MX2014010669A - Composiciones de alta concentracion de alfa-glucosidasa para el tratamiento de la enfermedad de pompe. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud proporciona composiciones que comprenden concentraciones altas de a-glucosidasa ácida en combinación con una chaperona activa específica para el sitio para la a-glucosidasa ácida y métodos para tratar la enfermedad de Pompe en un individuo que lo necesita, que incluye un método para administrar al individuo dichas composiciones. La presente solicitud proporciona además métodos para aumentar la estabilidad in vitro e in vivo de una formulación enzimática de a-glucosidasa ácida.

Description

COMPOSICIONES DE ALTA CONCENTRACIÓN DE ALFA-GLUCOSIDASA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE POMPE REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con el No. de serie 61/607, 920, presentada el 7 de marzo de 2012, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con el No. de serie 61/750,718, presentada el 9 de enero de 2013, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a métodos para tratar, prevenir y/o mitigar la enfermedad de Pompe. La presente invención también se refiere a composiciones y medicamentos que pueden etiquetarse para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Pompe (deficiencia de maltasa ácida) es provocada por una deficiencia en la enzima a-glucosidasa ácida (GAA) . La GAA metaboliza el glicógeno, una forma de almacenamiento de azúcar utilizada para energía, en glucosa. La acumulación de glicógeno conduce a una miopatía muscular progresiva a lo largo del cuerpo que afecta varios tejidos corporales, particularmente el corazón, los músculos esqueléticos, el hígado y el sistema nervioso. De conformidad con el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, se estima que la enfermedad de Pompe ocurre en aproximadamente 1 de 40,000 nacimientos .

Existen tres tipos reconocidos de enfermedad de Pompe: de inicio infantil, juvenil y adulta (véase por ejemplo, Hirschhorn y Reuser, en: Scriver CR, Beaudet AL, Sly W, Valle D, editores; The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Vol. III, Nueva York: McGraw-Hill ; 2001. páginas 3389 a 420, 2001: 3389-3420) . La enfermedad de Pompe de inicio infantil es la más seria y se presenta con síntomas que incluyen falta seria de tono muscular, debilidad, hígado y corazón hipertrofiados y cardiomiopatía . Tragar puede resultar difícil y la lengua puede sobresalir y agrandarse. La mayoría de los niños mueren por complicaciones respiratorias o cardiacas antes de los dos años de edad, aunque un subgrupo de pacientes infantiles viven por más tiempo (pacientes infantiles no clásicos). La enfermedad de Pompe de inicio infantil primero se presenta del comienzo al final de la niñez e incluye debilidad progresiva de los músculos respiratorios en el tronco, diafragma y extremidades inferiores, asi como intolerancia al ejercicio. La mayoría de los pacientes que padecen enfermedad de Pompe de inicio juvenil no viven más de la segunda o tercera década de vida. Los síntomas de inicio adulto implican debilidad muscular generalizada y debilitación de los músculos respiratorios en el tronco, extremidades inferiores y diafragma. Algunos pacientes adultos no presentan síntomas mayores o limitaciones motoras.

A menos que se identifique durante el análisis prenatal, el diagnóstico de la enfermedad de Pompe es un desafío. El diagnóstico de la enfermedad de Pompe de inicio adulto es aún más difícil dado que la cantidad, seriedad y tipo de síntomas que un paciente experimenta puede variar ampliamente y pueden sugerir enfermedades más comunes como la distrofia muscular. El diagnóstico se confirma mediante la medición de la actividad de a-glucosidasa y/o la detección de los niveles patológicos de glicógeno de muestras biológicas. Actualmente la única terapia aprobada es la terapia de reemplazo de enzimas con a-glucosidasa recombinante .

La enfermedad de Pompe es una de las varias patologías de glicógeno. Otras incluyen deficiencia de Debrancher (enfermedad de Cori-Forbes ; Glicogenosis tipo III) ; deficiencia de ramificación (Glicogenosis tipo IV; enfermedad de Andersen) ; Miofosforilasa (enfermedad de McArdle; enfermedad de almacenamiento de glicógeno V) ; deficiencia de fosfofructocinasa isoforma M (enfermedad de Tauri; Glicogenosis tipo VII); deficiencia de Fosforilasa b quinasa (Glicogenosis tipo VIII) ; deficiencia de la fosfoglicerato quinasa isoforma A (Glicogenosis IX) ; deficiencia de fosfoglicerato mutasa M (Glicogenosis tipo X) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento de la enfermedad de Pompe (por ejemplo, enfermedad de Pompe de inicio infantil) , mediante la administración a un individuo que necesita dicho tratamiento de una enzima a-glucosidasa ácida (GAA) (por ejemplo, una GAA recombinante humana (rhGAA) ) en combinación con una chaperona activa especifica para el sitio (ASSC) para la enzima GAA (por ejemplo, 1-desoxino irimicina (DNJ, 1-DNJ) ) .

La presente invención proporciona además un método para aumentar la estabilidad de una enzima GAA en una conformación adecuada, in vivo e ín vitro. En una realización, una enzima a-glucosidasa ácida (GAA) (por ejemplo, una GAA recombinante humana (rhGAA) ) en combinación con una ASSC para la enzima GAA (por ejemplo, 1-desoxinoj irimicina o 1-desoxinoj irimicina-HCl) se administra a un individuo que necesita dicho tratamiento. La enzima GAA se estabiliza conformacionalmente cuando se combina con una ASSC y es muy adecuada para soportar, por ejemplo, los desafios térmicos y de pH .

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC a una concentración alta, por ejemplo, a una concentración entre aproximadamente 5 y aproximadamente 250 mg/mL .

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC a una concentración alta, por ejemplo, a una concentración que se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 115 mg/mL, aproximadamente 160 mg/mL, aproximadamente 200 mg/mL y aproximadamente 240 mg/mL.

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC donde la ASSC se encuentra presente a una concentración entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL.

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC donde la ASSC se encuentra presente a una concentración que se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 32 mg/mL y aproximadamente 160 mg/mL.

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC donde la ASSC se encuentra presente a una concentración entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 20 mM.

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC como una coformulación .

En ciertas realizaciones, la enzima GAA se combina con una ASSC en una coformulación, donde la coformulación comprende además un excipiente. En ciertas realizaciones, el excipiente se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG-400, arginina, arginina y ácido glutámico, prolina, gamma-ciclodextrina y sus combinaciones.

En ciertas realizaciones, las formulaciones de la invención mantienen una estabilidad física y química durante períodos prolongados a pesar de la alta concentración de proteínas y tienen una viscosidad adecuada para la administración subcutánea. Las formulaciones de la invención se fundan, al menos en parte, en el descubrimiento sorprendente de que la enzima GAA combinada con una ASSC puede permanecer soluble a una concentración alta (por ejemplo, 25 mg/mL) y permanecer sin agregarse mientras mantiene una viscosidad adecuada para la inyección (por ejemplo, administración subcutánea) .

En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención comprenden más de aproximadamente 5 mg/mL de enzima GAA.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención comprenden aproximadamente 25 mg/mL de enzima GAA y aproximadamente 10 mM de DNJ.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención comprenden aproximadamente 25 mg/mL de enzima GAA y aproximadamente 1 mM de DNJ.

Una ventaja de la formulación de la invención es que proporciona una concentración alta de proteínas sin aumento de agregación de proteínas, lo que ocurre comúnmente con una concentración de proteínas superior. En una realización, la formulación de la invención tiene menos de aproximadamente un 1% de proteínas agregadas.

De conformidad con un aspecto de la invención, se proporcionan métodos para mejorar la administración de GAA a los tejidos, por ejemplo, tejido muscular, de un individuo que padece enfermedad de Pompe. Los métodos incluyen administrar GAA en combinación con una ASSC subcutáneamente al individuo. En algunas realizaciones, la GAA en combinación con una ASSC se administra en una dosis suficiente para resultar en una concentración pico de GAA en tejidos del individuo dentro de aproximadamente las 24 horas posteriores a la administración de la dosis. En ciertas realizaciones, la GAA en combinación con una ASSC se administra en una dosis suficiente para resultar en una concentración pico de GAA en tejidos del individuo dentro de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 50 horas, o aproximadamente 45, 40, 35, 30, 25 o menos horas después de la administración de la dosis. En algunas realizaciones, la dosis no resulta en un nivel tóxico de GAA en el hígado del individuo .

En varias realizaciones no limitantes, la ASSC para la enzima GAA es un inhibidor de molécula pequeña de la enzima GAA, que incluye inhibidores competitivos reversibles de la enzima GAA.

En una realización, la ASSC se representa por la fórmula : donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo , alcoxialquilo o aminoalquilo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 12 átomos de carbono opcionalmente sustituidos con -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -0-C (=0) N- (alquil) 2; y 2 es H o un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 9 átomos de carbono; incluidas sus sales, esteres y profármacos farmacéuticamente aceptables. En una realización, la ASSC es como se define anteriormente, donde Ri es H. En otra realización, la ASSC es como se define anteriormente, donde R2 es H.

En una realización particular no limitante, la ASSC es 1-desoxinoj irimicina (1-DNJ), que se representa por la siguiente fórmula: o las sales, ésteres o profármacos de 1-desoxinoj irimicina farmacéuticamente aceptables. En una realización, la sal es sal de clorhidrato (es decir, 1-desoxinoj irimicina-HCl) .

En una realización particular no limitante, la ASSC es N-butil-desoxinoj irimicina (NB-DNJ; Zavesca®, Actelion Pharmaceuticals Ltd, Suiza) , que se representa por la siguiente fórmula: o una sal, éster o profármaco de NB-DNJ farmacéuticamente aceptable.

En una realización particular no limitante, la ASSC es C10H19NO4, que se representa por la siguiente fórmula: o una sal, éster o profármaco de ?10??9??4 farmacéuticamente aceptable. En una realización, la sal es sal de clorhidrato.

En una realización particular no limitante, la ASSC es C12H23NO4 , que se representa por la siguiente fórmula: o una sal, éster o profármaco de C12H23NO4 farmacéuticamente aceptable. En una realización, la sal es sal de clorhidrato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la estabilidad de la GAA recombinante humana (Myozyme®, Genzyme Corp.) a pH ER (7.4) o pH lisosomal (5.2) en la presencia o ausencia de 100 µ? de clorhidrato de 1-desoxinoj irimicina (1-DNJ-HC1) como se determina en un ensayo de estabilidad térmica. El ensayo de estabilidad térmica utiliza calor para inducir la desnaturalización de las proteínas, que se controla mediante el uso de tinte anaranjado SYPRO que se vuelve fluorescente tras la unión a aminoácidos hidrófobos (que no se exponen en una proteína plegada) . Una estructura proteica que requiere más calor para desnaturalizarse es por definición más estable. Como se muestra anteriormente, Myozyme® es generalmente mucho más estable a pH lisosomal (5.2) que a pH ER (7.4). No obstante, la estabilidad enzimática a pH 7.4 aumenta de forma significativa tras la adición de 100 µ? de 1-desoxinoj irimicina, en comparación con Myozyme® sola.

La figura 2A representa los efectos del 1-DNJ-HC1 sobre la actividad enzimática de la GAA recombinante humana (Myozyme®, Genzyme Corp.) a pH de plasma (7.4) o pH lisosomal (5.2) a 37°C. La actividad de GAA se evaluó para determinar la capacidad de una ASSC de GAA de prolongar la actividad de la rhGAA con el tiempo. Se incubó Myozyme® (45 nM) en solución amortiguadora a pH 7.4 o pH 5.2 con o sin 50 µ? de 1-DNJ a 37°C durante 24 horas. Las muestras se analizaron para determinar la actividad enzimática de G7AA mediante el uso de 4-MU-a-glucosa a las 0, 3, 6 y 24 horas y la actividad de GAA. residual se expresó como un % de la actividad inicial. Estos resultados indican que la 1-DNJ mitiga la pérdida de la actividad enzimática de GAA a pH de plasma (7.4).

La figura 2B representa un experimento de estabilidad térmica de anaranjado SYPRO paralelo para determinar si la pérdida de la actividad enzimática mostrada en la figura 2A, particularmente la pérdida de la actividad de Myozyme® a pH ER (7.4) tiene correlación con el despliegue y desnaturalización de la proteina. Se incubó Myozyme® (0.9 ?M) en solución amortiguadora a pH 7.4 o pH 5.2 con o sin 100 ?M de 1-DNJ-HC1 a 37DC y el plegado de la proteina se controló cada 24 horas. Las figuras 2A y 2B muestran que la desnaturalización de GAA tiene correlación con la pérdida de la actividad enzimática (comparar la curva con las curvas de diamantes en las dos figuras) . Más importante, estos resultados indican que la 1-DNJ puede prevenir la desnaturalización de GAA y la pérdida de actividad enzimática a pH de plasma.

