MX2014005923A - Metodo para el diagnostico de enfermedad de niemann-pick. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto.

Description

MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD DE NIEMANN-PICK Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, un método para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, de enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B o de enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto, un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, a un método para determinar la efectividad de un compuesto para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick, al uso de análisis de espectrometría de masa para la detección de un biomarcador, al uso de un biomarcador para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, el uso de una proporción de un nivel de biomarcador presente en una muestra del sujeto, al nivel de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto para utilizarse en un método para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, y a un equipo para determinar la presencia de un biomarcador en la muestra de un sujeto.

Antecedentes de la Invención Las enfermedades del almacenamiento lisosomal también referidas en la presente invención como trastornos de almacenamiento lisosomal o LSDs, son un grupo de trastornos metabólicos heredados raros que resultan de defectos en la función lisosomal. Los LSDs resultan cuando funciona mal un organelo específico en las células del cuerpo - el lisosoma -. Alguna de las enfermedades de almacenamiento lisosomal más prominentes son enfermedad de Gaucher y enfermedad de Fabry .

Los LSDs son originados por disfunción lisosomal usualmente como una consecuencia de deficiencia de una enzima individual requerida para el metabolismo de lipidos, glucoproteínas o los llamados, mucopolisacáridos. Individualmente, los LSDs ocurren con frecuencias desde aproximadamente 1:10,000 hasta aproximadamente 1:250,000, sin embargo, como un grupo, la incidencia es de aproximadamente 1:5,000. La mayor parte de estos trastornos son heredados recesivamente en forma autosomal; sin embargo, algunos son heredados, enlazados por X, tal como enfermedad de Fabry y síndrome de Hunter (MPS II).

Igual que otras enfermedades genéticas, los individuos normalmente heredan enfermedades de almacenamiento lisosomal de sus parientes. Aunque cada trastorno resulta de diferentes mutaciones genéticas que se traducen en una deficiencia en actividad enzimática, todas comparten una característica bioquímica común - casi todos los trastornos lisosomales se originan de una acumulación anormal de sustancias dentro del lisosoma.

Las enfermedades de almacenamiento lisosomal afectan la mayor parte de los niños, y con frecuencia mueren jóvenes y en una edad no predecible, muchos, a los pocos meses o años después del nacimiento. Muchos de otros niños mueren de esta enfermedad después de años de padecer de varios síntomas de su trastorno en particular.

Los síntomas de enfermedad de almacenamiento lisosomal varían, dependiendo del trastorno particular y otras variables tipo edad de generación, y pueden ser de leves a severos. Pueden incluir un retraso en el desarrollo, trastorno de movimientos, convulsiones, demencias, sordera y/o ceguera. Algunas personas con enfermedad de almacenamiento lisosomal tienen hígados agrandados (hepatomegalia) y bazos agrandados (esplenomegalia), problemas pulmonares y cardiacos, y huesos que se desarrollan en forma anormal.

No existen curas para las enfermedades de almacenamiento lisosomal, y el tratamiento normalmente es sintomático, aunque se ha utilizado con buen éxito trasplante de médula ósea y terapia de reemplazo de enzimas (ERT) para algunas indicaciones. Además, el trasplante de sangre de cordón umbilical está siendo llevado a cabo en centros especializados para una cantidad de estas enfermedades. Además, actualmente está siendo evaluada para algunas de estas enfermedades la terapia de reducción de substrato (SRT), un método utilizado para disminuir la acumulación de material de almacenamiento. Además, la terapia de chaperón, una técnica utilizada para estabilizar las enzimas defectuosas producidas por los pacientes, está siendo revisada para ciertos de estos trastornos. La terapia genética constituye una opción adicional para el tratamiento de estas enfermedades.

La enfermedad de Niemann-Pick es una enfermedad de un subgrupo de LSDs, llamado esfingolipidosis, o trastornos de almacenamiento de lípidos, en los cuales se acumulan cantidades peligrosas de sustancias grasas, o lípidos en el bazo, hígado, pulmones, médula ósea, y cerebro.

La enfermedad de Niemann-Pick se hereda en un patrón recesivo autosomal, lo cual significa que tanto las copias, o alelos, del gen deben ser mutadas (alteradas de tal forma que se dañe la función, en contraste con un polimorfismo, en donde la secuencia de nucleótido se altera pero no origina interrupción funcional), para una persona que se ve afectada por el trastorno. Con la mayor la frecuencia los padres de un niño con un trastorno recesivo autosomal no se ven afectados pero son portadores de una copia del gen alterado.

En 1961, se introdujeron las siguientes clasificaciones: Enfermedad de Niemann-Pick tipo A: infantil clásica; Enfermedad de Niemann-Pick tipo B: visceral; Enfermedad de Niemann-Pick, tipo C: subaguda/juvenil; y Enfermedad de Niemann-Pick tipo D: Nueva Escocia.

Ahora que las genéticas son mejor comprendidas, la condición se puede clasificar como se indica a continuación: Enfermedad de Niemann-Pick, SMPD1 -asociada con, que incluye los tipos A y B; y Enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, que incluye los tipos C1 y C2 y enfermedad de Niemann-Pick, tipo D, que es originada por el mismo gen que el tipo C1.

Las mutaciones en el gen SMPD1 originan los tipos A y B de la enfermedad de Niemann-Pick, y las mutaciones en NPC1 y NPC2 originan el tipo C de la enfermedad de Niemann-Pick, que también es referido en la presente invención como NPC.

El tipo D fue separado originalmente del tipo C para delinear un grupo de pacientes con trastornos de otra manera idénticos, quienes comparten un ancestro de Nueva Escocia común. Los pacientes en este grupo ahora son conocidos por compartir una mutación específica en el gen NPC 1, y ahora NPC se utiliza para abarcar ambos grupos.

En la variante tipo A infantil clásica, una mutación missense origina una deficiencia completa de la esfingomielinasa. La esfingomielina es un componente de la membrana celular incluyendo la membrana organelar y por lo tanto la deficiencia de la enzima bloquea la degradación del lípido, dando como resultado la acumulación de esfingomielina dentro de lisosomas en el linaje de fagocito de macrófago-monocito. Las células afectadas se vuelven grandes, algunas veces de hasta 90 micrómetros de diámetro, secundarias a la distención de lisosomas con esfingomielina y colesterol. La histología demuestra macrófagos de la escalera de lípidos en la médula, así como "histiocitos azul océano" en patología. Se crean numerosos vacudos pequeños de tamaño relativamente uniforme, que imparten una apariencia espumosa al citoplasma.

La enfermedad de Niemann-Pick tipo C es una enfermedad de almacenamiento lisosomal asociada con mutaciones en los genes NPC1 y NPC2. La enfermedad de Niemann-Pick Tipo C impacta a un estimado de 1:150,000 personas. Aproximadamente el 50% de los casos se presentan antes de los 10 años de edad, aunque las manifestaciones pueden ser reconocidas por primera vez, tan tarde como en la sexta década .

Hasta la fecha solamente se puede elaborar un diagnóstico definitivo de una enfermedad de Niemann-Pick tipo C ensayando fibroblastos cultivados para esterificación de colesterol y manchando para colesterol no esterificado con filipina. Los fibroblastos se crecen a partir de una biopsia de piel pequeña tomada de un paciente con enfermedad de Niemann-Pick tipo C en sospecha, junto con la confirmación genética. Ya que numerosas y diferentes mutaciones pueden ser el origen de una enfermedad de almacenamiento lisosomal particular, la secuenciación de los genes NPC1 o NPC2 se aplica en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, con el objeto de confirmar el diagnóstico.

Aunque existen intentos de aplicar métodos de diagnóstico con base en anormalidades bioquímicas asociadas, existe una necesidad no cumplida para una prueba bioquímica simple que exhibe detección altamente específica y altamente sensible de la enfermedad de almacenamiento lisosomal en una edad temprana, que monitorea el progreso de la enfermedad y monitorea en forma temprana la eficacia de las terapias aplicadas.

Por consiguiente, la identificación de biomarcadores para la detección temprana y diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, la enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B y/o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C mantiene una gran promesa en mejorar el resultado clínico de los pacientes. Es especialmente importante que los pacientes con síntomas vagos o sin síntomas, o detectar pacientes que fallan en responder a una terapia.

Un biomarcador debe ser técnicamente factible en muchas opciones, fácil de medir; útil, con una magnitud consistente, relativa entre personas afectadas y controles, o tratados y no tratados; confiable, y clínicamente preciso, y clasificable como fuertemente predictivo o de pronóstico.

Actualmente, no está disponible un marcador para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente para el diagnóstico diferencial de enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

En enfermedad de Gaucher, otra LSD, algunas enzimas lisosomales, utilizadas como biomarcadores indirectos se encontraron elevadas, incluyendo fosfatasa de ácido resistente a tartrato, hexosaminidasa, y una quitinasa humana, quitotriosidasa. Por lo tanto, existen intentos de monitorear la reducción de células de almacenamiento en tejidos a través de la medición de dichos marcadores sustitutos de las células de Gaucher tipo quitotriosidasa y CCL18 (CE. Hollak et al. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease (Elevación marcada de actividad de quitotriosidasa de plasma. Característica novedosa de enfermedad de Gaucher), J. Clin. Invest. 93 (1994) 1288-1292; R.G. Boot et al. Marked elevation of the chemokine CCL18/PARC in Gaucher disease: a novel surrogate marker for assessing terapeutic intervention (Elevación marcada de quimiocina CCL18/PARC en enfermedad de Gaucher: marcador sustituto novedoso para evaluar la intervención terapéutica), Blood 103 (2004) 33-39). Sin embargo, además de otras desventajas en el uso de la quitotriosidasa como un biomarcador para enfermedad de Gaucher, la enzima se acumula en forma independiente de un enlace directo a la patología de enfermedad de Gaucher. Además, hasta el 35% de las etnias determinadas demuestran un defecto del gen que codifica para quitotriosidasa, dando como resultado una actividad de quitotriosidasa artificialmente reducida o no medible.

Se evaluó el uso de una molécula de almacenamiento primario como biomarcador se evaluó para ceramida de glucosilo (Gb1) en pacientes con enfermedad de Gaucher y se comparó en el nivel de Gb1 en individuos saludables (Groener et al. Biochim Biophys Acta. 2008 Enero-Febrero; 1781 (1 -2):72-8. Epub 2007 Diciembre 5; Plasma glucosylceramide and ceramide in type 1 Gaucher disease patients: correlations wit disease severity and response to terapeutic intervention (Glucosilceramida y ceramida en plasma en pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1: correlaciones con severidad de enfermedad y respuesta a la intervención terapéutica); Groener JE et al.). Sin embargo, aunque Gb1 medido en el estudio se incrementó en plasma de los pacientes, en incremento de Gb1 no fue prominente y por lo tanto la especificidad y la sensibilidad del método fueron bajas, lo que muestra que Gb1 no es aplicable como un biomarcador para la enfermedad de Gaucher.

Ya en la Publicación de 1989 Rosengren et al.

(Lysosulfatide (galactosylsfingosine-3-O-sulfate) from metachromatic leukodystrofy and normal human cerebro ((Lisosulfatida (galactosilsfingosina-3-O-sulfato) de leucodistrofia metacrónica y cerebro de humano normal), Rosengren B, Fredman P, Mansson JE, Svennerholm L.; J Neurochem. 1989 Abril; 52(4): 1035-41) mostró que la lipidosis no únicamente afecta el catabolismo del esfingolípido mayor, sino también su liso-compuesto. Sin embargo, el estudio concluyó que los liso-compuestos no desempeñan un papel importante en los mecanismos patógenos en la esfingolipidosis. Por lo tanto, los lisos-compuestos no deben ser biomarcadores adecuados para el diagnóstico de esfingolipidosis tal como enfermedad de Gaucher.

Es importante observar que hasta hoy no está disponible el uso de un biomarcador altamente específico y altamente sensible, y no está disponible un método para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, particularmente para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y del portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C, además de los métodos descritos anteriormente que presentan un límite de detección, sensibilidad y/o especificidad insatisfactorio, y por lo tanto probaron no ser adecuados para aplicación clínica, y en donde los métodos no permiten un diagnóstico diferencial de diferentes tipos de enfermedad de Niemann-Pick, tal como enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, y enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Por consiguiente, existe la necesidad de un método rápido, simple y de manera más importante, confiable, para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, particularmente el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, y de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y del transportador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

A la luz de lo anterior, el problema que subyace en la presente invención es proporcionar un método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, particularmente el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, y de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Es un problema adicional que subyace a la presente invención, proporcionar un método para el diagnóstico diferencial del primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, un segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y un tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Es aún un problema adicional que subyace a la presente invención, proporcionat un método el cual determina si el sujeto está sufriendo o no de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B y/o del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B y/o del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Un problema adicional que subyace a la presente invención, es proporcionar un método para determinar el curso y pronóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, particularmente el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, y de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Aún un problema adicional que subyace a la presente invención, es proporcionar un método para determinar en forma más bien rápida, la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que está siendo probado en forma positiva en cuanto al padecimiento de o que está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick, particularmente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Un problema adicional que subyace a la presente invención es proporcionar un método para determinar la efectividad de un compuesto para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick, particularmente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B y/o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Otro problema que subyace a la presente invención, es proporcionar un biomarcador que permite el diagnóstico específico y sensible de la enfermedad de Niemann-Pick, particularmente el diagnóstico específico y sensible de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, y de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Un problema aún adicional que subyace a la presente invención, es un equipo que comprende un compuesto que interactúa con un biomarcador el cual es específico y sensible para la enfermedad de Niemann-Pick, particularmente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B y/o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Estos y otros problemas se resuelven a través del asunto o materia de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las modalidades preferidas pueden tomarse de las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Estas reivindicaciones están mencionadas a continuación como modalidades. Se reconocerá que las modalidades adicionales pueden resultar de la descripción de la presente especificación, la cual no está limitada a las modalidades que son una mención de las reivindicaciones.

Modalidad 1. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto.

Modalidad 2. El método de acuerdo con la modalidad 1, en donde el método comprende un paso b) en donde el paso b) comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra.

Modalidad 3. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 o 2, en donde el nivel del biomarcador indica si el sujeto está sufriendo o no de enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 4. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 3, en donde la muestra del sujeto es una muestra de un sujeto quien ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick o una muestra de un sujeto quien ha sido diagnosticado previamente para enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 5. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 3, en donde la muestra del sujeto es una muestra de un sujeto quien no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick, o una muestra de un sujeto quien no ha sido diagnosticado previamente para enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 6. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 5, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base en si el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 7. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 6, en donde el método comprende: un paso d), en donde el paso d) comprende detectar biomarcador en una muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no se ha aplicado terapia en el paso c).

Modalidad 8. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 7, en donde el método comprende: un paso e), en donde el paso e) comprende determinar un nivel de biomarcador en la muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no se ha aplicado una terapia en el paso c).

Modalidad 9. El método de acuerdo con la modalidad 8, en donde el método comprende un paso f), en donde el paso f) comprende determinar si el nivel de biomarcador determinado en el paso b) es menor que el nivel del biomarcador determinado en el paso e).

Modalidad 10. El método de acuerdo con la modalidad 9, en donde el método comprende un paso g), en donde el paso g) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base en el paso f).

Modalidad 11. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 10, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 12. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 11, en donde el biomarcador es una liso-esfingomielina libre.

Modalidad 13. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 11, en donde el biomarcador es el compuesto 509.

Modalidad 14. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 13, en donde el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional dentro o en la muestra del sujeto.

Modalidad 15. El método de acuerdo con la modalidad 14, en donde el método comprende determinar el nivel de al menos un biomarcador adicional dentro o en la muestra del sujeto.

Modalidad 16. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 14 a 15, en donde se selecciona al menos un biomarcador adicional del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde al menos un biomarcador adicional es diferente al biomarcador.

Modalidad 17. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 14 a la 16, en donde el biomarcador es el compuesto 509 y en donde al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre.

Modalidad 18. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 14 a 16, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, y en donde al menos un biomarcador adicional es el compuesto 509.

Modalidad 19. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 18, en donde el método comprende determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 dentro o en la muestra.

Modalidad 20. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 14 a la 19, preferentemente de la 17 a la 19, en donde el método comprende: un paso h), en donde el paso h) comprende determinar la proporción del nivel de biomarcador dentro o en la muestra para el nivel del al menos un biomarcador adicional dentro o en la muestra.

Modalidad 21. El método de acuerdo con la modalidad 20, en donde la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional, preferentemente tal como se determina en el paso h), indica si el sujeto está padeciendo o no de enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 22. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 21, en donde el método comprende detectar la liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 dentro o en la muestra.

Modalidad 23. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 22, en donde el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detectan por medio de inmunoensayo, análisis espectrométrico de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador y/o un derivado fluorescente del al menos un biomarcador adicional.

Modalidad 24. El método de acuerdo con la modalidad 23, en donde el biomarcador se detecta por medio de análisis de espectrometría de masa.

Modalidad 25. El método de acuerdo con la modalidad 24, en donde análisis de espectrometría de masa se selecciona del grupo que consiste en SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF.

Modalidad 26. El método de acuerdo con la modalidad 25, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS.

Modalidad 27. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 26, en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC.

Modalidad 28. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 27, en donde el método comprende precipitación de proteína, HPLC y MS/MS.

Modalidad 29. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 28, en donde el sujeto es un humano.

Modalidad 30. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 29, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y el portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 31. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 30, en donde el paso d) que comprende detectar biomarcador en una muestra, comprende someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, precipitar la proteína de la muestra, proporcionar un sobrenadante de la muestra, someter el sobrenadante de la muestra a HPLC y MS/MS y determinar el nivel de biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional que está presente en el sobrenadante de la muestra.

Modalidad 32. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o segundo sobrenadante, o al menos una parte de los mismos, a un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS y utilizar una columna HPLC con un gradiente de agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar biomarcador en una muestra del sujeto, y opcionalmente un paso b), en donde el paso b) comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 31; Modalidad 33. Un método para diagnosticar una enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS, y utilizar una columna HPLC con un gradiente del agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, y opcionalmente un paso b), en donde el paso b) comprende determinar un nivel de biomarcador presente en la muestra, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 31.

Modalidad 34. Un método para el diagnóstico una enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS, y utilizar una columna HPLC con un gradiente del agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, y detectar al menos un biomarcador adicional en una muestra al sujeto; y opcionalmente un paso b), en donde el paso b) comprende determinar un nivel de biomarcador presente en la muestra; y un nivel del al menos un biomarcador adicional presente en la muestra; en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde al menos un biomarcador adicional es el compuesto 509, y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 31.

Modalidad 35. El método de acuerdo con la modalidad 34, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende determinar la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre, tal como se determina en el paso b).

Modalidad 36. El método de acuerdo con la modalidad 35, en donde la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, indica si el sujeto padece o no de la enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de una enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 37. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS, y utilizar una columna HPLC con un gradiente del agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada a MS/ S, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra al sujeto, y detectar al menos un biomarcador adicional en una muestra al sujeto; y un paso b), en donde el paso b) comprende determinar el nivel del biomarcador presente en la muestra y el nivel de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra; y un paso c), en donde el paso c) comprende determinar la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador tal como se determina en el paso b); en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es menor o tan alto como 0.031 ng/ml, esto indica que el sujeto o está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde si el nivel de al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 0.031 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es mayor a 0.031 ng/ml, y es menor a o tan alto como de 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick seleccionado del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 1.7 ng/ml, y la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador es tan alto como de 0.045, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B; y en donde si el nivel de al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 1.7 ng/ml, y la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador es menor a, o tan alto como 0.045 esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre; en donde al menos un biomarcador adicional es el compuesto 509; y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 31.

Modalidad 38. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 31 a 37, en donde el estándar interno comprende propionato de D5-fluticasona y/o liso-Gb2.

Modalidad 39. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 38, en donde el paso b), el paso c) y/o el paso e) comprende comparar el nivel del biomarcador en la muestra y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional en la muestra y/o la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto con un valor de corte.

Modalidad 40. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor al valor de corte, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 41. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si la proporción del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto, al nivel de al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto es mayor al valor de corte, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 42. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es menor al valor de corte, esto indica que el sujeto no está padeciendo de o no está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 43. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si la proporción del nivel de biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto es menor al valor de corte, esto indica que el sujeto no está padeciendo de, o no está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 44. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 43, en donde al valor de corte se selecciona de modo que la sensibilidad para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, sea preferentemente del 98.5% al 100%, más preferentemente del 99,5% al 100%, y/o de modo que la especificidad del diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto sea del 99.4% al 100%, preferentemente del 100%.

Modalidad 45. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 44, en donde el paso b) y/o paso c) y/o paso e) comprende(n) que un nivel del biomarcador en el sujeto y/o un nivel de al menos un biomarcador adicional es/se compara con un nivel de biomarcador y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional detectado en la muestra de una muestra de control; y/o que la proporción del nivel del al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador se compara con la proporción del nivel del al menos un biomarcador adicional con el nivel del biomarcador detectado en la muestra de un control.

Modalidad 46. El método de acuerdo con la modalidad 45, en donde la muestra de control es una muestra de un sujeto que no tiene enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 47. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 45 a la 46, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor al nivel del biomarcador en la muestra de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de y/o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 48. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 46, en donde si la proporción del nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional en la muestra de control al nivel del biomarcador en la muestra de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de y/o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 49. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 48, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y un portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 50. El método de acuerdo con la modalidad 49, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

Modalidad 51. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 50, preferentemente con la modalidad 50, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre, un producto de sangre, orina, saliva, fluido cerebroespinal, materia fecal, muestra de tejido y linfa.

Modalidad 52. El método de acuerdo con la modalidad 51, en donde la muestra de la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre y un producto de sangre.

Modalidad 53. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 51 a la 52, en donde el producto de sangre se selecciona del grupo que comprende suero y plasma.

Modalidad 54. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 53, preferentemente la 53, en donde el método tiene un límite de detección para la liso-esfingomielina libre de 0.04 ng/ml.

Modalidad 55. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y el valor del corte es 6.5 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 56. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde biomarcador es liso-esfingomielina libre y al valor del corte es de 9.23 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 57. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B y en donde biomarcador es liso-esfingomielina libre y el valor del corte es de 59 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 58. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde el biomarcador es el compuesto 509 y al valor del corte es de 0.031 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 59. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde biomarcador es el compuesto 509 y el valor del corte es 1.7 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 60. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B y en donde biomarcador es el compuesto 509 y al valor de corte es 5.0 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 61. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto, al nivel del biomarcador de liso-esfingomielina libre en la muestra del sujeto, se compara con un valor de corte, y en donde al valor de corte es de 0.087, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 62. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, y en donde la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador de la liso-esfingomielina libre en la muestra del sujeto se compara con un valor de corte, y en donde al valor de corte es de 0.045, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

Modalidad 63. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 51 a la 52, en donde la sangre es sangre completa.

Modalidad 64. El método de acuerdo con la modalidad 63, en donde la sangre completa se recolecta en una tarjeta de filtro de sangre seca.

Modalidad 65. Un método para determinar el curso de una enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende un paso a), en donde el paso a) comprende: determinar en varios puntos en el tiempo, un nivel de biomarcador presente en una muestra del sujeto.

Modalidad 66. El método de acuerdo con la modalidad 65, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende la liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 67. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 66, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 68. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 67, en donde el sujeto ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick y/o en donde el sujeto ha sido diagnosticado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 69. El método de acuerdo con la modalidad 68, en donde el sujeto no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick y/o en donde el sujeto no ha sido diagnosticado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 70. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 69, en donde el método comprende: un paso b), en donde el paso b) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base ya sea en que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 71. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 70, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende detectar el biomarcador en una muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no aplicado terapia en el paso b).

