante secuencia de aminoácidos. Cada muestra se diluyó a 100 veces. Luego 10 µl de esta solución (aproximadamente 50 pmol) se cargaron dentro del secuenciador . La pureza del producto final fue también confirmada mediante cromatografía analítica de RP-HPLC. El análisis se llevó a cabo utilizando una columna analítica C18 (Vydac) eluida con un gradiente de H2O/0.05% de TFA (Eluyente A) y acetonitrilo/ 0.05% de TFA (Eluyente B) como sigue: 0.5 min. 80% A 5-50 min. 80% A - 5% A 50-52 min. 5% A 52-54 min. 5% A - 80% A. Velocidad de flujo 1 ml/min., ciclo 20 µl, Detector de UV-Vis a 226 nm. El hGRF no conjugado eluyó a 20.7 min. El compuesto Al eluyó a 22.9 min., el compuesto A2 eluyó a 23.4 min., el compuesto A3 a 24.4 min., y el compuesto A4 a 25.5 min.

La caracterización conformacional de los péptidos "nativos" y enlazados al polímero se realizó mediante análisis de dicroísmo circular. La caracterización espectroscópica del hGRF no conjugado y de los conjugados de hGRF-PEG se llevó a cabo mediante análisis de dicroísmo circular en el intervalo de 190 a 300 nm. Las muestras (50 µg/ml) se disolvieron en ácido acético 10 mM o metanol/ácido acético 10 M en proporciones molares de 30:70 y 60:40. En todas las soluciones anteriores el hGRF no conjugado y los conjugados de hGRF-PEG presentaron un comportamiento superponible, como se muestra en la Figura 4 para el compuesto A3. En solución de ácido acético los péptidos estuvieron en conformación aleatoria, mientras que al incrementar el contenido de metanol el péptido asumió una estructura de hélice a. Los resultados demuestran que la conjugación con PEG no cambia notablemente las propiedades estructurales del péptido.

EJEMPLO 5: Evaluación de la Estabilidad de los Conjugados hGRF-PEG Se investigó la estabilidad proteolítica de hGRF y de los conjugados de hGRF-PEG utilizando enzimas proteolíticas, tales como subtilisina y qui otripsina . El estudio con subtilisina se realizó mediante incubación a 4°C de una solución peptídica 0.297 mM en Tris-HCl 0.1 M, cloruro de calcio 0.05 M, pH 8.0 con una proporción molar de péptido/proteasa de 1: 50, 000. En el caso de la quimotripsina, el péptido se disolvió en Tris-HCl 0.08 M, cloruro de calcio 0.1 M, pH 7.8 y se utilizó una proporción molar de péptido/proteasa de 1:15,000. El comportamiento de degradación fue seguido mediante RP-HPLC analítica utilizando la columna C18 eluida bajo las mismas condiciones que se reportan en el Ejemplo 4. La altura correspondiente al pico del compuesto inicial se calculó antes de la incubación con la enzima proteolítica y después de los tiempos programados de incubación. El porcentaje de altura residual en los tiempos programados se estimó y se reporta en las Figuras 3a y b.

Ej emplo 6 : Pegilación con PEG alquilante El hGRF se conjugó con PEG monometoxilado activado con diferentes grupos de acilación, así como grupos de alquilación. El PEG de alquilación presenta la ventaja de producir conjugados que mantienen la carga positiva en el residuo de lisina. El aislamiento y la caracterización se llevaron a cabo como se describe en los Ejemplos 1-4.

EJEMPLO 7: Evaluación de la Actividad de los Conjugados hGRF-PEG Materiales Compuestos de Prueba GRF!_29hGRF(l-29) -NH2 humano, lote 1299201, suministrado por Bachem; GRF3_29hGRF ( 3-29 ) -NH2, suministrado por Bachem; GRF3_29 humano, suministrado por ISL; y Conjugados hGRF-PEG preparados como se describe anteriormente .

Reacti vos Ensayo de CHO-hGRFR-LUC in vi tro El medio alfa MEM con ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco) más 600 µg/ml de sulfato de geneticina G418 (Gibco); Reactivo de lisis del cultivo celular (Promega); Reactivo de ensayo de luciferasa (Promega); y Luclite (Packard) .