La figura 3 representa los resultados de las pruebas de actividad de GAA en ratones KO con GAA que recibieron ERT con o sin administración oral concomitante de 1-DNJ-HC1. Se administró Myozyme® mediante infusión IV a una dosis de 10 mg/kg, una vez por semana durante hasta 3 semanas sola o en combinación con 10, 100 o 1000 mg/kg de 1-DNJ-HCl 30 minutos antes y 8, 16 y 24 horas después de la administración de Myozyme®. Estos resultados demuestran que la captación tisular de Myozyme® (como una medida de la actividad de GAA) disminuyó a los 7 días después de la inyección. La coadministración de 1-DNJ-HCl con Myozyme® facilitó un aumento dependiente de la dosis en la captación de Myozyme® durante hasta 7 días después de la inyección. El efecto de 1-DNJ-HCl fue más pronunciado y significativo (p<0.05 prueba t contra Myozyme® sola) a los 4 y 7 días después de la inyección de 1, 2 o 3 infusiones semanales de Myozyme®.

La figura 4 demuestra que 1-DNJ-HCl inhibe la GAA con una IC50 de aproximadamente 1 µ?.

La figura 5 representa los resultados de un ensayo de estabilidad térmica que utiliza calor para inducir la desnaturalización de las proteínas, que se controla mediante el uso de tinte anaranjado SYPRO que se vuelve fluorescente tras la unión a aminoácidos hidrófobos (que no se exponen en una proteína plegada) . El 1-DNJ-HCl aumenta la termoestabilidad de GAA como resulta evidente por los aumentos en la temperatura de fusión de GAA en una forma dependiente de la dosis.

La ficrura 6 representa los resultados de la actividad de GAA en ratas durante 24 horas después de la administración IV de 10 mg/kg de rhGAA o solución salina con o sin 3 mg/kg o 30 mg/kg de 1-DNJ-HC1 administrado oralmente. La rhGAA o solución salina se administró 30 minutos después de la administración del 1-DNJ-HC1. En este ejemplo, el 1-DNJ-HC1 inhibió la pérdida de actividad enzimática después de la administración, lo que aumentó la vida media in vivo de rhGAA. La vida media in vivo de rhGAA aumentó de 1.4 ± 0.2 horas (0 mg/kg de 1-DNJ-HC1) a 2.1 + 0.2 horas (3 mg/kg de 1- DNJ-HC1) y 3.0 ± 0.4 horas (30 mg/kg de 1-DNJ-HC1) .

La figura 7 representa la actividad de GAA en el tejido del corazón y del diafragma para la monoterapia con ERT y la coterapia con ERT/ASSC (rhGAA + 1-DNJ-HC1) cuando se administró a un ratón KO con GAA. La captación de rhGAA en el corazón y en el diafragma aumenta cuando se coadministra con 1-DNJ-HC1.

La figura 8 muestra que el 1-DNJ-HC1 evita la inactivación enzimática de rhGAA en la sangre. Se * incubó Myozyme® (0.5 µ?) a 37°C en sangre entera anticoagulada con citrato en la presencia o ausencia de 50 µ? de 1-DNJ-HC1. Se recolectaron alícuotas a las 0, 2, 4, 8 y 24 horas y se centrifugaron para obtener el plasma. Estas muestras de plasma después se diluyeron en solución amortiguadora de acetato de potasio (pH 4.0) y se analizaron para determinar la actividad de GAA mediante el uso de sustrato fluorogénico de 4-metilumbeliferil- -glucosa (4-MUG). La actividad medida de GAA para las muestras individuales en cada momento de tiempo se normalizó a la hora 0 y se expresó como % de la actividad inicial. Se analizaron los datos de 4 experimentos independientes para obtener el promedio (y desviación estándar) y se gráfico en función del tiempo para evaluar la pérdida de actividad enzimática a lo largo de este intervalo de tiempo.

La figura 9 muestra que concentraciones bajas de 1-DNJ-HC1 evitan la inactivación enzimática de rhGAA en la sangre. Se incubó Myozyme® (0.5 µ?) a 37°C en sangre entera anticoagulada con citrato con concentraciones variables de 1-DNJ-HC1 (0-100 µ?) . Se recolectaron alícuotas a las 0, 3 y 6 horas y se centrifugaron para obtener el plasma. Estas muestras de plasma después se diluyeron en solución amortiguadora de acetato de potasio (pH 4.0) y se analizaron para determinar la actividad de GAA mediante el uso de sustrato fluorogénico de 4-metilumbeliferil-a-glucosa (4-MUG) . La actividad medida de GAA para las muestras individuales en cada momento de tiempo se normalizó a la hora 0 y se expresó como % de la actividad inicial. La actividad enzimática de GAA residual se gráfico en función del tiempo para evaluar la pérdida de actividad enzimática con respecto a la concentración de 1-DNJ-HC1 a lo largo de este intervalo de tiempo.

La figura 10 muestra el diseño experimental para el ejemplo 9.

La figura 11 muestra que Myozyme® coadministrada con 1-DNJ-HC1 resultó en una reducción de glicógeno tisular significativamente mayor en ratones KO con GAA en comparación con Myozyme® sola. La reducción de glicógeno con Myozyme® sola fue de 93±1%, 41±4%, 69±3% y 18±4%, en el corazón, diafragma, soleo y cuádriceps, respectivamente, con relación a los ratones sin tratar. La reducción de glicógeno con Myozyme® coadministrada con 1-DNJ-HC1 fue de 96±0.6%, 66+5%, 82+3% y 23+3%, respectivamente.

La figura 12 muestra que la combinación de 1 mM de DNJ con 25 mg/mL de Myozyme® reduce la agregación de Myozyme® a pH neutro de 7.4 y a 37°C. La agregación se evaluó después de un periodo de incubación de 4 semanas.

La figura 13 muestra que la administración de 30 mg/kg de DNJ coformulada con una cantidad equivalente a 10 mg/kg de Myozyme® mediante inyección en la vena de la cola aumentó la vida media del plasma en circulación y la captación tisular de Myozyme® en los cuádriceps.

La figura 14 muestra que la administración subcutánea de DNJ coformulada con 20 mg/kg de Myozyme® aumentó los niveles de rhGAA en circulación en comparación con la administración de 20 mg/kg de Myozyme® sin DNJ.

La figura 15 muestra la actividad de rhGAA en la piel en el sitio de inyección 3 días después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 16A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en la piel ventral 3 dias (A) y 14 dias (B) dias después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 17A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en el corazón 3 dias (A) y 14 dias (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 18A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en la lengua 3 dias (A) y 14 dias (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 19A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en el diafragma 3 dias (A) y 14 dias (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 20A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en los bíceps 3 días (A) y 14 días (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 21A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en los tríceps 3 días (A) y 14 días (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 22A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en los músculos gastrocnemios 3 días (A) y 14 días (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 23A-B muestra la actividad de rhGAA (A) y el nivel de glicógeno (B) en los cuádriceps 3 días (A) y 14 días (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 24 muestra la actividad de rhGAA en el soleo 3 días después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 25 muestra la actividad de rhGAA en el hígado 3 días después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 26 muestra una comparación de la actividad de rhGAA en los varios tejidos probados 3 días después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 27 muestra la actividad de rhGAA en plasma 2 horas (a) y 4 horas (B) después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 28 muestra la actividad de rhGAA en plasma y el nivel de proteínas de GAA en plasma (como se midió con el ensayo de inmunotransferencia Western blot) 2 horas después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

La figura 29 muestra la actividad de rhGAA en plasma y el nivel de proteínas de GAA en plasma (como se midió con el ensayo de inmunotransferencia Western blot) 4 horas después de la última administración subcutánea de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ a un ratón, como se describe en el ejemplo 13.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de que la combinación de una enzima o¡-glucosidasa ácida (GAA) (por ejemplo, una GAA recombinante humana (rhGAA)), con una ASSC para la enzima GAA (por ejemplo, 1-desoxinoj irimicina) , resulta en un aumento sorprendente en la actividad de GAA in vivo en comparación con cualquiera de estos tratamientos solos. La presente invención también se basa al menos en parte en el descubrimiento de que una enzima GAA (por ejemplo, rhGAA) se estabiliza en una conformación adecuada, tanto in vitro como in vivo, tras la adición de una ASSC para la enzima GAA. La presente invención también se basa al menos en parte en el descubrimiento de que la combinación de una ASSC con una concentración alta de GAA reduce la agregación de GAA que ocurre comúnmente con una concentración superior de GAA.

A los efectos de claridad y a modo no limitante, la presente descripción detallada se divide en las siguientes secciones: (i) Definiciones; (?) Enfermedad de Pompe; (iü) Obtención de GAA y ASSC; (iv) Tratamiento de la enfermedad de Pompe con ERT y ASSC; (v) Composiciones farmacéuticas; ( i) Estabilidad in vitro; y ( ii) Estabilidad in vivo.

DEFINICIONES Los términos utilizados en la presente memoria descriptiva generalmente tienen sus significados comunes en la técnica, dentro del contexto de la presente invención y en el contexto especifico en que se utiliza cada término. Ciertos términos se discuten a continuación o en cualquier otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar una guia adicional para el practicante en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y cómo prepararlos y utilizarlos .

De conformidad con la invención, el "individuo" o "paciente" es un humano o un animal no humano. A pesar de que el sujeto animal es preferentemente un humano, los compuestos y composiciones de la invención también tienen aplicación en la medicina veterinaria, por ejemplo, para el tratamiento de especies domesticadas como caninos, felinos y otras varias mascotas; especies de animales de granja como bovinos, equinos, ovinos, caprinos, porcinos, etc.; animales salvajes, por ejemplo, en estado salvaje o en un jardín de zoológico; y especies aviarias, como pollos, pavos, codornices, pájaros cantores, etc.

El término "terapia de reemplazo de enzimas" o "ERT" se refiere a la introducción de una enzima purificada no nativa en un individuo que tiene una deficiencia de dicha enzima. La enzima administrada puede obtenerse a partir de fuentes naturales o mediante expresión recombinante . El término también se refiere a la introducción de una enzima purificada en un individuo que de otro modo requeriría o se beneficiaría de la administración de una enzima purificada, por ejemplo, que presenta una insuficiencia de proteínas. La enzima introducida puede ser una enzima recombinante purificada producida in vi tro o una enzima purificada a partir de un tejido o fluido aislado, como por ejemplo, placenta o leche animal o a partir de plantas.

El término "estabilizarse en una conformación adecuada" se refiere a la capacidad de un compuesto o péptido u otra molécula de asociarse con una proteína de tipo salvaje o a una proteína mutante que puede llevar a cabo su función de tipo salvaje in vitro e in vivo, de forma tal que la estructura de la proteína de tipo salvaje o mutante puede mantenerse como su forma nativa o adecuada. Este efecto puede manifestarse por si mismo prácticamente a través de uno o más de (i) vida útil superior de la proteína; (ii) actividad superior por unidad/cantidad de proteína; o (iii) eficacia superior in vivo. Puede observarse experimentalmente a través del rendimiento superior de ER durante la expresión; resistencia superior al despliegue debido a aumentos de temperatura (por ejemplo, como se determina en los ensayos de estabilidad térmica) o la presencia de agentes caotrópicos y mediante medios similares.

Como se utiliza en la presente, el término "sitio activo" se refiere a la región de una proteína que tiene alguna actividad biológica específica. Por ejemplo, puede ser un sitio que se una a un sustrato u otro componente de unión y aporte los residuos de aminoácidos que participan directamente en la preparación y rompimiento de los enlaces químicos. Los sitios activos de la presente invención pueden abarcar sitios catalíticos de enzimas, sitios de unión a antígenos de anticuerpos, dominios de unión a ligandos de receptores, dominios de unión de reguladores o dominios de unión a receptores de proteínas secretadas. Los sitios activos también pueden abarcar la transactivación, interacción proteína-proteína o dominios de unión a ADN de los factores y reguladores de transcripción.

Como se utiliza en la presente, el término "chaperona activa especifica para el sitio" se refiere a cualquier molécula que incluya una proteina, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, etc. que interactúe específicamente de forma reversible con un sitio activo de una proteína y mejore la formación de una conformación molecular estable. Como se utiliza en la presente, el término "chaperona activa específica para el sitio" no incluye chaperonas generales endógenas presentes en el reemplazo de enzimas (ER) de células como Bip, calnexina o calreticulina o chaperonas químicas no específicas generales como agua deuterada, DMSO o TMAO.

El término "purificado" como se utiliza en la presente se refiere a material que ha sido aislado en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, contaminantes, incluidos los materiales nativos a partir de los cuales se obtiene el material. Por ejemplo, una proteína purificada preferentemente se encuentra sustancialmente libre de otras proteínas o ácidos nucleicos con los que se encuentra asociada en una célula; una molécula de ácido nucleico purificada preferentemente se encuentra sustancialmente libre de proteínas u otras moléculas de ácido nucleico no relacionadas con las que puede encontrarse dentro de una célula. Como se utiliza en la presente, el término "sustancialmente libre" se utiliza opcionalmente, en el contexto de prueba analítica del material. Preferentemente, el material purificado sustancialmente libre de contaminantes es al menos un 95% puro; más preferentemente, al menos un 97% puro, y más preferentemente al menos un 99% puro. La pureza puede evaluarse mediante cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico y otros métodos conocidos en la técnica. En una realización específica, purificado significa que el nivel de contaminantes se encuentra por debajo del nivel aceptable para las autoridades reguladoras para la administración segura a un animal humano o no humano.