Modalidad 72. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 71, en donde el método comprende: un paso d), en donde el paso d) comprende determinar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no se ha aplicado terapia en el paso b).

Modalidad 73. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 71, en donde el método comprende un paso e), en donde el paso e) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinó el paso a) es menor al nivel del biomarcador determinado en el paso d).

Modalidad 74. El método de acuerdo con la modalidad 73, en donde el método comprende: un paso f), en donde el paso f) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base en el paso e).

Modalidad 75. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 74, en donde biomarcador es liso- esfingomielina libre.

Modalidad 76. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 74, en donde biomarcador es el compuesto 509.

Modalidad 77. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 76, en donde el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.

Modalidad 78. El método de acuerdo con la modalidad 77, en donde el método comprende determinar el nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.

Modalidad 79. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 77 a la 79, en donde al menos un biomarcador adicional se selecciona del grupo que consiste en liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde el al menos un biomarcador adicional es diferente al biomarcador.

Modalidad 80. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 77 a la 79, en donde biomarcador es el compuesto 509, y en donde el al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre.

Modalidad 81. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 80, en donde el método comprende determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 82. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 77 a la 81, preferentemente de la 80 a la 81, en donde el método comprende: un paso h), en donde el paso h) comprende determinar la proporción del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.

Modalidad 83. El método de acuerdo con la modalidad 82, en donde la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso h), indica si el sujeto está padeciendo o no de enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 84. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 83, en donde el método comprende detectar la liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 en la muestra del sujeto.

Modalidad 85. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 84, en donde biomarcador y/o al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de inmunoensayo, análisis de espectrometría de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente de liso-esfingomielina libre.

Modalidad 86. El método de acuerdo con la modalidad 85, en donde biomarcador se detecta por medio de análisis de espectrometría de masa.

Modalidad 87. El método de acuerdo con la modalidad 86, en donde el análisis de espectrometría de masa se selecciona del grupo que consiste en SELDI , MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF Modalidad 88. El método de acuerdo con la modalidad 87, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS MS/MS.

Modalidad 89. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 88, en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC.

Modalidad 90. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 89, en donde el método comprende precipitación de proteína, HPLC y MS/MS.

Modalidad 91. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 90, en donde el sujeto es un humano.

Modalidad 92. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 91, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 93. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 92, en donde el paso d) comprende detectar el biomarcador en una muestra, en donde el método comprende someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, precipitar la proteína de la muestra, proporcionar un sobrenadante de la muestra, someter el sobrenadante de la muestra a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o al menos un biomarcador adicional que está presente en el sobrenadante de la muestra.

Modalidad 94. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 65 a la 93, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

Modalidad 95. Un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que está siendo probado en forma positiva como que padece de o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende: un paso a), en donde el paso a) comprende detectar en varios puntos en el tiempo, un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra del sujeto.

Modalidad 96. El método de acuerdo con la modalidad 95, en donde el método comprende: un paso b), en donde el paso b) comprende determinar en varios puntos en el tiempo, un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto.

Modalidad 97. El método de acuerdo con la modalidad 96, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende determinar la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso b).

Modalidad 98. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a 97, en donde biomarcador se selecciona del grupo que comprende en liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 99. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a 98, en donde al menos un biomarcador adicional se selecciona del grupo que consiste en liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde al menos un biomarcador adicional es diferente al biomarcador.

Modalidad 100. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a 99, en donde biomarcador es el compuesto 509 y en donde el al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre.

Modalidad 101. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a 100, en donde el sujeto ha sido tratado previamente para enfermedad de Niemann-Pick o diagnosticado para la enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 102. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a la 100, en donde el sujeto no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick, o en donde el sujeto no ha sido diagnosticado previamente para enfermedad de Niemann-Pick.

Modalidad 103. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a 102, en donde el método comprende: un paso d), en donde el paso d) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento aplicado al sujeto con base en la disminución en el nivel del biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso b) y/o la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso c).

Modalidad 104. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a la 102, en donde el método comprende: un paso e), en donde el paso e) comprende detectar el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto, en donde la muestra se ha tomado antes de comenzar el tratamiento después de aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento en el paso d) y, opcionalmente determinar un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra del sujeto, y determinar opcionalmente la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional.

Modalidad 105. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 95 a la 104, en donde el tratamiento se selecciona del grupo que consiste en terapia de reemplazo de enzimas, terapia de reducción de substrato, terapia de chaperón, terapia genética, trasplante de célula madre de salto de ADN/ARN.

Modalidad 106. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 95 a la 105, en donde el método comprende: un paso f), en donde el paso f) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinado en el paso b) es menor que el nivel del biomarcador determinado en el paso e); y/o determinar si el nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en el paso b) es menor al nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en el paso e); y/o determinar si la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso c), es menor a la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso e).

Modalidad 107. El método de acuerdo con la modalidad 106, en donde el método comprende: un paso g) en donde el paso g) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento aplicado al sujeto con base en el paso f).

Modalidad 108. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 95 a la 107, en donde biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de inmunoensayo, análisis de espectrometría de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador.

Modalidad 109. El método de acuerdo con la modalidad 108, en donde el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de análisis de espectrometría de masa .

Modalidad 110. El método de acuerdo con la modalidad 109, en donde el análisis de espectrometría de masa se selecciona del grupo que consiste en SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF.

Modalidad 111. El método de acuerdo con la modalidad 110, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS.

Modalidad 112. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 95 a la 111, en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC.

Modalidad 113. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 96 a 112, en donde el método comprende precipitación de proteína, HPLC y MS/MS.

Modalidad 114. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 95 a la 113, en donde el sujeto es un humano.

Modalidad 115. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 95 a la 114, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 116. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 95 a la 115, en donde el paso de detectar el biomarcador en la muestra del sujeto, comprende precipitar la proteína de la muestra del sujeto, en donde la precipitación de la proteína de la muestra proporciona un sobrenadante de la muestra; someter un volumen del sobrenadante a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional que está presente en la muestra del sujeto.

Modalidad 117. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 115 a la 116, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

Modalidad 118. Un método para determinar la efectividad de un compuesto para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende los siguientes pasos: a) determinar un nivel de un biomarcador en una muestra de un sujeto que tiene enfermedad de Niemann-Pick; b) administrar al sujeto el compuesto; c) determinar nuevamente el nivel del biomarcador en una muestra del sujeto después de que el compuesto ha sido administrado al sujeto; y d) determinar si el nivel del biomarcador determinado en el paso c) es menor al nivel del biomarcador determinado en el paso a); en donde si un nivel del biomarcador determinado en el paso c) es menor al nivel del biomarcador determinado en el paso a) esto indica la efectividad del compuesto.

Modalidad 119. El método de acuerdo con la modalidad 118, en donde, el paso a) y c) cada uno comprenden adicionalmente, determinar un nivel de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra, y en donde el paso d) comprende en forma adicional: determinar si el nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en el paso c) es menor al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso a), y en donde, un nivel del al menos un biomarcador determinado en el paso c) el cual es menor al nivel de al menos un biomarcador determinado en el paso a), indica la efectividad del compuesto.

Modalidad 120. El método de acuerdo con la modalidad 119, en donde, el paso a) comprende además, determinar la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional; el paso c) comprende además determinar la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional, y en donde el paso d) comprende, determinar si la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso c), es menor a la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso a), y en donde, una proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso c), el cual es menor a la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso a) indica la efectividad del compuesto.

Modalidad 121. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 118 a la 120, en donde cualquiera del biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde el biomarcador es diferente al menos un biomarcador adicional.

Modalidad 122. El método de acuerdo con la modalidad 121, en donde el método comprende determinar un nivel del biomarcador en una muestra de control.

Modalidad 123. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 118 a la 121, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad Niemann-Pick tipo A o B, enfermedad Níemann-Pick tipo C, y un portador de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 124. El método de acuerdo con la modalidad 123, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

Modalidad 125. El uso de análisis de espectrometría de masa para la detección de un biomarcador, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 126. El uso de acuerdo con la modalidad 125, en donde la detección comprende el uso de HPLC.

Modalidad 127. El uso de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 125 a la 126, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS.

Modalidad 128. El uso de un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 127, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 129. El uso de un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre.

Modalidad 130. El uso de un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, en donde el biomarcador es el compuesto 509.

Modalidad 131. El uso de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 125 a la 130, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y un portador Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 132. El uso de acuerdo con la modalidad 130, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

Modalidad 133. El uso de una proporción de un nivel de un biomarcador presente en una muestra del sujeto a un nivel de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto para utilizarse en un método de diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 134. Un equipo para determinar la presencia de un biomarcador en una muestra al sujeto, en donde el equipo comprende: a) una parte de interacción del biomarcador; b) opcionalmente un soporte sólido que comprende al menos un reactivo de captura adherido al mismo, en donde el reactivo de captura enlaza al biomarcador; y c) instrucciones para utilizar el soporte sólido para detectar el biomarcador, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

Modalidad 135. El equipo de acuerdo con la modalidad 132, en donde el equipo es para: a) utilizarse en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick; b) utilizarse en un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto; y/o c) el uso en un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto, en donde preferentemente el método de a), b) y/o c), es un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124.

Modalidad 136. El equipo de acuerdo con cualquiera de las modalidades 134 a 135, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende la enfermedad Niemann-Pick tipo A o B, la enfermedad Niemann-Pick tipo C, y el portador de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 137. El equipo de acuerdo con la modalidad 136, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

Modalidad 138. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente modalidades de la 1 a la 64, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 0.031 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 139. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente la modalidad 138, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 0.031 ng/ml y es menor o tan alto como 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 140. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente con cualquiera de las modalidades 138 y 139, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 141. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 140, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 1.7 ng/ml, y es menor a o tan alto como 5.0 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 142. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades de la 138 a la 141, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 5.0 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B.

Modalidad 143. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 142, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 6.5 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B, en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 144. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 143, en donde el biomarcador es liso- esf ingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 6.5 ng/ml y es menor o tan alto como 9.23 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 145. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 144, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre; en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 9.23 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 146. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 145, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 9.23 ng/ml, y es menor o tan alto como 59 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 147. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 146, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es tan alto como 59 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B.

Modalidad 148. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 147, en donde si la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de la liso-esfingomielina libre es tan alta como de 0.087, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 149. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 148, en donde si la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de la liso-esfingomielina libre es mayor a 0.045, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Modalidad 150. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las modalidades 138 a 149, en donde si la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de la liso-esfingomielina libre es mayor a 0.045 y es menor o tan alta como 0.087, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B.

Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que el 465, también referido en la presente invención preferentemente como la liso-esfingomielina libre, constituye un biomarcador que permite un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, diagnosticar más específicamente la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto con alta especificidad y sensibilidad utilizando la liso-esfingomielina libre como el biomarcador.

Los inventores de la presente invención también han descubierto sorprendentemente que el compuesto 509 constituye un biomarcador, el cual permite un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, diagnosticar más específicamente la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto con alta especificidad y sensibilidad utilizando el compuesto 509 como el biomarcador.

Además, los inventores de la presente invención también han descubierto sorprendentemente que la proporción del nivel del compuesto 509 en una muestra del sujeto al nivel del compuesto 465 en una muestra, preferentemente la muestra del sujeto, ambas determinadas preferentemente a través de los métodos de la presente invención, es adecuada para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto, diagnosticada en forma más específica la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto con alta especificidad y sensibilidad.

En otras palabras, el compuesto 465 y el compuesto 509, respectivamente, constituyen biomarcadores que permiten un método para el diagnóstico diferencial de un primer grupo de enfermedad de Niemann-Pick, que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, un segundo grupo de enfermedad de Niemann-Pick que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y un tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. De acuerdo con esto es posible diferenciar a un sujeto que pertenece o se asume que pertenece al primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick, de un sujeto que pertenece o se asume que pertenece al segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick y/o el tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick. De acuerdo con esto, también es posible diferenciar a un sujeto que pertenece o se asume que pertenece al segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick, de un sujeto que pertenece o se asume que pertenece al primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick y/o al tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick. De acuerdo con esto, también es posible diferenciar a un sujeto que pertenece o se asume que pertenece al tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick, de un sujeto que pertenece o se asume que pertenece al primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick y/o el segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick.

La proporción del nivel del compuesto 509 en una muestra de un sujeto al nivel del compuesto 465 en una muestra, o en la muestra del sujeto permite diferenciar la enfermedad de Niemann-Pick tipo C de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B. Por consiguiente, es posible diferenciar a un sujeto que padece de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C de un sujeto que padece de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B. También está dentro de la presente invención, que la proporción del nivel del compuesto 509 en una muestra de un sujeto al nivel del compuesto 465 en a, o en la muestra del sujeto, permite determinar si el sujeto padece o no, o está en riesgo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Los inventores de la presente invención también han descubierto sorprendentemente que la liso-esf ingomielina libre, la cual será detectada a través de los métodos de la presente invención, está circulando en la sangre de un sujeto en una concentración de aproximadamente 1/1000 de la esfingomielina total. Además, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente, que, a diferencia de la esfingomielina total, la liso-esfingomielina libre que está presente en la sangre de un sujeto, es útil en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende el paso de detectar un biomarcador en una muestra al sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre. Los inventores de la presente invención también han descubierto sorprendentemente que el nivel de liso-esfingomielina libre determinado en la muestra de un sujeto a través de los métodos de la presente invención, pero permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad.

Los inventores de la presente invención rechazan la enseñanza de la técnica anterior en cuando a que el método de la presente invención comprende determinar el nivel de un compuesto, y utilizar el compuesto liso como un biomarcador para el diagnóstico de esfingolipidosis. Más específicamente, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la determinación del nivel de liso-esfingomielina libre en una muestra de un sujeto, permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad.

También es mérito de los inventores de la presente invención haber reconocido que una fracción de la esfingomielina total que se acumula en la enfermedad de Niemann-Pick, está presente como una molécula en la forma liso libre de la misma, es decir, liso-esfingomielina libre, y está circulando en la sangre de un sujeto en la forma liso libre además de la esfingomielina.

Además, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que el compuesto 509, el cual puede ser detectado por los métodos de la presente invención, está circulando en la sangre de un sujeto. Además, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que el compuesto 509 el cual está presente en la sangre de un sujeto, es útil en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende un paso de detectar un biomarcador en una muestra al sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509. Los inventores de la presente invención también han descubierto sorprendentemente que el nivel del compuesto 509 determinado en la muestra del sujeto a través de los métodos de la presente invención, permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad.

En relación con la presente invención, se hace referencia a la concentración o nivel del compuesto 509. Dicha concentración o nivel del compuesto 509 se determina preferentemente como se indica a continuación. En la preparación analítica tal como se describe con mayor detalle en la parte de Ejemplos, se agrega un estándar interno a la muestra que será analizada. En el curso de dicho análisis, se obtiene un cromatograma que indica como picos individuales, los diversos compuestos detectados en la muestra. Los diversos compuestos incluyen, entre otros el 509 y el estándar interno. Con el objeto de determinar a partir de dicho cromatograma y de los picos indicados en el mismo, la concentración o nivel del compuesto 509, se determina el área pico del pico que corresponde al compuesto 509 y el área pico del pico que corresponde al estándar interno. La proporción del área pico del pico que corresponde al compuesto 509 y el área pico del pico que corresponde al estándar interno se determina subsecuentemente y se normaliza para la concentración del estándar interno agregado a la muestra que será analizada. La concentración del compuesto 509 obtenida de esta forma, también es referida en la presente invención como la concentración normalizada del compuesto 509.

En las modalidades de los métodos de la presente invención, en donde se utiliza la concentración o nivel del compuesto 509, ya sea como tal, o cuando se calcula una proporción que implica la concentración o nivel del compuesto 509, tal como la proporción de la concentración del compuesto 509 en la muestra del sujeto a la concentración de liso-esfingomielina libre en la muestra del sujeto, la concentración del compuesto 509 es preferentemente la concentración normalizada del compuesto 509.

El término "trastorno de almacenamiento lisosomal", también referido en la presente invención como "enfermedad de almacenamiento lisosomal" o "LSD", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere preferentemente a las enfermedades genéticas y trastornos metabólicos que resultan de defectos en la función lisosomal. Los trastornos de almacenamiento lisosomal son originados por disfunción lisosomal normalmente como una consecuencia de deficiencia de una enzima simple requerida para el metabolismo de lípidos, glucoproteínas o los llamados mucopolisacáridos. Igual que otras enfermedades genéticas, los individuos heredan enfermedades de almacenamiento lisosomal de sus padres.

Aunque cada trastorno resulta de diferentes mutaciones genéticas que se traducen en una deficiencia en la actividad enzimática, todas comparten una característica bioquímica común - todos los trastornos lisosomales se originan de una acumulación anormal de sustancias dentro del lisosoma.

La enfermedad de Niemann-Pick, también referida en la presente invención como NP, son enfermedades genéticas heredadas en forma recesiva, autosomales que son clasificadas en un subgrupo de LSD llamado esfingolipidosis o trastornos de almacenamiento de lípidos, en donde se acumulan cantidades peligrosas de sustancias grasas, o lípidos en el bazo, hígado, pulmones, médula ósea, y cerebro. Dependiendo de la mutación de la proteína afectada, la enfermedad de Niemann-Pick normalmente se divide en cuatro subgrupos, a saber la enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B, C y D, también referida en la presente invención preferentemente como NPA en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A, NPB en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick tipo B, NPC en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y NPD NPD en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick tipo D, respectivamente. Por lo tanto, la enfermedad de Niemann-Pick, tal como se utiliza en la presente invención, comprende preferentemente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A, la enfermedad de Niemann-Pick tipo B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

La enfermedad de Niemann-Pick se hereda en un patrón recesivo autosomal que significa que ambas copias, o átelos, del gen deben mutarse o alterarse de tal forma que se dañe la función, en contraste con un polimorfismo, en donde la secuencia de nucleótido se altera pero no origina interrupción funcional, de una persona que estará afectada por el trastorno. En forma más frecuente, los padres de un niño con un trastorno recesivo lisosomal no se ven afectados, ya que son portadores de una copia del gen alterado. Dicho portador es referido en la presente invención como el portador de la enfermedad de Niemann-Pick, por ejemplo, portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Si ambos padres son portadores, existe un 25% de oportunidad con cada embarazo de un niño afectado. La asesoría genética y las pruebas genéticas son recomendadas para las familias quienes pueden ser portadores de la enfermedad de Niemann-Pick.

NPA tiene un diagnóstico extremadamente deficiente con la mayor parte de los casos siendo fatales a la edad de aproximadamente 18 meses. NPB y NPC normalmente poseen un mejor pronóstico, con muchos pacientes con estos trastornos viviendo en su edad de adolescencia o de adultos.

La enfermedad de Niemann-Pick Tipo C es bioquímica, genética y clínicamente distinta de la enfermedad de Niemann Pick tipos A o B.

Las mutaciones en el gen SMPD1 originan una deficiencia completa o parcial de una enzima llamada esfingomielinasa de ácido que da como resultado la acumulación de esfingomielina y conduce a NPA y NPB, respectivamente.

Aproximadamente el 95% de los casos de la enfermedad de Niemann-Pick Tipo C, aquí referidos preferentemente como tipo C1 o NPC1, son originados por mutaciones genéticas en el gen NPC1, mientras que el 5%, referido en la presente invención preferentemente como tipo C2 o NPC2, son originados por mutaciones en el gen NPC2 (Mellon SH et al., March 2008. Brain research reviews (Revisiones de Investigación de Cerebro) 57 (2): 410-20).

En NPC el producto de proteína del gen mutado mayor NPC1, no es una enzima sino parece funcionar como una proteína portadora de transmembrana en el sistema endosomal-lisosomal, el cual mueve moléculas grandes insolubles en agua a través de la célula. La proteína codificada por el gen NPC2 es una proteína no enzimática soluble que parece actuar en operación conjunta con la proteína NPC1 en el transporte de moléculas en la célula. La interrupción de este sistema de transporte da como resultado la acumulación de colesterol y glucolípidos en lisosomas.

Las manifestaciones clínicas de manifestaciones NPC1 y NPC2 son similares debido a que los genes respectivos ambos están implicados en el egreso de lípidos, particularmente colesterol, de los endosomas o lisosomas tardíos. El gen NPC1 se localiza en el cromosoma 18 (18q11-q12) (Zhang JR et al., Junio de 2008, The Journal of clinical investigation (Revista de Investigación Clínica) 118 (6): 2281-90).

NPD fue separada originalmente de NPC para delinear un grupo de pacientes con trastornos de otra forma idénticos quienes comparten un ancestro de Nueva Escocia común. Los pacientes en este grupo ahora son conocidos por compartir una mutación específica en el gen NPC1. En una modalidad de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, NPC comprende NPD. En una modalidad adicional de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, NPC comprende NPC 1 y NPC2.

Los individuos afectados por NPC pueden mostrar síntomas que comprenden esplenomegalia, hepatomegalia o hepatoesplenomegalia, aunque este descubrimiento puede estar ausente en los casos de generación tardíos. La ictericia o la bilirrubina elevada prolongadas pueden estar presentes en el nacimiento. Sin embargo en algunos casos, el ag randamiento del bazo y/o hígado no ocurre durante meses o años - o no ocurre nunca. El agrandamiento del bazo y/o hígado frecuentemente se vuelve menos aparente con el tiempo, en contraste con el progreso de otro LSD, tal como NPA y NPB o enfermedad de Gaucher. El agrandamiento de órganos normalmente no origina complicaciones mayores.

La enfermedad neurológica progresiva es la característica de NPC, y es responsable de la discapacidad y muerte prematura en todos los casos más allá de la niñez temprana. Los niños con NPC inicialmente pueden estar presentes con retrasos en alcanzar las habilidades de objetivos de desarrollo normales antes de manifestar disminución cognitiva, es decir, por ejemplo demencia.

Los signos y síntomas neurológicos incluyen ataxia cerebelar, disartria, disfagia, temblor, epilepsia tanto parcial como generalizada, parálisis supranuclear vertical que comprende parálisis de elevación de la mirada, parálisis de descenso de la mirada, parálisis sacádica, inversión del sueño, cataplexia gelástica, distonia, más comúnmente comienza con el giro hacia adentro de un pie cuando camina (distonia de acción) y puede volverse generalizada, espasticidad, hipotonia, pectosis, microcefalia, psicosis, demencia progresiva, pérdida de escucha progresiva, trastorno bipolar, depresión grave y psicótica que puede incluir alucinaciones, delirios, mutismo, o estupor. En las etapas terminales de NPC, el paciente permanece postrado en la cama, con oftalmoplegia total, pérdida de movimientos volitivos y tienen demencia severa.

Las sustancias acumuladas, colesterol y glucolípidos, tienen diversos desempeños en la célula. El colesterol es un componente importante de las membranas de plasma celular, que definen la célula como una totalidad y sus organelos. También es el bloque de construcción básico de hormonas estereoides, incluyendo neuroesteroides. En NPC, grandes cantidades de colesterol libre o no esterificado se acumulan en los lisosomas, y esto conduce a una deficiencia relativa de esta molécula en múltiples membranas y para la síntesis de esferoides. La acumulación de los glucoesfingolípidos en el sistema nervioso ha sido ligada a cambios estructurales, es decir, dendritogenesis ectópica y formación de meganeuritos.

NPC se diagnostica ensayando fibroblastos cultivados para esterif icación de colesterol y manchado para colesterol no esterificado con filipina. Los fibroblastos se crecen de una pequeña biopsia de piel tomada de un paciente del que se sospecha NPC. El diagnóstico puede confirmarse identificando mutaciones en los genes NPC1 o NPC2.

