MXPA00002236A - Vacunas de arn contra el virus sincicial respiratorio - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un vector que comprende una primera secuencia de ADN que es complementaria de al menos parte de un genoma de ARN de alfavirus y que tiene el complemento de las regiones de replicación completas del genoma de ADN del alfavirus;un asegunda secuencia de ADN que codifica una proteína de paramixovirus, particularmente, una proteína de fusión del virus sincicial respiratorio (RSV F) o un fragmento de la proteína F del RSV que genera anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína F del RSV, las secuencias de ADN primera y segunda están bajo el control transcripcional de un promotor . Este vector puede utilizarse para producir una transcripción de ARN que puede ser utilizada para inmunizar a un hospedero, incluyendo a un hospedero humano, para proteger el hospedero en contra de la enfermedad provocada por paramixovirus, particularmente, contra el virus sincicial respiratorio, mediante su administración al hospedero. La transcripción del ARN puede formarse mediante la linealización del vector por medio de la encisión en un sitio de restricciónúnico en un vector de plásmido y mediante la transcripción entonces de la molécula lineal.

Description

VACUNAS DE ARN CONTRA EL VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de las vacunas de paramixoviridae y está relacionada particularmente con las vacunas que comprenden ARN que codifican la proteína de fusión (F) del virus sincicial respiratorio (RSV por sus siglas en inglés) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus sincicial respiratorio (RSV) humano, ha sido identificado como el principal patógeno responsable de infecciones severas en el tracto respiratorio de lactantes, niños pequeños y de ancianos que reciben atención institucional (referencias 1, 2, 3 , 4 - En esta solicitud, se citan diversas referencias entre paréntesis para describir de manera más completa el estado de la técnica al que pertenece esta invención. La información bibliográfica completa de cada cita se encuentra al final de esta especificación, precediendo inmediatamente a las reivindicaciones. Las revelaciones de estas referencias se incorporaran, de esta manera, como referencias en la presente revelación) . Las cifras globales de mortalidad y morbilidad indican que existe la urgente necesidad de una vacuna eficaz contra el RSV (referencias 5, 6) . Solamente en los E.U.A., anualmente se hospitalizan 100,000 niños con casos graves de neumonía y bronquilitis, que resultan de una infección por RSV. La atención tanto hospitalaria como ambulatoria de los niños con infecciones por el RSV se ha estimado que tiene un costo que excede los $ 340 millones cada año en los Estados Unidos. Los comités asesores en materia de vacunas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e Infecciosas (NIAID) han clasificado en segundo lugar al RSV, sólo después del VIH en cuanto al desarrollo de vacunas . Las cifras anuales tanto de morbilidad como de mortalidad, así como los costos escalonados por los cuidados de la salud en cuento al manejo de las infecciones por el RSV han proporcionado el estímulo para buscar afanosamente el desarrollo de vacunas eficaces contra el RSV. Sin embargo, esta vacuna aun no está disponible. Las vacunas contra RSV inactivadas por formalina (FI-RSV) y RSV vivas atenuadas, han fracasado en lo que se refiere a demostrar eficacia en los ensayos clínicos (referencias 7, 8, 9, 10) . Además, la vacuna contra RSV inactivada por formalina, provocó un empeoramiento en la enfermedad en algunos niños después de la exposición al RSV de tipo silvestre (referencias 7, 8, 9, 10) . La dilucidación del o de los mecanismos involucrados en la potenciación de la enfermedad por RSV es importante para el diseño de vacunas seguras contra el RSV, especialmente para la población seronegativa. La resiente evidencia experimental sugiere que un desbalance o desequilibrio en las respuestas mediadas por célula puede contribuir a la inmunopotenciación. La mejorada histopatología observada en ratones que fueron inmunizados con la FI-RSV e inoculados con el virus podría anularse por agotamiento de las células CD4+ o tanto de interleucina-4 (IL-) como IL-10. La glucoproteína de fusión (F) del RSV es una de las proteínas inmunogénicas principales del virus. Esta glucoproteína envolvente media tanto la fusión del virus con la membrana de la célula hospedera como la propagación de célula del virus (referencia 1) . La proteína F se sintetiza como una molécula precursora (F0) que se escinde proteolíticamente para formar un dímero con enlace de disulfuro, compuesto de las porciones F N-terminal y Fi C-terminal (referencia 11) . La secuencia de aminoácidos de la proteína F se conserva bastante entre los subgrupos A y B del RSV y es un antígeno de protección cruzada (referencias 6, 12) En el sistema de expresión del bacilovirus, se ha expresado una versión secretada truncada de la proteína F del RSV en las células del insecto Trichoplusia ni (referencia 13) . Se demostró que la proteína recombinante es protectora en las ratas del algodón (referencia 13) . Se están llevando a cabo los estudios para el desarrollo de vacunas virales vivas y de vacunas de subunidad de glucoproteína en contra de la infección por virus de la parainfluenza. Los resultados del ensayo clínico con una vacuna PIV inactivada por formalina de los tipos 1, 2, 3, demostraron que esta vacuna no era eficaz (referencias 14, 15, 16) . Se discontinuó el desarrollo adicional de vacunas químicamente inactivadas después que los ensayos clínicos con una vacuna contra RSV inactivada con formalina demostró que la vacuna no sólo no era efectiva para evitar la infección por RSV sino que muchos de los vacunados que se infectaron posteriormente con el RSV padecieron una enfermedad más grave . La mayor parte de la investigación para la vacuna contra la parainfluenza se ha enfocado en las vacunas PIV-3 candidatas (referencia 17) reportándose un trabajo significativamente menor para la PIV-1 y la PIV-2. Los recientes enfoques a las vacunas PIV-3 han incluido el uso de virus de parainfluenza bobina estrechamente relacionado del tipo 3 y la generación de virus atenuados mediante adaptación al frío del virus (referencias 18, 19, 20, 21) . Otro enfoque al desarrollo de la vacuna contra el virus de la parainfluenza del tipo 3 es un enfoque de subunidad que se enfoca en las glucoproteínas superficiales de hemaglutinina-neuraminidaza (HN) y la proteína de fusión (F) (referencias 22, 23, 24) . El antígeno HN, una típica glucoproteína de tipo II, muestra tanto actividad de hemaglutinación como de la neuraminidaza y es responsable de la unión del virus a los receptores de la célula hospedera que contienen ácido siálico. La glucoproteína F de tipo I media la fusión de la envoltura viral con la membrana de la célula, así como la propagación del virus de célula a célula. Recientemente se ha demostrado que se requieren las dos glucoproteínas HN y F para la fusión de la membrana. La glucoproteína F se sintetiza como un precursor inactivo (F) que se escinde proteolíticamente en porciones F2 y Fl enlazadas con disulfuro. En tanto que las proteínas HN y F de los PIV-1, -2 y -3 son estructuralmente similares, son antigénicamente distintas. Los anticuerpos de neutralización en contra de las proteínas HN y F de uno de tipo PIV no son de protección cruzada. De este modo, una vacuna de subunidad PIV efectiva debe contener las glucoproteínas HN y F de los tres diferentes tipos de virus de la parainfluenza. El anticuerpo de cualquier glucoproteína es la neutralización in vi tro . Se ha observado una correlación directa entre el nivel de los títulos de anticuerpo de neutralización y la resistencia a las infecciones por PIV-3 en lactantes. Las vacunas de subunidad nativa del virus de parainfluenza tipo P1009 3 han investigado el grado de protección de las dos glucoproteínas