MXPA00002555A - Complejos de vanadio de monohidroxamato y composiciones farmaceuticas que los contienen - Google Patents

Abstract

Los complejos de vanadio de monohidroxamato de la fórmula l:R-CO-NHOH.X, en donde R es un residuo seleccionado de H2N-CH ( COY)- (ch2)n-, en donde n es 1,2,3, y Y es OH o NH2;H2N-CH (COOH)-CH2-s-CH2;y piridilo,piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo;y X es un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadio (VO1+), metavanadato (VO3-) o vanadato (vo4-3), sonútiles para la inducción de normoglicemia y /o reducción de los niveles de glucosa en la sangre de pacientes diabéticos.

Description

COMPLEJOS DE VANADIO DE MONOHIDROXAMATO Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS CONTIENEN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a complejos de vanadio de monohidroxamatos y a composiciones farmacéuticas que los contienen, útiles para el tratamiento de diabetes.

Abreviaciones: Asp(ß)HXM, ß-monohidroxamato de ácido L-aspártico; CytPTK, proteína citosólica-tirosina cinasa; Glu(?)HXM, ?-monohidroxamato de ácido L-glutámico; HXM, monohidroxamato; InsRTK, receptor de insulina de tirosina cinasa; IRS-1 , sustrato 1 receptor de insulina; PTK, proteína tirosina cinasa; KRB, bicarbonato de Krebs Ringer; NaVO3, metavanadato de sodio; STZ, estreptozocina; VOSO , sulfato de vanadilo; VOCI2, cloruro de vanadilo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han llevado a cabo estudios intensivos en las últimas dos décadas sobre los efectos insulinomiméticos de vanadio (revisados en Shechter et al., 1995). In vitro, las sales de vanadio imitan a la mayoría de los efectos de insulina en los tejidos objetivos principales de la hormona, e in vivo ^^f£ 3^ g^ ^^^^ ¡^¡¡^g. ^^^^*' ,:,Jafeá-.\ inducen normoglicemia, y mejoran la homeóstasis de glucosa en roedores diabéticos deficientes de insulina e y resistentes a la insulina (revisado en Brichard y Henquin, 1995). En la frontera básica de investigación, se continúan acumulando datos que muestran que las sales de vanadio manifiestan sus efectos metabólicos similares a la insulina mediante trayectorias alternativas, sin involucrar a la activación de tirosina cinasa receptora de insulina, y a la fosforilación del sustrato 1 receptor de insulina (IRS-1 ). Las partes clave de dicho sistema de soporte parecen involucrar a la inhibición de proteína-fosfotirosina fosfatasas y a la activación de proteínas tirosina cinasas no receptoras (revisado en Brichard y Henquin, 1995). El vanadio es un elemento ultratraza en mamíferos. La dieta varía entre 10-60 µg por día, y la concentración intracelular es de aproximadamente 20 nM (revisado en Shechter et al., 1995 y Brichard y Henquin, 1995). El volumen del vanadio intracelular es probablemente en la forma de vanadilo (+4). La administración oral aguda de los compuestos de vanadio demostró ser moderadamente tóxica. Sin embargo, los efectos antidiabéticos profundos de la terapia oral de vanadio en roedores diabéticos deficientes de insulina y resistentes a la insulina (revisado en Brichard y Henquin, 1995) potenció el inicio de estudios clínicos. Se permitieron pequeñas dosis de vanadio (100-125 mg/persona/día, durante un período de 3 semanas) y, aunque 100 veces inferiores a la dosis utilizada en la mayoría de los estudios animales, se observaron varios efectos benéficos (Cohén et al., 1995).

