MXPA00002455A - Usos de dinucleotido de nicotinamida adenina y sus analogos para el tratamiento de enfermedades malignas e infecciosas - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona un método para exterminar células de tumor o microorganismos que comprende poner en contacto la células de tumor o los microorganismos con una cantidad de nicotinamida adenina dinucléotido (NAD) o sus análogos ,efectiva para aumentar la toxicidad clonigénica de la células. Esta invención también proporciona un método para exterminar células de tumor o microorganismos en un sujeto, que comprende administrar una cantidad de nicotinamida adenina dinucléotido o sus análogos, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células al sujeto.

Description

USOS DE DINUCLEOTIDO DE NICOTINAMIDA ADENINA Y SUS ANÁLOGOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES MALIGNAS E INFECCIOSAS Esta solicitud reclama los beneficios de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/058,652, presentada el 10 de septiembre de 1997, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia. Durante toda esta solicitud se harán varias referencias entre paréntesis. Las exposiciones de estas publicaciones se incorporan aquí íntegramente como referencia, para describir más completamente el estado de la técnica al que pertenece la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El NAD y el NADP son fuentes de energía que se presentan en la naturaleza dentro de las células. Son importantes cofactores de numerosas reacciones enzimáticas. También son substratos para las NAD (P) asas que desintegran catalíticamente a estos productos para dar nicotinamida y ADP-ribosa o ADP-ribosa fosfato. Además, NAD también es un substrato para la poli (ADP-ribosa) polimerasa y mono (ADP-ribosa) transferasas, importantes en la reparación, apoptosis, diferenciación y transducción de señal de ADN (Althaus & Richter, ADP-ribosylation of Proteins: Enzymology and Biological Significance, Springer-Verlag, Berlin, 1987; Satoh et al., Biochemistry 33: 7099-7106, 1994; Kaufman et al., Cáncer Research 53: 3976-3985, 1993; Lindahl et al., TIBS 20: 405-411, 1995; Gilman AG, Cell 36: 577-579, 1984; Lee and Iglewski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 2703-2707, 1984) . No existen funciones útiles conocidas para las NAD (P) asas en células: un grupo de NADasas también posee actividades de ADP-ribosil ciclasa y /ADP-ribosa cíclica hidrolasa (Galione and White, Trends in Cell Biol. 4:431-436, 1994; Lee et al., Biochemie 77: 345-355, 1995). Estas enzimas se describieron primero en huevos de erizo de mar y han sido purificadas (Rusinsko and Lee, J. Biol. Chem. 264: 11725-11731, 1989; Lee and Aarhus , Cell Regul. 2: 203-209, 1991; Hellmich and Stumwasser, Cell Regul 2:193-203, 1991) y clonadas (Glick et al., Cell Regul 2: 211-218, 1991). Las propiedades hidrolizantes del NAD están acopladas a la síntesis de ADP-ribosa cíclica (CADPR) (Lee et al. J. Biol. Chem. 264: 1608-1615, 1989), que ha mostrado tener propiedades secundarias de mensajero involucrado en la inducción de la liberación de Ca2+ (Galione and White, Trends in Cell Biol. 4:431-436, 1994; Lee et al., Biochemie 77: 345-355, 1995) . Algunas de estas enzimas son bifuncionales teniendo las dos actividades, de ADP-ribosil ciclasa y cADPR hidrolasa, y consecuentemente puede tanto sintetizar 52/80 .MHa átf^tfMiaiin^^at cADPR como hidrolizar cADPR para dar ADP-ribosa (Kim et al., Science 261:1330-1333, 1993; Lee et al., Biochemie 77: 345-355, 1995; Galione and White, Trends in Cell Biol. 4:431-436, 1994) . Una de estas enzimas bifuncionales es la ectoenzima CD38 en células mieloides y linfocitos B- y T-de mamífero (Lund et al., Immunol . Today 16: 469-473, 1995) y en células ß humanas secretoras de insulina (Okamoto et al., Biochimie 77:356-363, 1995). El receptor CD38 a mostrado que mediante la liberación de Ca2+ está involucrado en la regulación de la proliberación de células B (Howard et al., Science 262:1056-1059, 1993; Kumagai . et al., J. Exp. Med. 181: 1101-1110, 1995), en la regulación de células de plasma, T, NK (Funaro et al., J. of Immunology 145: 2390-2396, 1990) y está regulada aceleradamente en células HL-60 estimuladas para diferenciarse con ácido retinoico (Kontani et al., J. Biol. Chem. 268:16895-16898, 1993) . Anteriormente también ya se había mostrado (Hemmi and Breitman, Biochem. Biophys. Res. Com. 109: 669-674, 1982) que el tratamiento con ácido retinoico inducía actividad NADasa en la misma línea celular, indicando un fuerte acoplamiento entre la actividad NADasa- y CD38/ciclasa. NADasa/ciclasa es una enzima celular localizada ectoplásmicamente . Por lo tanto, cuando se suministran células con NAD o NADP que pueden servir tanto como: (i) 52/80 .*..-_.'