MX2014009896A - Mejora de resistencia a la sequia en plantas: pectinasa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método novedoso para aumentar la resistencia a la sequía de una planta. El método abarca la afectación de la expresión de un gen o genes en la planta. En comparación con una planta no manipulada para afectar la expresión de los genes, las plantas exhiben una resistencia mejorada a la sequía. También se proporcionan plantas y productos vegetales que se pueden obtener mediante el método de acuerdo con la invención.

Description

MEJORA DE RESISTENCIA A LA SEQUÍA EN PLANTAS: PECTINASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para aumentar la resistencia a la sequía de una planta. El método abarca el deterioro de la expresión de un gen o genes en la planta. En comparación con una planta no manipulada para afectar la expresión de los genes, las plantas exhiben una resistencia mejorada a la sequía. También se proporcionan plantas y productos vegetales que se pueden obtener mediante el método de acuerdo con la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los estreses abióticos, tales como sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo son amenazas para la agricultura y es la causa principal de la pérdida de cultivos a nivel mundial (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14).

En la técnica, están disponibles diversos reportes que abordan el antecedente bioquímico, molecular y genético del estrés abiótico (Wang et al. (2003) Planta 218 (1) 1-14 o Kilian et al (2007) Plant J 50(2)347-363). La modificación a las plantas para abordar el estrés abiótico con frecuencia se basa en la manipulación de genes que protegen y mantienen la función y estructura de los componentes celulares. Sin embargo, debido a respuestas genéticamente complejas a las condiciones del estrés abiótico, estas plantas parecen ser más difíciles de controlar y crear por ingeniería. Wang, ( ang et al. (2003) Planta 218 (1) 1-14), ínter alia, menciona que una de las estrategias para la creación por ingeniería depende del uso de uno o diversos genes que estén ya sea implicados en trayectorias de señalización y reguladoras, o que codifiquen para las enzimas presentes en las trayectorias que conducen a la síntesis de protectores funcionales y estructurales, tales como osmolitos y antioxidantes, o que codifican para proteínas que confieren tolerancia al estrés.

Aunque se han reportado mejoras para proporcionar plantas tolerantes al estrés abiótico, la naturaleza de los mecanismos genéticamente complejos que la fundamentan proporciona una necesidad constante por una mejora adicional en este campo. Por ejemplo, se ha reportado que las plantas tolerantes a la sequía transformadas genéticamente en general, pueden exhibir crecimiento más lento y biomasa reducida (Serrano et al (1999) J. Exp. Bot 50:1023-1036) debido a un desequilibrio en el desarrollo y fisiología, teniendo de esta forma un costo de conveniencia significativa en comparación con las plantas que no se transformaron (Kasuga et al. (1999) Nature Biot. Vol. 17; Danby and Gehring (2005) Trends in Biot. Vol. 23 No. 11).

Se han propuesto diversos procedimientos biotecnológicos para obtener plantas que crezcan bajo condiciones de estrés. Las plantas con una resistencia aumentada al estrés salino, por ejemplo, se describen en la O03/020015. Este documento describen plantas transgénicas que son resistentes al estrés salino al utilizar ácidos nucleicos de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa y polipéptidos .

Las plantas con una tolerancia aumentada a la sequía se describen en, por ejemplo, la US 2009/0144850, la US 2007/0266453 y la WO 2002/083911. La US 2009/0144850 describe una planta que exhibe un fenotipo de tolerancia a la sequía debido a la expresión alterada de un ácido nucleico DR02. La US 2007/0266453 describe una planta que exhibe un fenotipo de tolerancia a la sequía debido a la expresión alterada de un ácido nucleico DR03 y la WO 2002/083911 describe una planta que tiene una tolerancia aumentada al estrés por sequía, debido a una actividad reducida de un transportador de ABC que se expresa en células guardas. Otro ejemplo es el trabajo de Kasuga y co-autores (1999), quienes describen que la sobreexpresión del ADNc que codifica para DREB1A en plantas transgénicas activa la expresión de muchos genes de tolerancia a estrés bajo condiciones normales de crecimiento y da por resultado en una tolerancia mejorada a la sequía, carga salina, y congelamiento. Sin embargo, la impresión de DREB1A también da por resultado en un retardo hospedero del crecimiento bajo condiciones normales de crecimiento (Kasuga (1999) Nat. Biotechnol 17 (3) 287-291) . Sigue habiendo una necesidad por una metodología novedosa, alternativa y/o adicional para aumentar la resistencia al estrés abiótico, en particular, el estrés abiótico similar a la sequía.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos novedosos para aumentar la resistencia a la sequía en una planta. Con esta planta, por ejemplo, es posible producir más biomasa y/o más cultivo y productos vegetales derivados de los mismos si se hacen crecer bajo condiciones de baja disponibilidad de agua/sequía en comparación con las plantas que no se someten al método de acuerdo con la invención.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de la proteína de pectinasa funcional en una planta, protoplasto vegetal o célula vegetal, en donde la proteína de pectinasa funcional comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y opcionalmente regenerar la planta .

La proteína de pectinasa funcional puede ser una proteína que, cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido, da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de la proteína de pectinasa funcional en una planta, célula vegetal o protoplasto vegetal, en donde la proteína de pectinasa funcional está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, y regenerar opcionalmente la planta.

La proteina de pectinasa funcional puede ser una proteina que cuando se expresa en una linea de inserción de T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional.

El paso de afectar la expresión puede comprender mutar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína pectinasa funcional. El paso de mutar la secuencia de ácido nucleico que implica insertar, suprimir y/o sustituir al menos un nucleótido.

El paso de afectar la expresión puede comprender silenciamiento génico.

El método puede comprender afectar la expresión de dos o más proteínas pectinasa funcionales. Este puede comprender además el paso de producir una planta o un producto vegetal proveniente de la planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía.

En otro aspecto, la presente invención pertenece al uso de una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 55% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 0 una secuencia de ácido nucleico que tenga al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 en selección para la resistencia a la sequía en plantas.

Adicionalmente, el uso de una secuencia de aminoácidos de pectinasa que de la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico de pectinasa de la SEC ID NO: 1 en la detección de resistencia a la sequía en plantas de Arabídopsis thaliana, se muestra en la presente.

La invención también se relaciona con el uso de al menos parte de una secuencia de ácido nucleico de pectinasa que tiene la SEC ID NO: 1 o al menos parte de una secuencia de aminoácidos de pectinasa de la SEC ID NO: 2 como un marcador para la propagación de plantas Arabídopsis thaliana resistentes a la sequía.

La invención de acuerdo con además el uso de una proteina pectinasa funcional, como se define en la presente para modular, de preferencia aumentar, la resistencia a la sequía de una planta.

Adicionalmente, la invención pertenece al uso de una planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde se afecta la expresión de la proteína pectinasa funcional, en donde la proteína pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tenga un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tenga un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína pectinasa funcional para el crecimiento, bajo condiciones de estrés por sequía, en donde las condiciones de estrés por sequía provocar, una planta control, una célula vegetal o un producto vegetal en donde no se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional para que muestre señales de estrés por sequía, tales como señales de marchitamiento más temprano que la planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde no se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional.

Por último, la invención proporciona una planta, célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulqare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, en donde se afecta la expresión de la proteina pectinasa funcional, en donde la proteína pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína pectinasa funcional. En una modalidad, la planta, célula vegetal, o producto vegetal comprende un gen de pectinasa endógeno interrumpido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1, muestra los resultados de un experimento típico descrito en los Ejemplos 1 y 2.

La figura 2, muestra el fenotipo resistente a la sequía de pectinasa inactivada (mutante de inserción At5gl9730 en Arabidopsis) en comparación con el fenotipo sensible a la sequía de una planta control (tipo silvestre) .

La figura 3, muestra la supervivencia a la sequía de un mutante de inserción At5gl9730 de Arabidopsis (pectinasa interrumpida) . El mutante de inserción At5gl9730 en Arabidopsis sobrevivió a la sequía significativamente mejor (p <0.05) de las plantas tipo silvestre o los mutantes de inserción At5gl9730 complementados con los homólogos provenientes de Brassica rapa, Solanum lycopersicum u Oryza sativa. Esta figura no sólo demuestra que una mutación de inserción en este gen proporciona un fenotipo resistente a la sequía, aunque también los homólogos de este gen provenientes de especies monocotiledóneas y dicotiledóneas de distinta evolución funcionan para restaurar el fenotipo normal susceptible a la sequía. Las barras grises tienen valores significativamente menores (p <0.05) que las barras negras.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones En la siguiente descripción y ejemplos, se utiliza una serie de términos. Para proporcionar una comprensión clara y consistente de la especificación y reivindicaciones, incluyendo el alcance que se otorgará a estos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan en la presente en su totalidad como referencia.