Los complejos de vanadio orgánicamente quelatados (+4) son aproximadamente 5 veces más potentes que el vanadio libre (+4) en la facilitación de los efectos metabólicos de insulina in vitro (Li et al., 1996) y en ratas STZ in vivo (Sakurai et al., 1995). Las bases teóricas para lo anterior aún se encuentran bajo estudio, y es probable obtener el resultado de estabilización de las especies de vanadio más potentes similares a la insulina. Las sales de vanadio imitan los efectos metabólicos de la insulina a través de los componentes de maquinaria independientes de insulina alternativos in vitro y pueden superar los estados de resistencia a la insulina en roedores diabéticos in vivo. Como tal, la terapia de vanadio puede llevar a cabo un enfoque útil, atractivo y complementario para la terapia de insulina, con la condición de que las sales de vanadio sean menos tóxicas o se pueda realizar cierta manipulación para llevar a cabo la terapia de vanadio sin cantidades o cantidades reducidas de fuente de vanadio exógena. La patente de Israel No. 99666 y la patente de E.U.A. correspondiente No. 5,338,759 de los mismos solicitantes describen complejos de vanadilo de dihidroxamatos de la fórmula: R2R3C{CH2O(CH2)m CO[NHCHR(CH2)qCO]nNOHR1}2 los cuales son útiles para el tratamiento de diabetes, pero se descubrió posteriormente por los inventores que eran inadecuados in vivo para normalizar los niveles de glucosa en la sangre en modelos de ratas diabéticas. Se mostró que los derivados de ácido hidroxámico se involucran en el transporte microbial de hierro, y por lo tanto se sugirieron para el tratamiento de condiciones de deficiencia de hierro. Estos también son inhibidores de la actividad de ureasa y se indican para el tratamiento de coma hepático. Gran parte de sus actividades biológicas se relacionan con su potencia para quelatar una variedad de metales. En la mayoría de los quelatadores de metal formados por ácidos hidroxámicos, la coordinación ocurre mediante desprotonación del grupo OH y coordinación subsecuente (O, O) con el oxígeno de carbonilo y OH desprotonado. Los monohidroxamatos de aminoácido son derivados simples, no tóxicos de aminoácidos. Se mostró que el ß-hidroxamato de ácido D-aspártico (D-Asp(ß)HXM) tiene actividad antitumoral en la leucemia murina L5178Y, in vitro e in vivo, y es activo contra la células de leucemia Friend in vitro (Tournaire et al., 1994). El (?)-monohidroxamato de ácido L-glutámico (Glu(?)HXM) es citotóxico contra las células de leucemia L1210 in vitro, y contra las células de leucemia L1210 y células de melanoma B16 in vivo (Vila et al., 1990).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto actualmente de acuerdo con la presente invención que ciertos monohidraxamatos de aminoácido (HXM), en particular las L-formas de ?-monohidraxamatos de ácido glutamico (Glu(?)HXM) y el ß- monohidroxamato de ácido aspártico (Asp(ß)HXM), interactúan con el vanadio (+4) y el vanadio (+5). En una estoiquiometría molar de 1 :1 ó 2:1 HXM: vanadio, potencian en gran medida a las potencias insulinomiméticas de vanadio (+4) y (+5) in vitro, y normalizan el nivel de glucosa en la sangre en las ratas tratadas con estreptozocina in vivo. La presente invención se refiere a complejos de vanadio novedosos de monohidroxamatos de la fórmula (I): R-CO-NHOH.X (I) en donde: R es un residuo seleccionado de: (i) H2N-CH (COY)-(CH2)n- (ii) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo; en donde n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2; y X es un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo (VO2+), metavanadato (VO3") o vanadato (VO43"). De acuerdo con la presente invención, en los monohidroxamatos de (i) anteriores, n es de preferencia 1 ó 2, es decir ß y ?-monohidroxamatos de ácido L-aspártico y ácido L-glutámico, respectivamente. En una modalidad más preferida, el monohidroxamato de aminoácido es Glu(?)HXM, el cual se descubrió que es más efectivo en la manifestación de los efectos metabólicos de insulina en adipocitos de rata al compararse con varios monohidroxamatos de a-aminoácido. De manera interesante, entre todos los quelatadores de vanadio conocidos descritos en la literatura tales como acetilacetonato, bispicolinato y ^ íainiít?-' el dihidroxamato RL-252 descritos en la patente de E.U.A. 5,338,759 mencionada anteriormente, los monohidroxamatos de aminoácido son únicos en su capacidad de producir efectos de insulina, in vitro, en la ausencia de vanadio externamente agregado, indicando que los monohidroxamatos de aminoácido pueden ser capaces de convertir la cantidad diminuta de vanadio intracelularmente localizado (+4, ~20nM) en una especie insulinomiméticamente activa. Otros estudios in vitro revelaron que el Glu(?)HXM facilita todos los bioefectos fisiológicamente relevantes de insulina. Estos incluyen la activación de la toma de hexosa y la inhibición de la lipolisis mediada por isoproterenol. De manera importante la activación mediante Glu(?)HXM es aditiva para el efecto máximo producido por una concentración saturada de insulina. Entre los monohidroxamatos de (iii) anteriores, los preferidos son el radical 3-piridilo, llamado hidroxamato de ácido nicotínico, el radical 2- ó 3-piperidilo y el radical 3-tetrahidroisoquinolinilo. Los monohidroxamatos utilizados en la presente invención son solubles en agua en contraste con los dihidroxamatos de la patente de E.U.A. 5,338,759 mencionada anteriormente, los cuales son insolubles en agua. De esta manera, los complejos de vanadio de la presente invención se pueden preparar mediante disolución simple en agua del monohidroxamato y de la sal de vanadio. Ejemplos de sales de vanadio utilizadas para formar los complejos utilizados en las composiciones de la presente invención son, sin limitarse a, VOCI2 (+4), VOSO4 (+4), NaVO3 (+5) y Na3VO4 (+5). Varias relaciones molares estoiquiométricas de HXM: sal de vanadio de los complejos se proveen por la presente invención, pero las relaciones molares de HXM: 1 de sal de vanadio 1 :1 y 2 son las preferidas. Los complejos de fórmula I de la invención se preparan al mezclar soluciones de agua del monohidroxamato y la sal de vanadio, congelando y liofilizando la solución, obteniendo de esta forma un polvo seco que se puede almacenar, por ejemplo, a temperatura ambiente. La invención además provee una composición farmacéutica útil para el tratamiento de diabetes, particularmente para la reducción de niveles de glucosa en la sangre y la inducción de normoglicemia en pacientes diabéticos, comprendiendo un complejo de vanadio de un monohidroxamato de fórmula (I) como un ingrediente y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones se pueden utilizar para el tratamiento de diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) y diabetes mellitus insulinodependiente (NIDDM). La dosis que se va administrar dependerá de las condiciones del paciente diabético y puede encontrarse en una escala de 0.2 mg/kg a 2 mg/kg diariamente. Aunque la cantidad permitida de vanadio que se está utilizando en pacientes diabéticos en pruebas clínicas actualmente es de 2 mg/kg/día, la cantidad mínima provista por la presente invención representa un incremento de 10 veces en la eficacia. Las composiciones de la invención que comprenden al complejo de vanadio de la fórmula I se pueden presentar en forma soluble, tales como gotas, o en la forma de cápsulas o tabletas y de preferencia se administran de forma oral. Estas se pueden administrar solas o en combinación con insulina. El complejo de vanadio de fórmula I también se puede generar in vivo por administración separada de la sal de vanadio y del monohidroxamato. La invención además comprende un empaque farmacéutico que contiene una composición farmacéutica que contiene un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH, en donde R es un residuo seleccionado de: (i) H2N-CH (COY) -(CH2)n-; (¡i) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo; y n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2; y una composición farmacéutica que contiene un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo (VO2+), metavanadato (VO3") o vanadato (VO43"), con instrucciones acerca de como administrarlos. De preferencia, la composición que contiene a la sal de vanadio se administra antes de la composición de monohidroxamato. Los dos ingredientes también pueden contener un compartimento de una composición única, es decir, una cápsula, separada mediante una membrana no permeable. Aunque un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH anterior, particularmente Glu(?)HXM, se puede asociar con el vanadio intracelular endógeno, la modificación de este último en una especie activa que evoca a las respuestas metabólicas de insulina, la invención además prevé una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes que comprende un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH, en donde R es un residuo seleccionado de: (i) H2N-CH (COY)-(CH2)n-; (ii) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo; y n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2. La invención además se refiere al uso de un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH, en donde R es un residuo seleccionado de: (i) H2N-CH (COY) - (CH2)n-; (¡i) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo; y n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para la reducción de niveles de glucosa en la sangre en un paciente diabético que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un complejo de vanadio de un monohidroxamato de fórmula (I) en la presente, o de cantidades efectivas de un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH en la presente y un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo (VO2+), metavanadato (VO3") o vanadato (VO43"), o de cantidades efectivas de un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH en la presente, sola o en combinación con terapia de insulina. En una otra modalidad, la invención se refiere a un método para inducir normoglicemia en un paciente diabético que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un complejo de vanadio de un monohidroxamato de fórmula (I) en la presente, o de cantidades efectivas de un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH en la presente y un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo ! ^&é ^j& ^i m^- (VO2+), metavanadato (VO3") o vanadato (VO43"), o de cantidades efectivas de un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH en la presente, sola o en combinación con terapia de insulina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la activación de lipogénesis dependiente de concentración por complejos de 1 :1 a 1 :5 de Glu(?)HXM:VOCI2 (+4) en comparación con el VOCI libre y el Glu(?)HXM. libre. La figura 2 muestra que un complejo 1 :1 de Glu(?)HXM:VOCI2 (+4) potencia el efecto normoglicémico de vanadio en ratas STZ en comparación con el VOCI2 libre. La figura 3 muestra una activación de lipogénesis dependiente de concentración por Glu(?)HXM:NaVO3 (complejo 1 :1 ), NaVO3 libre y Glu(?)HXM libre. La figura 4 muestra que el Glu(?)HXM libre, NaVO3 libre y un complejo 2:1 de Glu(?)HXM:NaVO3 estimula el influjo de hexosa en dos concentraciones diferentes. La figura 5 muestra que el Glu(?)HXM:NaVO3 (complejo 2:1 ) reduce los niveles de glucosa en la sangre en ratas tratadas con STZ en comparación con el Glu(?)HXM libre y el NaVO3 libre. La figura 6 muestra que el Glu(?)HXM libre activa la lipogénesis en adipocitos de rata en la ausencia de vanadio añadido de manera exógena. ^2g^^2^S -lfMrT- La figura 7 muestra la extensión de la lipogénesis evocada por el Glu(?)HXM libre, NaVO3 libre o insulina en concentraciones crecientes de estauroesporina. La figura 8 muestra una comparación de activación de lipogénesis evocada por las concentraciones de incremento de Glu(?)HXM libre en adipocitos normales y adipocitos enriquecidos con vanadio. La figura 9 muestra una comparación de la capacidad de lipogénesis de complejos 2:1 de Glu(?)HXM:VOCI2 y NaVO3 libres, y polvo seco de Glu(?)HXM:VOCl2 y Glu(?)HXM:NaVO3 almacenados a temperatura ambiente.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS De acuerdo con la presente invención, una potenciación única y específica de la potencia insulinomimética de vanadio se logra por ciertos formadores de complejo de monohidroxamato de vanadio. Particularmente, el ácido L-glutámico (?) monohidroxamato (Glu(?)HXM) potencia «7-10 veces el vanadio (+5) en la activación del metabolismo de glucosa en adipocitos de rata, y eleva de 5-7 veces la eficacia del vanadato para reducir los niveles de glucosa en la sangre en ratas diabéticas tratadas con STZ in vivo. La potenciación es máxima en una relación molar 2:1 de L- Glu(?)HXM:Vanadio. Las porciones a-amino y a-carboxilo no modificadas de L- Glu(?)HXM son esenciales para la potenciación. Además, la acción sinergística de L- Glu(?)HXM es esteroespecífica y no se facilita con D-Glu(?)HXM, aunque este último también forma complejos con vanadio. De manera interesante, todos los formadores de complejo de vanadio documentados que potencian las acciones insulinomiméticas de vanadio, el L-Glu(?)HXM es único en el sentido de la lipogénesis de en adipocitos de rata también en la ausencia de vanadio agregado de manera exógena. Se ha establecido además en la presente que dicho efecto se manifiesta a través de la trayectoria de vanadio mediante datos experimentales que indican que el L-Glu(?)HXM es capaz de convertir la cantidad fisiológica diminuta de vanadio presente de manera endógena en la adipocitos de rata en un especie activa insulinomimética. Los estudios quimicofísícos de dicho complejo activo indican características fisioquímicas únicas. El vanadio se mantiene en el estado de oxidación +5, en el valor de pH fisiológico, en equilibrio también si se prepara con el catión +4 de vanadilo. La prueba de selección in vitro utilizada en la presente invención indica que, además del Glu(?)HXM, también el L-Asp(ß)HXM y HXM de ácido nicotínico (a una relación molar de 1 :1) potencian también la potencia insulinomimética de vanadio (+4). Su efecto de sinergización es -85% y -57% de aquel ejercido por el Glu(?)HXM. En contraste, los hidroxamatos de a- aminoácido así como los D-isómeros de Glu(?)HXM y Aps(ß)HXM, no potenciaron la eficacia insulinomimética de VOCI2. La invención se ilustrará ahora por los siguientes ejemplos no limitantes.