. substratos para la producción de ADP-ribosa cíclica, desequilibrio de Ca2+ e inducir citotoxicidad, y (ii) como fuentes catabólicas para la generación de nicotinamida, que puede aumentar el flujo sanguíneo al tumor. Tanto la citotoxicidad apoptótica como el flujo sanguíneo reforzado hacia el tumor son mecanismos bien documentados mediante los cuales pueden sensibilizarse la radioterapia y quimioterapia convencionales (Pero et al., Cáncer Det. Prevent. 22(3): 225-236, 1998; Horsman, Acta Oncológica 34: 571-587, 1995) . En consecuencia, el NAD y el NADP son fármacos anti-tumorales novedosos debido a que pueden combinar dos mecanismos importantes de acción en el mismo compuesto, actuando como un profármaco metabólico. Además de esta invención se tiene la exposición de que las ADP-ribosas ciclasas, por ejemplo CD38, son sitios metabólicos importantes para la expansión de los efectos farmacológicos deseados de NAD. Por lo tanto, los agentes que pueden servir como precursores o productos metabólicos de NAD y NADP, juzgados por sus habilidades para interactuar con ciclasas, también deben considerarse adecuados para esta invención. Por ejemplo, de manera enunciativa, se tienen a los metabolitos y substratos como por ejemplo ADP-ribosa cíclica, ADP-ribosa, 21 y 3 ' deoxi NAD, 2' y 3' deoxi ADP-ribosa, NADH y NADPH (Gailone and White, Trends in Cell Biology 4: 431-436, 1994; Ashamu et 52/80 *&- . - ^^ al., Biochemistry 36: 9509-9517) así como otros agentes de unión por afinidad a las ADP-ribosas ciclasas (NADasas) como por ejemplo 3 -acetil piridina adenina dinucleótido, 3 -acetil piridina, nicotinamida mononucleótido, benzamida y 3-aminobenzamida (Olsson et al., Biochem. Pharmacol. 45:1191-1200, 1993) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención expone un método mediante el cual los agentes como NAD y NADP o sus precursores metabólicos, productos y substratos competitivos que agonizan/antagonizan con ADP-ciclasa y producen o inhiben ADP ribosa cíclica, y a su vez desequilibran el calcio intracelular, son útiles para inducir o inhibir apoptosis o citotoxicidad clonogénica en tumores, microorganismos o células normales. En este aspecto, las células de tumor, por ejemplo, que tienen una alta capacidad proliferativa, son obligadas ha dirigirse a una ruta de diferenciación y eventualmente a la muerte celular apoptótica. Debido a que la gran mayoría de tejidos normales del cuerpo no pasan por división celular, se obtiene una ganancia terapéutica de exterminar los tejidos tumorosos por sobre los tejidos normales. El método útil está comprendido de los pasos de administrar, mediante una ruta adecuada (por ejemplo intravenosa, oral, intramuscular) a un paciente que tiene 52/80 _ál£ á¡ «^J?u tJ . un tumor, un NAD o NADP a una dosis suficiente para elevar la ADP ribosa cíclica, el desequilibrio de calcio e inducir la citotoxidad apoptótica, de manera que se inhibe el crecimiento de las células de tumor proliferantes. En otro aspecto, esta invención muestra la forma en que se tratan los individuos que tienen tumores, mediante la aplicación de dosis terapéuticas de NAD o NADP o un análogo adecuado, lo cual no sólo exterminará a las células de tumor mediante apoptosis, sino que el producto enzimático de este proceso, la ADP (P) ribosa cíclica, también da origen a la producción de otro radio y quimiosensibilizador bien conocido, la nicotinamida. En consecuencia, la combinación de NAD o NAD(P) con radio o quimioterapias convencionales permite la sensibilización, por dos mecanismos, el apoptótico y el citotóxico con nicotinamida (es decir aumento del flujo sanguíneo al tumor; Horsman, Acta Oncológica 34: 571-587, 1995). Por lo tanto, el método mostrado por esta invención puede reforzarse al coadministrar a los pacientes que presentan un tumor, radio o quimioterapias tradicionales en combinación con formulaciones útiles de NAD y NADP como una terapia adyuvante sensibilizadora. En todavía otro aspecto, esta invención muestra que las NADasas o ADP-ribosa ciclasas también pueden verse como un mecanismo de transporte para internalizar dentro de 52/80 - ? i - ^¡pa-t. las células a precursores que contienen adenosina fosforilada, para su eventual uso en la síntesis de ADN. Se sabe que la entidad ADP-ribosa de NAD queda selectivamente absorbida por las células cuando se suministra con NAD de exógeno (Pero et al., In: ADP-ribose transfer reactions. Biological significance, Eds. M.K. and E.L. Jacobson, pp 378-385, Springer, New York, 1989) . La estimulación de la síntesis de ATP sin duda desequilibraría selectivamente los cúmulos de nucleótidos y proporcionaría oportunidades para la terapia antimetabolito (Harrup and Renshaw, Antibiotics Chemother. 