Bioensayo de células de pituitaria de rata in vi tro Sales balanceadas de Earle (EBSS) (Gibco) suplementadas con 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Sigma) . Medio 199 (M199) con sales de Earle (Gibco) con 12.5% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco) y 50 µg/ml de sulfato de gentamic.ina . Equipo de ensayo de GH de rata suministrado por Amersnam. Solución enzimática para digestión de tejidos (aforada hasta 30 ml de EBSS) : 120 mg de Colagenasa (Sigma) 30 mg de Hialuronidasa (Sigma) 30 mg de ADNasa I (Sigma) 900 mg de BSA (Sigma) después de la reconstitución, la solución se esterilizó por filtración y se colocó a 37°C.

Bioensayo in vi vo Equipo de radioinmunoensayo de GH de rata suministrado por Amersham. Equipo de radioinmunoensayo de GRF (1-44) humano suministrado por Phoenix Pharmaceutical.

Animales- Ratas macho adultas Sprague-Dawley SPF, de 200 a 250 g de peso corporal, suministradas por Charles River, se utilizan después de un periodo de aclimatación de al menos 7 días.

Métodos Ensayo de CHO-hGRFR in vi tro CHO-hGRFR-LUC (clon 1-11-20) es una línea celular clonada que ha sido obtenida mediante cotransfección de los vectores pcDNA3-hGRF-R y pTF5-53 LUC en la línea celular CHO-DUKX. El plásmido pcDNA3-hGRF-R fue construido mediante la inserción del ADNc del receptor del factor de liberación de la hormona de crecimiento humana (hGRF-R) dentro del vector de expresión pcDNA3. El plásmido Bluescript que contiene el ADNc de hGRF-R fue amablemente proporcionado por el Dr . B.

Gaylinn (Universidad de Virginia) , el vector de expresión de mamífero pcDNA3 fue obtenido de Invitrogen. La secuencia de codificación de hGRF-R fue promovida por el promotor del citomegalovirus humano (CMV) . Su mapa de restricción se reporta en la Figura 12. El plásmido pTF5-53LUC fue construido mediante inserción del elemento de respuesta c-fos cAMP junto con su promotor endógeno corriente arriba (5') de la secuencia de codificación de la luciferasa en el plásmido poLuc. El elemento de respuesta cAMP y el promotor c-fos fueron obtenidos del plásmido pTF5-53 (descrito en Fish et al., 1989) . El vector del gen reportero sin promotor (poLuc) con sitios de clonación múltiples en dirección 5 ' de la secuencia de codificación de la luciferasa se obtuvieron del Dr . Brasier (Universidad de Texax, Galveston) . Su mapa de restricción se reporta en la Figura 13. Estas células CHO-DUKX obtenidas por la co-transfección anteriormente mencionada fueron rutinariamente desarrolladas en medio MEM alfa que contenía ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos y suplementado con suero fetal de ternera al 10% más 600 µg/ml de sulfato de geneticina G418.

Las células se sembraron (40,000 células/pozo) en placas blancas de 96 pozos (Dynatech) y se incubaron por 16 a 18 horas en 200 µl de medio de crecimiento antes del ensayo. Al siguiente día, el medio se eliminó y se reemplazó con un medio que contenía diferentes concentraciones de hGRF (1-29) como estándar de referencia doméstico (Bachem) o diferentes conjugados de hGRF-PEG antes de la incubación de las placas a 37°C, 5% de C02 por dos horas. Al final de la incubación, las células CHO-hGRFR-LUC fueron lavadas dos veces con 200 µl de PBS (Sigma) y luego usadas mediante la adición de 50 µl de un reactivo de lisis de cultivo celular (Promega) a cada pozo. Después de una incubación adicional de 15 minutos a temperatura ambiente, las placas se leyeron en un luminómetro (Dynatech) después de introducir 150 µl de un reactivo de ensayo de luciferasa (Promega) . Como un método alternativo, las células CHO-hGRFR-LUC, sembradas a 50,000 células/pozo, al final de la incubación con diferentes conjugados de hGRF-PEG, se lavaron con PBS, como se discutió anteriormente. A cada pozo se agregaron 100 µl de PBS que contenía iones calcio y magnesio, antes de la adición de 100 µl de Luclite (Packard) . Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas fueron leídas en el luminómetro (Lumicount -Packard) . Los resultados se expresaron como unidades de luz relativa (RLU) .