El pronóstico para pacientes que tienen NPC normalmente se relaciona con la edad de generación. Los niños con generación prenatal o infantil normalmente sucumben en los primeros meses o años de vida, mientras que las formas de generación en adolescentes y adultos de NPC, tienen una generación más insidiosa y un progreso más lento, y los individuos afectados pueden sobrevivir hasta la séptima década. Los casos de NPC en adultos están siendo reconocidos cada vez con mayor frecuencia. Se sospecha que muchos pacientes afectados por NPC no son diagnosticados, debido a la carencia de conocimiento de la enfermedad y la ausencia de una clasificación o pruebas de diagnóstico fácilmente disponibles. Por las mismas razones el diagnóstico con frecuencia es retrasado por muchos años.

Actualmente no existen curas para la causa de NP, y el tratamiento en su mayor parte es sintomático y limitado con cuidados, en su mayoría, de soporte. Se ha intentado el trasplante de órganos con éxito limitado. Se ha intentado el trasplante de médula ósea para NPB. Los prospectos futuros incluyen terapia de reemplazo en enzimas, también referido en la presente invención preferentemente como ERT y terapia genética. Otras diversas estrategias de tratamiento están bajo investigación en cultivo celular y modelos animales de NPC. Estos incluyen ciclodextrina, movilización de colesterol, neuroesteroides y Curcumina como un agente modulador antiinflamatorio y de calcio (Loyd-Evans E et al., Octubre de 2008, Nature medicine (Medicina Natural) 14 (11): 1247-55).

El fármaco Zavesca que comprende Miglustat como un ingrediente activo ha sido aprobado al menos en la Unión Europea para el tratamiento de manifestaciones neurológicas progresivas en pacientes adultos y pacientes pediátricos con enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Miglustat es un inhibidor de sintasa de glucosilceramida, que inhibe la síntesis de glucoesfingolípidos en células. Ha demostrado retardar la generación de la enfermedad en el ratón NPC, y los datos publicados de una prueba clínica de centro múltiple of Miglustat en los Estados Unidos de América e Inglaterra y por los reportes del caso se sugiere que puede disminuir el curso de NPC humana.

La esfingomielina es un esfingolípido encontrado en membranas celulares de células animales, especialmente en el forro de mielina membranosa que rodea algunos axones de la célula nerviosa.

En humanos, la esfingomielina se considera como el único fosfolípido de membrana celular no derivado de glicerol.

Al igual que todos los esfingolípidos, la esfingomielina consiste en un centro de ceramida, es decir, esfingosina enlazada a un ácido graso a través de una ligadura de amida. Además, contiene un grupo de cabeza polar, que es ya sea fosfocolina, fosfocorilcolina o fosfoetanolamina. Una esfingomielina típica tiene la fórmula: En NPA y NPB la deficiencia enzimática da como resultado un bloque de degradación de lípidos, dando como resultado la acumulación de esfingomielina dentro de los lisosomas en linaje de fagocito de macrófago-monocito. Las células afectadas se agrandan, algunas veces hasta a 90 mieras de diámetro, secundario a la distensión de los lisosomas con esfingomielina y colesterol.

Quedará entendido por un experto en la técnica que el término "liso-esfingomielina" tal como se utiliza en la presente invención, preferentemente en relación con los diversos métodos de la presente invención, significa preferentemente que la molécula está presente en su forma de amino libre. Más precisamente, la liso-esfingomielina tal como se utiliza en la presente invención, difiere preferentemente de la esfingomielina en que la porción de ácido graso no está ligado al grupo -primario - amino de la porción de esfingosina de la molécula. Además, la liso-esfingomielina también es referida en la presente invención como el compuesto 465, la Esfingosilfosforilcolina o fosforilcolina de Esfingosina. Una liso-esfingomielina típica tiene la fórmula: Quedará entendido por un experto en la técnica que el término "liso-esfingomielina libre" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere preferentemente a liso-esfingomielina que está presente en una muestra de un, o del sujeto, tal como sangre, y preferentemente, no es el resultado de una manipulación de la muestra del sujeto. Dicha manipulación de una muestra puede ser una descrita por Groener et al. (Groener et al., Biochimica et Biophysica Acta 1781(2908)72 - 78, 2007). De acuerdo con esto, la liso- esfingomielina libre que está presente en la sangre de un sujeto de quien se toma la muestra, más particularmente no es una liso-esfingomielina que sea generada por tratamiento químico, bioquímico o físico de la muestra contenida en la sangre y la muestra, respectivamente, preferentemente fuera del cuerpo del paciente. También quedará entendido por un experto en la técnica que la liso-esfingomielina libre, tal como se utiliza en la presente invención, está presente preferentemente además de la esfingomielina y es un compuesto producido por las actividades metabólicas del sujeto. Por consiguiente, la esfingomielina, la cual es la molécula que se acumula en conexión con la enfermedad de Niemann-Pick, tal como enfermedad de Niemann-Pick tipo A y tipo B, está presente en la muestra del sujeto y se ha comparado con la molécula en su forma liso libre, es decir, liso-esfingomielina libre, presente en la sangre del sujeto al menos en una porción de ácido graso, enlazado al grupo-primario-amino de la porción de esfingosina de liso-esfingomielina.

En una modalidad del biomarcador de acuerdo con la presente invención, el biomarcador se detecta por medio de inmunoensayo, análisis de espectrometría de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador. En relación con esto es importante observar que dicha detección permite la detección selectiva del biomarcador tal como está presente en la sangre de un sujeto y particularmente no es el resultado de una manipulación de la muestra del sujeto que da como resultado un cambio de la concentración del biomarcador, tal como la derivación de Gb1 en liso-Gb1 de acuerdo con el método de la técnica anterior tal como se describió anteriormente. Dicha manipulación puede resultar en la incapacidad de distinguir el biomarcador de la presente invención, tal como liso-esfingomielina libre, y de esta forma el biomarcador de la presente invención no puede ser detectado, y el nivel del biomarcador no puede ser determinado, respectivamente, sin detectar la sustancia manipulada en forma adicional, por ejemplo, Gb1 derivado en Mso-Gb1 de acuerdo con el método de la técnica anterior. A la luz de lo anterior, se comprenderá inmediatamente que el biomarcador presente en la sangre del sujeto, tal como lisoesfingomielina libre presente en la sangre del sujeto, también está presente en la muestra del sujeto como tal, y sin embargo, puede ser marcada selectivamente con y/o enlazada a un medio tal como una tinta fluorescente o una molécula de ácido nucleico que enlaza específicamente al biomarcador. Dicho marcado o enlace selectivo permite detectar y/o determinar el nivel de biomarcador marcado o enlazado, sin el marcado, enlace o conversión a una sustancia adicional, tal como el liso-Gb1 convertido de la técnica anterior, que no puede ser distinguido del biomarcador, más precisamente el biomarcador marcado o enlazado. En relación con esto, por ejemplo, un derivado fluorescente del biomarcador de la presente invención se refiere a un biomarcador que está etiquetado con y/o enlazado a una tinta o molécula de fluorescencia, es decir, que da como resultado un derivado fluorescente del biomarcador, lo cual permite detectar el derivado fluorescente y/o determinar el nivel de derivado fluorescente del biomarcador de la presente invención.

La sustancia aquí referida como el compuesto 509, que se puede detectar a través de los métodos de la presente invención y que es útil en el método de acuerdo con la presente invención como un biomarcador, es una sustancia que tiene un peso molecular de 508, detectado como transición MRM en el modo positivo 509 m/z a 184 m/z en una muestra de plasma de un sujeto de acuerdo con el método de la presente invención, más particularmente en el Ejemplo 1 y Ejemplo 2 tal como aquí se describe.

El término "muestra", tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente una cantidad limitada de un material del sujeto, en donde el material del sujeto es parte de o ha sido tomado de un sujeto y/o cuerpo del sujeto. Preferentemente, el material se selecciona del grupo que comprende fluidos corporales tales como sangre, productos de sangre, orina, saliva, fluido cerebroespinal y linfa, así como materia fecal o cualquier clase de tejido o material celular que sea parte de un sujeto y/o cuerpo del sujeto. Un experto en la técnica reconocerá, que la presencia y/o nivel de un biomarcador de la presente invención en la muestra, está proyectada para ser similar a, y representa la presencia y/o el nivel de biomarcador en una mayor cantidad del material del sujeto. Más precisamente y como un ejemplo no limitante, ilustrativo, un nivel de un biomarcador de la presente invención determinado en la muestra, por ejemplo, de algunos mi de sangre de un sujeto también representa un nivel del biomarcador en la sangre del cuerpo del sujeto. Además, en una modalidad del método de la presente invención para diagnosticar enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, una muestra del sujeto comprende el material del sujeto en una forma, por ejemplo, procesada, fijada y/o conservada de modo que la muestra sea adecuada para utilizarse en el método de la presente invención, mediante lo cual el proceso, fijación y/o conservación preferentemente no genera liso-esfingomielina y/o el compuesto 59 que no estaba presente en la sangre del paciente. El material del sujeto en la muestra por lo tanto puede ser diluido, por ejemplo con un solvente adecuado para el método de la presente invención tal como metanol y/o agua, que puede ser secado, por ejemplo en una tarjeta de filtro, puede ser resuelto después de haber sido secado, por ejemplo con un solvente adecuado para el método de la presente invención tal como metanol y/o agua, o se puede agregar una sustancia, en donde la sustancia previene que la sangre se coagule, tal como por ejemplo EDTA o heparina. Será comprendido en forma adicional por un experto en la técnica, que el método de la presente invención comprende que el material del sujeto se separe en componentes individuales del material del sujeto y/o se extraen componentes individuales del material del sujeto, por ejemplo la sangre se separa en plasma o suero y se precipitan componentes de sangre celular o proteína de la muestra. Por consiguiente, en una modalidad del método de acuerdo con la presente invención en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC, la precipitación de proteína da resultado preferentemente a) una precipitación de componentes de sangre celular y/o proteína, que forma más preferentemente un pelet después de un paso de centrifugación, y b) siendo el biomarcador preferentemente no precipitado y estando presente en el sobrenadante después de un paso de centrifugación. Un experto en la técnica comprenderá inmediatamente que en una modalidad del método de acuerdo con la presente invención, en donde el método comprende HPLC, un sobrenadante que contiene el biomarcador(s) de la presente invención o una parte del mismo, se somete a HPLC. En relación con esto es importante comprender que el sobrenadante o una parte del mismo que se somete a HPLC, comprende el biomarcador que será detectado así como, preferentemente, un estándar interno. En una modalidad del método de la presente invención en donde se agrega el estándar interno a la muestra, el estándar interno puede agregarse a la muestra antes o después del paso de precipitación, es decir, el estándar interno puede agregarse en la muestra inmediatamente después de que se toma la muestra del sujeto, o puede agregarse al sobrenadante el cual se somete a HPLC, así como entre estos puntos de tiempo. Un experto en la técnica conocerá, como cuando el estándar interno se agrega preferentemente a la muestra con el objeto de lograr una detección y determinación precisa del nivel del biomarcador.

Quedará entendido inmediatamente que después de dicho procesamiento, fijación y/o conservación, la muestra se somete a los métodos de la presente invención para detectar y/o determinar el nivel de biomarcador contenido en la muestra, mediante lo cual el procesamiento, fijación y/o conservación preferentemente no generan liso-esfingomielina y/o el compuesto 509 que no están presentes en la muestra del paciente.

En una modalidad del método de la presente invención, en donde se recolecta sangre completa en la tarjeta de filtro de sangre seca, se recolectan aproximadamente de manera preferente 3 µ I de la sangre total en un punto de la tarjeta de filtro de sangre seca que tiene un diámetro de 3 mm. Un experto en la técnica reconocerá que el volumen exacto recolectado de esta forma, puede variar dependiendo del hematocrito del paciente específico.

Los niveles de glucosilceramida y su precursor de ceramida se utilizaron en la técnica anterior para correlacionar su presencia en plasma con la severidad de enfermedad de Gaucher tipo I y la respuesta a la aplicación de terapia (Groener et al., Biochimica et Biophysica Acta 1781(2908)72 -78, 2007). De esta forma, se encontró el nivel de Gb1 como diferente aunque los niveles de ceramida no fueron significativamente diferentes en plasma de pacientes de enfermedad de Gaucher tipo I tratados y no tratados.

En el estudio reportado por Groener et al. (Groener et al., supra), la proporción de Gb1/ceramida se utilizó para diferenciar entre pacientes con enfermedad de Gaucher y pacientes saludables. Se midieron Gb1 y ceramida con cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) esencialmente como lo describe Groener et al. (J.E.M. Groener et al., Clin.Chern. 53 (2007) 742-747). En relación con esto es importante comprender que Gb1 presente en el plasma, consiste principalmente de una porción de azúcar y una porción de ceramida. La porción de ceramida comprende una esfingosina y una porción de ácido graso. De acuerdo con el método de la técnica anterior, los lípidos se extraen y la ceramida y la glucosilceramida se desacetilan mediante hidrólisis alcalina formando de esta manera la forma liso, es decir liso-Gb1 (T. Taketomi et al., J. Biochem. (Tokyo) 120 (1996) 573-579).

Subsecuentemente, la liso-Gb1 producida de esta forma se marca con una tinta fluorescente mediante derivación con O-ftaldialde ído (OPA) en el grupo amina primario. Posteriormente se separan las bases esfingoides derivadas mediante HPLC de fase inversa y se detectan con un detector de fluorescencia. Por lo tanto el método de la técnica anterior tiene la capacidad de detectar Gb1 total que consiste en Mso-Gb1 libre y Gb1 y no tiene la capacidad de distinguir un nivel de liso-Gb1 libre de un nivel de Gb1 en una muestra del sujeto. El nivel del Gb1 total después de la descomposición de diversas porciones de ácido graso del grupo NH2 de Gb1, normalmente está dentro de un rango de 5 a 30 pg por ml_ de plasma o suero. A partir de esto es evidente que en el método de Groener et al. (Groener et al., supra) el Gb1 total, que se puede preparar y obtener, respectivamente, de una muestra, preferentemente una muestra de sangre, de un sujeto se utiliza como un biomarcador en lugar de un Mso-Gb1 libre contenido en la sangre y por consiguiente también en la muestra sin llevar a cabo una descomposición de la porción/porciones de ácido graso, preferentemente una descomposición llevada a cabo por un operador que maneja la muestra. Por lo tanto la presente invención se relaciona con la detección de liso-esfingomielina libre, en lugar de esfingomielina total.

Aunque Gb1 total medida como liso-Gb1 en el estudio de la técnica anterior se incrementó en el plasma de los pacientes, el incremento en Gb1 total no fue prominente y por lo tanto la especificidad y la sensibilidad del método mostraron que Gb1 no es adecuado como biomarcador para enfermedad de Gaucher.

Es una modalidad de los métodos de la presente invención abarcar la detección y/o determinación del nivel de liso-esfingomielina en una muestra de un sujeto de modo que se determine liso-esfingomielina libre y/o el nivel de liso-esfingomielina libre separado y/o aparte de la esfingomielina o un nivel de esfingomielina que puede estar presente en la sangre de un sujeto. En una modalidad adicional, la esfingomielina y/o el nivel de esfingomielina se detecta/determina además de la detección de y/o la determinación de un nivel de liso-esfingomielina libre.

De manera importante, cada amina primaria que circula en el plasma y que es lo suficientemente lipofílica para ser extraída en forma concomitante con esfingomielina utilizando un solvente orgánico de acuerdo con el método de la técnica, se marca de manera correspondiente y por lo tanto tiene la capacidad de perturbar la detección de la liso-esfingomielina descompuesta.

En una modalidad del biomarcador de acuerdo con la presente invención, que ha sido indicado anteriormente con respecto a la liso-esfingomielina libre, también aplica para cualquier biomarcador de la presente invención estando presente en una forma liso libre.

Por lo tanto, el biomarcador de la presente invención y los usos del mismo exceden claramente el desempeño de los métodos para diagnosticar enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C y/o un portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, conocido en la técnica, más específicamente, excede claramente los intentos de dichos métodos utilizando biomarcadores. Se comprenderá inmediatamente que un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick análogo al método aplicado por Groener et al. para diagnosticar enfermedad de Gaucher (Groener et al., supra) es perjudicial en comparación con los métodos de la presente invención, ya que el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick basado en dicho método de la técnica anterior utilizando esfingomielina total en lugar de liso-esfingomielina libre, como el método de la técnica anterior utilizando Gb1 total en lugar de liso-Gb1 libre, no es adecuado para una aplicación clínica confiable del mismo, es decir, el método no tiene sensibilidad y especificidad suficiente para diagnosticar enfermedad de Gaucher a través de una predicción confiable estadísticamente segura.

En claro contraste con esto, la presente invención proporciona métodos para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick y biomarcadores utilizados en los métodos que permiten el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad. De manera más importante, los métodos de la presente invención utilizando el biomarcador/biomarcadores de la presente invención permite el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B; y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y de portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto. En el mejor conocimiento de los inventores de la presente invención, se considera que los métodos de la presente invención permiten por primera vez delinear la enfermedad de Niemann-Pick tipo C de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B utilizando un biomarcador/biomarcadores de acuerdo con la presente invención en un ensayo rápido, y de manera más importante, altamente sensible y altamente específico adecuado para aplicación clínica.

El término "estatus de enfermedad de Niemann-Pick" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere preferentemente al estatus de la enfermedad en el sujeto. Los ejemplos de los tipos de estatus de enfermedad de Niemann-Pick incluyen pero no se limitan a el riesgo que tiene el sujeto de padecer o desarrollar enfermedad de Niemann-Pick, la etapa de la enfermedad en un sujeto y la efectividad del tratamiento de la enfermedad. Otros estatus y grados de cada estatus son conocidos en la técnica. En una modalidad de la presente invención, el estatus de la enfermedad de Niemann-Pick comprende el estatus de la enfermedad de Niemann-Pick severa, leve o saludable.

El término "diagnóstico" tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente determinar la presencia o la ausencia de una enfermedad o trastorno en el sujeto y/o determinar si el sujeto está en riesgo de desarrollar la enfermedad, un trastorno o síntoma relacionado con una enfermedad o trastorno, así como predecir el estado de una enfermedad. El término diagnosis o "diagnóstico" tal como se utiliza en la presente invención, también significan preferentemente que se identifica una causa de síntomas de una enfermedad que están presentes o estarán presentes.

En relación con esto es importante observar que un experto en la técnica, tal como un médico especialista consultado por el sujeto que padece de síntomas o sospecha estar enfermo, aplica los métodos de la presente invención y por lo tanto determina si un sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad, particularmente enfermedad de Niemann-Pick, y más particularmente enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, si un sujeto padece de la enfermedad o predice con anticipación la enfermedad, con base preferentemente en el resultado obtenido por la práctica de los métodos de la presente invención.

Con base en el diagnóstico el experto en la técnica recomendará aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia o llevar a cabo pruebas de diagnóstico adicionales.

Por lo tanto es una modalidad del método de la presente invención, diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, ya que el método comprende dar una recomendación de si una terapia debe ser aplicada, mantenida, reducida, elevada o no aplicada.

El término "diagnóstico en forma diferencial" tal como se utiliza en la presente invención, en relación con el método de la presente invención, significa preferentemente que el método permite la determinación de la presencia o la ausencia de una enfermedad o trastorno en un sujeto y/o determinar si el sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad, un trastorno o los síntomas relacionados con la enfermedad o trastorno, así como predecir el estado de una enfermedad, en donde la enfermedad es cada una y cualquiera de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B; la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

El término "detectar" dentro del contexto de la presente invención, significa métodos que incluyen detectar la presencia o ausencia de una sustancia en una muestra y/o calificar el tipo de la sustancia. La detección puede lograrse a través de métodos conocidos en la técnica y los descritos en forma adicional en la presente invención, incluyendo pero sin limitarse a, la medición directa de la proteína(s) afectada por ejemplo la secuenciación de los genes SMPD1, NPC1 y/o NPC2. Cualquier método adecuado puede ser utilizado para detectar uno o más de los biomarcadores aquí descritos. Los métodos incluyen sin limitación, espectrometría de masa (por ejemplo HPLC-MS/MS), fluorescencia (por ejemplo inmunoensayo de intercalado), HPLC-fluorescencia o HPLC-UV preferentemente después de la derivación de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509.

Un biomarcador tal como se utiliza en la presente invención, es preferentemente un compuesto biológico, tal como una proteína y un fragmento de la misma, un péptido, un polipéptido, un proteoglicano, una glucoproteína, un lipoproteína, un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico o un químico orgánico o inorgánico, polímero natural y molécula pequeña, que está presente en forma diferenciada en una muestra de un sujeto de un estado fenotípico (por ejemplo, que tiene una enfermedad) en comparación con otro estado fenotípico (por ejemplo que no tiene una enfermedad) y que puede aislarse de, o medirse en la muestra del sujeto. Además, el biomarcador puede ser toda la molécula intacta, o puede ser una parte de la misma, que preferentemente se detecta mediante análisis de espectrometría de masa, un anticuerpo, otra proteína que enlaza específicamente al biomarcador, ácidos nucleicos funcionales que enlazan específicamente al biomarcador y/o etiqueta fluorescente. Un biomarcador se considera además como información, si un aspecto medible del biomarcador está asociado con un estado determinado del paciente, tal como un estado particular de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Dicho aspecto medible puede incluir, por ejemplo, la presencia, ausencia o el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto y/o su presencia como parte del perfil de biomarcadores. Un aspecto medible también puede ser una proporción de dos o más aspectos medibles de biomarcadores, en donde los biomarcadores pueden o no tener una identidad conocida, por ejemplo. Un perfil de biomarcadores comprende al menos dos de dichos aspectos medibles, en donde los aspectos medibles pueden corresponder a la misma o diferente clase de biomarcadores tales como, por ejemplo, un ácido nucleico y un carbohidrato. Un perfil de biomarcador también puede comprender al menos tres, cuatro, cinco, 10, 20, 30 o más aspectos medibles. En una modalidad, un perfil de biomarcador comprende cientos, o incluso miles de aspectos medibles. En otra modalidad, el perfil del biomarcador comprende al menos un aspecto medible de al menos un biomarcador y al menos un aspecto medible de al menos un estándar interno.

En una modalidad del método de acuerdo con la presente invención, un estándar interno se agrega a una muestra del sujeto. Se reconocerá que mediante la adición del estándar interno, también referido en la presente invención como IS, a la muestra, es decir, adición a la muestra, que será sometida al método de acuerdo con la presente invención, la concentración de IS en la muestra es conocida y, por ejemplo, determinando el área bajo el pico, es decir, el área pico del estándar interno, por ejemplo en cromatograma de espectrometría de masa HPLC, se puede calcular la relación entre un área pico y una concentración de una sustancia, por ejemplo, de IS y/o el biomarcador de la presente invención, por ejemplo el liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, por ejemplo calculando la proporción del área pico de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y el área pico de IS. Un experto en la técnica reconoce en forma adicional que se pueden utilizar diversas moléculas como un IS. Sin embargo, es preferible un IS que tiene una estructura química similar en comparación con la molécula tal como el biomarcador, por ejemplo, liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509. De acuerdo con esto, los inventores de la presente invención tienen en una modalidad elegida Mso-Gb2, que no está presente en la naturaleza. En una modalidad preferida, la molécula que es IS puede distinguirse del biomarcador o los bioma rcadores de la presente invención, por ejemplo, la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, en el método de la presente invención. En una modalidad preferida adicional el IS se selecciona de modo que la molécula idealmente no está presente o es rara en la naturaleza. En una modalidad de la presente invención, en donde el estándar interno se agrega a una muestra del sujeto, se prefiere que el IS se agregue de modo que se disuelva en un solvente, por ejemplo etanol, antes de la adición a la muestra. En una modalidad preferida adicional, el solvente se selecciona de modo que el solvente tenga la capacidad de originar la precipitación de proteína, preferentemente que tenga la capacidad de originar el paso de precipitación de proteína como el método de la presente invención.