28: 68-77, 1980). Los compuestos de adenosina, algunos de los cuales pueden desequilibrar los cúmulos de nucleótido por la inhibición de adenosina deaminasa, por ejemplo coformicina y deoxicoformicina, se han utilizado para el tratamiento exitoso de enfermedades neoplásicas, fúngicas y parasíticas (Harrap and Renshaw, Antibiotics Chemother. 28. 68-77; Patentes de los Estados Unidos Nos.: 5,180,714; 4,997,818; 5,679,648). Aquí, expongo que los análogos que contienen adenosina y que pueden unirse a las NADasas localizadas ectoplásmicamente (ADP-ribosa ciclasas) y que quedan internalizadas dentro de las células y desequilibran los cúmulos de nucleótido, tienen utilidad en el tratamiento de enfermedades neoplásicas, fúngicas y parasíticas. 52/80 #i#* MHWÉIilt|lki¡ß-lí-iaa------i^ DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS Figura 1. Representa la respuesta a la dosis de NAD en células HL60 (leucemia promieloide) evaluada por la inducción de apoptosis en la presencia o ausencia de 10 mM de inhibidor de NADasa, 3 -acetil piridina adenina dinucleótido. Los niveles del control no tratado para apoptosis se restaron como fondo para todos los valores reportados . Figura 2. Apoptosis inducida por fármacos en células HL60 (leucemia promieloide) con 1000 µM NAD, 100 µM nMCA (metoclopramida neutra, Neu-Sensamide) , y 2 Gy de radiación en la presencia y ausencia de 10 mM inhibidor NADasa, 3 -acetil piridina adenina dinucleótido. Los niveles de apoptosis para el control sin tratar se restaron como fondo para todos los valores reportados. Figura 3. Colonias de células humanas HL60 (leucemia promieloide) (A) y agrupamientos (B) que se hicieron crecer en 0.6% metilcelulosa, medio RPMI 1640 con % de suero de ternera fetal, y suplementado con nicotinamida o NAD a las concentraciones indicadas, por 6 días en 5% C02 a 37°C. Figura 4. Citotoxicidad clonogénica de células de leucemia HL60 y K562 tratadas in vi tro por 7 días en 5% C02 a 37°C con 0-2000 µM dosis de NAD, ADP-ribosa y nicotinamida (NAM) . El número de colonias (> 40 células) formada se contaron microscópicamente en placas de microcultivo de fondo plano, con 96 cavidades. Obsérvese que las curvas dosis-respuesta IC50 para clonofenicidad de las células HL60 y K562 fueron las mismas después del 5 tratamiento ya sea con NAD o con ADP-ribosa. Figura 5. Citotoxicidad clonogénica de células de leucemia HL60 y K562 tratadas in vi tro por 7 días en 5% C02 a 37°C con 0-1000 µM dosis de NADH, NADP y 3-acetil piridina adenina dinucleótido (3-acetilpiridina AD) . El número de colonias (> 40 células) que se formaron fueron contadas microscópicamente en placas de microcultivo, fondo plano, de 96 cavidades. Figura 6. Radiosensibilización de células leucémicas HL60 y K562 por 0-300 µM NAD. Las células primero se irradiaron con 1-2 Gy y 15 minutos después se incubaron con las concentraciones indicadas de NAD por 7 días en 5% de C02 a 37°C. El número de colonias (> 40 células) formadas se contó microscópicamente en placas de microcultivo con fondo plano, 96 cavidades. 20 Figura 7. Histogramas que muestran el número de células 70Z/3 tratadas con 0-300 µM de NAD por 18 horas sobre el eje Y y fluorescencia con yoduro de propidio sobre el eje X. El pico izquierdo corresponde a células en G0/G1 y el pico derecho con el doble de fluorescencia se refiere a células en G0/M. Las células entre los dos picos están /80 pasando por la fase S. Figura 8. Ratones Scid (n = 10 por grupo) con xenoinjerto con adenocarcinoma de pulmón humano (H2981) se trataron i.p. con (dosis diarias de 5 x 25 ó 50 mg/kg NAD por semana durante 21 días. Los volúmenes iniciales de tumor fueron de 80-100 mm2 y el área bajo la curva (ABC) de los valores de crecimiento del tumor se calculó y analizó como se describió previamente (Hua et al., Anti-Cancer Drugs 6: 451-455, 1995). * = p < 0.05 mediante prueba t comparada con controles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un método para exterminar microorganismos o células de tumor, que comprende poner en contacto las células de tumor o el microorganismo con una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) o sus análogos efectivos para aumentar la toxicidad clonogénica de dichas células o microorganismos. En una modalidad, los microorganismos consisten en hongos o un parásito. En el sentido aquí utilizado, los análogos NAD incluyen, de manera enunciativa, precursores o productos metabólicos de nicotinamida adenina dinucleótido o inhibidores de substrato metabólico de nicotinamida adenma dinucleótido. Los ejemplos son NADP, NADH, NADPH, ADP- 52/80 ribosa, 3 ' -deoxi ADP ribosa, 2' y 3 ' -deoxi NAD, 3 ' -deoxi NADP, 2 ' y 3 ' -deoxi ADP-ribosa y otras modificaciones de NAD que pueden servir como un substrato para ADP-ciclasa/NADasas así como compuestos que pueden unirse al sitio metabólico, por ejemplo ADP cíclico-ribosa, ADP-ribosa (Gailone and White, Trends in Cell Biology 4: 431-436, 1994; Ashamu et al., Biochemistry 36: 9509-9517) así como otros agentes de unión por afinidad a las ADP-ribosas ciclasas (NADasas) como por ejemplo 3 -acetil piridina adenina dinucleótido, 3 -acetil piridina, nicotinamida mononucleótido, benzamida y 3-aminobenzamida (Olsson et al., Biochem. Pharmacol. 