MX2012010670A - Biocombustible y celdas de combustible que producen electricidad y sistemas y metodos relacionados a lo mismo. - Google Patents

Abstract

Se describe una celda de combustible que comprende un electrodo de ánodo, un electrodo de cátodo y un electrodo de referencia conectados electránicamente entre Sí; un primer biocatalizador que comprende un organismo bioprocesador consolidado (por ejemplo, un Celulomonas o Clostridium o cepas relacionadas, tal como Celulomonas uda (C. uda), C. lentocellum, A. cellolulyticus, C. cellobioparum, C. cellobioparum tolerante al alcohol, C. uda tolerante al alcohol, Clostridium cellobioparum CC. cellobioparum) y combinaciones de estos) capaces de fermentar biomasa (por ejemplo, biomasa celulósica o biomasa que contiene glicerina) para producir un subproducto de fermentación, y un segundo biocatalizador que comprende un electricígeno (por ejemplo, Geobacter sulfurreducens) capaz de transferir sustancialmente todos los electrones en el subproducto de fermentación (por ejemplo, hidrógeno, uno o más ácidos orgánicos, o una combinación de los mismos) al electrodo de ánodo para producir electricidad. También se describen sistemas y métodos relacionados a esto con un organismo bioprocesador consolidado.

Description

BIOCOMBUSTIBLE Y CELDAS DE COMBUSTIBLE QUE PRODUCEN ELECTRICIDAD Y SISTEMAS Y METODOS RELACIONADOS A LO MISMO Antecedentes de la Invención La preocupación creciente por el agotamiento inevitable del suministro de petróleo así como por el impacto negativo del uso de combustibles fósiles en el ambiente ha resaltado la necesidad de alternativas de biocombustible a partir de recursos renovables tal como etanol, diesel, butanol e hidrógeno. Idealmente, un biocombustible debe tener un alto contenido energético y debe ser compatible con las infraestructuras actuales de transporte, almacenamiento y distribución, basadas en petróleo.

Los inventores reconocen la necesidad en la técnica por sistemas y métodos que proporcionen conversión mejorada de biomasa hacia biocombustible de una manera efectiva en el costo .

Breve Descripción de la Invención En una modalidad, una celda de combustible que comprende un electrodo de ánodo, un electrodo de cátodo y un electrodo de referencia, conectados electrónicamente entre sí; un primer biocatalizador que comprende un organismo termentador y/o bioprocesador consolidado (por ejemplo un celulomonas, tal como Celulomonas uda (C. uda) , o un Clostridium tal como Clostridium lentocellum (C.

REF: 235493 lentocellum) , Clostridium cellobioparum (C. cellobioparum) , cepas adaptablemente evolucionadas de estos organismos, tal como cepas tolerantes al alcohol, cepas tolerantes a glicerol, cepas tolerantes a calor y combinaciones de las mismas) capaz de procesar y fermentar biomasa (por ejemplo, agua que contiene material celulósico, que contiene poliol tal como que contiene glicerina, etc.) para producir un biocombustible y subproductos de fermentación; y un segundo biocatalizador que comprende un microrganismo productor de electricidad o electricígeno (por ejemplo, Geobacter sulfurreducens, (Gsu) o Gsu tolerante al alcohol (GsuA) ) capaz de transferir sustancialmente todos los electrones en los subproductos de fermentación (por ejemplo, hidrógeno, uno o más ácidos orgánicos, una combinación de esto) al electrodo de ánodo para producir electricidad.

En una modalidad, la biomasa es biomasa celulósica. En una modalidad, la biomasa es un poliol, tal como agua que contiene glicerina .

En una modalidad, la celda de combustible comprende además una membrana de intercambio capaz de transferir electrones y protones; y un dispositivo electrónico conectado al electrodo de ánodo, al electrodo de cátodo y al electrodo de referencia.

En una modalidad, el electrodo de ánodo, el electrodo de cátodo y el electrodo de referencia están localizados en una cámara individual. En una modalidad, el electrodo de ánodo y el electrodo de referencia están localizados en una primera cámara y el electrodo de cátodo está localizado en una segunda cámara.

En una modalidad, el subproducto de fermentación es principalmente hidrógeno. En una modalidad, el organismo bioprocesador consolidado (CBP, por sus siglas en inglés) comprende uno o más Celulomonas, tal como Celulomonas uda (Cuda), o Clostridium o una cepa relacionada a Clostridium, tal como C. lentocellum o Acetivibrio cellulolyticus . En una modalidad, el organismo CBP comprende A. Acellulolyticus, C. cellobioparum (Cce) o una combinación de esto. En una modalidad, el Cce es una cepa de Cce tolerante a glicerol o alcohol (CceA) o una combinación de esto. En una modalidad, la tolerancia al alcohol se desarrolla en cualquiera de los organismos CBP mencionados anteriormente para producir una cepa del organismo CBP tolerante al alcohol para mejorar el desempeño del biocatalizador (por ejemplo, Cuda tolerante al alcohol) .

Las modalidades incluye adicionalmente un sistema que comprende una instalación de producción de biocombustible configurada para producir un biocombustible (por ejemplo, etanol, combustible biodiesel) y una corriente residual de biomasa (por ejemplo, corriente residual de biomasa que contiene material celulósico, corriente residual de biomasa que contiene glicerina) , en donde el biocombustible se produce de la biomasa; un sistema de celda de combustible configurado para producir alcohol y electricidad de la corriente residual de biomasa, el sistema de celda de combustible que comprende un electrodo de ánodo, un electrodo de cátodo y un electrodo de referencia conectados electrónicamente entre sí; un primer biocatalizador que comprende un organismo bioprocesador consolidado capaz de fermentar biomasa para producir un subproducto de fermentación; y un segundo biocatalizador que comprende un electricígeno capaz de transferir sustancialmente todos los electrones en el subproducto de fermentación al electrodo de ánodo para producir electricidad. En una modalidad, el sistema comprende además un sistema de computadora conectado a la celda de combustible para monitorizar y controlar la actividad de la celda de combustible.

En una modalidad, los electrodos se alojan en una cámara individual o en una doble cámara como se describe anteriormente .

Las modalidades incluyen adicionalmente un método que comprende, un paso de fermentación e hidrólisis, consolidados, para convertir biomasa a un biocombustible con un primer organismo en una cámara de ánodo, en donde el reactor de ánodo contiene un electrodo de ánodo y el paso de conversión produce un subproducto de fermentación; transferir electrones en el subproducto al electrodo de ánodo con un segundo organismo para producir una película, y dejar que la película divida catalíticamente los electrones y protones, en donde los electrones fluyen hacia un electrodo de cátodo para producir electricidad y los protones permean una membrana de intercambio de protones que conecta a la cámara de ánodo y la cámara de cámara de cátodo, en donde los electrones y protones reaccionan para producir gas hidrógeno.

En una modalidad, el primero y segundo organismos se adicionan secuencialmente . En una modalidad, el primero y segundo organismos se adicionan de manera sustancialmente simultánea .

En una modalidad, el método comprende además aplicar un potencial al electrodo de ánodo.

En una modalidad, el biocombustible es etanol . En una modalidad, el etanol se produce en menos de 50 horas a un rendimiento mayor de 40% de un rendimiento teórico total . En una modalidad, el biocombustible es combustible de biodiesel .

En una modalidad, la conversión de biomasa biocombustible se cataliza por un organismo bioprocesador consolidado, reduciendo de este modo el costo asociado con la hidrólisis enzimática. En varias modalidades, los productos de fermentación diferentes del biocombustible (es decir, subproductos de fermentación, considerados típicamente que son un subproducto residual) se remueven por un segundo organismo, es decir, un electricígeno, que convierte los subproductos de fermentación en electricidad, produciendo de este modo un producto de valor agregado. Este paso también impide la acidificación del medio y la acumulación de inhibidores de retroalimentación y subproductos tóxicos, mejorando de este modo la eficiencia de la fermentación a hidrólisis .

La biomasa puede ser, en algunas modalidades, una biomasa no alimenticia, tal como rastrojo de maíz o agua que contiene glicerina.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una vista esquemática simplificada de un proceso consolidado para la generación de etanol y electricidad de acuerdo a una modalidad.

La Figura 2 es una vista esquemática simplificada de una ceda de combustible microbiana (MFC, por sus siglas en inglés) de acuerdo a una modalidad.

La Figura 3· muestra la producción de hidrógeno (H2) versus tiempo para rastrojo de maíz (CS, por sus siglas en inglés) con expansión de fibra con amoníaco (AFEX, por sus siglas en inglés) y celobiosa con Acetivibrio cellulolyticus (Ace) o Clostridium lentocellum (Cien) como los organismos bioprocesadores consolidados (CBP) de acuerdo a varias modalidades .

La Figura 4 es una gráfica de barras que muestra las velocidades de crecimiento termentador de Cien Celulomonas uda ATCC 21399 (Cuda) con glucosa, xilosa, o ambos, de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 5 es una gráfica de barras que muestra los rendimientos de etanol y los rendimientos de dióxido de carbono (C02) usando AFEX-CS con Geojbacter sulfurreducens ATCC 51573 (Gsu) y Cuda solo, y en co-cultivo, en varias modalidades .

La Figura 6 muestra corriente versus tiempo para Gsu/acetato y después de la adición de AFEX-CS y Cuda de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 7 es una gráfica de barras que muestra la eficiencia de fermentación de azúcares, acetato, formiato e hidrógeno para Cuda solo, y en co-cultivo co Gsu, con y sin aspersión de gas, de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 8 es una gráfica de barras que muestra el rendimiento de C02 y el rendimiento de etanol de Gsu y un mutante de Gsu (Gsu Hyb) deficiente en la capacitación de hidrógeno en co-cultivos con con Cuda de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 9 muestra la corriente versus tiempo para Gsu/acetato secuencialmente inoculado con Cuda y AFEX-CS a corriente máxima, cero corriente, y durante una corriente en declinación de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 10 muestra corriente versus tiempo para inoculaciones simultáneas de AFEX-CS/Cuda/Gsu con acetato (1 mM) y sin acetato de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 11 es una gráfica de barras que muestra el rendimiento de etanol para Cuda, Cuda/Gsu y Cuda/Gsu/acetato (1 mM) de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 12 es una gráfica de barras que muestra los rendimientos de corriente (como eficiencia de conversión) para las inoculaciones secuenciales y simultáneas de Figuras 10 y 11, respectivamente, de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 13 es una gráfica de barras que muestra el rendimiento de corriente máxima para las inoculaciones secuenciales y simultáneas de Figuras 10 y 11, respectivamente, de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 14 es un diagrama esquemático simplificado que muestra un proceso para producir combustible de biodiesel .

La Figura 15A es una gráfica que muestra el crecimiento de glicerol de Gsu, C. cellobioparum (Cce) , y un co-cultivo que comprende Cce-Gsu, con el paso del tiempo de acuerdo a una modalidad.

La Figura 15B es una gráfica de barras que muestra el producto de fermentación para Cce y un co-cultivo que comprende Cce-Gsu con etanol, lactato, acetato, formiato e hidrógeno de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 16A es una gráfica que muestra la velocidad de crecimiento para Gsu, Cce y Cce-Gsu en glicerol de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 16B es una gráfica que muestra la velocidad de crecimiento para una cepa de Gsu (GsuA) , tolerante al alcohol, una cepa de Cce (CceA) y un co-cultivo que comprende CceA-GsuA en glicerol de acuerdo a varias modalidades .

La Figura 16C es una gráfica que muestra la velocidad de crecimiento para Gsu, GsuA y CceA en etanol de acuerdo a varias modalidades.

La Figura 17 es una gráfica que muestra la corriente versus tiempo para CceA-GsuA cultivado con 10% de glicerol de acuerdo a una modularidad.

Descripción Detallada de la Invención En la siguiente descripción detallada de las modalidades de la invención, se describen modalidades en detalle suficiente para permitir que los expertos en la técnica la practiquen, y se va a entender que se pueden utilizar otras modalidades y que se pueden hacer cambios químicos y de procedimiento sin apartarse del espíritu y alcance de la presente materia. Por lo tanto, la siguiente descripción detallada no se va a tomar en un sentido limitante, y el alcance de las modalidades de la presente invención se define sólo por las reivindicaciones anexas.

En una modalidad, se impulsa una tecnología de bioprocesamiento consolidado en una celda bioelectroquímica (BEC) , tal como una celda de combustible microbiana (MFC) , por un primero y un segundo compañeros microbianos. El primer compañero microbiano puede ser un organismo bioprocesador consolidado (CBP) , como se define en la presente. En una modalidad, el organismo CBP degrada un substrato lignocelulósico y adicionalmente co-fermenta sustancialmente todos los azúcares de fermentación en etanol y subproductos de fermentación. En una modalidad, el sustrato lignocelulósico se pre-trata, tal como se pre-trata químicamente. En una modalidad, el organismo CBP degrada u poliol, tal como agua que contiene glicerina. El segundo compañero microbiano puede ser un electricígeno, como se define en la presente. En una modalidad, Geobacter sulfurreducens (Gsu) sirve como el electricígeno.