Como se utiliza en la presente, "mutante" y "mutación" significa cualquier cambio detectable en un material genético, por ejemplo, ADN o cualquier proceso, mecanismo o resultado de dicho cambio. Esto incluye mutaciones de genes, en las que la estructura (por ejemplo, secuencia de ADN) de un gen se altera, cualquier gen o ADN que derive de cualquier proceso de mutación y cualquier producto de expresión (por ejemplo, ARN, proteína o enzima) expresado por un gen o secuencia de ADN modificada.

Como se utiliza en la presente, el término "proteína mutante" se refiere a proteínas traducidas de genes que contenían mutaciones genéticas que resultan en secuencias de proteínas alteradas. En una realización específica, dichas mutaciones resultan en la incapacidad de la proteína de alcanzar su conformación nativa en las condiciones normalmente presentes en ER. La imposibilidad de lograr esta conformación resulta en la degradación de estas proteínas, en lugar de su transporte a lo largo de su vía normal en el sistema de transporte proteico a su ubicación adecuada dentro de la célula. Otras mutaciones pueden resultar en una disminución en la actividad o un recambio más rápido.

Como se utiliza en la presente "gen de tipo salvaje" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína capaz de tener una actividad funcional biológica normal in vivo. La secuencia de ácidos nucleicos de tipo salvaje puede contener cambios de nucleótidos que difieren de la secuencia publicada conocida, siempre que los cambios resulten en sustituciones de aminoácidos que no tienen o tienen un efecto reducido sobre la actividad biológica. El término tipo salvaje también puede incluir secuencias de ácidos nucleicos diseñadas para codificar una proteína capaz de tener una actividad superior o mejorada con respecto a la proteína endógena o nativa.

Como se utiliza en la presente, el término "proteína de tipo salvaje" se refiere a cualquier proteína codificada por un gen de tipo salvaje que es capaz de tener actividad biológica funcional cuando se expresa o introduce in vivo. El término "actividad normal de tipo salvaje" se refiere a la función fisiológica normal de una proteina en una célula. Dicha funcionalidad puede probarse mediante cualquier medio conocido por conferir funcionalidad de una proteina.

El término "modificado genéticamente" se refiere a células que expresan un producto génico particular después de la introducción de un ácido nucleico que comprende una secuencia de codificación que codifica el producto génico, junto con elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de codificación. La introducción de ácido nucleico puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica incluida la inserción dirigida a un gen y la recombinación homologa. Como se utiliza en la presente, el término incluye además células que han sido diseñadas para expresar o sobreexpresar un gen endógeno o un producto génico que no se expresa normalmente por dicha célula, por ejemplo, mediante tecnología de activación de genes.

La frase "farmacéuticamente aceptable", utilizada con relación a las composiciones farmacéuticas de la invención, se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y que no producen típicamente reacciones inadecuadas cuando se administran a un humano.

Preferentemente, como se utiliza en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que se encuentra en la lista de Farmacopea de Estados Unidos u otras farmacopeas reconocidas de forma general para su uso en animales y más particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites. El agua o las soluciones acuosas, soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas se emplean preferentemente como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin, 18va edición.

Los términos "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a la cantidad de compuesto que es suficiente para resultar en una respuesta terapéutica. En realizaciones donde se administran una ASSC y una GAA en un complejo, los términos "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" pueden referirse a la cantidad del complejo que es suficiente para resultar en una respuesta terapéutica. Una respuesta terapéutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, médico) reconocerá como una respuesta eficaz a la terapia. Por consiguiente, la respuesta terapéutica generará una mejora de uno o más síntomas o signos de una enfermedad o trastorno.

Cabe señalar que una concentración de ASSC que es inhibitoria durante la producción, transporte o almacenamiento in vitro, de la proteína terapéutica purificada aún puede constituir una "cantidad eficaz" a los efectos de la presente invención dada la dilución (y consecuente desvío en la unión debido al cambio en el equilibrio) , biodisponibilidad y metabolismo de la ASSC tras la administración in vivo.

El término "alquilo" se refiere a un grupo de hidrocarburos de cadena lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contienen insaturación, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace simple, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo (isopropilo) , n-butilo, n-pentilo y 1, 1-dimetiletil (tere-butilo).

El término "alquenilo" se refiere a un grupo de hidrocarburos alifático C2-C20 que contiene al menos un enlace doble carbono-carbono y que puede ser una cadena recta o ramificada, por ejemplo, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo (alilo) , iso-propenilo, 2-metil-l-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo .

El término "cicloalquilo" indica un sistema anular de hidrocarburos insaturado, no aromático, mono o multiciclico como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo multiciclicos incluyen grupos perhidronaftilo, adamantilo y norbornilo, grupos cíclicos puenteados o grupos esprirobiciclicos, por ejemplo, espiro (4,4) ???-2-ilo.

El término "arilo" se refiere a radicales aromáticos que tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos de carbono como fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo .

El término "heterociclico" se refiere a un radical anular estable de 3 a 15 miembros que consiste en átomos de carbono de uno a cinco heteroátomos que se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxigeno y azufre. A los efectos de la presente invención, el radical anular heterociclico puede ser un sistema anular monocíclico o biciclico, que puede incluir sistemas anulares fusionados o puenteados y los átomos de nitrógeno, carbono, oxigeno o azufre en el radical anular heterociclico puede encontrarse opcionalmente oxidado a varios estados de oxidación. Además, un átomo de nitrógeno, donde estuviera presente, puede opcionalmente cuaternizarse; y el radical anular puede encontrarse parcialmente o completamente saturado (es decir, heteroaromático o heteroarilo aromático) .

El radical anular heterociclico puede encontrarse unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que resulte en la creación de una estructura estable.

El término "heteroarilo" se refiere a un anillo heterociclico donde el anillo es aromático.

Los sustituyentes en el 'alquilo sustituido1, 'alquenilo sustituido', ' cicloalquilo sustituido', 'arilo sustituido' y 'heteroarilo sustituido' pueden ser iguales o diferentes, donde uno o más se selecciona de los grupos hidrógeno, halógeno, acetilo, nitro, carboxilo, oxo (=0) , CF3, -0CF3, N¾, -C (=0) -alquilo2, 0CH3, o grupos opcionalmente sustituidos que se seleccionan de alquilo, alcoxi y arilo.

El término "halógeno" se refiere a radicales de flúor, cloro, bromo y yodo.

ENFERMEDAD DE POMPE La enfermedad de Pompe es un trastorno de almacenamiento lisosomal (LSD) autosomal recesivo caracterizado por la deficiencia de la actividad de alfa glucosidasa ácida (GAA) que afecta el metabolismo del glicógeno lisosomal. La deficiencia enzimática conduce a la acumulación de glicógeno lisosomal y resulta en la debilidad progresiva del músculo esquelético, función cardiaca reducida, insuficiencia respiratoria y/o deterioro del CNS en las últimas etapas de la enfermedad. Las mutaciones genéticas en el gen de GAA resultan en una expresión reducida o producen formas mutantes de la enzima con estabilidad alterada y/o actividad biológica que conduce en última instancia a la enfermedad, (véase en forma general Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid -Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, Nueva York, 7a edición, páginas 2443 a 2464) . Las tres formas clínicas reconocidas de la enfermedad de Pompe (infantil, juvenil y adulta) tienen correlación con el nivel de actividad de a-glucosidasa residual (Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency) , Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69) . Las ASSC (también denominadas "chaperonas farmacológicas") representan un nuevo y prometedor enfoque terapéutico para el tratamiento de enfermedades genéticas, como los trastornos de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, enfermedad de Pompe) .

La enfermedad de Pompe infantil (tipo I o A) es la más común y la más seria, caracterizada por la falta de crecimiento, hipotonía generalizada, hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiorespiratoria en el segundo año de vida. La enfermedad de Pompe juvenil (tipo II o B) es intermedia en cuanto a la seriedad y se caracteriza por la predominancia de síntomas musculares sin cardiomegalia . Los individuos que padecen enfermedad de Pompe juvenil generalmente mueren antes de alcanzar los 20 años de edad debido a la insuficiencia respiratoria. La enfermedad de Pompe adulta (tipo III o C) a menudo se presenta como una miopatía lentamente progresiva en la adolescencia o aún en la sexta década (Felice K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135) .

En Pompe, se ha demostrado que la a-glucosidasa se modifica de forma considerable después de la traducción mediante glicosilación, fosforilación y procesamiento proteolítico. La conversión del precursor de 110 kilodaltons (kDa) a las formas maduras de 76 y 70 kDa mediante proteólisis en el lisosoma es necesaria para una catálisis de glicógeno óptima.

Como se utiliza en la presente, el término "enfermedad de Pompe" se refiere a todos los tipos de enfermedad de Pompe. Las formulaciones y regímenes de dosificación divulgados en la presente solicitud pueden utilizarse para tratar, por ejemplo, la enfermedad de Pompe tipo I, tipo II o tipo III.

OBTENCIÓN DE GAA Y ASSC La GAA puede obtenerse a partir de una célula que expresa endógenamente la GAA, o la GAA puede ser una GAA recombinante humana (rhGAA) , como se describe en la presente. En una realización no limitante, la rhGAA es una GAA de tipo salvaje de longitud completa. En otras realizaciones no limitantes, la rhGAA comprende un subgrupo de los residuos de aminoácidos presentes en una GAA de tipo salvaje, donde el subgrupo incluye los residuos de aminoácidos de la GAA de tipo salvaje que forman el sitio activo para la unión al sustrato y/o la reducción de sustrato. Como tal, la presente invención contempla una rhGAA que es una proteina de fusión que comprende el sitio activo de GAA de tipo salvaje para la unión al sustrato y/o reducción de sustrato, asi como otros residuos de aminoácidos que pueden encontrarse presentes o no en la GAA de tipo salvaje.

La GAA puede obtenerse a partir de fuentes comerciales o puede obtenerse mediante técnicas de síntesis conocidas por el entendido en la técnica. La enzima de tipo salvaje puede purificarse a parir de un sistema de expresión celular recombinante (por ejemplo, células de mamíferos o células de insectos, véase de forma general la patente de Estados Unidos No. 5, 580, 757 de Desnick et al.,- la patente de Estados Unidos No. 6, 395, 884 y 6, 458, 574 de Selden et al.; la patente de Estados Unidos No. 6,461,609 de Calhoun et al.; la patente de Estados Unidos No. 6,210,666 de Miyamura et al.; la patente de Estados Unidos No. 6,083,725 de Selden et al.; la patente de Estados Unidos No. 6,451,600 de Rasmussen et al.; la patente de Estados Unidos No. 5,236,838 de Rasmussen et al.; y la patente de Estados Unidos No. 5,879,680 de Ginns et al.), placenta humana o leche animal (véase la patente de Estados Unidos No. 6,188,045 de Reuser et al.). Después de la infusión, se espera que la enzima exógena sea absorbida por los tejidos a través de mecanismos no específicos o específicos para receptores. En general, la eficiencia de absorción (sin el uso de una ASSC) no es alta y el tiempo de circulación de la proteína exógena es reducido (Ioannu et al., Am. J. Hum. Genet. 2001; 68: 14-25). Además, la proteína exógena es inestable y se encuentra sujeta a degradación intracelular rápida in vitro.

Otras técnicas de síntesis para obtener una GAA adecuada para el uso farmacéutico puede encontrarse, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 7,560,424 y la patente de Estados Unidos No. 7,396,811 de Lebowitz et al., las solicitudes publicadas de Estados Unidos No. 2009/0203575, 2009/0029467, 2008/0299640, 2008/0241118, 2006/0121018 y 2005/0244400 de Lebowitz et al., las patentes de Estados Unidos No. 7,423,135, 6,534,300 y 6,537,785; la solicitud internacional publicada No. 2005/077093 y las solicitudes publicadas de Estados Unidos No. 2007/0280925 y 2004/0029779. Estas referencias se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad.

En una realización, la GAA es alglucosidasa alfa, que consiste en la enzima a-glucosidasa ácida humana (GAA) , codificada por el halotipo más predominante de los nueve halotipos observados de este gen y producida mediante tecnología de ADN recombinante en la línea celular de ovario de hámster Chino. La alglucosidasa alfa se encuentra disponible como Myozyme® y Lumizyme® de Genzyme Corporation (Cambridge, MA) .