superficiales. Normalmente, las glucoproteínas son extraídas del virus utilizando detergentes no iónicos y se purifican adicionalmente utilizando métodos de afinidad a lectina o cromatográficos por inmunoafinidad. Sin embargo, ninguna de estas técnicas puede ser totalmente adecuada para la producción a gran escala de vacunas en todas las circunstancias. En los modelos de protección de animales pequeños (hámsters y ratas del algodón) , se demostró que la inmunización con las glucoproteínas evita la infección con PIV-3 vivo (referencias 25, 26, 27, 28, 29). También se han producido las glucoproteínas HN y F del PIV-3 utilizando tecnología de ADN recombinante . Se han producido glucoproteínas HN y F en células de insectos, utilizando el sistema de expresión de bacilovirus y mediante el uso del virus vacunal y los recombinantes del adenovirus (referencias 30, 31, 32, 33, 34) . En el sistema de expresión del bacilovirus, se han expresado tanto las formas de longitud completa como la forma truncada de las glucoproteínas PIV-3, así como una proteína de fusión F-HN quimérica. Se ha demostrado que las proteínas recombinantes son protectoras en los modelos de animales pequeños (ver O91/00104, Solicitud de los Estados Unidos No. 07/773,949 presentada el 29 de noviembre de 1991, cedida a la cesionaria de la misma) . El virus Semliki Forest (SFV por sus siglas en inglés) es un miembro del género Alfavirus de la familia Togaviridae. La partícula de virus maduro contiene una sola copia de un genoma ssARN con una polaridad positiva que tiene un remate en 5 ' y está poliadenilado en 3'. Funciona como un mARN y el ARN desnudo puede iniciar una infección cuando se introduce en las células . Con la infección/transfección, los dos tercios 5' del genoma se traducen en una poliproteína la cual es procesada en las cuatro proteínas no estructurales (nsPl a 4) por autoescisión. Una vez que las proteínas ns se han sintetizado, son responsables de la replicación del genoma de la hebra más (42S) en hebras menos de longitud completa (referencia 35) . Estas hebras menos sirven entonces como plantillas para la síntesis de nuevos genomas de hebra más (42S) y el mARN subgenómico 26S (referencia 35) . Este mARN subgenómico que es colineal con el último tercio del genoma, codifica las proteínas estructurales del SFV. En 1991, Liljestrom y Garoft (referencia 36) diseñaron una serie de vectores de expresión basados en el replicón del cADN del SFV. Estos vectores alfavirus también se describen en la WO 92/10578, cuya revelación se incorpora en la presente como referencia. A estos vectores se les ha eliminado los genes de la proteína estructural del virus P1009 para abrirle paso a los insertos hetorólogos pero, conservaron la región de codificación no estructural para la producción del complejo de replicasa nsPl a 4. También se conservaron los elementos de la secuencia 5 ' y 3 ' cortos requeridos para la replicación del ARN. Se insertó un sitio polienlazante corriente abajo del promotor 26S seguido por los sitios de detención de traducción en los tres marcos. Se insertó un sitio Spel justo después del extremo 3 ' del cADN del SFV para la linealización del piásmido para utilizarlo en las reacciones de transcripción in vi tro . Se ha mostrado que las inyecciones del ARN del SFV que codifica una proteína heteróloga resultan en la expresión de la proteína extraña y en la inducción del anticuerpo en varios estudios (referencias 37, 38) . El uso de la inoculación del ARN del SFV para expresar proteínas extrañas para fines de inmunización, tendría varias de las ventajas asociadas a la inmunización con ADN de piásmido: Por ejemplo, el ARN del SFV que codifica un antígeno viral puede ser introducido en presencia del anticuerpo en ese virus sin pérdida de potencia debido a la neutralización por los anticuerpos al virus. También, debido a que la proteína está expresada in vivo, la proteína debe tener la misma conformación que la proteína expresada por el virus mismo. Por lo tanto, las cuestiones acerca de los cambios de conformación que podrían ocurrir durante la purificación de la proteína que conduce a una pérdida de inmunogenicidad, epítopes protectores y, posiblemente, la inmunopotenciación, podrían evitarse mediante la inmunización con ácido nucleico. La inmunización con ARN del SFV también tiene varias ventajas únicas por encima de la inmunización con ADN de piásmido. El SFV es uno de los virus conocidos que replican en forma más eficiente. Después de unas cuantas horas, pueden preparase hasta 200,000 copias de los ARN-más en una sola célula. Estos ARNs del SFV son tan abundantes que casi todos los ribosomas de las células están enrolados en la síntesis de las proteínas codificadas del SFV, rebasando así la síntesis de proteínas de la célula hospedera (referencia 36) . Por lo tanto, debe requerirse una menor dosis del ARN del SFV y menor tiempo para lograr un efecto protector en comparación con la inmunización con ADN de piásmido. En segundo lugar, el ARN, a diferencia del ADN, no posee una potencial amenaza de integrarse en el genoma de la célula. En tercer lugar, la replicación y expresión del ARN del SFV ocurre solamente en el citoplasma de la célula. Por lo tanto, no existen los problemas que involucran el transporte nuclear y el corte y empalme asociado a los sistemas de expresión basados en el núcleo (inmunización con ADN) . En cuarto lugar, ya que la replicación del ARN de SFV es transitoria y el ARN es muy lábil, el ARN del SFB no persistirá por periodos prolongados después de la inmunización, como lo hacen los plásmidos del ADN. En la WO 95/27044, cuyas revelaciones se incorporan en la presente como referencia, se describe el uso de vectores de cADN de alfavirus, basados en el cADN complementario de la secuencia de ARN de alfavirus. Una vez transcrito del cADN según el control transcripcional del promotor heterólogo, el ARN de alfavirus puede autoreplicarse por medio de su propia replicasa y amplificar de esta manera el número de copias de las moléculas de ARN recombinante transcritas . En la solicitud de Patente Copendiente de los Estados Unidos No. 08/476,397 presentada el 7 de junio de 1995 (WO 96/40945) , cedida a la cesionaria de la presente y cuyas revelaciones se incorporan en la presente como referencia, se describen ciertas construcciones de piásmido utilizadas para la inmunización con ADN, que incluyen formas del gen F del RSV. Según se observa en la misma, un piásmido pXL2 confirió una protección completa a ratones inoculados con RSV vivo cuando se administró intranasal ente . Este piásmido contiene un gen que codifica una proteína F de RSV truncada que carece de la porción transmembrana de la proteína, el reforzador del promotor inmediato-temprano y las secuencias Intron del citomegatrovirus humano (CMV) y las secuencias Intron II de la ß-globina de conejo para evitar el corte y empalmado aberrantes. La misma construcción de piásmido pero sin las secuencias Intron II de la ß-globina de conejo, es decir, pXLl, solamente proporcionaron una protección parcial. De manera similar, construcción de piásmido pXL4, que es el mismo que el pXL2 con excepción del gen F del RSV que codifica a la proteína del RSV de longitud completa, proporcionó una protección parcial, en tanto que la correspondiente construcción que carece de la secuencia Intron II de la ß-globina de conejo, es decir, pXL3 , no confirió ninguna protección. Estos datos muestran que la ausencia de elementos para deducir el corte y empalmado aberrantes afecta en forma adversa la habilidad protectora del piásmido. El corte y empalmado aberrantes se presentan durante la transcripción nuclear del ADN en ARN. Al utilizar transcripciones ARN para la inmunización, se evita la necesidad del procesamiento nuclear y no puede ocurrir el corte y empalmado aberrantes. Esto permite el uso de las secuencias Intron II de las fuentes no humanas que serán evitadas . El uso de las transcripciones del ARN para