CZ2000845A3 - Komplexy monohydroxamátu vanadu a farmacutické prostředky, které je obsahují - Google Patents

Abstract

Monohydroxamát komplexů vanadu obecného vzorce I: RCO-NHOHX, kde Rje zbytek získaný z: H2N-CH(COY)- (CH2)n-, kde nje 1,2 nebo 3 a Yje OHnebo NH2; H2NCH(COOH)-CH2-S-CH2-; a (iii) pyridtyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl; a Xje sloučenina vanadu, získaná ze solí vanadylu (VO24), metavanadičnanu (VOý) a vanadičnanu (VO43.), jsou použitelné pro indukci normogtycemie a/nebo redukci množství glukosy v krvi u pacientů, kteří mají cukrovku.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká monohydroxamátových komplexů vanadu a farmaceutických prostředků, které je obsahují a jsou použitelné pro léčbu cukrovky.

Zkratky: Asp(p)HXM, β-monohydroxamát L-asparagové kyseliny; CytPTK, cytosolová protein-tyrosinová kinasa; Glu(y)HXM, γ-monohydroxamát L-glutamové kyseliny; HXM, monohydroxamát; InsRTK, inzulínový receptor tyrosinové kinasy; IRS-1, inzulínový receptor substrátu 1; PTK, protein-tyrosinová kinasa; KRB, Krebs Ringerův uhličitan; NaV03, vanadičnan sodný; STZ, streptozocin; VOSO4, síran vanadylu; VOCI2, chlorid vanadylu.

Dosavadní stav techniky

V posledních dvou dekádách se uskutečnily intenzivní studie efektu vanadu napodobujícího inzulín (souborný článek Shechter et al., 1995). In vitro, sole vanadu napodobují většinu efektů inzulínu v hlavní cílové tkáni hormonu a in vivo indukují normoglycemii a zlepšují homeostázu glukosy v hlodavcích majících cukrovku, kteří nemají dostatek inzulínu nebo jsou odolní proti inzulínu (souborný článek Brichard and Henquin, 1995). V hranicích základního výzkumu se sbírají data, aby mohlo být ukázáno, že sole vanadu projevují metabolické efekty podobné inzulínu v důsledku alternativních drah, netýkající se aktivace inzulínového receptorů tyrosinové kinasy, ani fosforylace inzulínového receptorů substrátu 1 (IRS-1). Klíčoví hráči tohoto podporovaného systému vyžadují inhibici protein-fosfotyrosinových fosfátů a aktivaci nereceptorového proteinu tyrosinových kinas (recenzováno v Brichard and Henquin, 1995).

Vanad je ultrastopový prvek u savců. Dietní příjem se pohybuje mezi 10 až 60 pg za den a vnitrobuněčná koncentrace je přibližně 20 nM (recenzováno v Shechter et al., 1995 a Brichard and Henquin, 1995). Většina vnitrobuněčného vanadu je přítomna ve vanadyl formě (+4). Akutní orální podávání sloučenin vanadu se ukazuje jako mírně toxické. Nicméně, skutečné antidiabetické efekty orální terapie vanadu v hlodavcích majících cukrovku, a kteří nemají dostatek inzulínu nebo jsou odolní proti inzulínu (souborný článek Brichard and Henquin, 1995) podporují start klinických studií. Malé dávky vanadu byly poskytovány (100 až 125

0000

0 0 0 ·

0

0

0

0 00

studiích na zvířatech bylo pozorováno několik prospěšných efektů (Cohen et al., 1995).

Organické komplexy vázaného vanadu (+4) jsou asi 5 krát více účinné než volný vanad (+4), což napomáhá metabolickým efektům inzulínu in vitro (Li et al., 1996) a v STZ krysách in vivo (Sakurai et al., 1995). Teoretický základ se stále ještě zkoumá a je pravděpodobně výsledkem stabilizujících více účinných druhů vanadu podobných inzulínu.

Vanadiové sole napodobují metabolické efekty inzulínu během alternativního, na inzulínu nezávislého použitého prostředku in vitro a mohou překonat stavy rezistence inzulínu v diabetických hlodavcích in vivo. Terapie vanadem, jako taková, může způsobovat užitečný, atraktivní a komplementární přístup k inzulínové terapii, za předpokladu, že sole vanadu by byly méně toxické neboť jistá manipulace by mohla být provedena v terapii vanadu s žádným nebo redukovaným množstvím exogenních zdrojů vanadu.

aplikace komplexů vanadylu dihydroxamátu následujícího obecného vzorce:

R²R³C{CH₂O (CH₂)_m CO[NHCR (CH₂)_q CO]_nNOHR'}₂ který je použitelný pro léčení cukrovky, ale vynálezci později zjistili, že jsou nevhodné in vivo pro normalizování množství glukosy v krvi modelových krys majících cukrovku.

Ukázalo se, že deriváty hydroxamové kyseliny jsou vyžadovány v mikrobiálním transportu železa a z tohoto důvodu byly navrženy pro léčení forem nedostatku železa. Jsou také inhibitory močové aktivity a jsou navrženy pro léčení hepatického komatu. Mnoho jejich biologických aktivit se týká jejich vlivu tvořit cheláty různých kovů. Ve většině kovových chelátů tvořených hydroxamovou kyselinou, koordinace se tvoří deprotonací OH skupiny a pozdější (0,0) koordinací s karbonylovým kyslíkem a deprotonovanou OH skupinou.

Monohydroxamáty aminokyselin jsou jednoduché, netoxické deriváty aminokyselin. U βhydroxamátu D-asparagové kyseliny (D-Asp(P)HXM) bylo ukázáno, že má protinádorovou aktivitu na murinovou leukémii L5178Y, jak in vitro, tak in vivo a je aktivní proti buňkám Friend leukémie in vitro (Toumaire et al., 1994). (y)-monohydroxamát L-glutamové kyseliny (Glu(y)HXM) je cytotoxický proti leukémii u L1210 buněk in vitro a proti leukémii u L1210 a melanomových B16 buněk in vivo (Vila et al., 1990).