La descripción detallada que sigue empieza con una sección de definiciones seguida por una breve vista general de las tecnologías actuales para la producción de alcohol (tanto las basadas en grano como las basadas en material celulósico), una descripción de las modalidades, una sección de ejemplo y una breve conclusión.

De iniciones El término "biomasa" como se usa en la presente, se refiere en general a materia orgánica recolectada o recogida de un recurso biológico renovable como una fuente de energía.

El recurso biológico renovable puede incluir materiales vegetales, materiales animales, y/o materiales producidos biológicamente. El término "biomasa" no se considera que incluya combustibles fósiles, que no son renovables.

Los términos "biomasa vegetal" o "biomasa lignocelulósica" como se usan en la presente, se proponen para referirse habitualmente cualquier materia orgánica derivad de planta (de madera o no de madera) disponible para energía en una base sostenible. La biomasa vegetal puede incluir, pero no se limita a, desperdicios y residuos de cosechas agrícolas tal como rastrojo de maíz, paja de trigo, paja de arroz, bagazo de caña de azúcar y similares. La biomasa vegetal incluye además, pero no se limita a, cultivos energéticos de madera, desperdicios y residuos de madera tal como árboles, incluyendo árboles frutales, tal como árboles que tienen fruta (por ejemplo, árboles de manzana, árboles de naranja, y similares), raleos forestales de madera blanda, desperdicios de corteza, aserrín, corrientes resídales de la industria de papel pulpa, fibra de madera y similares. Adicionalmente , los cultivos de hierbas, tal como varias hierbas de pradera, incluyendo espartina de pradera, pasto aguja, pitilla grande, pitilla pequeño, grama lateral de avena, y similares, tienen potencial para ser producidos a gran escala como fuentes adicionales de biomasa vegetal. Para áreas urbanas, la materia prima potencia de biomasa vegetal incluye desperdicio de patios (por ejemplo, recortes de pasto, hojas, recortes de árbol, arbustos, etc.) y desperdicio de procesamiento vegetal . Se conoce que la biomasa vegetal es la forma más prevalente de carbohidrato disponible en la naturaleza y actualmente el rastrojo de maíz es la fuente más grande de biomasa vegetal fácilmente disponible en los Estados Unidos de América.

El término "biocombustible" como se usa en la presente, se refiere a cualquier combustible sólido, líquido o gaseoso renovable producido de forma biológica, por ejemplo, aquellos derivados de biomasa. La mayoría de los biocombustibles se derivan originalmente de proceso biológicos tal como el proceso de fotosíntesis y por lo tanto se pueden considerar como una fuente de energía química o solar. Otros biocombustibles, tal como polímeros naturales (por ejemplo, quitina o ciertas fuentes de celulosa microbiana), no se sintetizan durante la fotosíntesis, pero sin embargo se pueden considerar un biocombustible debido a que son biodegradables. Los biocombustibles se pueden derivar de biomasas sintetizada durante la fotosíntesis. Estos incluyen, por ejemplo, biocombustibles agrícolas (definidos más adelante), tal como combustible de biodiesel . También los biocombustibles se pueden derivar de otras fuentes, tal como algas, para producir biocombustibles de algas (por ejemplo, combustible de biodiesel) . También, los biocombustibles se pueden derivar de desperdicios municipales (basura o desechos comerciales residenciales y ligeros con la mayoría de los materiales reciclables tal como vidrio y metal removidos) y de recursos forestales (por ejemplo, árboles, corrientes residuales o de subproductos de productos de madera, fibra de madera, e industrias de papel y pulpa) . Los biocombustibles producidos de biomasa no sintetizada durante la biosíntesis también incluyen, pero no se limita a, aquellos derivados de quitina, que es una forma químicamente modificada de celulosa conocida como un polímero de N-acetil-glucosamina . La quitina es un componente significativo del desperdicio producido por la industria de acuacultura debido a que comprende las conchas de los mariscos .

El término "combustible de biodiesel" o "biodiesel" como se usa en la presente, se refiere en general a ésteres de alquilo de ácidos grasos de cadena larga (C12-C22) que pueden ser ya sea ésteres de metilo (FAME, por sus siglas en inglés) o etilo (FAEE, por sus siglas en inglés) de ácido graso. Se puede producir combustible de biodiesel a partir de materias primas de aceites agrícolas y de algas. El combustible de biodiesel es químicamente análogo al diesel petroquímico que aprovisiona de combustible a los motores de compresión y se puede mezclar con petrodiesel para hacer funcionar las máquinas diesel convencionales. El petrodiesel es una mezcla combustible de hidrocarburos de C9 a C23 átomos de carbono de una longitud promedio de carbonos de 16, que tiene aproximadamente 75% de alcanos lineales, ramificados y cíclicos y 25% de hidrocarburos aromáticos. En general, los combustibles de biodiesel y petrodiesel tienen contenido energético comparable, temperatura de congelación comparable, presión de vapor comparable e índice de cetano comparable. El combustible de biodiesel también tiene mayor capacidad de lubricación y emisiones reducidas. La cadena más larga en los FAEE incrementa el índice de cetano y el contenido energético del combustible, en tanto que disminuye su densidad, y los puntos de fluidez y turbidez . Como resultado, se mejoran las propiedades de combustión y de flujo (incluyendo propiedades de flujo en frío, como su eficiencia de combustible. Una vez consumidos, también se reducen al mínimo las emisiones y las densidades de humo.

El término "biocombustible agrícola" , como se usa en la presente, se refiere a un biocombustible derivado de cosechas agrícolas (por ejemplo, granos, tal como maíz), residuos de cosechas, desperdicios de instalaciones de procesamiento de granos (por ejemplo, cáscaras de trigo/avena, partículas finas de maíz/fríjol, materiales fuera de especificación, etc.), desperdicios de instalaciones de producción de ganadería (por ejemplo, abono, animales muertos, etc.), desperdicio de instalaciones de procesamiento de ganadería (por ejemplo, partes indeseables, corrientes de limpieza, materiales contaminados, etc.), desperdicios de instalaciones de procesamiento de alimento por ejemplo, corrientes residuales separadas tal como cebo, grasa, callos, conchas, residuos de procesos intermedios, corrientes de enjuague/limpieza, etc.), subproductos de instalaciones agrícolas de valor agregado (por ejemplo, grano húmedo del destilador (DWG, por sus siglas en inglés) y jarabe de instalaciones de producción de etanol, etc.), y similares. Los ejemplos de industrias de ganadería incluyen, pero no se limita a, instalaciones de carnes rojas, de carne de cerdo, pavo, de pollo, de huevo y de leche. Los ejemplos de cosechas agrícolas incluyen, pero o se limitan a, cualquier tipo de planta no maderera (por ejemplo, algodón) , granos tal como algodón, trigo, soyas, rogo, cebada, avena, centeno y similares, hierbas (por ejemplo, cacahuate) , cultivos herbáceos de corta rotación tal como pasto aguja, alfalfa y demás .

El término "agua que contiene glicerina", como se usa en la presente, se refiere a un líquido, tal como agua que contiene cualquier cantidad de glicerina (es decir, glicerol, un poliol) . El líquido puede contener otros componentes, tal como sólidos, alcoholes, aceites, sales y/o otros componentes. El agua que contiene glicerina incluye agua residual con glicerina producida como un producto residual de la producción de combustible de biodiesel o de biorefinerías de etanol . Aunque el agua residual con glicerina puede referirse ya sea a "agua residual con glicerina cruda" (es decir, "agua residual con glicerina no refinada" que es agua residual con glicerina en su estado inicial después de la separación del producto de combustible de biodiesel) o "agua residual de glicerina refinada" después del tratamiento (típicamente en la preparación para la venta) que incrementa el volumen de glicerina a al menos aproximadamente 80% en volumen, los proceso descritos en la presente son útiles con agua con glicerina cruda, eliminando de este modo la necesidad de refinar el agua residual con glicerina de una manera convencional.

El término "biodegradable" , como se usa en la presente, se refiere a un substrato capaz de ser descompuesto, es decir, químicamente descompuesto, por la acción de uno o más agentes biológicos, tal como bacterias.

El término "electricígeno" como se usa en la presente, se refiere a un biocatalizador que es electroquímicamente activo o un microrganismo generador de electricidad, es decir, un organismo capaz de transferir electrones a un electrodo con o sin mediadores.

El término "microrganismo bioprocesador" como se usa en la presente, se refiere a un microrganismo capaz de degradar la biomasa, tal como biomasa lignocelulósica .

El término "organismo bioprocesador consolidado (CBP)" como se usa en la presente se refiere a un biocatalizador que también es capaz de fermentar la biomasa degradada en uno o más biocombustibles , es decir, capaz de realizar una fermentación la hidrólisis en un solo paso.

El término "tolerante al alcohol" como se usa en la presente, se refiere a un mutante de una cepa microbiana evolucionada de forma adaptable o manejada de forma genética para tener tolerancia incrementada al alcohol en comparación con el microbio nativo.

El término "tolerante a glicerol" como se usa en la presente, se refiere a un mutante de una cepa microbiana evolutivamente adaptada o manejada por ingeniería genética para tener una tolerancia incrementada a glicerol en comparación con el microbio nativo.

El término "tolerante a calor" como se usa en la presente, se refiere a un mutante de una cepa microbiana evolutivamente adaptada o manejada por ingeniería genética para tener una tolerancia incrementada a calor en comparación con el microbio nativo.

El término "evolución adaptable" como se usa en la presente, se refiere al proceso que mejora la adaptabilidad e un organismo a una condición ambiental particular bajo presión selectiva apropiada.

El término "etanologénesis" , como se usa en la presente, se refiere al proceso metabólico que da por resultado la producción de etanol.

Los términos "celda de combustible" o "celda electroquímica", como se usa en la presente, se refieren a un dispositivo usado para la generación de electricidad de una reacción química o microbiana. La reacción puede proseguir de forma natural o se puede facilitar con entrada eléctrica de, por ejemplo, un potenciostato . Una celda de combustible está comprendida de electrodos de ánodo y cátodo conectados a través de un material conductor. Los electrodos pueden estar alojados en una cámara individual o en una doble cámara y pueden estar separados por una membrana de intercambio catiónico o protónico. Un catalizador químico o biológico adicionado al ánodo impulsa la generación de electricidad.

El término "celda de combustible microbiana" o "celta electroquímica microbiana" como se usa en la presente, se refiere a una celda de combustible accionada por microrganismos electricigénicos ya sea en un cultivo sustancialmente puro (es decir, con al menos una pureza de 90%) de al menos una especie individual o un cultivo de especies mezcladas, es decir, un co-cultivo, que puede incluir el electricígeno a cualquier concentración y un número de otras especies o como parte de un consorcio microbiano, es decir, un grupo de diferentes especies de microrganismos que pueden tener diferentes capacidades metabólicas, pero que actúan conjuntamente como una comunidad, tal como un consorcio microbiano natural (por ejemplo, biopelículas) o definido en laboratorio.

El término "celda bioelectroquímica" o "BEC" como se usa en la presente, se refiere a una MFC capaz de introducir voltaje adicional a las salidas de producto de control del sistema e incrementar su desempeño.

El término "bioelectricidad" como se usa en la presente, se refiere a electricidad producida biológicamente, por ejemplo, de materiales biológicos tal como biocombustibles y biomasa.

El término "paso de pretratamiento" como se usa en la presente, se refiere a cualquier paso propuesto para alterar la biomasa nativa de modo que se pueda convertir de manera más eficiente y económica a compuestos químicos intermedios reactivos. Tal como azúcares, ácidos orgánicos, etc., que entonces se pueden procesar adicionalmente a una variedad de productos de valor agregado tal como un producto químico de valor agregado, tal como etanol . El pretratamiento puede reducir el grado de cristalinidad de un substrato polimérico, reducir la interferencia de lignina con la conversión de biomasa y prehidrolizar algo de los carbohidratos estructurales, incrementado de este modo su capacidad de digestión enzimática y acelerando la degradación de la biomasa a productos útiles. Los métodos de pretratamiento pueden utilizar ácidos de concentraciones variables (incluyendo ácidos sulfúricos, ácidos clorhídricos, ácidos orgánicos, etc.) y/u otros componentes tal como amoníaco, amonio, cal, y similares. Los métodos de pretratamiento pueden utilizar de manera adicional o alternativamente tratamientos hidrotérmicos que incluyen agua, calor, vapor o vapor presurizado. El pre-tratamiento puede presentarse o se puede desplegar en varios tipos de recipientes, receptores, tubos, celdas de flujo de paso y similares. La mayoría de los métodos de pre-tratamiento provocarán la solubilización y/o desestabilización parcial o completa de lignina y/o hidrólisis de hemicelulosa a azúcares de pentosa.

El término "contenido de humedad" como se usa en la presente, se refiere al por ciento de humedad de la biomasa. El contenido de humedad se calcula como gramos de agua por gramo de biomasa húmeda (materia seca de biomasa más agua) 100% .