Los métodos para llevar a cabo las técnicas convencionales utilizadas en los métodos de la invención se harán evidentes para el trabajador experto. La práctica de técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, química computacional , cultivo de células, ADN recombinante, bioinformática, genómica, secuenciación y campos relacionados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se analizarán, por ejemplo, en las siguientes referencias bibliográficas: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; y la serie Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utiliza en su sentido no limitante para dar a entender que se incluyen los puntos que siguen a la palabra, aunque no se excluyen los puntos que no se mencionan específicamente. Esto abarca verbos "que consiste esencialmente de", así como "que consiste de".

En el sentido en el que se utiliza en la presente, las formas singulares "uno", "una" y "el", incluyen referencias al plural a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Por ejemplo, un método para aislar "una" molécula de ADN, en el sentido en el que utilizó anteriormente, incluye aislar una pluralidad de moléculas (por ejemplo, 10, 100, 1000, 10 de miles, 100 de miles, millones, o más moléculas) .

Alineación y alineamiento: Con el término "alineación" y "alineamiento" se debe entender la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos con base en la presencia de tramos cortos o largos de nucleótidos idénticos o similares. Se conocen en la técnica diversos métodos para la alineación de las secuencias de nucleótidos, como se explicará adicionalmente más adelante.

"Expresión de un gen", se refiere al proceso en donde una región de ADN, que está ligado funcionalmente con las regiones reguladoras adecuadas, en particular un promotor, se transfiere en un ARN, que sea biológicamente activo, es decir, que sea capaz de ser traducido en una proteina o péptido biológicamente activo (o fragmento peptidico activo) o que es activo por si mismo (por ejemplo, en el silenciamiento génico pos-transcripcional o ARNi) . Una proteina activa, en ciertas modalidades, se refiere a una proteina que será activa constitutivamente. La secuencia codificante de preferencia en la orientación sentido y codifica una proteina o péptido deseado biológicamente activo o un fragmento de un péptido activo. "Expresión ectópica", se refiere a la expresión en un tejido en el cual no se expresa normalmente el gen.

"Funcional", en relación con las proteínas pectinasa (o variantes, tales como ortólogos o mutantes, y fragmentos) , se refiere a la capacidad del gen y/o la proteina codificada para modificar la tolerancia a la sequía (cuantitativa y/o cualitativa), por ejemplo, al modificar el nivel de expresión del gen (por ejemplo, mediante la sobre-expresión o silenciamiento ) en una planta. Por ejemplo, la funcionalidad de una proteína de pectinasa obtenida de la especie vegetal X se puede probar mediante diversos métodos. De preferencia, si la proteína es funcional, el silenciamiento o interrupción del gen que codifica para la proteína peictinasa en la especie vegetal X, utilizando por ejemplo, vectores de silenciamiento génico, conducirá a una resistencia mejorada a la sequía como se puede probar y como se explica en la presente en detalle. También, el complemento de una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene ur. gen de pectinasa interrumpido con una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de pectinasa funcional da por resultado en una planta en la cual se restaura la resistencia normal a la sequía, es decir la planta complementada tendrá una resistencia a la sequía similar a la planta control. El experto será capaz de probar la funcionalidad de una proteína de pectinasa utilizando métodos rutinarios como se ejemplifica en la presente.

El término "gen" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita) , que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo un ARNm) en una célula, ligado funcionalmente a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor) . De esta forma, un gen puede comprender diversas secuencias ligados funcionalmente, tal como un promotor, una secuencia líder 5' que comprende por ejemplo, las secuencias implicadas en el inicio de traducción, una región codificante (proteínica) (ADNc o ADN genómico) , y una secuencia no traducida 3' (también conocida como la secuencia no traducida 3' o UTR 3' ) que comprende por ejemplo, los sitios de secuencia para terminación de transcripción.

El término "ADNc" significa ADN complementario. Un ADN complementario se produce mediante un ARN de transcripción inversa en una secuencia de ADN complementario. Las secuencias de ADNc de esta forma corresponden a secuencias de ARN que se expresan a partir de genes. Mientras que las secuencias de ARNm cuando se expresan a partir del genoma pueden experimentar eliminación de intrones, es decir, los intrones se eliminan del ARNm y los exones se juntan, antes de ser traducidos en el citoplasma en las proteínas, se entiende que la expresión de un ADNc significa la expresión del ARNm que codifica para el ADNc. La secuencia de ADNc de esta forma puede no ser idéntica a la secuencia de ADN genómico a la cual corresponde mientras que el ADNc puede codificar sólo para el marco de lectura abierto completo, que consiste de los exones unidos, para una proteina, mientras que el ADN genómico codifica los exones entremezclados por secuencias de intrones, que están flanqueados por las secuencias UTR 5' y 3' .

"Identidad" es una medición de la identidad de las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias están alineadas de tal forma que se obtenga la coincidencia de orden mayor. "Identidad", per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando técnicas publicadas. Véase, por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. . , and Griffin, H. G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Mientras que existen una serie de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de pol inucleótidos o polipéptidos , el término "identidad" es bien conocido por los expertos (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073) . Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa, aquellos descritos en GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas computacionales . Los métodos en programas computacionales preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa, el paquete de programas GCS (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1): 387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215: 03) .

Como una ilustración, mediante un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que tenga al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para un polipéptido de una cierta secuencia se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de polipéptidos de referencia. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos con una secuencia del nucleótido de referencia se puede calcular sobre la longitud total de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica con una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede suprimir y/o sustituir con otro nucleótido, y/o una serie de nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, entremezclados ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Similarmente, por un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que tenga al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" con una secuencia de aminoácidos de referencia de la SEC ID NO: 2 se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia de la SEC ID NO: 2. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia se puede calcular sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos a al menos 95¾ idéntica con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede suprimir o sustituir con otro aminoácido, o una serie de aminoácidos hasta el 5% de los residuos totales de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, entremezclados ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede incluir cualquier polímero u ol i gomero de pirimidina y bases de purina, de preferencia citosina, timina, y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (Véase Albert L. Lehninger, Principies of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub . 1982), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para todos los fines) . La presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido, ribonucleótido o componentes de ácido nucleico peptídico, y cualesquiera variantes químicas de los mismos, tales como formas metiladas, hidroximetiladas o glucosiladas de estas bases, y lo semejante. Los polímeros u oligómeros pueden ser heterogéneos u homogéneos en la composición, y se pueden aislar de las fuentes de origen natural o se pueden producir artificial o sintéticamente. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir permanente o transicionalmente en una forma de cadena individual o doble cadena, incluyendo estados homodúplex, heterodúplex e híbridos.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "ligado funcionalmente" se refiere a una ligadura de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "ligado funcionalmente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, o en su lugar una secuencia reguladora de transcripción, está ligado funcionalmente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Ligado funcionalmente significa que las secuencias de ADN que estén ligadas típicamente sean contiguas y, cuando sea necesario unir dos o más regiones codificantes proteínicas, contiguas y en marco de lectura.