Procedimientos experimentales (a) Materiales. La glucosa de D-[U-14C] y la glucosa de 2-deoxi-D-[G-3H] se compraron de New England Nuclear (Boston, MA). La colagenasa de tipo I (134 U/mg) se obtuvo de Worthington Biochemicals (Freehold, NJ). La insulina de porcino se compró de Eli Lilly Co. (Indianapolis, IN). La floretina, 2-deoxiglucosa, ? -monohidroxamato de ácido L-glutámico (Glu(?)HXM), hidroxamato glicina (Glu-HXM), hidroxamato de L-isoleucina (isoleu-HXM), hidroxamato de L-triptofano (Trp-HXM), hidroxamato de L-tirosina (Tyr-HXM) y dihidroxamato de L-cistina (Cistina(HXM2) se compraron de Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. El regulador de pH de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRB), (pH 7.4), contiene 110 mM de NaCI, 25 mM de NaHCO3, 5 mM de KC1 , 1.2 mM de KH2PO4, 1.3 mM de MgSO4. Todos los otros compuestos químicos y reactivos utilizados en este estudio fueron de grado analítico. (b) Ratas tratadas con estreptozocina(STZ) La diabetes se indujo mediante una inyección intravenosa única de una solución frescamente preparada de estreptozocina (55 mg/kg de peso corporal) en 0.1 M de regulador de pH de citrato (pH 4.5). El efecto de los compuestos probados en el nivel de grupos en la sangre se determinó 14 días después de la inducción de la diabetes. (c) Preparación de células v/o prueba de lipogénesis Los adipocitos de rata se prepararon esencialmente mediante el método de Rodbell, 1964. Las almohadillas de grasa de rata Wístar macho se cortaron en pequeñas piezas con tijeras y se suspendieron en 3 ml de 5 regulador de pH de KRB. La digestión se llevó a cabo con colagenasa (tipo I, 134 unidades/mg; 1 mg/ml) en una botella de plástico flexible de 25 ml bajo una atmósfera de carbógeno (95% de O2, 5% de CO2) durante 40 minutos a 37°C con agitación vigorosa. Las preparaciones de célula mostraron más de 95% de viabilidad por la exclusión azul tripano al menos 3 horas después de la digestión. Entonces se agregaron 5 ml de regulador de pH y las células pasaron a través de un tamiz de malla. Las células entonces se pudieron mantener durante varios minutos en un tubo de prueba de plástico de 15 ml a temperatura ambiente, flotando, y el regulador de pH subyacente se removió. Dicho procedimiento (suspensión, flotación, y remoción del regulador de pH subyacente) se repitió tres veces. En la prueba lipogénica, para la medición de toma de glucosa y su incorporación en lípidos (lipogénesis), la suspensión de adipocito (3x105 células/ml) se dividieron en frascos de plástico (0.5 ml por frasco) y se incubaron durante 60 minutos a 37°C bajo una atmósfera de carbógeno con 0.2 mM de glucosa [U-14C] (4-7 mCi/moles), ya sea en la ausencia o presencia de insulina (100 ng/ml), y los complejos por probarse. La lipogénesis se determinó por la adición de fluido de escintilación con base en tolueno (1.0 ml por frasco) y se contó la radioactividad en lípidos extraídos (Moody et al., ->^*^^^¿^=aAa &^ +t ¡&S&¡!&h3Ai má&£ 1974). En un experimento típico, la lipogénesis estimulada por insulina fue 4-5 veces superior a la basal. Basal V «2000 cpm o 3x105 célula/insulina V « 8,000-10,000 cpm o 3x105 célula/h.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Potenciación in vitro de la capacidad lipoqénica de concentraciones bajas de VOCIg (10mM) por concentraciones equimolares de monohidroxamatos Se descubrió que el siguiente protocolo era una prueba confiable in vitro, lo que es indicativo para los efectos de potenciación de los monohidroxamatos en vanadio (+4) en ratas de STZ in vivo. La activación de lipogénesis se llevó a cabo como se describió en los procedimientos experimentales, sección (c), utilizando soluciones de 10 µM de varios monohidroxamatos de aminoácidos libres (HXM), solución de 10µm de VOCI2 (+4), o solución de 10 µM de complejo 1 :1 frescamente preparado de HXM aminoácido:VOCI2. Se probaron los siguientes monohidroxamatos de aminoácido: ?- monohidroxamato de ácido L-glutamico [Glu(?)HXM], hidroxamato de glicina (Gly-HXM), hidroxamato de L-isoleucina (lle-HXM), hidroxamato de L- triptofano (Trp-HXM), hidroxamato de L-tirosina (Tyr-HXM), dihidroxamato de L-cistina [Cys(HXM)2], hidraxamato de L-lisina (Lys-HXM), hidroxamato de ácido nicotinico (Nic-HXM), hidroxamato de L-arginina (Arg-HXM), hidroxamato de L-histidina (His-HXM), ?-monohidroxamato de ácido D- glutamico [D-Glu(?)HXM], ?-monohidroxamato de ácido N-acetil-L-glutámico 5 [N-acetil-Glu(?)HXM], ß-monohidroxamato de ácido L-aspartico [Asp(ß)HXM], monohidroxamato de ácido aminoisobutírico (Aib-HXM). Los resultados se resumen en los cuadros I y II. Como se muestra en el cuadro 1 , el Glu(?)HXM (10 µM), el VOCI2 (10 mm) o su complejo 1 :1 produjeron 22%, 40% y 117%, respectivamente, de la respuesta de insulina máxima. El efecto de potenciación pura cuantificó por lo tanto 51%. El Nic-HXM también potencia a la capacidad lipogénica de VOCI2 (29%, efecto de potenciación pura del cuadro 1 ). Otros hidroxamatos de aminoácidos estudiados no potenciaron el efecto de vanadio (+4). Lo anterior es válido para el D-Glu(?)HXM y para N-acetil-Glu(?)HXM, indicando que para Glu(?)HXM, el grupo a-amino libre y la forma L-isomérica son esenciales para la potenciación.

