MXPA00005110A - Enzimas de bacillus licheniformis que degradan pectina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a enzimasque degradan pectina derivadas de o endógenas a Bacillus licheniformis u otras especies de Bacíllus que son al menos 99%homologas a Bacillus licheniformis, basándose en las secuencias alineadas de 16s rADN, tienen actividadóptima a pH más alto de 8. Las enzimas que degradan pectina pertenecen a las clases de enzima pectato ligasas (EC 4.2.2.2), pectina ligasas (EC 4.2.2.10) y poligalacturonasas (EC 3.2.1.15) y sonútiles en procesos industriales bajo condiciones alcalinas tal como en el procesamiento détextiles y como un ingrediente activo, e.g. en detergentes para lavado de ropa y productos para limpieza de superficies duras.

Description

ENZIMAS DE Baclllus lichen±formis QUE DEGRADAN PECTINA Campo de la invención: La presente invención se refiere a una preparación de enzima que degrada pectina; preferentemente a enzimas que degradan pectina microbiana, mas especificamente a enzimas microbianas que presentan actividad que degrada pectina como su principal actividad enzimática en los intervalos neutro y alcalino de pH, especialmente a enzimas clonadas que degradan pectina derivadas de Ba ci l l us l i cheni formi s ; a un método para producir tales enzimas en las industrias textil, de detergente y de procesamiento de fibra de celulosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los polimeros de pectina son constituyentes importantes de la pared celular de vegetales. La pectina es un hetero-polisacárido con una estructura compuesta de homogalacturonana alternante (regiones planas) y ramnogalacturonana (regiones fibrosas). Las regiones planas son polimeros lineales de ácido alfa-D-galacturónico de enlace 1,4. Los residuos de ácido galacturónico pueden ser met il-esterificados en el grupo carboxi a un grado variable, usualmente de una REF.: 120236 forma no aleatoria con bloques de ácido poligalacturónico que es completamente etil-esterificado .

Las pectinasas pueden clasificarse de acuerdo a su sustrato preferido, pectina altamente metil-esterificada o pectina poco metil-esterificada y ácido poligalacturónico (pectato), y su mecanismo de reacción, eliminación beta o hidrólisis. Las pectinasas pueden ser principalmente de acción endo, cortan el polimero en sitios aleatorios dentro de la cadena para dar una mezcla de oligómeros, o podrían ser de acción exo, atacan desde un extremo del polimero y producen monómeros o dimeros. Varias actividades pectinasa que actúan en las regiones planas de la pectina se incluyen en la clasificación de enzimas, provistas de la Nomenclatura de Enzimas (1992) tal como pectato ligasa (EC 4.2.2.2), pectina ligasa (EC 4.2.2.10), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonasa (EC 4.2.2.9) y exo-poli-alfa-galacturonosidasa (EC 3.2.1.82) .

Las pectato ligasas se han clonado de diferentes géneros bacterianos tal como Erwi ni a , Pseudomona s , Kl ebsi ella y Xa n th omona s . También se ha descrito la clonación de una pectato ligasa de Bacillus subtilis (Nasser et al. (1993) FEBS 335:319-326) y Bacillus sp. YA- 14 (Kim et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:947-949). Se ha reportado la purificación de las pectato ligasas con actividad máxima en el intervalo de pH de 8-10 por Bacillus pumilis (Dave and Vaughn (1971) J. Bacteriol. 108:166-174), B. polymyxa (Nagel and Vaughn (1961) Arch. Biochem. Biophys. 93:344-352), B. stearothermophilus (Karbassi and Vaughn (1980) Can. J. Microbiol. 26:377-384), Bacillus sp (Hasegawa and Nagel (1966) J. Food Sci. 31:838-845) y Bacillus sp . RK9 (Kelly and Fogarty (1978) Can. J. Microbiol. 24: 1164-1172), sin embargo, no se encontró publicación de clonación de pectato ligasa que codifica genes de estos organismos. Todas las pectato ligasas descritas requieren cationes divalentes para actividad máxima, los iones de calcio son los más estimuladores.

WO 98/45393 describe composiciones de detergente que contienen protopectinasa con poder limpiador contra manchas de lodo.

En general, los organismos que producen pectinasas presentan un rango amplio de enzimas que degradan o modifican la pectina. A menudo los microorganismos también producen celulasas y/o hemicelulasas, y las preparaciones de complejo enzimático mult i-componente de tales microorganismos podrían dificultar optimizar varias aplicaciones, aún podrían contener enzimas con efecto desventajoso. Asi, es un objetivo de la presente invención proporcionar una enzima que degrada pectina que presenta solo los efectos deseados e.g. en detergentes o diferentes procesos industriales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Los inventores han encontrado varias enzimas que degradan pectina, especialmente enzimas que degradan pectina alcalina, las cuáles son endógenas a una cepa bacteriana del género Ba ci ll us, más específicamente a la cepa Ba ci l l us l i ch eni formi s, y se ha tenido éxito en identificar las secuencias de ADN que codifican tales enzimas .

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una preparación de enzima que consiste esencialmente de una enzima que degrada pectina derivada de o endógena a una cepa de Ba ci l l us li cheni formi s o especies de Ba ci l l us altamente relacionadas, la enzima es preferentemente una pectato ligasa (EC 4.2.2.2), una pectina ligasa (EC 4.2.2.10) o una poligalacturonasa (EC 3.2.1.15).

Las secuencias de ADN de dos pectato ligasas de la invención se listan en el listado de secuencias como SEC ID No. 3 y 7, respectivamente, y las secuencias de aminoácido deducidas se listan en el listado de secuencias como SEC ID No. 4 y 8, respectivamente. Se cree que estas nuevas enzimas se clasificarán de acuerdo a la Nomenclatura de enzimas en la Clase de la Enzima EC 4.2.2.2. Sin embargo, deberla observarse que la enzima de la invención también presenta actividad catalítica en pectina (que podria ser esterificada) además la actividad de pectato y poligalacturónidos se atribuye convencionalmente a enzimas que pertenecen a EC 4.2.2.2.

La secuencia de ADN de una pectina ligasa de la invención se lista en el listado de secuencias como SEC ID No. 1 y la secuencia de aminoácido deducida se lista en el listado de secuencias como SEC ID No. 2. Se cree que esta nueva enzima se clasificará de acuerdo a la Nomenclatura de Enzimas en la Clase de la Enzima EC 4.2.2.10.

La secuencia de ADN de una poligalacturonasa de la invención se lista en el listado de secuencias como SEC ID No. 5 y la secuencia de aminoácido deducida se lista en el listado de secuencias como SEC ID No. 6. Se cree que esta nueva enzima se clasificará de acuerdo a la Nomenclatura de Enzimas en la Clase de la Enzima EC 3.2.1.15.

Por lo tanto, en un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una pectato ligasa que es i) un polipéptido producido por Ba ci l l us l i cheni formi s , ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 28-341 de la SEC ID No. 8, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 45% homólogo con el polipéptido, o iv) se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que las argininas en la posición 233 y 238 se conserven y el polipéptido derivado sea al menos 42% homólogo con el polipéptido, o v) es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada .

Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de polinucleótido aislada, seleccionada del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID No: 7, del nucleótido 82 al nucleótido 1026; (b) especies homologas de (a); (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato 1-Lgasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 8 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 341; (d) moléculas complementarias a (a), (b) o (c); y (e) secuencias de nucleótido degenerado de (a), (b), (c) o (d).

El plásmido pSJl678, que comprende la molécula de polinucleótido (la secuencia de ADN) que codifica la pectato ligasa de la presente invención, como se representa por la secuencia de aminoácido SEC ID No: 8, se ha transformado en una cepa de Esch eri chi a col i que se depositó por los inventores de acuerdo al Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania, el 25 de Septiembre de 1997 bajo el número de depósito DSM En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una pectato ligasa que es i) un polipéptido producido por Ba ci l l us l i cheniformi s , ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 28-221 de la SEC ID No: 4, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 60% homólogo con el polipéptido, o iv) se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que las Usinas en la posición 158 se conserven y el polipéptido derivado sea al menos 66% homólogo con las posiciones 60-158 de la SEC ID No: 4, o v) es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada.

Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de polinucleótido aislada, seleccionada del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID No: 3, del nucleótido 82 al nucleótido 666; (b) especies homologas de (a); (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 4 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 221; (d) moléculas complementarias a (a), (b) o (c); y (e) secuencias de nucleótido degenerado de (a) , (b) , (c) o (d) .

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una pectina ligasa que es i) un polipéptido producido por Ba cill us l i cheni formi s , ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 31-494 de la SEC ID No: 2, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 60% homólogo con el polipéptido, o iv) se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que las argininas en la posición 377 y 383 respecto a la SEC ID NO: 2 se conserven y el polipéptido derivado sea al menos 60% homólogo con el polipéptido, o v) es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada.

Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de polinucleótido aislada, seleccionada del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectina ligasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID No: 1, del nucleótido 91 al nucleótido 1485; (b) especies homologas de (a); (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectina ligasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 2 del residuo aminoácido 31 al residuo aminoácido 494; (d) moléculas complementarias a (a), (b) o (c); y (e) secuencias de nucleótido degenerado de (a), (b), (c) o (d).

El plásmido pSJ1678, que comprende la molécula de polinucleótido (la secuencia de ADN) que codifica la pectina ligasa de la presente invención, como se representa por la secuencia de aminoácido SEC ID No: 2, se ha transformado en una cepa de Esch eri chi a col i que se depositó por los inventores de acuerdo al Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania, el 23 de Febrero de 1998 bajo el número de depósito DSM 12031.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una poligalacturonasa que es i) un polipéptido producido por Ba ci l l us l i cheni formi s , ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 1-415 de la SEC ID No: 6, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 70% homólogo con el polipéptido, se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, o es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada.

Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de polinucleótido aislada, seleccionada del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad poligalacturonasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID No: 5, del nucleótido 1 al nucleótido 1248; (b) especies homologas de (a); (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad poligalacturonasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 6 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 415; (d) moléculas complementarias a (a), (b) o (c); y (e) secuencias de nucleótido degenerado de (a), (b), (c) o (d) .

El plásmido pSJ1678, que comprende la molécula de polinucleótido (la secuencia de ADN) que codifica la poligalacturonasa de la presente invención, como se representa por la secuencia de aminoácido SEC ID No: 6, se ha transformado en una cepa de Esch eri chia coli que se depositó por los inventores de acuerdo al Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania, el 23 de Febrero de 1998 bajo el número de depósito DSM 12030.

Dentro de otros aspectos de la invención se proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos enlazados operablemente: un promotor de transcripción; un segmento de ADN seleccionado del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO: 7 del nucleótido 82 al nucleótido 1026, o como se muestra en la SEC ID NO: 3 del nucleótido 82 al nucleótido 666; o que codifica un polipéptido que tiene actividad pectina ligasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO: 1 del nucleótido 91 al nucleótido 1485; o que codifica un polipéptido que tiene actividad poligalacturonasa y que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO: 5 del nucleótido 1 al nucleótido 1248; (b) especies homologas de (a); (c) moléculas de polinucleót'ido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia aminoácido de la SEC ID NO: 8 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 341 o .a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 221; o codifica un polinucleótido que tiene actividad pectina ligasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia aminoácido de la SEC ID NO: 2 del residuo aminoácido 31 al residuo aminoácido 494; codifica un polinucleótido que tiene actividad poligalacturonasa que es al menos 70% idéntico a la secuencia aminoácido de la SEC ID NO: 6 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 415; (d) secuencias de nucleótido degenerado de (a), (b), o (c); y -un terminador de transcripción Aún dentro de otro aspecto de la presente invención, se proporciona un cultivo celular en el que se ha introducido un vector de expresión como se describió antes, en donde la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

Un aspecto más de la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad pectato ligasa, seleccionado del grupo que consiste de (a) moléculas de polipéptido que comprenden una secuencia de residuos aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 8 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 341; (b) moléculas de polipéptido que comprenden una secuencia de residuos aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 4 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 221; y (c) especies homologas de (a) o (b) .

Otro aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad pectina ligasa, seleccionado del grupo que consiste de (a) moléculas de polipéptido que comprenden una secuencia de residuos aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del residuo aminoácido 31 al residuo aminoácido 494; y (b) especies homologas de (a).

Otro aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad poligalacturonasa,- seleccionado del grupo que consiste de (a) moléculas de polipéptido que comprenden una secuencia de residuos aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 6 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 415; y (b) especies homologas de (a) .

Dentro de otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición que comprende polipéptidos purificados de acuerdo a la invención, en combinación con otros polipéptidos.

Dentro de otro aspecto de la presente invención se proporcionan métodos para producir un polipéptido de acuerdo a la invención, que comprende cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión como se describió antes, por medio del cual la célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN y recuperar el polipéptido.

La nueva enzima de la presente invención es útil para el tratamiento de material celulósico, especialmente fibra que contiene celulosa, hilados, tela tejida o no tejida, tratamiento de pulpas para hacer papel mecánico o papel de residuo reciclado, y para eliminar fibras. El tratamiento puede llevarse a cabo durante el procesamiento del material celulósico en un material listo para la manufactura de prendas de vestir o para la manufactura de tela, e.g. en la etapa de desencolado o lavado; o durante el lavado y planchado industrial o doméstico de tal tela o prenda de vestir.

Por lo tanto, aspectos adicionales de la presente invención se refieren a una composición de detergente que comprende una enzima que tiene actividad sustancial que degrada pectina; y para usar la enzima de la invención para el tratamiento de fibras que contienen celulosa, telas tejidas o no tejidas.

Las enzimas de la invención son muy efectivas para usar en un proceso de lavado enzimático, en la preparación de material celulósico, e.g. para respuesta propia en operaciones subsecuentes de teñido. Además, se contempla que las composiciones de detergente que contienen las nuevas enzimas son capaces de retirar o blanquear cierta suciedad o manchas presentes en la ropa de lavado, especialmente suciedad y manchas que resultan de galactana o arabigogalactana que contiene comida, plantas y similares. También se contempla que el tratamiento con composiciones de detergente que comprende la nueva enzima puede evitar la adherencia de cierta suciedad al material celulósico. Las enzimas de la invención también son útiles como ingredientes en composiciones de limpieza para superficie dura, que tienen el efecto de remover o asistir en la remoción de cierta suciedad o manchas de superficies duras que necesitan limpieza.

DEFINICIONES Antes de discutir esta invención con más detalle, se definirán primero los siguientes términos.

El término "ortólogo" (o "especie homologa") designa un polipéptido o proteina obtenida de una especie, que tiene homología a un polipéptido análogo o proteina de una especie diferente.

El término "parálogo" designa un polipéptido o proteina obtenida de una especie dada, que tiene homología a un polipéptido o proteina distintos de la misma especie.

El término "vector de expresión" denota una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés enlazado operablemente a los segmentos adicionales para proporcionar su transcripción. Tales segmentos adicionales podrían incluir secuencias promotora y terminadora, y podrían incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un aumentador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión se derivan genéticamente del ADN del plásmido o viral, o podrían contener elementos de ambos. El vector de expresión de la invención podria ser cualquier vector de expresión que se somete convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir el vector. Asi, el vector podria ser un vector que se replica autónomamente, i.e. un vector que existe como una entidad extra-cromosomal , la replicación de éste es dependiente de la replicación cromosomal, e.g. un plásmido. Alternativamente, el vector podria ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el cromosoma al que se ha integrado.

El término "expresado recombinante" o "expresado recombinantemente" , usado aqui en conexión con la expresión de un polipéptido o proteina, se define de acuerdo a la definición estándar en el arte. La expresión de forma recombinante de una proteina se realiza en general usando un vector de expresión, como se describió inmediatamente antes.

El término "aislado", cuando se aplica a una molécula de polinucleótido, denota que el polinucleótido se ha removido de su medio genético natural y de esta forma está libre de otras secuencias codificantes extrañas o indeseables, y está en una forma adecuada para usar dentro de los sistemas de producción de la proteina diseñada genéticamente. Tales moléculas aisladas son las que se separan de su medio natural, e incluyen cADN y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los .que se asocian ordinariamente, pero podrían incluir regiones no traducidas 3' y 5' que se presentan de forma natural, tal como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para un experto en el arte (ver por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). El término "un polinucleótido aislado" podria definirse alternativamente "un polinucleótido clonado" .

Cuando se aplica a un proteina/polipéptido, el término "aislado" indica que la proteina se encuentra en una condición diferente de su medio nativo. En una forma preferida, la proteina aislada está sus t anc I a lmen t e libre de otras proteinas, particularmente otras proteinas homologas (i.e. "Impurezas homologas" (ver abajo)). Se prefiere proporcionar la proteina en una forma más pura de 40%, más preferentemente en forma más pura de 60% .

Se prefiere aún más preferentemente proporcionar la proteina de una forma altamente purificada, i.e., más pura de 80%, más preferentemente más pura de 95%, y aún más preferentemente más pura de 99%, como se determinó por medio de SDS-PAGE.

El término "proteina/polipéptido aislado podria definirse alternativamente como "proteina/polipéptido purificado" .

El término "impurezas homologas" significa cualquier impureza (e.g. otro polipéptido diferente del polipéptido de la invención) que se origina de la célula homologa, donde el polipéptido de la invención se obtiene originalmente.

El término "obtenido de" como se usa aqui, en conexión con una fuente microbiana especifica, significa que el polinucleótido y/o polipéptido se producen por la fuente especifica, o por una célula en la que se ha insertado un gen de la fuente.

El término "endógeno a" como se usa aqui, en conexión con una fuente microbiana especifica, significa que un polipéptido se produce por la fuente especifica debido a la presencia en la fuente de un gen nativo, ie un gen que no se ha insertado recombinantemente en una célula de la fuente.

El término "enlazado operablemente", cuando se refiere a segmentos de ADN, denota que los segmentos se ordenan de tal forma que funcionan de acuerdo con sus fines proyectados, e.g. inicia transcripción en el promotor y prosigue a través del segmento de codificación hasta el terminador.

El término "polinucleótido" denota un polimero de una- o doble-hebra de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, leído del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y podrían aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vi tro, o prepararse de una combinación de moléculas naturales y sintéticas .

El término "complementos de moléculas de polinucleótido" denota moléculas de polinucleótido que tienen una secuencia de bases complementarias y orientación inversa al compararse a una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.

El término "secuencia de oligonucleótido degenerado" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (al compararse a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo aminoácido (i.e., los tripletes GAU y GAC codifica cada uno Asp) .

El término "promotor" denota una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la ARN polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en las regiones no codificantes 5' de los genes.

El término "secuencia señal secretora" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido más grande, dirige al polipéptido más grande a través de una ruta secretora de una célula que se sintetiza. El péptido más grande se corta comúnmente para retirar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora.