La ASSC puede obtenerse mediante el uso de técnicas de síntesis conocidas por el entendido en la técnica. Por ejemplo, la ASSC que puede utilizarse en la presente solicitud, como 1-DNJ, puede prepararse como se describe en las patentes de Estados Unidos No. 6,274,597 y 6,583,158 y la solicitud publicada de Estados Unidos No. 2006/0264467, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

En una realización de la presente solicitud, la ASSC es a-homonoj irimicina y la GAA es hrGAA (por ejemplo, Myozyme® o Lumizyme®) . En una realización alternativa, la ASSC es castanospermina y la GAA es hrGAA (por ejemplo, Myozyme® o Lumizyme®). La ASSC (por ejemplo, a-homonoj irimicina y castanospermina) puede obtenerse de las bibliotecas sintéticas (véase, por ejemplo, Needels et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. E.U.A. 1993; 90:10700-4; Ohlmeyer et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.Ü.A. 1993; 90:10922-10926; Lam et al., publicación de PCT No. O 92/00252; Kocis et al., publicación de PCT No. WO 94/28028) que proporcionan una fuente de posibles ASSC de conformidad con la presente invención. Las bibliotecas de compuestos sintéticos se encuentran disponibles comercialmente en Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, RU) , Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.) y Microsource (New Milford, Conn.). Una biblioteca química poco común se encuentra disponible en Aldrich (Milwaukee, Wis.). De forma alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales se encuentran disponibles en, por ejemplo, Pan Laboratories (Bothell, Wash.) o MycoSearch (NC) o pueden producirse fácilmente. Además, las bibliotecas y compuestos producidos sintéticamente pueden modificarse fácilmente mediante Res. 1986; 155:119-29.

En una realización, las ASSC útiles para la presente invención son inhibidores de enzimas lisosomales e incluyen derivados de glucosa y galactosa imino-azúcares como se describe en Asano et al., J. Med. Chem. 1994; 37:3701-06; Dale et al., Biochemistry 1985; 24:3530-39; Goldman et al., J. Nat. Prod. 1996; 59:1137-42; Legler et al, Carbohydrate Res. 1986; 155:119-29. Dichos derivados incluyen aquellos que pueden comprarse en fuentes comerciales como Toronto Research Chemicals, Inc. (North York, On. Canadá) y Sigma.

TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE POMPE CON ERT Y ASSC De conformidad con la invención, se proporcionan métodos para el uso de GAA (por ejemplo, rhGAA) en combinación con una ASSC para la GAA. Una realización de la presente invención proporciona terapia de combinación de GAA (por ejemplo, ERT con hrGAA) y una ASSC. Por ejemplo, la chaperona ASSC 1-desoxinoj irimicina-HCl se une a la GAA mutante y aumenta la capacidad de la GAA de estabilizarse en una conformación adecuada.

Una realización de la presente invención proporciona un método para tratar a un subgrupo de pacientes que padecen la enfermedad de Pompe con defecto de empalme IVS 1 (-13 T>G) con una terapia de reemplazo de enzimas con ASSC y hrGAA. En las lineas celulares derivadas de los pacientes que padecen enfermedad de Pompe de inicio tardío con esta mutación de empalme común, el 1-desoxino irimicina-HCl aumentó los niveles de GAA sola y en combinación con hrGAA.

En una realización no limitante de la presente invención, el 1-desoxinoj irimicina-HCl, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, puede administrarse a un individuo en una dosis de entre aproximadamente 10 mg/kg y 1000 mg/kg, preferentemente administrada oralmente, ya sea antes, conjuntamente con o después de la administración de la GAA. En una realización no limitante, el 1-desoxinoj irimicina-HCl y la GAA recom inante humana muestra una eficacia sorprendente sobre la actividad enzimática celular, la reducción de glicógeno y el tratamiento de la enfermedad de Pompe. En ratas, la vida media en plasma de la GAA recombinante humana (rhGAA) aumentó 2 veces cuando se administró 1-desoxinoj irimicina-HCl (30 mg/kg p.o.) en un régimen de dosificación que incluye una dosificación 30 minutos antes de la inyección de rhGAA. En ratones KO con GAA, la captación de rhGAA aumentó aproximadamente 2 veces en el corazón y en el diafragma cuando se administró 1-desoxinoj irimicina-HCl (100 mg/kg p.o.) en un régimen de dosificación que incluye administración antes de la inyección de rhGAA. Estos resultados indican que la coadministración de una ASSC con rhGAA aumenta la exposición de la enzima y la captación tisular in vivo en cantidades sorprendentes.

Por ejemplo, una realización de la presente invención proporciona un método para tratar la enfermedad de Pompe que comprende administrar GAA (por ejemplo, rhGAA) dos veces por semana, una vez por semana o una vez cada dos semanas durante hasta aproximadamente 10 semanas en combinación con aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 mg/kg de una ASSC (por ejemplo, 1-DNJ-HC1) antes de, y en intervalos regulares después de la infusión de GAA. Por ejemplo, la ASSC puede administrarse dentro de las dos horas de la infusión y después administrarse en intervalos regulares, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis veces dentro de las 24 horas después de la infusión.

En una realización particular, la GAA es Myozyme® y se administra mediante infusión una vez por semana y la ASSC (por ejemplo, 1-DNJ-HC1) se administra a 10 mg/kg, 100 mg/kg o 1000mg/kg 30 minutos antes de la infusión y después 8, 16 y 24 horas después de cada infusión de Myozyme®.

En otras realizaciones particulares, la GAA es Lumizyme® y se administra mediante infusión una vez por semana y la ASSC (por ejemplo, 1-DNJ-HC1) se administra a 10 mg/kg, 100 mg/kg o 1000mg/kg 30 minutos antes de la infusión y después 8, 16 y 24 horas después de cada infusión de Lumizyme®.

Sin restringirse con ninguna consideración teórica, se cree que la -glucosidasa ácida (GAA) funciona para eliminar los residuos de glucosa terminales del glicógeno lisosomal. Algunas mutaciones genéticas reducen el tráfico y maduración de GAA. La chaperona farmacológica 1-DNJ aumenta los niveles de GAA mediante la unión selectiva y la estabilización de la enzima en una conformación adecuada que reestablece el tráfico de proteínas adecuado al lisosoma.

En realizaciones alternativas, la ASSC se administra como se describe en la publicación internacional No. 2008/134628, que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

En algunas realizaciones, la vía de administración es subcutánea. Otras vías de administración pueden ser la oral o parenteral, incluida la intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, oftálmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradérmica, intracranial, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsula , intrapulmonar, intranasal, transmucosal, transdérmica o mediante inhalación. Los métodos de administración intrapulmonar, aparatos y preparaciones de fármacos se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 5,785,049, 5,780,019 y 5,775,320, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. En algunas realizaciones, el método de administración intradérmica es mediante administración iontoforética a través de parches; un ejemplo de dicha administración se muestra en la patente de Estados Unidos No. 5,843,015, que se incorpora en la presente a modo de referencia .

La administración puede ser mediante inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o como una forma de dosificación de liberación sostenida durante periodos prolongados de tiempo, o mediante administración intravenosa o intraperitoneal, por ejemplo, de una reserva externa (por ejemplo, una bolsa IV) o interna (por ejemplo, un implante biodegradable, un órgano bioartificial o una población de células implantadas que producen GAA) . Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 4,407,957 y 5,798,113, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. Los métodos y aparatos de administración intrapulmonar, se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 5,654,007, 5,780,014 y 5,814,607, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. Otros sistemas de administración parenteral útiles incluyen partículas de copolímeros de etilen-vinilo acetato, bombas osmóticas, sistemas de infusión inplantables , administración mediante bomba, administración de células encapsuladas, administración lisosomal, inyección administrada con aguja, inyección sin aguja, nebulizador, aerosol, electroporación y parche transdérmico . Los dispositivos de inyección sin aguja se describen en las patentes de Estados Unidos No. 5,879,327; 5,520,639; 5,846,233 y 5,704,911, cuyas memorias descriptivas se incorporan en la presente a modo de referencia. Cualquiera de las preparaciones de GAA descritas en la presente puede administrarse con estos métodos.

La administración de la formulación puede ser continua durante un periodo de administración seleccionado previamente que varia de varias horas, de una a varias semanas, de uno a varios meses o hasta uno o más años. En ciertas realizaciones, la forma de dosificación es una que se adapta para la administración de GAA durante un periodo extendido de tiempo. Dichos dispositivos de administración pueden adaptarse para la administración de GAA durante varias horas (por ejemplo, 2 horas, 12 horas o 24 horas a 48 horas o más) a varios dias (por ejemplo, 2 a 5 días o más, de aproximadamente 100 dias o más) a varios meses o años. En algunas de estas realizaciones, el dispositivo se adapta p,ara la administración durante un periodo que varia de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 12 meses o más . El dispositivo de administración de GAA puede ser uno que se adapta para administrar la GAA a un individuo durante un periodo de, por ejemplo, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 72 horas , de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas; de aproximadamente 2 dias a aproximadamente 30 dias , de aproximadamente 5 dias a aproximadamente 20 dias , de aproximadamente 7 dias a aproximadamente 100 dias o más, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 50 dias; de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 4 semanas; de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 24 meses o más, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 12 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 9 meses; u otros intervalos de tiempo, incluidos intervalos crecientes, dentro de estos intervalos, según sea necesario.

En ciertas realizaciones, los métodos de la invención incluyen administrar a un individuo, por ejemplo, administración subcutánea, una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg de GAA, donde la dosis se administra una vez al dia, una vez cada dos dias, una vez cada tres dias, una vez cada cuatro dias, una vez cada cinco dias o una vez cada seis dias. En ciertas realizaciones, la formulación de la presente solicitud se administra una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana o siete veces por semana.

En ciertas realizaciones, los métodos de la presente solicitud comprenden administrar una coformulación a un individuo que comprende GAA y una ASSC, donde las coformulaciones se administran de forma subcutánea. En ciertas realizaciones, la dosis de GAA en la coformulación es entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 5000 mg/kg, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 4000 mg/kg, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 3000 mg/kg, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2000 mg/kg, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 mg/kg, o entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 mg/kg.

En ciertas realizaciones, la dosis de GAA en la coformulación es entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 mg/kg, o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80 mg/kg, o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 mg/kg, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mg/kg, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 mg/kg.

En ciertas realizaciones, la dosis de rhGAA en la coformulación es de aproximadamente 20 mg/kg.

En ciertas realizaciones, la dosis de ASSC en la coformulación es entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 5000 mg/kg, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 4000 mg/kg, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 3000 mg/kg, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2000 mg/kg, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 mg/kg, o entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 mg/kg .

En ciertas realizaciones, la dosis de ASSC en la coformulación es entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 mg/kg, o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80 mg/kg, o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 mg/kg, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mg/kg, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 mg/kg.

En ciertas realizaciones, la dosis de ASSC en la coformulación es de aproximadamente 30 mg/kg.

En ciertas realizaciones, la dosis no resulta en un nivel tóxico de GAA en el hígado del individuo. En algunas realizaciones, la GAA se administra en una dosis suficiente para resultar en una concentración pico de GAA en tejidos del individuo, por ejemplo tejido muscular, dentro de aproximadamente las 24 horas posteriores a la administración de la dosis. En ciertas realizaciones, la GAA se administra en una dosis suficiente para resultar en una concentración pico de GAA en tejidos del individuo dentro de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 50 horas, o aproximadamente 45, 40, 35, 30, 25 o menos horas después de la administración de la dosis. En algunas realizaciones, la formulación de la GAA es una formulación de dosificación unitaria. En algunas realizaciones, la formulación de la GAA es una formulación de múltiples dosis.

Una preparación de GAA de la presente invención puede formularse de forma tal que la dosis requerida total pueda administrarse en una única inyección subcutánea de uno o más mililitros, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mililitros. La preparación puede formularse para administrarse subcutáneamente en varios sitios de inyección diferentes. Con el fin de permitir un volumen de inyección de uno o dos mililitros, puede formularse una preparación de GAA de la presente invención a una concentración en la que la dosis preferida se administre en un volumen de uno a dos mililitros. Las inyecciones subcutáneas de preparaciones de GAA tienen las ventajas de ser convenientes para el paciente, en particular mediante administración propia, en tanto también resultan en una vida media en plasma prolongada en comparación con, por ejemplo, la administración intravenosa. Una prolongación en la vida media en plasma resulta en el mantenimiento de niveles de GAA en plasma eficaces durante periodos de tiempo más prolongados, cuyo beneficio es aumentar la exposición de los tejidos afectados clínicamente a la GAA inyectada y, como resultado, puede aumentar la captación de GAA en dichos tejidos. Esto permite un efecto más beneficioso para el paciente y/o una reducción en la frecuencia de administración. Asimismo, puede utilizarse una variedad de dispositivos diseñados para la conveniencia del paciente, tal como bolígrafos de inyección rellenables y dispositivos de inyección sin agujas, con las preparaciones de GAA de la presente invención tal como se analiza en la presente. Dado que la GAA coformulada con una ASSC es estable a temperatura ambiente durante periodos prolongados de tiempo, la preparación puede mantenerse en un cartucho al lado del cuerpo del paciente para permitir una administración de dosis baja recurrente o una administración de volumen bajo continua para proporcionar un estado estable de administración de enzimas. Dicha administración puede evitar los efectos colaterales potenciales de dosis altas de terapia de reemplazo de enzimas (ERT) administrada durante una infusión intravenosa.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Los compuestos y las composiciones de la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas mediante mezcla con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable .

En una realización, una ASSC y GAA se formulan en una única composición (es decir, una coformulación) . Dicha composición mejora la estabilidad de GAA tanto durante el almacenamiento (es decir, in vitro) como in vivo después de la administración a un individuo, lo que aumenta la vida media en circulación, la captación tisular y lo que resulta en una eficacia terapéutica superior de GAA. La formulación es adecuada preferentemente para la administración parenteral, incluida la administración intravenosa, subcutánea e intraperitoneal, sin embargo, también se contemplan formulaciones adecuadas para otras vías de administración tal como oral, intranasal o transdérmica .

La presente invención presenta formulaciones farmacéuticas liquidas (por ejemplo, formulaciones que comprenden GAA y una ASSC) que tienen propiedades mejoradas en comparación con las formulaciones reconocidas en la técnica. La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que mediante la combinación de una ASSC con GAA, la concentración de GAA en una formulación puede aumentarse a una cantidad que normalmente resultaría en la formación de agregados de GAA en ausencia de una ASSC. A pesar de la alta concentración de GAA, la formulación de la invención es capaz de mantener la solubilidad y estabilidad de la GAA, por ejemplo, durante los pasos de fabricación, almacenamiento y/o procesamiento de congelamiento/descongelamiento repetidos o exposición prolongada a interfaces líquidas de aire aumentadas. Además, la formulación de la invención mantiene un bajo nivel de agregación de proteínas (por ejemplo, menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2% o menos de aproximadamente 1%), a pesar de tener una alta concentración de GAA. La formulación de la invención también mantiene sorprendentemente una viscosidad baja dentro de intervalos adecuados para la inyección subcutánea, a pesar de tener una alta concentración de GAA.

La presente invención también proporciona formulaciones de GAA concentradas y muy potentes que pueden lograrse mediante la solubilización de GAA en un pequeño volumen mediante combinación de GAA con una ASSC. Las formulaciones de la invención son de uso particular donde el dispositivo de administración es relativamente pequeño (por ejemplo, un sistema implantable) , donde se requiere administración durante un periodo de tiempo relativamente prolongado, o donde se requieren dosis eficaces altas de GAA para alcanzar el efecto terapéutico deseado. De este modo, es posible administrar una cantidad constante de GAA durante un periodo de tiempo prolongado (por ejemplo, dias, semanas, meses, etc.) sin la necesidad de rellenar o reemplazar el dispositivo de administración, lo que reduce el riesgo de infección y daño tisular, aumenta el cumplimiento del paciente y logra una dosificación correcta y uniforme.

En ciertas realizaciones de la presente invención, pueden administrarse cantidades terapéuticas de GAA (incluso dosis altas) a un individuo mediante el uso de volúmenes únicamente muy pequeños de GAA (por ejemplo, en el orden de microlitros por dia o nanolitros por día) . En determinados tejidos corporales, por ejemplo, espacio subcutáneo, la administración de volumen bajo facilita una mejor absorción de la GAA a través del tejido local, y minimiza la alteración del tejido local, trauma o edema.

En ciertas realizaciones, las formulaciones de la invención incluyen concentraciones altas de GAA de forma tal que la formulación liquida no muestre precipitación, agregación u opalescencia significativa.

En otra realización, las formulaciones de la invención incluyen concentraciones altas de GAA de forma tal que sean adecuadas para, por ejemplo, la administración subcutánea sin dolor significativo (por ejemplo, según se determinó mediante una calificación de escala análoga visual (VAS) ) .

En ciertas realizaciones, las formulaciones de la invención comprenden una concentración alta de GAA, incluida, por ejemplo, una concentración de GAA de aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL, o aproximadamente 80 mg/mL, o aproximadamente 100 mg/mL, o aproximadamente 115 mg/mL, o aproximadamente 150 mg/ml, o aproximadamente 160 mg/ml o aproximadamente 200 mg/mL, o aproximadamente 240 mg/mL, o aproximadamente 250 mg/mL. Por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 10 a continuación, en un aspecto de la invención, la formulación farmacéutica liquida comprende una concentración de GAA recombinante humana de tipo salvaje de aproximadamente 25 mg/mL. También se contempla que las formulaciones de la invención pueden comprender una concentración de GAA entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 500 mg/mL, o entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 500 mg/mL, o entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 250 mg/mL, o entre aproximadamente 10 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL, o entre aproximadamente 20 mg/mL y aproximadamente 100 mg/mL, o entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 60 mg/mL. Las concentraciones e intervalos intermedios con respecto a las concentraciones listadas anteriormente también pretenden ser parte de la presente invención (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189/ 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 mg/mL) .

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención comprende una GAA en una concentración que es mayor a 5 mg/mL.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención comprende una ASSC en una cantidad eficaz para reducir o inhibir la agregación de GAA en la formulación. Dicha cantidad de ASSC incluye, por ejemplo, entre aproximadamente 0.005 mM y 100 mM, o entre aproximadamente 0.05 mM y aproximadamente 90 mM, o entre aproximadamente 0.1 mM y aproximadamente 80 mM, o entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 70 mM, o entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 60 mM, o entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 3 mM y aproximadamente 40 mM, o entre aproximadamente 4 mM y aproximadamente 30 mM, o entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 20 mM. En ciertas realizaciones, la ASSC se encuentra presente en las formulaciones de la invención en una concentración de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 20 mM. En ciertas realizaciones, la ASSC se encuentra presente en las formulaciones de la invención en una concentración de aproximadamente 1 mM. En ciertas realizaciones, la ASSC . se encuentra presente en las formulaciones de la invención en una concentración de aproximadamente 10 mM.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención comprende una ASSC en una cantidad eficaz para reducir o inhibir la agregación de GAA en la formulación.

Dicha cantidad de ASSC incluye, por ej emplo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 mg/mL, O entre aproximadamente 10 y aproximadamente 250 mg/mL, O entre aproximadamente 20 y aproximadamente 200 mg/mL, O entre aproximadamente 30 y aproximadamente 150 mg/mL, o entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 mg/mL, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 75 mg/mL. En ci .ertas realizaciones, la ASSC se encuentra presente en una cantidad de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 mg/mL.

En ciertas realizaciones, la ASSC se encuentra presente en la formulación en una concentración de entre aproximadamente 32 mg/mL o aproximadamente 160 mg/mL.

En ciertas realizaciones de la invención, una formulación liquida que comprende DNJ y GAA se prepara mediante disolución de DNJ en agua para lograr una concentración de 10 mM de DNJ. La GAA puede reconstituirse en 1.8 mi de agua y puede dializarse durante la noche en solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4). Luego pueden agregarse 4.4 microlitros de DNJ (10 mM) a 400 microlitros de GAA de forma tal que la GAA se encuentre en una concentración de 25 mg/ml.

En otra realización, la GAA y la ASSC se formulan en composiciones individuales. En esta realización, la chaperona y la proteina de reemplazo pueden administrarse de conformidad con la misma vía, por ejemplo, infusión intravenosa, o diferentes vías, por ejemplo, infusión intravenosa para la proteína de reemplazo y administración oral para la ASSC.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de dispersión o soluciones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que exista fácil j eringabilidad. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol y similares), sus mezclas adecuadas y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos . Las prevenciones de la acción de microorganismos pueden ser provocadas mediante varios agentes antifúngicos y antebacterianos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, alcohol bencílico, ácido sórbico y similares.

En varios casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada mediante el uso en composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, de gelatina y monoestearato de aluminio. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de GAA y ASSC en las cantidades requeridas en el solvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización terminal o de filtro. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y la técnica de liofilización que proporcionan un polvo de ingrediente activo además de cualquier ingrediente deseado adicional a partir de su solución filtrada previamente estéril.

De preferencia, la formulación puede contener uno o más excipientes. Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden incluirse en la formulación son soluciones amortiguadoras tales como solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de fosfato (tales como, por ejemplo, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico y sus combinaciones), solución amortiguadora de acetato, solución amortiguadora de bicarbonato, aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos ; proteínas, tales como albúmina sérica, colágeno y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA y cloruro de sodio; liposomas; polivinilpirrolidona; azúcares, tales como dextrano, manitol, sorbitol y glicerol; propilenglicol y polietilenglicol (por ejemplo, PEG-4000, PEG-6000); glicerol; glicina u otros aminoácidos y lípidos. Los sistemas de soluciones amortiguadoras para su uso en las formulaciones incluyen soluciones amortiguadoras de citrato; acetato; bicarbonato y fosfato.

En ciertas realizaciones, las formulaciones de la presente solicitud comprenden además un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , PEG-400, arginina, arginina y ácido giutámico, prolina, gamma-ciclodextrina y sus combinaciones.

En ciertas realizaciones, la solución amortiguadora y/o excipiente se encuentra presente en la formulación en una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50% peso/volumen (p/v) , o entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40% p/v, o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 30% P/v, o entre aproximadamente 4 y aproximadamente 20% P/v, o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10% p/v.

En ciertas realizaciones, la solución amortiguadora y/o excipiente se encuentra presente en la formulación en una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 mM, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 400 mM, o entre aproximadamente 20 y aproximadamente 300 mM, o entre aproximadamente 30 y aproximadamente 250 mM, o entre aproximadamente 40 y aproximadamente 200 mM, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 150 mm, o entre aproximadamente 60 y aproximadamente 100 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende una solución amortiguadora de fosfato presente en una concentración de aproximadamente 26 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende una solución amortiguadora de citrato presente en una concentración de aproximadamente 150 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende PEG-400 presente en una concentración de aproximadamente 5% p/v.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende arginina presente en una concentración de aproximadamente 100 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende arginina en una concentración de aproximadamente 50 mM y ácido glutámico en una concentración de aproximadamente 50 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende prolina presente en una concentración de aproximadamente 250 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación comprende gamma-ciclodextrina presente en una concentración de aproximadamente 10% p/v.

La formulación puede contener ' también un detergente no iónico. Los detergentes no iónicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Tritón X-100, Tritón X-114, Nonidet P-40, Octil a-glucósido, Octil ß-glucósido, Brij 35, Plurónico y Tween 20.

Para la liofilización de preparación de chaperonas y proteínas, la concentración de proteínas puede ser de 0.1 a 10 mg/mL. Los agentes de volumen, tales como glicina, manitol, albúmina y dextrano pueden agregarse a la mezcla de liofilización. Además, pueden agregarse posibles crioprotectores , tales como disacáridos, aminoácidos y PEG, a la mezcla de liofilización . También pueden agregarse cualquiera de los amortiguadores, excipientes y detergentes listados anteriormente.

La via de administración puede ser oral o parenteral, incluida intravenosa, subcutánea, intra-arterial, intraperitoneal , oftálmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradérmica, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosal, transdérmica o a través de inhalación.

La administración de las formulaciones parenterales descritas anteriormente puede ser mediante inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o pueden administrarse a través de administración intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa i.v.) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial o una población de células implantadas que producen la proteina de reemplazo) . Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 4,407,957 y 5,798,113, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. Los aparatos y métodos de administración intrapulmonar se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 5,654,007, 5,780,014 y 5,814,607, cada una de las cuales se incorpora en la presente a modo de referencia. Otros sistemas de administración parenteral útiles incluyen partículas de copolímeros de etilen-vinilo acetato, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, administración por bombeo, administración celular encapsulada, administración liposomal, inyección administrada por aguja, inyección sin aguja, nebulizador, aerosol, electroporación y parche transdérmico . Los dispositivos de inyección sin aguja se describen en las patentes de Estados Unidos No. 5,879,327; 5, 520, 639; 5,846,233 y 5,704,911, cuyas memorias descriptivas se incorporan en la presente a modo de referencia. Cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente puede administrarse en estos métodos.

ESTABILIDAD IN VI RO Asegurar la estabilidad de formulaciones de GAA durante su vida útil es un desafío mayor. Por ejemplo, las instrucciones de pacientes para Myozyme® y Lumizyme® destacan que los recipientes sirven únicamente para una vez y que el producto no utilizado debe ser desechado. Las instrucciones establecen además que Myozyme® y Lumizyme® deberían reconstituirse, diluirse y administrarse por un profesional de la salud y que la administración no debería retrasarse. Myozyme® y Lumizyme® deben almacenarse de 2 a 8°C, y el producto es únicamente estable durante hasta 24 horas a estas temperaturas .

Cuando una ASSC y la GAA se encuentran presentes en la misma composición, las composiciones formuladas de la invención proporcionan composiciones más estables. Además de estabilizar la proteina administrada in vivo, la ASSC se une reversiblemente y estabiliza la conformación de la GAA in vitro, lo que previene la agregación y degradación, y extiende la vida útil de la formulación. El análisis de la interacción de proteína de reemplazo/ASSC puede evaluarse mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica, tal como, calorimetría de barrido diferencial o dicroísmo circular .