Bioensayo de célula de pituitaria de rata in vi tro para hGRF(l-29) Los animales (ratas Sprague-Dawley SPF de 200 g de peso corporal) se sacrificaron mediante inhalación de C02 y las pituitarias se retiraron. El tejido fue finalmente desmenuzado y colocado en una botella con la solución enzimática para la digestión del tejido. La botella se colocó en una incubadora a 37°C por 1 hora. El tejido digerido fue recubierto y las células se lavaron dos veces, se contaron y se aj ustaron a una concentración de 5xl 05/ml Las células fueron sembradas en placa en una placa de 48 pozos (200 µl/pozo) y la placa se colocó en una incubadora por 72 horas. Después de 72 horas, las células se incubaron con diferentes concentraciones de hGRF por 4 horas . Al final del periodo de incubación los sobrenadantes se recolectaron y se almacenaron a -80°C. El contenido de GH en cada muestra fue evaluado mediante un equipo de radioinmunoensayo de GH de rata, comercial.

Ensayo in vi vo El animal fue inyectado intravenosamente con hGRF(l-29) (400 µg/rata) . Unos pocos minutos antes de la recolección de la sangre, el animal fue anestesiado ( cetamina-xilazina) . Fueron retirados dos ml de sangre de la vena cava inferior de cada rata. La muestra se dividió en dos alícuotas: se recolectó 1 ml como tal y se obtuvo suero después de un periodo de incubación de aproximadamente 3 horas a 37°C y la centrifugación subsecuente; 1 ml remanente fue recolectado en un frasco que contenía 50 µl de una solución de heparina a 4 mg/ml, inmediatamente almacenada sobre hielo, y se obtuvo el plasma después de la centrifugación a 4°C. Se recolectaron muestras de sangre a diferentes puntos de tiempo a partir de la inyección del compuesto de prueba, utilizando diferentes animales. En cada sesión experimental se utilizó un total de tres ratas para cada periodo de tiempo. Las muestras de plasma y suero fueron inmediatamente congeladas y almacenadas a -20°C. Los niveles de suero de GH fueron medidos mediante un equipo de RÍA comercial; los niveles plasmáticos de hGRF fueron medidos mediante un equipo de RÍA comercial para hGRF(l-44) .

Resultados NOTA: A todo lo largo de esta sección y de las Figuras relacionadas "ler. pico de GRF-1PEG" corresponde a [Lys (MPEG5,ooo-CH2-CO-Nle-CO) 21-hGRF ( 1-29)-NH2], "2° pico de GRF-1PEG" corresponde a [Lys (MPEG5,ooo-CH2-CO-Nle-CO) ^-hGRF ( 1-29 ) -NH2] [GRF- 2PEG" corresponde a [Lys (MPEG5, ooo-CH2-CO-Nle-CO) 12' 21-hGRF(l-29) -NH2] y "GRF-3PEG" corresponde a Na- (MPEG5,ooo-CH2-CO-Nle-CO) [Lys (MPEG5, ooo-CH2-CO-Nle-CO) 12'21-hGRF(l-29) -NH2] .

Ensayo in vi tro de CHO-hGRFR-LUC Las actividades de dos lotes diferentes de conjugados hGRF-PEG, ambos preparados utilizando DMSO, en el ensayo de CHO-hGRFR-LUC in vi tro se mostraron en las Figuras 5 y 6. Se encontró que todas las preparaciones son activas aunque a un grado menor en comparación al hGRF (hGRF sujetado a los mismos pasos de purificación utilizados para los compuestos pegilados), con GRF-1PEG (el 1° y 2° picos) que es más activo que el GRF-2PEG y GRF-3PEG. No se observó diferencia entre hGRF y hGRF "nativo" (datos no mostrados) . Una bioactividad in vi tro similar de los conjugados hGRF-PEG provenientes de ambos lotes preparados con DMSO (Figura 5 versus Figura 6) así como los conjugados del lote preparado utilizando la solución de nicotinamida (Figura 7) fueron observados. La Figura 6 también muestra que dos diferentes preparaciones de hGRF(3-29) no poseían una actividad significativa ín vi tro en comparación a hGRF (1-29) .

Bioensayo de células de pituitaria de rata in vi tro para hGRF?-29 En ambos ensayos realizados con los conjugados de hGRF-PEG proveniente de dos preparaciones con DMSO, el ler. pico de GRF-1PEG se encontró que era el compuesto más activo, seguido por el 2° pico de GRF-1PEG, GRF-20PEG y luego GRF-3PEG (Figuras 8 y 9) . Estos hallazgos están en buena concordancia con aquellos obtenidos en el ensayo del gen reportero.

