MX2013000204A - Procedimiento para la preparacion de derivados de oxido de poli(alquileno) para modificacion de moleculas y materiales biologicamente activos. - Google Patents

Abstract

Un método para producir polímeros lineales activados y polímeros ramificados activables de los mismos, se lleva a cabo al: a) hacer reaccionar un polímero activable no peptídico lineal, químicamente bloqueado en un extremo, con un grupo activador de anillo de azol que provee un grupo residual para producir un polímero intermediario de la fórmula general poli-lm; b) hacer reaccionar dicho poli-lm con un agente de alquilación para formar una sal de imidazolio de la fórmula general poli-lm+(alquilo)X-; y c) hacer reaccionar dicho poli-lm+(alquilo)X- con una molécula enlazadora que tiene por lo menos dos porciones nucleofílicas para producir un derivado de polímero ramificado activable del mismo; en algunas modalidades "poli" es un polímero seleccionado del grupo que consiste de óxidos de poli(alquileno), poli(polioles oxietilados), poIi(alcoholes olefínicos), y polímeros de óxido de alquileno y óxido de propileno; en algunas modalidades "lm+" es un ion de imidazolio; y en algunas modalidades "X-" es un contraión aniónico.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE DERIVADOS DE ÓXIDO DE POLI(ALQUILENO) PARA MODIFICACIÓN DE MOLÉCULAS Y MATERIALES BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método mejorado para preparar derivados de oxido de poli(alquileno) y polímeros relacionados para usarse en la modificación de las propiedades fisicoquímicas de moléculas y materiales biológicamente activos. Muy particularmente, la presente invención provee un nuevo método de síntesis para poli(etilenglicol) lineal activado que puede ser útil como tal o como intermediario para la síntesis de polímeros ramificados del mismo para preparar conjugados con materiales biológicamente activos, tales como péptidos, polipéptidos, enzimas, proteínas, oligonucleótidos y porciones de fármacos. El procedimiento mejorado no incluye el uso de reactivos nocivos y describe un procedimiento de purificación conveniente para los derivados de polímeros ramificados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Algunas especies biológicamente activas usadas en el tratamiento de muchas enfermedades presentan diversos inconvenientes que restringen su eficacia terapéutica. Es reconocido que entre los problemas más críticos que limitan su rendimiento están la estabilidad baja y solubilidad baja en medio acuoso, velocidad de excreción rápida, susceptibilidad alta a degradación enzimática y/o reacciones inmunológicas no deseables. En las últimas décadas, se han hecho esfuerzos significativos para superar estas limitaciones y para mejorar el rendimiento farmacocinético y farmacodinámico in vivo estas especies biológicamente activas. La conjugación con polímeros ha probado ser un enfoque atractivo y útil para este propósito.

Una clase de polímeros preferidos para preparar conjugados de polímeros son óxidos de poli(alquilenos) (de aquí en adelante PAO) tales como poli(propilenglicol) y poli(etilenglicol). Particularmente, el poli(etilenglicol) (de aquí en adelante PEG) tiene varias propiedades que lo hacen específicamente adecuado para conjugación, es decir, PEG es soluble en agua, no tóxico y biocompatible. La molécula de PEG puede ser estructuralmente representada como HO-(CH2CH20)n CH2CH2-OH, en donde n típicamente tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,000. Ambos grupos hidroxilo terminales son más bien no reactivos para enlace covalente a porciones biológicamente activas. Por lo tanto, las moléculas de PEG generalmente deben ser activadas o convertidas a polímeros más reactivos antes de que sean adecuadas para conjugación.

La presencia de dos grupos hidroxilo terminales por molécula de PEG deja abierta la vía para la producción de polímeros de PEG di-activados, que a su vez típicamente producen un alto grado no deseado de entrelazamiento para modificación de biomateriales. Las moléculas de PEG con un grupo extremo bloqueado por lo tanto son más adecuadas que el diol de PEG. Por lo tanto, las moléculas de PEG con una porción extrema metilo no reactiva individual, conocida como monometoxi-poli(etilenglicol) (de aquí en adelante mPEG), son usualmente preferidas como polímeros activables. La molécula de mPEG puede ser estructuralmente representada como teniendo la fórmula CH30-(CH2CH20)n CH2CH2-OH, en donde el grupo metilo actúa como un grupo bloqueador. El mPEG monofuncional entonces puede ser usado convenientemente para preparar derivados de mPEG lineales activados que tienen un solo sitio de activación.

Los derivados monofuncionales de interés pueden ser estructuralmente presentados como que tienen la fórmula CH30-(CH2CH20)n CH2CH2-Z, en donde Z es un grupo residual reactivo, seleccionado de aquellos bien conocidos en la técnica, para unir selectivamente el polímero a una especie biológicamente activa.

Las proteínas y otros materiales biológicamente activos sólo tienen un número limitado de sitios para la unión de PEG. Es bien sabido que dichos sitios también pueden estar implicados en la actividad biológica. La porción épsilon-NH2 de los aminoácidos lisina y los grupos amino-terminales están entre los sitios más comunes capaces de reaccionar con polímeros activados para producir conjugados de polímero. Por lo tanto, la reacción de conjugación puede ser muy demandante debido a que si una unión excesivamente alta de derivados de PEG es necesaria para crear una nube de polímero que rodea al material biológicamente activo, la actividad biológica del conjugado podría ser negativamente influenciada. Un enfoque para preparar conjugados de polímero consiste en hacer reaccionar un derivado de PEG lineal activado con un material biológicamente activo. Existen algunos ejemplos de conjugados comerciales con derivados de PEG lineas, tales como Adagen®, Oncaspar®, Neulasta® y Pegintron®. En algunos casos, pueden surgir dificultades cuando es crítico reducir al mínimo la pérdida de actividad biológica. Un enfoque para lograr una nube de polímero incrementada, pero para reducir al mínimo el número de sitios de unión, implica el uso de polímeros ramificados activados que tienen dos o más cadenas de polímero por cada sitio de enlace. Los derivados de mPEG ramificados hasta ahora son los polímeros más comúnmente usados, que pueden ser estructuralmente representados como teniendo la fórmula CH30-(CH2CH20)nCH2CH2-X-CH2CH2(OCH2CH2)n-OCH3 Z en donde X es una porción no tóxica y no reactiva que enlaza las cadenas de mPEG, que pueden tener ya sea el mismo o un diferente peso molecular. Un ejemplo particular de Z es succinimidilcarbonato (Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1992; Mirón y Wilchek, Bioconjug. Chem. 1993). Este grupo ha sido ampliamente usado para acoplar PEG a materiales biológicamente activos que reaccionan con los grupos amino presentes, por ejemplo, en Usinas de proteínas y enzimas. La producción de lisina mPEG-disustituida activada como éster succinimidílico es bien conocida en la técnica. Una posibilidad es la reacción de PEG ramificado con N-hidroxisuccinimida y ?,?-diciclohexilcarbodiimida (Harris et al, patente de E.U.A. No. 5,932,462).

En el campo de conjugación de polímero, más específica en el campo de PEGilación, se ha probado que la modificación con polímeros ramificados es particularmente eficiente para mejorar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de las proteínas ((Interferon-a: Bailón et al., Patente E.P. No. 0 809 996; Lactoferrin: Nojima et al., Pham. Res. 2009), enzimas (Ribonuclease, Catalase, Asparaginase, Tripsin: Harris et al., patente de E.U.A. No. 5,932,462), fragmentos de anticuerpo (Certolizumab pegol: Nesbitt et al. in PEGilated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Application) y oligonucleótidos (Pegaptanib, Ng et al. Nat. Rev. Drug Discov.). por consiguiente, diferentes procesos para preparar PEGs activados ramificados han sido reivindicados. Por ejemplo, Martínez et al. (Patentes de E.U.A. Nos. 5,643,575 y 5,919,455), han descrito varias moléculas de PEG ramificadas con diferentes estructuras de enlace. Greenwald et al. (WO 98/41562) han sintetizado un polímero ramificado con un núcleo central de 1 ,3-diamíno-2-propanol. Monfardini et al. (Bíoconjugate Chem. 1995) han descrito la preparación de polímero ramificado a base de lisina Harris et al. (patente de E.U.A. No. 5,932,462; patente de E.U.A. No. 7,419,600) y Wu et al. (patente de E.U.A. No. No. 7,365,127) también han descrito métodos alternativos de síntesis del mismo polímero ramificado a base de lisina.