Por ejemplo, cuando una formulación inyectable acuosa de la composición se suministra en un recipiente con tapón adecuado para la extracción del contenido mediante el uso de una aguja y jeringa, la presencia de una ASSC inhibe la agregación de la GAA. El recipiente podría servir para un único uso o para varios usos. La formulación también puede suministrarse como una jeringa llenada previamente, un bolígrafo autoinyector o un dispositivo de administración sin aguja. En otra realización, la formulación se encuentra en estado seco o liofilizado, que podría requerir una reconstitución con un diluyente fisiológico estándar o suministrado a un estado líquido. En esta etapa, la presencia de una ASSC estabiliza la GAA durante y después de la reconstitución para evitar la agregación. En la realización donde la formulación es un líquido para la administración intravenosa, tal como en una bolsa estéril para la conexión a un catéter o línea de administración intravenosa, la presencia de una ASSC confiere el mismo beneficio.

Además de estabilizar la proteína de reemplazo que se va a administrar, la presencia de una ASSC permite que la formulación de GAA se almacene a un pH neutro de aproximadamente 7.0 a 7.5. Esto confiere un beneficio para proteínas que normalmente deben almacenarse a un pH más bajo para conservar la estabilidad. Por ejemplo, las enzimas lisosomales, tal como GAA, retienen típicamente una conformación estable a un pH bajo (por ejemplo, 5.0 o inferior) . No obstante, el almacenamiento prolongado de la enzima de reemplazo a un pH bajo puede acelerar la degradación de la enzima y/o formulación.

Tal como se describió anteriormente, la formulación líquida de la invención tiene propiedades ventajosas de estabilidad y almacenamiento. La estabilidad de la formulación líquida no depende de la forma de almacenamiento e incluye, a modo no taxativo, formulaciones que son congeladas, liofilizadas, secadas por atomización o formulaciones en las que se suspende el ingrediente activo. La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. En un aspecto de la invención, la proteina en la formulaciones liquidas es estable en una forma liquida durante al menos aproximadamente 1 semana; al menos aproximadamente 2 semanas; al menos aproximadamente 3 semanas; al menos aproximadamente 1 mes; al menos aproximadamente 2 meses; al menos aproximadamente 3 meses; al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses; al menos aproximadamente 6 meses; al menos aproximadamente 12 meses; al menos aproximadamente 18 meses. Los valores e intervalos intermedios con respecto a los periodos de tiempo listados anteriormente también pretenden ser parte de la presente invención, por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o aproximadamente 24. Además, los intervalos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores listados anteriormente como limites superiores y/o inferiores pretenden ser inclusivos. En ciertas realizaciones, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a aproximadamente 37 °C, o a aproximadamente 40 °C, o a aproximadamente 45 °C durante al menos aproximadamente 1 mes y/o estable a aproximadamente 2 a 8 °C durante al menos aproximadamente 1 año, o más preferentemente estable a aproximadamente 2 a 8 °C durante al menos aproximadamente 2 años. Asimismo, la formulación es preferentemente estable después del congelamiento (a, por ejemplo, -80 °C) y descongelamiento de la formulación, conocido en la presente como un "ciclo de congelamiento/descongelamiento".

La estabilidad de una proteina (por ejemplo, estabilidad de las proteínas y/o reducción en la contaminación) en una formulación líquida puede definirse también como el porcentaje de monómero, agregado o fragmento, o sus combinaciones, de la proteína en la formulación. Una proteína "mantiene su estabilidad física" en una formulación si no muestra sustancialmente ningún signo de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras un examen visual de color y/o claridad, o según se mide mediante dispersión de luz UV o mediante cromatografía de exclusión de tamaños, PAGE no desnaturalizante, u otros métodos para determinar el tamaño, etc. En un aspecto de la invención, una formulación líquida estable es una formulación que tiene menos de aproximadamente un 10%, o menos de aproximadamente un 5%, o menos de aproximadamente un 1% de la proteína que se encuentra presente como agregado en la formulación.

En una realización, la estabilidad física de una formulación líquida se determina mediante la determinación de la turbidez de la formulación después de un ensayo de estrés de agitación, por ejemplo, ensayo de estrés de agitación de 24 horas o 48 horas. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo de estrés de agitación mediante la colocación de un volumen adecuado de una formulación líquida en un vaso de precipitación con un agitador magnético, por ejemplo, (multipoint HP, 550 rpm) , mediante la eliminación de alícuotas en cualquier momento adecuado, por ejemplo, a T0-T48 (horas), y mediante la realización de ensayos adecuados, según se desee, sobre las alícuotas. Las muestras de una formulación en las mismas condiciones pero sin agitación sirven como control.

Las mediciones de turbidez pueden realizarse mediante el uso de un sistema de medición de turbidez de laboratorio de Hach (Alemania) y se informan como unidades nefelométricas (NTU) .

La estabilidad de la composición (por ejemplo, estabilidad de las proteínas y/o reducción en la contaminación) puede medirse también, por ejemplo, mediante la medición de la degradación de proteínas o crecimiento o presencia de contaminantes. La degradación de proteínas puede determinarse, por ejemplo, mediante HPLC de fase inversa, PAGE no desnaturalizante, cromatografía de intercambio de iones, mapeo de péptidos o métodos similares.

La estabilidad de la GAA en presencia de una ASSC, en una concentración descrita en la presente, puede medirse, por ejemplo, como una agregación o degradación porcentual, a un tiempo predeterminado y en comparación con uno o más estándares. Por ejemplo, un estándar adecuado es una composición similar a las condiciones de prueba excepto que la GAA no entra en contacto con una ASSC. Se comparan las estabilidades de la GAA en una concentración. La adecuación puede mostrarse a través de la GAA en una concentración particular en combinación con una ASSC que tiene estabilidad comparable o mejor que en ausencia de la ASSC.

ESTABILIDAD IN VIVO Tal como se describe anteriormente para las formulaciones in vitro, la presencia de una ASSC para la GAA tiene el beneficio de prolongar en plasma la vida media de la GAA exógena, lo que mantiene entonces niveles proteicos de reemplazo eficaces durante períodos de tiempo más prolongados, lo que resulta en una exposición superior de tejidos afectados clínicamente a la GAA y, así, una captación superior de proteínas en los tejidos. Esto confiere dichos efectos beneficiosos al paciente como alivio potenciado, reducción en la frecuencia y/o reducción en la cantidad administrada. Esto reducirá también el costo del tratamiento.

Además, para estabilizar la GAA de reemplazo de tipo salvaje, la ASSC también estabilizará y potenciará la expresión de GAA mutantes endógenas que son deficientes como resultado de mutaciones que evitan el procesamiento y plegamiento adecuados en el ER, como en trastornos conformacionales , tal como enfermedad de Pompe.

El alcance de la presente invención no se encuentra limitado por las realizaciones especificas descritas en la presente y los ejemplos que siguen a continuación. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente, resultarán evidentes para los entendidos en la técnica a partir de la descripción que antecede y las figuras y ejemplos adjuntos. Dichas modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Estabilidad térmica in vltro de rhGAA y 100 µ? de 1-DNJ-HC1 La estabilidad de GAA recombinante humana (Myozyme®, Genzyme Corp.) con y sin 100 µ? de ASSC 1-desoxinoj irimicina clorhidrato (1-DNJ-HC1) se determinó a través de un ensayo de estabilidad térmica que utiliza calor para inducir la desnaturalización de proteínas. La desnaturalización se controla mediante el uso de tinte anaranjado SYPRO que se vuelve fluorescente tras la unión a aminoácidos hidrófobos (que no se exponen en una proteina plegada) .

La estabilidad térmica se realizó a pH 7.4 para dos formulaciones, que corresponde al pH del ER. Tal como se muestra en la figura 1, la formulación que contiene 100 µ? de 1-DNJ-HCl a pH 7.4 requirió significativamente más calor para la desnaturalización, y es entonces más estable, en comparación con la formulación sin la ASSC a pH 7.4.

EJEMPLO 2: Actividad residual de GAA y estabilidad térmica de rhGAA y 50 µ? de 1-DNJ-HCl Se determinó la actividad de GAA residual para cuatro formulaciones : (1) solo Myozyme® a pH 7.4; (2) Myozyme® más 50 ?? de 1-DNJ-HCl a pH 7.4; (3) solo Myozyme® a pH 5.2; (4) Myozyme® más 50 DM de 1-DNJ-HCl a pH 5.2.

La actividad se midió con base en el % de actividad inicial (t=0) durante 24 horas. Las muestras se analizaron para determinar la actividad enzimática de GAA con base en la hidrólisis del sustrato fluorogénico de 4-MU-a-glucosa a 0, 3, 6 y 24 horas. La actividad de GAA se expresó como % de actividad inicial, es decir, actividad residual.

Tal como se muestra en la figura 2A, la formulación (1) anterior (sin la ASSC) perdió actividad con el paso del tiempo, que tiene únicamente aproximadamente un 20% de su actividad inicial 24 horas después de la administración. En contraste, la formulación (2) mantuvo casi toda, si no toda su actividad inicial durante 24 horas. Ambas formulaciones a pH 5.2 (formulaciones (3) y (4) anteriores) mantuvieron la mayoría de su actividad inicial durante 24 horas.

Con el fin de determinar si la pérdida de actividad enzimática inicial se corresponde con la incapacidad de mantener una conformación adecuada, se realizó un experimento de estabilidad térmica con color anaranjado SYPRO en las muestras anteriores según se describe de forma general en el ejemplo 1. En este experimento de estabilidad térmica, no obstante, la concentración de 1-DNJ-HCl aumentó hasta 100 µ? en las formulaciones (2) y (4). Con base en este experimento, se estimó el % de GAA plegada y se gráfico en la figura 2B. La disminución en la cantidad de GAA plegada durante 24 horas en la figura 2B para la formulación (1) se corresponde con la pérdida de actividad mostrada en la figura 2A para esta misma formulación general.

EJEMPLO 3 : Captación In vivo de Myozyme® en ratones KO con GAA con y sin administración oral de 1-DNJ-HCl.

Una de las siguientes formulaciones se administró a cinco grupos de ratones KO con GAA: (1) control sin tratar; (2) 10 mg/kg de Myozyme® IV una vez por semana, por hasta tres semanas (3) infusión de Myozyme® como en (2), más 10 mg/kg de 1-DNJ-HCl; (4) infusión de Myozyme® como en (2), más 100 mg/kg de 1-DNJ-HCl; (5) infusión de Myozyme® como en (2), más 1000 mg/kg de 1-DNJ-HCl; Se generaron homogenados tisulares para análisis. Se determinó la actividad enzimática mediante el uso de un ensayo de sustrato fluorogénico 4-MUG. Los resultados se muestran en la figura 3.

Estos resultados indican que la captación tisular de Myozyme® (como una medida de la actividad de GAA) disminuyó a los 7 dias después de la inyección para todos los grupos. La coadministración de 1-DNJ-HCl con Myozyme® facilitó un aumento dependiente de la dosis en la captación de Myozyme® durante hasta 7 dias después de la inyección. El efecto de 1-DNJ-HC1 fue más pronunciado y significativo (p<0.05 prueba t contra Myozyme® sola) a los 4 y 7 dias después de la inyección de 1, 2 o 3 dosis.

EJEMPLO : Captación in vivo de Myozyme® en ratones KO con GAA con y sin administración oral de 1-DNJ-HCl Se realizó un experimento de estabilidad térmica según se describió de forma general en el ejemplo 1 en cuatro composiciones : (1) composición única de Myozyme®; (2) Myozyme® más 1 µ? de 1-DNJ-HC1; (3) Myozyme® más 10 µ? de 1-DNJ-HC1; (4) Myozyme® más 100 µ? de 1-DNJ-HC1; Tal como se muestra en la figura 5, DNJ-HCl aumenta la termoestabilidad de GAA como resulta evidente por los aumentos en la temperatura de fusión de GAA en una forma dependiente de la dosis.

EJEMPLO 5: Semi vida in vivo de rhGAA en ratas cuando se administra como monoterapia o cuando se combina con 1-DNJ-HCl .

A cuatro grupos de ratas se les administró uno de los siguientes regímenes de dosificación: (1) Solución salina + agua; (2) 10 mg/kg de rhGAA + agua; (3) 10 mg/kg de rhGAA + 3 mg/kg de 1 DNJ-HCl; (4) 10 mg/kg de rhGAA + 30 mg/kg de 1 DNJ-HCl; La rhGAA o solución salina se administró 30 minutos después de la administración del 1-DNJ-HC1. La actividad de GAA se determinó según se describió de forma general en el ejemplo 3. Los resultados durante 24 horas se muestran en la figura 6. El 1-DNJ-HCl inhibió la pérdida de actividad enzimática después de la administración, lo que aumentó la vida media in vivo de rhGAA. La vida media in vivo de rhGAA aumentó de 1.4 + 0.2 horas (0 mg/kg de 1-DNJ-HCl) a 2.1 ± 0.2 horas (3 mg/kg de 1-DNJ-HCl) y 3.0 ± 0.4 horas (30 mg/kg de 1-DNJ-HCl) .