CUADRO 1 Potenciación de la capacidad lipogénica de concentraciones bajas de VOCIg (10 µM) por concentraciones equimolares de mono hidroxamatos de aminoácido Porciento de efecto máximo de insulina CUADRO 2 Efecto insulinomimético de varios VOCI2: HXM (1 :1). en comparación con L-Glu(?)HXM: VOCM1 :1) Complejo 1 :1 de VOCI2 y % de actividad relativa a Glu(?)HXM COCI2 L-Glu(?)HXM 100% L-Asp(ß)HXM, Nic-HMX 70% D-Glu(?)HXM, Glu(?)HXM de N-acetilo, D-Asp(ß)HXM Aib-HXM, Lys-HXM, Arg-HXM, Trp- 0% HXM, His-HXM EJEMPLO 2 Activación de lipoqénesis in vitro dependiente de concentración mediante un complejo 1 :1 a 1 :5 de GluMHXM: VOCIg en comparación con el VOC libre y el GluMHXM libre Con el fin de determinar la relación más efectiva del complejo Glu(?)HXM: VOCb para sinergizar la potencia insulinomimética de vanadio, la lipogénesis se llevó a cabo como se describió en los procedimientos experimentales, sección (c), utilizando complejos 1 :1 a 5:1 de Glu(?)HXM: VOCI2, VOCI2 libre, y Glu(?)HXM libre. Los resultados mostrados en la figura 1 demuestran que, en comparación con la potencia lipogénica de VOCI2 de 5 mm sólo y formado en complejo con concentraciones crecientes de Glu(?)HXM (5-25 µM), a un complejo estoiquiométrico de 1 :1 , se descubrió que es más efectivo en la sinergización de la potencia insulinomimética de vanadio (+4).