"Planta", se refiere a cualquier planta entera o partes de una planta, tales como células, tejidos u órganos (por ejemplo, polen, semillas, gametos, raices, hojas, flores, capullos, anteras, frutos, etc.) que se pueden obtener de la planta, asi como los derivados de cualquiera de estas y la progenie derivada de esta planta mediante autofecundación o cruza. "Célula vegetales" incluyen protoplastos , gametos, cultivos en suspensión, microesporas , granos de polen, etc., ya sea en aislamiento o dentro de un tejido órgano u organismo.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, ubicados en la dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio para inicio de transcripción del gen, y se identifique estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la polimerasa de ARN dependiente de ADN, los sitios para inicio de transcripción y cualesquiera otras secuencias de ADN, incluyendo, de manera enunciativa los sitios de unión al factores de transcripción, los sitios de unión a la proteina represora y activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas por alguien con experiencia en la técnica para que actúen directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Opcionalmente, el término "promotor" incluye en la presente también la región de UTR 5' (región sin traducir 5') (por ejemplo, el promotor en la presente puede incluir una o más partes en la dirección 5' (5')) del codón para inicio de traducción de un gen, ya que esta región puede tener una función para regular la transcripción y/o traducción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de tejidos bajo condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se regula fisiológicamente (por ejemplo, mediante la aplicación externa de ciertos compuestos) o mediante desarrollo. Un promotor "tejido específico" sólo es activo en tipos de tejidos específicos o células. Un "promotor activo en plantas o células de plantas" se refiere a la capacidad general del promotor para conducir la transcripción dentro de una planta o célula vegetal. No importan las implicaciones acerca de la actividad espacio-temporal del promotor.

Los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten de una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, tamaño, estructura tridimensional u origen. Un "fragmento" o "porción" de una proteína de esta forma todavía puede denominarse como una "proteína". Una "proteína aislada" se utiliza para hacer referencia a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula hospedera bacteriana o vegetal recombinante .

"Planta transgénica" o "planta transformada" se refiere en la presente a una planta o célula vegetal que se haya transformado, por ejemplo, mediante la introducción de una mutación no silente en un gen endógeno o parte del mismo. Esta planta se ha modificado genéticamente para introducir, por ejemplo una o más mutaciones, inserciones y/o supresiones en el gen y/o inserciones de una estructura de silenciamiento génico en el genoma. Una célula vegetal transgénica puede hacer referencia a una célula vegetal en aislamiento o en cultivo de tejidos, o a una célula vegetal contenida en una planta o en un órgano o tejido diferenciado, y ambas posibilidades se incluyen específicamente en la presente. Por lo tanto, una referencia a una célula vegetal en la descripción o las reivindicaciones no significa que haga referencia únicamente a células aisladas o protoplastos en cultivo, sino que hace referencia a cualquier célula vegetal, sin importar que pueda ser ubicada o en cualquier tipo de tejido vegetal u órgano pueda estar presente.

El intercambio de nucleótidos dirigido (TNE) es un proceso mediante el cual un oligonucleótido sintético, complementario parcialmente hacia un sitio en un gen cromosómico o uno episómico dirige la inversión de un nucleótido individual en un sitio específico. El TNE se ha descrito utilizando una amplia variedad de oligonucleótidos y blancos. Algunos de los oligonucleótidos reportados son quimeras de ARN/ADN, contienen modificaciones terminales para impartir resistencia a nucleasas.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "estrés por sequía" o "sequía" se refiere a una condición ambiental sub-óptima asociada con una disponibilidad limitada de agua para una planta. La disponibilidad limitada de agua se puede presentar cuando, por ejemplo, está ausente la lluvia o disminuye y/o cuando las plantas se riegan con menos frecuencia de la requerida. La disponibilidad limitada de agua para una planta también se puede presentar cuando, por ejemplo, el agua está presente en el suelo, pero que no se puede extraer deficientemente por la planta. Por ejemplo, cuando hay abonos fuertemente unidos al agua o cuando el agua tiene un alto contenido de sales, puede ser más difícil que la planta extraiga el agua del suelo. Por lo tanto, muchos factores pueden contribuir a dar por resultado en una disponibilidad limitada del agua, es decir, sequía para una planta. El efecto de someter las plantas a "sequía" o "estrés por sequía" puede ser que las plantas no tengan un crecimiento y/o desarrollo óptimos. Las plantas sometidas a sequía pueden tener señales de marchitamiento. Por ejemplo, las plantas se pueden someter a un período de al menos 15 días bajo condiciones controladas especificas donde no se proporcione agua, por ejemplo, sin caída de lluvia y/o riego de las plantas.

El término "resistencia mejorada a la sequía" se refiere a plantas que, cuando se producen con una resistencia mejorada a la sequía, cuando se someten a la sequía o estrés por sequía no muestran efectos ni muestran efectos aliviados según se observa en plantas control no proporcionadas con una resistencia mejorada a la sequía. Una planta normal tiene algún nivel de resistencia a la sequía. Esto se puede determinar fácilmente si una planta ha mejorado la resistencia a la sequía al comparar una planta control con una planta proporcionada con resistencia mejorada a la sequía bajo condiciones controladas seleccionadas de tal forma que en las plantas control se puedan observar señales de sequía después cierto periodo, es decir cuando las plantas se someten a la sequía o estrés por sequía. Las plantas con resistencia mejorada a la sequía mostrarán menos y/o señales reducidas de haber sido sometidas a la sequía, tales como marchitamiento, en comparación con las plantas control. El experto sabe la forma de seleccionar las condiciones adecuadas tales como por ejemplo, las condiciones controladas en los ejemplos. Cuando una planta tiene "resistencia mejorada a la sequía", es capaz de sostener un crecimiento normal y/o desarrollo normal cuando se someten a sequía o estrés por sequía de lo que de otra manera podría haber dado por resultado en un crecimiento reducido y/o desarrollo reducido de plantas normales. Por lo tanto, "la resistencia mejora a la sequía" es un término relativo determinado al comparar plantas, con lo cual la planta con mayor capacidad para sostener un crecimiento (normal) bajo estrés por sequía es una planta con "resistencia mejorada a la sequía". El experto se dará cuenta de la forma de seleccionar las condiciones adecuadas para determinar la resistencia a la sequía de una planta y la forma de medir las señales de sequías, tal como se describen, por ejemplo, en los manuales proporcionados por el IRRI, Breeding rice for drought prone environments, Fischer et al., 2003, and by the CIMMYT, Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize: from theory to practice, Banzinger et al, 2000. Se proporcionan, los ejemplos de métodos para determinar la resistencia mejorada a la sequía en plantas Snow and Tingey, 1985, Plant Physiol, 77, 602-7 y Harb et al., Analysis of drought stress in Arabidopsis, AOP 2010, Plant Physiology Review, y como se describe en la sección de ejemplos más adelante .

La presente invención se relaciona con un método por modular, por ejemplo, mejorar, la resistencia a la sequía de una planta al modificar, por ejemplo, afectar, la expresión de una proteina de pectinasa funcional en la planta, por ejemplo, al utilizar una modificación genética o un intercambio dirigido de nucleotido. La modulación tal como una mejora se relaciona con una planta control en la cual no se modifica, por ejemplo, se afecta la expresión de una proteina de pectinasa funcional. F.n otras palabras, una planta modificada de acuerdo con la invención es, en comparación con la planta no modificada, con mejor capacidad para crecer y sobrevivir bajo condiciones de disponibilidad reducida de agua, privación de agua (temporal) o condiciones de la sequía. Se debe entender que de acuerdo con la invención, modificar, por ejemplo, afectar, la expresión de la proteína pectinasa funcional puede implicar una modificación genética, por ejemplo, la expresión del gen de pectinasa, o un intercambio dirigido a nucleótidos.

En una modalidad, la invención proporciona un método para mejorar la resistencia a la sequía de una planta al afectar la expresión de una proteína de pectinasa funcional en la planta, por ejemplo, al utilizar una modificación genética o un intercambio dirigido a nucleótidos .

La modificación genética incluye introducir mutaciones, inserciones, supresiones en la secuencia de ácido nucleico y/o la inserción de estructuras de silenciamiento génico en un genoma de una planta o célula vegetal que se dirija a la secuencia de ácido nucleico. Modificar genéticamente una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un gen, que codifica para el ARNm puede no estar relacionado únicamente con la modificación con las secuencias de exones correspondientes a la secuencia de ARNm, sino que también puede implicar mutar las secuencias intrónicas del ADN genómico y/o (otras) secuencias reguladoras génicas de esta secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, el gen.

En una modalidad, la proteina de pectinasa funcional puede ser una proteina que, cuando se expresa en una linea de inserción T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido, tal como una linea At5gl9730 interrumpida, por ejemplo, SALK_136556C (http: //www. arabidopsis . org/servlets/SeedSearcher?action=deta il&stock number=SALK_136556C) mencionado en la presente, da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN en Arabidopsis thaliana que tenga un gen pectinasa endógeno interrumpido, por ejemplo, una línea At5gl9730 interrumpida, por ejemplo, SALK_136556C, en la cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional.