la administración al hospedero permite que se obtenga la protección total a la inoculación utilizando una dosis inferior en menos tiempo que cuando se utilizan plásmidos de ADN descritos en la Solicitud de los Estados Unidos No. 08/476,397 (WO 96/40945). El uso de las transcripciones de ARN evita la persistencia del ADN en el hospedero inmunizado y la potencial integración. La habilidad para inmunizar en contra de la enfermedad provocada por el RSV mediante la inmunización con ARN del SFV desnudo que codifica la proteína F del RSV particularmente, la versión secretada de la proteína F del RSV, era desconocida antes de la presente invención y no puede predecirse con base en la técnica anterior conocida. La infección con RSV conduce a una enfermedad grave. Sería útil y deseable proporcionar vectores mejorados para la administración in vivo de las preparaciones inmunogénicas , que incluyen a las vacunas, para la protección en contra de la enfermedad provocada por el RSV. En particular, sería deseable proporcionar vacunas que sean inmunogénicas y protectoras para en las poblaciones humanas pediátrica y anciana, incluyendo a los lactantes seronegativos, las cuales no provoquen un refuerzo en la enfermedad (inmunopotenciación) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona novedosos P1009 materiales inmunogénicos y procedimientos de inmunización, basados en estos novedosos materiales para la inmunización en contra de la enfermedad provocada por los paramixoviridae, que incluyen al virus sincicial respiratorio y la virus de la parainfluenza. En particular, la presente invención está dirigida al suministro de vacunas de ARN en contra de la enfermedad provocada por infección con los paramixoviridae . De conformidad con un aspecto de la presente invención, se proporciona un vector, que comprende una primera secuencia de ADN que es complementaria de al menos parte de un genoma de ARN de alfavirus y que tiene al complemento de las regiones de replicación del genoma completo de ARN de alfavirus; una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína de paramixovirus o un fragmento de proteína que genera anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína del paramixovirus; la segunda secuencia de ADN será insertada en una región de la primera secuencia de ADN que no es esencial para la replicación; las secuencias de ADN primera y segunda están bajo el control transcripcional de un promotor. La proteína del paramixovirus puede seleccionarse del grupo que consiste de un virus de la parainfluenza (PIV) y un virus sincicial respiratorio (RSV) . La proteína PIV puede ser PIV-1, PIV-2, PIV-3 o PIV-4, particularmente, P1009 las glucoproteínas HN o F del PIV-3. Particularmente, la proteína del RSV puede ser la glucoproteína F o G del RSV. La segunda secuencia de ADN puede codificar una proteína F del RSV de longitud completa o puede codificar una proteína F del RSV que carece de la ancla transmembrana y de la cola citoplásmica. La carencia de la región de codificación del ancla transmembrana y la cola citoplásmica resulta en una forma secretada de la proteína F del RSV. La segunda secuencia del ADN codifica, de preferencia, una proteína F del RSV y carece de un sitio de restricción Spel y, en forma opcional, carece también de la región que codifica el ancla transmembrana y la cola citoplásmica. La ausencia del sitio de restricción Spel puede realizarse al mutar el nucleótido 194 (T) del gen F del RSV en uno C, lo que elimina al Spel sin alterar la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos (SEQ. ID No: 1) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ. ID No: 2) del gen F del RSV truncado y mutado, se muestra en la Figura 2. El alfavirus es de preferencia un virus Semliki Forest y la primera secuencia del ADN es la secuencia viral de Semliki Forest, contenida en el pSFVl de piásmido. El promotor utilizado es, de preferencia, el promotor SP6. El vector puede contener un sitio de restricción único que permite la linealización del vector sin borrar la P1009 segunda secuencia de nucleótido y que mantiene las secuencias de nuecleótidos primera y segunda bajo el control transcripcional del promotor. El sitio de restricción único de preferencia es un sitio Spel, que se deriva, de manera particular, del pSFVl . La forma linealizada del vector forma una modalidad en la presente. El vector puede ser un vector piásmido, de preferencia, uno que tiene las características de identificación de piásmido pMP37 (ATCC 97905) , según se muestra en la Figura 1C y, con más preferencia, es el piásmido pMP37. La secuencia de ADN mutante que codifica una proteína F del RSV o un fragmento de la misma con la capacidad de inducir anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína F del RSV y que carecen del sitio de restricción Spel presente en la secuencia de ADN nativa, constituye otro aspecto de la presente invención. Esta secuencia de ADN mutante que carece del sitio Spel de la secuencia nativa preferentemente es la que se muestra en la Figura 2 (SEQ ID No: 1) o una que codifica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 2 (SEQ ID No: 2) . El novedoso vector que se proporciona en la presente puede linearizarse mediante escisión en el único sitio de restricción y transcribirse en una transcripción P1009 de ARN. De conformidad con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una transcripción de ARN de un vector según se proporciona en la presente, producida mediante linealización y transcripción. Las transcripciones de ARN proporcionadas en la presente pueden proporcionarse en forma de una composición inmunogénica para su administración in vivo a un hospedero para la generación en el hospedero de anticuerpos a la proteína del paramixovirus, tales como las composiciones inmunogénicas que comprenden, como el componente activo de las mismas, a una transcripción de ARN según se proporciona en la presente. Estas composiciones inmunogénicas, las cuales se proporcionan de conformidad con otro aspecto de la invención, pueden formularse con cualesquiera vehículo o portador farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración in vivo y puede producir una respuesta inmunitaria protectora. En otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para inmunizar a un hospedero en contra de la enfermedad provocada por la infección con el paramixovirus, el cual comprende la administración al hospedero de una cantidad efectiva de una transcripción de ARN, según se proporciona en la presente. La presente invención también incluye un método novedoso para utilizar a un gen que codifica una proteína F P1009 del RSV o a un fragmento de una proteína F del RSV que tiene la capacidad de generar anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína F del RSV para proteger al hospedero en contra de la enfermedad provocada por la infección con el virus sincicial respiratorio, que comprende aislar al gen; enlazar operativamente al gen con una secuencia de ADN que es complementaria de al menos una parte de un genoma de un ARN de alfavirus y que tiene al complemento de las regiones de replicación completas del genoma de ARN de alfavirus en una región de la secuencia de ADN que no es esencial para la replicación y formar un vector de piásmido en donde el gen y la secuencia de ADN están bajo el control transcripcional de un promotor; linealizar al vector del piásmido al tiempo que se mantiene al gen y a la secuencia de ADN bajo el control transcripcional del promotor; formar una transcripción de ARN del vector linealizado; e introducir la transcripción de ARN en el hospedero. La linealización del vector del piásmido se efectúa al despejar el vector de piásmido en un sitio de restricción único en el mismo en una ubicación que permite el mantenimiento del gen y de la secuencia de ADN bajo el control transcripcional del promotor. El sitio de restricción único puede ser un sitio Spel, tal como se deriva del pSFVl del piásmido.