Mientras que los métodos antes mencionados proveen los polímeros ramificados activados deseados, cabe notar que sustancias tóxicas que son nocivas para la salud humana y el ambiente son usadas actualmente. Además, procesos muy complejos son por lo regular requeridos para preparar y/o purificar intermediarios de síntesis y/o derivados de polímeros. Por ejemplo, las patentes de E.U.A. No. 7,419,600 y 7,365,127 describen algunas de estas características inconvenientes señaladas.

La patente de E.U.A. No. 7,419,600 describe dos procedimientos para preparar derivados de mPEG ramificados que tienen una porción lisina como el enlazador. Uno de los procedimientos de preparación descritos se basa en el uso de un mPEG activado comercialmente disponible costoso, mPEG-p-nitrofenilcarbonato, que es sintetizado a partir de mPEG y p-nitrofenilcloroformiato, este último es un compuesto tóxico. Un inconveniente adicional de usar derivados de p-nitrofenilcarbonato surge a partir de la toxicidad de la porción fenólica hidrófoba y su alta afinidad para proteínas. El otro procedimiento de preparación descrito usa mPEG-succinimidilcarbonato, que también está comercialmente disponible pero también es un compuesto costoso. Más aún, la preparación de esta especie activada implica el uso de fosgeno, que es un gas extremadamente tóxico.

La patente de E.U.A. No. 7,365,127 describe otro método de preparación de los mismos derivados de mPEG ramificados enlazados con lisina, seguido por conjugación de lnterferón- -lb. El procedimiento de síntesis empieza con la reacción de mPEG con trifosfeno, un derivado de fosfeno considerado ligeramente tóxico ya que es un cristal sólido a temperatura ambiente. Este compuesto sólido, sin embargo, también implica manejo cuidadoso. Más aún, una secuencia de síntesis compleja que comprende protección y desprotección de grupos funcionales es por lo regular necesaria para evitar los pasos de purificación de intermediarios de síntesis y los polímeros ramificados. Los pasos de purificación son evitados a expensas de incrementar el número de pasos de síntesis, y de usar varios reactivos sucesivamente en un procedimiento muy complejo que requiere experiencia química especializada para fabricación a gran escala.

Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos mejorados para preparar y purificar derivados de polímero para conjugarse con los grupos nucleofílicos de porciones biológicamente activas. La necesidad de dichos procedimientos mejorados incluye aquellos que son más confiables, más seguros, más rápidos, más fácilmente escalables y/o más efectivos que los procedimientos actualmente disponibles.

La presente invención enfrenta los inconvenientes anteriores en la técnica al proveer métodos mejorados para preparar derivados de óxido de poli(alquileno) y polímeros relacionados para usarse en la modificación de las propiedades fisicoquímicas de moléculas y materiales biológicamente activos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la presente invención es un método para producir polímeros lineales activados y polímeros ramificados activables de los mismos, que comprende: a) hacer reaccionar un polímero activable no peptídico lineal, químicamente bloqueado en un extremo, con un grupo activador de anillo de azol que provee un grupo residual para producir un polímero intermediario de la fórmula general poli-lm; b) Hacer reaccionar dicho poli-lm con un agente de alquilación para formar una sal de imidazolio de la fórmula general poli-lm+(alquilo)X"; y c) Hacer reaccionar dicho poli-lm+(alquilo)X' con una molécula enlazadora que tiene por lo menos dos porciones nucleofílicas para producir un derivado de polímero ramificado activable del mismo, en donde: poli es un polímero seleccionado del grupo que consiste de óxidos de poli(alquileno), poli(polioles oxietilados), poli(alcoholes olefínicos), y polímeros de óxido de alquileno y óxido de propileno; lm+ es un ion de imidazolio; y X" es un contraión anióníco seleccionado del grupo que consiste de halogenuros, nitratos, sulfonatos, cloratos, citratos, succinatos, tartratos, lactatos, sulfatos, fosfatos, acetatos, triflatos y boratos.

La presente invención provee el compuesto novedoso poli-lm+(alquilo)X", que es útil como un polímero lineal activado o para la síntesis de polímeros ramificados activables. Los polímeros lineales activados y polímeros ramificados activables de la presente invención se pueden usar para la pegilación de materiales biológicamente activos, tales como pero sin limitarse a péptidos, polipéptidos, enzimas, proteínas, oligonucleótidos y porciones de fármaco.

Otro aspecto de la presente invención es un proceso para producir polímeros lineales activados y polímeros ramificados activables de los mismos, que no comprenden o implican el uso de sustancias tóxicas tales como fosgeno o trifosgeno. El fosgeno, trifosgeno y N,N-carbonildiimidazol (CDI) se sabe que son equivalentes de carbonilo en algunas reacciones químicas (patentes de E.UA Nos. 5,359,086; 5, 182,284, y 6,784,310). Sin embargo, la sustitución de CDI, un grupo activador de anillo de azol, con fosgeno o trifosgeno no sería aplicable en la presente invención. Por ejemplo, la reacción de mPEG con fosgeno o trifosgeno da un cloroformiato. Los cloroformiatos no son útiles para la síntesis de derivados de poli-lm+(alquilo)X" (v.gr., polímeros ramificables activados de la presente invención) ni son útiles para la pegilación debido a su alta reactividad e inestabilidad. Es bien sabido en la técnica que para obtener un reactivo de pegilación útil, el aducto de cloroformiato debe ser transformado a un intermediario más estable, pero sin embargo reactivo, tal como succinimidilcarbonato, benzotriazolato, o 2-nitrofenolato. El succinimidilcarbonato muy frecuentemente se usa en la técnica, pero sin embargo no es muy estable, es altamente reactivo y con frecuencia produce altos grados de sobre pegilación. Por lo tanto, el fosgeno y trifosgeno son incapaces de actuar como sustitutos para CDI en los proceso de la presente invención.

En ciertos aspectos de la presente invención, un polímero activable no peptídico lineal se hace reaccionar con CDI para producir un polímero intermediario d la fórmula general poli-lm, en donde poli representa la cadena de polímero Im es imidazol. El polímero intermediario de la fórmula general poli-lm usualmente no es muy reactivo y particularmente no es tan reactivo como el succinimidilcarbonato. El intermediario poli-lm generalmente sólo se puede usar en la pegilación de grupos aminos reactivos (v.gr., el grupo e amino de lisina) y usualmente requiere una cantidad indeseablemente alta de material de partida para ser obtenido. Por lo tanto, la reactividad baja de poli-lm generalmente evita su uso en muchas reacciones de pegilación. En los procesos de la presente invención, poli-lm es convertido a una sal de imidazolio de la fórmula general poli-lm+(alquilo)X\ Poli-lm+(alquilo)X" es un compuesto estable con una reactividad adecuada para reacciones de pegilación. Por ejemplo poli-lm+(alquilo)X" es capaz de reaccionar tanto con grupos e como con a amino de lisina. La reactividad de po!i-lm+(alquilo)X fue muy inesperada. Esta reactividad inesperada es demostrada particularmente porque las sales de imidazolio de la presente invención despliegan una reactividad incrementada hacia el grupo a amino más impedido y menos reactivo y otros aminoácidos. La reactividad de poli-lm+(alquilo)X" permite buenos rendimientos de bísustitución de compuestos, tal como pero sin limitarse a, lisina. Dicha reactividad fue muy inesperada en el descubrimiento y procedimiento para preparar poli-lm+(alquilo)X" son un avance importante en el campo de pegilación. Por lo tanto, poli-lm+(alquilo)X" es altamente útil para pegilación y como un sustituto para succinimidilcarbonato.