EJEMPLO 3 Efecto de GluMHXM: VOCb (complejo 1 :1) en niveles de glucosa en la sangre (BGL) de ratas-STZ; comparación con VOCI2 bajo solo Con el fin de mostrar que los quelatadores de monohidroxamato de aminoácido de vanadio (+4) potencian el efecto normoglicémico de vanadio in vivo, las ratas tratadas con STZ (véanse procedimientos experimentales, sección (b)), se proveyeron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de VOCI2 (0.02 mmoles/kg/día) o de complejo 1 :1 de VOCI2:Glu(?)HXM (0.02 mmoles/kg rata/día). Los niveles de glucosa en la sangre se midieron durante un período de 12 días. Los resultados se muestran en la figura 2, los cuales muestran las inyecciones i.p. diarias de una dosis baja de VOCI2 por sí misma (aproximadamente 2 mg de vanadio/kg/día) no tuvieron un efecto significativo en la reducción de niveles de glucosa en la sangre, mientras que el complejo 1 :1 de Glu(?)HXM:VOCI2 (aproximadamente 1 mg de vanadio/kg/día) fue efectivo en la producción de una reducción considerable en los niveles de glucosa en la sangre de ratas tratadas con STZ a valores normales. La normoglicemia estable se logró 2 días después de administrar el complejo, y persistió durante varios días después de la administración (figura 2, la línea punteada representa los niveles de glucosa en la sangre de control de ratas saludables). La cantidad de vanadio libre (+4) requerido para inducir normoglicemia, es 9.3 mg/kg/día (administración i.p.). El complejo Glu(?)HXM:VOCI2 (1 :1 ) redujo la dosis diaria a alrededor de 1 mg/kg/día (administración i.p.). De esta forma, en dicho modelo de rata tratada con STZ in vivo, la formación de complejo de vanadio (+4) a Glu(?)HXM parece potenciar el vanadio (+4) a alrededor de 9 veces.