El término "pectina" denota pectato, ácido poligalacturónico, y pectina que podría ser esterificada a un grado más alto o más bajo.

El término "enzima que degrada pectina" o "pectinasa" denota una enzima pectinasa definida de acuerdo al arte donde las pectinasas son un grupo de enzimas que cortan enlaces glicosídicos de sustancias pécticas, principalmente poli ( 1 , 4-alfa-D-galacturónido y sus derivados (Sakai et al., 1993) .

Preferentemente una pectinasa de la invención es una pectinasa, que es una enzima pectinasa, que cataliza el corte aleatorio de enlaces alfa-1,4-glicosídicos en ácido péctico, también llamado ácido poligalacturónico, por medio de transeliminación tal como la clase de enzima poligalacturonato ligasa (EC 4.2.2.2) (PGL) también conocida como poli ( 1 , 4-alfa-D-galacturónido) ligasa, también conocida como pectato ligasa. También se prefiere una enzima pectinasa que cataliza la hidrólisis aleatoria de los enlaces alfa-1 , 4 -glicosídicos en ácido péctico tal como la clase de enzima poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) (PG) también conocida como endo-PG. También se prefiere una enzima pectinasa tal como polimet ilgalacturonato ligasa (EC 4.2.2.10) (PMGL), también conocida como Endo-PMGL, también conocida como poli (metoxigalacturónido) ligasa, también conocida como pectina ligasa, que cataliza el corte aleatorio de enlaces alfa-1 , -glicosidicos de pectina .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN COMO USAR UNA SECUENCIA DE LA INVENCIÓN PARA OBTENER OTRAS SECUENCIAS RELACIONADAS: La información de la secuencia descrita aquí, que se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica una pectato ligasa de la invención, puede usarse como una herramienta para identificar otras pectato ligasas homologas. Por ejemplo, la polimerasa de reacción en cadena (PCR, siglas en inglés) puede usarse para amplificar secuencias que codifican otras pectato ligasas homologas a partir de una variedad de fuentes microbianas, en particular de diferentes especies de Ba cill us .

POLINUCLEÓTIDOS: Dentro de las modalidades preferidas de la invención, un polinucleótido aislado de la invención hibridizará regiones de tamaño similar de la SEC ID No. 1, 3, 5 o 7, respectivamente, o una secuencia complementaria a la misma, bajo al menos condiciones de astringencia medias.

En particular los polinucleótidos de la invención hibridizarán a una sonda de ADN de doble hebra desnaturalizada, que comprende ya sea la secuencia completa (que codifica la parte madura del polipéptido) mostrada en las posiciones 91-1485 de la SEC ID NO: 1, en las posiciones 82-666 de la SEC ID NO: 3, en las posiciones 1-1248 de la SEC ID NO: 5 o en las posiciones 82-1026 de la SEC ID NO: 7, o cualquier sonda que contenga una subsecuencia de la SEC ID NO: 1, 3, 5 o 7, respectivamente, que tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 pares de bases bajo al menos condiciones de astringencia medias, pero preferentemente a condiciones de astringencia altas. Las condiciones experimentales adecuadas para determinar hibridización en astringencia media o alta entre una sonda de nucleótido y una secuencia de ADN o ARN homologa, involucra remojar previamente el filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN, para hibridizar en 5 x SSC (Cloruro de sodio/cit rato de sodio, Sambrook et al. 1989) durante 10 min, y la prehibridización del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS y 100 g/™! de ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguido por hibridización en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de un cebador aleatorio (Feinberg, A.P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), sonda marcada con 32P-dCTP (actividad específica más alta que 1 x 109 cpm/µg) durante 12 horas a ca . 45°C. El filtro se lava después dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% de SDS al menos 60°C (astringencia media), aún más preferentemente al menos 65°C (astringencia media/alta), aún más preferentemente al menos 70°C (astringencia alta) , y aún más preferentemente al menos 75°C (astringencia muy alta).

Las moléculas a las que la sonda de oligonucleótido hibridiza bajo estas condiciones se detecta usando una película de rayos X.

Como se observó anteriormente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para aislar ADN y ARN son bien conocidos en el arte. El ADN y ARN codifican genes de interés que pueden clonarse en los Bancos de Genes o bibliotecas de ADN por medio de métodos conocidos en el arte.

Los polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad pectato ligasa de la invención, se identifican y se asocian mediante, por ejemplo, hib idización o PCR.

La presente invención proporciona además la contraparte de los polipéptidos y polinucleótidos de diferentes cepas bacterianas (ortólogos o parálogos). De interés particular son los polipéptidos que degradan pectina de cepas alcalofílicas gram-posit ivas , incluyendo especies de Ba ci ll us .

Las especies homologas de polipéptidos que presentan actividad que degrada pectina de la invención, pueden clonarse usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, el ADN puede clonarse usando ADN cromosomal obtenido de una célula tipo que expresa la proteína. Las fuentes adecuada de ADN pueden identificarse probando Northern blots con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas aquí. Entonces se prepara una biblioteca de ADN cromosomal de una línea celular positiva. Un ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad que degrada pectina de la invención, puede aislarse después por una variedad de métodos, tal como probando con un ADN completo o parcial o con uno o más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADN también puede clonarse usando la polimerasa de reacción en cadena, o PCR (Mullís, Patente U.S. 4,683,202), usando cebadores diseñados a partir de las secuencias descritas aquí. Dentro de un método adicional, la biblioteca de ADN puede usarse para transformar o transfectar las células huésped, y la expresión del ADN de interés puede detectarse con un anticuerpo (monoclonal o policlonal) cultivado contra las pectato ligasas, pectina ligasa o poligalacturonasa clonada de B. licheniformis , ATCC 14580, expresado y purificado como se describe en Materiales y Métodos y los Ejemplos, o por una prueba de actividad que se refiere a un polipéptido que tiene actividad que degrada pectina. También pueden aplicarse técnicas similares para el aislamiento de clones genómicos.

El polipéptido que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en el plásmido pSJ1678, presente en Escherichia coli DSM 11789 y en Escherichia coli DSM 12030 y en Escherichia coli DSM 12031 y/o en una secuencia de ADN análoga de la invención podría clonarse a partir de una cepa de la especie bacteriana de Bacillus licheniformis , preferentemente la cepa ATCC 14580, que produce la enzima con actividad que degrada pectina, u otro organismo relacionado como se describe aquí .

Alternativamente, la secuencia análoga podría construirse en base de la secuencia de ADN obtenible a partir del plásmido presente en Escherichia coli DSM 11789, en Escherichía coli DSM 12030 o en Escherichia coli DSM 12031, e.g. ser una sub-secuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótido que no originan otra secuencia aminoácido de la enzima que degrada pectina codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponde al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótido que podrían generar una secuencia de aminoácido diferente (i.e. una variante de la enzima que degrada pectina de la invención ) .

Basándose en la información de la secuencia descrita aquí, podría clonarse una secuencia de ADN de longitud completa que codifica una pectinasa de la invención y que contiene la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID No 1, 3, 5 y 7, respectivamente.

La clonación se realiza por medio de procedimientos estándar conocidos en el arte tal como por, preparar una biblioteca genómica a partir de una cepa de Ba cill us; colocar en placa tal biblioteca, en placas de sustrato adecuado; identificar un clon que comprende una secuencia de polinucleótido de la invención por técnicas de hibridización estándar, usando una sonda basada en la SEC ID No 1, 3, 5 y 7, respectivamente; o identificando un clon de la biblioteca genómica de Ba ci l l us li ch eniformi s ATCC 14580 por una estrategia de PCR Inversa que usa cebadores basados en la información de la SEC ID No 1, 3, 5 y 7, respectivamente. Se hace referencia a M.J. MCPherson et al. ("PCR A practical approach" Information Press Ltd, Oxford England) para detalles adicionales que se refieren a PCR Inversa.

Basándose en la información de la secuencia descrita aquí (SEC ID Nos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8) es trabajo de rutina de un experto en el arte aislar secuencias de polinucleótido homólogo que codifican pectinasas homologas de la invención por una estrategia similar que usa bibliotecas genómicas de organismos microbianos relacionados, en particular de bibliotecas genómicas de otras cepas del género Ba cill us tal como Ba cil l us subti l i s .

Alternativamente, el ADN que codifica la enzima que degrada pectina de la invención podría, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, clonarse convenientemente a partir de una fuente adecuada, tal como cualquiera de los organismos mencionados después, por uso de sondas sintéticas de oligonucleótido, preparadas en base de la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en Escheri chi a coli DSM 11789, en Escheri chi a coli DSM 12030 o en Escheri chia coli DSM 12031.

Por lo tanto, la molécula de polinucleótido de la invención podría aislarse a partir de Escheri chi a coli DSM 11789, Esch eri chi a col i DSM 12030 o Esch eri chia col i DSM 12031, en las que se deposita el plásmido obtenido por clonación, tal como se describió antes. También, la presente invención se refiere a un cultivo biológico aislado sustancialmente puro de la cepa Escheri chia coli DSM 11789, Escheri chia coli DSM 12030, y Esch eri chi a col i DSM 12031, respectivamente.

POLIPÉPTIDOS: La secuencia de aminoácidos no. 28-221 de la SEC ID No 4 es una secuencia madura de pectato ligasa; las posiciones 1-27 son la prosecuencia. La secuencia de aminoácidos 28-341 de la SEC ID No 8 es una secuencia madura de pectato ligasa; las posiciones 1-27 son la prosecuencia. La secuencia de aminoácidos no. 31-494 de la SEC ID No 2 es una secuencia madura de pectina ligasa, las posiciones 1-30 son la prosecuencia. La secuencia de aminoácidos no. 1-415 de la SEC ID No 6 es una secuencia madura de poligalacturonasa.

La presente invención también proporciona polipéptidos que degradan pectina, que son sustancialmente homólogos a los polipéptidos de la SEC ID NO: 2, 4, 6 y 8, respectivamente, y sus especies homologas (parálogas u ortólogas). El término " s^ustancialmente homólogo" se usa aquí para denotar polipéptidos que tienen al menos 60%, preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 85%, y aún más preferentemente al menos 90%, de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en SEC ID NO: 2, 4, 6 y 8, respectivamente, o sus ortólogas o parálogas. Tales polipéptidos serán más preferentemente al menos 95% idénticos, y más preferentemente 98% o más idénticos a la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, 4, 6 y 8, respectivamente, o sus ortólogas o parálogas. El por ciento de identidad de la secuencia se determina por métodos convencionales, por medio de programas de computadora conocidos en el arte, tal como GAP proporciona en el paquete del programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) como se describe en Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. GAP se utiliza con los siguientes valores para comparación de secuencia de polipéptido: penalidad de creación GAP de 3.0 y penalidad de extensión GAP de 0.1.

La identidad de la secuencia de las moléculas de polinucleótido se determina por métodos similares usando GAP con los siguientes valores para comparación de la secuencia de ADN: penalidad de creación GAP de 5.0 y penalidad de extensión GAP de 0.3.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de varias secuencias de polinucleótido nuevas obtenidas de una cepa de Ba cill us li cheniformis, la cual codifica secuencias de polipéptido que tienen homología con otras secuencias de aminoácido de pectinasa microbiana.

Se han designado las nuevas pectinasas de Ba ci l l us li cheniformi s : I: pectato ligasa (EC 4.2.2.2) II: pectato ligasa (EC 4.2.2.2) III: pectina ligasa (EC 4.2.2.10) IV: poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) Las secuencias de polipéptido de pectinasa nuevas de la presente invención se identificaron inicialmente comparando las secuencias de búsqueda representativa, específicamente secuencia de aminoácido de pectinasas conocidas, con la base de datos de la secuencia de Ba ci l l us l i ch eni formi s para identificar secuencias homologas a las pectinasas.

Usando un programa de por ciento de identidad de secuencia convencional, como se describe con más detalle aquí ( vi de infra ) la identidad de la secuencia de aminoácido de las secuencias de aminoácido de las SEC ID NOS: 2 (III), 4 (I), 6 . (IV), 8 (II) a las pectinasas conocidas del arte anterior más cercano se muestran después en las tablas 1, 2 y 3.

Tabla 1: Homología entre las secuencias de aminoácido de las pectato liaasas (I) La mayoría de las proteínas que degradan pectina homologas a la pectato ligasa (I) de esta invención es la cepa B. sp . KSM-P15, encontrada la Solicitud de Patente Internacional publicada como WO 98/45393 como SEC ID NO: 1, la cual es 58.8% homologa a la proteína madura de la SEC ID NO: 4.

Tabla: Homología entre las secuencias de aminoácido para pectato ligasas (II) La secuencia usada para similaridad son las secuencias de proteína de TREMBLREL con el locus listado en el esquema. II: secuencia de aminoácido de la invención (SEC ID NO: 8) B: o08454. sp_bacteria Amycolata sp. Pectato ligasa C: q00893. sp_fungi Glomerella cingulata II B II 100% 40.8% 40.5% B 40.8% 100% 40.5% 100% Tabla 3: Homología entre las secuencias de aminoácido para pectina ligasas (III) La mayoría de las proteínas pectina ligasas homologas a la pectina ligasa de esta invención son la pectina ligasa 034819 de B . subtili s y la pectina ligasa P94449 de B . sub ti l i s , ambas secuencias de proteína se encuentran en la base de datos TRSMBL (EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS) . Son 55% y 56% homologas a la secuencia de proteína de la SEC ID NO: 2.

Tabla 4: Homología éntrelas secuencias de aminoácido para PQlisalacturonasas Las secuencias usadas para similaridad son las secuencias de proteína de SWISSPROT con el locus listado en el esquema. IV: Secuencia de aminoácido de la invención (SEC ID NO: 6) B: p27644. swissprot_bacteria Agrobacterium tumefaciens C: p20041. swissprot bacteria Burkholdaria solanacearum IV B IV 100% 36.6% 30.2% B 36.6% 100% C 30.2% 100% La preparación de enzima de la invención se deriva preferentemente de un microorganismo, preferentemente de una bacteria, una arquea o un hongo, especialmente de una bacteria tal como una bacteria que pertenece a Ba ci ll us, preferentemente a una cepa de Ba ci l l us alcalofílica, la cual podría seleccionarse del grupo que consiste de las especies de Ba cill us l i cheni formí s y especies de Ba ci ll us altamente relacionadas, en las que todas las especies son al menos 99% homologas a Ba ci ll us l i ch eni formi s basándose en las secuencias alineadas de rADN 16S.

Las proteínas y polipéptidos sustancialmente homologas se caracterizan en que tienen una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácido. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácido conservadoras (ver Tabla 2) y otras sustituciones que no afectan significativamente el enrollamiento o actividad de la proteína o polipéptido; pequeñas eliminaciones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones apiino- o carboxiterminal, tal como el residuo metionina amíno-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación (una marca de afinidad), tal como un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBQ J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzimol. 198:3, 1991). Ver, en general Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, que se incorpora aquí por referencia. Las marcas de afinidad que codifican ADNs están disponibles en proveedores comerciales (e.g., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA) .

Tabla 5 Sus-t ituciones de aminoácido conservadoras Básico : argmina lisina histidina Ácido glutamina ácido aspártíco Polar: glutamina asparagina Hidrofóbico leucina isoleucina valina Aromático : fenilalanina triptofano tirosina Pequeño : glicina alanina serina treonina metionina Además de los 20 aminoácidos estándares, aminoácido no estándares (tal como 4-hidroxiprolína, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminobut írico, isovalina y a-metil serina) podrían sustituirse por residuos aminoácidos de un polipéptido de acuerdo a la invención. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no se codifican por el código genético, y aminoácidos no naturales podrían sustituirse por residuos aminoácidos. "Los aminoácidos no naturales" se han modificado después de la síntesis de la proteina, y/o tienen una estructura química en su cadena lateral diferente de la de aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales pueden sintetizarse químicamente, o preferentemente, están comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-met ilprolina, y 3,3-dimet ilprolina .

Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de pectato ligasa de la presente invención pueden identificarse de acuerdo a procedimientos conocidos en el arte, tal como mutagénesis dirigida de sitio o mutagénesis de búsqueda de alanina (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989). En la última técnica, mutaciones de alanina simple se introducen en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad biológica (i.e. actividad que degrada pectina) para identificar los residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., J . Biol . Chem. 271:4699-4708, 1996. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse por análisis físico de la estructura, como se determina por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cri-Stalografia, difracción electrónica o marca de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 244:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden inferirse del análisis de homologías con polipéptidos que se relacionan a un polipéptido de acuerdo a la invención.

Sustituciones múltiples de aminoácido pueden hacerse y probarse usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o desordenamiento seguido por un procedimiento de cribado relevante, tal como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer ( Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci. USA .§_£: 2152-2156, 1989), W095/17413, o WO 95/22625. Brevemente, estos autores describen métodos para hacer aleatorias simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, o recombinación/desordenamiento de mutaciones diferentes (W095/17413, W095/22625), seguido por la selección funcional de un polipéptido, y secuenciar después los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen la exhibición del fago (e.g., Lowman et al., liochem. ¿_Q_:10832-10837, 1991; Ladner et al., Patente U.S. No. 5,223,409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis de sitio dirigido (Derbyshire et al., Gene 4_6:145, 1986; Ner et al., DNA 7 : 127, 1988).

Los métodos de mutagénesis/desordenamiento, como se describió antes, pueden combinarse con métodos de alto rendimiento de cribado automatizado para detectar actividad de polipéptidos clonados, mutagenizados en células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células huésped y secuenciarse rápidamente usando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoácido individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

Usando los métodos discutidos antes,' un experto en el arte puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que son sustancialmente homólogos a los residuos 31 a 494 de la SEC ID NO: 2 (la proteína madura), residuos 28 a 221 de la SEC ID NO: 4, residuos 1 a 415 de la SEC ID NO: 6, y residuos 28 a 341 de la EC ID NO: 8 y mantienen la actividad que degrada pectina de la proteína tipo silvestre.

La presente invención se refiere en un aspecto a una enzima pectina ligasa que tiene la secuencia de aminoácido de las posiciones 31-494 SEC ID NO: 2 o una secuencia de amino derivada de la misma por eliminación, reemplazo o adición de uno o más residuos aminoácidos (en lo sucesivo referido como mutación), con la condición de que la pectina ligasa no se desactive y la mutación conserve arginina en la posición 377 y arginina en la posición 383 de la SEC ID No: 2. También el grado de mutación no se limita particularmente, con la condición de que se conserven la arginina descrita antes en la posición 377 y la posición 383. Preferentemente, existe homología de 56% o más alta entre tales variantes de mutación de la enzima pectina ligasa nativa o madre, calculada en la secuencia parcial que corresponde a las posiciones de aminoácido 31 a 375 de la SEC ID No: 2. Más preferentemente, la homología es 70% o más alta, particularmente 80% o más alta.