Los anteriores y otros aspectos de la presente invención se describirán ahora con más detalle con respecto a otras modalidades descritas aquí. Cabe apreciar que la invención puede ser modalizada en diferentes formas y no debe considerarse como limitada a las modalidades expuestas aqui. Más bien, estas modalidades se proveen de modo que la descripción sea amplia y competa, y transmita el alcance de la invención a los expertos en la técnica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se describirá ahora en forma más completa de aquí en adelante. Esta invención, sin embargo, puede ser modalizada en diferentes formas y no debe considerarse como limitada a las modalidades expuestas aquí. Más bien, estas modalidades se proveen de modo que la descripción sea amplia y competa, y transmita completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.

La terminología usada en la descripción de la invención aquí es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no pretende ser limitante de la invención. Como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un, "una", "el" y "la" se pretende que incluya las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos (incluyendo términos técnicos y científicos) usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual compete esta invención. Se entenderá que términos tales como aquellos definidos en diccionarios comúnmente usados, deben ser interpretados como teniendo un significado que es consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la técnica pertinente y no deben ser interpretados en un sentido idealizado o excesivamente formal a menos que sea definido de esta manera expresamente aquí. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no pretenden ser limitantes de la invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas aquí son incorporadas por referencia en su totalidad.

También como se usa en la presente, "y/o" se refiere a y abarca cualesquiera y todas las posibles combinaciones de uno o más de los elementos listados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpretan en la alternativa ("o").

A menos que el contexto indique otra cosa, se pretende específicamente que las diversas características de la invención descrita aquí se pueden usar en cualquier combinación. Además, la presente invención también contempla que en algunas modalidades de la invención, cualquier característica o combinación de características expuestas aquí se pueden excluir u omitir. Para ilustrar, si la especificación establece que un complejo comprende componentes A, B y C, específicamente se pretende que cualquiera de A, B o C, o una combinación de los mismos, pueden ser omitidos y desaprobados.

Como se usa en la presente, la frase transicional "que consiste esencialmente de" (y variantes gramaticales) se ha de interpretar como que abarcan los materiales o pasos mencionados "y aquellas que no afectan materialmente las características básicas y novedosas" de la invención reivindicada. Véase, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461 , 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); véase también MPEP § 21 1 1.03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente de", como se usa aquí no debe ser interpretado como equivalente a "que comprende".

El término "aproximadamente", como se usa aquí, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad o concentración (v.gr., el peso molecular de un polímero) y similar, se entiende que abarca variaciones de 20%, 10%, 5%, 1 %, 0.5%, o incluso 0.1 % de la cantidad especificada.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para preparar nuevos polímeros lineales activados que se pueden usar como tales o como intermediarios de síntesis para preparar polímeros ramificados activables de los mismos.

"Polímero lineal activado", como se usa aquí, se refiere a un polímero lineal preparado por los procedimientos de la presente invención que se pueden utilizar como tales para modificar las propiedades fisicoquímicas de moléculas y materiales biológicamente activos. Alternativamente, el polímero lineal activado se puede usar para sintetizar polímeros ramificados activables.

"Polímeros lineales activables" y "polímeros ramificados activables", como se usa aquí, se refieren a polímeros que necesitan ser activados antes de que puedan ser utilizados para modificar las propiedades fisicoquímicas de moléculas y materiales biológicamente activos. La activación de los polímeros lineales activables se logra por los procedimientos de la presente invención para producir polímeros lineales activados. Los polímeros ramificados activables de la presente invención se preparan por procedimientos de la presente invención a partir de los polímeros lineales activados y pueden ser activados por los procedimientos de la presente invención o por cuales quiera métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Polímeros lineales activables ilustrativos que se pueden usar para preparar los polímeros lineales activados y los derivados de polímero ramificado activable de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, óxidos de poli(alquileno) (PAO) tales como poli(propilenglicol) y poli(etilenglicol); polioles poli(oxietilados); alcoholes poli(olefínicos), y polímeros de óxido de alquíleno y óxido de propileno. En algunas modalidades de la presente invención, el polímero lineal activable es poli(etilenglicol) (PEG). En otras modalidades de la presente invención, el polímero lineal activable tiene un grupo extremo bloqueado, tal, pero no limitado a monometoxi-poli(etilenglicol) (mPEG). Los polímeros lineales activables de la presente invención pueden tener un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 100,000 Da, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 75,000 Da o de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 50,000 Da.

Tanto los derivados de polímero lineales como ramificados de la presente invención son útiles para modificar las propiedades fisicoquímicas de moléculas y materiales biológicamente activos tales como, pero sin limitarse a péptidos, polipéptidos, proteínas, enzimas, oligonucleótidos y porciones de fármaco. La presente invención incluye, pero no se limita a la síntesis de nuevos PEGs lineales activados, que son caracterizados como estables, fáciles de manejar, no tóxicos y/o como que tienen reactividad similar a aquella mostrada por otros derivados bien conocidos en la técnica que son adecuados para reacciones de pegilación. Otro aspecto de la presente invención es PEGs ramificados activables útiles para reacciones de conjugación que se preparan de manera eficiente y/o segura a partir de los nuevos PEGs lineales activados, como se describe aquí. En algunas modalidades de la presente invención, el polímero PEG ramificado activable es (PEG)2Lys, en donde lisina se usa como una molécula enlazadora. El procedimiento mejorado de la presente invención también incluye un método de purificación conveniente para los polímeros ramificados deseados a partir del material crudo de la mezcla de reacción. El método de purificación comprende procedimientos individuales o combinados de ultrafiltración por membrana y/o cromatografía en columna.

El método de síntesis de la presente invención comprende dos pasos de reacción. En un aspecto de la presente invención, sólo dos pasos de reacción están implicados cuando se sintetizan los polímeros lineales activados a partir de polímeros activables adecuados. Los polímeros comercialmente disponibles adecuados incluyen, pero no se limitan a polímeros PAO o PEG con un grupo extremo bloqueado, tal como pero sin limitarse a mPEG. El primer paso clave en el procedimiento de la presente invención implica la reacción de un polímero lineal activable con un grupo activador de anillo de azol. Los grupos activadores de anillo de azol son bien conocidos en la técnica e incluyen aquellos que pueden ser activados por alquilación, tales como pero sin limitarse a N, N-carbonildiazoles. Grupos activadores de anillo de azol ilustrativos incluyen, pero no sin limitarse a, N,N-carbonildiimidazol (CDI), ?,?-carbonilbisbencimidazol, N,N-tiocarbonilbisimidazol, y ?,?-tiocarbonilbisbencimidazol. En ciertas modalidades de la presente invención, la reacción del polímero lineal activable con el grupo activador de anillo de azol provee un grupo residual para dar un polímero intermediario de la formula general poli-lm, en donde poli representa la cadena de polímero e Im es imidazol. En algunas modalidades, el polímero lineal activable es un polímero activable no peptídico lineal. En ciertas modalidades de la presente invención, el polímero lineal activable se hace reaccionar con el grupo activador de anillo de azol N,N- carbonildiimidazol (CDI) para dar pol¡-lm. El uso de CDI en algunas modalidades de la presente invención presenta ventajas sobre otros reactivos usados en la técnica anterior, tales como fosgeno y trifosgeno, ya que CDI es más fácil de manipular y mucho menos tóxico que los compuestos activadores utilizados en la técnica anterior (v.gr, fosfeno y trifosgeno).