P1009 El vector de piásmido utilizado es, de preferencia, el pMP37 de piásmido y el paso de la linealización se efectúa mediante la escisión en el sitio Spel del pMP37 de piásmido (ver Figura 1C) . Además, la presente invención incluye un método para producir una vacuna para la protección de un hospedero en contra de la enfermedad provocada por la infección con el virus sincicial respiratorio (RSV) , que comprende aislar una primera secuencia de ADN que codifica una proteína F del RSV del que el ancla transmembrana y la cola citoplásmica están ausentes y que carece de algún sitio de restricción Spel; enlazar operativamente la primera secuencia de ADN con una segunda secuencia de ADN que es complementaria de al menos una parte de un genoma de ARN de alfavirus y que tiene completas las regiones de replicación del genoma del alfavirus en una región de la segunda secuencia de ADN que no es esencial para la replicación y formar un vector de piásmido, en donde las secuencias de ADN primera y segunda están bajo el control transcripcional de un promotor; linealizar el vector de piásmido al tiempo que se mantienen las secuencias de ADN primera y segunda bajo el control transcripcional del promotor; formar una transcripción de ARN del vector linealizado; y, formular la transcripción de ARN como una vacuna para la administración in vi vo .

P1009 La linealización del vector de piásmido se realiza al despejar el vector de piásmido en un sitio de restricción único en el mismo, en una ubicación que permite el mantenimiento del gen y de la secuencia de ADN bajo el control transcripcional del promotor. El sitio de restricción único puede ser un sitio Spel, tal como el que se deriva del pSFVl de piásmido. El vector de piásmido utilizado es, de preferencia, pMP37 de piásmido y el paso de la linealización se efectúa mediante escisión en el sitio Spel del pMP37 de piásmido. Las ventajas de la presente invención incluyen el suministro de transcripciones de ARN que son útiles para generar una respuesta inmunitaria mediante la administración in vivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se comprenderá adicionalmente a partir de la siguiente descripción con referencia a los dibujos, en los cuales: las Figuras 1A, IB y 1C muestran un esquema de la construcción del pMP37 de piásmido utilizado para generar el ARN del RSV-F. la Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ P1009 ID No: 2) de un gen F de RSV truncado que carece de la ancla transmembrana y la cola citoplásmica y que mutó en el nucleótido 194 para eliminar el sitio de restricción Spel presente en el gen sin mutar; la Figura 3, que comprende los paneles A, B y C, muestra los títulos F de anti-RSV en suero de ratones tomado 4 semanas después de la inmunización primaria y 2 semanas después del refuerzo con el ARN del RSV F. Los paneles A, B y C muestran la respuesta IgG total, la respuesta IgGI y la respuesta IgG2a, respec ivamente; y la Figura 4 muestra los títulos de anticuerpos de neutralización específicos del RSV, expresados como títulos de reducción de placa de las diversas preparaciones del RSV.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Según se describió anteriormente, la presente invención se relaciona, en general con la protección de hospederos en contra de la enfermedad provocada por la infección por paramixovirus mediante la inmunización con ARN, utilizando transcripciones del ARN formadas a partir de vectores de ADN mediante linealización y la transcripción del vector linealizado. En particular, la invención se relaciona con la protección de hospederos en contra de la enfermedad provocada por la infección por el P1009 virus sincicial respiratorio (RSV) , aunque no está limitada específicamente al mismo. La siguiente descripción se refiere específicamente al empleo de la secuencia de ADN y de las transcripciones del ARN del mismo que codifican a la proteína F del RSV y a los fragmentos de la misma, los cuales generan anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína F del RSV. En esta solicitud, se utiliza el término "proteína F del RSV" para definir una proteína F del RSV de longitud completa, que incluye proteínas que tienen variaciones en sus secuencias de aminoácidos, incluyendo aquellas que se presentan en forma natural en diversas cepas del RSV y aquellas introducidas mediante la amplificación por PCR del gen que codifica, al tiempo que retiene las propiedades inmunogénicas, una forma secretada de la proteína F del RSV que carece de la ancla transmembrana y de la cola citoplásmica, así como fragmentos de la proteína F del RSV, capaces de generar anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína F del RSV y análogos funcionales de la proteína F del RSV.