En algunas modalidades de la presente invención, la precipitación de proteína y/o un paso de precipitación de proteínas, es a partir del método de la presente invención. Quedará entendido que la precipitación, tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente la formación de un sólido en una solución, es decir, por ejemplo la formación de un precipitado de proteína en una muestra, por ejemplo suero, del sujeto. Cuando la precipitación, por ejemplo, precipitación de proteína ocurre en una muestra, el sólido formado se llama el precipitado, o cuando se compacta a través de una centrifugadora, un pelet. El líquido que permanece arriba del sólido es en cualquier caso llamado el sobrenadante. La presente invención contempla diferentes métodos de precipitación y/o separación del sobrenadante y el precipitado o pelet, en donde los métodos comprenden entre otros, asentamiento o sedimentación y centrifugación. Un experto en la técnica conocerá en forma adicional los métodos para precipitación de proteína y/o para separar un sobrenadante y precipitado de proteína, sin embargo los expertos en la técnica reconocerán que si un método, preferentemente un método de la presente invención, se aplica, en donde la proteína precipitada deshabilitará un dispositivo, tal como una columna o columna HPLC utilizada en relación con la presente invención, la proteína precipitada se separa preferentemente del solvente y/o muestra.

En algunas modalidades de la presente invención, un nivel de biomarcador de la presente invención, por ejemplo liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, determinado a través de un método de la presente invención en una muestra, se compara con un nivel del mismo u otro biomarcador de la presente invención determinado a través de un método de la presente invención en otra muestra, por ejemplo, del mismo paciente, de otro paciente, de un control y/o de el mismo o diferente punto de tiempo, y/o un valor de corte y/o un nivel de control y/o un nivel de un IS. En relación con esto, el término "comparación" o "comparado con" tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente la comparación matemática de los dos o más valores de los niveles del biomarcador(s). Será inmediatamente evidente si uno de los valores es más alto, más bajo o idéntico, si al menos dos de dichos valores se comparan entre sí.

En algunas modalidades de la presente invención, el método de la presente invención comprende el paso de determinar la proporción del nivel de dos biomarcadores determinados por el método de la presente invención. En una modalidad más preferida, la proporción se determina dividiendo el nivel del primer biomarcador, es decir, un biomarcador de la presente invención, entre el nivel de un segundo biomarcador, es decir al menos un biomarcador adicional de la presente invención, en donde el nivel de ambos biomarcadores se determina a través de la presente invención. En una modalidad incluso más preferida, se determina la proporción dividiendo el nivel del biomarcador y el nivel de al menos un biomarcador adicional, en donde más preferentemente el biomarcador es el compuesto 509, y al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre. Es el mérito de los inventores de la presente invención haber descubierto que la proporción de los niveles de dos biomarcadores indica que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente de padecer de cualquiera de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B; la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y ser portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. En una modalidad más preferida la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de lis o -esfingomielina libre que es mayor al valor de corte indica que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Es importante comprender en relación con esto que un valor de corte con el cual se compara la proporción, es el valor que permite diagnosticar con la mayor selectividad y sensibilidad.

En una modalidad del método de acuerdo con la presente invención en donde se determina la proporción de dos biomarcadores determinada por el método de la presente invención y que indica que el sujeto está padeciendo una enfermedad particular, por ejemplo, al comparar la proporción con un valor de corte, se considera combinar el diagnóstico con base en la proporción con un diagnóstico con base en el nivel de uno o más biomarcadores individuales presentes en la muestra que indica que el sujeto está padeciendo de una enfermedad particular, por ejemplo, comparando el nivel(s) con el valor(s) de corte respectivo. En otras palabras, se considera detectar primero un biomarcador en una muestra del sujeto, determinar el nivel de biomarcador presente en la muestra y comparar el nivel de biomarcador con un primer valor de corte, en donde el primer valor de corte permite diagnosticar una enfermedad, preferentemente diagnosticar en forma diferencial la enfermedad; segundo, detectar un biomarcador adicional en una muestra del sujeto, determinar un nivel del biomarcador adicional presente en la muestra y comparar el nivel del biomarcador con un segundo valor de corte, en donde el segundo valor de corte permite diagnosticar en forma adicional la enfermedad o confirmar el resultado de diagnóstico con el biomarcador utilizado primero, y/o diagnosticar preferentemente en forma diferencial la enfermedad; y tercero, determinar la proporción del nivel del biomarcador con el nivel del biomarcador adicional y comparar la proporción de un tercer valor de corte, en donde el tercer valor de corte permite un diagnóstico adicional de la enfermedad y confirmar el resultado de diagnóstico con el biomarcador utilizado primero y el biomarcador adicional, y/o diagnosticar preferentemente en forma diferencial la enfermedad.

El término "valor de corte" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere preferentemente a un nivel, concentración y/o un titulador de un biomarcador de la presente invención. En algunas modalidades en donde se considera una proporción de dos niveles, concentraciones y/o tituladores de biomarcadores de la presente invención, el valor de corte es referido como un valor de una proporción con el cual se compara la proporción de dos niveles, concentraciones y/o tituladores de biomarcadores, y en donde se eleva la proporción de los dos niveles, concentraciones y/o tituladores de biomarcadores de la presente invención determinado por los métodos de la presente invención, incrementa o es mayor en comparación con el valor de corte con el cual se compara la proporción de dos niveles, concentraciones y/o tituladores de los biomarcadores, esto indica que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick, y/o preferentemente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y/o ser portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y/o en donde si se disminuye la proporción de los dos niveles, concentraciones y/o tituladores de los biomarcadores de la presente invención o es menor en comparación con un valor de corte con el cual se compara la proporción de los dos niveles, concentraciones y/o tituladores de biomarcadores, esto indica que el sujeto no padece de o no está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick.

En una modalidad particular de la misma al utilizar el compuesto 509 como el biomarcador se permite: diagnosticar NP tipo A y B utilizando un valor de corte para el compuesto 509 de 5 ng/ml con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 96.1%; y/o diagnosticar NP tipo C utilizando un valor de corte para el compuesto 509 de 1.7 ng/ml con una sensibilidad del 97.2% y una especificidad del 93.3%; y/o diagnosticar un portador de NP tipo C, utilizando un valor de corte para el compuesto 509 de 0.031 ng/ml con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 22.5%; utilizando liso-esfingomielina libre como el biomarcador adicional, se permite: diagnosticar NP tipo A y B utilizando un valor de corte para liso-esfingomielina libre de 59 ng/ml con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 99.3%; y/o diagnosticar NP tipo C utilizando un valor de corte para liso-esfingomielina libre de 9.23 ng/ml con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 81.3%; y/o diagnosticar el portador de NP tipo C utilizando un valor de corte para liso-esfingomielina libre de 6.5 ng/ml con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 61.2%; y utilizando la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre se permite: diagnosticar NP tipo A y B utilizando un valor de corte para la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre de 0.045 con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 82.1%; y/o diagnosticar NP tipo C utilizando un valor de corte para la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre de 0.087 con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 95.5%.

El término "proporción", tal como se utiliza en la presente invención significa que entre dos números del mismo tipo, tal como los niveles de dos biomarcadores de la presente invención, tal como los niveles del compuesto 509 y el compuesto 465, existe una relación que normalmente se expresa como "a a b", "a.b" o "la proporción de a a b", por ejemplo "la proporción de los niveles del compuesto 509 al compuesto 465". Preferentemente, la "proporción" indica que tantas veces el primer número, es decir, "a" contiene el segundo, es decir, "b", en donde la proporción no es necesariamente un entero. En otras palabras, si por ejemplo, "la proporción del nivel del compuesto 509 al compuesto 465" es con respecto al valor que representa el nivel del compuesto 509, se divide entre el valor que representa el nivel de 465.

En relación con esto, se ha observado que es el mérito de los inventores de la presente invención haber reconocido que la relación de dos bioma rcadores es el valor diagnóstico, cuya comparación con un valor de corte respectivo permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Quedará entendido que la relación entre los niveles de dos biomarcadores de acuerdo con la presente invención, puede expresarse y/o procesarse a través de diversas operaciones matemáticas y/o diversos modelos matemáticos pueden ser aplicados a un nivel o ambos niveles de los dos biomarcadores. Por consiguiente, está dentro de la presente invención que la operación matemática y/o los diversos modelos matemáticos sean aplicados a uno o más niveles de biomarcadores determinados de acuerdo con la presente invención. Como un ejemplo, el valor recíproco de la proporción del nivel de dos biomarcadores puede utilizarse en lugar de la propia proporción .

En algunas modalidades de la presente invención, el nivel del biomarcador también se determina en un control. Tal como se utiliza en la presente invención, el control es preferentemente una muestra de un sujeto en donde el estado de la enfermedad de Niemann-Pick del sujeto es conocido. En una modalidad, un control es una muestra de un paciente saludable. En una modalidad adicional, se agrega una cantidad del biomarcador a la muestra de un paciente saludable antes de determinar el nivel del biomarcador en la muestra de un paciente saludable, que comprende el biomarcador agregado con un método de la presente invención. En una modalidad adicional, el control es una muestra de al menos un sujeto que tiene un estado de enfermedad de Niemann-Pick conocido, tal como un estado de enfermedad de Niemann-Pick que comprende el estado de enfermedad de Niemann-Pick severo, leve o saludable, por ejemplo un paciente de control. En una modalidad preferida adicional, el estado de enfermedad de Niemann-Pick también comprende el tipo de la enfermedad de Niemann-Pick, que comprende más preferentemente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B, C, y aún además una modalidad preferida, también comprende el estatus genético con respecto a las mutaciones de los genes, que afectan las enfermedades, que comprenden SMPD1, NPC1 y NPC2, es decir que comprende el sujeto que tiene mutaciones homocigosas y/o heterocigosas del compuesto, siendo el sujeto un portador de una mutación.

En una modalidad preferida adicional, el control es una muestra de un sujeto que no está siendo tratado para enfermedad de Niemann-Pick. En una modalidad preferida adicional, el control es una muestra de un sujeto individual o un conjunto de muestras de diferentes sujetos y/o muestras tomadas del sujeto(s) en diferentes puntos de tiempo.

El término "nivel" o "nivel de un biomarcador" tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente la concentración de una sustancia y/o titulador de una sustancia, preferentemente de un biomarcador de la presente invención y más preferentemente de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, dentro de una muestra del sujeto. Quedará entendido por un experto en la técnica que en ciertas modalidades la muestra no se somete necesariamente a un método de la presente invención como una muestra no procesada, comprendiendo el método determinar un nivel del biomarcador, es decir, la muestra puede ser sometida, por ejemplo, a un paso de precipitación de proteína, separación, por ejemplo centrifugación y/o HPLC y se somete subsecuentemente a un paso para determinar el nivel del biomarcador, por ejemplo utilizando análisis de espectrometría de masa. Deberá observarse en forma adicional que siempre que el término nivel "a" de un biomarcador se utiliza en relación con el nivel del biomarcador de la presente invención, lo cual será determinado de acuerdo con la presente invención, se entiende "el" nivel del biomarcador de la presente invención el cual se determina a través de los métodos de la presente invención, y que está contenido en la muestra sometida al método(s) de la presente invención.

El nivel de un biomarcador es diferente entre diferentes estados de la enfermedad de Niemann-Pick, si el promedio o nivel promedio del biomarcador en los diferentes grupos se calcula como estadísticamente significativo. Las pruebas comunes para significancia estadística incluyen, entre otros, prueba-t, ANOVA, Wilcoxon, Mann-Whitney , probabilidades relativas y Kruskal-Wallis. Los biomarcadores solos o en combinación, proporcionan medidas de un riesgo relativo, ya que un sujeto pertenece a un estatus fenotípico u otro. Por consiguiente, los biomarcadores de la presente invención son útiles en una modalidad de la presente invención como marcadores para la enfermedad, efectividad terapéutica de un fármaco o un tratamiento.

El término "determinación del nivel" de un biomarcador tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente métodos que incluyen cuantificar una cantidad de al menos una sustancia de una muestra de un sujeto y/o cuantificar una cantidad de la sustancia contenida en parte del sujeto del sujeto, tal como la saliva, sangre, linfa, suero, plasma u licor y/o cuantificar una cantidad de la sustancia en el sujeto, siendo seleccionada la sustancia del grupo que comprende un biomarcador.

Quedará entendido para un experto en la técnica que detectar y/o determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en una muestra del sujeto, comprende preferentemente por lo tanto que la esfingomielina presente en la sangre de un sujeto no sea químicamente convertida, transformada o derivada, de modo que la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 no puedan ser detectados y/o el nivel del mismo no puede ser determinado en forma separada de y/o aparte de la esfingomielina. Los expertos en la técnica reconocerán que la esfingomielina presente en una muestra de un sujeto que se somete a un paso de desacetilación, por ejemplo, mediante hidrólisis en hidróxido de sodio metanólico, dará como resultado la descomposición de la porción de ácido graso de la esfingomielina, y de esta forma dará como resultado en forma indeseable una forma químicamente convertida, transformada o derivada de esfingomielina que no puede ser diferenciada de liso-esfingomielina libre. Por lo tanto es el mérito de los inventores de la presente invención reconocer que la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 aparte de la esfingomielina, son útiles en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick.

En una modalidad preferida de los métodos de la presente invención, el método es para detectar y/o determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en una muestra de un sujeto, en donde la esfingomielina presente en la muestra del sujeto no se somete a un paso que da como resultado la desacetilación de esfingomielina, preferentemente no se somete a un paso que da como resultado la descomposición de una porción de ácido graso de la esfingomielina contenida en la muestra. En una modalidad preferida adicional del método de la presente invención, la esfingomielina presente en la muestra del sujeto no es químicamente convertida, transformada o derivada. En una modalidad preferida adicional del método de la presente invención, la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 presente en la muestra del sujeto se separa de la esfingomielina presente en la muestra del sujeto antes del paso que puede dar como resultado la descomposición de una porción de ácido graso de la esfingomielina y/o antes de un paso en el cual la esfingomielina sea convertida químicamente, transformada o derivada. En una modalidad preferida adicional, se lleva a cabo un paso para detectar y/o determinar el nivel de un biomarcador en una muestra de un sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, en forma subsecuente a la separación utilizando HPLC mediante la aplicación de análisis de espectrometría de masa.

En una modalidad de los métodos de la presente invención, un sujeto será considerado como saludable con respecto a la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, si no tiene mutación de las partes funcionales del gen SMPD1 y/o no tiene mutación del gen SMPD1 que dé como resultado una reducción de la deficiencia de la proteína respectiva o la actividad de la misma, dando como resultado síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B.

Un sujeto se considera como un sujeto saludable con respecto a la enfermedad de Niemann-Pick, si el sujeto no padece de síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick. Además, en una modalidad de los métodos de la presente invención un sujeto será considerado como saludable con respecto a la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, si no tiene mutación de las partes funcionales de los genes NPC1 y NPC2 y/o mutación de los genes NPC1 y NPC2 que da como resultado una reducción o deficiencia de las proteínas respectivas o la actividad de las mismas, dando como resultado síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. En ciertas modalidades de los métodos de la presente invención, el diagnóstico del portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C es considerado. En relación con esto, es importante comprender que dicho paciente que es portador de una mutación tal como se describió anteriormente, no se considera como un sujeto saludable dentro del significado de la presente invención, aunque el portador pueda no padecer de los síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick. En ciertas modalidades de los métodos de la presente invención, la enfermedad de Niemann-Pick también comprende el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Es importante observar que los métodos de la presente invención normalmente son adecuados para identificar el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. El método de la presente invención es adecuado para diagnosticar si el sujeto es o no un portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. El método de la presente invención es adecuado además para diferenciar, diagnosticar y/o diagnosticar en forma diferencial si un sujeto es saludable, es un portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C o es un paciente de la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente, preferentemente un paciente con enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B y/o un paciente con enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

Las mutaciones, es decir de SMPD1, NPC1 o NPC2, serán detectadas si una muestra del sujeto se somete a una prueba genética para las mutaciones tal como aquí se describe. En una modalidad adicional de la presente invención, se utiliza una muestra de un sujeto saludable como una muestra de control o como una matriz en blanco en los métodos de la presente invención. Una matriz en blanco tal como se utiliza en la presente invención, es preferentemente una muestra de un sujeto saludable. Sin embargo, quedará entendido que dicha matriz en blanco puede contener un nivel nativo de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

En una modalidad de la presente invención, el nivel de un biomarcador indica que el sujeto padece de, o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno. El nivel del biomarcador determinado por el método de acuerdo con la presente invención se compara con un nivel de control del biomarcador, en donde el resultado de la comparación permite el diagnóstico de una enfermedad.

Más específicamente, el comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con el nivel de control del biomarcador, comprende comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con un valor de corte, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto se eleva, incrementa o es mayor en comparación con el valor de corte, esto indica que el sujeto está padeciendo de, o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick, y/o preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y/o es portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y/o en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto disminuye o es menor en comparación con un valor de corte, esto indica que el sujeto no padece o no está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick.

Lo mismo aplica si se compara una proporción de dos biomarcadores de acuerdo con la presente invención con un valor de corte, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es elevado, incrementado o mayor en comparación con el valor de corte, esto indica que el sujeto padece de o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, y/o preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y/o es portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, más preferentemente la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

El término "está en riesgo de desarrollar una enfermedad" tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente que probablemente un sujeto padece de la enfermedad y/o desarrollará la enfermedad o los síntomas asociados con la enfermedad, particularmente si no se aplica tratamiento. En relación con esto tiene que reconocerse que los LSDs son trastornos genéticos y por lo tanto el surgimiento de parientes, particularmente padres que tienen la enfermedad o que tienen una mutación conocida como la causa de la enfermedad, son indicativos de que un sujeto, por ejemplo, el niño de dos padres con enfermedad de Niemann-Pick tipo C, estará en riesgo de desarrollar la enfermedad. Se reconocerá en forma adicional que el progreso de una enfermedad está ligado al surgimiento de los síntomas así como a la severidad de los mismos. Por consiguiente, una persona que no padece de los síntomas actualmente, sin embargo, puede estar en riesgo de desarrollar la enfermedad, por ejemplo, aunque no estén presentes mutaciones genéticas de un gen, conocidas como la causa de la enfermedad, ni ocurran síntomas o síntomas severos. Sin embargo, se comprenderá que los métodos y biomarcadores de la presente invención, particularmente si el nivel(s) del biomarcador(s) de acuerdo con la presente invención está elevado, permiten el diagnóstico de si dicho sujeto está en riesgo de desarrollar la enfermedad, en forma independientemente de la presencia o ausencia de síntomas. Por consiguiente, los métodos de acuerdo con la presente invención permiten la determinación de si un sujeto está en riesgo de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick. También está dentro de la presente invención que se aplique, mantenga, reduzca, eleve o no se aplique terapia con base en si el sujeto está en riesgo de padecer o no de la enfermedad de Niemann-Pick.

También está dentro de la presente invención que el comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con un nivel de control, permite la determinación de la severidad de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, incrementado o es mayor en comparación con el nivel de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick de un estado o progreso más severo; y en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está disminuido o es menor en comparación con el nivel de control, esto indica que el sujeto está padeciendo o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick de un estado o progreso menos severo. En una modalidad adicional de la presente invención, la comparación del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con el nivel de control, comprende comparar el nivel del biomarcador en el sujeto con un nivel del biomarcador detectado en una muestra de un control, en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, incrementado o es mayor en comparación con una muestra de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de y/o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick; y/o un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, incrementado o es mayor en comparación con la muestra de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick de un estado o progreso más severo. Dicho control se selecciona preferentemente del grupo que comprende sujetos saludables, sujetos que padecen de enfermedad de Niemann-Pick o están en riesgo de padecer de los síntomas de la enfermedad de Niemann-Pick, sujetos que son probados en forma positiva para una mutación o una combinación de mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2, en donde la mutación o la combinación de mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2 indican una perspectiva de que el sujeto desarrolle la enfermedad de Niemann-Pick tipo C de un estatus o progreso más severo o menos severo. En una modalidad adicional de la presente invención, el nivel de control se determina en una muestra a partir de un control, en donde opcionalmente la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 se agregan a la muestra del control en una cantidad específica antes de determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en la muestra de control.

Es el mérito de la presente invención que se pueda establecer un método para diagnosticar enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto pueda ser establecido, en donde el método comprende detectar un biomarcador en una muestra de un sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, en donde dicho método comprende preferentemente en forma adicional terminar un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto, y más preferentemente comprende en forma adicional comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con un valor de corte, lo cual muestra alta sensibilidad, es decir, una sensibilidad de al menos el 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o 100%. En otras palabras la sensibilidad, lo cual significa la proporción de los positivos actuales que se identifican correctamente como altos, lo cual significa que el porcentaje de pacientes con enfermedad de Niemann-Pick identificados en forma correcta como teniendo la enfermedad, es tan alto como se ha indicado anteriormente. En contraste, en una prueba estadística tal como aquí se describe, la especificidad significa la proporción de negativos que están identificados correctamente como negativos, en otras palabras el porcentaje de pacientes saludables identificados correctamente como que no tienen la enfermedad de Niemann-Pick. Un experto en la técnica reconocerá que por lo tanto una predicción de una prueba de diagnóstico, tal como en algunas modalidades, de los métodos de acuerdo con la presente invención, se dirige en general a lograr el 100% de sensibilidad, es decir, predecir a todos los pacientes que tengan una enfermedad, tal como enfermedad de Niemann-Pick o que estén en riesgo de padecer de la enfermedad, como teniendo la enfermedad o estando en riesgo de padecer de la enfermedad, respectivamente. En una modalidad de los métodos de acuerdo con la presente invención, se prefiere una especificidad de al menos el 80.0%, 85.0%), 90.0%, 95.0%, 97.5%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%), 99.9% o 100%. En una modalidad adicional de la presente invención de los métodos de acuerdo con la presente invención, los métodos permiten el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto en forma independiente del estatus de progreso de la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto. Más específicamente, los métodos de la presente invención permiten el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que tiene un estatus temprano de la enfermedad de Niemann-Pick, así como en un sujeto que tiene un estatus avanzado o con progreso de la enfermedad de Niemann-Pick.

La potencia de un método para diagnosticar en forma correcta la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C o al portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, se mide comúnmente como la sensibilidad del método, la especificidad del método o el área bajo una curva característica operada por receptor (también referida en la presente invención como "curva ROC"). Una curva ROC es un trazo del rango positivo real contra el rango positivo falso de los diferentes valores de corte posibles de un método de diagnóstico. Una curva ROC muestra la relación entre sensibilidad y especificidad. La sensibilidad es el porcentaje de positivos reales que se predicen a través de la prueba como positivos, aunque la especificidad es el porcentaje de los negativos reales que se predicen mediante una prueba como negativo. Una curva ROC proporciona la sensibilidad de una prueba como una función de la especificidad 1. Entre mayor es el área bajo la curva ROC, más potente es el valor predictivo de la prueba. Por consiguiente, un incremento en sensibilidad estará acompañado por una disminución en la especificidad. Entre más cerrada está la curva después del eje de la izquierda y posteriormente el borde superior del espacio ROC, más precisa es la prueba. En forma inversa, entre más cerrada está la curva que está en 45 grados en la diagonal de la gráfica ROC, menos precisa es la prueba. Por consiguiente, el área bajo la ROC es una medida de la precisión de la prueba. La precisión de la prueba depende de que tan bien separa la prueba el grupo que está siendo probado en aquellos con y sin la enfermedad en cuestión. Un área bajo la curva (también referido en la presente invención como "AUC") de 1 representa un método perfecto, mientras que un área de 0.5 representa un método menos útil. Por lo tanto, los métodos de diagnóstico preferidos de la presente invención tienen una AUC mayor a 0.50, los métodos más preferidos tienen una AUC mayor a 0.9 y los métodos aún más preferidos tienen una AUC mayor a 0.97.