Como se indicó antes, los polímeros lineales activables incluyen, pero no se limitan a, óxidos de poli (alquileno) tales como poli (propilenglicol) y poli(etilenglicol); poli(polioles oxietilados); poli(alcoholes olefínicos), y polímeros de óxido de alquileno y óxido de propileno. En algunas modalidades de la presente invención, el polímero lineal activable es poli(etilenglicol) (PEG). En otras modalidades de la presente invención, el polímero lineal activable tiene un grupo extremo bloqueado, tal como pero sin limitarse a monometoxi-poli(etilenglicol) (mPEG). En ciertas modalidades de la presente invención el polímero activable no peptídico lineal mPEG con un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 100,000 Da.

La reacción de activación de polímero con el grupo activador de anillo de azol se lleva a cabo mediante agitación a temperaturas que varían de aproximadamente 5°C a aproximadamente 80°C, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 70°C o de aproximadamente 60°C, durante un período de aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas. El solvente usado como medio de reacción se escoge de aquellas conocidas en la técnica para realizar este tipo de reacción. Una lista no limitante de solventes en los cuales el polímero activable y grupo activador de anillo de azol son solubles a temperatura ambiente o más alta incluye: solventes halogenados, solventes oxigenados, solventes oxigenados cíclicos, solventes polioxigenados, solventes polioxigenados lineales y solventes apróticos polares. Solventes ilustrativos específicos incluyen, pero no se limitan a: cloruro de metileno, cloroformo, acetonitrilo (ACN) y otros nitrilos como propionitrilo, tetrahidrofurano (THF), dioxanos, glicoles, glimas, sulfóxido de dimetilo (DMSO), dimetilformamida (DMF), 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona (NMP), y mezclas de los mismo. En algunas modalidades de la presente invención, el solvente es THF. El producto formado, poli-lm, es estable a temperatura ambiente, o más alta, por lo regular hasta a aproximadamente 100°C.

El segundo paso de reacción clave en el proceso de la presente invención comprende la activación del grupo residual de anillo de azol por alquilación. En algunas modalidades de la presente invención, el grupo residual de anillo de azol es imidazol (es decir, Im) y el grupo Im es activado por alquilación con un reactivo de alquilación para formar una sal de imidazolio que pude ser estructuralmente representada como poli-lm+(alquilo)X, en donde lm+ es el ion de imidazolio, alquilo es un grupo alquílico, y X" es un contraión aniónico.

"Alquilo" como se usa aquí solo o como parte de otro grupo, se refiere a un hidrocarburo de cadena recta, ramificada o cíclica que contiene de 1 a 20 átomos de carbono. En algunas modalidades, el grupo alquilo puede contener 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 átomos de carbono. Ejemplos representativos de alquilo incluyen pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, ¡so-butilo, ter-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilohexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, y similares. El término "alquilo" pretende incluir tanto alquilo sustituido como no sustituido a menos que se indique otra cosa. Sustituyentes típicos incluyen átomos que no son hidrógeno (v.gr, halógenos) grupos funcionales (tales como, pero sin limitarse a grupos amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo, alcoxi, carboxilo, sililo, sililoxi, fosfato y similares), grupos hidrocarbilo, y grupos hidrocarbilo sustituidos con uno o más heteroátomos. Sustituyentes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a alquilo, alquilo inferior, halogenoalquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclo, heteroclicloalquilo, arilo, arilalquilo, alcoxi inferior, tioalquilo, hidroxilo, tio, mercapto, amino, ¡mino, halógeno, ciano, nitro, nitroso, azido, carboxi, sulfuro, sulfona, sulfoxi, fosforilo, sililo, siloxi, boronilo y alquilo inferior modificado.

"Contraión aniónico" (es decir, X") es un anión o un grupo aniónico asociado con la carga catiónica del ion de ¡midazolio. Los contraiones aniónicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, halogenuros tales como cloruro, yoduro, fluoruro y bromuro; nitratos; sulfonatos tales como sulfonatos de alquilo de C1-C6 (v.gr., metilsulfonato, mesilato y/o etilsulfonato) y arilsulfonatos (v.gr., bencensulfonato y tosilatos); cloratos; citratos; succinatos; tartratos; lactatos; sulfatos tales como alquilsulfato (v.gr., metilsulfato y etilsulfato), arilsulfatos (v.gr., bencensulfato y toluensulfato), alcoxisulfatos (v.gr., metoxisulfato y etoxisulfato), y ariloxisulfatos; fosfatos; acetatos; triflatos; y boratos tales como tetrafluoroborato.

Por lo tanto, el segundo paso en algunas modalidades de la presente invención comprende activar el grupo Im de poli-lm por alquilación con un reactivo de alquilación adecuado para formar la sal de imidazolio poli-lm+(alquilo)X\ Una lista no limitante de agentes de alquilación adecuados: halogenuros de alquilo, halogenuros de bencilo y compuestos relacionados, halogenuros de alilo, dialquilsulfatos, alquilo, bencilo o aliltosilatos, mesilatos o triflatos, y compuestos sustituidos relacionados. En algunas modalidades de la presente invención, poli-lm es activado por un halogenuro de alquilo. "Halogenuro", como se usa aquí, se refiere a cualquier halógeno adecuado, incluyendo Cl, Br y I. En ciertas modalidades de la presente invención, poli-lm es activado por yoduros de alquilo, tales como pero sin limitarse a yoduro de metilo. En otras modalidades de la presente invención, poli-lm comprende mPEG-lm y es activado por alquilación de halogenuro de alquilo, y en ciertas modalidades mPEG-lm es activado por yoduros de alquilo, tales como pero sin limitarse a yoduro de metilo.

La reacción de alquilación del anillo de azol, tal como el anillo Im de polímeros de poli-lm se lleva a cabo bajo temperatura de aproximadamente 5°C a aproximadamente 100°C, de aproximadamente 10°C a aproximadamente 50°C, o a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C), durante un período de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas.

Una lista no limitante de solventes que se pueden usar para realizar la reacción de alquilación incluye: solventes halogenados, solventes oxigenados lineales, solventes oxigenados cíclicos, solventes polioxigenados, solventes polioxigenados lineales, solventes apróticos polares, y otros solventes en los cuales los polímeros activables son solubles a temperaturas dentro de los intervalos mencionados. En algunas modalidades de la presente invención, la reacción de alquilación se lleva a cabo a temperatura ambiente. Solventes ilustrativos específicos que se pueden utilizar en la reacción de alquilación incluyen, pero no se limitan a: cloruro de metileno, cloroformo, ACN y otros nitrilos como propionitrilo, THF, dexanos, glicoles, glimas, DMSO, DMF, 2-pirrolidona, NMP, y mezclas de los mismos. En algunas modalidades de la presente invención, la reacción de alquilación se lleva a cabo en ACN.

Los polímeros lineales activados resultantes, v.gr., poli-lm+(alquilo)X", de la presente invención en algunas modalidades se usan para modificar las propiedades fisicoquímicas de materiales biológicamente activos y moléculas biológicamente activas tales como, pero sin limitarse a péptidos, polipéptidos, proteínas, enzimas, oligonucleótidos y porciones de fármaco. En otras modalidades de la presente invención, los polímeros lineales activados se utilizan para preparar polímeros ramificados activables que son adecuados para conjugación. Los polímeros ramificables activables de la presente invención pueden ser activados para reacciones de conjugación por cualquier método conocido por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, los derivados de polímero ramificado de la presente invención tienen una fórmula estructural general que puede ser representada como R polia-P-C-Q-polib Z en donde polia y poli son cadenas de polímero de los polímeros lineales activados que pueden tener el mismo o un diferente peso molecular, C denota un átomo de carbono, R es una porción no tóxica y no reactiva, P y Q son los mismos o diferentes fragmentos capaces de proveer enlaces hidrolíticamente estables, y Z se selecciona para proveer un grupo funcional reactivo hacia o capaz de ser activado para ser reactivo hacia porciones nucleofílicas de moléculas y materiales bilógicamente activos. La fórmula anterior se reescribe aquí como polia-P-C(R)(Z)-Q-polib.