Además, la presente invención se refiere en un aspecto a una enzima pectato ligasa que tiene la secuencia de aminoácido de las posiciones 28-211 de la SEC ID No: 4 o una secuencia de amino derivada de la misma por eliminación, reemplazo o adición de uno o más residuos aminoácidos (en lo sucesivo referido como mutación), con la condición de que la pectina ligasa no se desactive y la mutación conserve las Usinas en las posiciones 133 y 155 y la arginina en la posición 158 de la SEC ID No: 4. También el grado de mutación no se limita particularmente, con la condición de que se conserven la K133, K155 y R158 descritas antes. Preferentemente, existe homología de 66% o más alta entre tales variantes de mutación de la enzima pectina ligasa nativa o madre, calculada en la secuencia parcial que corresponde a las posiciones de aminoácido 60 a 158 de la SEC ID No: 4. Más preferentemente, la homología es 70% o más alta, particularmente 80% o más alta .

Además, la presente invención se refiere en un aspecto a una enzima pectato ligasa que tiene la secuencia de aminoácido de las posiciones 28-341 de la SEC ID No: 8 o una secuencia de amino derivada de la misma por eliminación, reemplazo o adición de uno o más residuos aminoácidos (en lo sucesivo referido como mutación), con la condición de que la pectina ligasa no se desactive y la mutación conserve las argininas en las posiciones 233 y 238 (R233 y R238) de la SEC ID No: 8. También el grado de mutación no se limita particularmente, con la condición de que se conserven la R233 y R238 descritas antes. Preferentemente, existe homología de 42% o más alta entre tales variantes de mutación de la enzima pectina ligasa nativa o madre, calculada en la secuencia madura de la SEC ID No: 8. Más preferentemente, la homología es 50% o más alta, aún más preferentemente más alta de 60%, particularmente 70% o más alta, especialmente 80% o más alta La enzima que degrada pectina de la invención podría, además del núcleo de la enzima que comprende el dominio catalítico, comprender también un dominio que enlaza celulosa (CBD, siglas en inglés), el dominio de enlace a celulosa y el núcleo de la enzima (el dominio catalíticamente activo), de la enzima que se enlaza operablemente el dominio que enlaza celulosa (CBD) podría existir como una parte integral de la enzima codificada, o un CBD de otro origen podría introducirse en la enzima que degrada pectina creando así una enzima hibrida. En este contexto, el término "dominio que enlaza celulosa" se destina que se entienda como el definido por Peter Tomme et al.: " Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición clasifica más de 120 dominios que enlazan celulosa en 10 familias (I-X), y demuestra que los CBD se encuentran en varias enzimas tal como celulasas, xilanasas, manasas, arabinofuranosidasas , acetil esterasas y quitinasas. Los CBD también se han encontrado en algas, e.g. como una proteína no hidrolítica que enlaza polisacárido del alga roja Porphyra purpurea , ver Tomme et al., op . ci t . Sim embargo, la mayoría de los CBD se encuentran en el término N y C de proteínas o son internos. Las enzimas híbridas se conocen en el arte, ver e.g. WO 90/00609 y WO 95/16782, y podrían prepararse transformando en una célula huésped una construcción de ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio que enlaza celulosa ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica la enzima que degrada pectina y que crece en la célula huésped para expresar el gen fusionado. Las enzimas híbridas podrían describirse por medio de la siguiente fórmula: CBD - MR - X donde CBD es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácido que corresponde al menos al dominio que enlaza celulosa, MR es la región media (el enlazador), y podría ser un enlace, o un grupo corto de enlace de preferencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, más preferentemente de 2 a 40 átomos de carbono; o de preferencia es de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 aminoácidos, más preferentemente de 2 a 40 aminoácidos y X es una región N-terminal o C-terminal de la enzima que degrada pectina de la invención.

Preferentemente, la enzima de la presente invención tiene su actividad catalítica máxima a un pH de al menos 8, más preferentemente de al menos 8.5, más preferentemente de al menos 9, más preferentemente de al menos 9.5, más preferentemente de al menos 10, aún más preferentemente de al menos 10.5, especialmente de al menos 11; y de preferencia la actividad máxima de la enzima se obtiene a una temperatura de al menos 50°C, más preferentemente de al menos 55°C.

PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA: Los polipéptidos de la presente invención, que incluyen proteínas de longitud completa, fragmentos de la misma y proteínas de fusión, pueden producirse en células huésped diseñadas genéticamente de acuerdo a técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son los tipos de células que pueden transformarse o trans fectarse con ADN exógeno y crecer en cultivo, e • incluye bacterias, células de hongos, y cultivo de células eucarióticas superiores. Se prefieren células de bacterias, particularmente células cultivadas de organismos gram-positivos. Se prefieren especialmente las células gram-posit ivas del género de Bacillus, tal como Ba ci l l us subtil i s , Ba ci l l us l en t us , Ba cil l us brevi s , Ba ci l l us stearothermophil us , Bacill us alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus circulans , Bacillus clausii , Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis , Bacillus agaradhaerens , o en particular Bacillus licheniformis .

ATCC 14580 es el tipo de cepa de Bacillus licheniformis .

Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonado e introducir ADN exógeno en una variedad de células huésped se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; y Bacillus subtilis and Other Gram-Posi t ive Bacteria, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C., que se incorporan aquí por referencia.

En general una secuencia de ADN que codifica una pectato ligasa de la presente invención se enlaza operablemente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, en general incluye un promotor y terminador de transcripción dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá comúnmente uno o más marcadores seleccionables uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en el -arte reconocerán que dentro de ciertos sistemas los marcadores seleccionables podrían proporcionarse en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno podría proporcionarse por integración en el genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño de rutina en el nivel del experto en el arte. Muchos de tales elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de suministradores comerciales.

Para dirigir un polipéptido en la ruta de secreción de una célula huésped, una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia guía, prepro secuencia o pre-secuencia) se proporciona en el vector de expresión. La secuencia señal secretora podría ser la del polipéptido, o podría derivarse de otra proteína secretada o sintetizarse de novo . Numerosas secuencias secretoras adecuadas se conocen en el arte y se hace referencia a (Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.; y Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus" . John Wiley and Sons, 1990), para descripción adicional de las secuencias señal secretoras adecuadas especialmente para la secreción en una célula huésped de Bacillus. La secuencia señal secretora se acopla a la secuencia de ADN en el marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente 5' a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal podrían colocarse en algún lugar en la secuencia de ADN de interés (ver, e.g., Welch et al., Patente U.S. No. 5,037,743; Holland et al., Patente U.S. No. 5,143,830).

Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo a procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células huésped elegidas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, se conocen en el arte e incluyen en general una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también podrían contener tales componentes como factores de crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento se seleccionará en general de células que contienen el ADN adicionado exógenamente, por ejemplo, mediante selección de fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa con el marcador seleccionable portado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula huésped.

Los polipéptidos de la presente invención también podrían producirse fermentando una cepa tipo silvestre que pertenece al género de Bacillus, preferentemente una cepa que podría seleccionarse del grupo que consiste de las especies de Bacillus licheniformis y especies de Bacillus altamente relacionadas, en las que todas las especies son al menos 99% homologas a Bacillus licheniformis basándose en secuencias alineadas de rADN 16S. Un ejemplo específico y altamente preferido es Bacillus licheniformis , ATCC 14580.

Además, los polipéptidos de la presente invención podrían producirse fermentando una mutante o una variante derivada de la cepa mencionada antes. Tal mutante podría obtenerse usando técnicas convencionales y selección de mutantes que dan actividad pectinasa más alta .

La fermentación podría llevarse a cabo por cultivo de la cepa bajo condiciones aeróbicas en un medio nutriente que contiene fuentes de carbono y nitrógeno junto con otros nutrientes esenciales, el medio se compone de acuerdo con los principios del arte conocido. El medio podría ser un medio rico complejo o un medio mínimo. La fuente de nitrógeno podría ser de naturaleza inorgánica y/u orgánica. Las fuentes de nitrógeno inorgánico adecuadas son sales de nitratos y amonio. Entre las fuentes de nitrógeno orgánico se usa regularmente un gran número en las fermentaciones. Ejemplos son harina de soya, caseína, maíz, licor de infusión de maíz, extracto de levadura, urea y albúmina. Las fuentes de carbono adecuadas son carbohidratos o materiales que contienen carbohidratos. De preferencia el medio nutriente contiene pectato, ácido poligalacturónico y/o pectina esterificada a un grado más alto o más bajo como fuente de carbono y/o inductor de la producción de pectinasa. Alternativamente, el medio contiene un material rico en pectina tal como harina de soya, pulpa de manzana o cascara de cítrico.

Ya que las especies de Ba cil l us de esta invención son alcalofílicas, el cultivo se realiza preferentemente en valores de pH alcalino tal como al menos pH 8 o al menos pH 9, que pueden obtenerse por adición de amortiguadores adecuados tal como carbonato de sodio o mezclas de carbonato de sodio y bicarbonato de sodio después de la esterilización del medio de cultivo .

Se contempla que la fermentación de una cepa tipo silvestre o mutante en un media adecuado puede resultar en una producción de al menos 5.0 g de proteína pectinasa por litro de caldo de cultivo o aún al menos 1 g/1 o 2 g/1.

AISLAMIENTO DE LA PROTEÍNA: Cuando se secreta el polipéptido expresado tipo silvestre o recombinante, el polipéptido podría purificarse del medio de cultivo. Preferentemente las células huéspedes de expresión se retiran del medio antes de la purificación del polipéptido (e.g. por centrifugación) .

Cuando el polipéptido recombinante expresado no se secreta de la célula huésped, preferentemente la célula huésped se rompe y el polipéptido se libera en un "extracto" acuoso que es la primera etapa de tales técnicas de purificación. Preferentemente las células huésped de expresión se retiran del medio antes de la ruptura celular (e.g. por centrifugación).

La ruptura celular podría realizarse por técnicas convencionales tal como por digestión con lisozima o forzando las células a través de alta presión. Ver (Robert K. Scobes, Protein Purification, Segunda edición, Springer Verlag) para descripción adicional de tales técnicas de ruptura celular.

Ya sean o no que los polipéptidos recombinantes expresados (o polipéptidos quiméricos) se secreten o no, pueden purificarse usando métodos y medios de fraccionamiento y/o de purificación convencional.

La precipitación con sulfato de amonio y extracción acida o por caótropo podrían usarse para el fraccionamiento de muestras. Ejemplos de etapas de purificación podrían incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC (siglas en inglés) y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Medios de intercambio aniónico adecuados incluyen derivados de dextranos, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad, y similares. Se prefieren derivados PEÍ, DEAE, QAE y Q, con DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) que se prefiere particularmente. Ejemplos de medios cromatográficos incluyen aquellos medios derivados con grupos fenilo, butilo u octilo, tal como Phenyl Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butil 650 (Toso Hass, Montgomeryville, PA) , Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tal como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa de enlace cruzado, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida de enlace cruzado y similares, que son insolubles bajo las condiciones en la que se van a usar. Estos soportes podrían modificarse con grupos reactivos que permitan la adherencia de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o radicales de carbohidrato. Ejemplos de químicos de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida, y derivados de carboxilo y amino para químicos de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y se usan ampliamente en el arte, y están disponibles con suministradores comerciales La selección de un método particular es un asunto de diseño de rutina y se determina en parte por las propiedades del soporte escogido. Ver, por ejemplo, Affinity Chromatographv : Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotech-nology, Uppsala, Suecia, 1988.

Polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos también podrían prepararse a través de síntesis química. Los polipéptidos de la invención podrían ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y podrían o no podrían incluir un residuo aminoácido metionina inicial.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a un método para producir _*15 la preparación de enzima de la invención, el método comprende cultivar un microorganismo capaz de producir la pectato ligasa bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperar la enzima del cultivo. El cultivo podría llevarse a cabo usando técnicas de fermentación convencionales, e.g. cultivo en matraces agitados o fermentadores con agitación para asegurar aeración suficiente en un medio de crecimiento que induce la producción de la enzima pectato ligasa. El medio de crecimiento podría contener una fuente de N convencional tal como peptona, extracto de levadura tí^ o casaminoácidos, una cantidad reducida de una fuente de c convencional tal como dextrosa o sacarosa, y un inductor tal como pectato o pectina o sustratos mixtos de planta tal como salvados de cereal (e.g. salvado de trigo o cascarilla de arroz) . La recuperación podría llevarse a cabo usando técnicas convencionales, e.g. separación de biomasa y sobrenadante por centrifugación o filtración, recuperación de sobrenadante o ruptura de las células si la enzima de interés es intracelular, tal vez seguido por purificación como se describe en EP 0 406 314 o por cristalización como se describe en WO 97/15660.

Aún en otro aspecto, la presente invención se refiere a una enzima aislada que degrada pectina, que tiene las propiedades descritas antes y que está libre de impurezas homologas, y se produce usando técnicas recombinantes convencionales.

PLANTAS TRANSGÉNICAS La presente invención también se refiere a una planta, parte de la planta o célula de la planta 5d transgénica que se ha transformado con una secuencia de ADN que codifica la enzima que degrada pectina de la invención, así como expresar y producir esta enzima en cantidades recuperables. La enzima podría recuperarse de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene la enzima recombinante podría usarse como tal.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea, abreviado dicot o monocot. Ejemplos de plantas monocot son pastos, tal como pasto para pastar (pasto azul, Poa), pasto de forraje tal como festuca, lólium, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, e.g. trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maí z .

Ejemplos de plantas dicot son tabaco, leguminosas, tal como leguminosa del género Lupi nus, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y soya, y cruciferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semillas de colza para aceite y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Ejemplos de partes de plantas son tallo, callos, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos. En el presente contexto, también se consideran que son parte de una planta tejidos específicos de planta, tal como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma. Además, cualquier célula de planta, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera que es parte de la planta.

También se incluyen dentro del alcance de la invención la progenie de tales plantas, partes de la planta y células de la planta.

La planta transgénica o célula de la planta que expresa la enzima de la invención podría construirse de acuerdo con métodos conocidos en el arte. En breve la planta o célula de la planta se construye incorporando una o más construcciones de expresión que codifican la enzima de la invención en el genoma de la planta huésped y que propaga la planta modificada resultante o célula de la planta en una planta transgénica o célula de la planta.

Convenientemente, la construcción de expresión es una construcción de ADN que comprende un gen que codifica la enzima de la invención, en asociación operable con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o parte de la planta de elección. Además, la construcción de expresión podría comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huésped, en las que se ha integrado la construcción de expresión, y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de J-a construcción en la planta en cuestión (las últimas dependen del método de introducción de ADN que se va a usar ) .

La selección de secuencias reguladoras, se determina tal como secuencias promotora y terminadora y opcionalmente secuencias señal o tránsito, eg en base de cuándo, dónde y cómo se desea que se exprese la enzima. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica la enzima de la invención podría ser constitutiva o inducible, o podría ser de desarrollo, de etapa o de tejido específico, y el producto del gen podría marcarse para un tejido específico o parte de la planta, tal como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras se describen eg por Tague et al, Plant, Phys., 86, 506, 1988.

Por expresión constitutiva podría usarse el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980. Cell 21: 285-294) . Los promotores específicos de órgano podrían ser eg un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tal como semillas, tubérculos de papa, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tal como meristemos (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina de arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8 pp. 885-889 (1998), un promotor de Vi cia faba de la leguminosa B4 y el gen desconocido de la proteína de semilla de Vi ci a faba descrito por Conrad U. et al, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6 pp . 708-711 (1998), un promotor de una proteína del cuerpo aceitoso de la semilla (Chen et al., Plant and cell physiology vol. 39, No. 9 pp. 935-941 (1998), el promotor de la semilla de almacenamiento napA de Brassica napus, o cualquier otro promotor especifico de semilla conocido en el arte, eg como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor podría ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, No. 3 pp . 991-1000 (1993), el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus de clórela (Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No. 1 pp . 85-93 (1994), o el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Vol. 248, No. 6 pp . 668-'674 (1995), o un promotor inducible por lesión tal como el promotor de la papa pin2 (Xu et al, Plant Molecular Biology Vol. 22, No. 4 pp . 573-588 (1993).

' Un elemento aumentador del promotor podría usarse para lograr expresión más alta de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento aumentador del promotor podría ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótido que codifica la enzima. Por ejemplo, Xu et al. op ci t describe el uso del primer intrón del gen actin 1 del arroz para aumentar la expresión.

El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte de la construcción de expresión podrían seleccionarse de los disponibles en el arte.

La construcción de ADN se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo a técnicas convencionales conocidas en el arte, incluyendo transformación mediada por Agroba c teri um, transformación mediada por virus, micro inyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al. Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 199D; Shimamoto et al, Nature 338, 274, 1989).

Actualmente, la transferencia de gen mediada por Agroba cteri um tumefa ci ens es el método de selección para generación de dicots transgénicas (para revisión Hooykas & Scilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38), sin embargo también puede usarse para transformación de dicots, aunque en general se prefieren otros métodos de transformación para estas plantas. Preferentemente, el método de selección para generar monocots transgénicas es bombardeo por partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante) de callos embriónicos o embriones desarrollados (Christou, 1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992. Bio/technology 10: 667-674) . Un método alternativo para la transformación de monocots se basa en la transformación del protoplasto como se describe por Omirulleh S, et al., Plant Molecular biology Vol. 21, No. 3 pp. 415-428 (1993) .

Después de la transformación, las transformantes que tienen incorporada la construcción de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas completas de acuerdo a métodos bien conocidos en el arte.

PREPARACIÓN DE LA ENZIMA En el presente contexto, el término "preparación de enzima" se destina para indicar ya sea un producto de fermentación enzimática convencional, posiblemente aislado y purificado, de una sola especia de un microorganismo, tal preparación comprende usualmente un número de diferentes actividades enzimáticas; o una mezcla de enzimas monocomponentes , preferentemente enzimas derivadas de especies de bacterias u hongos usando técnicas recombinantes convencionales, estas enzimas se han fermentado y posiblemente aislado y purificado separadamente, y podrían originarse de diferentes especies, preferentemente especies de hongos o bacterias; o el producto de fermentación de un microorganismo que actúa como una célula huésped para la expresión de una enzima recombinante que degrada pectina, pero este microorganismo produce simultáneamente otras enzimas, e.g. otras enzimas que degradan pectina, proteasas o celulasas, que son productos de fermentación que se presentan de forma natural del microorganismo, i.e. el complejo enzimático producido convencionalmente por el microorganismo correspondiente que se presenta de forma natural La preparación de enzima que degrada pectina de la invención podría comprender además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de proteasas, celulasas (endo-ß-1 , 4-glucanasas ) , ß-glucanasas (endo-ß-1 , 3 ( 4 ) -glucanasas ) , lipasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, amilasas, glucoamí lasas , pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinasas, hemicelulasas, anasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acil esterasas, ramnogalacturonan acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas , galactanasas , pectato ligasas, pectina ligasas, pectina me t i 1 e s t e r a s a s , celobiohidrolasas, t ransglutaminasas ; o mezclas de las mismas. En una modalidad preferida, una o más o todas las enzimas de la preparación se producen usando técnicas recombinantes, i.e. la (s) enzima(s) es/son enzima(s) mono-componente que se mezcla(n) con la(s) otra(s) enzima (s) para formar una preparación de enzima con la mezcla de enzima deseada.