Otras medidas útiles y adecuadas para la utilidad del método, son el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo. Un valor predictivo positivo es el porcentaje de los positivos reales de que la prueba es positiva. Un valor predictivo negativo es el porcentaje de los negativos reales de que la prueba es negativa.

Un experto en la técnica reconocerá que aunque la especificidad y/o sensibilidad de los métodos de acuerdo con la presente invención es tan alta como se describió anteriormente, y que se determinaron tal como se describe en los Ejemplos que se encuentran más adelante, no se pueden excluir casos individuales en donde el paciente que tiene la enfermedad de Niemann-Pick será probado como negativo falso, o en donde un paciente que no tiene la enfermedad de Niemann-Pick será probado como positivo falso con un método de la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que de acuerdo con los métodos de acuerdo con la presente invención, en donde el nivel de un biomarcador o la proporción de niveles de dos biomarcadores, se compara con el valor de corte, y en donde la comparación con el valor de corte es para utilizarse para diagnosticar en forma diferencial una enfermedad, en donde los métodos comprenden cada uno cualquiera de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, el valor de corte representa un nivel de biomarcador y/o un valor de la proporción que diferencia una enfermedad particular de otra, por ejemplo, que diferencia un nivel de un biomarcador que indica que el sujeto tiene la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B de un nivel de un biomarcador que indica que el sujeto tiene la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y/o de un nivel y/o valor en un sujeto saludable. Teniendo esto, es obvio que el experto en la técnica de acuerdo con los métodos de la presente invención, en donde el método es para diagnosticar en forma diferencial la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y/o el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, tampoco se pueden excluir casos individuales en donde un paciente que tiene la enfermedad de Niemann-Pick será probado como negativo falso, o en donde un paciente que no tiene la enfermedad de Niemann-Pick será probado como positivo falso, o en donde el tipo y/o estatus es diagnosticado en forma incorrecta con un método de la presente invención.

Tomando en cuenta los casos determinando al mismo tiempo la especificidad y la sensibilidad del método de acuerdo con la presente invención, la especificidad y la sensibilidad serán menores que los valores descritos anteriormente. Sin embargo, los expertos en la técnica también reconocerán que dicha alta especificidad y dicha alta sensibilidad, tal como han sido señaladas anteriormente nunca han sido descritas antes para un método de diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick. Por consiguiente es importante observar que aunque puedan variar la sensibilidad y la especificidad del método de la presente invención, si los colectivos de pacientes, además del reportado en la parte de Ejemplos, por ejemplo, al variar el número de pacientes, se someten a los métodos de la presente invención, es la firme creencia de los inventores de la presente invención que ningún método conocido en la técnica anterior que utilice especialmente biomarcadores, logrará una mayor especificidad y una mayor sensibilidad en comparación con los métodos de acuerdo con la presente invención. Esto es especialmente real ya que el límite de detección de los métodos de la presente invención permite la determinación del nivel de liso-esfingomielina libre y compuesto 509 en sujetos saludables. Por consiguiente, un sujeto enfermo que probó un negativo falso aplicando los métodos de la presente invención, es un negativo falso probado por la razón de que un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto enfermo probado como negativo falso, es tan alto como el nivel de biomarcador en una muestra de un sujeto saludable. Es importante en particular observar que el sujeto probado como negativo falso no es un negativo probado por la razón de que el nivel del biomarcador fue demasiado bajo para ser determinado por el método de la presente invención.

Un "límite de detección" de una sustancia tal como liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, tal como se utiliza en la presente invención, preferentemente es un nivel de la sustancia determinada por un método para determinar un nivel de la sustancia, en donde el nivel menor a o inferior al límite de detección no puede ser determinado por el método. Por lo tanto queda claro que un "valor de corte" y un "límite de detección", tal como se utiliza en la presente invención, preferentemente no son necesariamente idénticos, aunque ambos reflejan un cierto nivel de una sustancia, por ejemplo de un biomarcador de la presente invención. Quedará entendido que en contraste, el valor de corte será seleccionado preferentemente de modo que la selectividad y la sensibilidad del método sean tan altos como sea posible. En contraste con esto, un límite de detección representa un nivel absoluto del biomarcador de la presente invención que refleja el nivel mínimo de biomarcador lo cual se puede detectar con un método para determinar el nivel del biomarcador. Queda claro que un límite de detección depende del método para determinar un nivel de una sustancia y en la sustancia, cuyo nivel será determinado a través del método. Un experto en la técnica comprenderá que un límite de detección alto, por ejemplo, mayor a un valor de corte ideal puede resultar posiblemente en una baja sensibilidad del método, ya que el porcentaje de positivos reales que son anticipados por una prueba que será positiva, también depende de si el nivel de biomarcador puede ser determinado para los positivos reales. En otras palabras, si el límite de detección es mayor a un valor de corte ideal, los positivos reales que tienen un nivel de biomarcador ligeramente mayores al valor de corte, pueden no ser distinguidos de los negativos reales que tienen el nivel del biomarcador menor al valor de corte, ya que no se puede determinar el nivel del biomarcador para ambos positivos reales que tienen un nivel de biomarcador ligeramente mayor que el valor de corte, y los negativos que tienen un nivel de biomarcador menor que el valor de corte. Por lo tanto queda claro que es conveniente un bajo nivel de detección. Por consiguiente también es el mérito de los inventores de la presente invención mostrar que un límite de detección inferior permite un método de diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende el paso de determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra con mayor sensibilidad y selectividad. Un "valor de corte ideal" tal como se utiliza en la presente invención, es preferentemente el valor de corte tal como aquí se describe, en donde el método que utiliza el valor de corte ideal, tiene la más alta selectividad y sensibilidad.

Es una modalidad de los métodos de acuerdo con la presente invención comprender un paso para validar el método mediante el diagnóstico de una enfermedad o trastorno, preferentemente la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto a través del método de la presente invención; un paso para diagnosticar la enfermedad o trastorno, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick, en un sujeto mediante pruebas genéticas, en donde el método comprende secuenciar un gen, secuenciar preferentemente de un gen una mutación de la cual un experto en la técnica sabe que origina la enfermedad o trastorno, más preferentemente secuenciar los genes NPC1 y NPC2 en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el gen SMPD1 en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B; y comparar los resultados del método con las pruebas genéticas. Un sujeto saludable, tal como aquí se utiliza, se considerado preferentemente como saludable con respecto a una enfermedad o trastorno, si el sujeto no padece de síntomas asociados con la enfermedad o trastorno, y si el resultado de las pruebas genéticas no revela mutaciones de un gen, cuya mutación es conocida por los expertos en la técnica, por originar la enfermedad o trastorno. También queda entendido que un sujeto saludable es un sujeto que probó positivamente para no tener la enfermedad de Niemann-Pick. En una modalidad preferida, un sujeto saludable es un sujeto que no es un portador de la enfermedad de Niemann-Pick, más preferentemente, no está siendo un portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

El término "calificar el estatus de la enfermedad de Niemann-Pick" en un sujeto tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente una clasificación del perfil de biomarcador del sujeto seleccionado del grupo que comprende identificar o detectar la presencia o ausencia de la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto, predecir la generación de o el riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto, determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, determinar y/o predecir la severidad de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, determinar si el sujeto padece de un estatus temprano de la enfermedad de Niemann-Pick o un estatus avanzado o progreso de la enfermedad de Niemann-Pick o para determinar si el nivel de un biomarcador en un sujeto ha cambiado significativamente con el tiempo.

El término "manejo de tratamiento del sujeto" o "manejo del sujeto" tal como se utiliza en la presente invención, se refieren preferentemente al comportamiento del especialista o médico en forma subsecuente a la determinación del estatus de la enfermedad de Niemann-Pick. Por ejemplo, si el resultado del método de acuerdo con la presente invención queda inconcluso, o existe una razón para la cual sea necesaria la confirmación del estatus, el médico puede ordenar nuevas pruebas, tal como pruebas para la función de las proteínas afectadas y/o la secuenciación de los genes SMPD1, N PC 1 y NPC2, respectivamente. Como alternativa, si el estatus indica que el tratar la enfermedad de Niemann-Pick es lo adecuado, el médico puede programar al sujeto para tratamiento para la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B o enfermedad de Niemann-Pick tipo C. De igual manera, si el estatus es negativo, o si los resultados muestran que el tratamiento ha tenido éxito, puede no ser necesario un manejo adicional. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que además de la terapia genética, se puede aplicar cualquier terapia. Además es una modalidad de la presente invención que el manejo del tratamiento del sujeto comprenda la titulación de una dosis de un fármaco aplicado como un tratamiento para enfermedad de Niemann-Pick, por ejemplo, unidades de enzima recombinante aplicadas en ERT, administradas a un paciente. En algunas modalidades de los métodos de la presente invención, en donde un nivel de biomarcador presente en una muestra de un sujeto y/o una proporción de niveles de dos biomarcadores se determina en diversos puntos en el tiempo, o se compara con los otros niveles del biomarcador, un valor de corte y/o un nivel del biomarcador en un control y/o otro valor de la proporción de los niveles de dos biomarcadores, un experto en la técnica aplicará o no aplicará una terapia, o modificar una terapia ya aplicada con el objeto de tratar o no tratar, o continuar tratando la enfermedad de Niemann-Pick.

Está dentro de la presente invención que un experto en la técnica aplique una dosis y/o mantenga una dosificación o modificación de una dosificación por ejemplo aplicar una dosificación o una mayor dosificación, es decir, elevar una dosis, si dicha comparación del nivel de un biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores muestra, por ejemplo, que el nivel del biomarcador y/o la proporción de niveles de los dos biomarcadores es mayor que por ejemplo, un valor de corte, es decir el paciente es diagnosticado por tener enfermedad de Niemann-Pick; o que un nivel y/o proporción determinada en el mismo paciente antes en el tiempo, es menor o la misma, es decir, una terapia aplicada no es suficiente, es decir, no da como resultado una disminución en el nivel. Por otra parte los expertos en la técnica aplicarán o no aplicarán una dosificación o mantendrán o reducirán una dosificación, por ejemplo, no aplicarán dosificación o una dosificación menor, es decir, disminución de una dosis, si dicha comparación del nivel y/o la proporción del nivel de uno/dos biomarcadores muestra, por ejemplo, que el nivel del biomarcador y/o la proporción de los niveles de los dos biomarcadores es menor a la de por ejemplo, un valor de corte, es decir, el paciente es diagnosticado no teniendo la enfermedad de Niemann-Pick; o que un nivel y/o una proporción determinada del mismo paciente anteriormente en el tiempo es mayor, es decir, una terapia aplicada es suficiente, es decir, da como resultado una disminución en el nivel. En una modalidad de la presente invención, un nivel relativamente alto de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 con base en dicha comparación indica la aplicación de una alta dosis de una enzima recombinante aplicada en ERT y/o un nivel relativamente bajo de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 con base en dicha comparación, indica la aplicación de una dosis baja de enzima recombinante aplicada en ERT. Sin embargo, quedará entendido que un experto en la técnica considerará la historia del paciente, es decir, un experto que maneja el tratamiento en cuestión de un paciente que padece la enfermedad de Niemann-Pick, o que está siendo tratado, de modo que un nivel del biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores sea menor al valor de corte, por ejemplo, no decidirá detener el tratamiento en lugar de disminuir una dosis e incrementará el tiempo entre las aplicaciones adicionales de los métodos de la presente invención.

El curso de la enfermedad de Niemann-Pick puede determinarse a través del método de acuerdo con la presente invención, determinando un nivel del biomarcador y/o una proporción de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto en diferentes puntos en el tiempo en el curso de la enfermedad. Es importante observar que una sola aplicación de un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick de acuerdo con la presente invención permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, y en ciertas modalidades, comprende un paso para manejar el tratamiento del sujeto con base en el diagnóstico de si el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick. Si un sujeto cuya muestra es sometida al método de la presente invención prueba positiva para el padecimiento de o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, un experto en la técnica conocerá la manera de decidir con respecto al manejo del tratamiento del sujeto, es decir, como será tratado el sujeto, por ejemplo, aplicar una cierta dosis de enzimas en relación con un ERT. Quedará entendido que en forma independiente de la decisión del experto en la técnica en cómo manejar el tratamiento del sujeto, el experto decidirá para al menos una aplicación adicional del método de acuerdo con la presente invención en el punto en el tiempo posterior. Es por lo tanto una modalidad de la presente invención, que se puedan comparar los niveles del biomarcador y/o una proporción de los niveles de dos biomarcadores determinados en diferentes puntos de tiempo, en donde los diferentes puntos de tiempo significan al menos dos puntos de tiempo. Sin pretender limitarse a cualquier teoría, los inventores de la presente invención han descubierto que el nivel del biomarcador de la presente invención y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores en muestras de un paciente en particular, pueden correlacionarse con la severidad de la enfermedad en el paciente, en el punto en el tiempo en el que se tomó la muestra del paciente. Quedará entendido por lo tanto que un nivel elevado del biomarcador y/o una proporción elevada de los niveles de los dos biomarcadores determinado en la muestra del punto en el tiempo posterior en comparación con el nivel de biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores determinados en la muestra de un punto en el tiempo anterior, indica un estatus más severo del sujeto en el punto en el tiempo posterior en comparación con el estatus del sujeto en el punto en el tiempo anterior. Un nivel disminuido del biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores determinado en la muestra de un punto en el tiempo posterior en comparación con el nivel y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores del biomarcador determinados en la muestra de un punto en el tiempo anterior, indica un estatus menos severo del sujeto en el punto en el tiempo posterior en comparación con el estatus del sujeto en el punto en el tiempo anterior. Por consiguiente, en un aspecto la presente invención proporciona un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende el paso de determinar en diferentes puntos en el tiempo, un nivel de un biomarcador y/o una proporción de los niveles de dos biomarcadores presentes en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509. En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que está siendo probado positivo para el padecimiento de o que está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende el paso de determinar en varios puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador y/o una proporción de niveles de dos biomarcadores presentes en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509. Quedará entendido por un experto en la técnica que los métodos de la presente invención permiten por lo tanto seleccionar una terapia y/o ajustar las dosis y/o la dosis de una terapia seleccionada con base en los resultados del método de la presente invención. Si por ejemplo el sujeto está programado para tratar la enfermedad de Niemann-Pick, el método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede aplicarse cada 3 meses y los niveles del biomarcador y/o una proporción de los niveles de dos biomarcadores que se determinan de esta forma, se compararán con el objeto de determinar la efectividad del tratamiento(s) y/o la terapia/terapias aplicadas al sujeto. Si el sujeto alcanza un estatus, en donde un nivel estable del biomarcador y/o proporción estable de los niveles de dos biomarcadores se mantiene con el tiempo, se puede reducir a cada 6 meses la frecuencia de la aplicación del método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención. Si se cambia la dosis de la terapia, por ejemplo, se reducen o incrementan las unidades de enzima recombinante aplicada en ERT, se puede ajustar nuevamente a cada 3 meses la frecuencia de aplicación del método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención. Mediante la comparación de los niveles determinados del biomarcador y/o las proporciones de los niveles de dos biomarcadores en las muestras del sujeto, el experto en la técnica reconocerá si el nivel del biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores incrementa, disminuye o si se mantiene con el tiempo un nivel estable del biomarcador y/o una proporción estable de los niveles de dos biomarcadores. Por consiguiente, el experto en la técnica decidirá reducir la dosificación de la terapia, por ejemplo, las unidades de la enzima recombinante aplicada en ERT; para incrementar la dosis de la terapia; o para mantener la dosis de la terapia de acuerdo con la comparación de los niveles del biomarcador y/o las proporciones de los niveles de dos biomarcadores determinado con el método de acuerdo con la presente invención. Una reducción de aproximadamente 60% del nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 dentro de un período de 12 meses indica una terapia exitosa para enfermedad de Niemann-Pick, en donde la reducción, tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente que el nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 determinado por el método de la presente invención determinado al final de un período de tiempo, se compara con el nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 determinado por el método de la presente invención, determinado al comienzo de dicho período de tiempo. Por consiguiente, el experto en la técnica puede decidir reducir la dosificación de la terapia aplicada, o mantener la dosis de la terapia. Si la reducción del nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 es significativamente más débil, el experto en la técnica puede decidir incrementa la dosis de la terapia. También es un mérito de los inventores de la presente invención haber reconocido que la reducción del nivel de liso-esfingomielina libre y la reducción del compuesto 509, se correlaciona con la efectividad de una terapia. Entre más fuerte es la reducción del nivel de la liso-esfingomielina libre y/o más fuerte es la reducción del nivel del compuesto 509 dentro de un período de tiempo, por ejemplo, 12 meses, más exitosa es la terapia, tal como por ejemplo ERT, SRT o una terapia a base de chaperón. Por lo tanto es una modalidad adicional de la presente invención, que el método de la presente invención sea para comparar la efectividad de una terapia o de al menos dos terapias aplicadas al sujeto.

Un experto en la técnica reconocerá por lo tanto que el progreso, es decir, el curso de la enfermedad de Niemann-Pick, así como la efectividad de una terapia en un sujeto puede ser monitoreada mediante la determinación frecuente del nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores en muestras del sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que es probado en forma positiva por padecer de o estar en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende el paso de determinar en diversos puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores presentes en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509. En relación con lo que se ha descrito anteriormente en relación con manejar el tratamiento del sujeto, un experto en la técnica comprenderá que la efectividad de un tratamiento o la combinación de al menos dos tratamientos se puede comparar aplicando los métodos de la presente invención. Por lo tanto es posible probar y comparar diversos fármacos nuevos, formas de dosificación, dosificaciones o tratamientos de la enfermedad de Niemann-Pick a través del método de la presente invención.

Es una modalidad de la presente invención que el método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick de acuerdo con la presente invención, sea independiente de si el sujeto ha o no sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick. Por lo tanto la muestra del sujeto puede ser una muestra de un sujeto quien ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick, así como una muestra de un sujeto quien no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick. Es una modalidad adicional de la presente invención, que el método de la presente invención comprenda un paso para manejar el tratamiento del sujeto y/o determinar un nivel del biomarcador y/o una proporción de niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto después del manejo del sujeto. Dicho tratamiento del sujeto puede estar basado en el diagnóstico de si el sujeto padece de, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick; en la detección del biomarcador en una muestra del sujeto después del manejo; o en la determinación del nivel del biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto después del manejo del mismo. Sin embargo un experto en la técnica comprenderá que una muestra de algunos pacientes que no tienen la enfermedad de Niemann-Pick o de algunos pacientes que están siendo tratados con éxito para la enfermedad de Niemann-Pick, mostraran un nivel de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 menor al del límite de detección.

Sin pretender limitarse a la teoría los inventores de la presente invención asumen que el nivel de liso-esfingomielina libre y el nivel del compuesto 509, y la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, presentes en una muestra de un sujeto se correlaciona en forma adicional con la severidad de la enfermedad en un sujeto que padece de la enfermedad de Niemann-Pick. En relación con esto, los inventores de la presente invención asumen que aunque, en principio, el nivel de la liso-esfingomielina libre, el nivel del compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre es diferente en individuos particulares, y más específicamente puede ser diferente en individuos particulares que tienen la misma mutación(s), que entre mayor es el nivel de la liso-esfingomielina libre, un nivel del compuesto 509 y una proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del liso-esfingomielina libre, respectivamente, mayor es la severidad del curso de una enfermedad de Niemann-Pick en términos de promedio estadístico de acuerdo con una calificación clínica. Por lo tanto el nivel de la liso-esfingomielina libre, el nivel del compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, se correlaciona con la severidad de la enfermedad de Niemann-Pickm, en cuanto a que los pacientes están siendo probados positivamente para distintas mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2, respectivamente que son conocidos por originar generalmente un curso de leve a más moderado de la enfermedad de Niemann-Pick, un nivel de la liso-esfingomielina libre, un nivel del compuesto 509 y/o una proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, determinado en los pacientes se correlaciona estadísticamente con la severidad relacionada generalmente con dicha mutación.

Por lo tanto, una modalidad adicional de los diferentes aspectos de la presente invención, se refiere a un método para determinar la severidad de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los pasos de a) determinar un nivel del biomarcador y/o una proporción de los niveles de dos biomarcadores presentes en la muestra del sujeto, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, y el paso de: b) determinar la severidad de la enfermedad de Niemann-Pick, por ejemplo comparando el nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la proporción de niveles de dos biomarcadores en un sujeto, determinada preferentemente a través de un método de la presente invención para una calificación clínica.

En relación con esto, es importante observar que si un nivel de la liso-esfingomielina libre, el nivel del compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso- esfingomielina libre, respectivamente, se determina en muestras de pacientes que padecen de la enfermedad de Niemann-Pick que muestra una mutación normalmente enlazada a un curso más severo de la enfermedad de Niemann-Pick al momento de la secuenciación del gen respectivo (homocigoso y compuesto heterocigoso) sometido a un método de la presente invención, un nivel promedio de la liso-esfingomielina libre, el compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, es mayor que el nivel promedio de la liso-esfingomielina libre, el compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel dé la liso-esfingomielina libre, respectivamente, determinado en muestras de los pacientes que padecen de la enfermedad de Niemann-Pick, lo que muestra una mutación normalmente enlazada a un curso más leve de la enfermedad de Niemann-Pick al momento de secuenciar el gen respectivo, aplicando el mismo método. Una "mutación normalmente enlazada a un curso más severo de la enfermedad de Niemann-Pick" tal como se utiliza en la presente invención, es preferentemente conocido por originar un curso más severo de la enfermedad de Niemann-Pick - esto es especialmente real en el caso en el que el sujeto es homocigoso para dicha mutación. En forma correspondiente a esto, en una modalidad se determina un nivel promedio mayor de liso-esfingomielina libre, el compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, en el homocigoso en comparación con la mutación homocigosa normalmente enlazada a un curso más leve de la enfermedad de Niemann-Pick. Además, los pacientes que tienen un compuesto heterocigoso normalmente enlazado a un curso más severo de la enfermedad de Niemann-Pick, tienen un nivel de liso-esfingomielina libre, un nivel del compuesto 509 y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del liso-esfingomielina libre significativamente menores, respectivamente, que los homocigosos. Un experto en la técnica conocerá las calificaciones clínicas para categorizar la severidad de la enfermedad o síntomas de la enfermedad Niemann-Pick o una totalidad de los síntomas de la misma. Por lo tanto es una modalidad del método de la presente invención, que el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un paciente sea anticipado, y más particularmente, la severidad de la enfermedad de Niemann-Pick sea determinada con base en el nivel del biomarcador determinado de acuerdo con el método de la presente invención.