En ciertas modalidades de la presente invención, el método de síntesis además comprende un tercer paso de reacción para preparar derivados de polímero ramificados haciendo reaccionar los derivados de polímero lineales, v.gr., poli-lm+ (alquilo)X", que resulta del segundo paso de reacción con una molécula enlazadora que tiene por lo menos dos grupos nucleofílicos para producir un derivado de polímero ramificado activable del mismo. Moléculas enlazadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, alquildiaminas disustituidas, triaminas, y aminoácidos que incluyendo derivados de aminoácido naturales y no naturales, diaminoalquilos, dihidroxialquilos y ditioalquilos. Otras moléculas enlazadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, lisina, éster de lisina y éster etílico de lisina. En algunas modalidades de la presente invención, la molécula enlazadora es lisina. Un procedimiento de síntesis ilustrativo para polímeros ramificados de lisina, tales como (poli)2Lys, implica hacer reaccionar poli-lm+ (alquilo)X' con un solvente derivado de lisina en un solvente orgánico. Los derivados de lisina que son solubles en solventes orgánicos incluyen, pero no se limitan a, derivados de lisina sililatados. Si dichos derivados no están comercialmente disponibles, el método de síntesis adicional incluye la reacción de derivación bien conocida de lisina con amidas sililatadas como un paso de reacción adicional. Un polímero ramificado de lisina ilustrativo de la presente invención es (mPEG)2Lys. En algunas modalidades de la presente invención, el polímero ramificado activable es lisina mPEG-disustituida, es decir, (mPEG)2Lys.

Como se describió antes, los polímeros ramificados activables, en algunas modalidades, pueden ser estructuralmente representado como pol¡a-P-C(R)(Z)-Q-poli , en donde polia y polib son cadenas de polímero de los polímeros lineales activados, que pueden tener el mismo o un diferente peso molecular, C representa un átomo de carbono, R es un grupo no reactivo y no tóxico, 2 es un grupo funcional capaz de ser activado para unir el polímero ramificado con compuestos biológicamente activos, y P y Q son los mismos o diferentes fragmentos capaces de proveer enlaces hidrolíticamente estables.

Enlaces ilustrativos, P y Q, incluyen pero no se limitan a enlaces de amidas, aminas, éteres, carbamatos (es decir, enlaces de uretano), urea, tiourea, tiocarbamatos, tiocarbonatos, tioéteres, tioésteres y ditiocarbonato.

Enlaces de éster, que son porciones aromáticas hidrolíticamente estables y potencialmente tóxicas, se deben evitar.

Grupos funcionales ilustrativos para Z incluyen, pero no se limitan a: 1) grupos funcionales capaces de reaccionar con un grupo armiño, tales como, pero sin limitarse a: a) carbonatos, tales como carbonatos de p-nitrofenilo o succinimidilo; b) carbonilimidazol; c) azolactonas; d) imidotionas cíclicas, y e) isocianatos o isotiocianatos; 2) grupos funcionales capaces de reaccionar con ácidos carboxilicos o grupos carboxilato y grupos carbonilo reactivos, tales como, pero sin limitarse a: a) aminas primarias; y b) grupos funcionales hidracina e hidrazida, tales como carbazatos, semicarbamatos y tiocarbazatos; 3) grupos funcionales capaces de reaccionar con porciones mercapto y sulfhidrilo tales como fenilglioxales; y 4) grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos hidroxilo tales como ácidos carboxilicos u otros nucleófilos capaces de reaccionar con un centro electrofílico, tales como, pero sin limitarse a tioles, carbocíclico, aminas, hidroxilos y metilenos activos. El experto en la técnica debe reconocer que Z abarca las porciones de activación conocidas en química de pegilación y sus conjugados. En algunas modalidades de la presente invención, la porción Z también incluye una porción de separador situada proximal a la porción enlazadora.

En ciertas modalidades de la presente invención, el procedimiento además comprende el paso de hacer reaccionar poli-lm+(alquilo)X" con una molécula enlazadora que porta por lo menos dos porciones nucleofílicas para producir un derivado de polímero ramificado activable del mismo. El procedimiento de síntesis de la presente invención es útil para preparar derivados de polímero ramificados usando una amplia variedad de moléculas enlazadoras que portan por lo menos dos porciones nucleofílicas. En algunas modalidades, las moléculas enlazadoras comprenden uno o más grupos aminonucleofilicos que se sabe que reaccionan oportunamente con los derivados lineales activados.

El procedimiento de síntesis para preparar derivados de polímero ramificado activable implica la reacción entre los polímeros lineales activables, v.gr., poli-lm+(alquilo)X", y la molécula enlazadora en solventes orgánicos, a una temperatura adecuada y, en algunas modalidades, en presencia de una base. En algunas modalidades, la molécula enlazadora es lisina o un derivado de lisina. En ciertas modalidades, los derivados de lisina son derivados sililatados. Los derivados de lisina sililatados, en algunas modalidades, se obtienen mediante la reacción de lisina con reactivos de protección y/o derivación, tales como pero sin limitarse a amidas sililatadas y halógeno-trialquilsilanos. Una lista no limitante de reactivos útiles para preparar derivados de lisina solubles en solvente orgánicos incluye: clorotrimetilsilano, cloro-ter-butildimetilsilano, y reactivos similares. En algunas modalidades de la presente invención, la reacción de derivación comprende la reacción de lisina con amidas sililatadas. En otras modalidades, la reacción de derivación comprende la reacción de lisina con N,0-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) bajo condiciones de reacción ligeras, como se describe aquí más adelante.

Las reacciones entre los polímeros lineales activados, v.gr., poli- lm+(alquilo)X", y la molécula enlazadora se llevan a cabo a temperaturas que varían de aproximadamente 5°C a aproximadamente 140°C, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 110°C, o a aproximadamente 85° C, durante un período de aproximadamente 12 a aproximadamente 36 horas. Una lista no limitante de solventes que se pueden usar para realizar este paso de reacción incluye: solventes halogenados, solventes oxigenados lineales, solventes oxigenados cíclicos, solventes polioxigenados, solventes polioxigenados lineales, solventes apróticos polares y otros solventes en los cuales tanto los polímeros alquilados activados como la molécula enlazadora son solubles a temperaturas dentro de los intervalos mencionados anteriormente. En algunas modalidades de la presente invención, la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente o más alta. Solventes ilustrativos específicos incluyen, pero no se limitan a: cloruro de metileno, cloroformo, ACN y otros nitrilos como propionitrilo, THF, dioxanos, glicoles, glimas, DMSO, DMF, NMP, agua, 1 ,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1 H)-pirim¡dinona (DMPU), y mezclas de los mismos. En algunas modalidades de la presente invención, el solvente es una mezcla de solventes orgánicos, tales como pero sin limitarse a solventes apróticos polares con un punto de ebullición alto. En ciertas modalidades de la presente invención, la mezcla comprende ACN y DMSO. Mezclas de solventes, tales como pero sin limitarse a una mezcla de un solvente orgánico y un solvente aprótico polar, varían de aproximadamente 0/100 a aproximadamente 100/0, de aproximadamente 25/75 a aproximadamente 75/25, o son aproximadamente 50/50.