El término "gen de pectinasa endógeno interrumpido" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un gen de pectinasa presente naturalmente en el genoma de una planta que está interrumpido, por ejemplo, interrumpido, por ejemplo, por medio de una inserción de T-ADN en el gen de pectinasa. La interrupción del gen de pectinasa endógeno puede dar por resultado en la ausencia de expresión del gen de pectinasa endógeno.

El término "planta control" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a una planta de la misma especie, de preferencia de la misma variedad, de preferencia del mismo antecedente genético. Sin embargo, la modificación introducida en la planta control de preferencia no está presente o introducida en la planta control.

La presente invención, también se relaciona con la modulación de la resistencia a la sequía de una planta al modificar la expresión de la proteína pectinasa funcional en la planta. La modulación es con relación a una planta control (de preferencia una planta del mismo antecedente genético) en la cual no se haya introducido o no esté presente esta modificación.

"Afectar la expresión de una proteína pectinasa funcional" en el sentido en el que se utiliza en la presente, puede significar que se afecta la expresión del gen pectinasa, y/o que la expresión del gen pectinasa es normal, aunque se inhibe o evita la traducción del ARNm resultante (por ejemplo, mediante interferencia del ARN) , y/o que la secuencia de aminoácidos de la proteina de pectinasa se haya alterado de tal forma que se reduzca su actividad especifica de la pectinasa en comparación con la actividad especifica de la proteina de pectinasa que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEC ID NO: 2, de preferencia bajo condiciones fisiológicas, en particular condiciones fisiológicas idénticas. Alternativamente, una proteina de pectinasa se puede tornar menos funcional o no funcional al depurar la proteina utilizando, por ejemplo, un anticuerpo, o un inhibidor de pectinasa. Por ejemplo, se puede expresar simultáneamente un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de pectinasa, reduciendo con esto la actividad específica de la proteína de pectinasa. La frase "afectar la expresión de una proteína de pectinasa funcional" en el sentido en el que se utiliza en la presente, abarca además la depuración de la proteína de pectinasa funcional mediante la expresión aumentada de los inhibidores de pectinasa, por ejemplo, las proteínas que detienen, evitan o reducen la actividad de una proteína de pectinasa. Un ejemplo no limitante de este inhibidor de pectinasa es el gen Atlg48020. Alternativamente, se puede emplear un inhibidor químico de pectinasa, tal como se pueden depurar iones, o metales, o co-factores de pectinasa reduciendo de esta forma su disponibilidad para la actividad de pectinasa. De esta forma, la frase incluye la situación en la cual se expresa una proteina de pectinasa a un nivel normal aunque en la cual la proteina de pectinasa no tenga o tenga una actividad reducida en comparación con la proteina de pectinasa que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 2, ya sea mediante la mutación de la secuencia de aminoácidos o al depurar la proteina de pectinasa (opcionalmente funcional) .

La pectinasa cataliza la des-esterificación de pectina en pectato y metanol. La pectina es uno de los componentes principales de la pared celular de la planta. Se puede considerar la actividad especifica de una proteina de pectinasa "reducida" si la actividad especifica con respecto a la des-esterificación de la pectina de esta pectinasa es estadística y significativamente menor que la actividad específica de la pectinasa como se representa en la SEC ID NO: 2. La actividad específica de una proteína de pectinasa por ejemplo, se puede reducir en al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o más. La expresión reducida del gen de pectinasa endógeno de una planta se puede por ejemplo, llevar a cabo al alterar la secuencia de promotores, por ejemplo, utilizando intercambio de nucleótidos dirigidos.

El experto es capaz de determinar la actividad especifica de la pectinasa. Por ejemplo, la actividad de la enzima PE se puede determinar mediante titulación como se describe por Tucker et al. (Tucker GA, et al. (1982) . J Sci Food Agrie 33 396-400) .

Los inventores de la presente creen que afectar la expresión de la proteina de pectinasa funcional (por ejemplo, al reducir, reprimir o suprimir la expresión y/o actividad) conduce a la ausencia de un nivel reducido de la proteina de pectinasa funcional, ya sea como consecuencia de una baja expresión, por ejemplo, por interferencia de ARN, o como la secuencia de la actividad/funcionalidad disminuida de la proteina de pectinasa, o uno o más de los anteriores, y que la ausencia o nivel reducido de la proteina de pectinasa funcional conduce a una necesidad disminuida de agua o una resistencia mejorada a la sequía de la planta.

La proteína de pectinasa de Arabidopsis thaliana consta de 383 aminoácidos (la secuencia de aminoácidos está representada en la SEC ID NO: 2) . El ADNc derivado del gen del pectinasa de Arabidopsis thaliana comprende 1149 nucleótidos y la secuencia de ácido nucleico de los mismos se representa en la SEC ID NO: 1.

El término "proteína de pectinasa", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a la proteina que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEC ID NO: 2, asi como los fragmentos y variantes de la misma. Las variantes de una proteina de pectinasa incluyen, por ejemplo, proteínas que tengan al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 75¾, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, tal como el 100%, de identidad de la secuencia de aminoácidos, de preferencia con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2. La identidad de secuencia de aminoácidos se determinó por alineamiento por pares utilizando el algoritmo de Needleman and Wunsch y los parámetros por defecto GAP como se definió anteriormente.

En otro aspecto, se proporciona un método para aumentar la resistencia a la sequía de una planta, el método comprende el paso de afectar la expresión en la planta de un gen, que codifica para una proteína de pectinasa.

La "expresión afectada de un gen", de acuerdo con la presente invención, denota la ausencia o la presencia reducida de una proteína de pectinasa funcional. Un experto estará consciente de los muchos mecanismos disponibles para el mismo en la técnica para afectar la expresión de un gen en, por ejemplo, al nivel transcripcional o al nivel traduccional .

La afectación a nivel transcripcional puede ser el resultado de la introducción de una o más mutaciones en las secuencias para regulación de transcripción, entre las que se incluyen las secuencias de promotores, intensificadores, de inicio, de terminación o para eliminación de intrones. Estas secuencias en general están ubicadas en 5' , 3' o dentro de la secuencia codificante de los genes de pectinasa de la invención. Independientemente, o simultáneamente, la afectación de la expresión también se puede proporcionar mediante supresión, sustitución, redisposición o inserción de nucleótidos en la región codificante de los genes.

Por ejemplo, en la región codificante, los nucleótidos se pueden sustituir, insertar o suprimir conduciendo a la introducción de uno, dos o más codones de paro prematuros. También, la inserción, supresión, redisposición o sustitución puede conducir a modificaciones en la secuencia de aminoácidos codificada, y con esto proporcionar una expresión afectada de la proteina de pectinasa funcional. Aún más, se pueden eliminar grandes porciones de los genes, por ejemplo, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso el 100% de la (región codificante) del gen se elimina del ADN presente en la planta, afectando con esto la expresión de la proteina de pectinasa funcional.

Alternativamente, se pueden introducir uno, dos, tres o más nucleótidos en el gen o los genes codificantes para una proteina de pectinasa, ya sea conduciendo a, por ejemplo, un marco de lectura, o conducir a la introducción de una secuencia que codifica para aminoácidos adicionales, o la introducción de una secuencia que no codifica para aminoácidos, o la introducción de grandes insertos, afectando con esto la provisión/expresión de la proteina de pectinasa funcional .

En otras palabras, la supresión, sustitución o inserción de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de pectinasa, como se describió anteriormente, pueden conducir a, por ejemplo, un marco de lectura, una introducción de un codón de paro, o la introducción de un codón sin sentido. En particular, la introducción de un codón de paro y la introducción de una mutación del marco de lectura en general se aceptan como formas eficientes para producir una planta interrumpida, es decir, una planta con una expresión y/o actividad reducida, reprimida o suprimida de una proteina especifica.

Una mutación de marco de lectura (también denominada como un error de enfoque o un desplazamiento de marco de lectura) es una mutación genética provocada por indels (inserciones o supresiones) de una serie de nucleótidos que no se puede dividir uniformemente entre tres en una secuencia de nucleótidos. Debido a la naturaleza de tripletes de la expresión génica por codones, la inserción o supresión puede cambiar el marco de lectura (el agrupamiento de los codones), dando por resultado en una traducción completamente diferente de la original. Entre más pronto se presente en la secuencia la supresión o inserción, más alterada será la proteina producida. Una mutación de marco de lectura, en general, provocará que la lectura de los codones después de la mutación codifique para diferentes aminoácidos, aunque puede haber excepciones que resulten de la redundancia en el código genético. Además, el codón de paro ("UAA", "UGA" o "UAG") en la secuencia original no se leerá, y puede resultar un codón de paro alternativo en un sitio de paro anterior o posterior. La proteína creada puede ser anormalmente corta o anormalmente larga.