En esta solicitud, una primera proteína es un "análogo funcional" de una segunda proteína si la primera proteína está inmunológicamente relacionada con la segunda proteína y/o tiene la misma función que la segunda proteína. El análogo funcional puede ser, por ejemplo, un fragmento de P1009 la proteína o un mutante de substitución, adición o deleción de la misma. Se construye un vector que contiene una primera secuencia de ADN que es complementaria con al menos parte de un genoma de ARN de alfavirus, específicamente, del virus Semliki Forest y que tiene el complemento de las regiones de replicación completas del genoma de ARN de alfavirus. Una segunda secuencia de ADN que codifica a la proteína F del RSV se inserta en una región de la primera secuencia de ADN, que no es esencial para la replicación. Las secuencias de ADN primera y segunda están bajo el control transcripcional de un promotor. El vector resultante está linealizado y se forma una transcripción de ARN del vector linealizado. Las transcripciones de ARN proporcionadas en la presente, cuando se administran a un animal, incluyendo un ser humano se replican rápidamente y efectúan la expresión de la proteína F del RSV in vivo, según se demuestra mediante una, respuesta de anticuerpo específico de la proteína del RVF del animal en el que se administró. Estos anticuerpos pueden utilizarse, si se desea, en la detección de la proteína del RSV en una muestra. Según puede observarse de los resultados detallados de los siguientes ejemplos, las transcripciones de ARN proporcionaron un título de anticuerpo IgG anti-F P1009 elevado con una proporción IgGl/lgG2a que siguen estrechamente la proporción obtenida de la inmunización con virus vivo. La inmunización con las transcripciones de ARN protegieron a los animales en contra de la inoculación con el RSV vivo. Es muy evidente para los experimentados en la técnica que las diversas modalidades de la invención tienen muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, diagnóstico y tratamiento de las infecciones con RSV. Un análisis no limitante y adicional de estos usos se presenta a continuación. 1, Preparación y Uso de la Vacuna Las composiciones inmunogénicas, adecuadas para utilizarse como vacunas, pueden prepararse a partir del gen F del RSV y de los vectores, según se revela aquí. La vacuna produce una respuesta inmunitaria en un individuo, que incluye la producción de anticuerpos anti-RSV F. Las composiciones inmunogénicas, incluyendo a las vacunas, que contienen las transcripciones de ARN pueden prepararse como emulsiones o soluciones líquidas inyectables fisiológicamente aceptables para la administración del polinucleótido. Las transcripciones de ARN asociadas a liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como liposoma de ácido P1009 nucleico (por ejemplo, según se describe en WO 93/24640, referencia 38) o el ARN puede estar asociado con un adyuvante, según se describe más adelante con más detalle. Los liposomas que comprenden lípidos catiónicos interactúan espontánea y rápidamente con polianiones, tales como ADN y ARN, resultando en complejos de liposoma/ácido nucleico que capturan hasta arrasar al polinucleótido. Además, los complejos policatiónicos se fusionan con las membranas celulares, resultando en un suministro intracelular del polinucleótido que brinca o deriva las encimas degradantes del compartimiento liposómico. La solicitud PCT publicada WO 94/27435 describe composiciones para la inmunización genética que comprende lípidos catiónicos y polinucleótidos . De manera ventajosa pueden utilizarse agentes que ayuden a la absorción celular del ácido nucleico, tales como iones calcio, proteínas virales y otros agentes que faciliten la transfección. Las preparaciones inmunogénicas de polinucleótidos también pueden formularse como microcápsulas, incluyendo partículas biodegradables de liberación en el tiempo. De este modo, la Patente de los Estados Unidos 5,151,264, describe un vehículo particulado de naturaleza fosfolípida/glucolípida/polisacárida que ha sido denominado Bio Vecteurs Supra Moléculaires (BVSM) . Se pretende que los vehículos particulados transporten una variedad de moléculas que tienen actividad biológica en una de las capas del mismo. La Patente de los Estados Unidos 5,075,109, describe la encapsulación de los antígenos trinitrofenilados de hemocianina de lapa de bocallave y enterotoxina B de estafilococo en poli (DL-lactidecoglycolide) 50:50. Se sugieren otros polímeros para la encapsulación, tales como poli (glucolide) , poli (DL-lactide-coglycolide) , copolioxalatos, policaprolactona, poli (lactide-co-caprolactona) , poli (esteramidas) , poliortoésteres y poli (ácido 8-hidroxibutírico) y polianhíd idos . La solicitud PCT publicada WO 91/06282 describe un vehículo de suministro que comprende una pluralidad de microesferas bioadhesivas y antígenos. Las microesferas son de almidón, gelatina, dextrano, colágeno o albúmina. Este vehículo de suministro tiene la intención particular de la absorción de la vacuna a través de la mucosa nasal. El vehículo de suministro puede, adicionalmente, contener un mej orador de absorción. Las transcripciones de ARN pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, los cuales son compatibles con las mismas. Estos excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Las vacunas y las P1009 composiciones inmunogénicas pueden contener adicionalmente substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o 1 emulsionantes, agentes amortiguadores de pH o adyuvantes para mejorar la efectividad de los mismos. Las vacunas y las composiciones inmunogénicas pueden administrarse en forma parenteral, por inyección subcutánea, intravenosa, intradérmica o intramuscular, posiblemente después del pretratamiento del sitio de la inyección con un anestésico local. En forma alternativa, las composiciones inmunogénicas formadas de conformidad con la invención, pueden formularse y suministrarse en una forma que evoquen una respuesta inmunitaria en las superficies de mucosa. De este modo, la composición inmunogénica puede administrarse a las superficies de mucosa mediante, por ejemplo, las vías nasal u oral (intragástrica) . En forma alternativa, pueden ser deseables otros modos de administración, incluyendo los supositorios y las formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y los vehículos pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir los excipientes utilizados normalmente, tales como por ejemplo, los grados farmacéuticos de sacarina, celulosa o carbonato de magnesio. Las vacunas y las preparaciones inmunogénicas se administran en una forma compatible con la dosificación de la formulación y, en esta cantidad, según será terapéuticamente efectiva, protectora e inmunogénica. La cantidad que será administrada, depende del individuo que será tratado, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar la proteína F del RSV y los anticuerpos de la misma y, si es necesario, para producir una respuesta inmunitaria mediada por células. Las cantidades precisas del ingrediente activo requerido para administrarse dependerá del juicio del médico. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados pueden ser fácilmente determinados por los experimentados en la técnica y pueden ser del orden de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 10 mg del ARN F del RSV. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo también son variables pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores. La dosificación también puede depender de la vía de administración y variará de conformidad con la talla del hospedero. Una vacuna que protege en contra solamente de un patógeno es una vacuna monovalente. Las vacunas que contienen material antigénico de varios patógenos son vacunas combinadas y también pertenecen a la presente invención. Estas vacunas combinadas contienen material de, por ejemplo, varios patógenos o de varias cepas del mismo patógeno o de P1009 combinaciones de varios patógenos. La inmunogenicidad puede mejorarse en forma significativa si los vectores se co-administran con adyuvantes, utilizados comúnmente como solución de 0.05 a 0.1 por ciento en solución salina amortiguada con fosfato. Los adyuvantes mejoran la inmunogenicidad de un antígeno pero ellos mismos no son necesariamente inmunogénicos . Los adyuvantes pueden actuar al retener localmente al antígeno cerca del sitio de administración para producir un efecto de depósito que facilite una liberación lenta y prolongada del antígeno hacia las células del sistema inmunitario. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmunitario hacia un depósito de antígeno y estimular a dichas células para producir respuestas inmunitarias . Los agentes inmunoestimulatorios o adyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedero ante, por ejemplo, las vacunas. De este modo, se ha identificado que los adyuvantes mejoran la respuesta inmunitaria ante los antígenos. Sin embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden provocar efectos " secundarios indeseables, haciéndolos inadecuados para utilizarse en humanos y en muchos animales. Es claro que, solamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (referidos comúnmente en forma colectiva como alumbre) se utilizan rutinariamente P1009 como adyuvantes en vacunas para seres humanos y veterinarias . Una amplia gama de adyuvantes extrínsecos y otros materiales inmunomoduladores pueden provocar respuestas inmunitarias potentes ante los antígenos. Éstos incluyen saponinas acomplejadas con la membrana de proteína de los antígenos para producir complejos de estimulación inmunitarios (ISCOMS) , polímeros plutónicos con aceite mineral, micobacterias destruidas en aceite mineral, adyuvante completo de Freund's, productos bacterianos, tales como dipéptido de muramilo (MDP) y lipopolisacárido (LPS) , así como lípido monoforil A, QS 21 y polifosf ceno. En las modalidades particulares de la presente invención, puede suministrarse la transcripción de ARN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína F del RSV junto con una molécula blanco para enfocar el vector hacia las células seleccionadas que incluyen células del sistema inmunitario. La transcripción del ARN puede suministrarse al hospedero mediante una variedad de procedimientos, por ejemplo, Tang et al. (referencia 39) revela que la introducción de microproyectiles de oro recubiertos con ADN que codifica para una hormona de crecimiento de bovino (BGH) en la piel de ratones resultó en la producción de anticuerpos anti-BGH en los ratones, en tanto que Furth et P1009 al. (referencia 40) mostró que podría utilizarse un inyector de chorro para transfectar tejidos de piel, músculo, graso y mamario de animales vivos.

Depósitos Biológicos Ciertos vectores que contienen al gen que codifica la proteína F del RSV y a los que se hace referencia en la presente se han depositado en American Type Culture Collection (ATCC) ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, E.U.A., en acatamiento del Tratado de Budapest y antes de la presentación de esta solicitud. Las muestras de los plásmidos depositados estarán disponibles al público con el otorgamiento de una patente basada en esta solicitud de patente de los Estados Unidos y todas las restricciones al acceso a los depósitos serán retiradas en ese momento. Los depósitos no viables serán reemplazados en el caso de que la ATCC sea incapaz de despacharlos. La invención descrita y reivindicada en la presente no está limitada en su alcance a los plásmidos depositados, ya que la modalidad depositada se pretende solamente como una ilustración de la invención. Cualesquiera plásmidos equivalentes o similares que codifican antígenos similares o equivalentes según se describe en esta solicitud están dentro del alcance de esta P1009 invención.

Sumario del Depósito Piásmido Designación ATCC Fecha de Depósito pMP37 97905 27 de febrero de 1997 EJEMPLOS La anterior revelación describe de manera general a la presente invenciói. Puede obtenerse una comprensión más completa mediante la referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos Ejemplos se describen solamente con propósitos de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Están contemplados los cambios de forma y substitución de equivalentes ya que las circunstancias pueden sugerir o hacerlo más conveniente. Aunque en la presente se han utilizado términos específicos, se pretende que estos términos tengan un sentido descriptivo y no con el propósito de limitarlos. Los métodos de la genética molecular, la bioquímica de las proteínas y la inmunología utilizados pero, no descritos en forma explícita en esta revelación, y estos ejemplos están ampliamente reportados en la literatura científica y están dentro de la habilidad de los experimentados en la técnica.