EJEMPLO 4 Monohidroxamatos que también sinerqizan la potencia insulinomimética del vanadio (+5):L-Glu(?)HXM que altamente potencia el vanadio (+5) para activar el metabolismo de glucosa en adipocitos de rata Con el fin de probar el efecto sinergístico de Glu(?)HXM en la formación de complejos con vanadato (+5), la lipogénesis se llevó a cabo como se describió en los procedimientos experimentales, sección (c) con concentraciones que varían de 10 µm a 50 µm de complejo de 1 :1 de Glu(?)HXM:VO4+3(+5), Na3VO4 libre y Glu(?)HXM libre, respectivamente. A diferencia del quelatador de dihidroxamato designado RL-252 descrito en la patente de E.U.A. 5,338,759, el cual se descubrió que potencia la capacidad insulinomimética del vanadio (+4) pero que no tiene efecto en, incluso reducido, en la potencia del vanadio (+5) in vitro, el Glu(?)HXM potenció de manera considerable el efecto de vanadato (+5) similar a la insulina (figura 3). Se estima que el Glu(?)HXM:VO +3(+5) es al menos 7 veces más potente en la activación de lipogénesis al compararse con el Na3VO4 libre o el Glu(?)HXM libre.

EJEMPLO 5 Complejo GluMHXM v Glu(?)HXM:NaVOa (2:1) estimula el influjo de hexosa.

Con el fin de probar el efecto específico del Glu(?)HXM libre y el complejo Glu(?)HXM:NaVO3 (2:1) en la entrada de la glucosa en las células, se llevó a cabo una prueba in vitro utilizando 2-deoxi-D[6-3H]glucosa (2-DG). 2-DG es un análogo no metabolizado de glucosa y dicha prueba representa de esta manera la influencia de un compuesto en el influjo de glucosa a las células, independiente del metabolismo de glucosa. Los adipocitos frescamente preparados (3x105 células/ml) suspendidos en regulador de pH de KRB, pH 7.4, que contienen 1.0% de BSA, se preincubaron durante 30 minutos, en la ausencia y la presencia de insulina (17 nM), y las concentraciones indicadas (20 y 40 µm) de Glu(?)HXM, complejo Glu(?)HXM:NaVO3 (2:1 ) y NaVO3. Las alícuotas (70 µl) de las muestras antes mencionadas se transfirieron en tubos que contenían 2-deoxi-D[6-3H]glucosa (0.1 mM de concentración final). Después de 3 minutos, se agregó floretina (0.1 nM) con el fin de terminar la penetración del 2-DG en las células. Las muestras de las células suspendidas entonces se transfirieron a tubos con aceite de silicón en donde, con centrifugación, las células se separaron del medio de KRB y dejaron 2-DG. Como se muestra en la figura 4, se descubrió que el Glu(?)HXM libre y el complejo Glu(?)HXM:NaVO3 (2:1 ) activan la entrada de glucosa en - ***>* ~ ^^¡^^gg^^j las células independientemente del metabolismo de la glucosa. La magnitud del efecto se cuantificó a alrededor de 60% y 120%, respectivamente, de la respuesta máxima de insulina.

EJEMPLO 6 Complejo Glu(?,HXM:NaVQ3 (2:1) reduce los niveles de glucosa en la sangre en ratas tratadas con STZ Con el fin de mostrar que los complejos de vanadio (+5) y los quelatadores de monohidroxamato potencian el efecto normoglicémico de vanadio in vivo y para probar el efecto normoglicémico del Glu(?)HXM libre in vivo, las ratas diabéticas con STZ se dividieron en 4 grupos de 4-5 ratas cada uno: ratas con control diabético; ratas tratadas con vanadato (+5); ratas tratadas con complejo Glu(?)HXM:NaVO3 (2:1 ); y ratas tratadas con Glu(?)HXM libre. Cada grupo recibió inyecciones i.p. diarias de 0.05 mmoles/kg (a las 11 :00 a.m.), del compuesto correspondiente. Como se muestra en la figura 5, después del primer día (el nivel de glucosa en la sangre se midió a las 8:00 a.m.) el nivel de glucosa en la sangre del grupo tratado con el complejo se redujo a niveles normales.