La introducción de un codón de paro en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de pectinasa, como se define en la presente, puede dar por resultado en un paro de transcripción prematuro, que en general da por resultado en una proteína de pectinasa truncada, incompleta, y no funcional. De preferencia, el codón de paro se introduce antes en la dirección de transcripción. Entre más pronto se introduzca el codón de paro en la secuencia de nucleótidos, más corta y más alterada será la protelna producida. La introducción de un codón sin sentido en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de pectinasa puede dar por resultado en la transcripción de un ARNm en donde por ejemplo, un codón ya no codifica para el aminoácido como lo hace naturalmente en pectinasa, por ejemplo, un codón que normalmente codifica para un aminoácido que es esencial para una proteina de pectinasa será funcional. Por lo tanto, esta proteina de pectinasa puede no ser funcional.

En otras palabras, la afectación puede comprender la mutación de uno o más nucleótidos en los genes o secuencias de ácido nucleico descritos en la presente, dando por resultado ya sea en la presencia de menos o incluso en la ausencia total del producto de expresión proteinica (es decir, la ausencia de la proteína que se podría obtener cuando no se modificaron los genes de acuerdo con la invención como se describió anteriormente), o en presencia de una proteína no funcional.

Por lo tanto, en una modalidad del método descrito en la presente, la afectación es la consecuencia de una o más mutaciones en el gen de pectinasa dando por resultado en la presencia de menos producto para expresión proteinica o ausencia de un producto para expresión proteinica en comparación con una planta control .

El término inhibición/presencia de menos producto de expresión de la proteina en el sentido en el que se utiliza en la presente se relaciona con una reducción en la expresión proteinica de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 99% en comparación con una planta control, en la cual no se altera la expresión. El término "ausencia de la expresión proteinica" se refiere a la ausencia virtual de cualquier producto de expresión, por ejemplo menos del 5%, 4%, 3%, 2% o incluso menos del 1% en comparación con el control.

Como se entenderá por un experto, también se puede introducir una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para pectinasa, como se define en la presente, mediante la aplicación de compuestos mutagénicos, tales como metansulfonato de etilo (EMS) u otros compuestos capaces de introducir mutaciones (aleatoriamente) en las secuencias de nucleótidos. Los ^compuestos mutagénicos o el otro compuesto se pueden utilizar como un medio para crear plantas que alberguen una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de pectinasa.

Alternativamente, la introducción de una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de pectinasa de acuerdo con la invención se puede efectuar mediante la introducción de ADN de transferencia (T- ADN) en la secuencia de nucleótidos, que codifica para esta proteína, por ejemplo el T-ADN del plásmido inductor de tumores (Ti) de algunas especies de bacterias tales como ñgrobacterium tumefaciens . Se puede introducir un elemento de T-ADN en la secuencia de nucleótidos, conduciendo a ya sea una proteína no funcional o a la ausencia de expresión de la proteína, disminuyendo por consecuencia, la necesidad de agua de una planta obtenida mediante el método de acuerdo con la invención (véase, por ejemplo Krysan et al. 1999 The Plant Cell, Vol 11. 2283-2290). Asimismo, se puede aprovechar el uso de una inserción de un elemento susceptible de transposición (véase, por ejemplo, Kunze et al (1997) Advances in Botanical Research 27 341-370 o Chandlee (1990) Physiologia Planta 79(1) 105-115).

En una modalidad, introducir una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de acuerdo con la invención puede realizarse mediante TNE, por ejemplo como se describe en la WO2007073170. Al aplicar TNE, se pueden alterar nucleótidos específicos en una secuencia de nucleótidos que codifica para pectinasa, con lo cual, por ejemplo, se puede introducir un codón de paro que por ejemplo puede dar por resultado en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína truncada con actividad disminuida o sin actividad.

En otra modalidad, un método se proporciona como se describió anteriormente, en donde la afectación de la expresión de la proteina depectinasa funcional se provoca por la expresión de una proteina no funcional o una prote" 'ina con funcionalidad reducida. Como se explicó anteriormente, un experto no tendrá problemas para determinar la funcionalidad de los genes de acuerdo con la invención. Por ejemplo, puede realizar estudios complementarios, al introducir el gen control, sin ninguna modificación, en una planta en la cual se ha afectado la expresión de una proteina.de acuerdo con la invención y un estudio de resistencia a la sequía.

Alternativamente, puede realizar experimentos análogos a los experimentos descritos en los ejemplos más adelante, y determinar la resistencia a la sequía en una planta en la cual se introdujeron una o más mutaciones en los genes de acuerdo con la invención, por comparación con una planta control/tipo silvestre adecuada.

La afectación también se puede proporcionar al nivel de traducción, por ejemplo, al introducir un codón de paro prematuro o mediante modificaciones pos-traduccionales que influyen, por ejemplo, en el plegado de la proteína.

Independiente del mecanismo, la afectación de acuerdo con la presente invención se indica por la ausencia o presencia reducida de una proteína de pectinasa funcional, incluyendo la presencia de niveles normales de la proteina de pectinasa disfuncional.

Como se explicó anteriormente el término inhibición de la expresión o presencia reducida, en el sentido en el que se utiliza en la presente se relaciona con una reducción en la expresión de la proteina de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 99% en comparación con una planta control, en la cual no se afecta la expresión. El término "ausencia de expresión de la proteina" se refiere a la ausencia virtual de cualquier producto de la expresión, por ejemplo menor del 5%, 4%, 3%, 2% o incluso menor del 1% en comparación con el control.

De acuerdo con otra modalidad, la afectación se provoca por silenciamiento qénico, por ejemplo, interferencia de ARN o silenciamiento de ARN.

Con la ayuda de métodos de bioloqia molecular disponibles fácilmente para el experto, la afectación de los genes también se puede llevar a cabo mediante silenciamiento génico, por ejemplo utilizando técnicas de interferencia de ARN, ARNds u otras técnicas de silenciamiento de expresión (véase, por ejemplo, Kusaba et. al (2004) Current Opinión in Biotechnology 15:139-143, o Preuss and Pikaard (2003) en RNA Interference (RNAi) ~Nuts & Bolts of siRNA Technology (pp.23-36), ©2003 por DNA Press, LLC Editado por: David Engelke, Ph.D.) o, como ya se analizó anteriormente, mediante interrupción .

En otra modalidad preferida, y como ya se analizó anteriormente, es proporcionado un método de acuerdo con la invención en donde la afectación se provoca por inserción, supresión y/o sustitución de al menos un nucleótido. Por ejemplo, 1, 2, 3... 10, 40, 50, 100, 200, 300, 1000, o incluso más nucleótidos se pueden insertar, suprimir o sustituir en los genes de acuerdo con la invención. También se anticipan las combinaciones de inserción, supresión y/o sustitución, en las regiones ya sea codificantes o no codificantes del gen.

En otra modalidad del método descrito en la presente, el método comprende el paso de afectar la expresión en la planta de más de 1, por ejemplo 2, 3, 4, 5, o todos los genes que codifican para una proteina de pectinasa.

En esta modalidad, la expresión de más de un gen como se describió anteriormente, se presenta en una planta particular es afectada. Por ejemplo, se afecta la expresión de uno, dos, tres, cuatro, o todos los genes que codifican para una proteina de pectinasa, según se presenta en una planta. Al afectar la expresión de más genes, como se describió anteriormente, al mismo tiempo (cuando están presentes en una planta) incluso se puede alcanzar una mejorada resistencia a la sequía.

En otra modalidad, la planta proporcionada por el método de acuerdo con la invención, se puede utilizar para la producción de plantas adicionales y/o productos vegetales derivados de las mismas. El término "productos vegetales" se refiere a aquellos materiales que se puede obtener del crecimiento de plantas, e incluyen frutos, hojas, órganos de la planta, grasas de la planta, aceites de la planta, almidón de la planta, fracciones proteínicas de la planta, ya sea triturados, molidos o todavía intactos, mezclados con otros materiales, deshidratados, congelados, etc. En general estos productos vegetales, por ejemplo se pueden reconocer por la presencia de un gen como se describe en la presente tan modificado que se afecta la expresión de una proteína funcional, como se analizó anteriormente.