Podstata vynálezu

V souvislosti s předkládaným vynálezem bylo zjištěno, že některé monohydroxamáty aminokyselin (HXM), zvláště L-formy γ-monohydroxamátu glutamové kyseliny • ···· ·· ···· ·· ·· • · · 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · ·· · · · ♦ • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 99 9 99 9 9 (Glu(y)HXM) a β-hydroxamáty asparagové kyseliny (D-Asp(P)HXM), interagují s vanadem (+4) a vanadem (+5). V molárních stechiometrických poměrech 1:1 nebo 2:1 HXM: vanad, vysoce umocňují inzulínu podobné schopnosti vanadu (+4) a (+5) in vitro a normalizují hladinu glukosy v krvi krys léčených streptozocinem in vivo.

Předkládaný vynález se týká nových komplexů monohydroxamátů vanadu obecného vzorce I:

R-CO-NHOH.X (I) kde

R je zbytek získaný z:

(i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)_n(ii) H₂N-CH (COOH)-CH₂-S-CH₂-; a (iii) pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl;

kde n je 1, 2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂; a X je sloučenina vanadu získaná ze solí vanadylu (VO²⁺), metavanadičnanu (VO3') a vanadičnanu (VO4³').

Podle předkládaného vynálezu, v monohydroxamátech výše uvedeného (i), n je vhodněji 1 nebo 2, jmenovitě β- a γ-monohydroxamáty L-asparagové a L-glutamové kyseliny. Ve většině vhodných případů je monohydroxamát aminokyseliny (Glu(y)HXM), o kterém bylo zjištěno, že je více efektivní v projevu metabolických efektů inzulínu v krysích adipocytech, jak může srovnáno s různými monohydroxamáty a-aminokyselin.

Dost zajímavé je to, že se všechny známé cheláty vanadu společně se vyskytující v literatuře, jako acetylacetonát, bispikolinát a dihydroxamát RL-252 popsaný ve výše zmiňovaném US 5,338,759, monohydroxamát aminokyseliny je jedinečný pro její kapacitu produkovat inzulínové efekty, in vitro, při absenci zevně přidaného vanadu, indukujícího, že monohydroxamát aminokyseliny může být schopný přeměňovat nepatrné množství vanadu vyskytujícího se v buňkách (+4, ~20nM) do skupiny napodobující aktivitu inzulínu. Dále studie in vitro ukázaly, že (Glu(y)HXM) usnadňuje všechny fyziologicky důležité bioefekty inzulínu. Tyto zahrnují absorpci hexosy a inhibici lipolysy zprostředkovanou isoproterenolem. Je docela zajímavé, že aktivace (Glu(y)HXM) se přičítá k dosaženému maximálnímu efektu produkovaného nasyceným koncentrovaným inzulínem.

Mezi monohydroxamáty uvedenými výše (iii) jsou preferovány 3-pyridyl radikál, jmenovitě hydroxamát nikotinové kyseliny, 2- nebo 3-piperidyl radikál a 3tetrahydroisochinolinylový radikál.

Monohydroxamáty použité v předkládaném vynálezu jsou ve vodě rozpustné, tím pádem se liší od dihydroxamátů uvedených ve výše zmiňovaném US 5,338,759, které jsou ve vodě • ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · φ φ • · 9 9 ··· 9 · · 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 999 99 99 nerozpustné. Takto, komplexy vanadu v předkládaném vynálezu mohou být připraveny jednoduchým rozpuštěním ve vodě obsahující monohydroxamát a sůl vanadu.

Příklady solí vanadu použitelných k tvorbě komplexů a použitelných v předkládaném vynálezu jsou, ale není to limitující, VOCI2 (+4), VOSO4 (+4), NaVCh (+5) a NasVCL (+5).

V předkládaném vynálezu jsou předpokládány různé stechiometrické molární poměry komplexů HXM: soli vanadu, ale molární poměry 1:1 a 2 HXM: 1 soli vanadu jsou výhodné.

Komplexy obecného vzorce I v tomto vynálezu jsou připraveny smícháním vodného roztoku monohydroxamátu a soli vanadu, ochlazením a lyofilizaci roztoku tak, že získáme suchý prášek, který může být skladován, například při pokojové teplotě.

Vynález dále poskytuje farmaceutický prostředek použitelný pro léčení cukrovky, obzvláště pro redukci množství glukosy v krvi a indukci normoglycemie u pacientů s cukrovkou, obsahující komplex monohydroxamátu vanadu obecného vzorce I jako aktivní ingredience a výhodně obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Tento prostředek může být použit pro léčení jak cukrovky závislé na inzulínu (IDDM), tak cukrovky nezávislé na inzulínu (NEDDM).

Podávána dávka bude závislá na podmínkách pacienta s cukrovkou a může být v rozsahu od 0,2 mg/kg do 2 mg/kg denně. Protože je požadované množství vanadu použitého pro léčení pacienta s cukrovkou v klinickém testu v současné době asi 2 mg/kg/den, minimální množství poskytované předkládaným vynálezem reprezentuje 10-ti násobné zvýšení v účinnosti.

Prostředky vynálezu obsahující komplex vanadu obecného vzorce I mohou být prezentovány v rozpustné formě, jako jsou kapky, nebo ve formě kapslí nebo tablet a jsou vhodněji podávány orálně. Mohou být podávány samostatně nebo v kombinaci s inzulínem.