45:1191-1200, 1993). Esta invención también proporciona un método para exterminar células de tumor o microorganismos en un sujeto que presenta las células de tumor o los microorganismos, que comprende administrar al sujeto una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido o sus análogos efectiva para aumentar toxicidad clonogénica de las células o microorganismos. En una modalidad, el sujeto puede ser un animal. En otra modalidad, el sujeto es un humano. Por "administrar" se entiende que cualquiera de los métodos estándar de administrar un compuesto a un sujeto, conocido para los expertos, puede utilizarse. Los ejemplos incluyen, de manera enunciativa, administración intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. 52/80 La toxicidad clonogénica puede aumentarse por el desequilibrio de niveles citosólicos de Ca2+ o de cúmulos de nucleótido o en combinación de los mismos. Esta invención también proporciona usos para NAD o sus análogos en la preparación de un medicamento, que comprende una cantidad de NAD o sus análogos efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de células o microorganismos . Esta invención proporciona además el uso de NAD o 10 sus análogos para exterminar células de tumor o microorganismos . Esta invención también proporciona una composición para exterminar células de tumor o microorganismos, que comprende una cantidad de nicotinamida 15 adenina dinucleótido o sus análogos, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células o microorganimos y un portador adecuado. Esta invención también proporciona una composición farmacéutica para exterminar células de tumor o 20 células infecciosas, que comprende una cantidad de nicotinamida adenina dmucleótido o sus análogos, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células, y un portador farmacéuticamente aceptable. Para los fines de esta invención por "portadores 25 farmacéuticamente aceptable" se entienden cualquiera de los 52/80 portadores farmacéuticos de tipo estándar. Los ejemplos de portadores adecuados son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, de manera enunciativa, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, por ejemplo soluciones salinas reguladas con fosfato, soluciones salinas reguladas con fosfatos que contienen Polysorb 80, agua, emulsiones como por ejemplo emulsiones aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Otros portadores también pueden incluir soluciones estériles, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas. Típicamente, estos portadores contienen excipientes como por ejemplo almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos . Estos portadores también pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden estos portadores se formulan por métodos convencionales bien conocidos. Esta invención proporciona además un método para tratar enfermedades neoplásicas, fúngicas y parasíticas, mediante la administración a un sujeto, de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido o sus análogos, y que es efectiva para aumentar la toxicidad 52/80 ~sl**. clonogénica de las células. Los métodos para determinar una "cantidad efectiva" son bien conocidos por los expertos en este campo y dependen de factores entre los que se incluyen, de manera enunciativa: el tamaño de los pacientes y el portador utilizado . En una modalidad de las composiciones anteriores, la toxicidad clonogénica aumenta desequilibrando los niveles citosólicos de Ca2+ o cúmulos de nucleótido o en 10 combinación de los mismos. En una modalidad adicional de las composiciones, el análogo de nicotinamida adenina dinucleótido es un precursor metabólico o un producto de nicotinamida adenina dinucleótido o inhibidores de substrato metabólico de nicotinamida adenina dinucleótido. Esta invencrón también proporciona un estuche que comprende un compartimento que contiene una cantidad de nicotinamida adenina dinucléótido o sus análogos, con las células de tumor o los microorganismos, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células de tumor. Esta invención se comprenderá mejor a partir de los siguientes detalles experimentales. Sin embargo, el experto en este campo apreciará fácilmente que los métodos específicos y resultados analizados son simplemente ilustrativos de la invención, como se describe más 52/80 *""-. -^¿-.. • .fe- ^-"-- - '---' •- - i t j~~t •- -« IHBMBIIIGI f jfrf fl ' MÉÉFf'rf •• t?t i^-^-^g- 3A completamente en las reivindicaciones que se presentan al final .