El término pretratamiento "con Explosión de Fibras con Amoníaco" o "con Expansión de Fibras con Amoníaco" (más adelante en la presente "AFEX" , por sus siglas en inglés)" como se usa en la presente, se refiere a un proceso para pretratar la biomasa con amoníaco para solubilizar la lignina y re-depositarla de entre las paredes de las células vegetales a la superficie de la biomasa. Un pretratamiento AFEX rompe la matriz lignocelulósica , modificando de este modo la estructura de la lignina, hidrolizando parcialmente la hemicelulosa, incrementando la capacidad de acceso de la celulosa y la hemicelulosa restante a degradación enzimática subsiguiente. La lignina es el impedimento primario a la hidrólisis enzimática de la biomasa nativa, y la remoción o transformación de lignina es un supuesto mecanismo de varias de las tecnologías principales de pretratamiento, que incluyen AFEX. Sin embargo, en contraste a muchos otros pretratamientos , las condiciones no ácidas y las menores temperaturas del proceso AFEX impiden que la lignina se convierta en furfural, hidroximetil -furfural , y ácidos orgánicos que pueden afectar de forma negativa la actividad microbiana. El proceso expande e hincha adicionalmente las fibras de celulosa y rompe adicionalmente la hemicelulosa amorfa en la biomasa lignocelulósica . Estos cambios estructurales abren la estructura de la pared de las células vegetales permitiendo una conversión más eficiente y completa de la biomasa lignocelulósica a productos de valor agregado en tanto que conserva el valor nutriente y la composición del material. Ver, por ejemplo, los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,106,888, 7,187,176, 5,037,663, y 4,600,590, todas las cuales se incorporan de este modo como referencia en su totalidad como si se expusieran completamente en la presente.

Alcohol Basado en Grano Los métodos para producir varios tipos de alcohol a partir de grano siguen en general procedimientos similares, dependiendo de si el proceso se opere en húmedo o en seco. Un alcohol de gran interés hoy es el etanol . Se puede producir etanol a partir virtualmente de cualquier tipo de grano, pero se produce más frecuentemente de maíz. El maíz contiene altos niveles de almidones que se puede descomponer en los azúcares de glucosa necesarios para la fermentación tradicional.

El grano de maíz se puede pretratar químicamente, como se conoce en la técnica, para incrementar su capacidad de digestión y enzimática. Posteriormente, el grano de maíz pretratado se hidroliza en azúcares solubles por mezclas de enzimas microbianas. Los azúcares solubles resultantes solo se fermenta parcialmente por cepas genéticamente manejadas de bacterias u hongos. También, la fermentación se limita por la acidificación del medio, debido en parte a, la producción de ácidos orgánicos durante el metabolismo termentador microbiano. También, la fermentación se limita por la inhibición de retroalimentación en el metabolismo microbiano de los subproductos de fermentación tal como gas hidrógeno ácidos orgánicos.

El etanol resultante entonces se destila y evapora para separación de los productos restantes de fermentación. El material residual sólido de biomasa se filtra y lava para separar el desperdicio de lignina del desperdicio restante de la biomasa. Los esfuerzos de optimización se han enfocado en microbios genéticamente manejados para degradar y fermentar el substrato de la biomasa, la mejora de celulasa por evolución directa, y/o el manejo de cepas industriales con enzimas de celulasa y hemicelulasa más eficientes y estables, con solo éxito moderado. Sin embargo, la producción de alcoholes (por ejemplo, etanol) usando grano gradualmente se está remplazando con otras soluciones más eficientes y sostenibles . De importancia, la producción de etanol como se describe anteriormente, también genera un subproducto de glicerol a concentraciones de hasta aproximadamente 10% (p/p) del azúcar total consumido.

Conversión de Biomasa al alcohol Casi todas las formas de biomasa lignocelulósica, es decir, biomasa vegetal, tal como monocotiledóneas , comprenden tres fracciones químicas primarias: hemicelulosa, celulosa, y lignina. La hemicelulosa es un polímero de cadenas cortas, altamente ramificadas de principalmente azúcares de pentosa de cinco carbonos (xilosa y arabinosa) , y en un menor grado azúcares de hexosa de seis carbonos (galactosa, glucosa y mannosa) . Las dicotiledóneas, por otra parte, tienen un alto contenido de pectato y/o pectina, que es un polímero de ácido glucurónico alfa-enlazado. El pectato puede estar "decorado" con azúcares de mannosa o ramnosa, también) . Estos azúcares están altamente sustituidos con ácido acético.

Debido a su estructura ramificada, la hemicelulosa es amorfa y es relativamente fácil de hidrolizar (descomponer o escindir) a sus azúcares constituyentes individuales por tratamiento enzimático o con ácido diluido. La celulosa es un polímero lineal de azúcares de glucosa, al igual que el almidón, que es el sustrato primario de grano de maíz las plantas de etanol de molienda en húmedo y grano seco. Sin embargo, diferente del almidón, los azúcares de glucosa de la celulosa están ensartados conjuntamente por enlaces ß-glicosídicos que permiten a la celulosa formar cadenas lineales cercanamente asociadas. Debido al alto grado de unión de hidrógeno que puede presentarse entre cadenas de celulosa, la celulosa forma una estructura cristalina rígida que es altamente estable y mucho más resistente a la hidrólisis por ataque químico o enzimático de los polímeros de almidón o hemicelulosa. La lignina, que es un polímero de moléculas fenólicas, proporciona integridad estructural a las plantas, y permanece como material residual después de que los azúcares en la biomasa vegetal se han fermentado a etanol. La lignina es un subproducto de la producción de alcohol y se considera un combustible sólido de calidad superior debido a su cero contenido de azufre y valor calorífico, que está cerca de aquel del carbón sub-bituminoso .

Los intervalos típicos de concentraciones de hemicelulosa, celulosa y lignina en plantas se muestran en htt : //wwwl . eere . energy.gov/biomass/feedstock_databeses . html Típicamente, la celulosa constituye 30 a 50% de los residuos procedentes de fuentes agrícolas, municipales y forestales. La celulosa es más difícil de hidrolizar que la hemicelulosa, pero una vez hidrolizada se convierte más eficientemente en etanol con fermentación de glucosa que la hemicelulosa. En contraste, los polímeros de azúcar de la hemicelulosa son relativamente fáciles de hidrolizar, pero no se convierten tan eficientemente como la celulosa usando cepas normales de fermentación (que producen etanol a partir de glucosa) . Aunque los azúcares de hemicelulosa representan la fruta de las "ramas más bajas" para la conversión a etanol, el contenido sustancialmente mayor de celulosa representa el mayor potencial para aumentar al máximo los rendimientos de alcohol, como etanol, en una base por tonelada de biomasa vegetal .

Los métodos convencionales usados para convertir biomasa al alcohol incluyen procesos que emplean un pretratamiento de hidrólisis con ácido concentrado, un pretratamiento de hidrólisis con ácido de dos etapas así como procesos que emplean cualquier pretratamiento convencional conocido, tal como pretratamientos hidrotérmicos o químicos, seguido por una hidrólisis enzimática (es decir, hidrólisis catalizada con enzimas) o hidrólisis enzimática y sacarificación, simultáneas. Estos métodos de pretratamiento pueden incluir, pero no se limitan a, hidrólisis con ácido diluido, métodos basados en agua caliente y alta presión, es decir, tratamientos hidrotérmicos , tal como explosión de vapor y extracción acuosa con agua caliente, sistemas de reactor (por ejemplo, por lotes, de flujo continuo, de contraflujo, flujo de paso, y similares) , AFEX, percolación reciclada con amoníaco (ARP) , tratamiento con cal y un tratamiento a base de pH. Sin embargo, el pretratamiento-hidrólisis de la biomasa vegetal frecuentemente puede dar por resultado la creación y liberación de otros productos químicos que inhiben la fermentación microbiana. Estos inhibidores (es decir, furfural) son en su mayor parte el producto de la degradación de azúcares, y se necesitan métodos para remover estos inhibidores o para reducir su formación o cepas resistentes a los inhibidores.

Varios de estos métodos generan hidrólisis casi completa de la fracción de hemicelulosa para recuperar eficientemente altos rendimientos de los azúcares solubles de pentosa. Sin embargo, la solubilización química de hemicelulosa también produce productos tóxicos, tal como derivados de furano, que pueden inhibir las reacciones microbianos, corriente abajo (por ejemplo, fermentación) . Sin embargo, la hidrólisis de hemicelulosa facilita la remoción física de la hemicelulosa y lignina circundantes, exponiendo de este modo a la celulosa a procesamiento posterior. Sin embargo, la mayoría, si que no es que todos los planteamientos de pretratamiento no hidrolizan significativamente la fracción de celulosa de la biomasa.

La conversión de biomasa al alcohol también pose consideraciones únicas de fermentación. Las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae usadas en las plantas convencionales de etanol a partir de maíz, por ejemplo, pueden fermentar glucosa, pero no pueden fermentar azúcares de pentosa tal como xilosa. Adicionalmente , no hay actualmente un microrganismo que se presente de forma natural que puede convertir eficientemente todos los azúcares mayores presentes en la biomasa vegetal hacia etanol. Por lo tanto, las levaduras o bacterias genéticamente manejadas que pueden fermentar, en teoría, tanto glucosa como xilosa al alcohol, se están usando para procesos de biomasa al alcohol . Sin embargo, en la práctica, la co- fermentación es ineficiente y la fermentación de glucosa aun es la reacción principal para la producción de etanol. Adicionalmente, las cepas recombinantes , genéticamente mejoradas, de microrganismos termentadores, incluyendo cepas recombinantes de levadura, bacterias y hongos, así como ácidos nucleicos transgénicos (ADN, ARN) derivados de este componente pueden plantear problemas de permisos y eliminación ambiental.

Producción de combustible de biodiesel Típicamente, el combustible de biodiesel (más adelante en la presente "biodiesel") se produce mediante transesterificación de triglicéridos usando un alcohol y catalizador. En la presencia del catalizador, el alcohol reacciona con los triglicéridos del aceite y remueve subsiguientemente un éster metílico a la vez para generar glicerol y ésteres de ácidos grasos de biodiesel, como se muestra en la reacción a continuación: Los ésteres de ácido graso de biodiesel tienen longitudes y enlaces variables que corresponden a las cadenas laterales de los triglicéridos en el aceite de inicio, con el más frecuente que es palmitato (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:l), ácido linoleico (C18:2), y ácido linolénico (C18:3) en diferentes proporciones.

Aunque se pueden usar catalizadores ácidos y alcalinos para la reacción de transesterificación, muchos productores comerciales de biodiesel usan catalizadores alcalinos, que son menos corrosivos y tienen una mayor velocidad de reacción (aproximadamente 4,000 veces). Los catalizadores alcalinos baratos tal como hidróxido de sodio y potasio se usan comúnmente a concentraciones entre aproximadamente 0.5% y aproximadamente 1% para lograr rendimientos de biodiesel que varían de aproximadamente 94 a aproximadamente 99%.

El metanol y el etanol son los alcoholes más comunes usados en la reacción de transesterificación y producen, respectivamente, esteres metílicos de ácido graso (FAME) y ésteres etílicos de ácido graso (FAEE) . En comparación al metanol, el etanol es más biodegradable y tiene una menor toxicidad. El etanol tiene adicionalmente una mayor solubilidad en comparación al metanol, permitiendo mayores temperaturas de reacción e incrementa la velocidad de reacción.

Como se muestra en la Figura 14, la producción de biodiesel comprende no sólo transesterificación, sino también separación del biodiesel crudo a partir de residuos de glicerina, y refinación de biodiesel. En un proceso de producción de biodiesel de ejemplo, la transesterificación puede proseguir en un reactor durante aproximadamente 1-2.5 horas a aproximadamente 60 a aproximadamente 80 °C para generar una mezcla de aproximadamente 10:90 de glicerina cruda (es decir, una mezcla de impurezas de glicerol, alcohol, catalizador y aceite) y biodiesel crudo. La mayor densidad de la glicerina cruda permite una separación de fases en un tanque de asentamiento o centrífuga. Se puede adicionar agua a la mezcla para mejorar la separación de las fases, generando de este modo una corriente de glicerina cruda de aproximadamente un 40-50% de glicerol, conjuntamente con algo de alcohol, aceites, la mayoría del catalizador, y jabón.

El biodiesel crudo también contiene impurezas (principalmente jabón y catalizador, conjuntamente con alcohol), y típicamente se refina de forma adicional. El alcohol, por ejemplo, se puede remover con agua, produciendo de este modo biodiesel de alta calidad. Posteriormente, el biodiesel húmedo lavado se deja secar, tal como un proceso de destilación al vacío, en tanto que el agua residual, que contiene alcohol, sales y glicerol, se remueve por medios adecuados, tal como con centrifugación, y se adiciona al desperdicio de glicerina cruda. Este paso diluye adicionalmente la concentración de glicerol en el agua residual de glicerina a aproximadamente 10-20% con un contenido promedio de alcohol de 5%.

El agua residual de glicerina es el producto de residual principal de la industria del biodiesel y puede presentar preocupaciones ambientales, puesto que en general no es efectivo en el costo refinar y concentrar el glicerol en el agua residual para vender a las refinerías de glicerol. Como la Figura 14 lo muestra, antes de vender el agua residual de glicerina, en general se emprenden pasos costosos de pretratamiento y concentración. Como tal, el agua residual de glicerina sin refinar f ecuentemente se elimina como un desperdicio peligroso (por ejemplo, que contiene concentraciones peligrosas de glicerol y metanol) , que puede ser costoso para el productor de biodiesel .