P1009 Ejemplo 1 Este Ejemplo describe la construcción de un vector de expresión del virus Semliki Forest (SFV) que contiene una versión truncada del gen F del RSV. Una versión truncada del gen F del RSV se insertó en el vector de expresión pSFVl del SFV (Gibco BRL, Gaithersburg, MD EUA) , de conformidad con los pasos descritos en la Figura 1. El gen F del RSV se clonó originalmente a partir de un subtipo A del RSV clínico aislado en el F del pRSV de piásmido, según se describe en forma completa en la Solicitud de Patente copendiente de los Estados Unidos No. 08/001,554, presentada el 6 de enero de 1993, cedida a la cesionaria de la presente y cuya revelación se incorpora aquí como referencia (referencia 41 y WO 93/14207) . A partir del F del RSV de piásmido se extrajo un fragmento del gen F del RSV mediante digestión del piásmido con BspHI y EcoRI . La enzima de restricción BspHI se corta dentro de la región que codifica al gen F del RSV, retirando 48 aminoácidos del término C de la proteína F. Estos aminoácidos constituyen la mayor parte del dominio transmembrana y toda la cola citoplásmica. El fragmento del gen F del RSV truncado resultante de 1.6 Kb se clonó en los sitios EcoRI-BamHI del vector de expresión de célula de mamífero basado en la copia azul pMCR20 (Stratagene, La «Tolla, CA) en una ligadura de 3 vías con un P1009 enlazante, con base en la siguiente secuencia: 5' CATGACTTGATAATGAG 3' (SEQ ID No : 3) 3' TGAACTATTACTCCTAG 5' (SEQ ID No : 4) para generar al piásmido pES13A, según se describe en la antes mencionada solicitud de patente de los Estados Unidos 08/001,554 (WO 93/14207). Este enlazante añade una treonina codificada que no es de plantilla al término C de la proteína F del RSV truncada e inserta tres codones de detención sucesivos en el extremo del gen truncado. El fragmento del gen F del RSV truncado de 1.6 Kb se extrajo entonces del piásmido pES13A mediante digestión con EcoRI y BamHI . En otra ligadura de 3 vías, el fragmento del gen F de RSV EcoRI-BamHI de 1.6 Kb se clonó en el sitio BamHI del vector de expresión del pSFVl del SFV con otro enlazante, basado en la secuencia siguiente: ' GATCCGCGCGCGCG 3 ' (SEQ ID No: 5 3 ' GCGCGCGCGCTTAA 5' (SEQ ID No: 6 para generar el piásmido pMP35. Este piásmido contenía dos copias del fragmento de gen F del RSV BamHI de 1.6 Kb. En este momento, se descubrió que había un sitio Spel ubicado en el bp 193 del fragmento del gen F del RSV del sitio BamHI corriente arriba. Es necesario linealizar un piásmido basado en pSFVl con Spel antes de su uso en la P1009 reacción de transcripción in vi tro descrita más adelante. Por lo tanto, el sitio Spel del gen F del RSV necesitaba ser retirado y esto se efectuó de la siguiente forma. El fragmento del gen F de RSV truncado de 1.6 Kb se extrajo del piásmido pMP35 mediante digestión con BamHI y se ligó en el sitio BamHI de pUC19 para generar al piásmido pMP36. El estuche de mutagénesis dirigida al sitio Transformer™ (Clonetech, Palo Alto, CA, EUA) y un cebador, 5'- TGGTTGGTATACCAGTGTTATAACT (SEQ ID No: 7) se utilizaron, de conformidad con las instrucciones del fabricante, para cambiar el nucleótido 194 de una T a una C. Este cambio elimina al sitio Spel en el gen F del RSV sin afectar la secuencia de aminoácidos de la proteína F del RSV codificada. La secuencia del piásmido pMP36A, que contiene al gen F del RSV alterado, se determinó mediante análisis de la secuencia del ADN. El fragmento del gen F del RSV truncado de 1.6 Kb se extrajo del piásmido pMP36A mediante digestión con BamHI y se ligó en el sitio BamHI del pSFVl para generar al piásmido pMP37 (ATCC 97905) . La apropiada orientación del gen F de RSV truncado se confirmó mediante el mapeo de restricción y el análisis de la secuencia de ADN. La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 1) del fragmento BamHI del gen F de RSV truncado con el sitio Spel eliminado y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No : 2) de la proteína F del RSV P1009 secretada codificada de esta manera. El ADN del piásmido se purificó utilizando los estuches ADN mide de piásmido de Oiagen (Chatsworth, CA, EUA), de conformidad con las instrucciones del fabricante.

E emplo 2 Este Ejemplo describe la preparación del pMP37 linealizado de Spel requerido para la generación del ARN de SFV-RSVF en reacciones de transcripción in vitro y preparación del ARN de SFV-RSVF. 20 µg del piásmido pMP37, preparado según se describió en el Ejemplo 1, se cortaron con Spel en una reacción de 100 µl que contenía 20 MM de Tris-HCl (pH 7.4), mM de MgC12 , 50 mM de KCl y 30 unidades de Spel (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA) . El SFV-ARN se generó del piásmido linealizado en una reacción de transcripción in vi tro de 300 µL utilizando los siguientes materiales: 40 mM de Tris-HCl (pH 7.9) 6 mM MgCl2 2 mM de espermidine- (HCl) 3 1 mM de DTT (ditiotreonol) 1 mM de ATP (trifosfato de adenosina) 1 mM de GTP (trifosfato de guanosina) 1 mM de CTP (trifosfato de citidina) P1009 1 mM de UTP (trifosfato de uridina) 1 mM del análogo de casquete del ARN m7G(5' )ppp(5' )G (New England Biolabs, Mississauga, Ont . , Canadá) 360 unidades del inhibidor enzimático RNasin® (Promega, Madison, WI, EUA) 270 unidades de polimerasa de ARN SP6 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA) La reacción se incubó a 37°C durante 50 minutos. El ARN de SFV-RSVF producido de esta manera se purificó a partir de la sal, enzimas, NTP ' s no incorporados y análogo de casquete al pasar la mezcla de reacción a través de columnas CHROMA SPIN™-200 DEPC-H20 (Clonetech, Palo Alto, CA, EUA) (75 µL/columna) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. El ARN purificado se precipitó entonces con etanol y volvió a suspenderse en H20 tratada con DEPC hasta una concentración final de 1 µg/µL. El ARN purificado se mezcló con un volumen igual de PBS 2X justo antes de la inmunización.