Detalles Experimentales Cultivo Celular. Se cultivaron células HL60 (línea de leucemia promieloide humana) a una densidad de 0.5 x 106 hasta 1.0 x 106 células/ml en medio RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) a 37°C en una atmósfera al 5% de C02. Las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en un medio nuevo a una concentración de 1 x 106 hasta 2 x 106 células/ml con el fin de llevar a cabo bioensayos. Medición de citotoxicidad in vi tro por apoptosis. Las células HL60 se expusieron en cultivo a radiación 2 Gy, 100 µM nMCA (metoclopramida neutra, Neu-Sensamide) , 0-5000 µM NAD + 10 mM, e inhibidor de ± NADasa, 3 -acetil piridina adenina dinucleótido, administrándose 30 minutos antes del tratamiento con el fármaco. El porcentaje de apoptosis se determinó después de 6 horas. La citotoxicidad se evaluó por identificación morfológica de células apoptóticas (aumento de 400 x con microscopía de contraste de fase) utilizando exclusión con azul de triptan (solución isotónica al 0.1% + suero al 5%) después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente. Las células apoptóticas se identificaron con características de condensación de 52/80 cromatina, encogimiento, ampollado de la membrana, fragmentación y apariencia de "cuerpos apoptóticos" (Kaufman et al., Cáncer Res. 53:3976-3985, 1993). Las células necróticas se identificaron como células que no excluyeron al azul de triptano.

Valoración de citotoxicidad en células HL60 y K562 por ensayo clonogénico. El ensayo utilizado se basó en Schweitzer et al (Exper. Hematol. 21: 573-578, 1993). Las células HL60 o K562 se cultivaron en microplacas de 96 cavidades, a 800 células por cavidad, en un medio de 0.6% de metilcelulosa (Methocel A4M, Dow chemicals, USA) , 10% de suero de ternera fetal, medio RPMI 1640 (Life Technologies Ltd, UK) , y gentamicina (50 µg/ml, Biological Industries, Israel) . Las cavidades de microcultivo recibieron 10 µl de NAD, NADP, NADH, ADP-ribosa, nicotinamida (NAM) , o 3 -acetil piridina adenina dinucleótido, como soluciones, dentro de las cuales las concentraciones finales se ajustaron para quedar entre 0-5000 µM después de la adición de 190 µl del medio que contiene células. La concentración final de metilcelulosa fue de 0.6%. Las células se incubaron a 37°C en C02 al 5% por 7 días, después se valoraron microscópicamente para determinar el número de colonias de células (> 40 células) y agrupaciones (8-40 células) . En el caso de experimentos de radiosensibilización, las 52/80 "^"^ "•-* asrii células se irradiaron con radiación gamma de 1-2 Gy por 15 minutos, antes de la adición de NAD. El área central del fondo de cada cavidad (25% del total) se contó y la cuenta de colonias y agrupaciones se expresó como % de control con 5 el objeto de evitar influencias de variaciones interexperimentales respecto a los valores iniciales o línea basal .