Como se muestra en la Figura 14, el agua residual de glicerina en general se refina antes de la venta, para remover aceites, alcohol y sales antes de que se concentre a una pureza de aproximadamente 80% de glicerol, una concentración en general reconocida en la industria como una norma mínima para la pureza de la materia prima de glicerol. Este es un proceso costoso que comprende el pretratamiento ácido para remover aceites y para neutralizar y precipitar el catalizador alcalino y para convertir los jabones en sales solubles en agua y ácidos grasos libres. Aun más costoso es la eliminación de las pocas concentraciones de alcohol de la solución de glicerina y su concentración por evaporación instantánea o destilación.

Descripción de las modalidades En la presente se describe un nuevo sistema para producir alcohol y generar electricidad en un proceso combinado o consolidado. En una modalidad, el proceso comprende proporcionar biomasa, tal como biomasa que contiene material lignocelulósico (tal como, de una instalación de producción de etanol) o una biomasa que contiene poliol, tal como agua que contiene glicerina, tal como agua residual de glicerina (por ejemplo, agua residual de glicerina cruda o parcialmente refinada de un instalación de producción de biodiesel) .

En la modalidad mostrada en la Figura 1, se proporciona un proceso 100 en el cual se somete la biomasa 102 que contiene material lignocelulósico a uno o más pasos de pretratamiento para separar la lignina 106 de la celulosa/hemicelulosa insoluble (más adelante "insoluble") 108.

En la modalidad mostrada en la Figura 1, los insolubles 108 se proporcionan a una celda de combustible microbiana (MFC) 118 donde se degradan, es decir, se hidrolizan y fermentan en un proceso de un paso usando un microbio bioprocesador consolidado (CBP) 110 para producir etanol 112 y subproductos de fermentación tal como gas hidrógeno (H2) 114 y ácidos orgánicos 116. El gas hidrógeno 114 y/o ácidos orgánicos 116 proporcionan una fuente de electrones 124 para soportar el crecimiento de un electricígeno 120, que gana energía al transferir electrones 124 a un electrodo 126, produciendo de este modo electricidad 124 y una corriente residual 122 que contiene dióxido de carbono (C02) .

Diferentes de los procesos convencionales de etanol con material celulósico que requieren pasos separados de hidrólisis y fermentación, las modalidades descritas en la presente proporcionan el uso de un organismo CBP 110 que no es solo catalizar la hidrólisis enzimática, sino también puede servir como un biocatalizador alcohologénico (alcohologénesis) . En una modalidad, el organismo CBP 110 sirve como un biocatalizador alcohologénico (por ejemplo, un biocatalizador etanologénico) . Como tales, las modalidades descritas en la presente no sean dependientes de un paso previo de solubilización de biomasa o del crecimiento previo del organismo CBP 110 y electricígeno 120 en recipientes separados antes del inicio del proceso de fermentación. Esto es en contraste con los métodos convencionales en los cuales se cultiva el organismo electricigénico como un cultivo puro en un electrodo de una primera celda de combustible para producir una película electroquímicamente activa, que entonces se transfiere a una segunda celda de combustible inoculada con un microbio etanologénico y complementada con un material hidrolizado de biomasa. Estos pasos no solo adicionan complejidad al proceso, incrementan los costos. Adicionalmente , el uso de microrganismos etanologénicos en métodos convencionales que producen subproductos de fermentación diferentes de aquellos en los que el electricígeno puede convertir en electricidad da por resultado producción reducida de electricidad e inhibición de retroalimentación de la fermentación por el organismo CBP 110. En las modalidades descritas en la presente, tanto el organismo CBP 110 como el electricígeno 120 se pueden inocular secuencialmente en el mismo reactor en tanto que se mantiene la producción neta de etanol y electricidad (ver ejemplo 3) .

Se puede usar cualquier biomasa adecuada, como se define en la presente. En una modalidad, la biomasa es una biomasa no alimenticia, tal como desperdicio agrícola. En una modalidad, se usa rastrojo de maíz. Los pasos adicionales conocidos en la técnica también se pueden usar para preparar la biomasa para el uso en el nuevo proceso, que incluye, pero no se limitan a, molienda.

El paso de pretratamiento 104 puede tomar la forma de cualquier paso conocido de pretratamiento, incluyendo pretratamiento químico. También pueden presentarse calentamientos ó cocción con agua adicionada, como se conoce en la técnica. En una modalidad particular, se usa rastrojo de maíz de AFEX como se define en la presente. Se puede usar cualquier celda de combustible 118 que tenga una configuración y tamaño adecuados en las modalidades descritas en la presente. En una modalidad, la celda de combustible es una celda de combustible microbiana (MFC) , tal el tipo descrito en Microbial Fuel Cells-Challenges and Applications, Bruce E. Logan y John M. Regan, Environ. Sci. TechnoL, 2006, 40(17), páginas 5172-5180, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad, los electrodos de ánodo y cátodo se alojan en cámaras separadas. En una modalidad, los electrodos de ánodo y cátodo se separan por una membrana de intercambio catiónico o protónico. También puede variar el espaciado entre el electrodo de ánodo y el electrodo de cátodo, como se entiende por los expertos en la técnica.

En una modalidad, los electrodos de ánodo y de cátodo de la celda de combustible están alojados en la misma cámara. Ver, por ejemplo, Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms . Marsili E, Rollefson JB, Barón DB, Hozalski RM, Bond DR. Appl Environ Microbiol . Diciembre del 2008: 74 (23) : 7329-37. Epub 10 de Octubre del 2008, que de este modo se incorpora en la presente en su totalidad.

En una modalidad, se usa un electrodo de cátodo, externo o que traspira aire. En esta modalidad, Improved fuel cell and electrode designs for producing electricity from microbial degradation, Park DH, Zeikus JG. Biotechnol Bioeng. Febrero del 2003 5 : 81 (3 ): 348-55 y Electrically enhanced ethanol fermentation by Clostridium thermocellum and Saccharomyces cerevisiae . Shin HS, Zeikus JG, Jain MK, Appl Microbiol Biotechnol. Marzo del 2002: 58 (4 ) : 476 - 81 , ambos de los cuales se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades.

En una modalidad, los materiales de electrodo se seleccionan de cualquier material conductor conocido, incluyendo, pero no limitado a, carbono, metales preciosos o no preciosos, compuestos metal -orgánicos, acero inoxidable, polímeros conductores y similares, incluyendo adicionalmente combinaciones de estos. En una modalidad, el material del electrodo de cátodo y el material del electrodo de ánodo son diferentes materiales. En una modalidad, cada electrodo puede tener cualquier configuración adecuada como se conoce por los expertos en la técnica, con cada electrodo que tiene la misma o diferente configuración, como se desee. En una modalidad, cada electrodo tiene una configuración seleccionada de una o más hojas (elaboradas de cualquier material conductor) , o uno o más de varios tipos de tela, papel, vidrio, cepillo y varillas, y similares, o cualquier combinación de los mismos. En la Figura 2 se muestran detalles adicionales de una modalidad de una MFC.

En una modalidad, el organismo CBP 110 no solo hidroliza los sustratos lignocelulósicos y produce etanol a altos rendimientos (más de 40% de rendimiento teórico máximo) , sino que además produce principalmente subproductos de fermentación (incluyendo, por ejemplo, principalmente ácidos orgánicos y/o principalmente gas hidrógeno y/o principalmente otros subproductos de fermentación conocidos en la técnica) , que se usan como donadores de electrones para crecimiento de, y generación de electricidad por un electricígeno . En una modalidad, el organismo CBP 110 es un microbio en los grupos de Clostridium o Celulomonas. En una modalidad, se usa Celulomonas uda ATCC 21399 (más adelante en la presente "Cuda" o "C.uda"), que produce principalmente acetato y formiato además de etanol . El acetato y formiato se convierten en electricidad por el electricígeno Geobacter sulfurreducens (más adelante en la presente "Gsu" o "G. sulfurreducens") . Este proceso remueve ácidos orgánicos del medio de crecimiento, e impide la acidificación del medio y la inhibición de retroalimentación del metabolismo termentador de C. Uda . Como resultado, se estimula la producción de etanol y el crecimiento de C.uda en el co-cultivo. Adicionalmente, debido a que se convierten en electricidad sustancialmente todos los subproductos de fermentación, sustancialmente todos los electrones potencialmente disponibles para generación de electricidad se recuperan y el etanol es el único producto de fermentación que permanece en el medio líquido.

Esto es en contraste a ciertos microbios conocidos, tal como Clostridium cellulolyticum, que no hidrolizan o fermentan de forma suficiente, y también producen una amplia variedad de subproductos de fermentación, incluyendo aquellos que no se pueden convertir en electricidad por el electricígeno. Esta plataforma conduce a pérdidas de electrones y acumulación de subproductos de fermentación de "desperdicios" , en lugar de la producción neta de etanol y electricidad, como se desea. Como tales, las modalidades descritas en la presente no incluyen el uso de Clostridium cellulolyticum como el organismo CBP 110.

Se puede adicionar cualquier electricígeno adecuado 120 a la cámara de ánodo 202 para activar la generación de electricidad. En una modalidad, el electricígeno 120 produce filamentos proteicos conductores llamados "nanoalambres pilus" que permiten el apilamiento sustancial de celdas en el electrodo y el flujo eficiente de electrones a través de la película electricigénica y al electrodo. Esto incluye, pero no se limita a, miembros de la familia Geoiiacteraceae, tal como G. sulfurreducens.

En una modalidad, una reacción química catódica, tal como una reacción de oxidación con oxígeno o cianuro férrico se presenta en la cámara cátodo. Esta modalidad se puede usar en aplicaciones donde no es factible ni eficiente en el costo la introducción electrónica desde un potenciostato .

Se esperan rendimientos de etanol mayores de 30% del producto total de fermentación. En una modalidad, el rendimiento puede ser mayor de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mayor, incluyendo cualquier intervalo entre estos.

Esto es en contraste a los intentos previos por otros para producir tanto etanol como electricidad (tal como con C. cellulolyticum y celulosa parcialmente amorfa, por ejemplo, celulosa/hemicelulosa, en lugar de los insolubles 108) , en los cuales se obtienen rendimientos de etanol menores de 40%, debido a la conversión relativamente ineficiente de los subproductos de fermentación en electricidad. Estos métodos requieren adicionalmente que el electricígeno se cultive previamente en una celda de combustible, microbiana, separada. Sin embargo, en una modalidad alternativa, el electricígeno (por ejemplo, 120) y/o el organismo CBP (por ejemplo, 110) , se pueden cultivar opcionalmente en una celda de combustible microbiana separada aunque nuevamente, esto no se requiere.

Los nuevos métodos y sistemas descritos en la presente son eficientes, completando el proceso de fermentación e hidrólisis de un paso para producir un rendimiento máximo de etanol con un organismo CBP deseado (por ejemplo, 110) en un período de tiempo de menos de aproximadamente 50 horas. En general, el período de tiempo es menos que los métodos convencionales para alcanzar un rendimiento máximo de etanol a través de pasos separados de hidrólisis y de fermentación, que puede tomar más de 100 horas, tal como hasta 120 horas.

En una modalidad, se producen rendimientos de etanol de al menos 80% del rendimiento máximo teórico después de menos de 50 horas, tal como de aproximadamente 40 a 46 horas, aproximadamente 43 horas y se produce 80% de rendimiento máximo después de menos de 50 horas, tal como al menos aproximadamente 45 horas.

En la modalidad mostrada en la Figura 2, se proporciona una MFC 118, que es una celda electroquímica que comprende dos cámaras (es decir, la cámara de ánodo 204 y la cámara de cátodo 205) en una configuración "H" . Un electrodo de ánodo 206 se localiza en la cámara de ánodo 204 y un electrodo de cátodo 207 se localiza en la cámara cátodo 205. Una membrana de intercambio catiónico o protónico 210, junto con empaques 211 y bridas de vidrio 212, crean un "puente de vidrio" que separa las cámaras de ánodo y de cátodo, 204 y 208, respectivamente.

En esta modalidad, cada cámara, 204 y 205 contiene una cantidad de medio de crecimiento 208, que, en una modalidad, es sustancialmente idéntica. El medio de crecimiento 208 puede ser cualquier medio que soporta el crecimiento de los biocatalizadores 224, y no necesita ser necesariamente el mismo en cada cámara, 204 y 205. En una modalidad, el medio de crecimiento 208 es agua fresca (F ) (Ver Lovley, D. R. y E. J. P. Phillips. 1988. Novel mode of icrobial energy metabolism: organic carbón oxidation coupled to dissi ilatory reduction of iron or manganeee . Appl Environ Microbiol. 54 (6 ) : 1472 - 1480 ) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad, el medio de crecimiento 208 contiene adicionalmente minerales, vitaminas, o combinaciones de los mismos. En una modalidad, se usa el "medio de Regan" como el medio de crecimiento 208. (Ver Ren, Z., T. E. Ward y J. M. Regan. 2007. Electricity production from cellulose in a microbial fuel cell using a defined binary culture. Environ. Sci. Technol . 41:4781-6, más adelante "Regan") que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad, se usa el "medio de Daniel Bond" como el medio de crecimiento 208. (Ver Marsili, E., Rollefson, J. B., et al., 2008, Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms . Appl Environ Microbiol, Diciembre: 74(23) :7329-3), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad, el medio de crecimiento 208 está presente en la cámara de ánodo 204 y la cámara de cátodo 205 en cantidades sustanciales de modo que su sumergen completamente los electrodos.