EJEMPLO 6: La actividad enzimática de GAA en ratón KO con GAA A tres grupos de ratones KO con GAA se les administró una de las siguientes formulaciones: (1) Control (sin tratamiento) ; (2) 10 mg/kg de rhGAA; (3) 10 mg/kg de rhGAA y 100 mg/kg de 1-DNJ-HCl 30 minutos antes de la infusión de rhGAA, y cada 8 horas después de la infusión durante 48 horas.

Los homogenados de tejido de corazón y diafragma se cosecharon y se midió la actividad de rhGAA mediante el uso de sustrato fluorogénico (4-MUG). Los resultados se muestran en la figura 7.

EJEMPLO 7: 1-DNJ-HCl estabiliza rhGAA y previene la inactivación enzimática en la sangre Se evaluó el 1-DNJ-HCl portara determinar su capacidad para estabilizar la rhGAA (por ejemplo, Myozyme®) en sangre (citrato de sodio anti-coagulado) entera a 37°C para imitar el ambiente al que está expuesto el ERT durante la infusión en varias horas. Los resultados indican que la rhGAA es inestable en estas condiciones de forma tal que aproximadamente un 40% de las enzimas se inactivo en 4 horas, -70% en 8 horas y casi un 100% en 24 horas tal como se muestra (gráfica de linea de diamantes roja) en la figura 8. Estos resultados sugieren que una fracción significativa de la dosis de rhGAA seria probablemente inactiva ya que estas infusiones son típicamente mayores a 6 horas y en algunos casos 12 horas. Además, dado que Myozyme® tiene una semi vida en plasma más larga (se informó mayor a 3 horas), existe una gran probabilidad de que una cantidad apreciable de la enzima permanezca en circulación varias horas después de la infusión que también tenderla a la inactivación. En contraste, cuando se incubó rhGAA con 50 µ? de 1-DNJ-HC1 en las mismas condiciones experimentales, la enzima permaneció completamente activa durante todo el estudio (gráfica de linea cuadrada azul) . Estos resultados indican que el 1-DNJ-HC1 estabilizó la rhGAA y evitó la inactivación enzimática en sangre entera. De manera importante, estos datos también indicaron que las proteínas en plasma presentes en sangre no son suficientes para evitar la pérdida de actividad enzimática de la rhGAA donde una chaperona farmacológica como 1-DNJ-HC1 es capaz de evitar la inactivación enzimática.

Ejemplo 8: 1-DNJ-HCl estabiliza rhGAA y previene la inactivación enzimática en la sangre La rhGAA medida en sangre entera con diversas concentraciones de 1-D J-HCl (de 0 a 100 µ?) determina la concentración mínima de 1-DNJ-HCl que evita la inactivación enzimática de rhGAA (figura 9). Tal como es de esperarse, las concentraciones altas de 1-DNJ-HCl (50 y 100 µ?) fueron mejores para estabilizar la rhGAA y evitar la inactivación enzimática. De forma interesante, no obstante, las concentraciones bajas de 1-DNJ-HCl (tan bajas como 2.5 µ?) también mantuvieron la actividad de rhGAA con una pérdida de -20% durante un período de tiempo de 6 horas. Estos resultados sugieren que concentraciones moderadas de 1-DNJ-HCl (por ejemplo, 10-25 µ?) pueden ser adecuadas para estabilizar la rhGAA en sangre durante las infusiones. Con base en datos PK en plasma humanos, estas concentraciones se obtienen fácilmente en la clínica.

Ejemplo 9: Myozyme® coadministrada con 1-DNJ-HCl resultó en reducción de glicógeno tisular significativamente mayor en ratones KO con GAA en comparación con Myozyme® sola A ratones KO con GAA machos de doce semanas de edad se les administró una única dosis de Myozyme® (40 mg/kg) a través de inyección en vena de cola en bolo semana por medio durante 8 semanas. Para prevenir la anafilaxis, antes de la tercera y cuarta inyección con Myozyme®, se administró difenhidramina (10 mg/kg intraperitonealmente) 10 minutos antes de la inyección con Myozyme®. Además, los ratones recibieron agua o 30 mg/kg de 1-DNJ-HC1 administrados a través de sonda oral 30 minutos antes de la administración de Myozyme®. Los ratones se sometieron a eutanasia 14 días después de la última administración de Myozyme®. El diseño experimental se muestra en la figura 10.

Después se midieron los niveles de glicógeno en corazón, diafragma, soleo y cuádriceps. La Myozyme® coadministrada con 1-DNJ-HC1 resultó en una reducción de glicógeno tisular significativamente mayor en ratones KO con GAA en comparación con Myozyme® sola (figura 11) . En resumen, los homogenados se prepararon mediante homogeneización de ~50 mg de tejido durante 3 a 5 segundos sobre hielo con un microhomogeneizador en 200 L de agua desionizada. Los sobrenadantes se desnaturalizaron con calor (99°C durante 10 minutos) para quitar actividad amiloglucosidasa endógena. Después se analizaron los Usados desnaturalizados (4 L) en duplicado mediante la adición de 36 µL de agua con y sin 10 pL de 800 U/mL de amiloglucosidasa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y se incubaron durante 1 hora a 50 °C. La reacción se detuvo mediante inactivación a 100 °C durante 10 minutos. Finalmente, se agregaron 200 pL de reactivo de glucosa (Sigma) y se leyó la absorbancia a 340 nm sobre Spectramax . Se ejecutó una curva estándar que varia de 5 g/mL a 400 g/mL de glicógeno de hígado de conejo tipo III (Sigma) cada día para conversión de absorbancia a unidades de glicógeno absolutas. Simultáneamente, se determinó la cantidad de proteína en los homogenados tisulares mediante el uso de ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce, Rockford, IL) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El contenido de glicógeno de cada muestra se normalizó a la proteína, y los datos se expresaron finalmente como microgramos de glicógeno por miligramo de proteína ^g/mg proteína) .

E emplo 10 : DNJ reduce agregación de Myozyme® en composiciones que comprenden concentraciones altas de Myozyme® Una formulación líquida que comprende DNJ y GAA se preparó mediante la disolución de DNJ en agua para lograr una concentración de 10 mM de DNJ. La GAA se reconstituyó en 1.8 mi de agua y se dializó durante la noche en solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4). Luego se agregaron 4.4 microlitros de DNJ (10 mM) a 400 microlitros de GAA de forma tal que la GAA se encontrara en una concentración de 25 mg/ml .

Se incubaron 25 mg/mL de Myozyme® con o sin 1 mM de DNJ en solución salina tamponada con fosfato a pH 7.4. La agregación de Myozyme® se evaluó después de la incubación durante 4 semanas a 37 °C. Tal como se muestra en la figura 12, la combinación de 1 mM de DNJ con 25 mg/mL de Myozyme® redujo la agregación de Myozyme®.

Ejemplo 11: DNJ aumenta la semi vida en circulación y captación tisular de Myozyme® A las ratas Sprague-Dawley se les administró 10 mg/kg de Myozyme® o 30 mg/kg de DNJ mezclados con 10 mg/kg de Myozyme® a través de la vena de la cola. La actividad de GAA se midió en el tejido de cuádriceps y plasma. Se sustrajo la actividad de GAA del punto de referencia en cuádriceps (-16 nmol/mg de proteina/hora) a la de la GAA medida después de la administración de GAA o DNJ y GAA.

Tal como se muestra en la figura 13, la administración de 30 mg/kg de DNJ con 10 mg/kg de Myozyme® a través de la vena de la cola aumentó la vida media en plasma en circulación y captación tisular de Myozyme© en cuádriceps.

Ejemplo 12: Solubilidad de Lumizyme® en presencia de 1- DNJ.

Se examinó la solubilidad de Lumizyme® (alfa alglucosidasa) en presencia de 1-DNJ y diferentes excipientes.

Método Un recipiente de Lumizyme® que contenia 52.5 mg de proteina, 210 mg de manitol, 0.5 mg de polisorbato 80, 9.9 mg de Na2HP04 x 7H20 y 31.2 mg de NaH2P04 x H20 se disolvió en un volumen mínimo de agua (1 mL agregado) lo que proporcionó 1.2 mL de solución de proteína. Se transfirieron cinco alícuotas de 240-µ?, (cada una contenía 10.5 mg de proteína) a dispositivos de filtro centrífugo de corte 30 kDa de 0.5 mL Amicon Ultra y se centrifugaron durante 10 minutos a 14,000 x g en un centrífugo Eppendorf para obtener aproximadamente 50 pL de fracción retenida.

Los excipientes originales presentes en la composición, es decir, manitol y polisorbato 80 se intercambiaron por nuevos excipientes para analizar la solubilidad de la proteína (manteniendo las mismas condiciones amortiguadoras) . Se prepararon las siguientes soluciones de excipientes para el intercambio mediante el uso de la solución amortiguadora de fosfato original: 1. PEG 400 (5% p/v) 2. Arginina (100 mM) 3. Arginina (50 mM) + ácido glutámico (50 mM) 4. Prolina (250 mM) 5. Gamma-ciclodextrina (10%) Todas las muestras contenían el mismo ligando de molécula pequeña 1-desoxinoj irimicina clorhidrato (1-DNJ-HC1, AT2220 HC1, 2220 HC1) en una relación 1:1 (p/p) del ligando con respecto a la proteína, excepto para la muestra 2 (100 mM de arginina) que contenia el ligando en una relación 1:5 (p/p) reducida de ligando con respecto a la proteina.

Para intercambiar excipientes, se disolvieron 5.2 mg de Na2HP04 y 27.1 mg de NaH2P04 en 10.3 mL de agua para preparar la solución amortiguadora de fosfato de intercambio de excipiente/lavado de aproximadamente 26 mM. Se complementó un volumen de 8 mL de la solución amortiguadora para intercambio del excipiente con 160 mg/mL del ligando de molécula pequeña (para preparar soluciones de excipiente 1,3, 4 y 5), en tanto se complementaron 2 mL con 32 mg/mL de ligando para el excipiente 2 (100 mM de arginina) . Se disolvió cada excipiente en 2 mL de esta solución amortiguadora en las concentraciones listadas anteriormente.

Se agregó una solución de excipiente a cada dispositivo de filtro individual para lograr un volumen total de 0.5 mL. Se centrifugó cada dispositivo de filtro durante 15 minutos a 14, 000 x g en un centrifugo Eppendorf de mesa para retener aproximadamente 25 L. Las unidades se volvieron a llenar con la misma solución de excipientes a 0.5 mL y se centrifugaron nuevamente (este proceso se repitió 2 veces). Este procedimiento reemplazó de forma eficaz el manitol y polisorbato 80 con los excipientes descritos anteriormente, mediante disolución de los constituyentes originales en aproximadamente 1:1000. Se recogieron todos los filtrados para cada excipiente y se examinaron para detectar cualquier fuga de proteina a través del filtro.

Se invirtió cada dispositivo de filtro centrífugo en un tubo limpio, y se recogió la solución de proteína concentrada de cada dispositivo de filtro mediante centrifugación durante.2 minutos a 1000 x g. Se determinó el volumen de cada muestra (66 L, que corresponden a una concentración de proteínas diana de 160 mg/mL) , y se confirmó que no se observaron precipitados visibles en cada muestra. Las muestras se transfirieron nuevamente a sus dispositivos de filtros respectivos y se centrifugaron durante 5 minutos adicionales. Después las muestras de recogieron mediante inversión de los filtros en tubos limpios y se centrifugaron durante 2 minutos a 1000 x g para proporcionar aproximadamente 37 pL de fracción retenida (que corresponden a >280 mg/mL de proteínas con base en una concentración inicial total de 10.5 mg de proteínas) .

Las muestras se sometieron a vórtice y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para equilibrar las fases sólidas y líquidas seguido de centrifugación durante 10 minutos a 14,000 x g. Nuevamente, no se observaron precipitados visibles. Se tomaron de dos a tres alícuotas de 10 iL del sobrenadante de cada muestra (en función del volumen disponible de la fase líquida), y se diluyeron 1:1000 en dos pasos. La concentración de proteínas se midió mediante absorbancia UV a 280 nm, y se calculó la solubilidad de proteína máxima de conformidad con una curva de calibración altamente reproducible . La curva de calibración se preparó mediante disolución de 6.8 mg de polvo liofilizado (que contenía 1.16 mg de proteína) Myozyme® (alfa alglucosidasa) en 1.16 mL de agua seguido de una dilución en serie en agua desionizada. La absorbancia se midió a 280 nm en una cubeta semi-micro de cuarzo de pase ligero de 1 cm mediante el uso de alícuotas de 0.5 mL.