Estimación de detención del ciclo en células de tumor preB/B de ratón 70Z/3. El procedimiento estuvo de acuerdo a Vindelóv (Virchows Archives Cell Pathology 24:277, 1977). En resumen, las células expusieron en un cultivo a 37°C hasta ± 300 µM NAD por 16 horas, antes de que se recolectaran por centrifugación y se suspendieran en una solución amortiguada que contiene detergente NP-40, RNase A y yoduro de propidio. El yoduro de propidio se intercala en un ADN de doble hebra y puede medirse por fluorescencia utilizando citometría de flujo. El NP-40 liza las membranas de plasma y la RNase evita la interferencia provocada por la tinción de RNA. Las células en G2/M tendrán el doble de la cantidad de DNA y por lo tanto la fluorescencia de las células en G0/G1. Las células en la fase S se ubican en el histograma entre los picos G0/G1 y G2/M. 25 /80 Evaluación de la actividad antitumoral de NAD in vivo . Los ratones Scid (n = 10 por grupo) se transplantaron por inyección subcutánea de la suspensión de tejido tumoral H-2981 (adenocarcinoma humano) en el flanco derecho. Cuando los tumores crecieron hasta 80-100 mm2, los animales se dividieron en tres grupos: el Grupo 1 se inyectó i.p. con solución salina, el Grupo 2 se inyectó i.p. con NAD a 25 mg/kg disuelto en solución salina y el Grupo 3 se inyectó i.p. con NAD a 50 mg/kg. El programa de tratamiento fue diariamente de lunes a viernes sin recibir tratamiento sábado y domingo, durante 21 días. Los volúmenes de tumor se registraron un día sí y un día no durante 21 días y se convirtieron en valores de crecimiento de tumor de ABC (área bajo la curva) como ya se describió en detalle (Hua et al., Anti-Cancer Drugs 6- 451-455, 1995).

Ejemplo 1 La Figura 1 muestra los resultados de exponer las células HL60 a dosis aumentadas de NAD ± la presencia del inhibidor de NADasa. Los datos muestran que NAD induce una inducción dependiente de la dosis en la apoptosis, que a su vez requiere de NADasa activa/ciclasa, como prueba para la inhibición notable de apoptosis mediante la presencia del inhibidor de NADasa, 3-acetilpiridina adenina dinucleótido. Como NAD, NADP y el inhibidor de NADasa son substratos para 52/80 - ' .*——> - -..._.- - - »-!«»*_«— "'tJ^K la NADasa/ciclasa y como el inhibidor de NADasa se utiliza en un exceso molar considerable, por lo tanto queda claro que NAD es un substrato inhibido por la NADasa/ciclasa. Como NAD y NADP pueden generar intermediarios cíclicos y no 5 3 -acetil piridina adenina dmucleótido, es obvio que la producción de ADP-ribosa cíclica es necesaria para inducir apoptosis y no sólo para una modulación de la actividad de NADasa/ciclasa. Los substratos de NADasa/ciclasa que no modulan la ciclación conducen a un desequilibrio de Ca2+ que 10 no se esperaría presentara propiedades antitumor.

Ejemplo 2 Este ejemplo muestra dos puntos importantes. En primer lugar, aunque el inhibidor de NADasa, 3 -acetil piridina adenina dinucleótído, es un substrato para la NADasa/ciclasa ectoplásmica, no puede inducir citotoxicidad por apoptosis (Figura 2) . En segundo lugar, NAD que también es un substrato para la NADasa/ciclasa, difiere de 3-acetilpiridina adenina dinucleótido porque produce ADP- 20 ribosa cíclica que puede desequilibrar el calcio citosólico dando por resultado apoptosis, y esta inducción es inhibida cuando la actividad de ciclasas entra en competencia con el inhibidor de NADasa (Figura 2) . Por otra parte, la nMCA metoclopramida neutra, Neu-Sensamide) y la radiación, que se sabe muy bien inducen apoptosis (Pero et al., Cáncer 52/80 , fetíí Det. Prevent. 22 (3): 225-236, 1998), se ven sin afectación por la presencia del inhibidor de NADasa. Estos datos indican claramente que el mecanismo de inducción de apoptosis por agentes convencionales, como radiación o nMCA, se realiza por diferentes mecanismos a los de los efectos de NAD sobre la apoptosis.

Ejemplo 3 Los datos presentados en la Figura 3 confirman el punto importante de que NAD que induce apoptosis también da por resultado citotoxicidad potente de células de tumor clonogénicas . Las dosis de NAD < 500 µM dan por resultado >50% de inhibición de clonogenicidad . Nicotinamida (NAM) por sí misma es un inhibidor y también otro producto de la actividad de NADasa/ciclasa, pero tiene muy poco o ningún efecto sobre la clonogenicidad. Estos datos exponen el valor terapéutico de utilizar NAD como un profármaco para mejorar las propiedades antitumor de los agentes. NAD puede exterminar células de tumor clonogénicas mediante la producción de ADP-ribosa cíclica que media el desequilibrio Ca2+, y al mismo tiempo produce nicotinamida, un reforzador bien conocido del flujo sanguíneo hacia el tumor, que puede sensibilizar tanto la radio como la quimioterapia. Estas propiedades representan mecanismos aditivos de no competencia para la sensibilización de la citotoxicidad del 52/80 tumor .