El electrodo de ánodo 206 y el electrodo de cátodo 207 se conectan electrónicamente mediante alambres conductores de ánodo y alambres conductores de cátodo, 213A y 213B, respectivamente, ambos de los cuales, a su vez, se conectan a un potenciostato 214. La cámara de ánodo 204 aloja adicionalmente un electrodo de referencia 216, que también se conecta al potenciostato 214 con alambres conductores 213C, como se muestra en la Figura 2.

La cámara de ánodo 204 y la cámara de cátodo 205 se sella con un tapón de ánodo 218A y un tapón de cátodo 218B, respectivamente. Se proporciona un orificio de salida de ánodo 220A en el tapón ánodo 218A y se proporciona un orificio de salida de cátodo 220B en el tapón de cátodo 220B. La cámara de ánodo 204 está equipada adicionalmente con un orificio de rociado de ánodo 222A en el cual se puede insertar una primera aguja 223A. De manera similar, la cámara de cátodo 205 está equipada con un orificio de rociado de cátodo 222B en el cual se puede insertar una segunda aguja 223B. Los orificios de rociado, 222A y 222B, incluyen adicionalmente tapones de tamaño adecuado, como se conoce en la técnica.

En el uso, el potenciostato 214 pone en equilibrio el electrodo de ánodo 206 a un potencial definido, permitiendo de este modo un sistema limitado de cátodo para resultados controlados y reproducibles . En una modalidad, el proceso empieza al adicionar una cantidad de insolubles de biomasa 108 (por ejemplo, rastrojo de maíz pretratado) y una cantidad de cada biocatalizador 224 (es decir, uno o más electricígenos 120 y uno o más organismos CBP 110, como se muestran en la Figura 1) a la cámara de ánodo 204 para iniciar el procesamiento de biomasa.

Los insolubles 108 puede tener cualquier contenido adecuado de humedad. En una modalidad, el contenido de humedad es al menos aproximadamente 15%. Los insolubles 108 se pueden secar antes del uso, si, por ejemplo, que han almacenado durante un período de tiempo, aunque este paso incrementa el costo del proceso. Igualmente, ambos biocatalizadores 224 pueden tomar cualquier forma, incluyendo un sólido o líquido. En una modalidad, se adiciona al menos uno de los biocatalizadores 224 como un gránulo de celda, húmedo, sustancialmente concentrado. En una modalidad, se adiciona como polvo seco (liofilizado) .

Los biocatalizadores 224 se puede adicionar sustancialmente el mismo tiempo o de manera secuencial, como se señala en la presente. Conforme prosigue la hidrólisis y fermentación en un paso individual de los insolubles de biomasa 108, se produce etanol 230 en la cámara de ánodo 204. En una modalidad, el etanol 230 se extrae de gas del medio de crecimiento 208 de la cámara de ánodo 204 mediante el orificio de salida de ánodo 220A y se recolecta en otro recipiente o tubo conforme se está produciendo, para distribución inmediata o distribución posterior. En la modalidad mostrada en la Figura 2, el etanol 230 producido como resultado de la fermentación se descarga a través del orificio de salida de ánodo 220A, aunque la invención no se limita de este modo. El etanol 230 se puede retirar de cualquier manera adecuada, incluyendo en una fase líquida.

En una modalidad, el orificio de salida de ánodo 22 OA también permite que se desfogue el dióxido de carbono (C02) de la MFC 118 durante la porción de fermentación de la hidrólisis y fermentación en un solo paso. En una modalidad, el C02 se recolecta y se recicla para el uso en un proceso fuera de sitio.

Los subproductos de fermentación que comprenden principalmente uno o más ácidos orgánicos (no mostrados) y una cantidad de hidrógeno (H+) producidos con el paso individual de hidrólisis y fermentación, se exponen a un segundo biocatalizador 224 (es decir, electricígeno 120, como se muestra en la Figura 1) provocando que la película electricigénica 228 crezca en el electrodo de ánodo 206. La película electricigénica 228 puede crecer a cualquier espesor adecuado. En una modalidad, la película electricigénica 228 es al menos de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 micrómetros de grueso.

La película electricigénica 228 cataliza la división de electrones (e~) y protones (H+) presentes en los subproductos de fermentación, provocando que los electrones (e~) fluyan desde el electrodo de ánodo 206 hacia el electrodo de cátodo 207 (tal como a través de alambres conductores 213A, hacia el potenciostato 214, y hacia los alambres conductores 213B, como se muestra en la Figura 2) .

Los protones (H+) permean la membrana de intercambio protónico 210 y reaccionan con los electrones (e~) en el electrodo de cátodo 207, generando de este modo gas hidrógeno (H2) . En la modalidad mostrada en la Figura 2, el gas hidrógeno (H2) generado en la cámara de cátodo 205 sale a través del orificio de salida 220B.

Ambos orificios de rociado, 222A y 222B, se configuran para remover gas oxígeno, facilitar el mezclado, y/o proporcionar gases definidos para amortiguar el pH del medio de crecimiento (por ejemplo, gas que contiene C02 para amortiguar el pH del medio que contiene bicarbonato) de sus respectivos cámaras, 204 y 205, y finalmente de la MFC 118. El mezclado también se puede lograr con barras de agitación 224, como se conoce en la técnica.

En una modalidad, se usa agua que contiene glicerol como materia prima para generar etanol y/o electricidad en una celda electroquímica microbiana. El agua que contiene glicerina se puede someter a uno o más pasos de pretratamiento para remover componentes indeseados, tal como aceites y sales (en tanto que ambos retienen glicerol y si está presente, alcohol) . En una modalidad, el pretratamiento incluye de manera adicional o alternativamente, un paso de concentración para incrementar la concentración de glicerol en el agua residual que contiene glicerina a un nivel deseado.

En esta modalidad, por lo tanto, el componente "insoluble" (comparable a los insolubles 108 en la Figura 1) es glicerina. Puesto que la glicerina se puede proporcionar a un BEC, tal como MFC, (por ejemplo, la MFC 118 mostrada en la Figura 1) . La glicerina entonces se degrada, es decir, se hidroliza y fermenta en un proceso de un solo paso usando microbio bioprocesador consolidado (CBP) (por ejemplo, 110) para producir un alcohol (por ejemplo, etanol 112) y subproductos de fermentación, tal como gas hidrógeno (H2) y ácidos orgánicos. El gas hidrógeno 114 y/o ácidos orgánicos proporcionan una fuente de electrones para soportar el crecimiento de un electricígeno como se describe en las figuras 1 y 2. Nuevamente, como se describe en la presente con la biomasa lignocelulósica, las modalidades de la biomasa que contienen glicerina, descritas en la presente, proporcionan el uso de un organismo CBP que no solo es capaz de catalizar la hidrólisis enzimática, sino también puede servir como un biocatalizador alcohologénico (alcoholo-génesis) . En una modalidad, el organismo CBP 110 sirve como un biocatalizador etanologénico . (Ver análisis adicional anterior con respecto a las figuras 1 y 2, que es aplicable a la modalidad de glicerina) .

Adicionalmente , el glicerol es un soluto permeable que entra libremente dentro de una celda, afectando de este modo las propiedades del ambiente acuoso intracelular y los procesos enzimáticos, lo que puede conducir a inhibición de crecimiento. Adicionalmente , la viscosidad del medio también se incrementa a una alta carga de glicerol y las celdas microbianas se pueden estresar osmóticamente. En una modalidad, se incrementa la tolerancia a glicerol de los catalizadores microbianos útiles como biocatalizadores alcohologénicos por al menos dos veces hasta aproximadamente 10 veces. En una modalidad, la mejora está entre aproximadamente cuatro y seis veces. En una modalidad, la tolerancia de glicerol de los catalizadores microbianos útiles como biocatalizadores alcohologénicos se incrementa al menos aproximadamente 10 veces. (Ver también ejemplo 5) . Con modificación adicional de las celdas microbianas, es posible la mejora que puede ser aun mayor de 10 veces.

En una modalidad, el biocatalizador alcohologénico es Clostridium cellobioparum (Cce) que puede fermentar glicerol en etanol y subproductos de fermentación que se pueden convertir en electricidad con Gsu como el electricígeno . En una modalidad, una cepa tolerante a glicerol de Cce (CceA) o una cepa tolerante al alcohol de Gsu (GsuA) o un co-cultivo de Cce-Gsu, CceA GsuA o cualquier combinación de esto, incluyendo cualquier combinación con Cce, es usa como el biocatalizador alcohologénico (ver e emplo 5) .

En una modalidad, se usa selección de alcohol alílico para mejorar adicionalmente el desempeño de un catalizador tolerante al alcohol. En una modalidad, se puede incrementar la presión selectiva en un catalizador tolerante a glicerol, tal como CceA, para para acelerar el proceso de selección al seleccionar mutantes en la enzima etanol -deshidrogenasa . Esta enzima cataliza la conversión natural de acetaldehído a etanol en Clostridium pero también convierte alcohol alílico en acroleína. La presencia de alcohol alílico en el medio de crecimiento se espera que seleccione rápidamente variantes que producen enzimas mutantes de etanol-deshidrogenasa con afinidad disminuida para alcohol alílico en tanto que mantienen o incrementan su afinidad para acetaldehído. Como resultado, se espera que estas variantes que tengan alta tolerancia a etanol y altas velocidades etanologénicas .

En una modalidad, se puede usar este planteamiento para acelerar la selección de cepas tolerantes a etanol de CceA con velocidades termentadoras mejoradas y mayores rendimientos de etanol . También se ha reportado variantes que surgen las cuales tienen mutaciones que reducen la actividad de la enzima acetaldehído-deshidrogenasa, que cataliza la conversión de acetil-CoA a acetaldehído. Adicionalmente, estas cepas se pueden diferenciar debido a que no producen tolerancia al alcohol y tienen rendimientos reducidos de etanol. Se puede prevenir que estas variantes crezcan al complementar medio de crecimiento no solo con alcohol alílico, sino con etanol . De esta manera, se espera que se puedan incrementar las posibilidades de aislar las variantes deseadas al adicionar etanol a los cultivos también.

Puesto que Gsu no tiene la enzima etanol -deshidrogenasa, se puede seguir un planteamiento diferente que usa temperaturas elevadas para incrementar la presión selectiva para cepas tolerantes al alcohol de GsuA. En una modalidad, la temperatura de incubación de la cepa elegida se puede incrementar gradualmente desde cualquier punto de inicio adecuado menor que la temperatura óptima para el crecimiento a justo por arriba de la temperatura óptima para crecimiento. En una modalidad, la temperatura de incubación se puede incrementar gradualmente, iniciando en aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 40°C (por ejemplo, 2°C por arriba de la temperatura óptima para el crecimiento de Gsu y Cce, respectivamente) .

En una modalidad, se puede monitorizar el crecimiento como densidad óptica y también se pueden transferir los cultivos en fase estacionaria para capitalizar el comportamiento propenso a error de ADN-polimerasa IV. Se espera que las velocidades de crecimiento disminuyan primero conforme se usen temperaturas subóptimas. Sin embargo, mantenimiento la selección por temperatura se espera seleccionar eventualmente las variantes que han recuperado las velocidades originales de crecimiento. En este punto, se pueden conservar alícuotas de los cultivos a una temperatura adecuada, tal como abajo de aproximadamente -80 °C. Los cultivos entonces se pueden transferir e incubar a una mayor temperatura en el tiempo deseado. Finalmente, se espera que se puedan alcanzar temperaturas a las cuales no se pueden recuperar las velocidades óptimas de crecimiento, marcando de este modo el final de la evolución adaptable. Las cepas tolerantes a calor, entonces se puede probar para tolerancia al alcohol, que se espera que la tengan incrementada a la temperatura de crecimiento ancestral.

Como se describe en los ejemplos posteriores, los inventores van a probar primero un método para desarrollar de forma adaptable tolerancia a glicerol en biocatalizadores alcohologénicos . En una modalidad que usa Cce como el biocatalizador, los pasos sucesivos a concentraciones crecientes de glicerol puede permitir que crezcan varias cepas a mayores cargas de glicerol de hasta aproximadamente 10%, adicionalmente hasta aproximadamente 20%. En una modalidad, se cultiva CceA a cargas de glicerol de hasta aproximadamente 10%.