Ensayo in vi vo En experimentos preliminares los niveles de GH en suero y de hGRF en plasma fueron determinados en ratas después de la inyección intravenosa de 400 µg de hGRF. Los resultados relevantes se ilustran en la Figura 10. Como se muestra, GH y hGRF se elevaron a los 10 minutos después de la inyección de hGRF. Después de esto, las concentraciones de GH en suero declinaron rápidamente y regresaron a los niveles básales después de 60 minutos, mientras que las concentraciones de hGRF en plasma mantuvieron un nivel sostenido en el mismo intervalo de tiempo. En las Figuras HA y 11B se reportan los niveles sanguíneos de GH y GRF a diferentes puntos de tiempo hasta 48 horas, en ratas tratadas con 400 µg i.v. del Io y 2 ° picos de GRF-1PEG, GRF-2PEG y GRF-3PEG (preparaciones en DMSO) .

Todas las preparaciones pegiladas inducen un pico sérico de GH 10 minutos después de su inyección intravenosa, similarmente a hGRF?-29. Sin embargo, mientras que el 1° y 2° picos de GRF-1PEG y GRF-2PEG inducen niveles de GH comparables a aquellos obtenidos con hGRF?-29, GRF-3PEG confirma su más baja actividad como se encuentra in vi tro . En lo que a los niveles plasmáticos de GRF se refiere, se observa un patrón completamente diferente con el 1° y 2° picos de GRF-1PEG en comparación a GRF-2PEG y GREF-3PEG, independientemente de la preparación (DMSO o nicotinamida) utilizada. A las 48 horas después de la inyección del Io y 2° picos de GRF-1PEG, las concentraciones plasmáticas de GRF regresan al valor basal, mientras que se obtienen niveles más sustentados con GRF-2PEG y GRF-3PEG.

EJEMPLO 8 Síntesis en Fase Sólida de Derivados de hGRF ( 1-29) -NH2 Protegidos en el Sitio, como Compuestos Iniciales en el Proceso de Pegilación Una síntesis en fase sólida de los derivados de hGRF ( 1-29) -NH2 que contiene un grupo de protección específico (el grupo N-aliloxicarbonilo) en los grupos amino primarios de las Lisinas 12 y 21, ha sido llevada a cabo. Esto es para permitir la pegilación específica del sitio en el extremo Na. Se prepara otro derivado protegido con amino mediante el bloqueo del extremo Na a través de la acilación y la Lisina 12 con el grupo N-aliloxicarbonilo . Este derivado se utiliza para la pegilación específica del sitio en la Lisina 21.

Ma teriales y Métodos Procedimiento de Sintesis de Péptidos Todas las resinas-péptidos derivadas de hGRF fueron inicialmente ensambladas utilizando la química de Fmoc sobre un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Inc. Modelo 431A, utilizando una resina de baja sustitución (0.16 mmol/g) PAL-PEG-PS y un protocolo de acoplamiento doble y encasquetamiento para cada recibo, para optimizar la cantidad y la pureza del producto crudo. Adicionalmente se trató manualmente el péptido [N-isopropil- Tyr1, Lys (Alloc) 12] -hGRF (1-29) -NH2-resina con un procedimiento de alquilación reductiva para agregar un grupo isopropilo N-terminal.

Todas las resinas peptídicas fueron escindidas con una mezcla de TFA/1,2-etanoditiol/tioanisol/agua [10:0.5:0.5:0.5 (v/v)] por 2 horas, y los péptidos crudos se aislaron mediante precipitación en MTBE y centrifugación. Los péptidos crudos liofilizados fueron purificados mediante HPLC en gradiente de fase inversa utilizando una columna Preparativa Vydac C18 con un sistema de 0.1% de TFA/agua/acetonitrilo . Todos los péptidos purificados fueron caracterizados por HPLC Analítica de Fase Inversa y Espectrometría de Masa MALDI-TOF.

Materiales Fmoc-L-aminoácidos (Bachem Bioscience, Perseptive Biosystems, NovaBiochem) , DMF, tambor de 20 litros (J.T. Baker), Piperidina (Applied Biosystems, Chem-Impex) , HBTU (Rainin, Richelieu Biotechnologies) , NMM (Aldrich), Acetic Anhydride (Applied Biosystems), Resinas (Perseptive Biosystems, NovaBiochem) , ácido a-ciano-4-hidroxi-cinnámico (Sigma), ácido sinapínico (Aldrich), acetonitrilo (J.T. Baker), TFA (Sigma, Pierce), agua desionizada (Millipore Milli-Q Water System) . Los otros solventes y reactivos se listan como sigue: REACTIVOS/SOLVENTES VENDEDORES NMP Applied Biosystems Inc., J. T. Baker HBTU Applied Biosystems Inc., Richelieu Biotechnologies Inc. HOBt 0.5 M en DMF Applied Biosystems Inc. DIEA 2.0 M en NMP. Applied Biosystems Inc. Piperidina Applied Biosystems Inc. Diclorometano Applied Biosystems Inc. Anhídrido Acético Applied Biosystems Inc.