Un experto en la técnica reconocerá que un nivel del biomarcador de la presente invención determinado en una muestra de un sujeto, en donde el nivel del biomarcador se correlaciona con la severidad de la enfermedad de Niemann-Pick tal como se describió anteriormente, indicará la aplicación de una cierta terapia y/o la dosis o dosificación de dicha terapia. Por ejemplo, si el nivel del biomarcador y/o la proporción de los niveles de dos biomarcadores determinada de acuerdo con los métodos de la presente invención se correlaciona con un estatus de la enfermedad de Niemann-Pick "severo", el sujeto se programa para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick y el método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención, puede aplicarse cada 3 meses y los niveles del biomarcador determinados de esta forma serán comparados con el objeto de determinar la efectividad del tratamiento(s) y/o la terapia/terapias aplicadas al sujeto. Si el sujeto alcanza un estatus, en donde el nivel del biomarcador y/o la proporción de los niveles de los dos biomarcadores, respectivamente, se correlaciona con una enfermedad de Niemann-Pick "leve", o en donde un nivel estable y/o proporción del biomarcador se mantiene con el tiempo, se puede reducir a cada 6 meses la frecuencia de aplicación del método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para determinar la efectividad de una composición para el tratamiento de enfermedad de Niemann-Pick. Dicho método puede comprender los pasos de determinar un nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o una proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, en un sujeto que tiene una enfermedad de Niemann-Pick; administrar al sujeto el compuesto en una cantidad suficiente para determinar la efectividad del compuesto; volver a determinar el nivel de la liso-esfingom ielina libre y/o el compuesto 509 y/o la proporción de los niveles del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, en el sujeto; comparar el nivel de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la proporción de los niveles del compuesto 509 con el nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, determinar antes y después de administrar la composición, en donde un nivel inferior de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o una proporción menor de los niveles del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre, respectivamente, determinados después de administrar la composición en comparación con el nivel de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la proporción de los niveles del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, respectivamente, determinados después de administrar la composición, indica la efectividad del compuesto para tratar la enfermedad de Niemann-Pick.

La enfermedad de Niemann-Pick afecta en su mayoría a niños y con frecuencia mueren en la juventud, y una edad no predecible, muchos a los pocos meses o años de nacimiento. Muchos otros niños mueren de esta enfermedad después de años de padecer de diversos síntomas del trastorno.

Un biomarcador preferible para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo C, puede permitir el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo C, con alta sensibilidad y alta especificidad independiente de la edad del sujeto.

Es el mérito de los inventores de la presente invención haber descubierto que los biomarcadores de la presente invención son útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto en forma independiente de la edad del mismo. Por lo tanto es una modalidad de la presente invención, que el método de la presente invención permita el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto en forma independiente de la edad. En una modalidad preferida, el sujeto del método de la presente invención, es un sujeto de edad joven. Un sujeto de edad joven tal como aquí se utiliza es preferentemente un sujeto con menos de 30 años de edad, más preferentemente menos de 20 años de edad y lo más preferentemente menos de 10 años de edad.

Breve Descripción de las Figuras La presente invención se ilustra en forma adicional a continuación a través de las siguientes figuras y ejemplos de los cuales se pueden tomar características, modalidades y ventajas adicionales.

Más específicamente: La figura 1, es un diagrama de recuadros que indica los niveles del compuesto 465 en ng/ml de plasma; La figura 2, es un diagrama de recuadros que indica los niveles del compuesto 509 en ng/ml de plasma; La figura 3, es un diagrama de recuadros que indica la proporción de los niveles del compuesto 509 a los niveles del compuesto 465; Las figuras 4A, 4B y 4C, son gráficas que muestran características de operación del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP tipo A y B; Las figuras 5A, 5B y 5C, son gráficas que muestran las curvas características de operación del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP tipo C; La figura 6, es una gráfica que muestra las curvas características de operación del receptor (ROC) del compuesto 465 y del compuesto 509 para el diagnóstico del portador de NP tipo C; la figura 7, es un diagrama que muestra los niveles en plasma de un biomarcador de la presente invención como una función con el tiempo para un total de 6 pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y 1 portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; La figura 8A, es un cromatograma de espectrometría de masa HPLC que muestra la intensidad pico de la liso-esfingomielina libre, el compuesto 509 y IS de un sujeto saludable.

Las figuras 8B, 8C, 8D y 8E, son cromatogramas de espectrometría de masa HPLC que muestran la intensidad pico de la liso-esfingomielina libre, el compuesto 509 y el IS del paciente de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; Las figuras 9A, 9B, 9C y 9D, son diagramas de recuadros o gráficas de dispersión que indican los niveles del compuesto 465 o el compuesto 509 en ng/ml de plasma, dependiendo de la edad de los pacientes.

Ejemplos En los Ejemplos que se describen a continuación se utilizó plasma humano como una muestra de un sujeto. Sin embargo un experto en la técnica reconocerá que dependiendo del tipo de muestra utilizado procedente del sujeto, por ejemplo, que comprende saliva, licor, plasma, suero, sangre completa, sangre en una tarjeta de filtro de sangre seca u otro producto de sangre, el método de la presente invención tiene que ser ajustado al tipo de muestra y en forma adicional se tiene que determinar un valor de corte para cada tipo de muestra de acuerdo con el método descrito en los ejemplos que se encuentran a continuación. Los inventores de la presente invención han descubierto que utilizando una muestra de suero humano en el método tal como se describe más adelante, en lugar de una muestra de plasma humano, conducirá a resultados idénticos en términos del nivel de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, respectivamente, si la muestra de suero humano y la muestra de plasma humano se toman del mismo sujeto, en el mismo punto de tiempo y si las muestras fueron medidas en paralelo; y más particularmente, conducirán al mismo valor de corte.

Ejemplo 1: Método para la detección de liso-esfingomielina libre v/o el compuesto 509 en suero humano Equipo Para detectar la liso-esfingomielina libre y/o una sustancia con un peso molecular de 508, detectado como transición MRM en modo positivo de 509 m/z a 184 m/z, también referido en la presente invención como el compuesto 509 en una muestra de plasma del sujeto, se utilizó el equipo que se encuentra a continuación: Aparato/Pieza de Equipo Tipo/Productor Bomba HPLC Serie 200, Perkin Elmer, E.U.A.

Inyector de muestras Serie 200, Perkin Elmer, E.U.A.

Horno de columna Serie 200, Perkin Elmer, E.U.A.

Detector selectivo de masa API 4000 Q TRAP, AB SCIEX, E.U.A./Canadá Vortizador de tubo múltiple DVX-2500 Henry Troemner LLC, E.U.A.

Mezclador de vórtice Vortex Genie 2; Scientific Industries, E.U.A.

Centrifugador Megafuge 1.0; Heraeus, Alemania Multipipeta(s), pipeta(s) Eppendorf, Alemania Baño de agua SW21-C, Julabo, Alemania Reactivos Para detectar liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en una muestra de plasma de un sujeto se utilizaron los siguientes reactivos.

Hasta el grado en que los valores dependen de la temperatura (por ejemplo el valor de pH) dichos valores fueron determinados a una temperatura de 25°C.

Reactivo Pureza Acetonitrilo (ACN) grado HPLC o grado Gradiente Acetona 99.5 Dimetilsulfóxido (DMSO) grado HPLC Etanol (EtOH) p.a., 96 % Ácido fórmico (FA) p.a. ,98 a 100% Metanol (MeOH) Gradiente (LiChrosolv) Acido trifluoroacético (TFA) puro > 98 % Agua ASTM-I La abreviatura "p.a." tal como se utiliza en la presente invención significa "pro análisis".

El término "puro" tal como se utiliza en la presente invención, significa preferentemente un grado comercial de un compuesto químico que tiene una pureza superior al valor especificado.

ASTM-I, tal como se utiliza en la presente invención se refiere a agua con un grado de pureza estándar logrado mediante métodos de purificación que comprenden Ósmosis Inversa y Oxidación Ultravioleta (UV).

Preparación de Estándares de Calibración Se preparó una solución de reserva de Liso-Esfingomielina disolviendo 2.16 mg de Liso-Esfingomielina (tal como se determina mediante Matreya, pureza manifestada como 95.1%) en 5 mL de MeOH/agua (1:4; v/v).

Subsecuentemente la solución de VI-A se preparó como una mezcla de 74 pL, de una solución de reserva Liso-Esfingomielina y 5 mL de MeOH/agua (1:4; v/v), tal como se muestra a continuación: Marca de concentració Volumen solución volumen de solvente solución n exp. de solvente resultante fjg/mL] solución [mL] [pg/mL] VI-A 6.0803 74 Reserva de 5 DMSO/MeOH Liso- (1:4; v/v) Esfingomielina Subsecuentemente se prepararon los estándares de calibración, adicionando la solución VI-A o Estándares de Calibración concentrados superiores en el solvente de MeOH/agua (1:1; v/v).

A continuación se mostrará un esquema de adición detallado.

Marca de concentración Volumen solución volume solvente Volumen solución [ng/mL] de n de [mi] resultant solución solvent e [pg/mL] e [ml_] Std5A- 200.26 119.2 VI-A 3.5 MeOH/agua 3.0303 NPC (1:1; v/v) Std4A- 60.002 29.9 VI-A MeOH/agua 3.0927 NPC (1:1; v/v) Std3A- 18.040 297 Std5A-NPC 3 MeOH/agua 3.297 NPC (1:1; v/v) Std2A- 6.0025 92.7 Std5A-NPC 3 MeOH/agua 3.0299 NPC (1:1; v/v) StdlA- 2.0024 30.3 Std5A-NPC 3 MeOH/agua 3.6192 NPC (1:1; v/v) Se utilizaron todos los estándares de calibración mencionados anteriormente que tienen cinco niveles de concentración entre 2.00 y 200 ng/mL.

Preparación de Muestras de Control.

Las muestras de control se prepararon adicionando la solución VI-A en una matriz en blanco.

A continuación se muestra un esquema de adicionam iento detallado.

Marca de concentración Volumen de solución volumen de Volumen [mi] solución [ng/mL] solución matriz en resultante [pg/mL] blanco [mL] QC-A1- concentración 3* nativa NPC QC-B1- 100.07 50.2 VI-A 3.0502 NPC * la concentración nativa está debajo de 10 ng/mL, por consiguiente el nivel QC-B1-NPC se influencia fuertemente.

Matriz en Blanco Como una matriz en blanco, se utilizó plasma humano de un sujeto saludable. Un experto en la técnica reconoce que el plasma del sujeto saludable contendrá un nivel nativo de liso-esfingomielina libre y/o un nivel nativo del compuesto 509. Dicho nivel nativo de liso-esfingomielina libre es de aproximadamente 3.9 ng/ml de acuerdo con los métodos de la presente invención. Es obvio que las muestras de control preparadas adicionando la matriz en blanco, en donde la matriz en blanco comprende el nivel nativo de liso-esfingomielina libre y compuesto 509, respectivamente, también comprenden el nivel nativo de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 además del nivel de liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 obtenido mediante la adición con una solución concentrada o una muestra de control más concentrada. Por consiguiente, el nivel de liso-esfingomielina libre en la muestra de control es como se indica: QC-B1-NPC 100 ng/mL + concentración activa en matriz en blanco Un experto en la técnica reconocerá que el plasma humano del sujeto saludable utilizado como la matriz en blanco puede comprarse en cualquier fuente comercial conocida por los expertos en la técnica. Es importante observar que si se utiliza accidentalmente el plasma de un sujeto no saludable, es decir, de un sujeto que tiene la enfermedad de Niemann-Pick como la matriz en blanco, esto dará como resultado niveles inusualmente altos de liso-esfingomielina libre o el compuesto 509 en las muestras de control determinado por el método de acuerdo con la presente invención, y por lo tanto se reconoció inmediatamente, que la tolerancia del método se determina como estando dentro del rango del 15% arriba o debajo de los niveles estimados de los controles sometidos al método de acuerdo con la presente invención.

Muestras del estudio Preparación de Estándar Interno Se preparó la solución de reserva del Estándar Interno ( I S 1 ) disolviendo 1.00 mg del Lyso-Gb2 (tal como lo proporciona Matreya) en 2 ml_ de DMSO/MeOH (1/1; vol/vol).

En forma subsecuente, se preparó la solución de Trabajo del Estándar Interno como una mezcla de 410 µ?_ de la solución de reserva IS1 y 500 mL de etanol. El etanol se puede comprar de cualquier fuente comercial, en donde el etanol es etanol absoluto que tiene un grado adecuado para los métodos aquí descritos. Un experto en la técnica reconocerá que las proteínas contenidas en 50 µ?_ de una muestra tienen que precipitarse si se agregan a la muestra 100 µ?_ de la solución de operación del Estándar Interno.

Almacenamiento de Muestras y Soluciones Las muestras de control o muestras de estudio fueron ya sea almacenadas inmediatamente a una temperatura debajo de -20°C en el momento o se transfirieron alícuotas en frascos de vidrio nuevos antes de almacenarse bajo las mismas condiciones.

Se congelaron soluciones concentradas (soluciones de reserva, V1-A-534 etc.), así como soluciones de reserva del Estándar Interno a una temperatura debajo de -20°C a la espera de la siguiente adición.

Las soluciones de operación del Estándar Interno se almacenaron a una temperatura de entre 2°C y 8°C hasta utilizarse.

Sin pretender limitarse a teoría alguna, los inventores de la presente invención asumen que la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, respectivamente, son estables en las soluciones antes mencionadas. En forma más precisa, el nivel de la liso-esfingomielina y el nivel del compuesto 509 de una muestra de plasma y/o una muestra de suero de un paciente con enfermedad de Niemann-Pick determinado mediante los métodos de acuerdo con la presente invención se encontraron como idénticos, si el nivel de nivel de liso-esfingomielina libre y, respectivamente, el nivel del compuesto 509 se determina en las muestras antes y después de almacenamiento a una temperatura de 37°C durante 2 días. Por consiguiente, las soluciones y las muestras de la presente invención pueden transportarse en una cantidad de formas bien conocidas para los expertos en la técnica, en donde el uso de una cadena fría para la transportación del material del paciente es preferida, aunque no necesariamente requerida. Un experto en la técnica también conocerá métodos y sus respectivas condiciones para el almacenamiento adecuado de las soluciones y muestras, por ejemplo, las soluciones y muestras se pueden almacenar durante varias semanas.

Preparación de Muestras para Análisis Todas las muestras utilizadas en el lote analítico se preparan para análisis como se indica a continuación: Las muestras congeladas se descongelaron a una temperatura de aproximadamente 20 a 25°C en un baño de agua, tomado de condiciones ambientales. Después de descongelarse, las muestras fueron mezcladas.

Se transfirieron 50 µ?_ de la muestra en un frasco de muestra Se agregaron a la muestra 100 µ?_ de la solución de operación del Estándar Interno (en EtOH) La mezcla obtenida de esta forma se mezcló subsecuentemente con un dispositivo vórtex DVX-2500 M u I titube en 2500 rpm durante aproximadamente 30 segundos La mezcla obtenida de esta forma se centrifugo para la separación de fase en 4000 rpm durante 2 minutos.

La transferencia de un volumen del sobrenadante adecuado para propósitos de inyección (aproximadamente 100 pL) en frascos automuestreadores adecuados (cónicos).

Métodos Parámetros C romatográf icos y de Automuestreador Las muestras preparadas para el análisis tal como se describió anteriormente, se sometieron subsecuentemente al método descrito a continuación: Parámetro Rango programado/descripción Solvente de fase móvil A 50 mM FA en agua Solvente de fase móvil B 50 mM FA en ACN/acetona (1:1, vol/vol) Corrida cromatográfica Gradiente lineal 0.0 - 4.0 min: 5% B?66%B Isocrático 4.1 -5.1 min: 100% B Isocrático 5.1 - 5.9 min: 5%B Flujo 0.9 mL/min Volumen de inyección 5µ?_ Descarga de inyector 0.1% TFA en 70% MeOH Columna + precolumna ACE 3 C8, 50 x 2.1 mm ID + Security Guard C8 Temperatura de columna 60°C Aproximadamente 3.2 a 3.4 min: liso-esfingomielina Tiempo de retención y liso-GB 2 (IS) aproximadamente 3.6 a 3.9 min: compuesto 509 La columna ACE 3 C8 (columna ACE C8 Nr. ACE- 12-0502) aquí utilizada ha sido comprada en Advanced Chromatografy Technologies, Aberdeen.

Una secuencia tal como aquí se utiliza en la presente invención, es preferentemente un lote de números de muestras definidos, preferentemente 250 en el máximo analizado en secuencias, en donde los parámetros que comprenden el flujo y la temperatura permanecen sin cambio. Los ajustes y calibraciones llevadas a cabo entre las secuencias son conocidas por los expertos en la técnica y comprenden intercambio de la columna. Estos ajustes dentro de los límites especificados son cambios menores y se registran dentro de los datos sin procesar del estudio en la estación de medición.

Detección Las muestras preparadas de esta forma se sometieron subsecuentemente al método de detección cuyos parámetros se describen a continuación: Modo de ionización MS: Ionización de Electrorocío (ESI) Polaridad MS: Positivo Modo de detección MS: Monitoreo de reacción múltiple (MRM) Temperatura de vaporizador: 500°C ± 50°C Voltaje de ionización: 5.5 kV Disociación colisionalmente activada Bajo gas (CAD): Gas 1: Presión = 45 psi Gas 2: Presión = 60 psi Gas de cortina: Presión = 40 psi Posición lateral: 5 unidades Posición vertical: 4 unidades Resolución de cuádruplo: unidad-?unidad Transiciones: 465.4? 184.1 m/z liso-esfingomielina 624.5? 282.2 m/z liso-Gb2 (Estándar Interno) 509.5? 184.1 m/z el compuesto 509 Transiciones 462.4? 282.2 m/z liso-Gb1 624.5? 282.2 m/z liso-Gb2 (Estándar Interno) DP (potencial de desagrupación) 40 V CXP (potencial de salida de célula de 8 V colisión) Un experto en la técnica podrá reconocer que los métodos para detectar la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509, y/o determinar el nivel de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en la muestra de un sujeto utilizando análisis de espectrometría de masa también pueden emplear otras transiciones y fragmentos que permiten la detección específica y/o cuantificación de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en la muestra de un sujeto.

Evaluación y Cálculo de Resultados Para evaluar y calcular los resultados obtenidos con los métodos especificados anteriormente, se aplicó el siguiente protocolo.

Procedimiento de Redondeo Se redondearon los datos de concentración alimentados y recuperados del sistema de datos cromatográficos (CDS) a cinco dígitos significativos. Se llevaron a cabo cálculos adicionales en la hoja de cálculo para una precisión de cómputo total y se redondearon en forma subsecuente para los lugares de dígitos/decimales significativos que serán reportados. Por lo tanto, pueden ocurrir desviaciones de los resultados intermedios originadas por el redondeo. La precisión y los coeficientes de variación (CV) se reportarán con uno y dos lugares de decimal, respectivamente.

Referencia al procedimiento de redondeo: El último dígito reportado puede ser redondeado hacia arriba si el dígito subsecuente es igual o mayor a "5".

Regresión y Estadísticas Con base en los estándares de calibración, se establecieron las adaptaciones de la curva de calibración utilizando el software de procesamiento de datos por medio de proporciones de área pico (área pico de la liso-fingomielina libre y el compuesto 509, respectivamente, contenido en la muestra del sujeto/área pico del Estándar Interno). Se evaluaron las concentraciones de liso-esf ingomielina y el compuesto 509 utilizando un modelo de regresión del método A de Estándar Interno cuadrático (y = ax2 + fox + c) utilizando el factor de ponderación 1/conc, que se utilizará para calcular la concentración de cada material para análisis en cada lote que será evaluado. Las concentraciones se calcularon por medio de la siguiente fórmula: Concentración = Con base en los valores promedio, se calcularon los resultados de precisión (en términos de CVs) y las precisiones (la fórmula se muestra más adelante) utilizando el programa "Lotus 123".

(V) recisión = Concentración calculada { o) precisión Concentración esperada Los modelos estadísticos adecuados se describen por ejemplo en las Publicaciones de Green, J.R., Statistical Treatment de Experimental Data (Tratamiento Estadístico de Datos Experimentales) (Elsevier, Nueva York, 1977), página 210 ff.

Lotar Sachs, Angewyte Statistik - Anwendung statistischer Metoden (Springer, Berlín, Heidelberg, Nueva York, Tokyo 1984).

Un experto en la técnica reconocerá que de acuerdo con una sustancia, cuya estructura molecular no se conoce, no se sintetiza una partida de referencia. La evaluación de dichas sustancias está basada por lo tanto en la proporción de área pico al Estándar Interno Agregado a cada muestra en comparación en pacientes y personas saludables, respectivamente.

Software Se llevó a cabo la adquisición de datos, procesamiento de datos, estadísticas y cálculos utilizando el software Analyst 1.4.2 o superior (AB SCIEX, USA/Canadá) asi como Lotus 1-2-3 97 o superior (Lotus Corp, E.U.A.).

Manuales Manual Arbeiten mit SmartSuite 97 (Lotus Development Corp., 1997) Documentación de Documentación del Software Analyst® (AB SCIEX, software utilizada USA/Canadá): Operator's Manual & Operator's Manual Addendum (Manual del Operador y Addendo del Manual del Operador) "New Functionality in Analyst 1.2" y Online Help System Analyst 1.4 (o superior) Ejemplo 2: Pruebas genéticas v clasificación de participantes de estudio Después del consentimiento por parte de los pacientes a participar en el estudio, los pacientes se sometieron a pruebas genéticas para mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2. Por consiguiente, de 5 a 10 mi de la sangre EDTA se secuenció de acuerdo con Seeman et al. (Seeman et al., 1995). Fueron adecuados otros genes además de que los genes SMPD1, NPC1 y NPC2 fueron secuenciados en forma adicional, particularmente en los controles. Dichas pruebas genéticas se controlaron utilizando muestras de prueba de pacientes de control con edad y sexo correspondientes.

Se analizaron 448 muestras de plasma de 304 sujetos. Más precisamente, para 274 pacientes estuvo disponible una muestra de plasma, para 14 pacientes dos muestras de plasma y para 16 pacientes más de dos muestras de plasma.

De acuerdo con el resultado de las pruebas genéticas descritas anteriormente, se clasificaron los pacientes que participan en el estudio en los siguientes grupos: 1.) Pacientes que tienen la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B: el estándar de oro para el diagnóstico fue la detección de dos mutaciones patogénicas dentro del gen SMPD1, ya sea homocigoso o un compuesto heterocigoso (el grupo es nombrado en las figuras como "Niemann-Pick tipo A/B"). 2. ) Pacientes que tienen la enfermedad de Niemann-Pick tipo C: el estándar de oro para el diagnóstico fue la detección de las mutaciones patógenas dentro del gen NPC1 o NPC2, ya sea homocigoso o compuesto heterocigoso (el grupo nombrado en las figuras como "Niemann-Pick tipo C"). 3. ) Pacientes que son portadores heterocigosos de una mutación dentro del gen NPC1 o NPC2 (normalmente parientes de los pacientes afectados) (el grupo es nombrado en las figuras como "portador de Niemann-Pick tipo C"). 4.) Pacientes con otros trastornos de almacenamiento lisosomal como control (el grupo es nombrado en las figuras como "otro LSD"); esto comprende pacientes con enfermedad de Krabbe, entre otras. Los pacientes que son probados en forma positiva para la enfermedad de Gaucher se agruparon por separado; todos los diagnósticos han sido probados mediante la detección de dos mutaciones patógenas. 5.) Controles saludables que corresponden en edad y género (el grupo es nombrado en las figuras como "control").

La distribución del género de los pacientes 304 se ilustra en la tabla 1 b.

Tabla 1b: 304 sujetos clasificados por género Todos r N> % (individuos) Total 304 Sexo Mujer 141 46.7 Hombre 161 53.3 Faltante 2 La siguiente tabla 1C muestra la distribución de la edad de los 304 pacientes y la clasificación de dichos pacientes con base en los resultados de las pruebas genéticas descritas, así como el género de dichos pacientes.