REACTIVIDAD CRUZADA INMUNOLÓGICA: Los anticuerpos policlonales (que son monoespecí fieos para una proteína enzimática dada) que se van a usar en la determinación de reactividad cruzada inmunológica podrían prepararse por el uso de una enzima que degrada pectina purificada. Más específicamente, antisuero contra la enzima que degrada pectina de la invención podría generarse inmunizando conejos (u otros roedores) de acuerdo al procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A Manual of Quantitative Immunoe lee t rophores i s , Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications , 1982 (más específicamente p. 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas podrían obtenerse del antisuero, por ejemplo por precipitación de sal ( (NH4 ) 2S04 ) , seguido por diálisis y cromatografía de intercambio iónico, e.g. en DEAE-Sephadex . La caracterización inmunoquímica de proteínas podría hacerse ya sea por análisis de difusión doble de Outcherlony (0. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology {D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp . 655-706), por ínmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra. Capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis de reacción directa (N. Axelsen et al., Capítulo 2).

Uso en la industria de detergente o de limpieza En aspectos adicionales la presente invención se refiere a una composición de detergente que comprende la enzima que degrada pectina o preparación de enzima de la invención, para un proceso de tratamiento de telas con máquina que comprende tratar la tela durante un ciclo de lavado, de un proceso de lavado a máquina, con una solución de lavado que contiene enzima que degrada pectina o preparación de enzima de la invención, y composiciones de limpieza, incluyendo composiciones de lavado de ropa, de limpiadores de superficies duras, de limpieza personal y oral/dental, que contiene una enzima que degrada pectina o preparación de enzima de la invención, proporciona superior funcionamiento de limpieza, i.e. superior remoción de manchas.

Sin que se relacione con esta teoría, se cree que las manasas de la presente invención son capaces de degradar o hidrolizar efectivamente cualquier suciedad o manchas que contengan galactomananas y, por Lo tanto, de ropa para lavar que contiene tal suciedad o manchas.

Las composiciones de limpieza de la invención deben contener al menos un componente de detergente adicional. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales, y niveles de incorporación de los mismo dependerán de la forma física de la composición, y la naturaleza de la operación de limpieza para la que se va a usar.

Las composiciones de limpieza de la presente invención contienen además de preferencia un ingrediente de detergente seleccionado de un surfactante seleccionado, otra enzima, un formador y/o un sistema de blanqueo.

Las composiciones de limpieza de acuerdo a la invención pueden ser líquido, pasta, geles, barras, tabletas, atomizado, espuma, polvo o granular. Las composiciones granulares también pueden ser en forma "compacta" y las composiciones de líquido también pueden ser en una forma "concentrada".

Las composiciones de la invención podrían por ejemplo, formularse como composiciones de lavado de trastos a mano y en máquina, composiciones de detergente de lavado de ropa a mano y en máquina que incluyen composiciones aditivas de lavado de ropa y composiciones adecuadas para usar en el remojo y/o pretratamiento de telas manchadas, composiciones suavizadoras de telas adicionadas al enjuague, y composiciones para usar en operaciones de limpieza de superficies duras de la casa en general. Las composiciones que contienen tales carbohidrasas también pueden formularse como productos sanitarios, limpiadores de lentes de contacto y productos de cuidado de la salud y de la belleza, tal como composiciones de limpieza oral/dental y personal.

Cuando se formulan como composiciones para usar en métodos manuales de lavado de trastos, las composiciones de la invención contienen preferentemente un surfactante y preferentemente otros compuestos de detergente seleccionados de compuestos poliméricos, agentes aumentadores de espuma, iones metálicos del grupo II, disolventes, hidrótropos y enzimas adicionales .

Cuando se formulan como composiciones adecuadas para uso en un método de lavado de ropa en máquina, las composiciones de la invención contienen preferentemente tanto un surfactante como un compuesto formador y adicionalmente uno o más compuestos de detergente seleccionados de compuesto poliméricos orgánicos, agentes de blanqueado, enzimas adicionales, supresores de espuma, dispersantes, dispersantes de jabón de cal, suspensión de suciedad y agentes de anti-redeposición e inhibidores de corrosión. Las composiciones de lavado de ropa también contienen agentes de suavizado, como componentes adicionales del detergente. Tales composiciones contienen carbohidrasa que puede proporcionar blanqueado de la tela, remoción de manchas, mantenimiento de la blancura, suavizado, apariencia de color, inhibición de la transferencia del tinte y saneamiento, cuando se formulan como composiciones de detergente para lavado de ropa.

Las composiciones de la invención también pueden usarse como productos aditivos del detergente en forma sólida o líquida. Tales productos aditivos se destinan a suplementar o ayudar al funcionamiento de las composiciones de detergente convencional y pueden adicionarse en cualquier etapa del proceso de limpieza.

Si se necesita la densidad de las composiciones de detergente para lavado de ropa de aquí, está en el rango de 400 a 1200 g/litro, preferentemente 500 a 950 g/litro de la composición medida a 20°C.

La forma "compacta" de las composiciones de aquí se refleja mejor por la densidad y, en términos de composición, por la cantidad de sal de relleno inorgánica; las sales de relleno inorgánicas son ingredientes convencionales de las composiciones de detergente en forma de polvo; en las composiciones de detergente convencionales, las sales de relleno están presentes en cantidades sustanciales, típicamente 17-35% en peso de la composición total. En las composiciones compactas, la sal de relleno está presente en cantidades que no exceden del 15% de la composición total, preferentemente no exceden de 10%, más preferentemente no exceden de 5% en peso de la composición. Las sales de relleno inorgánicas, tal como se indica en las presentes composiciones se seleccionan de sales de metales alcalinos y alcalino-térreos , de sulfatos y de cloruros. Una sal de relleno preferida es el sulfato de sodio.

Las composiciones de detergente líquido de acuerdo a la presente invención también pueden ser de una "forma concentrada", en tal caso, las composiciones de detergente líquido de acuerdo a la presente invención contendrán una cantidad más baja de agua, comparadas a los detergentes convencionales. Típicamente el contenido de agua del detergente líquido concentrado es preferentemente menos de 40%, más preferentemente menos de 30%, más preferentemente menos de 20% en peso de la composición del detergente.

Los compuestos de detergente específicos adecuados para usar aquí se seleccionan del grupo que consiste de los compuestos específicos como se describe en WO 97/01629, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad .

La manasa podría incorporarse en las composiciones de limpieza de acuerdo con la invención, preferentemente aun nivel de 0.0001% a 2%, más preferentemente de 0.0005% a 0.5%, más preferentemente de 0.001% a 0.1% de la enzima pura en peso de la composición .

Las celulasas útiles en la presente invención incluyen tanto celulasas bacterianas como fúngicas. Preferentemente, tendrán un pH óptimo de entre 5 y 12 y una actividad específica arriba de 50 CEVU/mg (Unidad de Viscosidad de Celulosa). Las celulasas adecuadas se describen en la Patente U.S. 4,435,307, J61078384 y WÓ96/02653 que describe la celulasa fúngica producida por Humicola insolens , Trichoderma , Thielavia y Sporotrichum, respectivamente. EP 739 982 describe celulasas aisladas de nuevas especies de Bacillus . Las celulasas adecuadas también se describen en GB-A-2075028; GB-A-2095275 ; DE-OS-22 47 832 y W095/26398.

Ejemplos de tales celulasas son las celulasas producidas por una cepa de Humicola insolens (Humicola grisea var. Thermoidea) , particularmente la cepa Humicola insolens , DSM 1800. Otras celulasas adecuadas son las celulasas originadas de Humicola insolens que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kD, un punto isoeléctrico de 5.5 y contiene 415 aminoácidos; y una endo-beta- 1 , 4 -glucanasa de -43 kD derivada de Humicola insolens , DSM 1800; una celulasa preferida tiene la secuencia aminoácido descrita en la Solicitud de Patente PCT No. WO 91/17243. También son celulasas adecuadas las celulasas EGIII de Trichoderma longibrachiatum descritas en WO94/21801. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en W096/29397, EP-A-045257, WO 91/17243, W091/17244 y WO91/21801. Otras celulasas adecuadas para cuidado de tela y/o propiedades de limpieza se describen en WO96/34092, W096/17994 y W095/24471 Las celulasas se incorporan normalmente en la composición de detergente en niveles de 0.0001% a 2% de la enzima pura en peso de la composición de detergente.

Las celulasas preferidas para el propósito de la presente invención son celulasas alcalinas, i.e. enzima que tiene al menos 25%, más preferentemente al menos 40% de su actividad máxima a un pH en el intervalo de 7 a 12. Las celulasas más preferidas son enzimas que tienen su actividad máxima a un pH que está en el rango de 7 a 12. Una celulasa alcalina preferida es la celulasa vendida bajo el nombre comercial de Carezyme® por Novo Nordisk A/S.

Las amilasas (a y/o ß) pueden incluirse para la remoción de manchas de base de carbohidrato. WO94/02597, Novo Nordisk A/S publicado el 03 de Febrero de 1994, describe composiciones de limpieza que incorporan amilasas mutantes. Ver también WO95/10603, Novo Nordisk A/S, publicada el 20 de Abril de 1995. Otras amilasas conocidas para usar en composiciones de limpieza incluyen tanto OÍ- como ß-amilasas. Las c.-amilasas se conocen en el arte y se incluyen las descritas en la Pat. US no. 5,003,257; EP 252,666; WO/91/00353; FR 2,676,456; EP 285,123; EP 525,610; EP 368,341; y especificación de Patente Británica no. 1,296,839 (Novo). Otras amilasas adecuadas son las amilasas de estabilidad aumentada descritas en W094/18314, publicada el 18 de Agosto de 1994 y WO96/05295, Genencor, publicada el 22 de Febrero de 1996 y variantes de amilasa que tienen modificación adicional en la original inmediata disponible en Novo Nordisk A/S, descrita en WO 95/10603, publicada en Abril del 95. También son adecuadas las amilasas descritas en EP 277 216, W095/26397 y W096/23873 (todas de Novo Nordisk) .

Ejemplos de productos comerciales de a-amilasas son Purafect Ox Am® de Genencor y Termanyl®, Ban®, Fugamyl® y Duramyl®, todos disponibles en Novo Nordisk A/S Dinamarca. W095/26397 describe otras amilasas adecuadas: c.-amilasas caracterizadas porque tienen una actividad específica de al menos 25% más alta que la actividad específica de Termanyl® a una temperatura en el rango de 25°C a 55°C y a un valor de pH en el rango de 8 a 10, medido por la prueba de actividad de a-amilasa de Phadebas®. Variantes adecuadas de las enzimas anteriores se describen en W096/23873 (Novo Nordisk) .

Otras enzimas amilolíticas con propiedades mejoradas con respecto al nivel de actividad y la combinación de termoestabilidad y un nivel de actividad más alto se describen en W095/35382.

Las amilasas preferidas para el propósito de la presente invención son las amilasas vendidas bajo el nombre comercial de Termanyl, Duramyl y Maxamyl y o la a-amilasa variante que demuestra termoestabilidad incrementada descrita como SEC ID No. 2 en W096/23873.

Las amilasas preferidas para aplicaciones específicas son amilasas alcalinas, ie enzimas que tienen una actividad enzimática de al menos 10%, preferentemente al menos 25%, más preferentemente al menos 40% de su actividad máxima a un pH que está en el rango de 7 a 12. Las amilasas más preferidas son enzimas que tienen su actividad máxima a un pH que está en el rango de 7 a 12.

Las enzimas amilolíticas se incorporan en las composiciones de detergente de la presente invención a un nivel de 0.0001% a 2%, preferentemente de 0.00018% a 0.06%, más preferentemente de 0.00024% a 0.048% en peso de la composición de la enzima pura.

El término xiloglucanasa abarca la familia de enzimas descrita por Vincken and Voragen en Wageningen University [Vincken et al (1994) Plant Physiol., 104, 99-107] y son capaces de degradar xiloglucanas como se describe en Hayashi et al (1989) Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 139-168. Vincken et al demostraron la remoción de xiloglucanas cubiertos de celulasa de la pared celular de manzana aislada por medio de xiloglucanasa purificada de Tri choderma vi ri de (endo-IV-glucanasa ) . Esta enzima aumenta la degradación enzimática de la celulosa embebida en la pared celular y trabaja en sinergia con enzimas pécticas. Rapidase LIQ+ de Gist-Brocades contiene una actividad xiloglucanasa.

Esta xiloglucanasa se incorpora en las composiciones de limpieza de acuerdo con la invención a un nivel de 0.0001% a 2%, más preferentemente de 0.0005% a 0.5%, más preferido de 0.00% a 0.1% en peso de la composición de la enzima pura.

Las xiloglucanasas preferidas para aplicaciones específicas son xiloglucanasas alcalinas, ie enzimas que tienen una actividad enzímática de al menos 10%, preferentemente al menos 25%, más preferentemente al menos 40% de su actividad máxima a un pH que está en el rango de 7 a 12. Las xiloglucanasas más preferidas son enzimas que tienen su actividad máxima a un pH que está en el rango de 7 a 12.

Las enzimas mencionadas antes podrían ser de cualquier origen adecuado, tal como origen vegetal, animal, bacteriano, fúngico y de levadura. El origen puede ser además mesofílico o extremofílico (psicrofílico, psicrotrópico , termofílico, barofílico, alcalofílico, acidofílico, halofílico, etc.). Podrían usarse las formas purificadas o no purificadas de estas enzimas. Hoy en día, es práctica común modificar enzimas de tipo silvestre por vía de técnicas de ingeniería de proteínas o genética para optimizar su eficiencia de funcionamiento en las composiciones de limpieza de la invención. Por ejemplo, las variantes podrían diseñarse de tal forma que se incrementa la compatibilidad de la enzima para encontrar comúnmente ingredientes de tales composiciones. Alternativamente, la variante podría diseñarse de tal forma que el pH óptimo blanqueado o estabilidad del quelante, actividad catalítica y similares, de la variante de la enzima se ajustan a la aplicación de limpieza.

En particular, la atención debería enfocarse en aminoácidos sensibles a la oxidación en el caso de estabilidad de blanqueo y en cargas superficiales para la compatibilidad del surfactante. El punto isoeléctrico de tales enzimas podría modificarse por la sustitución de algunos aminoácidos cargados, e.g. un aumento en el punto isoeléctrico podría ayudar a mejorar la compatibilidad con surfactantes aniónicos. La estabilidad de las enzimas podría aumentarse más por la creación de e.g. puentes de sal adicionales y sitios de enlace de metal reforzados para aumentar la estabilidad del quelante.

Uso en las industrias textil y que procesa fibra celulósica La enzima que degrada pectina de la presente invención puede usarse sola o en combinación con otros carbohidratos que degradan enzimas (por ejemplo arabinasa, xiloglucanasa, manasa) para biorreparación de fibras o para limpieza de fibras en combinación con detergentes. Las fibras de algodón consisten de una capa de pared celular primaria que contiene pectina y una capa secundaria que contiene principalmente celulosa. Bajo la preparación de algodón o parte de refinación del algodón se removerá la pared celular primaria. La presente invención se refiere a ayudar durante la refinación del algodón por medio de la remoción de la pared celular primaria. 0. durante la limpieza del algodón para remover las sustancias pécticas residuales y evitar el agrisamiento del textil .

En el presente contexto, el término "material celulósico" se destina a indicar fibras, telas cocidas o no cocidas, incluyendo bordados, tejidos, mezclillas, hilados y toallas, hechos de algodón, mezclas de algodón o celulósicos naturales o hechos por el hombre (e.g. originados de fibras de celulosa que contiene xilana tal como de la pulpa de madera) o mezclas de los mismos. Ejemplos de las mezclas son mezclas de algodón o rayón/viscosa con uno o más materiales acompañantes tal como lana, fibras sintéticas (e.g. fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de cloruro de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida), y fibras que contienen celulosa (e.g. rayón/viscosa, ramio, cáñamo, hilado de lino/tela de lino, yute, fibras de acetato de celulosa, liocell).

La preparación de enzima de la presente invención es útil en la industria de procesamiento de fibra celulósica para el pretratamiento o eliminación de fibras del cáñamo, hilado de lino o tela de lino.

El procesamiento de material celulósico para la industria textil, como por ejemplo fibra de algodón, en un material listo para manufacturar prendas de vestir involucra varios pasos: hilatura de la fibra en un hilado; construcción de tela tejida o bordada a partir del hilado y operaciones subsecuentes de preparación, teñido y acabado. Buenos tejidos se construyen tejiendo un hilado relleno entre una serie de tejidos de urdimbre; los tejidos podrían ser de dos tipos diferentes. Buenos bordados se construyen formando una red de ciclos entrecruzados de una longitud continua del hilado. Las fibras celulósicas también pueden usarse para telas no tejidas.

Los procesos de preparación preparan el textil para la respuesta propia en las operaciones de teñido. Las sub-etapas involucradas en la preparación son a. Desencolar (para buenos tejidos) usando cola polimérica como e.g. almidón, CMC o PVA, que se adiciona antes de tejer para aumentar la velocidad de urdimbre. Este material debe retirarse antes de procesamiento adicional. b. Lavar, el fin de esto es remover material no celulósico de la fibra de algodón, especialmente la cutícula (que consiste principalmente de ceras) y pared celular primaria (que consiste principalmente de pectina, proteína y xiloglucano) . Una remoción propia de cera es necesaria para obtener una alta humectabilidad, que es una medida para obtener un buen teñido. La remoción de la pared celular primaria -especialmente las pectinas - mejora la remoción de cera y asegura un teñido más uniforme. Además esto mejora la blancura en el proceso de blanqueado. El principal químico usado en lavado es hidróxido de sodio en altas concentraciones, hasta 70 g/kg de algodón a temperaturas altas, 80-95rC; y c. Blanquear; normalmente el lavado se sigue por un blanqueado que usa peróxido como el agente de oxidación para obtener ya sea una tela totalmente blanqueada (blanca) o para asegurar un tono claro del tinte.