Aminoácidos: la mayoría de los Fmoc-aminoácidos utilizados sobre el sintetizador ABI 431A fueron adquiridos de Applied Biosystems como cartuchos pre-pesados de 1.0 mmol. FMOC-Lys (Alloc) -OH se adquirió de Perseptive Biosystems (Framingham, MA) a granel, y los cartuchos se rellenaron domésticamente. Todos los aminoácidos utilizados fueron de la configuración L. Resinas: las resinas primarias utilizadas para los análogos de hGRF fueron PAL-PEG-PS (Enlazador de Amida de Péptido-Polietilenglicol-Polies tireno ) . Los soportes de PAL-PEG-PS, adquiridos de PerSeptive Biosystems, muestran consistentemente resultados superiores en pureza y rendimiento del producto crudo. Se utilizó una resina de baja sustitución de 0.16 mmol/g para todos los derivados. Las resinas de baja sustitución son comúnmente utilizadas para secuencias difíciles, largas, para asegurar el mejor acoplamiento mediante la disminución del impedimento esférico y la formación de la lámina ß en las cadenas peptídicas en desarrollo .

Métodos Ensamble de la Cadena- Sintetizador Peptídico App1 ied Biosystems Inc. Modelo 431A Las cadenas peptídicas protegidas son inicialmente ensambladas utilizando la estrategia FMOC sobre un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystem Inc. Modelo 431A, el cual utiliza ciclos programados rápidos de FMOC (FastMocMR) . Se utiliza HBTU para la activación y el acoplamiento, 20% de Piperidina para la desprotección, y NMP es el solvente principal utilizado durante la desprotección, la disolución de aminoácidos y el lavado de la resina. Los aminoácidos se introducen en cartuchos pre-pesados de 1.0 mmol. Los ciclos de FastMocMR de 0.25 mmol utilizan cartuchos de 1.0 mmol y un recipiente de reacción de 40 ml .

Ensamble de la Cadena-Procedimiento Los pasos para los ciclos programados a escala de 0.25 mmol se pueden resumir como sigue: 1. Desprotección de Piperidina - La resina es primeramente lavada con NMP, luego se distribuye una solución de 18% de piperidina/NMP y se desprotege por 3 minutos. El recipiente de reacción se drena y se suministra una solución de 20% de piperidina y la desprotección se continúa por aproximadamente 8 minutos. 2. Disolución de Aminoácido - NMP (2.1 g) y 0.9 mmol de HBTU 0.45 M/HOBt en DMF (2.0 g) se agregan al cartucho y se mezclan por 6 minutos. 3. Lavados NMP - El recipiente de reacción se drena y la resina se lava 5 veces con NMP. 4. Activación de aminoácidos y transferencia al recipiente de reacción (RV) - 1 ml de DIEA 2 M en NMP se agrega al cartucho para comenzar la activación del aminoácido disuelto, luego se transfiere desde el cartucho al RV.

. Acoplamiento y lavado final - La reacción de acoplamiento entre el aminoácido activado y la resina-péptido desprotegida N-terminalmente, procede por aproximadamente 20 minutos y luego el RV es drenado y la resina se lava con NMP. 6. Encasquetamiento (si se desea) - Aproximadamente 12 ml de un Anhídrido Acético 0.5 M, DIEA 0.125 M y HOBt 0.015 M en solución de NMP, se agrega al recipiente de reacción y se agita en torbellino por 5 minutos. Esto debe acetilar cualesquiera sitios no acoplados sobre la resina, dando como resultado secuencias truncadas más que suprimidas, lo cual simplifica los pasos de purificación posteriores.

El protocolo completo para estos ciclos puede ser encontrado en el Boletín del Usuario No. 35 de Applied Biosystems (FastMocMR 0.25 y 0.10 en el Modelo 431A) .

Pasos de Protocolo Estándar para una Síntesis Típica: Paso 1. Lavar resina 3 veces con DMF Paso 2. Desproteger 2 veces por 5 minutos con 20% de piperidina/DMF Paso 3. Lavar resina 6 veces con DMF Paso 4. Acoplar por 45 minutos con Aminoácido activado con HBTU/NMM en DMF Paso 5. Lavar resina 3 veces con DMF Para secuencias difíciles, un paso de encasquetamiento extra puede ser insertado después del acoplamiento, el cual utiliza 70% de Anhídrido Acético en DMF por 20 minutos para acetilar cualesquiera sitios no acoplados sobre el péptido-resina, dando como resultado secuencias truncadas en vez de secuencias de supresión en el producto crudo final .