Komplex vanadu, který má obecný vzorec I, může být také získán in vivo odděleným podáváním sole vanadu a monohydroxamátu. Vynález takto dále obsahuje farmaceutické balení obsahující farmaceutický prostředek obsahující monohydroxamát obecného vzorce RCO-NHOH, kde R je získáno z: (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)_n-; H₂N-CH (COOH)-CH₂-S-CH₂-; a pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl; a n je 1, 2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂; a farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu vanadu byl získán ze solí vanadylu (VO²⁺), metavanadičnanu (VO3') a vanadičnanů (VO4³) s instrukcemi, jak je podávat. Vhodněji, prostředek, který obsahuje sůl vanadu, je podáván přednostně před monohydroxamátovým prostředkem. Dvě ingredience mohou být také obsaženy v rámci děleného jednoho prostředku, například kapsle, separované nepropustnou membránou.

Protože může být monohydroxamát výše uvedeného obecného vzorce R-CO-NHOH, obzvláště (Glu(y)HXM) asociován s endogenním vnitrobuněčným vanadem, později může být • «·«· ·· ···· ·· ·· • · · · · · ···· • · · ♦ · · · ···* • · · · · ·»···· • · · · · · · · · ··· · ·· ·*· ·· ·· modifikován na farmaceutický prostředek pro léčení cukrovky a může obsahovat monohydroxamát obecného vzorce R-CO-NHOH, kde R je zbytek získaný z: (i) H₂N-CH (C0Y)-(CH2)_n-; H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; a pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl; a n je 1,2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂.

Vynález se dále týká použití monohydroxamátu obecného vzorce R-CO-NHOH, kde R je zbytek získaný z: (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)„-; H₂N-CH (COOH)-CH₂-S-CH₂-; a pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl; a n je 1, 2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂ pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení cukrovky.

V jiném způsobu, se vynález týká metody pro redukci množství glukosy v krvi u pacientů, kteří mají cukrovku, která zahrnuje podávání účinného množství komplexu vanadu monohydroxamátu obecného vzorce I výše zmíněným pacientům, který je uveden v předkládaném vynálezu nebo účinná množství monohydroxamátu obecného vzorce R-CONHOH uvedeného v předkládaném vynálezu a sloučeniny vanadu získané ze solí vanadylu (VO ), metavanadičnanu (VO3 ) a vanadičnanu (VO4 ) nebo účinná množství monohydroxamátu obecného vzorce R-CO-NHOH, který je uveden v předkládaném vynálezu, samostatně nebo v kombinaci s inzulínovou terapií.

V dalším využití se vynález týká metody pro indukování normoglycemie u pacientů, kteří mají cukrovku, která zahrnuje podávání účinného množství komplexu vanadu monohydroxamátu obecného vzorce I výše zmíněným pacientům, který je uveden v předkládaném vynálezu nebo účinná množství monohydroxamátu obecného vzorce R-CONHOH uvedeného v předkládaném vynálezu a sloučeniny vanadu získané ze solí vanadylu (VO ), metavanadičnanu (VO₃ ) a vanadičnanu (VO4 ') nebo účinná množství monohydroxamátu obecného vzorce R-CO-NHOH, který je uveden v předkládaném vynálezu, samostatně nebo v kombinaci s inzulínovou terapií.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje koncentraci závislou na aktivaci lipogeneze 1:1 až 1:5 komplexu G1u(y)HXM:VOC1₂ (+4) ve srovnání s volným VOC1₂ a volným Glu(y)HXM.

Obrázek 2 ukazuje, že 1:1 komplex G1u(y)HXM:V0C1₂ (+4) umožňuje normoglycemický efekt vanadu v STZ-krysách ve srovnání s volným VOC1₂.

Obrázek 3 ukazuje koncentraci závislou na aktivaci lipogeneze Glu(y)HXM:NaV03 (1:1 komplex), volným NaVO3 a volným Glu(y)HXM.

• fefefefe fefe fefefefe ·· fefe ·· · · fe fe · · · · • · fefefefefe fefefefe • · fefefe ······ fefefefe····· • fefe fe fefe fefefe fefe fefe

Obrázek 4 ukazuje, že volný Glu(y)HXM, volný NaVOs a 2:1 komplex Glu(y)HXM:NaV03 simuluje zvýšení množství hexosy ve dvou rozdílných koncentracích.

Obrázek 5 ukazuje, že Glu(y)HXM:NaV03 (2:1 komplex) snižuje množství glukosy v krvi v STZ-léčených krysách ve srovnání s volným Glu(y)HXM a volným NaV03.

Obrázek 6 ukazuje, že volný Glu(y)HXM aktivuje lipogenezi vadipocytech krys s nedostatkem exogenně přidaného vanadu.

Obrázek 7 ukazuje rozsah lipogeneze vyvolané buď volným Glu(y)HXM, volným NaV03 nebo inzulínem při zvyšující se koncentraci staurosporinu.

Obrázek 8 ukazuje srovnání aktivace lipogeneze vyvolané zvyšující se koncentrací volného Glu(y)HXM v normálních adipocytech a v adipocytech obohacených vanadem.

Obrázek 9 ukazuje srovnání kapacity lipogeneze volného Glu(y)HXM, VOCI2, a NaVO3 a suchého prášku Glu(y)HXM:VOCl₂ a Glu(y)HXM:NaV03 2:1 komplexů uchovávaných při pokojové teplotě.