Un paso de proceso combinado de lavado/blanqueado también se usa en la industria. Aunque los procesos de preparación son los más comúnmente empleados en el estado de tela; las operaciones de lavado, blanqueado y teñido también pueden hacerse en el estado de fibra o hilado.

El régimen de procesamiento puede ser ya sea en lote o continuo con la tela que se pone en contacto con la corriente de procesamiento líquida en forma extendida o amarrada. Las formas extendidas usan por lo general un saturador por medio del cual un peso aproximadamente igual de baño químico por peso de tela se aplica a la tela, seguido por una cámara de residencia calentada donde se lleva a cabo la reacción química. Después una sección de lavado prepara la tela para el siguiente paso de procesamiento. El procesamiento en lote se lleva a cabo en general en un baño de procesamiento por medio del cual la tela se pone en contacto con aproximadamente 8-15 veces su peso en baño químico. Después de un período de reacción, los químicos se drenan, la tela se enjuaga y se aplica el siguiente químico. El procesamiento discontinuo en lote relleno involucra un saturador por medio del cual un peso aproximadamente igual del baño de químico por peso de tela se aplica a la tela, seguido por un período de residencia que en el caso de lote de relleno frío podría ser de uno o más días.

Buenos tejidos son la forma prevalente de la construcción de tela. El proceso de tejido demanda un "encolado" del hilado de urdimbre para proteger su abrasión. Almidón, alcohol polivinílico (PVA), carboximetil celulosa, ceras y aglutinantes acrílicos son ejemplos de encolantes químicos típicos usados debido a su disponibilidad y costo. La cola debe removerse después del proceso de tejido, como el primer paso en la preparación de buenos tejidos. La tela encolada ya sea en forma extendida o amarrada se pone en contacto con el líquido de procesamiento que contiene los agentes de desencolado. El agente de desencolado empleado depende del tipo de cola que se va a remover. Para colas de PVA, se usan a menudo procesos de agua caliente u oxidativo. El agente de encolado más común para tela de algodón se basa en almidón. Por lo tanto muy a menudo, telas de algodón tejido se desencolan por una combinación de agua caliente, la enzima a-amilasa para hidrolizar el almidón y un agente humectante o surfactante. El material celulósico se deja reposar con los químicos de desencolado durante un "período de residencia" suficientemente grande para realizar el desencolado. El período de residencia es dependiente del tipo de régimen de procesamiento y la temperatura, y puede variar de 15 minutos a 2 horas, o en algunos casos varios días. Típicamente, los químicos de desencolado se aplican en un baño saturador que está en general en el rango de aproximadamente 15°C a aproximadamente 55°C. La tela se mantiene después en el equipo tal como una "caja J" que proporciona suficiente calor, usualmente entre aproximadamente 55°C a aproximadamente 100°C, para aumentar la actividad de los agentes de desencolado. Los químicos, incluyendo los agentes de encolado removidos, se quitan por lavado de la tela después de terminar el período de residencia .

Para asegurar una blancura alta o una buena humectabilidad y tonalidad resultante, los químicos de encolado y otros químicos aplicados deben removerse completamente, en general se cree que un desencolado eficiente es de importancia crucial para el siguiente proceso de preparación: lavado y blanqueado.

El proceso de lavado remueve mucho del compuesto no celulósico encontrado de forma natural en el algodón. Además de las impurezas no celulósicas naturales, el lavado puede remover mugre, suciedad y materiales residuales introducidos en la manufactura tal como lubricantes para hilatura, elaboración de conos o cortado. El proceso de lavado emplea hidróxido de sodio o agentes cáusticos relacionados tal como carbonato de sodio, hidróxido de sodio o mezclas de los mismos. En general un surfactante estable al álcali se adiciona al proceso para aumentar la solubilización de compuestos hidrofóbicos y/o evitar su redeposición en la tela. El tratamiento es en general a una temperatura alta, 80°C -100°C, empleando soluciones fuertemente alcalinas, pH 13-14, del agente de lavado. Debido a la naturaleza no específica de los procesos químicos no sólo se atacan las impurezas sino la misma celulosa, conduciendo a daños en resistencia u otras propiedades deseables de la tela. La suavidad de la tela celulósica es una función de ceras residuales del algodón natural. La naturaleza no específica del proceso de lavado fuertemente alcalino a alta temperatura no puede discriminar entre los lubricantes deseables del algodón natural y los lubricantes introducidos para la manufacturación. Además, el proceso de lavado convencional puede causar problemas ambientales debido al efluente fuertemente alcalino de estos procesos. La etapa de lavado prepara la tela para la respuesta óptima en el blanqueado. Una tela lavada inadecuadamente necesitará un nivel de químico blanqueado más alto en las etapas de blanqueado subsecuentes La etapa de blanqueado decolora los pigmentos naturales del algodón y remueve cualquier componente residual del corte natural del algodón leñoso no removido durante el despepitado, cardado o lavado. El principal proceso en uso ahora es un blanqueado de peróxido de hidrógeno alcalino. En muchos casos, especialmente cuando no se necesita una blancura muy alta, el blanqueado puede combinarse con lavado.

En los ejemplos posteriores se muestra que el paso de lavado puede llevarse a cabo usando la pectato ligasa o preparación de pectato ligasa de la presente invención, una temperatura de aproximadamente 50°C -80°C y un pH de aproximadamente 7 - 11, sustituyendo o suplementando así los agentes altamente cáusticos. Un proceso enzimático optimizado asegura una remoción alta de pectina y humectabilidad completa.

Degradación o modificación del material de la planta La enzima o preparación de enzima de acuerdo a la invención se usa preferentemente como un agente para la degradación o modificación de paredes celulares de la planta o cualquier material que contiene pectina, que se origina en las paredes celulares de la planta debido a la alta actividad de degradación de la pared celular de la planta de la enzima de la invención.

La enzima que degrada pectina de la presente invención podría usarse sola o junto con otras enzimas como glucanasas, pectinasas y/o hemicelulasas para mejorar la extracción de aceite de material vegetal rico en aceite, como aceite de soya de los frijoles de soya, aceite de oliva de las olivas o aceite de colza de la semilla de colza o aceite de girasol del girasol.

La enzima que degrada pectina de la presente invención podría usarse para la separación de componentes de materiales celulares de la planta. De particular interés es la separación de material vegetal rico en azúcar o almidón en componentes de interés comercial considerable (como sacarosa de remolacha azucarera o almidón de papa) y componentes de bajo interés (como pulpa o fracciones de cascara) . También, de particular interés es la separación de cosechas ricas en proteína o ricas en aceite en fracciones valiosas de proteína y aceite o no valiosas de cascara. Los procesos de separación podrían realizarse mediante el uso de métodos conocidos en el arte.

La enzima que degrada pectina de la invención también podría usarse en la preparación de jugo de fruta o vegetal para aumentar el rendimiento, y en la hidrólisis enzimática de varios materiales derivados de la pared celular de la planta, e.g. a partir de la producción de vino o jugo, o residuos agrícolas tal como cascaras de vegetales, cascaras de frijol, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de papa, y similares.

El material de la planta podría degradarse para mejorar diferentes tipos de procesamiento, facilitar la purificación o extracción de componentes diferentes de galactanas, como purificación de pectinas de cítricos, mejorar el valor alimenticio, disminuir la capacidad de enlace de agua, mejorar la degradabilidad en plantas de agua residual, mejorar la conversión de material de planta para ensilar, etc.

Por medio de una preparación de enzima de la invención es posible regular la consistencia y apariencia de fruta y vegetales procesados. La consistencia y apariencia se ha mostrado que es un producto de la combinación actual de enzimas usadas para el procesamiento, i.e. la especificidad de las enzimas con que se combina la pectato ligasa de la invención. Los ejemplos incluyen la producción de jugo claro e.g. de manzanas, peras o bayas; jugo obscuro estable e.g. de manzanas, peras, bayas, cítricos o tomates; y purés e.g. de zanahorias y tomates.

La enzima que degrada pectina de la invención podría usarse para modificar la viscosidad del material derivado de la pared celular de la planta. Por ejemplo, la enzima que degrada pectina podría usarse para reducir la viscosidad de la alimentación que contiene galactana y para promover el procesamiento de material viscoso que contiene galactana. La reducción de viscosidad podría obtenerse tratando el material de la planta que contiene galactana con una preparación de enzima de la invención bajo condiciones adecuadas, para degradación total o parcial del material que contiene galactana .

La enzima que degrada pectina puede usarse e.g. en combinación con otras enzimas para la remoción de sustancias pécticas de fibras de plantas. Esta remoción es esencial e.g. en la producción de fibras textiles u otros materiales celulósicos. Para este propósito el material de la fibra vegetal se trata con una cantidad adecuada de la enzima que degrada pectina de la invención bajo condiciones adecuadas para obtener degradación completa o parcial de sustancias pécticas asociadas con el material de fibra vegetal.

Aditivo de alimento para animal La enzima que degrada pectina de la presente invención podría usarse para la modificación de alimento para animal y podría ejercer su efecto ya sea in vitro (modificando los componentes del alimento) o in vivo. La enzima que degrada pectina es particularmente adecuada para adición a composiciones de alimento para animal que contienen altas cantidades de arabinogalactanas o galactanas, e.g. alimento que contiene material vegetal de soya, semilla de colza, leguminosa del género Lupi n us , etc. Cuando se adiciona al alimento la enzima que degrada pectina mejora significativamente el rompimiento in vivo del material de la pared celular de la planta, por medio de lo cual se logra una mejor utilización de los nutrientes de la planta por el animal. De este modo, se mejora la velocidad de crecimiento y/o relación de conversión de alimento (i.e. el peso del alimento ingerido con respecto a la ganancia de peso) del animal. Por ejemplo la galactana indigerible se degrada por medio de la pectina ligasa, e.g. en combinación con ß-galactosidasa, a galactosa o galactooligómeros que son digeribles por el animal y contribuye así a la energía disponible del alimento. También , por degradación de galactana, la pectato ligasa podría mejorar la digestibilidad y toma de constituyentes del alimento que no son carbohidratos tal como proteína, grasa y minerales .

Para mayor descripción se hace referencia a PCT/DK 96/00443 y se trabaja un ejemplo aquí.

Procesamiento de vino y jugo La enzima o preparación de enzima de la invención podría usarse para des-pect inización y reducción de la viscosidad en jugo de vegetales o frutas, especialmente en jugo de manzana y pera. Esto podría realizarse tratando el jugo de frutas o vegetales con una preparación de enzima de la invención, en una cantidad efectiva para degradar el material que contiene pectina contenido en el jugo de frutas y vegetales.

La enzima o preparación de enzima podría usarse en el tratamiento de trituración de frutas y vegetales para mejorar la extractabilidad o degradabilidad del triturado. Por ejemplo, la preparación de enzima podría usarse en el tratamiento de trituración de manzanas y peras para producción de jugo, y en el tratamiento del triturado de uvas para la producción de vino.

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD CATALÍTICA DE ENZIMAS QUE DEGRADAN PECTINA La prueba de viscosidad APSU Unidades APSU: La prueba de unidad APSU es una medición de la viscosidad que usa el sustrato de ácido poligalacturónico sin adicionar calcio.

El sustrato de sal sódica de ácido poligalacturónico al 5% (Sigma P-1879) se solubiliza en amortiguador de glicina 0.1 M de pH 10. El sustrato de 4 ml se preincuba durante 5 min a 40°C. La enzima se adiciona (en un volumen de 250 µl) y se mezcla durante 10 seg en un mezclador a velocidad máxima, después se incuba durante 20 min a 40°C. Para una curva estándar de doble determinación de una dilución de la concentración de enzima en el intervalo de 5 APSU/ml a aproximadamente 100 APSU/ml, con mínimo de 4 concentraciones entre 10 y 60 APSU por ml . La viscosidad se mide usando un MIVI 60 de la compañía Sofraser, 45700 Vi llemandeur, France. La viscosidad se mide como mV después de 10 seg.

Para el cálculo de unidades APSU se usa una dilución estándar de la enzima, como se describió antes, para obtener una curva estándar: APSU/ml mV 0.00 300 4.00 276 9.00 249 14.00 227 19.00 206 24.00 188 34.00 177 49.00 163 99.00 168 El programa GrafPad Prism, que usa un ajuste no lineal con una disminución de la fase exponencial con una meseta, se usó para los cálculos. La meseta más extendida es la obtenida mV sin enzima. La meseta es la mV de más de 100 APSU y la reducción de la mitad de la viscosidad en ambos ejemplos se encontró que es de 12 unidades APSU con un error estándar de 1.5 APSU.

La prueba de ligasa (a 235 nm) Para la determinación de la ß-eliminación se llevó a cabo una prueba que mide el incremento en la absorbancia a 235 nm, usando el sustrato de sal sódica de ácido poligalacturónico al 0.1% (Sigma P-1879), solubilizado en amortiguador de Glicina 0.1 M de pH 10. Para el cálculo de la velocidad catalítica un aumento de Absorbancia de 5.2 a 235 unidades por min corresponde a la formación de 1 µmol del producto saturado (Nasuna and Starr (1966) J. Biol. Chem. Vol 241 página 5298-5306; y Bartling, Wegener and Olsen (1995) Microbiology Vol 141 página 873-881).

Condición de estado estable que usa una cubeta de 0.5 ml con una ruta de luz en un espectrofotómetro de arreglo de diodo HP en un contenedor de cubeta de temperatura controlada con medición continua de la absorbancia a 235 nm. Para estado estable se usa un incremento lineal de al menos 200 seg, para el cálculo de la velocidad. Se usó para convertir la formación a µmol de producto por min.

Prueba de Agar La actividad pectato ligasa puede medirse aplicando una solución de prueba a orificios de 4 mm horadados en placas de ágar (tal como, por ejemplo ágar LB) , que contenía 0.7% p/v de poligalacturonato de sodio (Sigma P 1879). Las placas se incubaron después durante 6 h a una temperatura particular (tal como, e.g., 75°C) . Las placas se lavaron después ya sea en (i) CaCl2 ÍM durante 0.5 h o (ii) alquil trimetilamonio Br mezclado al 1% (MTAB, Sigma M-7635) durante 1 h. ambos procedimientos causan la precipitación de poligalacturonato en el ágar. La actividad pectato ligasa puede detectarse por la apariencia de zonas claras en un antecedente de poligalacturonato precipitado. La sensibilidad de la prueba se calibra usando diluciones de una preparación estándar de pectato ligasa.

Análisis de punto final - Transeliminación a 235 nm para Pectato Ligasas (método se Calcio alto : Calcio ImM en la mezcla de incubación final) En este método, el sustrato y enzima se incuban durante 20 min a 37rC seguido por la medición a 235 nm de la formación de dobles enlaces. Finalmente, la velocidad de la degradación se calcula en base al coeficiente de extinción molar en términos de Unidades Trans . Procedimiento: Mezclar 0.5 ml de la dilución de enzima con 0.5 ml de solución 2*sustrato. Sustrato: Ácido poligalacturónico de Sigma P-1879 lote 77H3784 Amortiguador 2x : Glicina 0.1M a pH 10 + 2.0 mmol de CaCl2 Reactivo de paro: H3P04 0.02M Temperatura de incubación 37°C Tiempo de reacción 20 min. Coeficiente de extinción de la transeliminación de 0.0052 µmol cirT1 Enzima diluida en agua desionizada a 0.5 a 5 APSU por ml . Valor principal en duplicado 0.5 ml . El sustrato al 2% p/v en 2x amortiguador se mezcla con 0.5 ml de la enzima diluida. Ambos pre-incubados 5 min en baño de agua a 37°C. Incubar durante 20 min. Parar usando 5 ml de reactivo de paro y mezclar. Blanco mezclar enzima y reactivo de paro primero, y después adicionar todo el sustrato en el mismo volumen. Enzima 0.5 ml Sustrato 0.5 ml Paro 5 ml Volumen total 6 ml Medir la absorbancia a 235 nm en una cubeta de 1 cm. Calcular la formación de transeliminación por min usando el coeficiente de extinción de 0.0052 µmol cm"1 Cálculo: [(principal más principal) /2 - Blanco] 0.0052*6*2*dilución de la Enzima/20 min/1000 ml = µmol por min.

Análisis de punto final - Transeliminación a 235 nm para Pectina Ligasas a pH 9.0 El método se lleva a cabo como se describió antes para el análisis de Punto final - Transeliminación a 235 nm para Pectato Ligasas (método de Calcio alto) pero usando el siguiente sustrato y amortiguador: Sustrato: Pectina esterificada de Cítrico de Sigma P-9561 lote 125H0123. Amortiguador 2x: Borato 0.1M a pH 9.0, EDTA 5 mM.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas Ba cill us l i cheniformi s ATCC 14580. B . subtil i s PL2306. Esta cepa es el B. subtilis DN1885 con genes apr y npr rotos (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sj0holm, C. (1990) Cloning of aldB, wich encodes alpha-acetolactate decarboxylase exoenzyme from Bacillus brevis. J.

Bacteriol., 172, 4315-4321), rotos en la unidad transcripcional del gen celulasa conocido de Bacillus subtilis, que resulta en células celulasa negativas. La ruptura se realizó esencialmente como se describe en (Eds. A.L. Sonensheim, J.A. Hoch and Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Socíety for microbiology, p. 618) .

Las células competentes se prepararon y se transformaron como se describe por Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilís: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121:296-304.

Plásmidos pMOL944: Este plásmido es un derivado de pUBUO, que contiene esencialmente elementos que hacen al plásmido propagable en Bacillus subtilis , gen de resistencia a canamicina, y tiene un promotor fuerte y péptido señal clonado del gen amyL de B. licheniformis ATCC14580. El péptido señal contiene un sitio SacII que hace conveniente clonar el ADN que codifica la parte madura de una proteína en-fusión con el péptido señal. Esto resulta en la expresión de una Pre-proteína que se dirige hacia el exterior de la célula.

El plásmido se construye por medio de técnicas de ingeniería genética convencionales que se describen brevemente como sigue.

Construcción de pMOL944: El plásmido pUBllO (McKenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15:93-10) se digirió con la enzima de restricción única Ncil. Un fragmento amplificado por PCR a partir del promotor de amyL, codificado en el plásmido pDN1981 (P.L. Jargensen et al., 1990, Gene, 96, p37-41.) Se digirió con Ncil y se insertó en el pUBllO digerido con Ncil para dar el plásmido pSJ2624.