Escisión/Extracción El coctel de escisión utilizado para eliminar los grupos protectores de cadena lateral y liberar el péptido de la resina es una mezcla estándar utilizada para péptidos que contienen Arginina y/o Metionina. Para 0.1-1.5 g de péptido-resina, 10 ml de Ácido Trifluoroacético, 0.5 ml de Agua D.I., 0.5 ml de Tioanisol, 0.5 ml de Etanoditiol (87% de Ácido Trifluoroacético, 4.3% de Agua D.I., 4.3% de Tioanisol, 4.3% de Etanoditiol) .

Procedimi ento de Esci si ón 100 mg - 1 g de péptido-resina se colocan en un recipiente de vidrio de 20 ml y se enfría en un baño de hielo. El coctel de escisión se prepara y también se enfría en un baño de hielo, luego se agrega al péptido-resina para un volumen final de aproximadamente 10 ml . El recipiente es retirado del baño de hielo y se deja calentar hasta la temperatura ambiente. El recipiente se encasqueta y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente por 2 horas. Después de 2 horas, la solución se filtra a vacío a través de un filtro de porosidad media a gruesa en aproximadamente 30 ml de MTBE frío. El recipiente de reacción se lava con 1 ml de TFA y se filtra a través del mismo embudo de filtro en el MTBE frío. La suspensión completa se transfiere luego a un tubo para centrífuga de 50 ml y se centrifuga por aproximadamente 10 minutos a 2,000 rpm a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspira, el precipitado se resuspende en 40 ml de MTBE frío y se centrifuga nuevamente. Este paso se repite una vez más. El sobrenadante final es aspirado y el precipitado se purga con nitrógeno para evaporar la mayor parte del éter remanente . El péptido es luego disuelto en 20-30 ml de Ácido Acético acuoso al 1%-10%, diluido a aproximadamente 100-150 ml con agua desionizada, se congela y se liofiliza.

Purificación Métodos de RP-HPLC Sistema - Waters Delta Prep 4000 Columna - C18 de fase inversa Vydac, 10 µm, 2.2 x 25 cm (Cat. No. 218TP1022) Amortiguadores - A: Agua/0.1% de TFA B: Acetonitrilo/0.1% de TFA Velocidad de Flujo - 15 ml/minuto Detección - Detector Waters 484 UV, 220 nm Gradiente - Variable, usualmente 0.2% de B/minuto hasta 1.0% de B/minuto. Los péptidos crudos liofilizados se preparan mediante disolución 50-100 mg del péptido en 200 ml de TFA acuoso al 0.1%. La solución peptídica se carga luego directamente sobre la columna preparativa a través de la línea de depósito del amortiguador "A" y se inicia el programa en gradiente. ßl Las fracciones recolectadas son corridas toda la noche en un sistema analítico automuestreador de HPLC. Las fracciones en traslape que se juzgan son >92% puras mediante integración de picos, son combinadas, diluidas 4:1 con Agua D.I., congeladas, y luego liofilizadas en un Liofilizaodr Virtis 25 SL.

Caracterización HPLC de Fa se Inversa Condiciones : Sistema - Bombas Waters 510, Tomador automático de muestras 111 , Detector de UV de longitud de onda múltiple 490 Columna - Vydac C18, 5 µm, 0.46 x 25 cm (Cat. No. 218TP54) Amortiguadores - A : H2O/ 0 . 1 % de TFA B : ACN/ 0 . 1 % de T FA Velocidad de Flujo - 1 ml/minuto Detección - UV: 214 nm, 280 nm Gradiente - 2% de B/minuto Muestras de péptidos liofilizados, purificados se preparan mediante disolución de 0.2 - 1.0 mg de péptido en TFA al 0.1% acuoso a una concentración de 0.5 - 1.0 mg/ml.

Se inyectan 15 a 18 µl sobre la columna y se eluyen con un programa en gradiente de 0 - 50% de ACN en 25 minutos. Los datos del cromatograma se recolectan y se almacenan con el sistema de dotación lógica informática (software) Waters Expert-Ease.