Podle předkládaného vynálezu, jedinečný a specifický potenciál vanadu napodobovat inzulín, je dosažen určitými monohydroxamátovými komplexy vanadu. Obzvláště, monohydroxamát L-y-glutamové kyseliny (Glu(y)HXM) umožňuje « 7 až 10 krát zvýšit vanad (+5) v metabolismu aktivujícím glukosu v krysích adipocytech a zvýšit 5 až 7 krát účinnost vanadu tak, aby snižoval množství glukosy v krvi v STZ-léčených krysách s cukrovkou in vivo. Zvýšení je maximální při molárním poměru 2:1 L-Glu(y)HXM:vanad. Obě nemodifikované α-amino a α-karboxyl skupiny L-Glu(y)HXM jsou nezbytné pro účinnost. Kromě toho, synergistická akce L-Glu(y)HXM je stereospecifická a není podpořena D-Glu(y)HXM, ačkoli také tvoří komplexy s vanadem. Dost zajímavé je to, že všechny popsané komplexy vanadu mohou napodobovat akce inzulínu, L-Glu(y)HXM je unikátní ve významu aktivace lipogeneze v krysích adipocytech rovněž za absence exogenně přidaného vanadu. V tomto vynálezu je také uvedeno, že tyto experimentální data ukazují efekt během dráhy vanadu, který dává najevo, že L-Glu(y)HXM je schopný konvertovat minimální fyziologické množství endogenního vanadu v krysích adipocytech na inzulín podobné aktivní skupiny. Chemofyzikální studie tohoto aktivního komplexu uvádějí unikátní fyziochemické znaky. Vanad je udržován v oxidačním stavu +5 při fyziologické hodnotě pH a také je v rovnováze, jestliže je připraven z kationtu vanadylu +4.

Kvantitativní rozbor in vitro použitý v předkládaném vynálezu indikuje, že kromě Glu(y)HXM, také L-Asp(P)HXM a nikotinová kyselina-HXM (v molárním poměru 1:1) umožňují vanadu (+4) napodobovat rovněž efekt inzulínu. Jejich synergistický efekt je ~85 % • · ····· · · · · • · ··· ······ ········· ··· · ·· ··· ·· ·«

Ί a ~57 % použitého Glu(y)HXM. V kontrastu, hydroxamáty α-amino kyselin stejně jako Dizomery jak Glu(y)HXM, tak Asp(fl)HXM neumožňovaly VOCI2 napodobovat schopnost inzulínu.

Vynález bude nyní ilustrován následujícími neomezujícími příklady.

Experimentální podmínky ·« ·*·· (a) Materiály. D-[U-^I4C] glukosa a 2-deoxy-D-[G-³H] glukosa byly koupeny od New England Nuclear (Boston, MA). Colagenasa typu I (134 U/mg) byla získána od Worthington Biochemicals (Freehold, NJ). Prasečí inzulín byl koupen od Eli Lilly Co. (Indianapolis, IN). Floretin, 2-deoxyglukosa, γ-monohydroxamát L-glutamové kyseliny (Glu(y)HXM), glycin hydroxamát (Gly-HXM), L-isoleucin hydroxamát (isoleu-HXM), L-tryptofan hydroxamát (Trp-HXM), L-tyrosin hydroxamát (Tyr-HXM) a L-cystin dihydroxamát (Cystine(HXM)2) byly koupeny od Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO.

Krebs-Ringerův uhličitanový (KRB) pufr, (pH 7,4), obsahující 110 nM NaCl, 25 mM NaHCO₃, 5 mM KC1, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄.

Všechny ostatní chemikálie a činidla použité v této studii byly analytického stupně čistoty.

(b) Streptozocin (STZ)-léčené krysy: Cukrovka byla indukována jedinou intravenózní injekcí čerstvě připraveného roztoku streptozocinu (55 mg/kg tělesné hmotnosti) v 0,1 M citrátovém pufru (pH 4,5). Účinek testovaných sloučenin na množství glukosy v krvi byl zjišťován po 14 dnech od indukce cukrovky.

(c) Příprava buněk a kvantitativní stanovení lipogeneze: Krysí adipocyty byly v podstatě připraveny metodou Rodbella, 1964. Ztučnělé tlapky samčích Wistar krys byly nastříhány nůžkami na malé kousky a suspenzovány ve 3 ml KRB pufru. Rozložení bylo vykonáno kolagenasou (typ 1, 134 jednotek/mg; 1 mg/ml) v 25-ml pružné plastikové lahvi v atmosféře směsi plynů (95 % O₂, 5 % CO₂) po 40 minut při 37 °C za stálého míchání. Buněčný preparát prokázal více než 95 % účinnost modrého Trypanového zbarvení, nejméně 3 hodiny po rozkladu. Potom bylo přidáno 5 ml pufru a buňky byly propasírovány sítem. Potom byly buňky ponechány několik minut v 15-ml plastikové testovací trubici při pokojové teplotě, promíchány a spodek pufru byl odstraněn. Tento postup (suspenze, promíchání a odstranění spodku pufru) byl zopakován třikrát.

V lipogením kvantitativním rozboru pro měření glukosy a jejího začlenění do tuků (lipogeneze), suspenze adipocytů byla rozdělena (3x10⁵ buněk/ml) do plastikových lahviček (0,5 ml do každé lahvičky) a byly inkubovány po dobu 60 minut při 37 °C v atmosféře směsi • »0«0 00 0·0· 00 00 00 0 000 0000

0 00000 0000 0 0 00 0 000 00 0 0 0 00 0 0000

000 0 00 000 00 00 plynů s 0,2 mM [U-¹⁴C] glukosou (4 až 7 mCi/mol) buď za absence nebo přítomnosti inzulínu (100 ng/ml) a komplexy byly testovány. Lipogeneze byla ukončena přidáním scintilační kapaliny na toluenové bázi (1,0 ml do každé lahvičky) a radioaktivita v extrahovaných tucích byla vypočtena (Moody et al., 1974). V typickém experimentu inzulínem stimulovaná lipogeneze byla 4 až 5 krát větší než bazální. Vbazální «2000 c/m na 3x10⁵ buněk/h; Vinzulínová «8000 až 10000 c/m na 3x10⁵ buněk/h.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. In vitro možnost lipogení kapacity malých koncentrací VOCI2 (10 mM) se stejnými molárními koncentracemi monohydroxamátů.

Následující protokol byl shledán, že může být spolehlivým kvantitativním stanovením in vitro, že je důkazem pro možnost efektu monohydroxamátů aminokyseliny vanadu (+4) v STZ-krysách in vivo.