Ejemplo 4 Los datos presentados en las Figuras 4 y 5 muestran tres puntos importantes acerca de esta invención. En primer lugar, los dos precursores metabólicos, NADH o productos metabólicos como ADP-ribosa, son igualmente efectivos para inducir citotoxicidad en células de tumor clonogénicas. En segundo lugar, las células de tumor distintas a HL60, que en este caso fueron células K562, fueron exterminadas con igual habilidad. Esto fue cierto incluso aunque se sabe que las células leucémicas HL60 realmente pasan por apoptosis, mientras que las células leucémicas K562 se sabe son mucho más resistentes a la apoptosis (McGahon et al Blood 83: 1179-1187, 1994). Por lo tanto, el hecho de que NAD y ADP-ribosa tengan curvas dosis-respuesta similares en las células HL60 y K562 muestra que estos agentes no inducen apoptosis y citotoxicidad por rutas apoptóticas convencionales conocidas para la mayoría de los agentes, sino mediante una ruta independiente única. En tercer lugar, el 3 -acetil piridina adenina dinucleótido, aunque no es un productor conocido de ADP-ribosa cíclica, puede sin embargo mostrar citotoxicidad a las células HL60 o K562 clonogénicas. Estos datos revelan inhibidores de substrato de NADasas 52/80 ^^^^^jg¡^^¡ £ (ADP-ribosa ciclasas) que pueden inducir citotoxicidad clonogénica con utilidad semejante para el tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo el cáncer.

Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra la habilidad de los análogos de NAD para sensibilizar los efectos citotóxicos de la radiación ionizante. La Figura 6 expone la citotoxicidad clonogénica de NAD administrado dentro del intervalo de dosis de 0-500 µM ± radiación. Como la curva de dosis-respuesta de la radiación + NAD tuvo una pendiente negativa con una citotoxicidad clonogénica mayor que cualquiera de los agentes separados, entonces los efectos sensibilizados observados fueron desde aditivos hasta sinérgicos durante todo el intervalo de dosis evaluado. Estos datos se toman como evidencia de que puede esperarse que NAD y sus análogos sensibilicen terapias convencionales, por ejemplo radiación, en donde la inducción de DNA es una parte importante de su modo de acción.

Ejemplo 6 Ya se ha reportado en la literatura que los compuestos que contienen adenosina pueden desequilibrar los cúmulos de nucleótido y de esta manera, son útiles en el 52/80 tratamiento de enfermedades neoplásticas, fúngicas y parasíticas (ver citas en la Sección de Sumario de la Invención) . Este ejemplo muestra que NAD también es un agente de bloqueo de ciclo celular potente que acumula células en la fase S. En la Figura 7 muestra que el histograma de células 70Z/3 no tratadas exhibe un pico GO/Gl típico de la región celular 200 y un pico G2/M de la región celular 400. Las células en fase S ubicadas entre estas dos regiones de pico fueron muy reducidas. Sin embargo, las células expuestas a 300 µM NAD mostraron una acumulación apreciable de células en fase S. Estos datos muestran que NAD puede funcionar como un profármaco para la captación o absorción de agentes que contienen adenosina mediante la unión a las NADasas (ADP-ribosa ciclasas) y, de esta manera, pueden funcionar como un antimetabolito que desequilibra los cúmulos de nucleótido e induce citotoxicidad por antiproliferación. Esta propiedad de NAD nunca antes había sido descrita, aún cuando se trata de uno de los metabolitos más importantes y más conocidos en las células. Por lo tanto, este descubrimiento es inusualmente novedoso respecto a la técnica anterior, y como tal implica actividad inventiva.

Ejemplo 7 Los datos presentados en la Figura 8 evalúan al 52/80 M á¡ á^^* É iiU m **¿É¡?á* NAD como un fármaco antitumoral de acción directa. Aquí se expone que los ratones Scid, xenoinjertados con un adenocarcinoma humano (H2981) y a los que se les administraron dosis diarias de NAD a 50 mg/kg, habían mostrado una reducción significativa (p < 0.05) en el crecimiento del tumor en comparación con controles no tratados o con una dosis menor del tratamiento de NAD (25 mg/kg) . Tampoco hubo una pérdida significativa en el peso corporal o síntomas agudos significativos que se relacionaran al tratamiento con NAD, indicando una falta de cualquier efecto secundario tóxico. Estos resultados muestran la capacidad y utilidad al emplear NAD como fármaco quimioterapéutico. Además, el efecto dosis-respuesta de NAD para controlar el crecimiento tumoral establece un intervalo de dosis eficaz no tóxica para futura extrapolación a partir de modelos de tumor en roedores para determinar los datos en humanos . 2/80 m &tÉéet&?iu ,*. •**-" ^^~ ??ßí-Á?sÁiSi teai

Claims (16)

1. ? V RÉJfjrBÉBt CACIQNES ; 1. Un método paarS exterminar células tumorales o microorganismos neoplásmicos, fúngicos o parasíticos, que comprende poner en contacto las células tumorales o los microorganismos neoplásmicos, fúngicos o parasíticos con una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido o un análogo de nicotinamida o benzamida fosforilado del mismo, que sea eficaz para aumentar la toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismos neoplásmicos, fúngicos o parasíticos, en donde el análogo es distinto a NADH o NADPH.