Eiemplo 3 Este Ejemplo describe la inmunización de ratones con ARN de SFV-RSVF y los resultados de inmunogenicidad obtenidos . Previamente se ha mostrado que los ratones son P1009 susceptibles a la infección con RSV (referencia 42) y que son un modelo animal relevante . Los ratones se inmunizaron, por vía intramuscular (i.m.), con el ARN de SFV-RSVF, preparado según se describió en el Ejemplo 2. Los músculos tibialis anteriores de cinco ratones BALB/c (hembras de 6 a 8 semanas de edad) (Jackson Lab. , Bar Harbour, ME, EUA) , fueron bilateralmente inyectados con 2 x 25 µg (0.5 µg/µL) del ARN de SFV-RSVF dirigido con PBS. Cinco días antes de la inmunización con ARN, a los músculos se les trató con 2 x 50 µL de cardiotoxina (10 µM en PBS) (Latoxan, Francia) . Previamente se ha mostrado que el tratamiento de los músculos con cardiotoxina mejora la absorción del ADN y aumenta la respuesta inmunitaria (referencia 43) . Cuatro semanas después, a estos ratones se les aplicó un refuerzo en una forma idéntica (Cuadro 1 más adelante) . Los grupos de control se inmunizaron con (1) ARN de SFV que expresa ß-galactosidasa (ARN de SFV-LacZ) , (2) ARN de SFV-RSVF conforme se prepara en la presente; (3) RSV vivo, (4) PBS con alumbre y preparación subunitaria de RSV con alumbre. A estos ratones también se les aplicó un refuerzo de manera idéntica 4 semanas después (Cuadro 1) . La preparación subunitaria de RSV que comprende proteínas F, G y M del RSV se describe en la Solicitud copendiente de Patente de los Estados Unidos No. 08/679,060, presentada el 12 de julio de 1996, cedida a la P1009 cesionaria de la misma y cuya revelación se incorpora aquí como referencia (WO 98/02457) . Dos semanas después de la segunda inmunización, a los ratones se les inoculó intranasalmente 106 unidades formadoras de placa (pfu) de la cepa A2 del RSV (BG-4A) . Los animales fueron sacrificados 4 días después. Los pulmones se retiraron asépticamente, se pesaron y homogeneizaron en 2 mL de medio de cultivo completo. El título de los virus en los homogenatos de pulmón se determinó por duplicado utilizando células Vero, según se describió previamente (referencia 44) . De los ratones se obtuvieron sueros a las 4 y a las 6 semanas. Los títulos de anticuerpo F anti-RSV (IgC, IgGl y IgG2a) en estos sueros se determinaron mediante el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) , según se describe en el Ejemplo 4. Los títulos de reducción de placa específicos del RSV de estos sueros se determinaron según se describió previamente (referencia 44) . Las respuestas al anticuerpo F anti-RSV en los sueros de los ratones BALB/c que fueron inmunizados según se describe en el Cuadro 1, se resumen en la Figura 3. Los animales inmunizados con ARN de SFV-RSVF, RSV vivo o la preparación subunitaria RSV más alumbre, tuvieron todos títulos de anticuerpo F IgG anti-RSV totales altos en sus sueros tanto a las 4 como a las 6 semanas (Figura 3, panel P1009 A) . Sin embargo, las proporciones de IgGl/lgG2a difieren marcadamente, según se observa en los paneles B y C de la Figura 3. Los sueros de los animales que fueron inmunizados con RSV vivo tenían una proporción anti-F IgGl/lgG2a de aproximadamente 0.69 después de 6 semanas. Este valor contrasta con la proporción anti-RSV F IgGl/lgG2a que se obtuvo en los ratones después de 6 semanas de que fueron cebados y reforzados con la preparación subunitaria del RSV adyuvada con alumbre. En este caso, la proporción de anti-RSV IgGl/IgG2a fue de aproximadamente 4.3. Las proporciones de F anti-RSV IgGl/lgG2a obtenidas en los ratones inmunizados con el ARN de SFV-RSVF después de 6 semanas fueron de 0.79. Estos resultados sugieren que la inmunización de ratones con ARN de SFV-RSVF resulta en más de una respuesta tipo Th-1 similar a la obtenida con el virus de RS vivo en vez de la respuesta de tipo Th-2 observada con la preparación subunitaria de RSV adyuvada con alumbre. Según se muestra en la Figura 4 , los sueros de los ratones que fueron cebados y que se reforzaron con las diversas preparaciones de RSV según se describe en el Cuadro 1, todos tuvieron niveles significativos de anticuerpos de neutralización específicos del RSV (grupos 2, 3 y 5) . Por contraste con los animales de control con placebo (grupos 1 y 4) , el tracto respiratorio inferior de P1009 los ratones que se inmunizaron con ARN de SFV-RSVF, RSV vivo o la preparación subunitaria de RSV adyuvada con alumbre, estuvieron totalmente protegidos contra la inoculación con virus de RS vivos, según se observa en el Cuadro 2. La inmunización de los ratones con el ARN de SFV-RSVF, protegió a los ratones en contra de la inoculación con RSV vivo. La habilidad protectora de este replicón del SFV fue comparable a la inducida mediante la inoculación con RSV vivo o con subunidades del RSV adyuvadas con alumbre. El tipo de respuesta inmunitaria generada pareció que era más una respuesta de tipo Th-1, similar a la producida por el RSV vivo.

Ejemplo 4 Este ejemplo describe la determinación de los títulos del anticuerpo F anti-RSV. Las cavidades de placa Nunc-MaxiSorp se recubrieron durante toda la noche a temperatura ambiente con 2.5 ng de la proteína F del RSV purificada por inmunoafinidad, diluida en regulador de carbonato- bicarbonato al 0.05M, pH 9.6. Las cavidades se bloquearon en cuanto a la unión no específica añadiendo BSA al 0.1% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en un regulador de lavado de BSA al 0.1% en PBS P1009 + Tween 20 al 0.1%. A las cavidades se añadieron diluciones en serie al doble o al cuádruple del suero del ratón. Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron cinco veces con regulador de lavado y se añadió conjugado etiquetado de peroxidasa de rábano picante (HRP) a la apropiada dilución óptima en el regulador de lavado. El ensayo para IgG total utilizó IgG de antiratón de cabra F(ab')2 (específico de H+I)-HRP de Jackson Immuno Research Laboratory Inc. (Baltimore MD, USA) . En el ensayo de IgGl se utilizó IgGl-HRP anti-ratón de borrego de Serotec (Toronto, Ontario, Canadá) y en el ensayo de IgG2a se utilizó IgG2a anti-ratón de cabra de Caltag Laboratories (San Francisco, CA, USA) . Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron cinco veces con regulador de lavado y se añadió peróxido de hidrógeno (substrato) en presencia de tetrametilbenzidina. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico al 2 M. El color se leyó en un lector de placas Multiscan Titertek a una densidad óptica (OD) de 450 nm. El título se obtuvo como el recíproco de la última dilución a la cual la OD era de aproximadamente el doble. Esta OD debe ser mayor que el control negativo del ensayo a la dilución inicial. El suero pre-inmunitario de cada animal fue utilizado como control negativo.

P1009 SUMARIO DE LA REVELACIÓN En el sumario de esta revelación, se proporcionan vectores novedosos que contienen secuencias de ADN que codifican una proteína de paramixovirus, particularmente, una proteína F de RSV, que puede linealizarse y transcribirse en ARN para la administración in vivo para generar una respuesta inmunitaria protectora a la enfermedad provocada por la infección con paramixovirus, particularmente, con virus sincicial respiratorio. Dentro del alcance de esta invención son posibles modificaciones.

Cuadro 1. Protocolo de inmunización A los ratones se les inoculó: 1 25 µg de ARN se inyectaron en cada músculo de la pata trasera en 50 µL de PBS. 2 2.5 X 105 de pfu de virus A2 adaptado a ratón. 3 1 µg de la vacuna subunitaria de RSV adsorbida en alumbre (1.5 mg/dosis) .