Los dos cebadores de PCR usados tienen las siguientes secuencias: # LWN5494 5 • -GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3 ' # LWN5495 5 ' -GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAA TGAGGCAGCAAGAAGAT -3' El cebador #LWN5494 inserta un sitio Notl en el plásmido . El plásmido pSJ2624 se digirió después con Sacl y Notl y un nuevo fragmento PCR amplificado en el promotor amyL codificado en el pDN1981 se digirió con Sacl y Notl, y este fragmento de ADN se insertó en el pSJ2624 digerido con Sacl-Notl para dar el plásmido pSJ2670.

Esta clonación reemplaza el primer promotor de amyL clonado con el mismo promotor pero en dirección opuesta. Los dos cebadores usados para la amplificación PCR tienen las siguientes secuencias: #LWN5983 5 * -GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATG AGGCAGCAAGAAGAT -3* #LWN5939 5 ' -GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3' El plásmido pSJ2670 se digirió con las enzimas de restricción PstI y Bcll y un fragmento PCR amplificado de una secuencia de ADN clonado, que codifica la amilasa alcalina SP722 (descrita en la Solicitud de Patente Internacional publicada como W095/26397, que se incorpora aquí por referencia en su integridad) se digirió con PstI y Bcll, y se insertó para dar el plásmido pMOL944. Los dos cebadores usados para la amplificación PCR tienen la siguiente secuencia: #LWN7864 5 ' -AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3 ' #LWN7901 5 ' -AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3 * El cebador #LWN7901 inserta un sitio SacII en el plásmido .

Métodos generales de biologia molecular A menos que se mencione lo contrario las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos de biología molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (Eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).

Las enzimas para manipulaciones de ADN se usaron de acuerdo a las especificaciones de los proveedores (e.g. endonucleasas de restricción, ligasas, etc., se obtienen de New England Biolabs, Inc.).

Medios TY (como se describe en Ausubel, F.M. et al. (eds.), "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995) . Ágar LB (como se describe en Ausubel, F.M.. et al. (eds.), "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995). LBP6 es ágar LB suplementado con 0.5% de Glucosa y fosfato de potasio 0.05 M, pH 7.0 Medio BPX se describe en EP 0 506 780 (WO 91/09129) .

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Clonación, expresión, purificación y caracterización de una pectato ligasa (II) de Baclllus lichenlformis Preparación de ADN senómico La cepa de Ba cil l us l i cheni formi s ATCC 14580 se propagó en medio líquido 3 como se especifica por ATCC (American Type Culture Collection, USA) . Después de 18 horas de incubación a 37nC y 300 rpm, las células se cosecharon, y se aisló el ADN genómico por el método descrito por Pitcher et al. (Pitcher, D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J. (1989) . Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).

La pectato ligasa II ( vi de supra , representada por la secuencia de aminoácido SEC ID NO : 8 ) que codifica la secuencia de ADN de la invención se amplificó por PCR usando el grupo de cebadores PCR, que consiste de estos dos oligonucleótidos: Pecl.B.lich. upper. Sacl I 5' -CTA ACT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCC TTA AAC TCG GGC -3* Pecl.B.Lich. lower. Notl 5 ' -GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT GAA TGC CCC GGA CGT TTC ACC -3 ' Los sitios de restricción SacII y NotlI son los subrayados.

El ADN cromosomal aislado de B . li ch eni formi s ATCC 14580 como se describió antes, se usó como molde en una reacción PCR usando Polimerasa de ADN Amplitaq (Perkin Elmer) , de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La reacción de PCR se produjo en amortiguador de PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.01% (p/v) de gelatina) que contenía 200 µM de cada dNTP, 2.5 unidades de polimerasa AmpliTaq { Perkin-Elmer , Cetus, USA) y 100 pmol de cada cebador.

Las reacciones de PCR se realizaron usando ciclador térmico de ADN (Landgraf , Alemania) . Una incubación a 94°C durante 1 min seguido por tres ciclos de PCR realizados usando un perfil de ciclo de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, alineación a 60°C durante 1 min, y extensión a 72°C durante 2 min. Se analizaron alícuotas de 5 µl del producto de amplificación por electroforesis en geles de agarosa al 0.7% (NuSieve, FMC) . La apariencia de un fragmento de ADN de 1.0 kb de tamaño indicó la amplificación apropiada del segmento del gen.

Subclonación de fragmentos PCR Alícuotas de cuarenta y cinco µl de los productos PCR generados como se describió antes se purificaron usando el estuche de purificación QIAquick PCR (Qiagen, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se e-luyó en 50 µl de Tris-HCl 10 mM, pH 8.5. 5 µg de pMOL944 y veinticinco µl del fragmento PCR purificado se digirieron con SacII y Notl, se sometieron a electroforesis en geles de agarosa de temperatura de gelificación baja al 0.8% (SeaPlaque GTG, FMC), los fragmentos relevantes se cortaron de los geles, y se purificaron usando el Estuche de extracción QIAquick Gel (Qiagen, EU) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN por PCR aislado se ligó después al pMOL944 digerido con SacII-Notl y purificado. La ligación se realizó toda la noche a 16°C usando 0.5 µg de cada fragmento de ADN, 1 U de T4 ADN ligasa y amortiguador T4 ligasa (Boehringer Manheim, Alemania) .

La mezcla de ligación se usó para transformar PL2306 de B . sub ti l i s competentes. Las células transformadas se colocaron en placas en placas de LBPG de 10 µg/ml de Canamicina. Después de 18 horas de incubación a 37°C varios clones se volvieron a picar en placas de ágar fresco y también se crecieron en cultivos de TY líquido con 10 µg/ml de canamicina y se incubaron toda la noche a 37°C. Al día siguiente se usaron 1 ml de células para aislar el plásmido de las células que usan Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106 de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes para las preparaciones del plásmido de B . sub ti l i s . Este ADN del plásmido se usó como molde para la secuenciación de ADN.

Se guardó un clon que contenía el gen de pectato ligasa, este clon se denominó MB541.

El ADN que corresponde a la parte madura de la pectato ligasa se caracterizó por secuenciación de ADN por medio de avance del cebador, usando el estuche de ciclo de secuenciación desoxi-terminal con Taq (Perkin-Elmer, USA) , terminadores con marca fluorescente y oligonucleótidos apropiados como cebadores.

El análisis de los datos de la secuencia se realizó de acuerdo a Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395. La secuencia de ADN clonada se expresó en B . subti l i s y la proteína que apareció en el sobrenadante corresponde a la proteína madura representada en la SEC ID NO : 8.

Purificación MB541 se creció en 25 x 200 ml de medio BPX con 10 µg/ml de Canamicina en dos matraces agitados con bafles de 500 ml durante 5 dias a 37°C a 300 rpm, de lo que se obtuvo 3500 ml de caldo de cultivo. El pH se ajustó a 5.0 usando ácido acético y 100 ml de agente catiónico (C521) y 200 ml de agente aniónico (A130) se adicionaron durante la agitación para floculación. El material floculado se separó por centrifugación usando una centrífuga Sorval RC 3B a 10000 rpm durante 30 min a 6°C . El sobrenadante resultante contuvo 370 APSU por ml en un volumen total de 3600 ml .

El sobrenadante se clarificó usando filtras de vidrio Whatman GF/D y C, y finalmente se concentró en una membrana de filtro UF con un corte de 10 kDa. El volumen total de 2000 ml se ajustó a pH de 8.5. 50 gramos de DEAE A-50 Sephadex (Pharmacia) se dilataron en 2000 ml de Tris 50 mM a pH 8.5. Se desechó el amortiguador de exceso y la solución de enzima concentrada clara se mezcló con la suspensión durante 15 min. La enzima se separó del material de intercambio iónico por succión en un embudo Buchner. La solución resultante se concentró en un filtro que se cortó de 10 kDa hasta un volumen final de 800 ml .

Para obtener una pectato ligasa altamente purificada se realizó un paso final de cromatografía de intercambio catiónico usando S-sefarosa. 50 ml de la solución de 950 APSU por ml (ver antes) se ajustó a pH 5.0 usando ácido acético. Se aplicó a una columna de 50 ml que contenía S-Sepharose (Pharmacia) equilibrada con un amortiguador de acetato de sodio 50 mmol de pH 5.0. La pectato ligasa enlazado se eluyó usando un gradiente de cloruro de sodio 0.5 M.

Caracterización La enzima pura dio una sola banda en SDS-PAGE de 35 kDa y un punto isoeléctrico de alrededor de 6.1.

La concentración de proteína se determinó usando un coeficiente de extinción molar de 57750 (basado en la composición de aminoácido deducida de la secuencia) .

Usando la prueba de detección, la formación de corte por la formación de un doble enlace que puede medirse a 235 nm, se obtuvieron los siguientes resultados 1. (condiciones: pH 10; amortiguador de glicina; sin calcio; ácido poligalacturónico Sigma P-1879 como sustrato) : 1 µmol por min por mg . 2. (Condiciones: pH 10; amortiguador de glicina; sin calcio; DE 35 (35% de pectina esterificada) como sustrato) : 4 µmol por min por mg .

La enzima pura se dializó contra EDTA a pH 8.0 (Tris 20 M pH 8.0, y a pH 10 (Glicina 20 mM pH 10) y la enzima se analizó en dicroismo Circular, no se vieron diferencias en el espectro con y sin EDTA.

La Calorimetría de Barrido Diferencial DSC de las 4 muestras demostró que la enzima fue más estable a pH 8.0 con una temperatura de fusión de alrededor de 70°C en tris pH 8.0 y 75°C después de hacer diálisis otra vez con EDTA. A pH 10 la enzima fundió a 55°C con y sin EDTA.

La actividad catalítica de la pectato ligasa se inhibió por la presencia de EDTA durante la incubación con sustrato, pero la enzima dializada otra vez contra EDTA fue aún activa si se omitió EDTA durante la incubación con sustrato. El catión divalente como Fe++, Li++, Mg++, Cu++, Mn++ no tiene efecto en la actividad catalítica .

La actividad de ß-transeliminación (usando la prueba de ligasa a 235 nm) a diferentes valores de pH se determinó como cinética de estado estable a 40°C, usando los siguientes amortiguadores: pH 6.0: Na-MES 0. ÍM pH 6.5, 7.0 y 7.5: Na-MOPS 0. ÍM pH 8.0 y 8.5: Tris 0. ÍM pH 9.0, 9.5, 10.0 y 10.5: Na-glicina 0. ÍM pH: 11-11.5: Na-Carbonato 0. ÍM MES: De SIGMA número M-8250 (ácido 2 [N-Morfolino] etan sulfónico ) .

MOPS: De SIGMA número M-1254 (ácido 3- [N-Morfolino] propan sulfónico) . Tris: De Merck No. 1.08382 na de MERCK y carbonato de sodio de Merck No.

La actividad relativa (velocidad) se calcula como porcentaje de la actividad óptima, se obtuvo el siguiente resultado: pH % de actividad • 6.5 1 7 5 7.5 4 4 8.5 4 15 9 6 9.5 23 10 100 10.5 n.d. 11 52 20 11.2 0 Correspondientemente, se encontró la actividad relativa a diferentes temperaturas (a pH 10): temp . °C % de actividad 40 65 50 87 55 87 60 100 65 90 Actividad en detergentes: Usando detergentes comerciales en vez de amortiguador, e incubación durante 20 min. a 40°C con sal sódica de ácido Poligalacturónico (Sigma P-1879), seguido por la determinación de azúcares reductoras, la enzima fue activa en detergente en polvo comercial Europeo Ariel Futur, con 44% de actividad relativa, Tide de EU en polvo comercial con 51% de actividad relativa y en Tide en detergente líquido comercial de EU con 30% de actividad relativa, para una actividad medida en amortiguador de Glicina. La concentración de detergente como la recomendada para usar y el agua tomada del chorro de agua con 18 grados de dureza Alemana de acuerdo a las condiciones Europeas y 9 grados de acuerdo a las condiciones de EU.

Propiedades inmunológicas: En la compañía Danesa DAKO, el suero monoespecí fico policlonal de conejo se enjuagó contra la pectato ligasa altamente purificada usando técnicas convencionales. El suero formó un buen precipitado simple en geles de agarosa con la pectato ligasa de la invención y solo un arco de precipitación contra los productos crudos de Ba ci l l us l i ch eni formi s , como Pulpzyme HC lote no. CKF0054 o lote no. CKN00009 de Novo Nordisk A/S.

EJEMPLO 2 Clonación, expresión, purificación y caracterización de una pectato ligasa (I) de Baclllus llchenl fonal s • Preparación de ADN Genómico La cepa ATCC 14580 se propagó en medio líquido 3 como se especifica por ATCC (American Type Culture Collection, USA). Después de 18 horas de incubación a 37°C y 300 rpm, las células se cosecharon, y se aisló el ADN genómico por el método descrito en Pitcher et al. [Pitcher, D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol.. 1989 8 151-156] .

Definición de la secuencia de la invención La secuencia se define por los dos siguientes cebadores que pueden usarse en una reacción subsecuente de PCR para amplificación del marco de lectura completo de la pectato ligasa de la invención: Pecl3.orf . PstI 5* -CAC ATC TGC AGC ATG AAG AGA TTA GCA GGT ACG GTT ATT TTG TC-3 ' PecI3. Licheniformis . lower. Notl 5'- CTC ATC ATG CGG CCG CAG GGG CCT TTA TTT GCA ATC AGT G -3' .

Los sitios de restricción para fines de clonación son los subrayados.

El orf completo puede clonarse usando los cebadores anteriores en una PCR llevada a cabo como se describe en el ejemplo 1. La apariencia de un fragmento de ADN de 0.7 kb de tamaño indica una amplificación propia del segmento del gen. Este fragmento de ADN puede clonarse en cualquier vector adecuado para clonación en E . col i , B . subtil i s u otros. El fragmento se clona como un fragmento PstI-Notl. Cuando se realiza la secuenciación de ADN del fragmento de PCR o fragmento clonado, el marco de lectura abierto de la secuencia de ADN que así aparece se muestra en la SEC ID No. 3.

Subclonación v expresión de Pectato ligasa en B . subtilis La secuencia de ADN que codifica la Pectato. ligasa (SEC ID NO: 3) de la invención se amplificó por PCR usando el conjunto de cebadores de PCR que consiste de estos dos oligonucleótidos: Pecl3. Licheniformis . upper . Pst I 5' -CAC ATC TGC AGC CGC GGC AGC CGA GGT CGT TCA CAÁ AAC G -3' Pee13. Licheniformis . lower .Notl 5'- CTC ATC ATG CGG CCG CAG GGG CCT TTA TTT GCA ATC AGT G -3'.

Los sitios de restricción PstI y Notl son los subrayados .

El ADN cromosomal aislado de Ba cill us l i ch eni formi s como se describió antes, se usó como molde en una reacción de PCR llevada a cabo como se describió en el ejemplo 1. La apariencia del fragmento de ADN de 0.6 kb de tamaño indicó amplificación apropiada del segmento del gen.

La subclonación del fragmento de PCR se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 1, excepto que el* fragmento de PCR purificado se digirió con PstI y Notl. Se analizaron varios clones aislando el ADN del plásmido del caldo de cultivo toda la noche.

Tal clon positivo se volvió a picar varias veces en placas de ágar como se usó antes, este clon se llamó MB750. El clon MB750 se creció toda la noche en TY-10 µg/ml de canamicina a 37°C, y al siguiente día 1 ml de células se usaron para aislar el plásmido de las células usando el Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106, de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes para preparaciones de plásmido de B . subti l i s . Este ADN fue ADN secuenciado, y reveló la secuencia de ADN que corresponde a la parte madura de la Pectato ligasa, i.e. posiciones 85-666 de pb de la secuencia SEC ID NO: 3 anexada. La secuencia de la proteína derivada se lista en la SEC ID NO: 4.

Fermentación y purificación El clon MB 750, obtenido como se describió antes, se creció en 200 ml de medio BPX con 10 µg/ml de Canamicina en dos matraces de agitación con bailes de 500 ml durante 5 días a 37°C a 300 rpm.

La floculación se hizo usando el agente de floculación catiónico C521 (solución al 10%) y solución al 0.1% de agente aniónico A130: A 1300 ml de medio de fermentación a pH 6.0, se adicionaron 10 ml de C521 (10%) simultáneamente con 20 ml de A130 (0.1%) bajo agitación a temperatura ambiente. El material floculado se separó por centrifugación usando una centrífuga Sorval RC 3B a 10,000 rpm durante 30 min. El líquido se concentró en 200 ml usando filtro de ultrafiltración con un PM cortado de 10 kDa. Este producto se usó para las pruebas de aplicación después de la estabilización usando Glicerol al 40% (lote #9845 que contenía 193 Unidades Trans por ml o 1.97 mg de pectato ligasa activa por ml ) .

La enzima altamente purificada se obtuvo usando columna de S-Sepharose para cromatografía catiónica a pH 5.5, usando un amortiguador de Acetato de Sodio 25 mM) la enzima se eluyó usando un gradiente de NaCl, el paso de purificación final fue una cromatografía de volumen en una columna Superdex 200 corrida en un amortiguador de acetato de sodio 0.1 M.

Caracterización La enzima pura tiene un PM de 22 kDa y un pl de 6.2." La temperatura óptima (actividad relativa) a pH 10 es de 40°C.

La actividad relativa es más alta de 50% entre pH 9.5 y 10.5 a una temperatura de 40°C.

El DSC de la enzima a pH 6.0 dio una temperatura de desenrollamiento de 61°C.

El término N de la pectato ligasa purificada tiene la siguiente secuencia: AEVVHKTIV (empezando en la posición 29 de la secuencia aminoácido de la SEC ID NO: 4) . Esta enzima pertenece a la familia 3 de las polísacárido ligasas.

EJEMPLO 3 Clonación, expresión, purificación y caracterización de una pectina ligasa (III) de Baclllus lichenl forzáis Clonación del gen que codifica la pectina ligasa de Bacillus llcheniformls Subclonación v expresión de una pectina ligasa de B . l i cheniformi s en B . subti l i s La secuencia de ADN que codifica pectina ligasa de la SEC ID no. 1 de la invención se amplificó por PCR usando el conjunto de cebadores de PCR que consiste de los siguientes oligonucleótidos: Pect . upper . PstI 5' -CAT AAA TCT GCA GCC GCG GCA GCA AAC GAA GAT TAT CCG GAA C - 3 ' Pect. lower. Notl 5' -GAA AGG AAA AGC GGC CGC CAÁ ATA TTG AAA AGT GAG CGC AAT GTC G -3 ' Los sitios de restricción PstI y Notl son los subrayados .

El ADN cromosomal aislado de Ba ci l l us l i ch eni formi s como se describió antes se usó como molde en una reacción de PCR, realizada como se describió en el ejemplo 1. La apariencia apropiada de una fragmento de ADN de tamaño aproximado de 1.5 kb indicó la amplificación apropiada del segmento del gen.