La base opcionalmente utilizada en la reacción de los polímeros lineales activados, v.gr., poli-lm+(alquílo)X", con la molécula enlazadora se pueden seleccionar de aquellos usualmente utilizados en este tipo de transformación. Bases ilustrativas incluyen, pero no se limitan a aminas básicas terciarias tales como trialquilaminas, dialquilarilaminas, díarilalquilaminas y otras aminas como diazabiciclo-undecano y p-dimetilaminopiridina (DMPA); aminas terciarias alquílicas tales como aminas con grupos lineales y ramificados alifáticos como tributilamina, trietilamina, ?,?-diisopropíletilamina; tetrametílguanidina; dietanolamina e hidróxido de tetrabutilamonio. En algunas modalidades de la presente invención, la base es ?,?-diisopropiletílamina.

El polímero ramificado, en algunas modalidades, puede ser estructuralmente representado como que tiene la fórmula mPEGa-OC(0)-NH-(CH2)i)-CH-NH-C(O)-0-mPEGb C(0)OH en donde mPEGa y mPEGb tienen la estructura: H3CO-(CH2CH20)nCH2CH2-, en donde n puede ser el mismo o diferente en mPEGa y mPEGb y típicamente varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,500 para proveer pesos moleculares de aproximadamente 100 a aproximadamente 100,000 Da. El grupo carboxilo puede ser activado siguiendo diversos enfoques para permitir el acoplamiento de materiales biológicamente activos, como es bien conocido en la técnica.

A diferencia de los procedimientos de la técnica anterior, el uso de compuestos nocivos o tóxicos, tales como fosgeno o trifosgeno (Harris et al, patente de E.U.A. No. 7,419,600; Wu et al, patente de E.U.A. No. 7,365,127) o p-nitrofenilcarbonato (Harris et al., patente de E.U.A. No. 7,419,600) se evita. Además, todos los pasos de reacción se llevan a cabo fácilmente y/o eficientemente bajo condiciones ligeras, sin la necesidad de pasos intermedios para protección de grupo funcional, inactivación y/o purificación. Consecuentemente, los procesos de síntesis de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de laboratorio estándares. Además, los procedimientos de síntesis de la presente invención son simples y requieren únicamente experiencia química estándar, habilidades y/o trabajo de laboratorio.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es un método para producir polímeros lineales activados y polímeros ramificados activables de los mismos, que comprenden: a) hacer reaccionar un polímero activable no peptídico lineal, químicamente bloqueado en un extremo, con un grupo activador de anillo de azol que provee un grupo residual para producir un polímero intermediario de la fórmula general poli-lm; b) hacer reaccionar dicho poli-lm con un agente de alquilación para formar una sal de imidazolio de la fórmula general poli-lm+(alquilo)X"; y c) hacer reaccionar dicho poli-lm+(alquilo)X" con una molécula enlazadora que porta por lo menos dos porciones nucleofílicas para producir un derivado de polímero ramificado activable del mismo, en donde: poli es un polímero seleccionado del grupo que consiste de óxidos de poli(alquileno), poli(polioles oxietilados), poli(alcoholes olefínicos), y polímeros de óxido de alquileno y óxido de propileno; lm+ es un ion imidazolio, y X" es un contraión aniónico seleccionado del grupo que consiste de halogenuros, nitratos, sulfonatos, cloratos, citratos, succinatos, tartratos, lactatos, sulfatos, fosfatos, acetatos triflatos y boratos.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de purificación eficiente para los derivados de polímero deseados de las mezclas de reacción crudas. El método descrito comprende, consiste de o, consiste esencialmente de uno o ambos de los siguientes pasos de purificación: filtración por membrana y/o cromatografía en columna. En algunas modalidades de la presente invención, el proceso de filtración por membrana utilizado es ultrafiltración y en ciertas modalidades en procedimiento de ultrafiltración es operado bajo el modo de diafiltración. La cromatografía en columna se puede basar en procedimientos de afinidad, intercambio de iones, exclusión de tamaño, interacción hidrófoba y/o combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades de la presente invención, el método de purificación comprende, consiste de o consiste esencialmente de un procedimiento de dos pasos, en donde el primer paso comprende diafiltración por filtración de flujo tangencial para lavar especies de peso molecular bajo de la solución de lumen mientras retiene derivados de polímero deseados. Para los propósitos de la presente invención, la diafiltración resultó ser un enfoque económico, simple, robusto rápido y/o efectivo para remover impurezas de peso molecular bajo de las mezclas de reacción crudas. La solución resultante del primer paso de purificación puede ser altamente enriquecido en el derivado ramificado deseado sin pérdidas significativas en rendimientos, lo que permite una cantidad más alta de polímero ramificado que se cargaría en la columna cromatográfica en el segundo y más costoso paso de purificación sin comprometer la capacidad de la columna. En el segundo paso de purificación, el concentrado resultante es altamente purificado por cromatografía de alta resolución. En algunas modalidades, el concentrado resultante es purificado por cromatografía de interacción hidrófoba este procedimiento da los polímeros ramificados deseados con alta pureza y altos rendimientos. El procedimiento de dos pasos secuenciales tiene la ventaja de capacidad de carga de masa alta en virtud de lo cual los procedimientos de purificación en columna pueden ser realizados de manera más eficiente.

El procesamiento de diafiltración se realiza para reducir especies de peso molecular tan bajo como sea posible para un volumen de material permeado removido dado y para reducir al mínimo las pérdidas en forma neta de los derivados de polímero deseado. Para lograr esta meta, los materiales y condiciones de operación aplicables dependen de las características de los derivados de polímero así como de los requerimientos de pureza específicos. Las propiedades hidrófilas-hidrófobas y el corte de peso molecular de las membranas y la composición de la solución reguladora de pH también se escogen para hacer el procedimiento lo más barato, flexible, robusto, rápido y eficiente como sea posible, reduciendo al mínimo a su vez los procedimientos de ensuciamiento de membrana. Como es conocido por los expertos en la técnica, existe una amplia gama de materiales y condiciones de operación para procedimientos de diafiltración. Los materiales y parámetros mencionados son cuidadosamente fijados controlados.

Las condiciones de purificación ilustrativas se proveen a continuación. En algunas modalidades de la presente invención, el procedimiento de purificación es utilizado para purificar lisina mPEG disustituida. En ciertas modalidades, la lisina mPEG disustituida tiene cadenas de PEG con un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. Una lista no limitante de membranas poliméricas sintéticas útiles incluye: polisulfonas (PS), polietersulfonas (PES), polipropileno (PP) y fluoruro de polivinideno (PVDF). En algunas modalidades, las membranas de PES con un corte de peso molecular entre aproximadamente 20,000 y aproximadamente 80,000 Da o entre aproximadamente 40,000 y aproximadamente 60,000 Da son utilizadas. El pH, concentración iónica y otras condiciones de operación son ajustadas para obtener buenos rendimientos de separación del derivado de polímero deseado, tal como pero sin limitarse a lisina mPEG-disustituida, de la mezcla de reacción cruda siguiendo aspectos bien conocidos en la técnica. La concentración iónica es controlada como sales inorgánicas tales como, pero sin limitarse a cloruro de sodio. Las concentraciones de las sales inorgánicas varían de aproximadamente 0.00 a aproximadamente 4.00 M, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 2.00 M, y de aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.30 . Dependiendo de las características de membrana, los procedimientos de ultrafiltración se pueden llevar a cabo a presiones de hasta aproximadamente 315 kPa y a temperaturas entre aproximadamente 4°C a aproximadamente 60°C o aproximadamente temperatura ambiente. El procedimiento ele separación se lleva a cabo utilizando velocidades de flujo variables entre aproximadamente 15 a aproximadamente 300 L m"2 h" o entre aproximadamente 60 y aproximadamente 180 Lm'2h"1. En algunas modalidades de la presente invención, la velocidad de flujo se ajusta a aproximadamente 90 L m"2 h'\ Después de procesamiento de diafiltración, la pureza de la muestra resultante es mayor que aproximadamente 80%, como se puede inferir visualmente a partir de geles de SDS-PAGE.