En una modalidad, se mejora la tolerancia a etanol de CceA en tanto que se mejora simultáneamente la tolerancia a glicerol, puesto que la sensibilidad de etanol de CceA puede enmascarar su capacidad verdadera para crecer e incrementar mayores cargas de glicerol. En una modalidad, se cultivan células con concentraciones crecientes de glicerol hasta que se estabiliza su densidad óptica, que es una señal que las celdas han entrado a una fase estacionaria de crecimiento. En esta fase, son mayores las velocidades de mutación y la presión para usar glicerol selecciona variantes mutantes con mayores velocidades de crecimiento. En una modalidad, las variantes muestran crecimiento mejorado, que les permite competir excelentemente con las células más lentas, y se puede enriquecer en transferencias sucesivas. En una modalidad, la selección positiva de estas variantes prosigue, permitiendo que los cultivos alcancen más rápido la fase estacionaria.

Una vez que se estabilizan las velocidades de crecimiento, en una modalidad, los cultivos se pueden transferir nuevamente y dejar crecer a hacia una fase tempranamente exponencial, donde predominarán las células que más rápidamente crezcan. En una modalidad, se pueden aislar variantes clónales en placas que contienen glicerol y cultivar en medio líquido fresco hacia una fase exponencial. Después de transferencias sucesivas en la fase exponencial, se pueden seleccionar y conservar los que crezcan más rápido en una temperatura adecuada, tal como una temperatura menor de aproximadamente -80°C. En una modalidad, la variante con las velocidades más altas de crecimiento y los más altos rendimientos se puede usar para iniciar una ronda de evolución adaptable en el siguiente incremento de glicerol.

En una modalidad, los biocatalizadores alcohologénicos en un co-cultivo se desarrollan de manera adaptable para co-desarrollar rasgos de interés. En una modalidad, la evolución o desarrollo adaptable de un co-cultivo (es decir, más de un cultivo, tal como CceA y GsuA) , ejerce una selección múltiple en cada componente en el co-cultivo para tolerar mayores cargas de glicerol, para fermentar más rápido glicerol, para incrementar la tolerancia al alcohol (conforme se acumula más alcohol) , y para remover y utilizar los subproductos de fermentación (incluyendo lactato) . De esta manera, se puede desarrollar un co-cultivo para crezca a cargas crecientes de glicerol. En una modalidad, se usa un ensayo de fluorescencia rápida, que permite el monitoreo de desempeño de un co-cultivo como una función del crecimiento de catalizador. En una modalidad, los números de células de cada una las cepas en un co-cultivo se cuantifican por el ensayo al teñir inicialmente todas las células en un color (por ejemplo, verde) con un tinte de unión adecuado, tal como un tinte de unión a ácido nucleico SYTO 9 y las células Gram-negativas de contra-tinción en otro color (por ejemplo, rojo) con un tinte adecuado de unión a ácido, tal como un tinte de unión a ácido nucleico, fluorescente, yoduro de hexidio. Ver, por ejemplo, Haugland, R. P. Molecular Probés . Handbook of fluorescent probes and research chemicals . , (1999), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

La absorción y emisión diferencial de los dos tintes permite su rápida detección y cuantificación en un lector de fluoroplaca. En una modalidad, la intensidad del tinte para los números de cada cepa en el co-cultivo se estandariza y puede medir el número absoluto de células para cada cepa y la relación de las dos. Se espera que las relaciones sean constantes si no surgen variables o si surgen simultáneamente variantes de las dos. En consecuencia, las relaciones cambiarán igualmente cuando surjan primero variantes de una o la otra. Se puede monitorizar por rutina el crecimiento como la densidad óptica. Estos co-cultivos que muestran velocidades mejoradas de crecimiento se pueden analizar con el ensayo de fluorescencia descrito anteriormente, para cuantificar el crecimiento del catalizador y calcular las relaciones.

En una modalidad, los co-cultivos siguen una evolución gradual puesto que los cambios de una variante positiva que surgen son miembros son mayores que la probabilidad de mutaciones positivas y complementarias que surgen en los dos catalizadores microbianos, simultáneamente. Por ejemplo, las variantes de CceA con velocidades incrementadas de fermentación pueden surgir primero, lo que puede producir más productos de fermentación. Esto puede adicionar presión selectiva en GsuA para tolerar mayores concentraciones de inhibidores de crecimiento (por ejemplo, etanol o lactato) y remover más rápido donadores de electrones. De esta manera, las variantes de GsuA con tolerancia, captación y/o metabolismo, mejorados, de productos de fermentación se pueden seleccionar en transferencias sucesivas. Esto puede da por resultado números crecientes de células para GsuA y recuperación de relaciones de los dos catalizadores microbianos. En una modalidad, cuando surgen las variantes, se colocan en placa alícuotas en medio sólido complementado con una cantidad adecuada de glucosa, acetato y/o fumarato de aislar cantidades individuales, es decir, una cantidad suficiente para soportar suficientes tiempos de duplicación de una célula individual de modo que sea visible la colonia a simple vista. En una modalidad, se usa aproximadamente 0.2% (p/v) de glucosa para CceA y para GsuA se usa aproximadamente 0.2% (p/v) de acetato y fumarato. Posteriormente, se pueden realizar la selección clonal, crecimiento, almacenamiento, y pruebas para tolerancia al alcohol y glicerol y fermentación como se describe en la sección de ejemplos.

En una modalidad, se usa ingeniería genética para mejorar el desempeño del biocatalizador alcohologénico . Aunque se puede usar evolución adaptable para mejorar la conversión eléctrica de lactato por Gsu, la disponibilidad de un sistema genético para este organismo permite también la aplicación de herramientas de ingeniería genética. Se ha estudiado también la base genética de la utilización ineficiente de lactato por Gsu. Se han aislado cepas de Gsu evolucionadas de forma adaptable para crecer en medio de lactato con tiempos de duplicación comparables al donador preferido de electrones, acetato, y se secuencia su genoma. Summers, Z. M. et al. en Genomics : GTL Contractor-Grantee Workshop VII, (ed. Office of Science U.S. Department of Energy) 121 (Genome Management Information System (Oak Ridge National Laboratory) ) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Todas las cepas adaptadas a lactato tienen sustituciones individuales de pares de base en un gen (GSU0514) que codifican para un represor de la enzima succinil-CoA sintetasa. Esta enzima cataliza la conversión de succinil-CoA a succinato en el ciclo de TCA cuando el acetato no es el donador de electrones. Debido a que el represor GSU0514 también regula la actividad de otros genes, es importante seleccionar mutaciones puntuales individuales que activan el gen de succinil-CoA sintetasa sin romper el funcionamiento normal de la célula. En una modalidad, se puede realizar mutagénesis aleatoria al poner en ciclo la PCR propensa a error, un método en el cual el GSU0514 amplificado por PCR se clona primero en el vector de expresión de GsuA pRG5 y luego se amplifica en su totalidad bajo condiciones propensas a error para introducir mutaciones aleatorias. Ver, por ejemplo, Fujii, R. , Kitaoka, M. & Hayashi, K. One-step random mutagenesis by error-prone rolling circle amplification . Nucleic Acids Res. 32, el45, doi : 32/l9/el45 [pii] 10.1093/nar/gnhl47 (2004) y Coppi, M. V. , Leang, C, Sandler, S. J. & Lovley, D. R. Development of a genetic system for Geobacter sulfurreducens. Appl . Environ. Microbiol . 67, 3180-3187 (2001) (más adelante en la presente "Coppi"), ambos de los cuales se incorporan como referencia en sus totalidades.

En una modalidad, la mezcla de plásmido entonces se puede someter a electroforesis en un mutante de GsuA con supresión de GSU0514 usando técnicas de PCR recombinante y los mutantes de interés se pueden aislar en base a su capacidad para crecer en medio sólido con lactato como el único donador de electrones. (Ver Coppi) . En una modalidad, los mutantes con las velocidades más rápidas de crecimiento se pueden introducir en GsuA mediante PCR recombinante para generar mutantes estables, que entonces se pueden probar en una BEC accionada con lactato como un donador de electrones (Ver Coppi) .

En una modalidad, se usa la configuración "H" de MFC (mostrada en la Figura 2) con el electrodo de ánodo puesto en equilibrio a un potencial fijo. En una modalidad, se puede monitorizar la remoción de lactato del medio por HPLC usando un detector de UV. La conversión eléctrica de lactato entonces se puede calcular como la eficiencia culombiana (la cantidad de electrones útiles en el lactato consumido (12 electrones por mol) dividida por los electrones medidos como corriente) . En una modalidad, la se alcanzan eficiencias culombianas similares al donador preferido de electrones, acetato, (tal como aproximadamente 80% hasta aproximadamente 90%) .

En una modalidad, se maneja genéticamente un imitante de CceA defectuoso en la producción de lactato. La mutación se puede introducir en una cepa seleccionada evolucionada de forma adaptable, tal como una que muestre alta tolerancia al alcohol, carga de glicerol, y fuerza de crecimiento. Los Clostridium se conocen por producir lactato en una reacción individual de piruvato que se cataliza por la enzima lactato-deshidrogenasa . Ver, por ejemplo, Yazdani, SS., et al, Anaerobio fermentation of glycerol : a path to economic viability for the biofuels industry, Current Opinión in Biotechnology, Volumen 18, Issue 3, Junio del 2007, Páginas 213-219, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Aunque no está disponible la secuencia del genoma de Cce, hay muchas otros genomas de Clostridium cercanamente relacionados. Ver, por ejemplo, Collins, M. D. et al. The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations . Int . J. Syst . Bacteriol . 44, 812-826 (1994), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad, la alta conservación de genes de Clostridium de lactato-deshidrogenasa puede permitir la alineación de las secuencias y la identificación de regiones de conservación para el diseño de cebadores de PCR degenerados. Estos cebadores se pueden usar para amplificar el gen de lactato-deshidrogenasa de Cce, que se secuenciará. Está disponible un sistema genético universal para mutagénesis dirigida en Clostridium, que permite la generación de imitantes estables de inserción en solo unos pocos días (de 10 a 14) . Ver, por ejemplo, Heap, J. T., Pennington, 0. J., Cartman, S. T., Cárter, G. P. & Minton, N. P. The ClosTron: a universal gene knock-out system for the genus Clostridium. J. Microbiol . Methods 70, 452-464, doi : SO167-7012 (07) 00208-4 [pii] 10.1016/j .mimet .2007.05.021 (2007) (más adelante en la presente "Heap 2007") y Heap, J. T. et al. The ClosTron: Mutagénesis in Clostridium refined and streamlined. J. Microbiol. Methods 80, 49-55, doi:S0167-7012 (09) 00350-9 [pii] 10.1016/j .mimet.2009.10.018 (2010) (más adelante en la presente "Heap 2010"), ambos de los cuales se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades. El método, conocido como el ClosTron, consiste de un plásmido con una secuencia de intrón bacteriano de grupo II donde se clona una secuencia corta del gen buscado como objetivo. El plásmido se introduce en la bacteria por electroporacion y se seleccionan clones positivos en la presencia del antibiótico del plásmido. Ver, por ejemplo, Phillips-Jones , M. K. en Electroporation protocole for microorganisms Volumen 47 (ed J. A. Nickoloff) Capítulo 23, 227-235 (Humana Press Inc., 1995) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad, la concentración inhibitoria mínima de CceA a los antibióticos disponibles en varios plásmidos ClosTron se establece (ver Heap 2007 y Heap 2010) . En una modalidad, el objetivo ClosTron específico se sintetiza para lactato-deshidrogenasa . El plásmido replica en el hospedador de clostridio y se expresa constitutivamente el intrón, que se inserta espontáneamente por sí mismo en el cromosoma en la ubicación seleccionada como objetivo. Los clones con una inserción de intrón llegar a ser resistente a un segundo antibiótico y se pueden aislar fácilmente en placas selectivas. El plásmido se pierde posteriormente produciendo una inserción estable en el gen de elección. En una modalidad, el mutante de lactato de CceA se puede cultivar con glicerol para confirmar que no produce lactato. Debido a que está más disponible piruvato para la producción de acetato y etanol, se esperan mayores rendimientos de corriente (de acetato) y/o de etanol.

La producción de etanol en Clostridium procede en dos reacciones catalizadas por las enzimas acetaldehído y etanol-deshidrogenasa . En una modalidad, se puede producir un mutante de Cce deficiente de etanol. En una modalidad, se usa ingeniería genética para inactivar la primera reacción para re-encaminar efectivamente el acetil-CoA hacia la síntesis de acetato. La reacción de acetil-CoA acetato genera ATP y se espera que sea energéticamente favorecida. El resultado es un mutante deficiente de etanol que fermenta predominantemente glicerol a acetato. En una modalidad, la mutación se puede introducir en una cepa de CceA deficiente de lactato para generar un mutante que fermenta solo glicerol a acetato, formiato y H2. Debido a que estos son los donadores de electrones que tienen las velocidades más altas de conversión eléctrica por Gsu, se espera que se incremente la producción corriente en una MFC.

Se pueden mejorar adicionalmente los parámetros electroquímicos para incrementar la eficiencia de la plataforma en la MFC. En una modalidad, el potencial de voltaje de la MFC, por ejemplo, se puede ajustar para promover una eficiente conversión eléctrica de la mezcla de subproductos de fermentación.