Aktivace lipogeneze byla provedena jak je popsáno v Experimentálních podmínkách, sekci (c), použitím 10 μΜ různých roztoků bez hydroxamátů aminokyselin (HXM), 10 μΜ roztok VOCI2 (+4) nebo 10 μΜ roztokem čerstvě připraveného 1:1 komplexu aminokyselinaHXM:VOC1₂.

Testovány byly následující hydroxamáty aminokyselin: γ-monohydroxamát L-glutamové kyseliny [Glu(y)HXM], glycin hydroxamát (Gly-HXM), L-isoleucin hydroxamát (Ile-HXM), L-tryptofan hydroxamát (Trp-HXM), L-tyrosin hydroxamát (Tyr-HXM), L-cystin dihydroxamát [Cys(HXM)2], L-lysin hydroxamát (Lys-HXM), hydroxamát nikotinové kyseliny (Nic-HXM), L-arginin hydroxamát (Arg-HXM), L-histidin hydroxamát (His-HXM), γ-monohydroxamát D-glutamové kyseliny [D-Glu(y)HXM], γ-monohydroxamát N-acetyl-Lglutamové kyseliny [N-acetyl-Glu(y)HXM], β-monohydroxamát L-asparagové kyseliny [Asp(p)HXM], monohydroxamát aminoisobutyrátové kyseliny [Aib-HXM].

Výsledky jsou shrnuty v Tabulkách Ia II. Jak ukazuje Tabulka 1, Glu(y)HXM (10 μΜ), VOCE (10 mm) nebo jejich 1:1 komplex vytváří 22 %, 40 % a 117 %, v tomto pořadí, maximální inzulínové odezvy. Čistý potenciální efekt je proto do 51 %. Nic-HXM také umožňuje lipogenní kapacitu VOCI2 (29 %, čistý potenciální efekt Tabulka I). Jiné studované hydroxamáty aminokyselin neumožňují efekt vanadu (+4). To samé platí pro D-Glu(y)HXM a N-acetyl-Glu(y)HXM, naznačující, že pro Glu(y)HXM, zbavený α-amino skupiny a Lisomerní formy jsou nezbytné pro tuto účinnost.

Tabulka I. Účinnost lipogenní kapacity nízkých koncentrací VOCI2 (10 μΜ), ekvimolámích koncentrací monohydroxamátů aminokyselin

• 9499	99	4 99 4	49	99
99 4	9	9	4	* ♦	•		«
9 9	9	•	494	• 4	•		«
							«
• 9	9	9	9	4 4	•		a
« 4 9 9	• 4		499	44		94

Procent maximálního efektu inzulínu

	Aminokyselina -HXM pouze (10 μΜ)	VOC12 pouze (10 μΜ)	VOC12:HXM 1:1 (10 μΜ)	Čistý potenciální efekt (%)
Glu(y)HXM	22%	40%	117%	51 %
Nic-HXM	11 %	40%	80%	29%
Aib-HXM	0 % (-3 %)	40%	22%	0
Lys-HXM	0 % (-4 %)	40%	36%	0
D-Glu(y)HXM	1 %	40%	17%	0
N-acetyl Glu(y)HXM	0%	40%	24%	0
L-Asp(3)HXM	8%	11 %	73 %	54%
Arg-HXM	4%	11 %	17%	~2 %
Trp-HXM	2%	11 %	22%	~9 %
His-HXM	4%	11 %	18%	~3 %

Tabulka II. Inzulínu podobný efekt různých VOC1₂:HXM (1:1), ve srovnání sLGlu(y)HXM:VOCl₂ (1:1)

1:1 komplex VOC1₂ a:

L-Glu(y)HXM

L-Asp(p)HXM, Nic-HXM

D-Glu(y)HXM, N-acetyl Glu(y)HXM, D-Asp(3)HXM Aib-HXM, Lys-HXM, Arg-HXM, Trp-HXM, His-HXM % aktivity vztažené ke Glu(y)HXM VOC1₂ 100 % %

0% ···*

Příklad 2. Koncentrace závislá in vitro na aktivaci lipogeneze 1:1 až 1:5 komplexem • · · » • ř 9 *· 999

G1u(y)HXM:VOC1₂ ve srovnání s volným VOC1₂ a volným Glu(y)HXM

Aby byl určen nej efektivnější poměr Glu(y)HXM:VOCl₂ komplexu synergizuj ícího inzulín podobné potence vanadu, byla lipogeneze provedena, jak je popsáno v Experimentálních podmínkách, sekce (c), použitím 1:1 až 5:1 komplexů Glu(y)HXM:VOCl₂, volným VOC1₂ a volným Glu(y)HXM. Výsledky uvedené na obrázku 1 jsou demonstrovány takto, ve srovnání s lipogenní silou 5 mM samotného VOC1₂ a komplexovaným, se zvyšující se koncentrací Glu(y)HXM (5 až 25 μΜ), 1:1 stechiometrický komplex obou byl nalezen nej efektivnější v synergizuj ící inzulín podobné schopnosti vanadu (+4).

Příklad 3. Efekt Glu(y)HXM:VOCl₂ (1:1 komplex) na množství glukosy v krvi (MGK) STZ-krys; Srovnání s nejnižší úrovní samotného VOC1₂.

Aby se ukázalo, že vanadové (+4) cheláty monohydroxamátových aminokyselin umožňují normoglycemický efekt vanadu in vivo, STZ-krysám (viz. Experimentální procedury, sekce (b)), byly dány intraperitoneálně (i.p.) injekce buď VOC1₂ (0,02 mmol/kg/den) nebo VOCl₂:Glu(y)HXM 1:1 komplex (0,02 mmol)/kg krysy/den). Množství glukosy v krvi bylo měřeno v průběhu 12-ti denní periody. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 2 a ukazují, že denní i.p. injekce s nízkou dávkou VOC1₂ (přibližně 2 mg vanadu/kg/den) neměla žádný významný efekt na snižování množství glukosy v krvi, zatímco 1:1 komplex Glu(y)HXM:VOCl₂ (přibližně 1 mg vanadu/kg/den) byl efektivní a způsobil dramatické snížení množství glukosy v krvi STZ-krys vůči normálním hodnotám. Stabilní nonnoglycemie byla dosažena během 2 dní po podání komplexu a pokračovala po několik dní následujícího podávání (obrázek 2, křivka reprezentuje množství glukosy v krvi kontrolovaných zdravých krys).