P1009 Cuadro 2 P1009 REFERENCIAS . Mc?ntoch K. an Chanouk R.M, iu Fieids B.N. and Klllpe Ü.M. (eds), Virology. Ravßn Press, New ?ork, 1990, pp.1045-1072. . Murphy B,R., Hall s.L., ulkarnl A.8., crowe J.E., Louins P.L., Csnnors M., Kaxron R.A. and Chanock R.M., Viiua Res 32, 13-36, 1994. . Ostei eil D. and Norman D., Am Geriat Soc 36, 659- Agius G., Dindinand Q, , Bíggax R.J., Peyxe R. , Véuílant v», Ranger S., Paupet J.?., Cissa M.F. and Castere M., J Med Viral 30, 117-127, 1990. Kat£ S.L. in New vaccine develcp.nent establishipg pri rlties Vol 1. Nstional Academie Press, Washington, 1985, pp. 3974 09. 6. Sullender ,M., Biotechnology 20, 7. Fulginiti V.A., Eller J.J., Sieber O.P., Joyner J, ., MinamitaiU M. and Neiklejohn G., Am i Epiüe iol 83, 449-463, 1969. B. Chin ü., Magnffin R.L., S éarer I.A., Schißbls J.K. Jggq L?nnßttß E'H'' J Epidemiol 89, 449-463, 9. Belshe R.B., Van Voris .P. and Mufson M,A., J Infßct Dis 145, 311-319/ 19S2. 10. im R.IM. j Arrobio .o., fyles G., Brandt C.D., Lam rgo E.r Chanock R.M. and Pa rott R.H., Pediátrica 49, 745-755, 1971. 11, ^?e? C. and evine S., J Gen Virol 64, 825-832, 12. Ol stead R.A., Elango N. and Princß G.A., Pfoc Nati Auad Sel USA aa, 7462-7466, 1 91. 13, Parrington M., oc le S.f Wy?e P., Du R.-P., Snßll .-Y., Wang Q. , Gisonni L. , $anhueza =., M- an Klein M. , Virus Genes 14, 65-74, 14. Fuiginiti, V.A., Eller, J.J., sieber, ?.?\, doyner, J.h., Minamitami, M. and Mciklcjo n, G, (1969) ?irw j, Epi eiaial, 89 (4), 435-448.

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Claims (25)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Un vector, caracterizado por: una primera secuencia de ADN que es complementaria de al menos parte de un genoma de ARN de alfavirus y que tiene el complemento de las regiones de replicación completas del genoma de ARN de alfavirus, una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína de paramixovirus o un fragmento de proteína que genera anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína del paramixovirus, la segunda secuencia de ADN será insertada en una región de la primera secuencia de ADN que no es esencial para la replicación de la misma, las secuencias de ADN primera y segunda están bajo el control transcripcional de un promotor.
2. 2. El vector según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de paramixovirus se o selecciona del grupo que consiste de una proteína del virus de la parainfluenza (PIV) y una proteína del virus sincicial respiratorio (RSV) .
3. 3. El vector según la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína del paramixoviridae es una proteína del PIV seleccionada del grupo que consiste de proteínas PIV-1, PIV-2, PIV-3 y PIV- .
4. 4. El vector según la reivindicación 3, P1009 caracterizado porque la proteína del PIV se selecciona del grupo que consiste de las glucoproteínas HN y F del PIV-3.
5. 5. El vector según la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína del paramixoviridae es una proteína del RSV.
6. 6. El vector según la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína del RSV se selecciona del grupo que consiste de las glucoproteínas F y G del RSV.
7. 7. El vector según la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda secuencia de ADN codifica una proteína F del RSV de longitud completa o una proteína F del RSV que carece del ancla transmembrana y de la cola citoplásmica .
8. 8. El vector según la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda secuencia de ADN codifica una proteína F del RSV y carece de un sitio de restricción Spe I y, opcionalmente, carece de una región que codifica el ancla transmembrana y la cola citoplásmica.
9. 9. El vector según la reivindicación 10, caracterizado porque el nucleótido 194 (T) del gen F del RSV se mutó en uno C para eliminar al sitio Spe I en el gen F del RSV.
10. 10. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el alfavirus es un virus Semliki Forest. P1009
11. 11. El vector según la reivindicación 10 caracterizado porque la primera secuencia de ADN es la secuencia del virus Semliki Forest contenida en el piásmido pSFVl .
12. 12. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el promotor es el promotor SP6.
13. 13. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 , que es un vector piásmido que tiene un sitio de restricción único que permite la linealización del vector sin la escisión de la segunda secuencia de ADN.
14. 14. El vector según la reivindicación 13, caracterizado porque el sitio de restricción único es un sitio Spel, opcionalmente derivado del piásmido pSFVl .
15. 15. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 , que es el piásmido p P37 (ATCC 97905) .
16. 16. Una secuencia de ADN mutante que codifica una proteína F del RSV o un fragmento de la misma, que tiene la capacidad de inducir anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína F del RSV, caracterizada por la ausencia de un sitio de restricción Spel presente en la secuencia no mutante.
17. 17. La secuencia de ADN mutante según la P1009 reivindicación 16, que carece de una región que codifica el ancla transmembrana y la cola citoplásmica.
18. 18. La secuencia de ADN mutante según la reivindicación 16 ó 17, caracterizada porque el nucleótido 194 (T) - de un gen F de RSV no mutante muta a un C para eliminar al sitio Spel en el gen F del RSV no mutante.
19. 19. Una secuencia de la molécula de ADN mutante, caracterizada porque carece de un sitio Spel presente en la secuencia no mutante y que codifica una proteína F del RSV truncada y que tiene la secuencia ADN que se muestra en la Figura 2 (SEQ ID No:l) o que tiene una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 2 (SEQ ID No: 2) .
20. 20. Una transcripción de ARN lineal de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
21. 21. La transcripción de ARN según la reivindicación 20, que se deriva mediante linealización de un vector de piásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en un sitio de restricción único proporcionado en el vector, opcionalmente, un sitio Spel y que permite la linealización del vector sin la escisión de la segunda secuencia de ADN y que transcribe al vector linealizado.
22. 22. Una composición inmunogénica para la administración in vivo a un hospedero para generar P1009 anticuerpos en el hospedero, de preferencia, anticuerpos protectores, ante la proteína del paramixoviridae, caracterizada por una transcripción de ARN, como el componente activo de la misma, según la reivindicación 20 ó 21.
23. 23. Un método para producir una vacuna para proteger a un hospedero en contra de la enfermedad provocada por la infección con el virus sincicial respiratorio (RSV) , caracterizado por: aislar una primera secuencia de ADN que codifica una proteína F del RSV de la cual están ausentes el ancla transmembrana y la cola citoplásmica y carecen de algún sitio de restricción Spel, enlazar operativamente la primera secuencia de ADN a una segunda secuencia de ADN que es complementaria de al menos parte de un genoma de ARN de alfavirus y que tiene las regiones de replicación completas del genoma del alfavirus en una región de la segunda secuencia de ADN que no es esencial para la replicación para formar un vector de piásmido, en donde las secuencias de ADN primera y segunda están bajo el control transcripcional de un promotor, linealizar al vector de piásmido al tiempo que se mantienen las secuencias de ADN primera y segunda bajo el control transcripcional del promotor, formar una transcripción de ARN del vector P1009 linealizado, y formular la transcripción de ARN como una vacuna para la administración in vivo .
24. 24. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque la linealización del vector de piásmido se efectúa mediante la escición del vector de piásmido en un sitio de restricción único en el mismo, de preferencia, un sitio Spel, en una ubicación que permite el mantenimiento del gen y de la secuencia de ADN bajo el control transcripcional del promotor.
25. 25. El método según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizado porque el vector es el piásmido p P37 (ATCC 97905) y se linealiza mediante la escisión en el sitio Spel . P1009