De preferencia, la expresión y/o actividad de la proteína de pectinasa acuerdo con la invención se afecta (por ejemplo, reduce, reprime o suprime) en una planta que pertenece a la familia Brassicaceae que incluye Brassica napus (semilla de colza) , familia Solanaceae, incluyendo tomate, o familia Cucurbitaceae, incluyendo melón y pepino, o la familia Poaceae incluyendo Oryza, incluyendo arroz, o Zea mays, incluyendo maíz (cereal), o la Fabaceae incluyendo legumbres, guisantes, o frijoles. De preferencia, el método de acuerdo con la invención se aplica en tomates, arroz, maíz, melón, o pepino, mejorando con esto una planta con menor necesidad de agua o una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control correspondiente.

También se proporciona una planta, célula vegetal o producto vegetal derivados del mismo, que se pueda obtener mediante el método de acuerdo con la invención, y en donde la planta, célula vegetal o producto vegetal muestra una expresión reducida de la proteína de pectinasa funcional, en comparación con una planta control no sometida al método de acuerdo con la invención.

También se proporciona una planta, célula vegetal o producto vegetal derivados del mismo, caracterizado porque en la planta, célula vegetal o producto vegetal derivados del mismo, la expresión de al menos uno, de preferencia todos los genes que codifican a la proteína de pectinasa, tales como aquellos en donde la secuencia de ADNc correspondiente a la secuencia de ARNm transcrito de al menos un gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, y las secuencias de ADNc con más de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 y/o donde la secuencia de aminoácidos codificada por al menos un gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, o se afecta una variante del mismo. De preferencia, la planta no es el mutante Arabidopsis thaliana como se describe en los ejemplos más adelante, o un mutante para inserción de T-ADN de Brachypodium.

En otro aspecto, la invención se dirige al uso de un gen en donde la secuencia de ADNc correspondiente a la secuencia de ARNm transcrita desde el gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, y la secuencia de ADNc con más de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con las mismas y/o en donde la secuencia de aminoácidos codificada por el gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y las secuencias de aminoácidos con más del 40¾, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con las mismas, para proporcionar una resistencia aumentada a la sequía a una planta.

En esta modalidad, el gen descrito se puede utilizar como un blanco para mejorar la resistencia a la sequía en una planta, de acuerdo con la descripción en la presente, o el gen se puede utilizar para identificar nuevas proteínas implicadas en la sensibilidad y resistencia a la sequía.

En otra modalidad, se proporciona el uso de una secuencia fe pectinasa que tenga la SEC ID NO: 1 ó 2 de la especie Arabidopsis thaliana en la selección de la resistencia a la sequía en plantas Arabidopsis thaliana .

Además, se proporciona el uso en donde la secuencia de pectinasa es una secuencia análoga con la SEC ID NO. 1 ó 2 de otra especie de plantas y en donde la selección se realiza en plantas de otra especie vegetal. Además, se proporciona un método para seleccionar plantas o células vegetales con resistencia mejorada a la sequía que comprende los pasos de: proporcionar una población heterogénica de células vegetales o plantas de la especie Arabidopsis thaliana ; - proporcionar una secuencia de pectinasa que tenga la SEC ID NO: 1 ó 2; determinar la secuencia de al menos parte del gen de pectinasa de las células vegetales o plantas; comparar las secuencias de pectinasa determinadas a partir de las células vegetales o plantas con la secuencia de pectinasa proporcionada; identificar las células vegetales o plantas en donde la secuencia de pectinasa comprende una mutación.

Alternativamente, en el método, las células vegetales o plantas que se proporcionan son de una especie distinta, y en donde la secuencia de genes de pectinasa que se proporciona es una secuencia análoga de la otra especie.

Por lo tanto, al utilizar la secuencia de pectinasa de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2 de la especie Arabidopsis thaliana, o una secuencia análoga de la misma proveniente de otra especie, las secuencias de pectinasa mutadas se pueden identificar en la especie vegetal que puede proporcionar una resistencia mejorada a la sequía. Una secuencia análoga, en otra especie, de la secuencia de pectinasa de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2 de la especie Arabidopsis thaliana se define como una secuencia que tiene al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o al menos 99%, de identidad de secuencia con la misma. La proteína de pectinasa análoga puede tener sustancialmente la misma función que la SEC ID NO: 1 ó 2. Secuencias análogas se representan como las SEC ID NOs : 3-10 en el listado de secuencias y se derivan de Brassica rapa, Solanum lycopersicum y Oryza sativa, respectivamente. Sus identidades de secuencia en comparación con la SEC ID NO: 2 se establecen en la Tabla 2 más adelante.

En el método, se proporciona una población heterogénica de células vegetales o plantas de la especie. La población heterogénica, por ejemplo, se puede proporcionar al someter células vegetales a un mutante que introduzca mutaciones aleatorias proporcionando con esto una población he erogénica de células vegetales. Por lo tanto, la población heterogénica se puede derivar de una sola variedad de plantas, que se somete a mutagénesis aleatoria para obtener una variedad de mutaciones en la progenie proporcionando con esto una población heterogénica . Se conocen en la técnica muchos mutágenos, por ejemplo radiación iónica, radiación UV, y productos químicos mutagénicos, tales como azidas, bromuro de etidio o metansulfonato de etilo (EMS) . Por lo tanto, el experto sabe la forma de proporcionar una población heterogénica de plantas o células vegetales. También el experto puede proporcionar una variedad de plantas como una población heterogénica, es decir, no una variedad individual proveniente de una especie. Una variedad de plantas muestran variedad genética, no son genéticamente idénticas, pero provocan que las plantas que provienen de la misma especie sean sustancialmente idénticas. En cualquier caso, una población heterogénica de células vegetales o plantas puede tener al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99%, 99.5% o al menos el 99.9% de identidad de secuencia.

Al determinar al menos parte de la secuencia de la secuencia de genes de pectinasa con la secuencia de las plantas o células vegetales provenientes de la población heterogénica, y posteriormente comparar estas secuencias con la secuencia de genes de pectinasa proporcionada (la referencia) , se pueden identificar que las células vegetales o plantas comprenden una mutación en la secuencia del gen de pectinasa. Se debe entender que esta comparación se puede realizar mediante el alineamiento de las secuencias y que una mutación es una diferencia con respeto al menos un ácido nucleico o una posición del aminoácido en la secuencia de pectinasa análoga (de referencia) de la especie vegetal. De esta forma, las plantas o células vegetales se identifica que tienen mutaciones en el gen de pectinasa (por ejemplo, inserciones, supresiones, sustituciones) que puedan proporcionar una resistencia mejorada a la sequía.

De preferencia, se seleccionan plantas que tengan mutaciones que podrían dar por resultado en una afectación de la expresión de una proteína de pectinasa funcional, tal como ya se señaló anteriormente. Las mutaciones que podrían afectar la expresión de una proteína de pectinasa funcional pueden ser mutaciones que podrían interrumpir el marco de lectura abierto (introducir un marco de lectura o un codón de paro) o interrumpir o de otra manera alterar la función de la proteína codificada al alterar los nucleótidos en los codones que codifican para los aminoácidos que son esenciales para un funcionamiento adecuado de la proteína, conduciendo con esto a una resistencia modificada (por ejemplo, aumentada) a la sequía, en comparación con la proteína no alterada. El método también se puede utilizar, por ejemplo en la investigación y selección de plantas que se hayan sometido a modificación genética que se dirige a la secuencia del gen de pectinasa como se señaló anteriormente. También, la secuencia de pectinasa se puede utilizar en un ensayo de selección, en el cual una población (heterogénica) de plantas se somete a la sequía .

En otra modalidad, se proporciona el uso de al menos parte de una secuencia de pectinasa que tenga la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2 de la especie Arabidopsis thaliana como un marcador para sembrar plantas Arabidopsis thaliana resistentes a la sequía. También, la secuencia de pectinasa puede ser de una secuencia análoga de otra especie en donde el marcador es para sembrar plantas resistentes a la sequía de la otra especie de planta.