Množství volného vanadu (+4) potřebného k indukování normoglycemie, je 9,3 mg/kg/den (i.p. podání). G1u(y)HXM:VOC1₂ komplex (1:1) snížil denní dávku přibližně na 1 mg/kg/den. A tak, v tomto in vivo modelu STZ-krys, komplexace vanadu (+4) k G1u(y)HXM potencuje možnost vanadu (+4) okolo 9 krát.

Příklad 4. Monohydroxamáty také synergizuj i schopnost vanadu (+5) napodobovat inzulín: L-G1u(y)HXM umožňuje vanadu (+5) vysoce aktivovat metabolismus glukosy v krysích adipocytech.

Aby byl testován synergistický efekt G1u(y)HXM na komplexací s vanadičnanem (+5), lipogeneze byla provedena jak je popsáno v Experimentálních podmínkách, sekci (c), • · • · · · • 0 · · · · ♦··· • · ····· · · · · • 0 · · · ·♦···· · 9 9 9 9··· ············· s koncentracemi v rozmezí od 10 μΜ do 50 μΜ 1:1 komplexem G1u(y)HXM:VC>4⁺³ (+5), volným Na3VC>4 a volným Glu(y)HXM, v tomto pořadí. Na rozdíl od chelatačního dihydroxamátu určený RL-252 popsaný v US 5338759, byl založen na možnosti zvyšovat inzulínu podobnou kapacitu vanadu (+4), ale neměl na ni žádný efekt, dokonce snížil potenci vanadu (+5) in vitro, Glu(y)HXM dramaticky zvýšil inzulínu podobný efekt vanadičnanu (+5) (obrázek 3). Je odhadnuto, že Glu(y)HXM:VO4⁺³ (+5) je nejméně 7 krát více účinný v aktivaci lipogeneze v porovnání buď s volným Na3VO₄ nebo volným Glu(y)HXM.

Příklad 5. Glu(y)HXM a (2:1) komplex stimulující zvýšení množství hexosy.

Z důvodu testu specifického efektu volného Glu(y)HXM a Glu(y)HXM:NaVO₃ (2:1) komplexu na vstupu glukosy do buněk, in vitro kvantitativní rozbor byl proveden použitím 2deoxy-D-[6-³H]glukosy (2-DG). 2-DG je nemetabolizovatelný analog glukosy a tento kvantitativní rozbor reprezentuje vliv sloučeniny na zvýšení toku glukosy do buněk, nezávislého na metabolismu glukosy.

Čerstvě připravené adipocyty (3x10⁵ buněk/ml) suspendované v KRB pufru pH 7,4, obsahujícím 1,0 % BSA, byly předinkubovávány 30 minut, za absence a přítomnosti inzulínu (17nM) a byly indikovány koncentrace (20 a 40 μΜ) Glu(y)HXM, Glu(y)HXM:NaVO₃ (2:1) komplex a NaVO₃. Alikvotní části (70 μΜ) shora zmíněných vzorků byly přeneseny do zkumavek, které obsahovaly 2-deoxy-D-[6-³H]glukosu (0,1 mM finální koncentrace). Po 3 minutách, byl přidán floretin (0,1 nM), aby ukončil proniknutí 2-DG do buněk. Vzorky suspenzovaných buněk byly potom přeneseny do zkumavek se silikonovým olejem, po centrifugaci byly buňky separovány od KRB prostředí a od zbylé 2-DG.

Jak je ukázáno na obrázku 4, volný Glu(y)HXM a Glu(y)HXM:NaVO₃ (2:1) komplex aktivoval vstup glukosy do buněk nezávislých na metabolismu glukosy. Velikost efektu činila okolo 60 % až 120 % maximální inzulínové odezvy.

Příklad 6. Glu(y)HXM:NaVO₃ (2:1) komplex snižuje množství glukosy v krvi STZléčených krys.

Aby se ukázalo, že komplex vanadu (+5) a chelátory monohydroxamátů umožňují normoglycemický efekt vanadu in vivo a testování normoglycemického efektu volného Glu(y)HXM in vivo, STZ-diabetické krysy byly rozděleny do 4 skupin po 4 až 5 krysách v každé: diabetická kontrola krys; vanadičnanem (+5)-léčené krysy; Glu(Y)HXM:NaVO₃ (2:1) komplexem léčené krysy; a volným Glu(y)HXM léčené krysy. Každá skupina denně dostala

i.p. injekci 0,05 mmol/kg (v 11.00 hodin), odpovídající sloučeniny. Jak je ukázáno na obrázku • · · 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 · • 0 00· 00000

0· 0 000

0000 00000 00 00

5, po prvním dni (množství glukosy v krvi bylo měřeno v 8.00 hodin) množství glukosy v krvi komplexem léčené skupiny bylo sníženo na normální množství.

Příklad 7. Glu(y)HXM aktivuje lipogenezi v adipocytech krys při absenci exogenně přidaného vanadu.

Aby se vyzkoumal normoglycemický potenciál volného Glu(y)HXM, lipogeneze byla provedena jak bylo popsáno výše použitím koncentrací dosahujících hodnot mezi 10 až 100 μΜ Glu(y)HXM. Jak je ukázáno na obrázku 6, Glu(y)HXM je zkoušen, společně s veškerými vanadiovými sloučeninami testovanými v tomto vynálezu, v kapacitě produkce inzulínového efektu při absenci exogenně přidaného vanadu. Je předpokládáno, že L-Glu(y)HXM se liší od všech jiných HXM-aminokyselin ve schopnosti přeměňovat velmi nepatrné množství vnitrobuněčně umístěného vanadu (~20 nM) do aktivovaných látek schopných napodobovat inzulín.