Tabla 1c: Características de paciente de 304 sujetos NPA/B NPC Portador NP C Gaucher Otras LSDs Controles saludables 106 N 18 36 16 14 114 106 Individual s % 5.9 11.8 5.3 4.6 37.5 34.9 Medidas 2.0 17.0 47.5 44.0 34.0 47.0 Edad en años (1.0-14) (7.8-25.0) (35.5-53.3) (27.5-58.0) (14.0-49.0) (36.0-54.0) (promedio, (n-11) (n=34) (n=14) (n=13) (n=91) (n=98) rango intercuartos) (número de casos) H(ombr M(ujer H M H H M H M H M e) ) n 9 9 17 19 8 8 10 4 59 53 38 68 % en ese 50.0 50.0 47.2 50.0 50.0 50.0 71.4 28.6 52.7 47.3 35.8 64.2 grupo Edad 1.0 10.5 14.0 19.0 47.5 47.0 44.0 48.5 24.0 44.0 47.5 46.5 (medio, (0-11) (2.5- (5.5- (10.0- (31.5- (38.0- (27.5- (20.8 (10.0 (26.0- (39.3 - (35.0- 47.0) 25.5) 24.0) 54.0) 52.8) 55.5) - - 50.0) 53.0 56.0) rangos 60.5) 49.0) intercuartos) El nivel de la liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 en las muestras de los 304 sujetos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1. La tabla 1d muestra el promedio y los niveles promedio de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, así como la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre en las muestras de los 304 sujetos.

Tabla 1d: Valores promedio rango intercuarto) diferentes grupos n 465 509 509/465 NPA/B 18 494.0 (274.6-634.8) 30.94 (17.78-41.84) 0.07 (0.06-0.10) NPC 36 18.0(12.5-24.7) 4.14(2.67-5.58) 0.24 (0.13-0.32) Portador NP 16 9.4 (6.7-12.6) 0.16(0.07-0.66) 0.03 (0.01-0.07) C Gaucher 14 3.0 (0.5-9.7) 0.09 (0.05-0.17) 0.01 (0.01-0.10) (n=13) 0.02 (n=13) Otros LSDs 5.3 (0.5-7.6) 0.04 (0.02-0.07) 0.01 (0.005-0.02) Control 4.7 (2.4-6.4) 0.04 (0.02-0.06) 0.01 (0.005-0.02) El nivel de liso-esfingomielina libre en las muestras de dichos pacientes que dependen de la clasificación mediante análisis genético se muestra en la figura 1.

La figura 1 es un diagrama de recuadros que indica los niveles de la liso-esfingomielina libre, por ejemplo, el compuesto 465. El eje y, demuestra los niveles logarítmicos de liso-esfingomielina libre en ng/ml determinados en plasma de pacientes a través del método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje x ilustra grupos de pacientes (dgn), los cuales han sido agrupados tal como se describe en el Ejemplo 2. El diagrama de recuadros representa el 25° y 75° percentil de cada grupo de pacientes en la parte superior e inferior del cuadro, respectivamente; la banda cercana a la parte media del cuadro representa el 50° percentil (es decir, el promedio) de cada grupo; Las comillas representan una desviación estándar arriba y debajo del promedio de los datos; cualquiera datos no incluidos entre las comillas se muestra como algo sobresaliente con un pequeño círculo o estrella.

Los casos procesados fueron tal como se indica a continuación: El nivel del compuesto 509 en las muestras de los pacientes dependiendo de la clasificación mediante análisis genético se muestra en la figura 2.

La figura 2 es un diagrama de recuadros que indica los niveles del compuesto 509; el eje y demuestra los niveles logarítmicos del compuesto 509 en ng/ml determinados en plasma de pacientes a través del método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje x, ilustra los grupos de pacientes (dgn), que han sido agrupados tal como se describe en el Ejemplo 2. El trazo del cuadro representa el 25° y 75° percentil de cada grupo de pacientes en la parte inferior y superior del cuadro, respectivamente; y la banda cerca de la parte media del cuadro representa el 50° percentil (es decir, el promedio) de cada grupo; Las comillas representan una desviación estándar arriba y debajo del promedio de los datos; cualquier datos no incluidos entre las comillas se muestra como sobresaliente con un círculo o estrella pequeña.

Los casos procesados fueron como se indica a continuación: La proporción del nivel del compuesto 509 y el nivel de la liso-esfingomielina libre en las muestras de dichos pacientes que dependen de la clasificación mediante análisis genético se muestra en la figura 3.

La figura 3 es un diagrama de recuadros que indica en el eje y la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 ambos determinados en plasma de pacientes a través del método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje x, ¡lustra los grupos de pacientes (dgn), que han sido agrupados tal como se describe en el Ejemplo 2. El diagrama de recuadros representa el 25° y 75° percentil de cada grupo de pacientes en la parte inferior y superior del cuadro, respectivamente; la banda cerca de la parte media del cuadro representa el 50° percentil (es decir, el promedio) de cada grupo; Las comillas representan una desviación estándar arriba y debajo del promedio de los datos; cualquiera datos no incluidos entre las comillas se muestra como sobresaliente con un círculo o estrella pequeña.

Los casos procesados son como se indica a continuación: El tipo de mutación y la distribución de los tipos de mutaciones del gen NPC1 en pacientes clasificados como pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo C de acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas genéticas tal como se describió anteriormente, se ilustran en la tabla 2A que se encuentra a continuación.

Tabla 2A: La distribución de mutaciones que están siendo detectadas en 48 de 72 medidas de pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo C que son válidas/36 individuos (dos medidas por individuo) cADN n % de medidas válidas C.28610T 5 10.4% C.3019OG 4 8.3% C.3104OT 3 6.3% c.1166G>T 2 4.2% c.1990G>A 2 4,2% c.2196dupT 2 4,2% c.3245G>A 2 4,2% c.3478-6T>A 2 4,2% c.3493G>A 2 4,2% c.1112de1T 1 2,1% c.1 1 14C>T 1 2,1% c.1202C>T 1 2,1% c.1501 G>T 1 2,1% c.1535A>G 1 2,1% c.2621A>T 1 2,1% c.2660C>T 1 2,1% c.3478-6T>A 4,2% c.2684dupG 1 2,1 % c.2727G>A 1 2,1 % c.2795+1G>C 1 2,1% c.289T>A 1 2,1% c.3001A>G 1 2,1% c.58-3T>G 1 2,1% c.616_619de1ACTC 1 2,1% c.749_755de1AGCCCCA 1 2,1% c.1 143G>C 1 2,1 c.1554-1900G>A 1 2,1% c.2292G>A 1 2,1% c.2668T>C 1 2,1 % C.2872C>T 1 2,1% c.3100G>A 1 2,1% c.3433T>C 1 2,1% c.3618de1A 1 2,1% c.3662de1T 2,1% 1 El tipo de mutación y la distribución de los tipos de las mutaciones del gen SMPD1 en los pacientes clasificados como pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B de acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas genéticas tal como se describió anteriormente, se ilustra en la tabla 2B que se encuentra a continuación.

Tabla 2B: La distribución de mutaciones que están siendo detectadas en 34 de 36 medidas de pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B son válidas/18 individuos (dos medidas por individuos) cADN n % de medidas válidas c.1556A>G 5 14,71 % c.416T>C 4 11,76% c.573delT 4 11,76% c.1267>C 2 5,88% c.1493G>A 2 5,88% C.1502A>C 2 5,88% C.1624>C 2 5,88% c.1718G>C 2 5,88% c.488T>C 2 5,88% C.502G>A 2 5,88% c.742G>A 2 5,88% c.776T>G 2 5,88% C.1390G>T 1 2,94% c.533T>A 1 2,94% c.1785-1786de1TT 1 2,94% Ejemplo 3: Diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick utilizando liso-esfingomielina libre v/o el compuesto 509 como un biomarcador Los protocolos descritos en el Ejemplo 1 anterior, se utilizaron para generar cromatograma de espectrometría de masa-HPLC de 448 muestras de plasma derivadas de 304 sujetos. Los cromatogramas de espectrometría de masa HPLC de ejemplo que muestra una intensidad pico de liso-esfingomielina libre y IS de cuatro pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo C y una persona de control saludable se ilustran en las figuras 8A, 8B, 8C, 8D y 8E.

Más particularmente, la figura 8 A muestra el cromatograma de espectrometría de masa - HPLC que muestran la intensidad pico en liso-esfingomielina libre (panel superior), el compuesto 509 (panel medio) y IS (panel inferior) de una muestra de un sujeto saludable como una función con respecto al tiempo de retención en minutos. Las figuras 8B, 8C, 8D y 8E muestran los cromatogramas de espectrometría de masa-HPLC que muestran la intensidad pico en cps de liso-esfingomielina libre (panel superior), el compuesto 509 (panel medio) y IS (panel inferior) de una muestra de un sujeto saludable como una función con respecto al tiempo de retención en minutos. El tiempo de retención de una sustancia tal como aquí se utiliza, se ilustra preferentemente en el eje x y es el tiempo transcurrido entre el tiempo de inyección de un soluto, por ejemplo, un biomarcador de acuerdo con la presente invención y/o un estándar interno, y el tiempo de elución del pico máximo del soluto. Un experto en la técnica reconocerá que el tiempo de retención de una sustancia de acuerdo con los métodos aquí descritos, es una característica única del soluto y se puede utilizar con propósitos de identificación. Se agregó a la muestra, la solución de operación del Estándar Interno que comprende Lyso-Gb2 como un estándar interno, tal como se describe en el Ejemplo 1. Es importante comprender que medíante la adición de IS a la muestra, por ejemplo, el aumento de la muestra, que será sometida al método de acuerdo con la presente invención, la concentración de IS en la muestra es conocida, y determinando un área bajo el pico, es decir, el área pico, del estándar interno en el cromatograma de espectrometría de masa - HPLC, se puede calcular la relación entre un área pico y una concentración de una sustancia, por ejemplo, de IS y/o un biomarcador. En forma más precisa, un experto en la técnica reconocerá que un área pico de una sustancia ilustrada en un cromatograma de espectrometría de masa - HPLC, tal como el cromatograma de espectrometría de masa - HPLC ilustrado en las figuras 8A, 8B, 8C, 8D o 8E, representa una medida de una cantidad de la sustancia sometida a un análisis de espectrometría de masa-HPLC. Además, un experto en la técnica tendrá la capacidad de calcular la cantidad de la sustancia en una muestra del sujeto, sometida a un análisis de espectrometría de masa- HPLC, por ejemplo, la cantidad de liso-esfingomielina libre en una muestra sometida al método de la presente invención, utilizando una proporción del área pico de la liso-esfingomielina libre, cuya cantidad será determinada a través del método y el área pico de IS, por ejemplo, liso-Gb2 libre; así como las curvas de calibración generadas con el método y la liso-esfingomielina libre y/o IS. Por consiguiente, esto permite que se determine subsecuentemente un nivel de liso-esfingomielina libre. Con respecto al compuesto 465<lloq, ha sido reemplazado por 0.02, lo cual se refiere a la mitad del límite de detección.

Para comparar el valor de diagnóstico de los diferentes biomarcadores y para el cálculo de las correlaciones entre los biomarcadores, agregamos primero los datos utilizando el primer valor medido de cada marcador para cada paciente.

Se utilizaron técnicas estadísticas de muestras emparejadas para la comparación de dos biomarcadores. El método explota la equivalencia matemática de la AUC de la estad Ística-U Mann-Whitney (Delong E.R., Delong D.M., Clarke-Pearson D.L., 1988, Biometrics, 44, 837-45.).

La posición de los niveles de los diferentes biomarcadores (liso-esfingomielina libre, el compuesto 509) obtenidos mediante el método descrito en el Ejemplo 1 anterior, así como la precisión de la proporción de los dos biomarcadores de acuerdo con la presente invención, se calculó para diferenciar a los pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick de pacientes sin tener la enfermedad de Niemann-Pick, así como para diferenciar a los pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick tipo C de los pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B, utilizando el análisis de la curva con la Característica de Operación del Receptor (ROC) (Metz CE. ,1978, Semin Nucí Med, 8, 283-98; Zweig M.H., Campbell G., 1993, Clin Chem, 39, 561-77).

Se calcularon las curvas ROC utilizando PASW Statistics 18, Reléase Versión 18.0.2 (© SPSS, Inc., 2009, Chicago, IL, www.spss.com). Las comparaciones de las curvas ROC y los modelos mezclados lineales se llevaron a cabo utilizando el software SAS, Versión 9.2 del SAS System for Windows. (© 2008 SAS Institute Inc., Cary, NC, E.U.A).

Los resultados ilustrados en las curvas ROC mostradas en la figura 4, 5 y 6 también muestran especificidad y la sensibilidad del método de acuerdo con la presente invención, dependiendo de los diferentes valores de corte de liso-esfingomielina libre. El área bajo la curva (AUC) y los límites del 95% de confiabilidad para la liso-esfingomielina se reportan en la tabla 3.

Las figuras 4A a C son gráficas que muestran las curvas de características de operación del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP tipo A y B; El eje x representa "1 -especificidad" y el eje y representa la sensibilidad.

La figura 4A muestra las curvas ROC del compuesto 465 y el compuesto 509 para el diagnóstico de NP tipo A y B en donde la prueba para la diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor-p 0.363. La curva ROC para el compuesto 465 ilustrada mediante la línea sólida, está reflejando una AUC de 0.9628, mientras que la curva ROC del compuesto 509 ilustrada por la línea punteada está reflejando una AUC de 0.9916. La gráfica está basada en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 18 de ellos fueron probados en forma positiva para tener NP Tipo A/B mediante la prueba genética, tal como se describe en el Ejemplo 2 de la presente invención.

La figura 4B, muestra las curvas ROC del compuesto 465 y la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP tipo A y B, en donde la prueba para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0.0083. La curva ROC del compuesto 465 ilustrada mediante la línea sólida está reflejando una AUC de 0.9669, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 ilustrada mediante la línea punteada está reflejando una AUC de 0.9903. La gráfica está basada en el diagnóstico de 146 pacientes en total, en donde 15 de ellos fueron probados en forma positiva por tener NP Tipo A/B mediante pruebas Genéticas, tal como se describe en el Ejemplo 2 de la presente invención.

La figura 4C, muestra las curvas ROC del compuesto 509 y la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP tipo A y B de 303 muestras, en donde 18 son positivas para NPC Tipo A/B y en donde la Prueba de Wald para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de p < 0.0001. La curva ROC para el compuesto 509 ilustrada mediante la línea sólida está reflejando una AUC de 0.9916, mientras que la curva ROC para la proporción de niveles del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 ilustrada mediante la línea punteada está reflejando una AUC de 0.8520. La gráfica está basada en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 18 de ellos fueron probados en forma positiva para tener NP Tipo A/B mediante pruebas Genéticas tal como se describe en el Ejemplo 2 de la presente invención.

Las figuras 5A a C son gráficas que muestran curvas de características de operación de receptor (ROC) para el diagnóstico de NP tipo C; El eje x representa "1 -especificidad" y el eje y representa la sensibilidad.

La figura 5A, muestra las curvas ROC del compuesto 465 y el compuesto 509 para el diagnóstico de NP tipo C, en donde la prueba para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0.0003. La curva ROC para el compuesto 465 ilustrado mediante la línea sólida está reflejando una AUC de 0.8944, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 ilustrada mediante la línea punteada está reflejando una AUC de 0.9371. La gráfica está basada en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 36 de los mismos fueron probados en forma positiva para tener NP tipo C mediante pruebas Genéticas, tal como se describe en el Ejemplo 2 en la presente invención.

La figura 5 B, muestra las curvas ROC del compuesto 465 y la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP tipo C, en donde la prueba para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0.0001. La curva ROC para el compuesto 465 ilustrada mediante la línea sólida está reflejando una AUC de 0.8685, mientras que la curva ROC para la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 ilustrada mediante la línea punteada está reflejando una AUC de 0.9654. La gráfica está basada en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 36 de los mismos fueron probados en forma positiva para tener NP tipo C mediante pruebas Genéticas, tal como se describe en el Ejemplo 2 en la presente invención.

La figura 5 C, muestra las curvas ROC del compuesto 509 y la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP tipo C, en donde la prueba para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0.0065. La curva ROC para el compuesto 509 ilustrada mediante la línea sólida está reflejando una AUC de 0.9371, mientras que la curva ROC para la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 ilustrada mediante la línea punteada está reflejando una AUC de 0.9800. Las gráficas están basadas en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 36 de los mismos fueron probados en forma positiva para tener NP tipo C mediante pruebas Genéticas tal como se describe en el Ejemplo 2 en la presente invención.

La figura 6 es una gráfica que muestra las curvas de características de operación de receptor (ROC) del compuesto 465 y del compuesto 509 para el diagnóstico del portador de NP tipo C; la gráfica está basada en el diagnóstico de 146 pacientes en total, en donde/los mismos fueron probados en forma positiva para ser portadores de NP tipo C mediante pruebas Genéticas tal como se describe en el Ejemplo 2 en la presente invención. El eje x representa " 1 -especificidad" y el eje y representa la sensibilidad. La prueba para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0.5991. La curva ROC para el compuesto 465 ilustrada mediante la línea sólida está reflejando una AUC de 0.7468, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 ilustrada mediante la línea punteada está reflejando una AUC de 0.6984.

Tabla 3: Sensibilidad y especificidad para diferentes biomarcadores con respecto a NPC 465 509 509/465 NP A/B (n) 18 de 304 18 de 303 18 de 303 Punto de corte >59 >5 >0.045 Sensibilidad 94.4% 94.4% 94.4% Especificidad 99.3% 96.1% 82.1% AUC y 95%CI en 0.96(0.90-1.00) 0.99 (0.98-1.00) 0.85 (0.81-0.90) análisis ROC NP A/B (n) 36 de 304 36 de 303 36 de 303 Punto de corte >9.23 >1.7 >0.087 Sensibilidad 94.4% 97.2% 94.4% Especificidad 81.3% 93.3% 95.5% AUC y 95%CI en 0.90 (0.86-0.93) 0.94 (0.91-0.97) 0.98 (0.96-1.00) análisis ROC La tabla 4 que se encuentra a continuación muestra de manera correspondiente la sensibilidad y la especificidad del método de acuerdo con la presente invención, dependiendo de diferentes valores de corte de la liso-esfingomielina libre.

Comparando el nivel del biomarcador en una muestra de un sujeto determinada mediante el método de acuerdo con la presente invención con un valor de corte, preferentemente un valor de corte que permite que un diagnóstico tenga alta especificidad y alta sensibilidad para permitir de esta forma el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el nivel elevado del biomarcador en la muestra del sujeto en comparación con el valor del corte, indica que el sujeto padece de o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick y en donde un nivel inferior del biomarcador en la muestra del sujeto en comparación con valor del corte indica que el sujeto no está padeciendo de o no está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick.

Comparando la proporción de los niveles de los dos bioma rcadores en una muestra de un sujeto determinada mediante el método de acuerdo con la presente invención para un valor de corte, preferentemente un valor de corte que permite que un diagnóstico tenga alta especificidad y alta sensibilidad para permitir de esta forma el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto, en donde una proporción de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto, en comparación con un valor del corte indica que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Niemann-Pick y en donde la proporción inferior de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto en comparación con el valor del corte, indica que el sujeto no está padeciendo de o no está en riesgo de desarrollar enfermedad de enfermedad de Niemann-Pick.

Por consiguiente, en la tabla 3, la sensibilidad y la especificidad de liso-esf ingomielina libre como un biomarcador utilizado en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, y más particularmente diferentes tipos de la enfermedad de Niemann-Pick en la muestra de un sujeto, se compara utilizando diferentes valores de corte. La liso-esfingomielina libre se determinó de acuerdo con el método de la presente invención. El valor de corte ideal para los bioma rcadores y la enfermedad respectiva, se pueden tomar de la tabla 3 anterior.

Un experto en la técnica reconocerá que el método de acuerdo con la presente invención utilizando liso-esfingomielina libre y/o el compuesto 509 como un biomarcador, y/o la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre, para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, es claramente conveniente con respecto a métodos de la técnica anterior.

Por consiguiente, los niveles del compuesto 509 determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo al método de la presente solicitud mayores a 5 ng/ml, permiten para el diagnóstico de que el sujeto padece de o está en riesgo de desarrollar NP tipo A y B con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 96.1%.

Los niveles del compuesto 509 determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo al método de la presente solicitud, mayores a 1.7 ng/ml permiten el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar P tipo C con una sensibilidad del 97.2% y una especificidad del 93.3%.

Los niveles del compuesto 509 determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo al método de la presente solicitudes mayores a 0.031 ng/ml, permite el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar ser portador del NP tipo C con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 22.5%.

Los niveles de la liso-esfingomielina libre determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud mayores a 59 ng/ml, permiten el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar NP tipo A y B con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 99.3%.

Los niveles de liso-esfingomielina libre determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud mayores a 9.23 ng/ml, permiten el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar NP tipo C con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 81.3%.

Los niveles de la liso-esfingomielina libre determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud mayores a 6.5 ng/ml, permiten el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar ser portador de NP tipo C con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 61.2%.

La proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso- esfingomielina libre determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente solicitud mayores a 0.045 permiten el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar NP tipo A y B con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 82.1%.

La proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre determinados en una muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud mayores a 0.087, permiten el diagnóstico de que el sujeto está padeciendo de o está en riesgo de desarrollar NP tipo C con una sensibilidad del 94.4% y una especificidad del 95.5%.

Ejemplo 4: Análisis del cambio de biomarcadores con el tiempo El método y los pacientes utilizados en relación con este Ejemplo fueron los descritos en los Ejemplos 1 a 3.

Para analizar como el nivel de biomarcadores, tal como el compuesto 509, cambió con el tiempo en pacientes que tienen enfermedad de Niemann-Pick, se analizaron los datos no agregados de los pacientes para quienes se analizó más de una muestra de plasma, es decir seis pacientes de NPC tipo C y un portador de NPC tipo C. Se ajustó un punto de tiempo cero en la primera medida bajo terapia para cada paciente. Los modelos mezclados lineales fueron utilizados para probar si ocurrió una reducción dependiente del tiempo.

Los niveles del compuesto 509 con el tiempo para pacientes individuales se muestran en la figura 7.

Más particularmente, la figura 7 es un diagrama que muestra los niveles del compuesto 509 en ng/ml de plasma como una función con el tiempo para un total de 6 pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo C y 1 portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

El nivel de biomarcador respectivo se determinó a través del método de acuerdo con la presente invención en una muestra de plasma de los pacientes de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, los cuales se sometieron a terapia durante el curso del estudio. Cada curva y cada número de paciente, respectivamente, representan los niveles determinados en plasma recolectado del mismo paciente en diferentes puntos de tiempo tal como se indica en el eje x. El eje x representa los puntos en el tiempo de la recolección de plasma, en donde el punto de tiempo cero indica la primera medida bajo terapia para cada paciente. Para el análisis del cambio del nivel del biomarcador de acuerdo con la presente invención con el tiempo en pacientes con enfermedad de Niemann-Pick tipo C tal como se describe en el Ejemplo 3, se utilizaron datos no agregados de los pacientes para quienes se había analizado más de una muestra de plasma.

En la figura 7, el eje y representa los niveles del compuesto 509 como una función con el tiempo.

Ejemplo 5: Análisis de niveles de biomarcadores dependiendo de la edad de los sujetos Las enfermedades de almacenamiento lisosomal afectan en su mayoría a niños, y con frecuencia mueren jóvenes y en una edad no previsible, muchos a los pocos meses o años de nacimiento. Muchos de otros niños mueren de esta enfermedad después de años de padecer de varios síntomas de su trastorno en particular.

Por lo tanto es de particular interés probar el valor de los biomarcadores de la presente invención para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en grupos de pacientes en la juventud.

Un biomarcador preferido para el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo C, puede permitir el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo C, con alta sensibilidad y alta especificidad en forma independiente de la edad del sujeto.

Los niveles del compuesto 465 y del compuesto 509, respectivamente, determinados de acuerdo con el método de la presente invención, fueron analizados con respecto a la edad del sujeto.

El resultado se muestra en la tabla 5 y en la figura 9.

La tabla 5 que se encuentra a continuación muestra distribución de la edad entre sujetos probados.