El procesamiento de cromatografía en columna es finalmente realizado para producir el derivado de polímero deseado con alta pureza. En algunas modalidades de la presente invención, se utiliza cromatografía de interacción hidrófoba en columna. En ciertas modalidades, la cromatografía de interacción hidrófoba se utiliza después del procesamiento de diafiltración. A diferencia de los enfoques de la técnica anterior, las muestras altamente enriquecidas del polímero ramificado pueden ser cargadas en la columna desde el principio, de tal manera que haya muy alta capacidad de carga del derivado de polímero deseado de la operación del derivado de polímero deseado por lote; por lo tanto, haciendo el proceso global más rápido y/o menos costoso. Como es conocido por un experto en la técnica, hay una amplia disponibilidad de columnas de selección, medios y condiciones de operación para realizar cromatografías de operación hidrófoba. Los parámetros tales como presión, altura del lecho, velocidad de flujo lineal, composición media, capacidad y concentración de la muestra son cuidadosamente fijadas y controladas. Una lista no limitante de medios de cromatografía de interacción hidrófoba incluyen: butilsefarosa, octilsefarosa, fenilsefarosa, butilagarosa, hexilagarosa, octilagarosa, decilagarosa y fenilagarosa. En ciertas modalidades de la presente invención, fenilsefarosa de alto rendimiento (GE Healthcare) es empacada en una columna XK50 (50mm i.d., GE Healthcare) con una altura de lecho de 12 cm y después equilibrada con NaCI 4m, y se usa para separar el derivado de polímero deseado del polímero sin reaccionar, tal como, pero sin limitarse a separación del derivado de mPEG ramificado a partir de mPEG y oligómeros de mPEG sin reaccionar. La elución en algunas modalidades, se realiza usando un gradiente por pasos por deducción de concentración iónica. Los procesos de purificación de la presente invención, en algunas modalidades, permiten la purificación de grandes cantidades del derivado de polímero deseado, tal como, pero sin limitarse a lisina mPEG-disustituida, sin comprometerla capacidad de la columna.

La presente invención se explica con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de mPEG (20kDa)-OC(O)-lm(1 ) mPEG comercialmente disponible (20 kDa) (12.600 g, 6.3 10"4 mol) se disolvió en THF anhidro (60 mL) a 60°C CDI (0.293 g, 1.81 10"3 mol) se añadió y la solución se agitó a 60°C durante 18 horas. El solvente se removió bajo vacio. El residuo se disolvió en agua (100 mL) y después se extrajo 5 veces con cloroformo (5 x 100 mL). La fase orgánica se evaporó a presión reducida y se secó (5 mmHg) hasta un peso constante: rendimiento: 97-99%. 1H-RMN (300 MHz - CI3CD): 3.35 ppm (s, 3H, OMe); 3.60 ppm (brs estructura de base de mPEG); 4.43-4.52 ppm (m, sobrepuesta sobre el pico de estructura de base de mPEG, CH2OC(0)); 7.04 ppm (s, 1 H, Im-H); 7.40 ppm (s, 1 H, Im-H); 8.1 1 ppm (s, 1 H, Im-H).

EJEMPLO 2 Síntesis de mPEG(20 kDa -OC(0)-(lmMe)(*> I H (2) El mPEG(20 kDa)-OC(0)-lm (2.000 g, 1 10-4 mol) obtenido en el ejemplo 1 se disolvió en ACN (10 mL) a temperatura ambiente. Se añadió yoduro de metilo (1 mL, 1.6 10'2 mol), y la solución se agitó a temperatura amiente durante 16 horas. El solvente se removió a presión reducida y el residuo sólido resultante se secó (5 mmHg) hasta un peso constante. Rendimiento: 95-99%. 1H-RMN (300 MHz - C13CD): 3.36 ppm (s, 3H, OMe); 3.63 ppm (brs, estructura de base de mPEG); 3.86 ppm (m, sobrepuesto sobre pico de estructura de base de mPEG, CH2OC(0)); 4.06 ppm (s, 3H, CH3); 7.51 ppm (s, 2H, 2 x Im-H); 9,96 ppm (s, 1 H, Im-H).

EJEMPLO 3 Síntesis de mPEG(20KDa)-OC(O)-Lis-(O)CO-mPEG(20KDa) (3) a) Preparación de solución de Me3SiNH(CH2)4(COOSiMe3)NHSiMe3: una solución de lisina (0.073 g, 0.5 mmol), BSA (0.65 mL, 2.62 10"2 mol) y ACN (0.30 mL) se sometió a sonicación a temperatura amiente hasta disolución completa de los reactivos. b) mPEG(20 kDa -OC(0)-(lmMe) ®'? (1.931 g, 0.96 mmol) se disolvió en ACN (4 mL) y DMSO (4.00 mL) y después en la solución de Me3S¡NH(CH2)4(COOS¡Me3)NHS¡Me3 (87.1 µ?) y N,N-diisopropilet¡lamina (34.0) se añadieron. La solución molar mPEG(20 kDa -OC(0)-(lmMe) f|? : lisina fue 2:1. La mezcla de reacción se agitó a 85°C durante 20 horas y se dejo que alcanzara la temperatura amiente. Se añadió salmuera (150 mL) y la fase acuosa se extrajo 5 veces con cloruro de metileno (40 mL cada una). El extracto combinado se evaporó y se secó a presión reducida (5 mmHg) hasta un peso constante. Rendimiento: 95-99% los productos de reacción fueron monitoreados usando análisis de SDS-PAGE.1'H-RMN (300 MHz - C13CD): 0.90-0.95 ppm (m, 2H, estructura de base de lisina); 1.2-1.4 ppm (m, 6H, estructura de base de lisina); 3.09 ppm (s, 3H, OMe); 4.14 ppm (m, 2H, CH2OC(0)); 7.49 ppm (s, 1 H, NH); 7.65 ppm (s,IH, NH).

EJEMPLO 4 Purificación de mPEG(20 kDa)-OC(O) -Lvs-(O)CO-mPEG(20 kDa) Una solución acuosa que contenía 2.000 g de sólido obtenido en el ejemplo 3 se diafiltró a través de una membrana de PES de corte de 50,000 PM (cásete de Vivaflow 200) usando un regulador de pH de NaCI 0.2 M, pH 7, a una velocidad de flujo entre 30 y 180 L m"2 h"1. Después de un ciclo de untrafiltración con 4 litros de regulador de pH de NaCI 0.2 M, la solución resultante se encontró que era altamente enriquecida en el producto de interés, es decir, mPEG(20 kDa)-OC(O)-Lis-(O)CO-mPEG(20 kDa) (pureza >80%, como se estimó por inspección visual de gel de SDS-PAGE). La solución se extrajo 5 veces con cloruro de metileno (40 mL cada uno). El extracto combinado se evaporó y se secó con vacio (5 mmHg). Una muestra del producto seco (0.6 g) se disolvió después en regulador de pH de NaCI 4 M (40 mL), y se purificó por cromatografía en columna de interacción hidrófoba (matriz: Phenü Sepharose HP; columna: XK 50/20. GE Healthcare). El procedimiento de purificación se condujo bajo condiciones de elución de gradientes por pasos por reducción de concentración iónica. Las muestras de elución que contenían mPEG(20 kDa)-OC(O)-Lis-(O)CO-mPEG(20 kDa) fueron identificadas por análisis de SDS-PAGE, se pusieron en acervo y se extrajeron 4 veces con cloruro de metileno (40 mL cada una). El extracto combinado se evaporó y se secó a presión reducida (5 mmHg). El sólido obtenido se analizó por SDS-PAGE, MALDI TOF, H-RMN y RP-HPLC-ELSD. Estas pruebas confirmaron que mPEG(20 kDa)-OC(O)-Lis-(O)CO-mPEG(20 kDa) se obtuvo en buen rendimiento y con alta pureza como resultado del procedimiento mejorado de la presente invención.