'Subclonación del fragmento de PCR La subclonación se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 1, excepto que el fragmento de PCR purificado se digirió con PstI y Notl. Se analizaron varios clones aislando el ADN del plásmido del caldo de cultivo toda la noche.

Tal clon positivo se volvió a picar varias veces en placas de ágar como se usó antes, este clon se llamó MB588. El clon MB588 se creció toda la noche en TY-10 µg/ml de canamicina a 37°C, y al siguiente día 1 ml de células se usaron para aislar el plásmido de las células usando el Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106, de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes para preparaciones de plásmido de B . subti l i s . Este ADN fue ADN secuenciado, y reveló la secuencia de ADN que corresponde a la parte madura de la Pectina en la secuencia de ADN SEC ID NO: 1 anexada y que corresponde a la secuencia de proteína en la secuencia de proteína SEC ID NO: 2 anexada.

Fermentación v purificación El clon MB588, obtenido como se describió antes, se creció en 25 x 200 ml de medio BPX con 10 µg/ml de Canamicina en dos matraces de agitación con bafles de 500 ml durante 5 días a 37°C a 300 rpm.

La floculación se hizo usando el agente de floculación catiónico C521 (solución al 10%) y solución al 0.1% de agente aniónico A130: A 2000 ml de medio de fermentación a pH 6.0, se adicionaron 20 ml de C521 (10%) simultáneamente con 40 ml de A130 bajo agitación a temperatura ambiente. El material floculado se separó por centrifugación usando una centrífuga Sorval RC 3B a 10,000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se clarificó usando filtro de vidrio Whatman número F.

El líquido se concentró en 300 ml, usando filtro de ultrafiltración con un PM cortado de 10 kDa, que contenía 2,262,000 Unidades Trans de Pectina. El filtrado se ajustó a pH 5.5 usando ácido acético y se aplicó a columna de S-Sepharose equilibrada con acetato de sodio 50 mM pH 5.5. La pectina ligasa se enlazó y se eluyó como una proteína pura usando un gradiente de NaCl.

Caracterización La enzima pura tiene un PM de 55 kDa y un pl de 9.3.

La actividad relativa es más alta de 50% entre pH .5 y 9.3 a una temperatura de 40°C (la pectina no estable esterificada arriba de 9.3) Esta enzima pertenece a la familia 1 . de las polisacárido ligasas.

EJEMPLO 4 Construcción y expresión de la proteína de fusión entre Pectato ligasa y CBD La secuencia de ADN que codifica CBD del gen CipB de Cl os tri di um thermocel l um cepa YS (Poole D M; Morag E; Lamed R; Bayer EA; Hazlewood GP; Gilbert HJ (1992) Identification of the cellulose binding domain of the cellulosome subunit Sl from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp . 181-186, se amplificó usando el conjunto de cebadores de PCR que consiste de los siguientes dos oligonucleótidos: CIPCBD. upper. PECL. Salí 5' -CGA CAÁ TGT CGA CAÁ TGT AAA ATC AAT CGT CAÁ GCA AAA TGC CGG AGT CGG CAÁ AAT CCA GCG CAG ACC GCC AAC ACC GAC CCC GAC TTC ACC GCC AAG CGC AAA TAC ACC GGT ATC. AGG CAÁ TTT G -3' CIPCBD. lower. Notl 5 ' -GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT ATA CCA CAC TGC CAC CGG GTT CTT TAC-3 ' Los sitios de restricción Salí y Notl son los subrayados .

El ADN cromosomal que codifica el CBD puede obtenerse como se describe en Poole D M; Morag E; Lamed R; Bayer EA; Hazlewood GP; Gilbert HJ (1992) Identification of the cellulose-binding domain of the cellulosome subunit Sl from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp . 181-186. Una muestra de ADN que codifica el CBD se usó como molde en una reacción de PCR llevada a cabo como se describe en el ejemplo 1. La apariencia de un fragmento de ADN de tamaño aproximado de 0.5 kb indicó la amplificación apropiada del segmento deL gen.

Subclonación del fragmento de PCR La subclonación se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 1, excepto que el fragmento de PCR purificado se digirió con Salí y Notl. Se analizaron varios clones aislando el ADN del plásmido del caldo de cultivo toda la noche.

Tal clon positivo se volvió a picar varias veces en placas de égar como se usó antes, este clon se llamó MB914. El clon MB914 se creció toda la noche en TY-10 µg/ml de canamicina a 37°C, y al siguiente día 1 ml de células se usaron para aislar el plásmido de las células usando el Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106, de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes para preparaciones de plásmido de B . subtili s . Este ADN fue ADN secuenciado, y reveló la secuencia de ADN que corresponde a la proteína de fusión de: Pectato ligasa-enlazador-cbd, como se representa en la SEC ID NO: 9 y en la secuencia de proteína SEC ID NO: 10 anexada.

Expresión y detección de la proteína de fusión Pectato-ligasa-cbd MB914 se incubó durante 20 horas en medio TY a 37°C y 250 rpm. 1 ml de sobrenadante libre de células se mezcló con 200 µl de Avicel al 10% (Merck, Darmstadt, Alemania) en Millipore H20. La mezcla se dejó durante s hora de incubación a 0°C. Después de esto se enlazó la proteína de fusión Pectato ligasa-Enlazador-CBD a Avicel, el Avicel con la proteína enlazada se moldeó por centrifugación 5 min a 5000 g. El paquete se resuspendió en 100 µl de amortiguador SDS-page, hirvió a 95°C durante 5 min, se moldeó por centrifugación durante 5 min y se cargaron 25 µl en un Laemli Tris-Glicina al 4-20%, gel SDS-PAGE NOVEX {Novex, EU) . Las muestras se sometieron a electroforesis en un' Xcell™ Mini-Cell (Novex, EU) como se recomienda por el fabricante, todo el manejo subsecuente de los geles que incluyen teñido con comassie, desteñido y secado se realizó como se describe por el fabricante.

La apariencia de una banda de proteína de aprox. 55 kDa, indicó la expresión en B . subti li s de la fusión Pectato ligasa-Enlazador-CBD codificada en el plásmido ?MB914.

EJEMPLO 5 Tratamiento con Pectato Ligasa de Material Celulósico : Efecto de la Temperatura en la Remoción de Pectina y Humectabilidad Una tela tejida en diagonal de 100% de algodón, Prueba de Tela desencolada #428U, que representa un material celulósico típico, se trató con una solución de enzima acuosa que contenía la pectato ligasa de B . li ch eni formi s del ejemplo 1, se dosificó a 9 APSU/g de tela a pH 9 y a una relación de 15:1 de licor. El tiempo de tratamiento fue de 2 horas y la temperatura se varió entre 35-75°C. La tela se enjuagó bien después del tratamiento con enzima, se secó y después se tiñó con Rojo de Rutenio. La toma de tinte se midió espectrofotométricamente y es una medida de la pectina residual en la fibra. El porcentaje de pectina residual se calculó usando la toma de tinte del material inicial como 100% de pectina residual, y la de la tela lavada completamente con químico y blanqueada como 0% . Los resultados se muestran en la Tabla 6. Además, la humectabilidad (prueba de gota - que el tiempo en segundos para que una gota de agua se llegue a absorber por la tela) se midió y se comparó a un control sin enzima. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 6 (% de pectina residual) un lavado alcalino deja típicamente 20-25% de pectina residual Tabla 7 - la humectabilidad blanco es típicamente < 5 segundos _ El efecto benéfico de aumentar la temperatura se ve claramente en ambas respuestas.

EJEMPLO 6 Tratamiento de Pectato Ligasa de Material Celulósico : Efecto de pH en la remoción de Pectina Una tela tejida en diagonal de 100% de algodón, Prueba de Tela desencolada #428U, que representa un material celulósico típico, se trató con una solución de enzima acuosa que contenía la pectato ligasa de B . l i cheni formi s del ejemplo 1, se dosificó a 9 APSU/g de tela a una relación de 15:1 de licor. El tiempo de tratamiento fue de 2 horas y la temperatura de 55°C. El pH se varió entre 8-11. La tela se enjuagó bien después del tratamiento con enzima, se secó y después se tiñó con Rojo de Rutenio. La toma de tinte se midió espectrofotométricamente y es una medida de la pectina residual en la fibra. El porcentaje de pectina residual se calculó usando la toma de tinte del material inicial como 100% de pectina residual, y la de la tela lavada completamente con químico y blanqueada como 0%. Los resultados se muestran en la Tabla 8: Tabla 8 El pH óptimo se encontró que es a ap . 9.5, pero una buena actividad se demuestra en un intervalo alcalino muy amplio.

EJEMPLO 7 Uso de la enzima de la invención en detergentes La enzima purificada obtenida como se describió en el ejemplo 1 (lote 9751) mostró funcionamiento de limpieza mejorado cuando se probó a un nivel de 1 ppm, en una prueba de inilavado usando un detergente líquido comercial. La prueba se llevó a cabo bajo condiciones de lavado convencionales de Norte América.

EJEMPLO 8 Efecto de carbohidrasas en telas de algodón manchadas con plátano Método Tres plátanos se machacaron y se homogeneizaron en un Ultra Turrax con 40 ml de agua. El algodón Style 400 (Testfabrics, Inc.) se remojó en la solución, se exprimió entre dos rodillos y se secó toda la noche.

La tela de algodón manchada se lavó en el detergente líquido comercial de marca Ariel Futur Liquid bajo condiciones de lavado Europeas, con una adición de 0.1 ppm, 0.2 ppm, 1 ppm y 10 ppm respectivamente, de la pectato ligasa del ejemplo 1 al detergente líquido. La prueba se repitió.

Resultados Ariel líquido: % de remoción de las manchas de plátano (100% es la remoción total de la mancha) Prueba A Prueba B Sin enzima 26% 32% ppm de enzima, ej 1 59% 58% 1 ppm de enzima, ej 1 47% 48% 0.1 ppm de enzima, ej 1 35% 34% LITERATURA Lever, M. (1972) A new reaction for colormetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 47, 273-279.

N. C. Carpita and D. M. Gibeaut (1993) The Plant Journal 3:1-30.

Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sj0holm, C. (1990) Cloning of aldB, wich encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Ba cill us brevi s . J. Bacteriol. 172:4315-4321.

Sakai et al., Pectin, pectinase .and protopect inase : production, properties and applications, pp 213-294 en: Advances in Applied Microbiology vol:39, 1993.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

REI lNDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una preparación de enzima, caracterizada porque consiste esencialmente de una enzima que degrada pectina derivada de o endógena a Ba ci l l us li cheni formi s , ATCC 14580, o especies de Ba cil l us en las que todas las especies son preferentemente al menos 99% homologas a Ba cill us l i cheni formi s, basándose en las secuencias alineadas de 16s rADN.

2. La preparación de enzima de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzima que degrada pectina tiene su actividad óptima a pH más alto de 8, preferentemente a un pH más alto de 9.

3. La preparación de enzima de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzi a que degrada pectina se selecciona del grupo que consiste de pectato ligasas (EC 4.2.2.2), pectina ligasas (EC 4.2.2.10) y poligalacturonasas (EC 3.2.1.15).

4. Una pectato ligasa, caracterizada porque es i) un polipéptido producido por Ba ci l l us li cheniformi s, ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 28-341 de la SEC ID No. 8, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 45% homólogo con el polipéptido, o iv) se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que las argininas en la posición'233 y 238 se conserven y el polipépt ido, derivado sea al menos 42% homólogo con el polipéptido, o v) es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada .

5. Una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polípéptido que tiene actividad pectato ligasa, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID No: 7, del nucleótido 82 al nucleótido 1026,; b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 8 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 341; y c) secuencias de nucleótido degenerado de (a) o (b).

6. Una pectato ligasa, caracterizada porque es i) un polipéptido producido por Ba ci l l us li cheniformis, ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 28-221 de la SEC ID No. 4, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 60% homólogo con el polipéptido, o iv) se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que las usinas en las posiciones 133 y 155 y la arginina en la posición 158 se conserven y el polipéptido derivado sea al menos 66% homólogo con las posiciones 60-158 de la SEC ID NO: 4, o v) es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada .

7. Una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID No: 3, del nucleótido 82 al nucleótido 666; b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 4 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 221; y c) secuencias de nucleótido degenerado de (a) o (b).

8. Una pectina ligasa, caracterizada porque es i) un polipéptido producido por Ba ci ll us li cheniformi s, ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 31-494 de la SEC ID No. 2, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 60% homólogo con el polipéptido, o iv) se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que las argininas en las posiciones 377 y 383 respecto a la SEC ID NO : 2 se conserven y que el polipéptido derivado sea al menos 60% homólogo con el polipéptido, o es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada .

9. Una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad pectina ligasa, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID No: 1, del nucleótido 91 al nucleótido 1395; b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 2, del residuo aminoácido 31 al residuo aminoácido 494; y c) secuencias de nucleótido degenerado de (a) o (b) .

10. Una poligalacturonasa, caracterizada porque es i) un polipéptido producido por Ba cil l us li cheniformi s, ATCC 14580, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en las posiciones 1-415 de la SEC ID No. 6, o iii) un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos 40% homólogo con el polipéptido, o se deriva del polipéptido por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, o es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal cultivado contra el polipéptido de forma purificada.

11. Una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad poligalacturonasa, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID No: 5, del nucleótido 1 al nucleótido 1248; b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que es al menos 4 0 % idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 6, del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 415; y c) secuencias de nucleótido degenerado de (a) o (b) .

12. La molécula de polinucleótido aislada de conformidad con la reivindicación 5, 7, 9 u 11, caracterizada porque el polinucleótido es ADN.

13. Un vector de expresión caracterizado porque comprende los siguientes elementos enlazados operablemente: un promotor de transcripción; un segmento de ADN seleccionado del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID No: 7, del nucleótido 1 al nucleótido 1026 o como se muestra en la SEC ID NO: 3 del nucleótido 82 al nücleótido 666, (b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa, que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID No: 8 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 341, o a la SEC ID No: 4 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 221, (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectina ligasa que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID No: 1, del nucleótido 91 al nucleótido 1485, (d) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad pectato ligasa, que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 del residuo aminoácido 31 al residuo aminoácido 494, (e) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad poligalacturonasa que comprenden una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID NO: 5, del nucleótido 1 al nucleótido 1248, (d) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad poligalacturonasa, que es al menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 415, y (g) secuencia de nucleótido degenerado de (a), (b), (c), (d) , (e) o (f); y un terminador de transcripción.

14. Una célula de cultivo en la que se ha introducido un vector de expresión de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizada porque la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

15. Un polipéptido aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) moléculas polipéptido que tienen actividad pectato ligasa y que comprenden una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID No: 8, del residuo 28 al residuo 341; b) moléculas de polipéptido que tienen actividad pectato ligasa y que son al menos 70% idénticas a los aminoácidos de la SEC ID NO: 8 del residuo aminoácido 28 al residuo aminoácido 341; c) moléculas polipéptido que tienen actividad pectato ligasa y que comprenden una secuencia de aminoácido co o se muestra en la SEC ID NO: 4, del residuo 1 al residuo 221; d) moléculas de polipéptido que tienen actividad pectato ligasa y que son al menos 70% idénticas a los aminoácidos de la SEC ID NO: 4 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 221; e) moléculas polipéptido que tienen actividad pectina ligasa y que comprenden una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2, del residuo 31 al residuo 494; f) moléculas de polipéptido que tienen actividad pectina ligasa y que son al menos 70% idénticas a los aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del residuo aminoácido 31 al residuo aminoácido 494; g) moléculas polipéptido que tienen actividad poligalacturonasa y que comprenden una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 6, del residuo 1 al residuo 415; d) moléculas de polipéptido que tienen actividad poligalacturonasa y que son al menos 70% idénticas a los aminoácidos de la SEC ID NO: 6 del residuo aminoácido 1 al residuo aminoácido 415; y i) especies homologas de a), b) , c), d) , e), f ) , g) y h) .

16. Una preparación de enzima, caracterizada porque comprende un polipéptido purificado de conformidad con la reivindicación 15.

17. Un método, para producir un polipéptido que tiene actividad que degrada pectina, que comprende cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque por medio de éste la célula expresa un polipéptido codificada por el segmento de ADN; y se recupera el polipéptido.

18. Una enzima aislada, caracterizada porque tiene actividad que degrada enzima, en la que la enzima es (i) libre de impurezas homologas, y (ii) se produce por el método de conformidad con las reivindicaciones 16 o 17.

19. La preparación de conformidad con la reivindicación 1 o 16, caracterizada porque comprende además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de proteasas, celulasas ( endo-glucanasas ) , ß-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, a-amilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinosidasas, manasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acil esterasas, ramñogalacturonan acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectina ligasas, otras péctatp ligasas, pectina metilesterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas de las mismas .

20. Una composición de detergente, caracterizada porque comprende la preparación de enzima de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o las enzimas de conformidad a la reivindicación 4, 6, 8 o 10 y un surfactante .

21. Un proceso para limpiar una superficie dura, caracterizado porque 'comprende tratar una superficie dura con una solución de limpieza que contiene la preparación de enzima de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o la enzima de conformidad con la reivindicación 4, 6, 8 o 10.

22. Un proceso de tratamiento en máquina de telas, caracterizado porque el proceso comprende tratar la tela durante un ciclo de lavado de un proceso de lavado en máquina con una solución de lavado que contiene la preparación de enzima de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o la enzima de conformidad con ia reivindicación 4, 6, 8 o 10.

23. Un método- para mejorar las propiedades de fibras celulósicas, hilados, telas tejidas o no tejidas, caracterizado porque en el método las fibras, hilados o tela se tratan con una cantidad efectiva de la preparación de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o una cantidad efectiva de la enzima de conformidad con la reivindicación 4, 6, 8 o 10.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la preparación de enzima o la enzima se usa en una etapa del proceso de lavado.

25. Un método para la degradación o modificación de material vegetal, caracterizado porque en el método el material vegetal se trata con una cantidad efectiva de la preparación de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o una cantidad efectiva de la enzima de conformidad con la reivindicación 4, 6, 8 o 10.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el material vegetal es papel de residuo reciclado, pulpas para hacer papel mecánico o fibras sometidas a un proceso de eliminación.

27. Un método para preparar alimento para animal, caracterizado porque una cantidad efectiva de la preparación de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o una cantidad efectiva de la enzima de conformidad con la reivindicación 4, 6, 8 o 10 se adiciona como un aditivo del alimento para animal a los ingredientes convencionales de alimento para animal.