La invención además pertenece al uso de una planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional, en donde la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tenga un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional para crecimiento bajo condiciones de estrés por sequía, en donde las condiciones de sequía provocan una planta control, una célula vegetal o un producto vegetal en donde no se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional para que muestre signos de estrés por sequía, tales como señales de marchitamiento antes de la planta, célula vegetal o producto vegetal en donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional.

En un aspecto, la presente invención pertenece a una planta, célula vegetal o producto vegetal que se puede obtener o se obtiene mediante el método mostrado en la presente. Adicionalmente, la invención proporciona una semilla derivada de esta planta.

La invención también se relaciona con una planta, célula vegetal, o producto vegetal en donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional, en donde la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional. La planta, célula vegetal o producto vegetal, por ejemplo, puede comprender un gen de pectinasa endógeno interrumpido.

La planta, célula vegetal o producto vegetal puede ser cualquier planta o célula vegetal, o se puede derivar de cualquier planta, tal como plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, aunque de mayor preferencia la planta pertenece a la familia Solanaceae. Por ejemplo, la planta puede pertenecer al género Solanum (incluyendo lycopersicum) , Nicotiana, Capsicum, Petunia y otros géneros. Se pueden utilizar adecuadamente las siguientes especies hospederas: Tabaco (especies Nicotiana, por ejemplo, N. benthamiana , N. plumbaginifolia r N. tabacum, etc.), especies vegetales, tales como tomate (Solanum lycopersicum) , tales como por ejemplo, tomate cherry, var. cerasiforme o tomate grosella, var. pimpinellifolium) o árbol de tomate (S. betaceumr syn. Cyphomandra betaceae) , papa (Solanum tuberosum) , berenjena (Solanum melongena) , pepino (Solanum muricatum) Cocona (Solanum sessiliflorum) y naranjilla (Solanum quitoense) , pimientos (Capsicum annuumf Capsicum frutescens, Capsicum baccatum) , especies ornamentales (por ejemplo, Petunia hybrída Petunia axillaries, P. integrifolia) .

Alternativamente, la planta puede pertenecer a cualquier otra familia, tal como a la Cucubitaceae o Gramineae. Las plantas hospederas adecuadas incluyen, por ejemplo, maiz/cereal (especie Zea), trigo (especie Triticum) , cebada (por ejemplo, Hordeum vulgare) , avena (por ejemplo, Avena sativa), sorgo (Sorghum bicolor) , centeno (Sécale cereale) , soya (Glycine spp, por ejemplo, G. max) , algodón (especie Gossypium, por ejemplo, G. hirsutum, G. barbadense) , Brassica spp. (por ejemplo, B. napus, B. júncea, B. olerácea, B. rapa, etc.), girasol {Helianthus annus) , cártamo, ñame, mandioca, alfalfa {Medicago sativa) , arroz (especie Oryza, por ejemplo, O. sativa indica grupo cultivar o japónica grupo cultivar), pastos para forraje, mijo {Pennisetum spp. por ejemplo, P. glaucum) , especies arbóreas (Pinus, poplar, fir, plantain, etc.), té, café, aceite de palma, coco, especies vegetable, tales como, guisantes, calabacín, frijoles (por ejemplo, especie Phaseolus) , pepino, alcachofa, espárrago, brócoli, ajo, puerro, lechuga, cebolla, rábano, nabo, coles de Bruselas, zanahoria, coliflor, achicoria, apio, espinaca, endivia, hinojo, remolacha, plantas de frutos frescos (uva, duraznos, ciruelas, fresa, mango, manzana, ciruela, cereza, albariceque, plátano, mora, mora azul, cítricos, kiwi, higos, limón, · lima, nectarinas, frambuesa, sandía, naranja, pomelo, etc.), especies ornamentales (por ejemplo, Rosa, Petunia, Crisantemo, Lily, especie Gerjbera) , hierbas (menta, perejil, albahaca, tomillo, etc.), árboles madereros (por ejemplo, especies de Populus, Salix, Quercus, Eucalyptus) , especies de fibra por ejemplo, lino {Linum usitatissimum) y cáñamo {Cannabis sativa), u organisos modelo, tales como Arabidopsis thaliana .

Los hospederos preferidos son "plantas de cultivo", es decir, las especies de plantas que se cultivan y se reproducen por seres humanos. Una planta de cultivo se puede cultivar para fines de alimentación (por ejemplo, campos de cultivos), o para fines ornamentales (por ejemplo, la producción de flores para corte, pastos de césped, etc.). Una planta de cultivo, como se define en la presente también incluye plantas de las cuales se recolectan productos no alimenticios, tales como, aceite para combustible, polímeros plásticos, productos farmacéuticos, corcho y lo semejante.

De preferencia, la planta, la célula vegetal o el producto vegetal de la invención no es una planta, célula vegetal o producto vegetal de Arabidopsis thaliana o Brachypodi um .

La planta, célula vegetal o producto vegetal de la invención por ejemplo puede ser una planta célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum o Brassica rapa.

Por ejemplo, la presente invención, se relaciona a una planta, célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp . , Hordeum vulqare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, en donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional, en donde la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional. La planta, célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum sp . , Hordeum vulgare. , Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus pueden comprender un gen de pectinasa endógeno interrumpido.

Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan en la misma como referencia en su totalidad.

E emplos Ejemplo 1 Prueba de la sequía Semillas de Arabidopsis thaliana (At) transformadas con el vector Agrobacterium tumefaciens de pR0K2, que conduce a la ausencia de la proteína de pectinasa funcional (NASC ID: N664100, código AGI AT5gl9730 y SALK_136556C; en lo sucesivo denominado como semillas mutantes o plantas mutantes) se obtuvieron de Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC, School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD Reino Unido) . Como control se utilizaron At Col-0 (Columbia, N60000) ; en lo sucesivo, denominado como semilla o planta control).

Medio de crecimiento: Se utilizó una mezcla de suelos que comprende una parte de arena y vermiculita y dos partes de composta ( arena : ermiculita : composta = 1:1:2) . Esta mezcla aumenta la percolación de agua, y por lo tanto, facilita una absorción uniforme de agua por cada maceta y un mejor drenaje del agua. Antes de la siembra, las semillas se mantuvieron a 4°C durante 3 días bajo la oscuridad y condiciones de humedad para estratificación.

Las semillas tanto mutantes como control se sembraron en una bandeja rectangular que contiene 8 x 5 = 40 macetas de ~4 cm de diámetro con densidad de 5 plantas por maceta. Se suministró una solución de nutrientes (EC = 1.5) a todas las plantas desde el fondo de las macetas en la bandeja 10 días después de la germinación (DAG) , y a 15 DAG las plantas se sometieron a la sequía (durante 15, 16, 17 ó 18 días) al transferir las macetas a bandejas secas. Posteriormente, las plantas se rehidrataron y se observaron para recuperación después de 1 semana.

Se incluyeron tres replicados de macetas de cada genotipo en la selección pre-sequía. El tiempo total necesario para una prueba completa fue de aproximadamente 36-39 días.

Examen para el análisis de sequía Una vez que las plantas alcanzaron la fase de 2 hojas verdaderas, las mismas se hicieron poco tupidas para mantener exactamente 5 plantas por maceta. A 10 DAG, las plantas recibieron nutrición (EC = 1.5) y a 15 DAG cada maceta se movió a una bandeja seca. Desde este día en adelante, las plantas no recibieron agua. Cada día las plantas, en especial las control (o tipo silvestre) (Col-0) se observaron para señales de marchitamiento. En el día 15 de sequía (DOD) , Col-0 se marchitaron totalmente y no se recuperaron con la rehidratació . Se determinó este día como su punto de marchitamiento permanente (PWP) . Desde este día en adelante, se rehidrató un replicado proveniente del mutante y se observó para señales de recuperación y se tomaron fotografías. El mutante mostró una supervivencia durante al menos 2 días más bajo sequía en comparación con el control y se sometió a selección rigurosa adicional.