Příklad 8. Staurosporin inhibuje Glu(y)HXM-vyvolanou lipogenezi v adipocytech krys. Srovnání staurosporinového efektu na lipogenezi vyvolanou inzulínem a vanadem.

Staurosporine, možný inhibitor krysí-adiposy CytPTK (ki ~2 nM) a slabý inhibitor InsRTK (ki ~lnM), přednostně inhibuje efekt vanadičnanu ve stimulující lipogenezi. Aby se určilo jestli volný Glu(y)HXM také dokončí dráhu vanadu, adipocyty byly vystaveny různým koncentracím staurosporinu (jak je uvedeno na obrázku 7) po 30 minut při 37 °C. Lipogeneze byla potom provedena použitím adipocytů připravených jak je popsáno výše, v přítomnosti inzulínu (17 nM), metavanadičnanu sodného (0,8mM) nebo Glu(y)HXM (100 μΜ). Maximální aktivace (100 %) je získána inzulínem, vanadičnanem nebo Glu(y)HXM při absenci staurosporinu.

Obrázek 7 ukazuje rozsah lipogeneze vyvolané volným Glu(y)HXM, metavanadičnanem sodným nebo inzulínem při zvyšující se koncentraci staurosporinu. Aktivace lipogeneze Glu(y)HXM byla inhibována staurosporinem v dávce závislé na způsobu podání. Inhibiční křivka je podobná té, která byla získána vanadičnanem (spíše než inzulínem) vyvolanou lipogenezi, naznačující, že volný Glu(y)HXM dokončí (na inzulínu nezávislou) dráhu vanadu.

Příklad 9. Lipogeneze: srovnání normálních adipocytů a vanadem obohacených adipocytů, léčených Glu(y)HXM.

Volný Glu(y)HXMje z určitého hlediska jedinečný při aktivaci lipogeneze v adipocytech krys za absence exogenně přidaného vanadu. V tomto vynálezu je nepopiratelné, že tento ·

0 0 0 0 0 0 0 · 000·

0 ·00 »0000

00 0 000

0000 00 000 00 · · 13 efekt je zjevný v dráze vanadu a experimentální data ukazují, že volný Glu(y)HXM je schopný přeměňovat velmi nepatrné fyziologického množství endogenně přítomného vanadu v adipocytech krys v aktivní látku schopnou napodobovat inzulín.

K demonstrování tohoto efektu, samec Wistar krysy dostával denní podkožní (s.c.) injekci NaVCL (12 mg/kg/den) po pět dnů (potom v tomto vynálezu označené vanadem obohacené krysy”). Lipogeneze byla provedena, jak je popsáno výše, použitím volného Glu(y)HXM ke srovnání čerstvě připravených adipocytů krys (3x10⁵ buněk/ml) z vanadem neobohacených krys do vanadem obohacených krys. Jak ukazuje obrázek 8, volný Glu(y)HXM zvyšoval možnosti efektu vnitrobuněčného vanadu v buňkách vanadem obohacených krys v mnohem větším rozsahu.

Příklad 10. Vanadové komplexy Glu(y)HXM jsou stabilní.

K důkazu, že Glu(y)HXM vytváří stabilní komplexy s NaV(>3 a VOCh, které zůstávají vysoce aktivní po dosti dlouhou časovou periodu, když jsou udržovány jako suchý prášek při pokojové teplotě, 2:1 komplexy Glu(y)HXM:NaVO₃ a G1u(y)HXM:VOC1₂ byly připraveny rozpuštěním monohydroxamátu a soli vanadu v ekvimolárních koncentracích 2:1, ve vodě, v tomto pořadí. Vodný roztok byl potom zamíchán, zmražen kapalným dusíkem a lyofilizován. Získaný suchý prášek byl ponechán při pokojové teplotě po 4 týdny. Lipogeneze byla poté provedena jak je popsáno výše, použitím volného G1u(y)HXM, NaVCL, VOC1₂ a Glu(y)HXM:NaVO3, G1u(y)HXM:VOC1₂ 2:1 komplexů jako suchých prášků. Jak je ukázáno na obrázku 9, oba komplexy udržovaly svoji hladinu inzulínu podobné aktivity, naznačující, že jsou stabilní.

Odkazy

Brichard, S.M., and Henquin, J.C. (1995) Trends in Pharmacol. Sci. 16, 265-270.

Brown, D.A., R.A. Coogan, N.J. Fitzpatrick, W.K. Glass, D.E. Abukshima, L. Shiels, M. Ahlgren, K. Smolander, T.t. Pakkanen, T.A. Pakkanen and M. Perakyla (1996) J.Chem.Soc., Perkin Trans. 2, 2673-2679.

Cohen, N., Halberstam, M., Shimovich, P., Chang, C.R., Shamoon, H., and Rossetti, L. (1995) J. Clin. Invest. 95, 2051-2509.

Li, J., Elberg, G., Crans, D.C., and Shechter, Y. (1996) Biochemistry 35, 8314-8318.

Moody, A, Sta, M.A., Stan, M., and Gliemann, J. (1974) Horm. Metab. Res. 6, 12-16.

Rodbell, M (1964) J. Biol. Chem. 239, 375-80.

Sakurai et.al. (1995) BBRC,214,1095-1101.

♦ ···« »« ···· ·· ·· *· · · · · 9 9 9 9 • · · · ··· · · « · • · · · · ····«· • · 9 9 9 9 9 9 9 • 99 9 9· ··· 9· 99

Shechter, Υ., Shisheva, A., Lazar, R., Libman, J. and Shanazer, A. (1992) Biochemistry 31, 2063-68.

Shechter, Y., Li, J., Meyerovitch, J., Gefel, D., Bruck, R., Elberg, G., Miller, D.S., and Shisheva, A., (1995) Molec. Cell. Biochem. 153, 39-47.