EJEMPLO 5 Activación de mPEG(20 kDa)-OC(O)-Lis-(O)CO-mPEG(20 kDa) La activación del polímero ramificado de la invención se llevó a cabo usando técnicas bien conocidas en el campo. N-hidroxisuccinimida (NHS) (4.83 mg, 0.042 mmol) se disolvió en 1 mL de cloruro de metileno anhidro y 1 mL de THF anhidro bajo atmosfera de nitrógeno y se mantuvo bajo agitación a 0°C en un baño de hielo. mPEG(20 kDa)-OC(0)-Lis-(0)CO-mPEG(20 kDa) obtenido en el ejemplo 4 y ?,?'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (5.8 mg, 0.028 mmol) se añadieron bajo atmosfera de nitrógeno. La solución se agitó 2 horas a 0°C y después una nueva porción de DCC (2.9 mg, 0.014 mmol) se añadió. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a 0°C y después se mantuvo durante 16 horas a 4°C sin agitación. Se añadió éter dietílico seco (30 mL) y el producto precipitado se separó por centrifugación. El sólido se lavo con éter dietílico seco, se secó y se redisolvió en 2 mL de ACN. Se añadió ácido acético (35 µ?_) y la solución se mantuvo 1 hora bajo agitación a temperatura ambiente. La fase superior se separó por centrifugación y el producto se precipitó con éter dietílico seco, se separó por centrifugación y una vez más se lavó y se precipitó. El sólido obtenido se secó a presión reducida (5 mmHg) hasta un peso constante. La conversión a mPEG(20 kDa)-OC(O)-Lis(mPEG(20 kDa)(0)CO)-OSu se evaluó usando una prueba espectrofotométrica (Niemczik y Van Arnum, 2008). Rendimiento: 90-95%.

EJEMPLO 6 Conjugación de IFN g-2a a mPEG(20 kDa)-OC(O)-Lis(mPEG(20 kDa)(0)CO)-OSu La reacción de conjugación se hizo usando metodologías bien conocidas en la técnica. mPEG(20 kDa)-OC(O)-L¡s(mPEG(20 kDa)(0)CO)-OSu (250 mg, 0.00625 mmol) se disolvió en 1 mM HCI enfriado a 4°C (2.5 mL), y se mantuvo con agitación en un baño de hielo. Cuando se disolvió el reactivo, se añadió rápidamente IFN a-2a (14 mL de una solución de 3.21 mg/ml, en regulador de pH de borato de sodio 50 mM pH 8.0), y la reacción se dejo proceder durante 3 horas a 4°C bajo agitación suave. La solución se extinguió con ácido acético a pH 4.5, después se diluyo 8 veces con NH4Ac 10 mM (pH 4.5) y se cargó en una columna de cromatografía de intercambio de iones (matriz: Fractogel EMD COO" CM; columna: XK 26/20, GE Healthcare; CV=60 ml_; 4°C). El procedimiento de purificación se condujo bajo condiciones de elución de gradiente por pasos con los siguientes reguladores de pH: 40 mM de NH4AC pH 4.5; 0.12 M de NaCI en 40 mM de NH4AC pH 4.5; 0.5 M de NaCI en 40 mM de NH4AC pH 4.5 y 1 M de NaCI en 40 mM de NH4AC pH 4.5. Las muestras de elución de monitorearon por absorbancia de UV a 280 nm. Las fracciones que contenían el conjugado IFN a-2a-PEG2 fueron puestas en acervo y concentradas usando filtros de ultracentrífuga Amicon® (celulosa regenerada 10,000 MWCO) y se analizaron. La mezcla cruda de PEGilación se caracterizó con SEC-HPLC (columna: TSK Gel 3000SW, 7,5x600mm, Tosoh) indicando 36% del rendimiento del conjugado IFN ct-2a-PEG2, 2.5% de oligómeros de IFN cc-2a-PEG2, y 61.5% de geles de IFN a-2a SDS-PAGE no modificados (teñidos con azul brillante de Coomasie, y BaC /l; usando PEGASYS como conjugado de referencia) se usó en diferentes etapas del procedimiento para confirmar la presencia de conjugado. La concentración de proteínas se determinó con UV a 280 nm, y con prueba de proteína de Lowry. Rendimiento cromatográfico: 72%. Rendimiento aislado final: 26%.

Lo anterior es ilustrativo de la presente invención y no debe considerarse como limitante. La invención está definida por las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones por ser incluidas en las mismas.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir polímeros lineales activados y polímeros ramificados activables de los mismos, que comprende: a) hacer reaccionar un polímero activable no peptídico lineal, químicamente bloqueado en un extremo, con un grupo activador de anillo de azol que provee un grupo residual para producir un polímero intermediario de la fórmula general poli-lm; b) hacer reaccionar dicho poli-lm con un agente de alquilacion para formar una sal de imidazolio de la fórmula general poli-lm+(alquilo)X"; y c) hacer reaccionar dicho poli-lm+(alquilo)X" con una molécula enlazadora que tiene por lo menos dos porciones nucleofilicas para producir un derivado de polímero ramificado activable del mismo, en donde: poli es un polímero seleccionado del grupo que consiste de óxidos de poli(alquileno), poli(polioles oxietilados), poli(alcoholes olefínicos), y polímeros de óxido de alquileno y óxido de propileno; lm+ es un ion de imidazolio; y X" es un contraión aniónico seleccionado del grupo que consiste de halogenuros, nitratos, sulfonatos, cloratos, citratos, succinatos, tartratos, lactatos, sulfatos, fosfatos, acetatos, triflatos y boratos.

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende el paso de: d) purificar dicho polímero ramificado activable.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el polímero ramificado activable es purificado por cualquiera de los siguientes: filtración por membrana, cromatografía en columna o una combinación de las mismas. 4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque dicho polímero activable es un óxido de poli(alquileno) que tiene un grupo extremo bloqueado, dicho polímero teniendo un peso molecular de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 100,000 Da. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho óxido de poli(alquileno) es polietilenglicol. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho polietilenglicol es monometoxi-poli(etilenglicol). 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho monometoxi-poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 40,000 Da. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el grupo activador de anillo de azol es N,N-carbonildiimidazol. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caractenzado además porque dicho agente de alquilación es halogenuro de alquilo. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el halogenuro de alquilo es yoduro de alquilo. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el yoduro de alquilo es yoduro de metilo. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha molécula enlazadora se selecciona del grupo que consiste de alquildiaminas disustituidas, triaminas, y aminoácidos. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha molécula enlazadora es un derivado de aminoácido natural o no natural. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha molécula enlazadora se selecciona del grupo que consiste de lisina, diaminoalquilos, dihidroxialquilos y ditioalquilos. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha molécula enlazadora se selecciona del grupo que consiste de lisina, éster de lisina y éster etílico de lisina. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polímero ramificado tiene la estructura general: mPEGa-0-C(0)-NH-(CH2)

4-CH(C(0)OH)-NH-C(O)-O-mPEGb, en donde: mPEGa y mPEGb tienen la estructura: H3CO-(CH2CH20)nCH2CH2-, en donde n puede ser el mismo o diferente en mPEGa y mPEGb y varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,500 para proveer pesos moleculares de aproximadamente 100 a aproximadamente 100,000 Da; y el grupo carboxilo puede ser activado además para permitir el acoplamiento de moléculas y materiales biológicamente activos.