Ejemplo 2 Prueba de sequía Medio de crecimiento: El mismo mutante y las plantas control como en el Ejemplo 1 se hicieron crecer en una bandeja similar preparada como se describió anteriormente en la prueba de pre- selección. Las plantas se sometieron a estrés al privarlas de agua desde 15 DAG hasta que el control alcanzó su P P. Durante este período, cada tercer día las macetas se movieron dentro de las bandejas para reducir los efectos de la posición y permitir una evaporación uniforme. En el día 15 DOD, las plantas control alcanzaron el PWP y no se recuperaron con la rehidratación . Un replicado de la macera proveniente del mutante se rehidrató cada día desde 15 DOD en adelante y se verificó para recuperación o detención por sequía. Se tomaron fotografías y se marco la recuperación. El mutante mostró una recuperación del estrés por sequía durante al menos 3 días más después de que el control alcanzó su PWP.

La figura 1, muestra una fotografía que compara el mutante y el control, demostrando el efecto superior del mutante con respecto a la resistencia al estrés por sequía en comparación con el control.

Ejemplo 3 Prueba de sequía Materiales y métodos Material vegetal. Se obtuvo una línea de inserción de TADN con un gen AT5G19730 (pectinasa) interrumpido (SALK_136556C) a partir del Centro de Reserva de Arabidopsis Stock Nottingham Arabidopsis (NASC) . Las líneas de complementación se produjeron mediante la transformación estable de plantas Arabidopsis thaliana utilizando transformación por solución química floral (Bent et al., 2006. Methods Mol. Biol. Vol. 343:87-103). Los homólogos del gen de pectinasa de Arabidopsis thaliana (AT5G19730) se identificaron a partir de diversas especies de cultivo, incluyendo Brassica rapa (col), Solanum lycopersicum (tomate) y Oryza sativa (arroz) y la especie modelo Arabidopsis thaliana .

Tabla 2 Porcentaje de identidad de la secuencia de ácido nucleico entre la secuencia de ADNc de pectinasa de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO: 1) y secuencias de ADNc de los homólogos en Brassica rapa (Br81413; SEC ID NO: 3) , Solanum lycopersicum (Slg24530; SEC ID NO: 5), y Oryza sativa (Os01g53990_l y Os01g53990_2 SEC ID NO: 7 y 9, respectivamente) (primera columna) ; y el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido entre la secuencia de la proteina de pectinasa de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO: 2) y las secuencias proteinicas de los homólogos en Brassica rapa (Br81413; SEC ID NO: 4), Solanum lycopersicum (Slg24530; SEC ID NO: 6), y Oryza sativa (Os01g53990 1 y Os01g53990 2; SEC ID Análisis de la sequía. Se sembraron lineas interrumpidas y de complementación de TADN, tipo silvestre en un diseño de bloque replicado en bandejas de sembrado de 50 células que contuvieron una mezcla 2:1:1 de medio sin tierra Metro-Mix 852, arena fina y vermiculita. Las bandejas plantadas se colocaron a 4°C durante tres días para interrumpir la latencia y luego se transfirieron a una cámara de crecimiento (16 h, 22/20°C, 50% rH) para germinación y establecimiento. Las lineas de complementación se rociaron con una formulación glufosinato (20 mg de glufosinato, 20 pL de tensioactivo Silwet, 200 mL de agua) una vez que las cotiledóneas se expandieron totalmente para asegurar que se seleccionaran sólo las lineas transformadas. Después de este tratamiento, las plántulas en cada celda se redujeron a una sola planta. Una vez que las plantas alcanzaron la fase de 4-6 hojas verdaderas se aclimataron a condiciones de mayor déficit de presión por vapor para estimular el estrés por sequía uniforme (28/26°C, 25% rH) e inusualmente las plantas pequeñas se identificaron para retiro antes del tratamiento de sequía. Las bandejas de plantación se empaparon con agua y luego se dejaron secar, dejando todas las células a la capacidad de maceta. Las bandejas enteras se humedecieron una vez que la mitad de las plantas tipo silvestre en cualquier bandejas determinada parecieron estar a su punto de marchitamiento permanente (1.5-2 semanas de tratamiento de sequía) . Se dejó que las plantas se recuperarán durante unos cuantos días y se registró la supervivencia, con las plantas pequeñas anormalmente pre-identificadas omitidas de los análisis adicionales.

Análisis estadístico. Se evaluó la significancia estadística de las diferentes probabilidades de supervivencia durante este tratamiento de sequía al aplicar la prueba de proporciones iguales o proporcionadas en el programa de software estadístico, R (http://www.r-project.org/). Se utilizó la función prop.test para probar la hipótesis nula de que fueron iguales las proporciones de supervivencia de las plantas entre el mutante y tipo silvestre (unilateral), o alternativamente, entre las líneas de mutantes de inserción que contienen o no contienen transgenes complementarios (bilateral) .

Resul tados La figura 2 muestra el fenotipo resistente a sequía (At5gl9730 KO) contra el fenotipo sensible a la sequía (tipo silvestre) . La figura 3, muestra la supervivencia a la sequía de un mutante de inserción At5gl9730 de Arabidopsis (pectinasa interrumpida) . El mutante de inserción At5gl9730 de Arabidopsis sobrevivió a la sequía significativamente mejor (p <0.05) que las plantas tipo silvestre o los mutantes de inserción At5gl9730 complementados con los homólogos provenientes de Brassica rapa ("transgen Br81413") , Solanum lycopersicum ("trangén Slg24530") u Oryza sativa ("transgen Os01g53990_l" y "transgen Os01g53990_2") . Esta figura demuestra no sólo que una mutación de inserción en este gen proporciona un fenotipo resistente a la sequía, pero también los homólogos de este gen provenientes de especies de monocotiledóneas (Oriza sativa) y dicotiledóneas (Arabidopsis thaliana r Brassica rapa r Solanum lycopersicum) de distinta evolución funcionan para restaurar el fenotipo normal susceptible a la sequía. Las barras grises tienen valores significativamente menores (p <0.05) que las barras negras.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un método para producir una planta que tiene resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión de la proteína de pectinasa funcional en una planta, protoplasto vegetal o célula vegetal, en donde la proteína de pectinasa funcional comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y opcionalmente regenerar la planta.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógena interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional.

3. Un método para producir una planta que tiene resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión de la proteína de pectinasa funcional en una planta, protoplasto vegetal o célula vegetal, en donde la proteína de pectinasa funcional está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, y opcionalmente regenerar la planta.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de ñrabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el paso de afectar la expresión comprende mutar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de pectinasa funcional.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mutación de la secuencia de ácido nucleico implica una inserción, una supresión y/o una sustitución de al menos un nucleótido.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el paso de afectar la expresión comprende silenciamiento génico.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el método comprende afectar la expresión de dos o más proteínas de pectinasa funcionales.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado además porque comprende el paso de producir una planta o un producto vegetal proveniente de la planta que tenga resistencia mejorada a la sequía.

10. El uso de una secuencia de aminoácidos que tiene de al menos 55% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 en la selección para resistencia a la sequía en plantas.

11. El uso de una secuencia de aminoácidos de pectinasa que tiene la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico de pectinasa de la SEC ID NO: 1 en la selección para resistencia a la sequía en plantas de Arabídopsis thalíana.

12. El uso de al menos parte de una secuencia de ácido nucleico de pectinasa que tiene la SEC ID NO: 1 o al menos parte de una secuencia de aminoácidos de pectinasa de la SEC ID NO: 2 como un marcador para la propagación de plantas de Arabidopsis thaliana resistentes a la sequía.

13. El uso de una proteína de pectinasa funcional, de conformidad como cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para modular de preferencia aumentar, la resistencia a la sequía de una planta.

14. El uso de una planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional, en donde la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional para crecimiento bajo condiciones de estrés por sequía, en donde las condiciones de estrés por sequía provocan una planta control, célula vegetal o producto vegetal en donde no se afecta la expresión de la proteina de pectinasa funcional para mostrar señales de estrés por sequía, tales como señales de marchitamiento más temprano que la planta, célula vegetal o producto vegetal donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional.

15. Una planta, célula vegetal, o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp . , Hordeum vulgare., Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, en donde se afecta la expresión de la proteína de pectinasa funcional, en donde la proteína de pectinasa funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de ñrabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de ñrabidopsis thaliana que tiene un gen de pectinasa endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína de pectinasa funcional.

16. Una planta, célula vegetal, o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulgare., Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, de conformidad con la reivindicación 15, que comprende un gen de pectinasa endógeno interrumpido.