En una modalidad, la densidad energética obtenible con la modalidad de glicerol se mejora en comparación a celdas de combustible, microbianas, convencionales. En una modalidad, la eficiencia de remoción de glicerol también se mejora en comparación a las celdas de combustible, microbianas, convencionales. En una modalidad, la eficiencia culombiana de la modalidad de glicerol también se mejora en comparación a celdas microbianas convencionales. En una modalidad, la concentración de glicerol usada es mayor de 2.5% en volumen, tal como hasta aproximadamente 10% o mayor, hasta aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, hasta glicerol sustancialmente puro, incluyendo cualquier intervalo entre estos. En una modalidad, la concentración de glicerol en agua que contiene glicerina es al menos aproximadamente 50% hasta aproximadamente 80%. En una modalidad, la actividad electrogénica se mejora en comparación a una celda de combustible, microbiana, convencional. En una modalidad, la actividad electrogénica no requiere la adición de un mediador de reducción en oxidación en comparación a una celda de combustible, microbiana, convencional. En una modalidad, el biocatalizador alcohologénico no es un patógeno "oportunista" como se entiende ese término en la técnica.

En una modalidad, el proceso descrito anteriormente se puede aumentar en escala hasta 10, 100 a 1000 veces o más para la producción de electricidad y etanol a tras escala. En una modalidad, la electricidad generada se puede usar para remplazar algo de la demanda de electricidad de una instalación de producción de biocombustible, tal como una producción de etanol y/o biodiesel. En una modalidad, se produce electricidad usando una celda bioelectroquímica (BEC) . En una modalidad, el etanol producido de acuerdo a los métodos descritos en la presente se puede destilar en una instalación de producción de biodiesel usando equipo existente de destilación y reutilizar como el alcohol en la reacción e transesterificación.

Las modalidades descritas en la presente incluyen sistemas y métodos implementados en computadora, que operan de acuerdo a funciones particulares o algoritmos que se puede implementar en software en una combinación de software y procedimientos implementados por humano. En una modalidad, el software puede comprender instrucciones ejecutables en computadora, almacenadas en un medio leíble en computadora tal como una memoria u otro tipo de dispositivos de almacenamiento. Adicionalmente , estas funciones corresponden a módulos, que son software, hardware, programa en circuito o cualquier combinación de esto. Se pueden realizar múltiples funciones en uno o más módulos como se desee, y las modalidades descritas son solo ejemplos. El software se puede ejecutar en un procesador de señales digitales, ASIC, microprocesador, u otro tipo de procesador coopere en una computadora, es decir, un sistema de computadora, tal como una computadora personal, servidor y u otro sistema de computadora .

Las modalidades de la invención se describirán adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se ofrecen para ilustrar adicionalmente varias modalidades de la presente invención. Sin embargo se debe entender que se pueden hacer muchas variaciones y modificación que permanezcan dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Se realizaron experimentos preliminares para seleccionar un organismo CBP y para mostrar que subproductos de la fermentación de etanol, producidos por un organismo CBP a partir de substratos lignocelulósicos , se pueden convertir en C02 y electrones por un electricígeno . En estos experimentos, el substrato lignocelulósico fue rastrojo de maíz tratado por AFEX (llamado más adelante en la presente AFEX-CS) , el organismo CBP fue C. uda y el electricígeno usado fue G. sulfurreducens (Gsu) que catalizó la conversión de subproductos de fermentación usando un aceptador de electrones, químico (fumarato) . Estos experimentos también demostraron que las velocidades de producción de etanol se incrementaron por al menos diez (10)% hasta aproximadamente 15% durante el crecimiento de co-cultivo a través de la remoción de subproductos de fermentación cuya acumulación inhibirá de otro modo el paso de bioprocesamiento consolidado y/o la etanologénesis .

Equipo Los subproductos de fermentación líquida tal como etanol y ácidos orgánicos en fluidos sobrenadantes se analizaron por un sistema de Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC, por sus siglas en inglés) equipado con una bomba 25P que corre a 0.6mL/min y -1600 lb/pul2 (112.49 kg/cm2), en el desgasificador en línea AF, detector de absorbancia de longitud de onda dual 2487 refractómetro diferencial 410 automuestreador 717Plus (Waters, Milford, MA) y un soporte de cartucho estándar #125-0131 con un cartucho de relleno 30 x 4.6 mm Micro-Guard Carbo-C conectado a una columna de exclusión iónica Aminex HPX-87H (Bio-Rad) . La columna se calentó a una temperatura de 25°C. Se inyectaron aproximadamente 100 µ? de la muestra para análisis y se logró la separación del metabolito usando una solución portadora de H2S04 4mM en ddH0. La adquisición de datos fue con una computadora Microsoft Compaq equipada con el software Breeze (Waters, Milford, MA) . Se analizaron os subproductos de fermentación gaseosos tal como H2 y C02 en n cromatógrafo de gases CP-4900 (Varían, Inc, Palo Alto, CA) equipado con una columna MSAH BF con gas portador a argón al >99.999% y una columna PPQ con gas portador helio al >99.99%. La recolección de datos fue con una computadora Dell Latitude D620 que corre el Sistema de Datos de Cromatografía Galaxie versión 1.9.3.2 (Varían, Inc, Palo Alto, CA) .

Materiales de Inicio Productos químicos Todos los productos químicos fueron de Sigma- Aldrich y tiene una pureza mínima de 98%. Para el crecimiento de Gsu, se usaron rutinariamente acetato de sodio y fumarato de sodio como el donador y el aceptador de electrones, respectivamente. Los organismos CBP se cultivaron rutinariamente con azúcares tal como celobiosa, glucosa y xilosa .

Substrato Se usó rastrojo de maíz tratado por Expansión de Fibra con Amoníaco ( "AFEX" ) (todo lo que permanece después de que se recolecta el grano, típicamente incluyendo tallos y hojas con/sin mazorcas) como el substrato en esta prueba. Se proporcionó AFEX-CS de Dr. Dale ' s Laboratory, Michigan State University (East Lansing, Michigan) . Se preparó rastrojo de maíz (CS) , premolido y hecho pasar a través de un tamiz de 4 mm, proporcionado por el National Renewable Energy Laboratory (NREL, Golden, CO) . El contenido de humedad del CS no tratado fue de aproximadamente 7% (en base al peso total) . El análisis de la materia primera por NREL reveló una composición estimadas (en base al peso seco) de 34.1% de celulosa, 22.8% de xilano, 4.2% arabinano, 11.4% de lignina y 2.3% de proteína en el rastrojo de maíz. El CS molido se mantuvo a 4°C para almacenamiento a largo plazo. El pretratamiento con AFEX se llevó a cabo en un recipiente a presión de 2.0 L (Parr) equipado con termopares y un sensor de presión. El recipiente se calentó de 100 a 110°C antes de que se cargaran 240 g de CS pre-humectado a 60% de humedad (en base a peso seco) . La tapa se cerró con pernos. Concurrentemente, se adicionaron 150 g de amoníaco anhidro a un cilindro separado de acero inoxidable de 500 mi y se calentó hasta que la presión del gas alcanzó 4.48 MPa (650 psi/pul2) . Entonces el amoníaco calentado se transfirió al reactor para iniciar la reacción. Después de 15 minutos, la presión se liberó a través de la válvula de escape. Las temperaturas inicial y final del pretratamiento fueron 130 ± 5°C y 110 + 5°C, respectivamente. Después del tratamiento por AFEX, el CS pretratado se secó con aire durante la noche bajo una campana de humos, y se mantuvo a 4°C para almacenamiento a largo plazo. Se suministraron aproximadamente 125 g de AFEX-CS a este laboratorio en una bolsa ZIPLOCK de un galón (3.79 litros) y se almacenó a cuatro (4)°C. El AFEX-CS se molió en una moledora (GE Modelo 168940) y se tamizó a través de un filtró cerámico con poros de 0.75mm x 0.75mm .

Organismos Bioprocesadores Consolidados (CPB) Se usaron Clostridium cellulolyticum, Clostridium hungatei AD, Clostridium hungatei B3B, Clostridium papyrosolvens C7, Ruminococcus albus, C. uda ATCC 21399, Celulomonas biazotea, Celulomonas cartae, Celulomonas gélida, Celulomonas fimí, Celulomonas uda ATCC 491, Celulomonas flavigena , Celulomonas cellobioparum, Clostridium longisporum, Clostridium populeti , Clostridium cellulovorans, Clostridium phytofermentans, Clostridium lentocellum, C. papyrosolvens NCIMB de la colección de cultivos de laboratorio de los inventores.

Estas cepas originadas de una colección de cultivo de laboratorio en University of Massachusetts (Amherst, MA) . Estas cepas se cultivaron en medio GS2 , como se describen "Cellulase system of a free-living, mesophilic Clostridium (strain C7) " . K Cavedon, S B Leschine y E Canale-Parola J Bacteriol . 1990 Agosto; 172(8) : 4222-4230, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, con 0.2% de celobiosa o 0.2% de glucosa como la única fuente de carbono y energía. Las cepas se incubaron a 30°C. Las soluciones concentradas congeladas en sulfóxido de dimentilo al 10% se mantuvieron a -80 °C par almacenamiento a largo plazo.

Se compró Acetivibrio cellulolyticus ATCC 33288 (Ace) de la American Type Culture Collection ATCC (Manassas, VA) para el uso en estos experimentos preliminares. Se cultivó en un medio conocido como ATCC 1207 (ATCC, anassas, VA) y se incubó a 37°C.

Electricígeno Se usó G. sulfurreducens ATCC 51573 (Gsu) como el electricígeno . Este microbio se obtuvo originalmente de la American Type Culture Collection (ATCC) como un cultivo sustancialmente puro y se mantuvo bajo condiciones conocidas en la técnica en la colección de cultivos de laboratorio de los inventores .

Procedimiento Los varios organismos se examinaron para eficiencia etanologénica en el "medio de Regan," ver Regan, supra . Se adicionó AFEX-CS (0.2%) como la fuente de carbono y energía. Se valoraron las eficiencia de fermentación al cuantificar primero los rendimientos de etanol y luego los rendimientos de subproductos líquidos (ácidos orgánicos y gaseosos (hidrógeno y CO2) de fermentación en cultivos de una a dos semanas mediante análisis por HPLC o por GC.

Para los experimentos de co-cultivo entre Cuda y Gsu, se pre-cultivaron las cepas a fase exponencial media a tardía en el medio de Regan, con respectivamente, 0.2% D+ celobiosa o acetato 15 mM y fumarato 40 m y se incubó a 30°C en una incubadora de tambor giratorio (Glas-Col 099A RD4512) corrida a baja velocidad (10 por ciento) . Se adicionó aproximadamente un inoculo al 10% (v/v) con una densidad óptica a 660 nm de 0.2 a tubos de presión anaeróbicos (N2:C02. 80:20) (Bélico) que contiene 10 mi del medio de Regan y AFEX-CS al 0.2%. También se incluyeron controles con Cuda solo (con o sin fumarato 40 mM) , Gsu solo, y controles sin inoculador. Todos los tubos de cultivo se incubaron a 30°C en una incubadora de tambor giratorio, como se describe anteriormente .

Se monitorizó periódicamente el crecimiento al tomar la densidad óptica de los cultivos a 660 nm. Para mediciones de crecimiento, los tubos se removieron de la incubadora giratoria y se dejo al AFEX-CS asentar al fondo del tubo durante -10 minutos antes de medir la densidad óptica del cultivo. Los tubos de control no inoculados se usaron para calibrar las lecturas de absorbancia a cero.

El espacio libre entre la superficie del líquido y la tapa de cada tubo se muestreó periódicamente (cada 1-3 días) para analizar la composición de los gases (hidrógeno y C02) por cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) . Se removió aproximadamente 1 mL del espacio libre entre la superficie del líquido y la tapa con una jeringa enjuagada con N2 y se inyectó en el GC. También se removieron muestras de sobrenadante (0.7 mi) de forma anaeróbica, se usaron 70 µ? para colocar en placa con medio de Regan sólido complementado con 0.2% de celobiosa y se midió el crecimiento de Cuda como unidades formadoras de colonias . El resto de la muestra se filtró a través de un filtro de membrana de 0.45 µ (Fisher) y se almacenó a -20°C antes de que se analizara por HPLC.

Resultados y Examen Inicial Después de una o dos semanas de incubación a 30°C, se valoró la eficiencia etanologénica de cada organismo al medir los rendimientos de etanol en fluidos sobrenadantes libres de células. Los mejores etanológenos (rendimientos de etanol de más de 40% de los rendimientos teóricos máximos) fueron C. populeti , C. lentocellum, A. cellulolyticus, C. gélida, C. biazotea, y C. ATCC 21399. Se descartaron las otras cepas.

Examen Adicional y Resultados Los subproductos líquidos (ácidos orgánicos) y gaseosos (hidrógeno y C02) de fermentación de las cepas etanologénicas seleccionadas se midieron por análisis de HPLC y GC, respectivamente. En base al subproducto predominante de fermentación (hidrógeno o ácidos orgánicos) , las cepas en esta pruebas fueron dos categorías funcionales.

El primer grupo (C. populeti , C. lentocellum, y A. cellulolyticus) produjo H2 como su principal producto de fermentación.