EJEMPLO 7 GlufyjHXM activa la lipoqénesis en adipocitos de rata en ausencia de vanadio añadido de manera exó ena Con el fin de investigar el potencial normoglicémico del Glu(?)HXM libre, la lipogénesis se llevó a cabo como se describió anteriormente, utilizando concentraciones que varían de entre 10-100 µM de Glu(?)HXM. Como se muestra en la figura 6, el Glu(?)HXM es, entre todos los aglutinantes de vanadio probados en la presente, único en la capacidad de producir efecto de insulina en la ausencia de vanadio añadido de manera exógena. Se asume que el Glu(?)HXM difiere de todos los otros HXM de aminoácido por ser capaz de convertir la cantidad diminuta de vanadio localizado intracelularmente (~20nM) en una especie insulinomiméticamente activa.

EJEMPLO 8 Estauroesporina inhibe la lipoqénesis evocada de Glu( )HXM en adipocitos de rata. Comparación con el efecto de estauroesporina en lipoqénesis evocada de insulina y vanadato La estauroesporina, un inhibidor potencial de CytPTK (Ki - 2nm) adiposo de rata y un inhibidor débil de InsRTK (Ki - 1 µM), de preferencia inhibe el efecto del vanadato en la estimulación de lipogénesis. Con el fin de determinar donde trabaja de igual manera el Glu(?)HXM libre a través de la trayectoria de vanadio, los adipocitos se sometieron a varias concentraciones de estauroesporina (como se indica en la figura 7) durante 30 minutos a 37°C. La lipogénesis entonces se llevó a cabo utilizando adipocitos preparados como se describe anteriormente, en la presencia de insulina (17 nM), metavanadato de sodio (0.8 nM) o Glu(?)HXM (100 µM). La activación máxima (100%) es la que se obtiene con insulina, vanadato o Glu(?)HXM en la ausencia de estauroesporina. La figura 7 muestra la extensión de lipogénesis evocada por el Glu(?)HXM libre, metavanadato de sodio, o insulina en concentraciones en aumento de estauroesporina. La activación de la lipogénesis por Glu(?)HXM se inhibió por la estauroesporina en una forma dependiente de dosis. La curva de inhibición se pareció a la obtenida de la lipogénesis evocada de vanadato (en lugar de insulina), indicando que el Glu(?)HXM libre trabaja a través de la trayectoria de vanadio (no insulinodependiente).

EJEMPLO 9 Lipoqénesis: comparación entre adipocitos normales y adipocitos enriquecidos con vanadio, tratados con GlufyjHXM El Glu(?)HXM libre es único en el sentido de la activación de lipogénesis en adipocitos de rata en la ausencia de vanadio añadido en forma exógena. Se ha establecido en la presente que dicho efecto se manifiesta a través de la trayectoria de vanadio mediante datos experimentales que muestran que el Glu(?)HXM libre es capaz de convertir la cantidad fisiológica diminuta del vanadio presente en forma exógena en adipocitos de rata en una especie insulinomiméticamente activa. Para demostrar dicho efecto, las ratas Wistar macho recibieron inyecciones subcutáneas (s.c.) diarias de NaVO3 (12 mg/kg/día) durante 5 días (designadas en lo sucesivo "ratas enriquecidas con vanadio"). La lipogénesis se llevó a cabo como se describió anteriormente utilizando Glu(?)HXM libre para comparar los adipocitos de rata frescamente preparados (3x105 células/ml) de ratas no enriquecidas con vanadio a las ratas enriquecidas con vanadio. Como se muestra en la figura 8, se descubrió que el Glu(?)HXM libre potencia el efecto del vanadio intracelular en las células de rata enriquecidas con vanadio a una extensión mucho mayor.

EJEMPL0 10 Complejos de vanadio de GluMHXM que son estables Para demostrar que el Glu(?)HXM forma complejos estables con NaVO3 y VOC que permanecen altamente activos durante un período largo cuando se mantienen como polvo seco a temperatura ambiente, complejos de 2:1 de Glu(?)HXM: NaVO3 y Glu(?)HXM: VOCI2 se prepararon al disolver el monohidroxamato y la sal de vanadio en concentraciones equimolares de 2:1 , respectivamente, en agua. Las soluciones acuosas se mezclaron, se ^^^^g ?^g¿ congelaron con nitrógeno líquido, y se liofilizaron. El polvo seco obtenido se pudo mantener a temperatura ambiente durante 4 semanas. La lipogénesís entonces se llevó a cabo como se describió anteriormente, utilizando Glu (?)HXM: NaVO3 y VOCI2, y el Glu(?)HXM: NaVO3 y Glu(?)HXM libres: complejos de 2:1 de VOCI2 como polvos secos. Como se muestra en la figura 1 , ambos complejos mantuvieron su nivel de actividad insulinomimética, indicando que son estables Referencias Brichard, S.M., y Henquin, J.C. (1995) Trends ¡n Pharmacol. Sci. 16, 265-270. Brown, D.A., R.A. Coogan, N.J. Fitzpatrick, W.K. Glass, D.E. Abukshima, L. Shiels, M. Ahlgren, K. Smolander, T.t. Pakkanen, T.A. Pakkanen y M. Perakyla (1996) J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2,2673-2679. Cohén, N., Halberstam, M., Shimovich, P., Chang, C.R., Shamoon, H., y Rossetti, L. (1995) J. Clin. Invest. 95, 2051-2509. Li, J., Elberg, G., Crans, D.C., y Shechter, Y. (1996) Biochemistry 35, 8314-8318. Moody, A, Sta, M.A., Stan, M. y Gliemann, J. (1974) Horm.