Tabla 5A: Distribución de edad Más particularmente, la figura 9A es un diagrama de recuadros y la figura 9B es un a gráfica de dispersión que indica los niveles de liso-esfingomielina libre, es decir del compuesto 465; y la figura 9C es una diagrama de recuadros y la figura 9D es una gráfica de dispersión que indica los niveles del compuesto 509; el eje-y demuestra los niveles logarítmicos de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, respectivamente, en ng/ml determinado en plasma de pacientes a través del método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje-x ilustra grupos de pacientes de acuerdo con los años de edad. Los trazos de cuadros de los pacientes han sido agrupados por edad en años como se indica, es decir, teniendo los pacientes 0-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70 años de edad o teniendo 71 años de edad o más. El diagrama de recuadros representa el 25° y 75° percentil de cada grupo de pacientes en la parte inferior y superior del cuadro, respectivamente; la banda cercana a la parte media del cuadro representa el 50° percentil (es decir el promedio) de cada grupo; las comillas representan una desviación estándar arriba y debajo del promedio de los datos; cualquiera datos no incluidos entre las comillas se muestran como un sobresaliente con un círculo o estrella pequeña.

Puede tomarse a partir de esto que el compuesto 509, así como el compuesto 465 son biomarcadores que permiten el diagnóstico de enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo A/B y más preferentemente enfermedad de Niemann-Pick tipo C con alta sensibilidad y alta especificidad independiente de la edad del sujeto.

Además podrá reconocerse que el método de la presente invención permite diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto en forma independiente de la edad. Más particularmente, el método de la presente invención permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el sujeto es un sujeto joven, más particularmente con menos de 30 años de edad, menos de 20 años de edad o menos de 10 años de edad .

Ejemplo 6: Liso-Gb3 libre en cerebelo de ratas transqénicas Se determinó el nivel de liso-esfingomielina libre en cerebelo de 3 ratas NPC1 -/- transgénicas y se comparó con el nivel en una muestra de un animal de control (NPC1 +/ + ).

Los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6 Cerebelo de animal de rata Liso-Gb3 Puede apreciarse a partir de lo anterior que está elevado el nivel de liso-esfingomielina libre en aproximadamente un factor de 2 a 3, en el cerebelo de animales NPC1-/- para muestras de animales de control sin un gen de eliminación, es decir, N PC 1 +/+.

En otras palabras, en el cerebelo de animales de eliminación NOC1-, la concentración de liso-Esfingom ielina es aproximadamente del doble, tan alta como en controles tipo silvestre.

El descubrimiento se correlaciona con la situación histopatológica en humanos, en donde se ve afectado preferentemente el cerebelo.

Las características de la presente invención descritas en la especificación, las reivindicaciones, listado de secuencias y/o los dibujos, ambos se pueden separar y en cualquier combinación de los mismos, ser material para desempeñar la presente invención en varias formas de la misma.

Claims (150)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende un paso b) en donde el paso b) comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra .

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el nivel del biomarcador indica si el sujeto está sufriendo o no de enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde la muestra del sujeto es una muestra de un sujeto quien ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick o una muestra de un sujeto quien ha sido diagnosticado previamente para enfermedad de Niemann-Pick.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde la muestra del sujeto es una muestra de un sujeto quien no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick, o una muestra de un sujeto quien no ha sido diagnosticado previamente para enfermedad de Niemann-Pick.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base en si el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en donde el método comprende: un paso d), en donde el paso d) comprende detectar biomarcador en una muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no se ha aplicado terapia en el paso c).

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, en donde el método comprende: un paso e), en donde el paso e) comprende determinar un nivel de biomarcador en la muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no se ha aplicado una terapia en el paso c).

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el método comprende un paso f), en donde el paso f) comprende determinar si el nivel de biomarcador determinado en el paso b) es menor que el nivel del biomarcador determinado en el paso e).

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el método comprende un paso g), en donde el paso g) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base en el paso f).

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, en donde el biomarcador es una liso-esfingomielina libre.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, en donde el biomarcador es el compuesto 509.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, en donde el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional dentro o en la muestra del sujeto.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el método comprende determinar el nivel de al menos un biomarcador adicional dentro o en la muestra del sujeto.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en donde se selecciona al menos un biomarcador adicional del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde al menos un biomarcador adicional es diferente al biomarcador.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 14 a la 16, en donde el biomarcador es el compuesto 509 y en donde al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, y en donde al menos un biomarcador adicional es el compuesto 509.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18, en donde el método comprende determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 dentro o en la muestra.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 14 a la 19, preferentemente de la 17 a la 19, en donde el método comprende: un paso h), en donde el paso h) comprende determinar la proporción del nivel de biomarcador dentro o en la muestra para el nivel del al menos un biomarcador adicional dentro o en la muestra.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional, preferentemente tal como se determina en el paso h), indica si el sujeto está padeciendo o no de enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 21, en donde el método comprende detectar la liso-esf ingomielina libre y el compuesto 509 dentro o en la muestra.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detectan por medio de inmunoensayo, análisis espectrométrico de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador y/o un derivado fluorescente del al menos un biomarcador adicional.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el biomarcador se detecta por medio de análisis de espectrometría de masa.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde análisis de espectrometría de masa se selecciona del grupo que consiste en SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS.

27. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26, en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC.

28. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 27, en donde el método comprende precipitación de proteína, HPLC y MS/MS.

29. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 28, en donde el sujeto es un humano.

30. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y el portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

31. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 30, en donde el paso d) que comprende detectar biomarcador en una muestra, comprende someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, precipitar la proteína de la muestra, proporcionar un sobrenadante de la muestra, someter el sobrenadante de la muestra a HPLC y MS/MS y determinar el nivel de biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional que está presente en el sobrenadante de la muestra.

32. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ü) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o segundo sobrenadante, o al menos una parte de los mismos, a un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS y utilizar una columna HPLC con un gradiente de agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y onitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar biomarcador en una muestra del sujeto, y opcionalmente un paso b), en donde el paso b) comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31.

33. Un método para diagnosticar una enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema H PLC-MS/MS, y utilizar una columna HPLC con un gradiente del agua acida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, y opcionalmente un paso b), en donde el paso b) comprende determinar un nivel de biomarcador presente en la muestra, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31.

34. Un método para el diagnóstico una enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno, iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS, y utilizar una columna HPLC con un gradiente del agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, y detectar al menos un biomarcador adicional en una muestra al sujeto; y opcionalmente un paso b), en donde el paso b) comprende determinar un nivel de biomarcador presente en la muestra; y un nivel del al menos un biomarcador adicional presente en la muestra; en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde al menos un biomarcador adicional es el compuesto 509, y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende determinar la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de liso-esfingomielina libre, tal como se determina en el paso b).

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la proporción del nivel del compuesto 509 al nivel de la liso-esfingomielina libre, indica si el sujeto padece o no de la enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de una enfermedad de Niemann-Pick.

37. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B o la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto, en donde el método comprende los siguientes pasos: i) agregar un estándar interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre; ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el estándar interno; iii) someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, mediante lo cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra; iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a un primer paso de separación que proporciona un segundo sobrenadante, mediante lo cual, preferentemente el primer paso de separación es un paso de centrifugación; v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, un segundo paso de separación, en donde el segundo paso de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS, y utilizar una columna HPLC con un gradiente del agua ácida para acetonitrilo/acetona; en donde la columna HPLC es preferentemente una columna HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna C8 HPLC y una columna C18 HPLC, y en donde el segundo paso de separación proporciona una muestra separada; vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde MS/MS comprende ionización por electrorocío y Monitoreo de Reacción Múltiple; y que comprende un paso a), en donde el paso a) comprende detectar un biomarcador en una muestra al sujeto, y detectar al menos un biomarcador adicional en una muestra al sujeto; y un paso b), en donde el paso b) comprende determinar el nivel del biomarcador presente en la muestra y el nivel de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra; y un paso c), en donde el paso c) comprende determinar la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador tal como se determina en el paso b); en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es menor o tan alto como 0.031 ng/ml, esto indica que el sujeto o está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde si el nivel de al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 0.031 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es mayor a 0.031 ng/ml, y es menor a o tan alto como de 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick seleccionado del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y en donde si el nivel del al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 1.7 ng/ml, y la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador es tan alto como de 0.045, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B; y en donde si el nivel de al menos un biomarcador adicional es tan alto como de 1.7 ng/ml, y la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador es menor a, o tan alto como 0.045 esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C; y en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre; en donde al menos un biomarcador adicional es el compuesto 509; y en donde el método es preferentemente un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31.

38. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 37, en donde el estándar interno comprende propionato de D5-fluticasona y/o liso-Gb2.

39. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 38, en donde el paso b), el paso c) y/o el paso e) comprende comparar el nivel del biomarcador en la muestra y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional en la muestra y/o la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto con un valor de corte.

40. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor al valor de corte, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick.

41. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si la proporción del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto, al nivel de al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto es mayor al valor de corte, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

42. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es menor al valor de corte, esto indica que el sujeto no está padeciendo de o no está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

43. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 39, preferentemente 39, en donde si la proporción del nivel de biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto es menor al valor de corte, esto indica que el sujeto no está padeciendo de, o no está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

44. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 43, en donde al valor de corte se selecciona de modo que la sensibilidad para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, sea preferentemente del 98.5% al 100%, más preferentemente del 99,5% al 100%, y/o de modo que la especificidad del diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en un sujeto sea del 99.4% al 100%, preferentemente del 100%.

45. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 44, en donde el paso b) y/o paso c) y/o paso e) comprende(n) que un nivel del biomarcador en el sujeto y/o un nivel de al menos un biomarcador adicional es/se compara con un nivel de biomarcador y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional detectado en la muestra de una muestra de control; y/o que la proporción del nivel del al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador se compara con la proporción del nivel del al menos un biomarcador adicional con el nivel del biomarcador detectado en la muestra de un control.

46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la muestra de control es una muestra de un sujeto que no tiene enfermedad de Niemann-Pick.

47. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 45 a la 46, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor al nivel del biomarcador en la muestra de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de y/o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

48. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 46, en donde si la proporción del nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a la proporción del nivel de al menos un biomarcador adicional en la muestra de control al nivel del biomarcador en la muestra de control, esto indica que el sujeto está padeciendo de y/o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

49. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 48, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y un portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

50. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

51. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50, preferentemente con la reivindicación 50, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre, un producto de sangre, orina, saliva, fluido cerebroespinal, materia fecal, muestra de tejido y linfa.

52. El método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde la muestra de la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre y un producto de sangre.

53. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 51 a la 52, en donde el producto de sangre se selecciona del grupo que comprende suero y plasma.

54. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 53, preferentemente la 53, en donde el método tiene un límite de detección para la liso-esf ingomielina libre de 0.04 ng/ml.

55. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre y el valor del corte es 6.5 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

56. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde biomarcador es liso-esfingomielina libre y al valor del corte es de 9.23 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

57. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B y en donde biomarcador es liso-esfingomielina libre y el valor del corte es de 59 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

58. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico del portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde el biomarcador es el compuesto 509 y al valor del corte es de 0.031 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

59. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde biomarcador es el compuesto 509 y el valor del corte es 1.7 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

60. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B y en donde biomarcador es el compuesto 509 y al valor de corte es 5.0 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

61. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y en donde la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto, al nivel del biomarcador de liso-esfingomielina libre en la muestra del sujeto, se compara con un valor de corte, y en donde al valor de corte es de 0.087, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

62. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, en donde el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, y en donde la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador de la liso-esfingomielina libre en la muestra del sujeto se compara con un valor de corte, y en donde al valor de corte es de 0.045, y en donde la muestra del sujeto es preferentemente suero o plasma.

63. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 51 a la 52, en donde la sangre es sangre completa.

64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde la sangre completa se recolecta en una tarjeta de filtro de sangre seca.

65. Un método para determinar el curso de una enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende un paso a), en donde el paso a) comprende." determinar en varios puntos en el tiempo, un nivel de biomarcador presente en una muestra del sujeto.

66. El método de acuerdo con la reivindicación 65, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende la liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

67. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 66, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

68. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 67, en donde el sujeto ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick y/o en donde el sujeto ha sido diagnosticado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick.

69. El método de acuerdo con la reivindicación 68, en donde el sujeto no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick y/o en donde el sujeto no ha sido diagnosticado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick.

70. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 69, en donde el método comprende: un paso b), en donde el paso b) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base ya sea en que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer de la enfermedad de Niemann-Pick.

71. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 70, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende detectar el biomarcador en una muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no aplicado terapia en el paso b).

72. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 71, en donde el método compr nde: un paso d), en donde el paso d) comprende determinar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto después de que se ha aplicado, mantenido, reducido, elevado o no se ha aplicado terapia en el paso b).

73. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 71, en donde el método comprende un paso e), en donde el paso e) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinó el paso a) es menor al nivel del biomarcador determinado en el paso d).

74. El método de acuerdo con la reivindicación 73, en donde el método comprende: un paso f), en donde el paso f) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia con base en el paso e).

75. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 74, en donde biomarcador es liso-esfingomielina libre.

76. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 74, en donde biomarcador es el compuesto 509.

77. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 76, en donde el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.

78. El método de acuerdo con la reivindicación 77, en donde el método comprende determinar el nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.

79. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 77 a la 79, en donde al menos un biomarcador adicional se selecciona del grupo que consiste en liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde el al menos un biomarcador adicional es diferente al biomarcador.

80. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 77 a la 79, en donde biomarcador es el compuesto 509, y en donde el al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre.

81. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 80, en donde el método comprende determinar el nivel de liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

82. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 77 a la 81, preferentemente de la 80 a la 81, en donde el método comprende: un paso h), en donde el paso h) comprende determinar la proporción del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.

83. El método de acuerdo con la reivindicación 82, en donde la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso h), indica si el sujeto está padeciendo o no de enfermedad de Niemann-Pick o si el sujeto está en riesgo o no de padecer de enfermedad de Niemann-Pick.

84. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 83, en donde el método comprende detectar la liso-esfingomielina libre y el compuesto 509 en la muestra del sujeto.

85. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 84, en donde biomarcador y/o al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de inmunoensayo, análisis de espectrometría de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente de liso-esfingomielina libre.

86. El método de acuerdo con la reivindicación 85, en donde biomarcador se detecta por medio de análisis de espectrometría de masa.

87. El método de acuerdo con la reivindicación 86, en donde el análisis de espectrometría de masa se selecciona del grupo que consiste en SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF

88. El método de acuerdo con la reivindicación 87, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS MS/MS.

89. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 88, en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC.

90. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 89, en donde el método comprende precipitación de proteína, HPLC y MS/MS.

91. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 90, en donde el sujeto es un humano.

92. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 91, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y portador de enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

93. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 92, en donde el paso d) comprende detectar el biomarcador en una muestra, en donde el método comprende someter la muestra a un paso de precipitación de proteína, precipitar la proteína de la muestra, proporcionar un sobrenadante de la muestra, someter el sobrenadante de la muestra a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o al menos un biomarcador adicional que está presente en el sobrenadante de la muestra.

94. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 93, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, enfermedad de Niemann- Pick tipo C2 y enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

95. Un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que está siendo probado en forma positiva como que padece de o está en riesgo de padecer de enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende: un paso a), en donde el paso a) comprende detectar en varios puntos en el tiempo, un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra del sujeto.

96. El método de acuerdo con la reivindicación 95, en donde el método comprende: un paso b), en donde el paso b) comprende determinar en varios puntos en el tiempo, un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto.

97. El método de acuerdo con la reivindicación 96, en donde el método comprende: un paso c), en donde el paso c) comprende determinar la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso b).

98. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 97, en donde biomarcador se selecciona del grupo que comprende en liso-esf ingomielina libre y el compuesto 509.

99. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 98, en donde al menos un biomarcador adicional se selecciona del grupo que consiste en liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde al menos un biomarcador adicional es diferente al biomarcador.

100. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 99, en donde biomarcador es el compuesto 509 y en donde el al menos un biomarcador adicional es liso-esfingomielina libre.

101. El método de acuerdo con cualquiera de las rei indicaciones 95 a 100, en donde el sujeto ha sido tratado previamente para enfermedad de Niemann-Pick o diagnosticado para la enfermedad de Niemann-Pick.

102. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a la 100, en donde el sujeto no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick, o en donde el sujeto no ha sido diagnosticado previamente para enfermedad de Niemann-Pick.

103. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 102, en donde el método comprende: un paso d), en donde el paso d) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento aplicado al sujeto con base en la disminución en el nivel del biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso b) y/o la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso c).

104. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a la 102, en donde el método comprende: un paso e), en donde el paso e) comprende detectar el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto, en donde la muestra se ha tomado antes de comenzar el tratamiento después de aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento en el paso d) y, opcionalmente determinar un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra del sujeto, y determinar opcionalmente la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional.

105. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 95 a la 104, en donde el tratamiento se selecciona del grupo que consiste en terapia de reemplazo de enzimas, terapia de reducción de substrato, terapia de chaperón, terapia genética, trasplante de célula madre de salto de ADN/ARN.

106. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 95 a la 105, en donde el método comprende: un paso f), en donde el paso f) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinado en el paso b) es menor que el nivel del biomarcador determinado en el paso e); y/o determinar si el nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en el paso b) es menor al nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en el paso e); y/o determinar si la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso c), es menor a la proporción del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional tal como se determina en el paso e).

107. El método de acuerdo con la reivindicación 106, en donde el método comprende: un paso g) en donde el paso g) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento aplicado al sujeto con base en el paso f).

108. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95 a la 107, en donde biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de inmunoensayo, análisis de espectrometría de masa, formación de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador.

109. El método de acuerdo con la reivindicación 108, en donde el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de análisis de espectrometría de masa.

110. El método de acuerdo con la reivindicación 109, en donde el análisis de espectrometría de masa se selecciona del grupo que consiste en SELDI , MALDI, MALDI-Q TOF, MS/ S, TOF-TOF y ESI-O-TOF.

111. El método de acuerdo con la reivindicación 110, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS. 5

112. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 95 a la 111, en donde el método comprende precipitación de proteína y/o HPLC.

113. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 96 a 112, en donde el método comprende 0 precipitación de proteína, HPLC y MS/MS.

114. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 95 a la 113, en donde el sujeto es un humano.

115. El método de acuerdo con cualquiera de las 5 reivindicaciones de la 95 a la 114, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y portador de la enfermedad de Niemann-« Pick tipo C. 0

116. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 95 a la 115, en donde el paso de detectar el biomarcador en la muestra del sujeto, comprende precipitar la proteína de la muestra del sujeto, en donde la precipitación de la proteína de la muestra proporciona un sobrenadante de la 5 muestra; someter un volumen del sobrenadante a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional que está presente en la muestra del sujeto.

117. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 115 a la 116, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

118. Un método para determinar la efectividad de un compuesto para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende los siguientes pasos. a) determinar un nivel de un biomarcador en una muestra de un sujeto que tiene enfermedad de Niemann-Pick; b) administrar al sujeto el compuesto; c) determinar nuevamente el nivel del biomarcador en una muestra del sujeto después de que el compuesto ha sido administrado al sujeto; y d) determinar si el nivel del biomarcador determinado en el paso c) es menor al nivel del biomarcador determinado en el paso a); en donde si un nivel del biomarcador determinado en el paso c) es menor al nivel del biomarcador determinado en el paso a) esto indica la efectividad del compuesto.

119. El método de acuerdo con la reivindicación 118, en donde, el paso a) y c) cada uno comprenden adicionalmente, determinar un nivel de al menos un biomarcador adicional presente en la muestra, y en donde el paso d) comprende en forma adicional: determinar si el nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en el paso c) es menor al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso a), y en donde, un nivel del al menos un biomarcador determinado en el paso c) el cual es menor al nivel de al menos un biomarcador determinado en el paso a), indica la efectividad del compuesto.

120. El método de acuerdo con la reivindicación 119, en donde, el paso a) comprende además, determinar la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional; el paso c) comprende además determinar la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional, y en donde el paso d) comprende, determinar si la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso c), es menor a la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso a), y en donde, una proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso c), el cual es menor a la proporción del nivel del biomarcador al nivel de al menos un biomarcador adicional determinado en el paso a) indica la efectividad del compuesto.

121. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 118 a la 120, en donde cualquiera del biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509, y en donde el biomarcador es diferente al menos un biomarcador adicional.

122. El método de acuerdo con la reivindicación 121, en donde el método comprende determinar un nivel del biomarcador en una muestra de control.

123. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 118 a la 121, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad Niemann-Pick tipo A o B, enfermedad Niemann-Pick tipo C, y un portador de Niemann-Pick tipo C.

124. El método de acuerdo con la reivindicación 123, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

125. El uso de análisis de espectrometría de masa para la detección de un biomarcador, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

126. El uso de acuerdo con la reivindicación 125, en donde la detección comprende el uso de HPLC.

127. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 125 a la 126, en donde el análisis de espectrometría de masa comprende o utiliza MS/MS.

128. El uso de un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 127, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

129. El uso de un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre.

130. El uso de un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, en donde el biomarcador es el compuesto 509.

131. El uso de acuerdo con cualquiera de las r ivindicaciones de la 125 a la 130, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y un portador Niemann-Pick tipo C.

132. El uso de acuerdo con la reivindicación 130, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

133. El uso de una proporción de un nivel de un biomarcador presente en una muestra del sujeto a un nivel de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto para utilizarse en un método de diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferentemente en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

134. Un equipo para determinar la presencia de un biomarcador en una muestra al sujeto, en donde el equipo comprende: a) una parte de interacción del biomarcador; b) opcionalmente un soporte sólido que comprende al menos un reactivo de captura adherido al mismo, en donde el reactivo de captura enlaza al biomarcador; y c) instrucciones para utilizar el soporte sólido para detectar el biomarcador, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que comprende liso-esfingomielina libre y el compuesto 509.

135. El equipo de acuerdo con la reivindicación 132, en donde el equipo es para: a) utilizarse en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick; b) utilizarse en un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto; y/o c) el uso en un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto, en donde preferentemente el método de a), b) y/o c), es un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124.

136. El equipo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 134 a 135, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende la enfermedad Niemann-Pick tipo A o B, la enfermedad Niemann-Pick tipo C, y el portador de Niemann-Pick tipo C.

137. El equipo de acuerdo con la reivindicación 136, en donde la enfermedad de Niemann-Pick tipo C se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y la enfermedad de Niemann-Pick tipo D.

138. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente reivindicaciones de la 1 a la 64, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 0.031 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

139. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente la reivindicación 138, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 0.031 ng/ml y es menor o tan alto como 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

140. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente con cualquiera de las reivindicaciones 138 y 139, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 1.7 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

141. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 140, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 1.7 ng/ml, y es menor a o tan alto como 5.0 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

142. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones de la 138 a la 141, en donde el biomarcador es el compuesto 509, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 5.0 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B.

143. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 142, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 6.5 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B, en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C y el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

144. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 143, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 6.5 ng/ml y es menor o tan alto como 9.23 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en el portador de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

145. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 144, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre; en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 9.23 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

146. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 145, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es mayor a 9.23 ng/ml, y es menor o tan alto como 59 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

147. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 146, en donde el biomarcador es liso-esfingomielina libre, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es tan alto como 59 ng/ml, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B.

148. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 147, en donde si la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de la liso-esfingomielina libre es tan alta como de 0.087, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

149. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 148, en donde si la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de la liso-esfingomielina libre es mayor a 0.045, esto indica que el sujeto está padeciendo de enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C.

150. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 124, preferentemente cualquiera de las reivindicaciones 138 a 149, en donde si la proporción del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de la liso-esfingomielina libre es mayor a 0.045 y es menor o tan alta como 0.087, esto indica que el sujeto está padeciendo de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A y/o B.