Espectrometría de Masa Tipo: MALDI-TOF (desorción con láser ayudada por matriz/tiempo de trayectoria de ionización) Sistema: Perseptive Biosystems Voyager Élite Matrices: ácido a-ciano-4-hidroxicinnámico, 10 mg/ml en 67% de ACN/ 0.1% de TFA o Acido Sinapínico, 10 mg/ml en 50% de ACN/0.1% de TFA Se preparan muestras de péptidos a 1 - 20 µmol de concentración en 50% de ACN/0.1% de TFA, 0.5 µl de solución de matriz, seguido por 0.5 µl de muestra de péptido, se aplican a los pozos de la placa de análisis, y se dejan secar. La placa de análisis es cargada dentro de la máquina y las muestras se exploran y analizan utilizando un método de Reflector-Extracción Retardada optimizado para péptidos. Para cada muestra, se recolecta una señal de dato acumulativo de 32 a 128 disparos láser y se analiza. Cada corrida incluye un pozo de muestra con un péptido estándar para la calibración.

Síntesis Especifica Preparación de [Lys (Alloc) 12'21 ] -hGRF ( 1-29 ) -NH2 El [Lys (Alloc)12'21] -hGRF (1-29) -PAL-PEG-PS-resina se ensambló inicialmente mediante la química de Fmoc sobre el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (ver Métodos de Síntesis anteriores), incluyendo la desprotección del grupo Fmoc de residuo N-terminal . El péptido-resina fue escindido por una mezcla de TFA: 1, 2-etanoditiol : tioanisol : agua [10:0.5:0.5:0.5 (v/v)] por 2 horas, y el péptido se aisla mediante precipitación en MTBE para dar 240 mg del péptido crudo. La purificación mediante HPLC de fase inversa, preparativa con una columna Vydac C18 (22 x 250 mm) dio como resultado 60 mg del producto purificado (>95% mediante HPLC analítica) espectroscopia de masa MALDI-TOF: Calculado: 3523.8, Observado: 3524.2.

Preparación de [Na-isopropil-Tyr1, Lys (Alloc) 12] -hGRF(l-29) -NH2 Ensamble de [Lys (All oc) 12 ] -hGRF (1 -29) -PAL-PEG-PS-resina ini ci al El conjugado [Lys (Alloc) 12-hGRF ( 1-29) -PAL-PEG-PS-resina se ensambló inicialmente mediante química de Fmoc sobre el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (ver Métodos de Síntesis anterior) , incluyendo la desprotección del grupo Fmoc del residuo N-terminal. ^-i sopropil a ci ón median te al quil aci ón reducti va El grupo Na-isopropilo se agregó mediante alquilación reductiva del péptido-resina utilizando cianoborohidruro de sodio y la cetona correspondiente (acetona) como se describe por Hocart, et al., 1987. 880 mg de péptido-resina (aproximadamente 70 µmoles) se hincharon en 5 ml de DCM por 30 minutos, luego 10 mmol (174 µl) de acetona en 7 ml de metanol/1% de HOAc se agregaron y la mezcla se agitó intermitentemente por 2 horas a temperatura ambiente. Se agregaron luego 2 mmoles (129 mg) de cianoborohidruro de sodio en 12 ml de metanol/1% de HOAc, la mezcla se agito intermitentemente por 2 horas, luego se dejo agitar toda la noche (15 horas) . El monitoreo cualitativo con ninhidrina indicó una reacción completa (sin color azul) . El péptido-resina fue escindido con una mezcla de TFA: 1,2-etanoditiol : tioanisol : agua [10:0.5:0.5:0.5 (v/v)] por 2 horas, y el péptido se aisló mediante precipitación MTBE para dar aproximadamente 200 mg del péptido crudo. La purificación mediante HPLC en gradiente de fase inversa preparativa con agua/acetonitrilo/ 0.1 % de TFA como solventes sobre una columna Vydac C18 (22 x 250 mm) dio como resultado 50 mg del producto crudo (>95% mediante HPLC analítica) . Espectroscopia de masa MALDI-TOF: Calculado: 3481.9, Observado: 3481.8.

EJEMPLO 9: Pegilación de hGRF(l-29) Protegido Los derivados de hGRF preparados como se describe en el Ejemplo 8 fueron conjugados con PEG activado como se describe en los Ejemplos 1 y 6. La purificación en este caso involucró únicamente una separación de los reactivos en exceso y los productos colaterales, mientras que no existió necesidad para llevar a cabo el procedimiento descrito en los Ejemplos 2 y 3.