Metab. Res. 6, 12-16. Rodbell, M (1964) J. Biol. Chem. 239, 375-80. Sakurai et al. (1995) BBRC, 214,1095-1101.

Shechter, Y., Shisheva, A., Lazar, R., Libman, J. Y Shanzer, A. (1992) Biochemistry 31 , 2063-68. Shechter, Y., Li, J., Meyerovitch, J., Gefel, D., Bruck, R., Elberg, G., Miller, D.S., y Shisheva, A., (1995) Molec. Cell. Biochem. 153, 39-47. Tournaire, R., S. Malley, F. Hamedi-Sangsari, N. Thomasset, J.

Grange, J.F. Dore y J. Vila, (1994) Int. J. Cáncer 58, 420-425. Vila, J., N. Thomasset, C. Navarro y J.F. Dore (1990) Int. J. Cáncer 45, 737-743. &**£&&*&£&&*

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un complejo de vanadio de monohidroxamato de la fórmula (I): R-CO-NHOH.X (I), en donde R es un residuo seleccionado de: (i) H2N-CH (COY)-(CH2)n-, en donde n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2; (ii) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo; y X es un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo (VO2+), metavanadato (VO3") o vanadato (VO43").

2.- El complejo 1 :1 ó 2:1 de vanadilo de ?-monohidroxamato de ácido L-glutámico de conformidad con la reivindicación 1 , de la fórmula: H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH:VOCI2.

3.- El complejo de 1 :1 ó 2:1 de vanadato de ? -monohidroxamato de ácido L-glutámico de conformidad con la reivindicación 1 , de la fórmula: H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH:NaVO3.

4.- El complejo de vanadilo de ß-monohidroxamato de ácido L-aspártico de conformidad con la reivindicación 1 , de la fórmula: H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH:VOCI2.

5.- El complejo de vanadilo de hidroxamato de ácido nicotínico de conformidad con la reivindicación 1 de la fórmula: piridil-3-CO-NHOH:VOCI2.

6.- Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una cantidad efectiva de un complejo de vanadio de un monohidroxamato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, opcionalmente con un portador farmacéuticamente aceptable.

7.- La composición farmacéutica de conformidad con la 5 reivindicación 6, caracterizada además porque es útil para la reducción de niveles de glucosa en la sangre y/o inducción de normoglicemia en pacientes diabéticos.

8.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, en una forma adecuada para administración oral. 10

9.- La composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes que comprende un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo, metavanadato y vanadato, y un monohidroxamato de la fórmula R- CO-NHOH, en donde R es un residuo seleccionado de: (i) H2N-CH (COY)- (CH2)n-, en donde n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2; (ii) H2N-CH (COOH)-CH2-S- 15 CH2-; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolínilo; en donde dicha sal de vanadio y dicho monohidroxamato se separan entre sí en la composición.

10.- Un empaque farmacéutico que tiene dos compartimentos, un primer compartimento que contiene un compuesto de vanadio seleccionado de una sal de vanadilo, metavanadato y vanadato, y un segundo 20 compartimento que contiene un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH, en donde R se selecciona de: (i) H2N-CH (COY)-(CH2)n, en donde n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2; (ii) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; y (iii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo; e instrucciones acerca de como administrarlas para la reducción de niveles de glucosa en la sangre y/o la inducción de normoglicemia en pacientes diabéticos.

11.- El uso de un complejo de vanadio de un monohidroxamato como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición farmacéutica para la reducción de niveles de glucosa en la sangre y/o la inducción de normoglicemia en pacientes diabéticos.

12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el compuesto de vanadio se selecciona de una sal de vanadilo, metavanadato y vanadato, y una cantidad efectiva de un monohidroxamato de la fórmula R-CO-NHOH, en donde R se selecciona de: (i) H2N-CH (COY)- (CH2)n-, en donde n es 1 , 2 ó 3, y Y es OH o NH2; (ii) H2N-C (COOH)-CH2-S- CH2-; y (¡ii) piridilo, piperidilo o tetrahidroisoquinolinilo.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde el compuesto de vanadio se administra antes del compuesto de monohidroxamato.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde dicho complejo de vanadio se administra oralmente.

15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde la composición farmacéutica se combina con insulina.