2. 2. Un método para exterminar células tumorales o microorganismos neoplásmicos, fúngicos o parasíticos, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido o un análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada del mismo, eficaz para aumentar la toxicidad clonogénica de las células tumorales o del microorganismo neoplásmico, fúngico o parasítico, en donde el análogo es distinto a NADH o NADPH.
3. 3. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada es capaz de unirse a la NADasa y transportar los metabolitos de NAD u otras moléculas de unión de la NADasa, en forma intracelular.
4. 4. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, 52/80 ** 5r en donde el análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada se selecciona del grupo que consiste de ADP-ribosa, ADP-ribosa cíclica y 3 -acetil piridina adenina dinucleótido.
5. 5. El método según la reivindicación 3, en donde el análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada se selecciona del grupo que consiste de ADP-ribosa, ADP-ribosa cíclica y 3 -acetil piridina adenina nucleótido.
6. 6. El método según la reivindicación 2, en donde el sujeto es un animal.
7. 7. El método según la reivindicación 2, en donde el sujeto es un humano.
8. 8. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismos neoplasmicos, fúngicos o parasíticos aumenta al desequilibrar los niveles citosólicos de Ca2+ o de los cúmulos de nucleótido o una combinación de los dos.
9. 9. El método según la reivindicación 3, en donde la toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismos neoplasmicos, fúngicos o parasíticos aumenta al desequilibrar los niveles citosólicos de Ca2+ o de los cúmulos de nucleótido o una combinación de los mismos .
10. 10. Una composición para exterminar células tumorales o microorganismos neoplásmicos, fúngicos o 52/80 parasíticos, que comprende una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido o un análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada del mismo, efectiva para aumentar toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismos neoplásmicos, fúngicos o parasíticos, y un portador farmacéuticamente aceptable, el análogo es distinto a NADH o NADPH.
11. 11. Una composición para exterminar células tumorales o microorganismos neoplásmicos, fúngicos o parasíticos, en un sujeto, que comprende una cantidad efectiva de nicotinamida adenina dinucleótido o un análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada del mismo, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismo neoplásmico, fúngico o parasítico, y un portador farmacéuticamente aceptable, el análogo es distinto a NADH o NADPH.
12. 12. El método según las reivindicaciones 10 u 11, en donde la toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismos neoplasmicos, fúngicos o parasíticos aumenta al desequilibrar los niveles citosólicos de Ca2+ o de los cúmulos de nucleótido o una combinación de los mismos.
13. 13. El método según las reivindicaciones 10 u 11, en donde el análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada es capaz de unirse a NADasa y transportar los metabolitos de NAD o de otras moléculas de unión de NADasa, en forma intracelular.
14. 14. El método según las reivindicaciones 13, en donde el análogo de nicotinamida o benzamida fosforilada se seleccionan del grupo que consiste de ADP-ribosa, ADP-ribosa cíclica y 3 -acetil piridina adenina dinucleótido.
15. 15. El método según la reivindicación 13, en donde la toxicidad clonogénica de las células tumorales o de los microorganismos neoplasmicos, fúngicos o parasíticos aumenta al desequilibrar los niveles citosólicos de Ca2+ o los cúmulos de nucleótido o una combinación de los mismos.
16. 16. El método según la reivindicación 14, en donde la toxicidad clonogénica de las células tumorales o los microorganismos neoplasmicos, fúngicos o parasíticos aumenta al desequilibrar los niveles citosólicos de Ca2+ o de los cúmulos de nucleótido o una combinación de los mismos . 52/80 Esta invención proporciona un método para exterminar células de tumor o microorganismos que comprende poner en contacto las células de tumor o los microorganismos con una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) o sus análogos, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células. Esta invención también proporciona un método para exterminar células de tumor o microorganismos en un sujeto, que comprende 10 administrar una cantidad de nicotinamida adenina dinucleótido o sus análogos, efectiva para aumentar la toxicidad clonogénica de las células al sujeto. 52/80