28. Un método para procesar vino o jugo, caracterizado porque en el método el vino o jugo se trata con una cantidad efectiva de la preparación de conformidad con la reivindicación 1 o 16, o una cantidad efectiva de la enzima de conformidad con la reivindicación 4, 6, 8 o 10. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Enzimas que degradan pectina derivadas de o endógenas a Ba cil l us l i cheniformi s u otras especies de Ba cil l us que son al menos 99% homologas a Ba ci l l us li cheniformis, basándose en las secuencias alineadas de 16s rADN, tienen actividad óptima a pH más alto de 8. Las enzimas que degradan pectina pertenecen a las clases de enzima pectato ligasas (EC 4.2.2.2), pectina ligasas (EC 4.2.2.10) y poligalacturonasas (EC 3.2.1.15) y son útiles en procesos industriales bajo condiciones alcalinas tal como en el procesamiento de textiles y como un ingrediente activo, e.g. en detergentes para lavado de ropa y productos para limpieza de superficies duras. LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: NOVO NORDISK A/S (B) DIRECCIÓN: Novo Alié (C) CIUDAD: Bagsvaerd (E) ESTADO: Dinamarca (F) CÓDIGO POSTAL: (ZIP): DK-2880 (G) TELÉFONO: +45 44 44 88 88 (H) FAX +45 44 49 32 56 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ENZIMAS DE Bacillus licheniformis QUE DEGRADAN PECTINA (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 10 (iv) FORMA DE LECTURA DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1485 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1: ATGAAACTGA TCAAAAACGC ATCTTTTATC ATTTCTTTTT TGGCTGCGGC CGGCATTTAT 60 TTTTTATTAG GTACAGTCGC TGCTTCTGCG GCAAACGAAG ATTATCCGGA ACAGATGATC 120 AGGCTGGAAA GCTCATCAGG CTTAAATATT ACGCCCGCCG GGAATCAAGA CAACGCACCG 180 TTAACAGCAA AA.CAGACGAG CGGAGAAAAA. GAAGAAAGAT GGAGGCTTGA TACGTCTGAC 240 GGCAAACAAT TCAAAATCAG AAATATGGAT AGCGGCAAAA TTATCATCCC TGCCCATTAC 300 GCACTGTCAG ACAATAATCC GGCTGTGGTC TACTATGACA ATTCACGGAA GGAAGAGTTG 360 TGGAATATCA TCGGGGCCGA CAAAGACGGA AACGGAGATT TTATCACGTA TAAAATCGTC 420 AGTGCACAAA ACAGCAGCCT TGCACTGACA CTGGACGGCA GCGGAGTGAA GCTTGCCAAA 480 TATACGGGCA GCTCCGTCCA AAAGTGGAAG CTTCCAAGCG ACGGGCTCGA AGGTTTCGCA 540 GGCTATGCAA GGGAAACGAA CGGCAAGCAG AAAACAGGCA CAACCGGCGG CCTGCTTGGA 600 AAAGTCGTCT ATGTCAATAA TCTGGGCGAA CTGAAGGCCA ATATTGAAGA TTCAACGCCG 660 CGCACGATTG TCGTCTCCAG CAATATCGGC GCTTCAGCCA AAACGGTATT AACGGTGGGC 720 GCCAATAAAA CAATCATCGG CTCGTATGAA AAACATAAGC TGAATAACAT TTACTTTAAA 780 ACAAAAGCGG ACTCTGGCAA CGTTATTTTC AAAAATCTGG TCATTGCACA TGATGCATCC 840 ATAAATGAAA ACAATGACAT CCCTGTTTAC ATTACCGATT CGAGAAACTA CTGGATTGAC 900 CATGTCACAT TCCAAGGCCA CAGCTATACG GCAAACGGCC ACGATCTCGA CAAGCTCTTA 960 TACGTCGGCG CTAAAGCCGA TTACGTCACA CTGTCGCACA GCACATTCAC AGACCACAGG 1020 TACGGCCTGA TTCTCGGCTG GCCTCAAGAT GACAAGCAAT ACCACAGTAT ATATAATGGC 1080 TATCCGCGGA TGACAATCAG CCACAATCGC TTTGAGAATC TCTATGTCAG GGCGCCCGGG 1140 TTGATGCGTT ACGGCTATTA TCACGTGAAA AGCAATTATA TCAACAATTA CCACCTTGGC 1200 TTCACGATTA CGACATTGGC GAAAATATAT TCTGAAGCCA ATTACTTCGG CACGGGCAAT ¡260 GAGAAAGGCA TACTGGATGA TTACGGAGAC GGCGCGTTTA AAGATGTCGG GTCATATCCG 1320 GCGATAAAGG GGCAGAAATC GCCTGAGACA AGCTGGACAC CTTCATCCAA CTACAGCTAT 1380 CGGACGATGA AGGCCGGCAA TGCCAAAGCT TTTGCCAAAC GGTACGCAGG TGCGCAGCGC 1440 ACCGCTCTGT ACTATGCGAA TTACAGCCAG TTTAAAAAAG ACTAA 1485 (2) INFORMACIÓN PARA ' SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 494 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: Met Lys Leu He Lys Asn Ala Ser Phe He He Ser Phe Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gly He Tyr Phe Leu Leu Gly Thr Val Ala Ala Ser Ala Ala Asn 20 25 30 Glu Asp Tyr Pro Glu Gln Met He Arg Leu Glu Ser Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Asn He Thr Pro Ala Gly Asn Gln Asp Asn Ala Pro Leu Thr Ala Lys 50 55 60 Gln Thr Ser Gly Glu Lys Glu Glu Arg Trp Arg Leu Asp Thr Ser Asp 65 70 75 80 Gly Lys Gln Phe Lys He Arg Asn Met Asp Ser Gly Lys He He He 85 90 95 Pro Ala His Tyr Ala Leu Ser Asp Asn Asn Pro Ala Val Val Tyr Tyr 100 105 110 Asp Asn Ser Arg Lys Glu Glu Leu Trp Asn He He Gly Ala Asp Lys 115 120 125 Asp Gly Asn Gly Asp Phe He Thr Tyr Lys He Val Ser Ala Gln Asn 130 135 140 Ser Ser Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ser Gly Val Lys Leu Ala Lys 145 150 155 - 160 Tyr Thr Gly Ser Ser Val Gln Lys Trp Lys Leu Pro Ser Asp Gly Leu 165 170 - 175 Glu Gly Phe Ala Gly Tyr Ala Arg Glu Thr Asn Gly Lys Gln Lys Thr 180 185 190 Gly Thr Thr Gly Gly Leu Leu Gly Lys Val Val Tyr Val Asn Asn Leu 195 - 200 205 Gly Glu Leu Lys Ala Asn He Glu Asp Ser Thr Pro Arg Thr He Val 210 215 220 Val Ser Ser Asn He Gly Ala Ser Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Gly 225 230 235 " 240 Ala Asn Lys Thr He He Gly Ser Tyr Glu Lys His Lys Leu Asn Asn 245 250 255 He Tyr The Lys Thr Lys Ala Asp Ser Gly Asn Val He Phe Lys Asn 260 265 270 Leu Val He Ala His Asp Ala Ser He Asn Glu Asn Asn Asp He Pro 275 280 285 Val Tyr He Thr Asp Ser Arg Asn Tyr Trp He Asp His Val Thr Phe 290 295 300 Gln Gly His Ser Tyr Thr Ala Asn Gly His Asp Leu Asp Lys Leu Leu 305 310 315 - 320 Tyr Val Gly Ala Lys Ala Asp Tyr Val Thr Leu Ser His Ser Thr Phe 325 330 335 'Thr Asp His Arg Tyr Gly Leu He Leu Gly Trp Pro Gln Asp Asp Lys 340 345 350 Gln Tyr His Ser He Tyr Asn Gly Tyr Pro Arg Met Thr He Ser His 355 360 365 Asn Arg Phe Glu Asn Leu Tyr Val Arg Ala Pro Gly Leu Met Arg Tyr 370 375 380 Gly Tyr Tyr His Val Lys Ser Asn Tyr He Asn Asn Tyr His Leu Gly 385 390 395 400 Phe Thr He Thr Thr Leu Ala Lys He Tyr Ser Glu Ala Assn Tyr Phe 405 410 415 Gly Thr Gly Asn Glu Lys Gly He Leu Asp Asp Tyr Gly Asp Gly Ala 420 425 430 Phe Lys Asp Val Gly Ser Tyr Pro Ala He Lys Gly Gln Lys Ser Pro 435 440 445 Glu Thr Ser Trp Thr Pro Ser Ser Asn Tyr Ser Tyr Arg Thr Met Lys 450 455 460 Ala Gly Asn Ala Lys Ala Phe Ala Lys Arg Tyr Ala Gly Ala Gln Arg 465 470 475 480 Thr Ala Leu Tyr Tyr Ala Asn Tyr Ser Gln Phe Lys Lys Asp 485 490 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 666 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: ATGAAGAGAT TAGCAGGTAC GGTTATTTTG TCAGGTTTGC TCGTATGCGG GTTTGGACAG 60 GCTCTGCCTG AAAAAGCTTT GGCCGCCGAG GTCGTTCACA AAACGATCGT AGTCGAGAAA 120 GGCCAAACGT ATGACGGAAA AGGCAAGCGG CTGATTGCAG GTCCGGAGCT CGGGGACGGC 180 AGCCAACGCG AGGATCAAAA ACCGATTTTC AAAGTGGAGG ATGGTGCAAC GCTCAAAAAT 240 GTCGTGCTTG GCGCTCCTGC TGCTGATGGT GTTCACACAT ATGGAAACGC TTCCATAAAC 300 AACGTTGTTT GGGAAGATGT CGGCGAAGAT GCCTTGACTG TCAAAAGCGA AGGAAGTGTC 360 ACGATAAACG GAGGATCGGC CCGGCTTGCC GCGGACAAAA TCTTTCAGAT TAATAAAGCG 420 AGCACATTTA CCGTGAAAAA TTTTACTGCC GATCAAGGAG GCAAATTCAT TCGCCAGCTC 480 GGAGGCTCGA CATTTAAA.GC CGTGGTCAAT ATTGATAACT GTACGATTAC AAACATGAAA 540 GAGGCGATCT TCCGAACCGA CAGCAGTACA AGTTCCGTTA CAATGACAAA TACAAGATAC 600 TCAAAAGTCG GTCAGAAATG GATCGGTGTG AAGCATGCTA CGGAAAGAAA CAATCATGAA 660 TTTTAA 666 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 221 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: péptido ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 4 : Met Lys Arg Leu Ala Gly Thr Val He Leu Ser Gly Leu Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Phe Gly Gln Ale Leu Pro Glu Lys Ala Leu Ala Ala Glu Val Val 20 25 30 His Lys Thr He Val Val Glu Lys Gly Gln Thr Tyr Asp Gly Lys Gly 35 40 45 Lys Arg Leu He Ala Gly Pro Glu Leu Gly Asp Gly Ser Gln Arg Glu 50 55 60 Asp Gln Lys Pro He Phe Lys Val Glu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80 Val Val Leu Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly Val His Thr Tyr Gly Asn 85 90 95 Ala Ser He Asn Asn Val Val Trp Glu Asp Val Gly Glu Asp Ala Leu 100 105 110 10 Thr Val Lys Ser Glu Gly Ser Val Thr He Asn Gly Gly Ser Ala Arg 115 120 125 Leu Ala Ala Asp Lys He Phe Gln He Asn Lys Ala Ser Thr Phe Thr 130 135 140 Val Lys Asn Phe Thr Ala Asp Gln Gly Gly Lys Phe He Arg Gln Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ser Thr Phe Lys Ala Val Val Asn He Asp Asn Cys Thr He 165 170 175 Thr Asn Met Lys Glu Ala He Phe Arg Thr Asp Ser Ser Thr Ser Ser 180 185 190 Val Thr Met Thr Asn Thr Arg Tyr Ser Lys Val Gly Gln Lys Trp He 195 200 205 Gly Val Lys His Ala Thr Glu Arg Asn Asn His Glu Phe 210 215 220 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1248 pares de base (B) TTPO: ácido nucleico (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 11 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: TTGCGATATT TAAAACAGGC GTCACATTAT AAAGGGAGCG GTAACGTGAG TCTACAGAAA 60 ATAAAACAAG AGATTGTAAA GAAGCTGAAG GTTCCGGTAT TTCCGAATCG CTCATTTGAT 120 GTCACATCGT TTGGGGCTGA CGAAAACGGA AAAAACGATT CGACCGAAGC GATACAGAAG 180 GCGATTGATC AAGCCCACCA AGCCGGCGGC GGAAGAGTAA CGGTTCCTGA AGGCGTGTTT 240 CTTTCCGGTG CGCTCAGATT GAAAAGCAAT GTGGATCTTC ATATTGCAAA GGGAGCGGTG 300 ATCAAATTCA GTCAGAACCC TGAAGATTAT CTCCCTGTTG TGCTGACGAG GTTTGAAGGA 30 GTCGAGCTCT ATAATTATTC ACCGCTCATC TACGCTTACG AAGCCGATAA TATTGCGATA 420 ACCGGAAAGG GCACGCTTGA CGGTCAAGGA GATGACGAGC ATTGGTGGCC GTGGAAAAGA 480 GGAACGAACG GCCAGCCTTC ACAGGAAAAA GATCGGAACG CTTTGTTTGA AATGGCTGAG 540 CGCGGTATCC CGGTCACTGA GCGGCAGTTT GGAAAAGGGC ATTATTTGCG GCCGAATTTC 600 ATTCAGCCGT ATCGCTGCAA ACATATATTG ATTCAAGGCG TCACTGTGCT GAATTCGCCG 660 ATGTGGCAAG TTCATCCCGT GCTTTGCGAG AATGTGACAG TGGACGGCAT CAAAGTCATC 720 GGACACGGCC CCAATACCGA CGGAGTCAAC CCGGAATCGT GTAAAAACGT GGTGATCAAG 780 12 GGCTGCCATT TTGATAATGG AGACGACTGC ATCGCCGTCA AATCGGGAAG AAATGCGGAC 840 GGCCGAAGGA TCAACATTCC GTCGGAAAAC ATCGTCATTG AACATAACGA AATGAAAGAC 900 GGGCATGGAG GGGTCACGAT CGGAAGCGAA ATTTCCGGCG GCGTGAAGAA CGTCATCGCA 960 GAGGGCAATC TTATGGACAG CCCGAACTTG GACAGAGCCC TCCGCATTAA AACGAATTCG 1020 GTGCGTGGCG GCGTTCTTGA AAACATCTAC TTTCACAAAA ATACGGTCAA AAGCTTGAAG 1080 CGCGAATTGA TCGCCATCGA TATGGAATAT GAAGAAGGAG ATGCCGGAGA TTTCAAACCT 1140 GTCGTCCGCA CGGTTGGATG TTTAACAACT GAAAAGCATG GGCGGACATT ACGGGATCAG 1200 GGTGCTGGCA TACGACCACT CTCCGGTCAC CGGGCTGAAA GTGGCTGA 1248 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 415 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: 13 Leu Arg Tyr Leu Lys Gln Ala Ser His Tyr Lys Gly Ser Gly Asn Val 1 5 10 15 Ser Leu Gln Lys He Lys Gln Glu He Val Lys Lys Leu Lys Val Pro 20 25 30 Val Phe Pro Asn Arg Ser Phe Asp Val Thr Ser Phe Gly Ala Asp Glu 35 40 45 Asn Gly Lys Asn Asp Ser Thr Glu Ala He Gln Lys Ala He Asp Gln 50 55 60 Ala His Gln Ala Gly Gly Gly Arg Val Thr Val Pro Glu Gly Val Phe 65 70 75 80 Leu Ser Gly Ala Leu Arg Leu Lys Ser Asn Val Asp Leu His He Ala 85 90 95 Lys Gly Ala Val He Lys Phe Ser Gln Asn Pro Glu Asp Tyr Leu Pro 100 105 110 Val Val Leu Thr Arg Phe Glu Gly Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Ser Pro 115 120 125 Leu He Tyr Ala Tyr Glu 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Leu Glu Asn He Tyr Phe His 340 345 350 Lys Asn Thr Val Lys Ser Leu Lys Arg Glu Leu He Ala He Asp Met 355 360 365 Glu Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Gly Asp Phe Lys Pro Val Val Arg Thr 370 375 380 Val Gly Cys Leu Thr Thr Gly Lys His Gly Arg Thr Leu Arg Asp Gln 385 390 . 395 400 Gly Ala Gly He Arg Pro Leu Ser Gly His Arg Ala Glu Ser Gly 405 410 415 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1026 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: 16 ATGAAGAAAT TAATCAGCAT CATCTTTATC TTTGTATTAG GGGTTGTCGG GTCATTGACA 60 -GCGGCGGTTT CGGCAGAAGC AGCTTCTGCC TTAAACTCGG GCAAAGTAAA TCCGCTTGCC 120 GACTTCAGCT TAAAAGGCTT TGCCGCACTA AACGGCGGAA CAACGGGCGG AGAAGGCGGT 180 CAGACGGTAA CCGTAACAAC GGGAGATCAG CTGATTGCGG CATTAAAAAA TAAGAATGCA 240 AATACGCCTT TAAAAATTTA TGTCAACGGC ACCATTACAA CATCAAATAC ATCCGCATCA 300 AAGATTGACG TCAAAGACGT GTCAAACGTA TCGATTGTCG 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péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8: Met Lys Lys Leu He Ser He He Phe He Phe Val Leu Gly Val Val 1 5 10 15 Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn 20 25 30 Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala 35 40 45 Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr 50 55 60 18 Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu He Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala 65 70 75 80 Asn Thr Pro Leu Lys He Tyr Val Asn Gly Thr He Thr Thr Ser Asn 85 90 95 Thr Ser Ala Ser Lys He Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser He 100 105 110 Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly He Gly He Lys He 115 120 125 Trp Arg Ala Asn Asn He He He Arg Asn Leu Lys He His Glu Val 130 135 140 Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala He Gly He Glu Gly Pro Ser Lys Asn 145 150 155 — 160 He Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys 165 170 175 Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr He 180 185 190 Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met 195 200 205 Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr He Thr Phe His His 210 215 220 19 Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly 225 230 235 240 Glu Gly His He Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys He He Asp Ser Gly 245 250 255 He Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg He Arg He Glu Asn Asn Leu Phe 260 265 270 Glu Asn Ala Lys Asp Pro He Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly 275 280 285 Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met 290 295 300 Pro Thr Trh Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu 305 310 315 _ 320 Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser He Val Lys Gln Asn Ala Gly Val 325 330 335 Gly Lys He Asn Pro 340 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1482 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico 20 (C) HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal ^ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: 5 GCTTCTGCCT TAAACTCGGG CAAAGTAAAT CCGCTTGCCG ACTTCAGCTT AAAAGGCTTT 60 GCCGCACTAA 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