Toumaire, R., S. Malley, F. Hamedi-Sangsari, N. Thomasset, J. Grange, J.F. Doře and J. Vila,(1994) Int.J. Cancer 58, 420-425.

Vila, J., N. Thomasset, C. Navarro and J.F. Doře (1990) Int.J.Cancer 45, 737-743.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Komplexy monohydroxamátů vanadu vyznačující se tím, že zahrnují obecný vzorec I:

   R-CO-NHOH.X (I) kde

   R je zbytek získaný z:

   (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)_nkde n je 1,2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂;

   (ii) H₂N-CH (COOH)-CH₂-S-CH₂~; a (iii) pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl;

   a X je sloučenina vanadu získaná ze solí vanadylu (VO²⁺), metavanadičnanu (VO3') a vanadičnanu (VO4³').
2. 2. Komplex vanadylu γ-monohydroxamátu L-glutamové kyseliny 1:1 nebo 2:1 podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje obecný vzorec:

   H₂N-CH(COOH)-CH₂-CH₂-CO-NHOH: VOC1₂
3. 3. Komplex vanadičnanu γ-monohydroxamátu L-glutamové kyseliny 1:1 nebo 2:1 podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje obecný vzorec:

   H₂N-CH(COOH)-CH₂-CH₂-CO-NHOH:NaVO₃
4. 4. Komplex vanadylu β-monohydroxamátu L-asparagové kyseliny podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje obecný vzorec:

   H₂N-CH(COOH)-CH₂-CO-NHOH: VOC1₂
5. 5. Komplex vanadylu monohydroxamátů nikotinové kyseliny podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje obecný vzorec: pyridyl-3-CO-NHOH: VOC1₂
6. 6. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje aktivní ingredienci účinného množství komplexu vanadu monohydroxamátů, jak je požadováno podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, výhodně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   9 9999 99 9999 99 99 ·* · ··· 9 9 9 9

   4 4 4 4 4«· 9 9 9 9 • · «44 44444«

   4· 44 4 444«

   4··· 99 9 99 9 9 9 9

   Ί. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 vyznačující se tím, že je použitelný pro redukci množství glukosy v krvi a/nebo indukci normoglycemie u pacientů, kteří mají cukrovku.
7. 8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 vyznačující se tím, že je ve vhodné formě pro orální podávání.
8. 9. Farmaceutický prostředek pro léčení cukrovky vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu vanadu získanou ze soli vanadylu, metavanadičnanu a vanadičnanů a monohydroxamátu obecného vzorce R-CO-NHOH, kde R je zbytek získaný z:

   (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)_n-, kde n je 1,2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂;

   (ii) H₂N-CH (COOH)-CH₂-S-CH₂-; a (iii) pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl;

   kde výše uvedená sůl vanadu a výše uvedený monohydroxamát jsou separovány z jiné látky obsažené ve složce.
9. 10. Farmaceutické balení vyznačující se tím, že má dvě části, první část obsahuje sloučeninu vanadu získanou ze soli vanadylu, metavanadičnanu a vanadičnanů a druhá část obsahuje monohydroxamát obecného vzorce R-CO-NHOH, kde R je zbytek získaný z: (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)„-, kde n je 1, 2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂; (ii) H₂N-CH (COOH)CH₂-S-CH₂-; a (iii) pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl, instrukce k podávání pro redukci množství glukosy v krvi a/nebo indukci normoglycemie u pacientů, kteří mají cukrovku.
10. 11. Použití komplexu vanadu monohydroxamátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro přípravu farmaceutického prostředku, který je vhodný pro redukci množství glukosy v krvi a/nebo indukci normoglycemie u pacientů, kteří mají cukrovku.
11. 12. Použití monohydroxamátu mající obecný vzorec R-CO-NHOH, kde R je zbytek získaný z: (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)_n-, kde n je 1, 2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂;

    (ii) H₂N-CH (COOH)-CH₂-S-CH₂-; a (iii) pyridyl, piperidyl nebo tetrahydroisochinolinyl; pro přípravu farmaceutického prostředku použitelného pro redukci množství glukosy v krvi a/nebo indukci normoglycemie u pacientů, kteří mají cukrovku.

    « »·»» »« ··»· ·» *» ·· ···· »·»· • . · « *·» · · · · » « »·· «·»»·« , »«······» > · »it « >* Ct* k* «·
12. 13. Metoda pro redukci množství glukosy v krvi a/nebo indukci normoglycemie/ u pacientů, kteří mají cukrovku vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi

    9 s cukrovkou účinného množství komplexu vanadu monohydroxamátu obecného vzorce

    I: / kQ adičnanu duje 1:1 obecného du je 1:1 íbecného anadu je pacientů, Likrovkou ičnanu a vanadičnanu a monohydroxamátu obecného vzorce R-CO-NHOH, kde R je zbytek /získaný z: (i) H₂N-CH (COY)-(CH₂)_n-, kde n je 1, 2 nebo 3 a Y je OH nebo NH₂;

    •fe·· •fe fefefefe ·· ·· fe· fefe·· · ·· · • fe fe · fefefe · fefe · • · fe · · ······ • fe · · fefefefefe • fefe · fefe fefefe fefe fefe (ii) H2N-CH (COOH)-CH2-S-CH2-; a (iii) pyridyl, piperidyŘ,.'nebo tetrahydroisochinolinyl;

    1 18. Metoda podle nároku 17 vyznačující se tím, že sloučenipa^vanadu je podávána přednostně k monohydroxamátové sloučenině.

    19. Metoda podle kteréhokoliv znárokt^bS až 18 vyznačující se tím, že výše zmíněný komplex vanadu je podáván orálně.

    20. Metoda podje^teréhokoliv z nároků 13 až 18 vyznačující se tím, že léčení je kombkfováno s podáváním inzulínu.