Resultados : Tal como se muestra en la tabla 1, los excipientes analizados en este estudio aumentaron la solubilidad de la proteína en presencia de un ligando de molécula pequeña, 1-DNJ-HC1. El mayor valor observado para la mezcla fue arginina y ácido glutámico (242 mg/mL) , el menor fue gamma-ciclodextrina (114 mg/mL). Se determinó que la solubilidad de la proteína sin los excipientes agregados es de aproximadamente 80 mg/mL. Sin limitarse a ninguna consideración teórica, el aumento en la solubilidad puede deberse a interacciones eficaces de excipientes de aminoácidos con los sitios hidrófilos e hidrófobos de superficie de proteínas, lo que bloquea competitivamente las asociaciones proteína-proteína.

Tabla 1. Solubilidad de Lumizyme® (alfa alglucosidasa) en presencia del ligando 1-DNJ-HC1 y excipientes seleccionados .

Ejemplo 13: Efecto de repetir la dosificación subcutánea de rhGAA y 1-DNJ coformulados sobre la captación tisular y la reducción de glicógenos en ratones KO con GAA El presente estudio examinó si los ratones de genes inactivados por GAA (GAA KO) toleran inyecciones subcutáneas (SQ) repetidas de rhGAA o una coformulación de rhGAA y 1-DNJ, si las inyecciones SQ repetidas de rhGAA aumentan la absorción tisular de rhGAA y reducen los niveles de glicógeno en los ratones KO con GAA, y si las inyecciones SQ repetidas de una coformulación de rhGAA y 1-DNJ aumentan la captación tisular de rhGAA y reducen los niveles de glicógeno en comparación con inyecciones SQ de rhGAA sola.

Métodos Se utilizaron ratones KO con GAA macho de 12 semanas de edad en grupos de 7 en el presente estudio. A cada grupo de ratones se le administró uno de los siguientes tratamientos : (1) Solución salina únicamente (sin control de fármaco); (2) Lumizyme© sola (20 mg/kg) administrada subcutánemente (SQ) ; o (3) Lumizyme® (20 mg/kg ) y 1-DNJ (30 mg/kg) coformulados SQ.

Cada uno de los tratamientos se administró a su grupo de tratamiento respectivo durante un período de 2 semanas. Los tratamientos se administraron los lunes y jueves de cada semana. Las inyecciones SQ se administraron entre el omóplato de cada ratón que recibió tratamiento. Se administró un total de 4 dosis a cada animal de estudio. Se administró difenhidramina intraperitonealmente (IP) antes de la tercera y cuarta dosis.

Los niveles de rhGAA y glicógeno se determinaron de conformidad con el siguiente protocolo de muestra. La sangre se extrajo de cada animal de estudio después de la cuarta dosis para el análisis farmacocinético en plasma. La actividad de GAA, los ensayos de inmunotransferencia Western Blot y los niveles de 1-DNJ se determinaron para muestras plasmáticas extraídas 2 y 4 horas después de la última dosis SQ.

Las muestras tisulares se recogieron para determinar la captación de rhGAA 3 dias después de la última dosis del estudio (es decir, 3 dias después de la dosis 4). Las muestras tisulares incluyeron corazón, diafragma, lengua, cerebro, bazo, hígado, bíceps, tríceps, cuádriceps, soleo, gastrocnemio, piel ventral y piel dorsal del sitio de inyección SQ. Las muestras tisulares también se recogieron para determinar la concentración de glicógeno 14 días después de la última dosis del estudio (es decir, 14 días después de la dosis 4) . En la tabla 2 se muestra un resumen de los tratamientos administrados a los sujetos de prueba y el tiempo de recolección de muestra.

Tabla 2. Tratamientos administrados y tiempos de recolección de muestra del presente estudio.

La dosificación se administró cada lunes y jueves durante 2 semanas en un total de 4 administraciones. No hubo muertes en ningún grupo.

Resultados Glicógeno y rhGAA tisular Las figuras 15 a 25 muestran la actividad de GAA 3 días después de la dosis de tratamiento final, y los niveles de glicógeno 14 dias después de la dosis de tratamiento final en muestras tisulares extraídas de animales que recibieron uno de los tres tratamientos. Para la mayoría de los tejidos analizados, la coformulación de rhGAA con 1-DNJ aumentó significativamente la captación de rhGAA y la actividad en los tejidos analizados en comparación con la administración de rhGAA sola. De forma adicional, después del tratamiento con rhGAA o la coformulación de rhGAA y 1-DNJ, la actividad de rhGAA fue alta en el sitio de inyección SQ, en piel ventral y en músculos de la extremidad superior 3 días después de la dosis de tratamiento final. La actividad de rhGAA fue mayor en el hígado que en todos los músculos analizados excepto en las extremidades superiores.

Asimismo, tal como se describió en la tabla 3, los niveles de rhGAA alcanzados con la coformulación de 1-DNJ y rhGAA (Lumizyme®) administrados SQ fueron tan altos o más altos (en una mayoría de tejidos) en comparación con los niveles alcanzados mediante administración de rhGAA (Myozyme®) intravenosamente sola.

Tabla 3. Captación de la actividad de rhGAA (nmol/mg/hora) de una coformulación de rhGAA (Lumizyme®) y 1- DNJ administrados SQ en comparación con rhGAA (Myozyme®) administrada sola intravenosamente (IV) y Lumizyme® administrada sola SQ. 2 A los ratones KO con GAA se les administró 4 dosis de Lumizyme (20 mg/kg) +/- 1-DNJ (30 mg/kg) SQ en intervalos de 3-4 dias (lunes y jueves) .

Los datos de captación de la actividad enzimática para ambos estudios se evaluaron 3 dias después de la última dosis (cuarta) .

Con respecto a los niveles de glicógeno detectados en las muestras tisulares, la magnitud de la reducción en glicógeno se correspondió con la captación de rhGAA en algunos tejidos. El corazón, la lengua y la piel ventral mostraron una correlación entre la captación mejorada de rhGAA y la reducción de glicógeno mejorada con la coformulación de rhGAA + 1-DNJ en comparación con rhGAA sola.

Sin restringirse con ninguna consideración teórica, la alta actividad enzimática de rhGAA en algunos Usados tisulares podría ser a partir de enzimas que están en el tejido (por ejemplo, vasos sanguíneos, linfáticos, grasos) pero que no se han absorbido todavía en las células y lisosomas. De forma adicional, sin restringirse con ninguna consideración teórica, puede haber abundancia de glicógeno citoplásmico que no esté disponible para la enzima lisosomal pero que es detectable en lisados de célula completa. rhGAA en plasma Para determinar si la 1-DNJ presente en muestras plasmáticas de animales tratados con la coformulación inhibió la rhGAA en las muestras, la actividad de rhGAA se determinó mediante incubación de rhGAA de muestras plasmáticas con sustrato de GAA durante 1 hora, y la determinación de la actividad enzimática con base en el metabolismo de sustratos. Después las muestras se volvieron a analizar mediante incubación de las muestras durante 3 horas con sustrato para permitir la disociación de 1-DNJ de la enzima, y por lo tanto invierte toda inhibición enzimática ocasionada por 1-DNJ. No se observaron cambios sustanciales en los resultados entre los dos formatos de ensayos.

Las figuras 26 a 28 muestran la actividad de rhGAA en plasma y la concentración de proteínas en muestras recogidas 2 y 4 horas después de la dosis de tratamiento final. 2 horas después de la dosis de tratamiento SQ final, se detectó mayor actividad de la rhGAA y concentraciones de proteínas en el plasma (es decir, ensayo de actividad e inmunotransferencia Western Blot, respectivamente) cuando se administró 1-DNJ con rhGAA en la coformulación en comparación con rhGAA administrada sola. 4 horas después de la dosis de tratamiento SQ final, los niveles de rhGAA en plasma permanecieron elevados en los ratones tratados con la coformulación, mientras que los niveles de rhGAA en plasma de ratones tratados con rhGAA sola aumentaron en comparación con niveles en las muestras de 2 horas.

El alcance de la presente invención no se encuentra limitado por las realizaciones especificas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente, resultarán evidentes para los entendidos en la técnica a partir de la descripción que antecede y las figuras adjuntas. Dichas modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adj untas .

Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de productos, números de acceso del Banco de Genes y protocolos se citan a lo largo de la presente solicitud, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende a-glucosidasa ácida y una chaperona activa especifica para el sitio que se selecciona del grupo que consiste en 1-desoxinoj irimicina y n-butildesoxinoj irimicina, donde la a-glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad mayor a 5 mg/mL.

2. La composición de la reivindicación 1, donde la enzima -glucosidasa ácida es una -glucosidasa ácida recombinante humana de tipo salvaje.

3. La composición de la reivindicación 1, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables .

4. La composición de la reivindicación 3, donde la chaperona activa específica para el sitio es una sal de clorhidrato de 1-desoxinoj irimicina .

5. La composición de la reivindicación 1, donde la chaperona activa específica para el sitio es n-butildesoxinoj irimicina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables .

6. La composición de la reivindicación 1, donde la o¡-glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 250 mg/mL.

7. La composición de la reivindicación 6, donde la -glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad que se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 115 mg/mL, aproximadamente 160 mg/mL, aproximadamente 200 mg/mL y aproximadamente 240 mg/mL.

8. La composición de la reivindicación 1, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina presente en una cantidad entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 20 mM.

9. La composición de la reivindicación 1, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina presente en una cantidad entre aproximadamente 20 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL.

10. La composición de la reivindicación 1, donde la composición se formula para la administración subcutánea a un individuo .

11. La composición de la reivindicación 1, donde la composición se formula para la administración intravenosa a un individuo.

12. La composición de la reivindicación 1, que comprende además una solución amortiguadora que se selecciona del grupo que consiste en solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de acetato, solución amortiguadora de bicarbonato, solución amortiguadora de fosfato y sus combinaciones .

13. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol 400, arginina, ácido glutámico, prolina, gamma-ciclodextrina y sus combinaciones.

14. Un método para tratar la enfermedad de Pompe en un individuo que comprende administrar al individuo una composición que comprende -glucosidasa ácida y una chaperona activa especifica para el sitio que se selecciona del grupo que consiste en 1-desoxinoj irimicina y n-butildes'oxinoj irimicina, donde la a-glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad mayor a aproximadamente 5 mg/mL .

15. El método de la reivindicación 14, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables .

16. El método de la reivindicación 14, donde la a-glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 250 mg/mL.

17. El método de la reivindicación 14, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina presente en una cantidad entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 20 mM.

18. El método de la reivindicación 14, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina presente en una cantidad entre aproximadamente 20 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL.

19. El método de la reivindicación 14, donde la chaperona activa especifica para el sitio es n-butildesoxinoj irimicina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables .

20. El método de la reivindicación 14, donde la composición se administra subcutáneamente.

21. El método de la reivindicación 14, donde la composición se administra en una dosis suficiente para resultar en una concentración pico de a-glucosidasa ácida en el tejido muscular del individuo dentro de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 50 horas después de la administración de la dosis.

22. El método de la reivindicación 14, donde la composición se administra en una dosis suficiente para resultar en una concentración pico de a-glucosidasa ácida en el tejido muscular del individuo dentro de aproximadamente 24 horas después de la administración de la dosis.

23. El método de la reivindicación 14, donde la composición es una formulación de dosificación unitaria.

24. El método de la reivindicación 14, donde la composición es una formulación de múltiples dosis.

25. El método de la reivindicación 14, donde la composición se administra una vez por dia, una vez cada dos dias, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días o una vez cada siete días.

26. El método de la reivindicación 14, donde la composición se administra dos veces por semana.

27. Un método para aumentar la estabilidad de la a-glucosidasa ácida en una formulación para la administración subcutánea a un individuo, que comprende combinar la OÍ-glucosidasa ácida con una chaperona activa específica para el sitio que se selecciona del grupo que consiste en 1-desoxinoj irimicina y n-butil-desoxinoj irimicina, donde la -glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad mayor a 5 mg/mL.

28. El método de la reivindicación 27, donde la chaperona activa específica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables .

29. El método de la reivindicación 27, donde la a-glucosidasa ácida se encuentra presente en una cantidad entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 250 mg/mL.

30. El método de la reivindicación 27, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina presente en una cantidad entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 20 mM.

31. El método de la reivindicación 27, donde la chaperona activa especifica para el sitio es 1-desoxinoj irimicina presente en una cantidad entre aproximadamente 20 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL.

32. El método de la reivindicación 27, donde la chaperona activa especifica para el sitio es n-butil-desoxinoj irimicina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables .

33. El método de la reivindicación 27, donde la a-glucosidasa ácida se combina con la chaperona activa especifica para el sitio en una cantidad eficaz para reducir la agregación de la a-glucosidasa ácida en la formulación.

34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, donde la a-glucosidasa ácida se estabiliza ín vitro.

35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, donde la a-glucosidasa ácida se estabiliza in vivo.