Referencias Abuchowsi A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3571-3581, 1997a; Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3582-3586, 1977b; Benchamp C.O. et al., Anal. Biochem. , 131, 25-33, 1983; Caliceti et al., J. Bioactive Compatible Polymer, 8, 41-50, 1993; Campbell R. et al., J. Peptide Res., 49, 527-537, 1997; Chan W. C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., P. 2209, 1995; Clark R. et al., J. Biol. Chem., 36, 21969-21977, 1996; Delgado C. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128, 1990; F. Dick et al., Peptides 1996, Proceedings of the 24th European Peptide Symposium, Edinburgh, Scotland, 1997; Félix A.M. et al., Jnt. J. Peptide Protein Res., 46, 253-264, 1995; Fish et al., Genes and Development, 3, 1989, 198-211; Greene T.W. et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc. Pub., pp . 331- 3333, 1991; Habeed A.S.F.A. et al., Anal. Biochem. , 14, 328-336, 1966. Harris J.M., Rev. Macromol . Chem. Phys., C25, pp . 325-76, 1985; Hocart et al., J. Med. Chem., 30(4), 739-743, 1987; Lu et al., Jnt. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 127-138; Monfardini et al., Biocon. Chem., 6, 62-69, 1995; Morpurgo et al., Biocon. Chem., 1, 363-368, 1996; Murphy, W.A. et al., Peptide Research, 1(1), 36, 1988; Pande C.S., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 11, 895-899, 1980; Sartore L. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45, 1991; Sartore L., et al., Applied Biochem. Biotechnol., 31, 213-22, 1991; Sims G.E.C. et al., Anal. Biochem. , 107, 60-63, 1980; Ta , J.P. et al., Strong acid deprotection of synthetic peptides. Jn The Peptides, 9. S.

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LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. (B) CALLE: 14 JOHN B. GORSIRAWEG (C) CIUDAD: CURAZAO (E) PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS (F) CÓDIGO POSTAL: NINGUNO (G) TELEFONO: 639300 (H) FAX: 614129 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PREPARACIÓN ESPECIFICA DEL SITIO EN FASE DE SOLUCIÓN DE CONJUGADOS DE GRF-POLIETILENGLICOL ( Í Ü : NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTARE: Patentin Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 1-: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. : 1: Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp lie Met Ser Arg 20 25

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la preparación específica del sitio de conjugados hGRF-PEG que contienen una o más unidades PEG (por hGRF) covalentemente enlazadas a Lys12 y/o Lys21 y/o Na, caracterizado porque la reacción de conjugación entre el péptido hGRF y el PEG activado se lleva a cabo en solución y el conjugado hGRF-PEG deseado es aislado de la mezcla de reacción y purificado. «

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la solución es una solución concentrada de nicotinamida acuosa o una solución acuosa amortiguada de un agente de desplegamiento .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el solvente es un solvente orgánico polar seleccionado entre: sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida/amortiguador o acetonitrilo/amortiguador .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el conjugado hGRF-PEG es aislado de la mezcla de reacción y purificado mediante métodos cromatográficos .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el péptido hGRF es h-GRF ( 1-29 ) -NH2.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde antes de que ocurra la reacción de pegilación, el péptido hGRF es protegido en una o más de las posiciones: Na, Lys12 y Lys21.

7. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 6, que comprende además una reacción de desprotección después de la pegilación.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el PEG activado es un PEG de alquilación o acilación en su forma mono-metoxilada .

9. Un conjugado hGRF-PEG que contiene una o más unidades PEG (por hGRF) covalentemente enlazadas a Lys12 y/o Lys21 y/o Na.

10. Un conjugado hGRF-PEG de conformidad con la reivindicación 9, en el cual 1 unidad PEG está covalentemente enlazada a Lys 12

11. Un conjugado hGRF-PEG de conformidad con la reivindicación 9, en el cual 1 unidad PEG está covalentemente enlazada a Lys 2'1

12. Un conjugado hGRF-PEG de conformidad con la reivindicación 9, en el cual 1 unidad PEG está covalentemente enlazada a cada uno de Lys12 y Lys21.

13. Un conjugado hGRF-PEG de conformidad con la reivindicación 9, en el cual 1 unidad PEG está covalentemente enlazada a cada uno de Lys12, Lys21 y Na.

14. [Lys (Alloc) 12'21] -hGRF, como intermediario en la reacción de pegilación de la reivindicación 1.

15. [N -isopropil-Tyr1,Lys (Alloc) 12] -hGRF, como intermediario en la reacción de pegilación de la reivindicación 1.

16. El uso de los conjugados hGRF-PEG de conformidad con las reivindicaciones 9 a 13, como un medicamento.

17. El uso de los conjugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o diagnóstico de desórdenes relacionados a la hormona de crecimiento.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD) .

19. Una composición farmacéutica que comprende los conjugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.