Se descartó C. populeti debido a que los estudios de crecimiento que usan azúcares solubles tal como glucosa al 0.2% revelaron lisis celular abrupta conforme el cultivo alcanzó densidades celulares de más de 0.6 de absorbancia a 600 nm, que es consistente con la presencia de infección de fase lítica en este organismo. Se han reportado infeccione s de fase lítica en el género Clostridium y son una fuente principal de contaminación en las fermentaciones industriales. Las cepas infectadas son difíciles de curar del virus y no son deseables para propósitos industriales.

De otro modo, como se muestra en la Figura 3, Ace produjo significativamente más H2 que C. lentocellum durante la degradación de AFEX-CS y durante la fermentación de unidades repetitivas de disacárido de celulosa, celobiosa. El acetato y el formiato fueron los ácidos orgánicos predominantes producidos producidos durante la fermentación de AFEX-CS tanto por Ace como por Cien (no mostrado) .

El segundo grupo (C. gélida, C. biazotea, y C. uda ATCC 21399) consistió de miembros de la familia Cellulomonadaceae, un grupo de actinobacterias aeróbicas facultativas y produjo predominantemente ácidos orgánicos (principalmente acetato y/o formiato) como productos de fermentación, con muy poco o indetectable gas hidrógeno termentador .

El alto nivel de producción de pacidos orgánicos ainos por los organismos en este grupo conduce a acidificación del medio durante la fermentación, provocando de este modo crecimiento subóptimo y fermentación subóptima. En el caso de C. uda, el pH del medio cayó desde 7 a 5.5 durante la degradación y fermentación de AFEX-CS. De esta manera, se espera que la remoción de ácidos orgánicos tenga un efecto positivo en el crecimiento de las células y en la etanologénesis .

En comparación con Cuda, C. lentocellum tiene una mayor velocidad de crecimiento durante la co- fermentación de glucosa y xilosa, como se muestra en la Figura 4.

Específicamente, las velocidades de crecimiento para la fermentación de azúcares individuales fue seis y tres veces mayor para C. lentocellum en comparación con Cuda cuando se cultiva, con 0.2% de glucosa y 0.2% de xilosa, respectivamente, lo que hace a C. lentocellum una cepa más fuerte para fermentaciones industriales de los azúcares individuales .

Sin embargo, fueron comparables las velocidades de co- fermentación de Cuda y Cien, como se muestra en la Figura 4, que los hace candidatos atractivos para fermentaciones en base a substratos de lignocelulosa .

Además, Cuda fue el único Celulomonas que creció óptimamente bajo las condiciones anaeróbicas útiles para desempeño óptimo de la celda de combustible. Cuda también produjo los más altos rendimientos de acetato y formiato, específicamente más de 20 mM y 30 mM, respectivamente. Por esta razón, se seleccionó para estudios adicionales.

Prueba de Remoción de Subproductos de Fermentación por Gsu En base a los resultados anteriores, se predice que la remoción de ácidos orgánicos para soportar el crecimiento de Gsu impide la acidificación del medio en cultivos de Cuda cultivos con AFEX-CS y por lo tanto incrementa la viabilidad celular y los rendimientos de etanol . Para probar esta hipótesis, se co-cultivaron Cuda y Gsu en recipientes de cultivo con AFEX-CS como fuete única de carbono y energía, con fumarato como un aceptador de electrones para el crecimiento de Gsu. Se usaron controles negativos con Gsu (que no puede crecer con AFEX-CS como un donador de electrones y fumarato como un aceptador de electrones) y en co-cultivo con Cuda pero en medio sin fumarato que sirve como aceptador de electrones para el crecimiento de Gsu) para demostrar que cualquier cambio metabólico fuer una consecuencia del crecimiento sintrófico del consorcio.

Como se muestra la Figura 5, cuando se cultivó en co-cultivo, las velocidades de degradación de biomasa por Cuda se incrementaron aproximadamente de 10 a 15%, como lo hacen los rendimientos de etanol de Gsu. El crecimiento de Cuda también se estimuló más de 15 veces conforme se removieron los subproductos de fermentación de Gsu como se mide por el incremento en las unidades formadoras de colonias de Cuda. El crecimiento tanto de Cuda como de Gsu también se muestra como absorbancia a 660 nm en Figura 5. Además, se usaron todos los subproductos de fermentación (ácidos orgánicos e hidrógenos) por Gsu, en un proceso acoplado a la reducción de fumarato en el medio, que se monitorizó por la acumulación de succinato. Se usó C02 producido de la oxidación compleja de acetato como un delegado para el crecimiento de Gsu, que se incremento durante el co-cultivo de las dos cepas .

Conclusión Estos resultados demuestran que el acoplamiento de un organismo CBP apropiado a un electricígeno trabaja de forma efectiva para remover los subproductos de fermentación e incrementa las velocidades de degradación de biomasa y producción de bioetanol. Estos resultados demuestran adicionalmente que la remoción de ácidos orgánicos incrementó de forma efectiva el crecimiento de Cuda. Sin embargo, no se incrementa de forma lineal la cantidad de etanol.

De todos los organismos probados, C. populeti , C. lentocellum, A. cellulolyticus, C. gélida, C. biazotea, y C. uda ATCC 21399 estuvieron entre los mejores etanologenos.

Cuda, junto con la cepa clostridial C. lentocellum descrita anteriormente, tiene los más altos rendimientos de etanol a partir de AFEX-CS.

Cuda y C. lentocellum también tienen las más altas velocidades de crecimiento durante la co- fermentación anaeróbica de azúcar de seis y cinco carbonos.

El co-cultivo de Cuda con Gsu estimuló el crecimiento del organismo CBP con AFEX-CS y los rendimientos de etanol en tanto que soporta la remoción de subproductos de fermentación y transferencia de electrones por Gsu.

Ejemplo 2 Optimización de una MFC Se personalizó una incubadora por Convección, Mecánica de Precisión (no. de catálogo 51220098) para alojar equipo electrónico y cordones eléctricos que conectan a una MFC personalizada descrita más adelante a un potenciostato externo (Bio-Logic EUA, modelo VSP) y se conecta a una computadora portátil Dell Inspiron 1721 que corre el software EC-Lab V9.55 (Bio-Logic EUA), que controló los parámetros electroquímicos de la MFC y almacenó los datos de salida.

Se construyó y probó una celda de combustible, microbiana, de dos cámaras, tipo H como se muestra en la Figura 2 y se describe anteriormente. Los volúmenes de las cámaras (100 mi) se redujeron por 5 veces el volumen de las celdas de combustible normales tipo H (como se describe en Improved fuel cell and electrode designs for producing electricity from microbial degradation, Park DH, Zeikus JG. Biotechnol Bioeng. 2003 Feb 5 ; 81 ( 3 ) : 348-55 ) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, para reducir al mínimo los costos asociados con cada corrida, para mantener la anaerobiosis y para mejorar la capacidad de reproducción. Las celdas de combustible también se diseñaron tal que tanto el ánodo como el cátodo de cuatro (4) celdas de combustible se puedan agitar con una placa de agitación individual de 10 posiciones (Fisher Scientific, IKAMAG) que permiten que se lleven a cabo cuatro experimentos de forma simultánea .

Se probaron varias configuraciones de electrodo de ánodo y cátodo. Se puede usar un alambre de platino como el electrodo de cátodo, sin embargo, se probaron materiales de grafito más baratos a fin de reducir al mínimo los costos y de incrementar el área superficial del electrodo. Los materiales de electrodo fueron grafito con diferentes grados de porosidad (es decir, fieltro tejido de grafito fino (Electrosynthesis) , bloques de grafito poroso, y cilindros de grafito (pureza >99%, Alfa Aesar) , que se usaron para encontrar material más barato que puede producir resultados reproducibles y sea reutilizable . Los cilindros de grafito tienen la más baja resistencia de los materiales de electrodo (es decir menos de 0.5O) y fueron los más durables de modo que se usaron para los electrodos de ánodo y cátodo.

Se probaron tres tipos de conectadores para el uso con lo cilindros de grafito: alambre de platino de 0.5mm (Electrosynthesis), alambre de cobre de 0.5mm, y conectadores epoxi reforzados con fibra, herméticos a agua, comercialmente disponibles (Teledyne Impulse, XSA-BC) que ese conectan a un alambre trenzado de aproximadamente dos (2) pies (0.61 metros) (Teledyne Impulse, R A-FS) . Se usó epoxi de plata conductor (Fulton Radio, Inc.) para sellar las conexiones. Los conectadores comercialmente disponibles se desempeñaron bien debido a que son baratos, crearon un sello hermético para proteger las conexiones de alambre y epoxi de plata de la corrosión, fueron los más dudables y permitieron que se removieran los electrodos de la celda de combustible para análisis adicional (por ejemplo microscopía confocal) . Los electrodos completados tienen resistencias de menos de 0.5O.

Se probaron tres diferentes tipos de medios de crecimiento en la configuración optimizada de celda de combustible, específicamente agua fresca (FW, por sus siglas en inglés), medio de Regan y medio de Daniel Bond ("DB"). Todos los medios de crecimiento se complementaron con acetato l-15mM. No se produjo corriente usando se inicio de Gsu en el medio de Regan. Se produjo corriente de FW y DB, sin embargo, la eficiencia de conversión en DB fue mayor en 70% en tanto que la conversión para FW fue -20%. Adicionalmente , el medio DB soportó el crecimiento de Gsu así como muchos de los organismos CBP probados incluyendo Cuda, y de este modo se eligió como el medio preferido de la celda de combustible.

También se optimizaron las condiciones de inoculación de células de Gsu. Las células se cultivaron en medio de FW+ citrato férrico complementado con acetato 15mM (ver Development of a Genetic System for Geobacter sulfurreducens. Coppi MV, Leang C, Sandler SJ, y Lovley DR.

Applied and Environmental Microbiolog . 2001 Julio; Vol . 67(7): 3180-3187, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , medio FW complementado con acetato 15m y fumarato 40m y medio DB complementado con acetato 15-20mM y fumarato 40mM.

El 40% vol/vol de las células (es decir, 36mL) se recolectó en la fase exponencial tardía, se centrifugó para remover el exceso de acetato y fumarato, se lavó y luego se volvió a suspender en el medio de la celda de combustible y se inoculó en la cámara de ánodo. Las celdas del medio DB empezaron produciendo corriente después de aproximadamente 18 horas, en tanto que las celdas de FW tomaron a aproximadamente 24 horas y las celdas de FW+ citrato férrico tomaron aproximadamente pero no prosiguieron a la fase de crecimiento exponencial hasta aproximadamente 48 horas. Por lo tanto se eligió el medio DB como el medio de incubación para las células de Gsu debido que se desempeñó bien y debido a que es conveniente para usar el mismo medio para todas las etapas del ajuste de la celda de combustible.

Adicionalmente se optimizaron las condiciones de inoculación al probar las velocidades de producción de corriente de células cultivadas a fase exponencial y aquellas cultivadas a fase estacionaria temprana. Las células inoculadas de la fase estacionaria empezaron produciendo corriente más pronto (en aproximadamente 12 horas) de modo que se eligió esta condición de inoculación.

Los detalles de la MFC de doble cámara, optimizada, están en el Ejemplo 3 posterior.

Ejemplo 3 A menos que se indique de otro modo, todos los materiales (incluyendo AFEX-CS) usados fueron como se describe en los Ejemplo 1 y 2 anteriores.

Celda de Combustión Microbiana (MFC) La MFC optimizada como se describe anteriormente en el Ejemplo 2, se construyó y usó en esta prueba. Por conveniencia, los números de referencia se refieren a la MFC 118 de ejemplo mostrada en la Figura 2, aunque la Figura 2 no se va a interpretar como que se limita a los tamaños, materiales y configuraciones específicas de los componentes descritos en este ejemplo.

Las cámaras de ánodo y cátodo (por ejemplo, 204 y 205), respectivamente, se construyeron de botellas de medio Pyrex de 100-mL (Fisher Scientific) . Orificios laterales de vidrio hechos a medidas se fusionaron a las botellas (tina de vidrio de Michigan State University) usando tubos de presión de vidrio con un diámetro de 18 mm (Bélico) . Los varios orificios (por ejemplo, 220A, 220B, 222A y 222B) se sellaron con tapones septo de 18-mm (Fisher Scientific) .

Los electrodos (por ejemplo, 206 y 207) usados en la MFC fueron varillas de grafito de 2.5 cm de largo, cada una que tiene conectadores removibles sellados contra agua, para permitir la remoción de los alambres del electrodo cuando se necesite, por ejemplo, para examinar la biopelícula microbiana formada en el electrodo por microscopía o para limpiarlas después de cada uso.

Se construye un puente de vidrio (que comprende, por ejemplo, la membrana de intercambio catiónico 210, empaques 211 y bridas de vidrio 212) con un tubo de vidrio de 15 mm de diámetro y una brida de vidrio de 32 mm de diámetro. Se intercaló una membrana de intercambio catiónico NAFION de 32 mm de diámetro (Ion Power, Inc. N117) entre los dos empaques de caucho de 32 mm de diámetro (comprados en un almacén local, y modificados para que tengan un agujero de 15 mm en la parte media) . Las bridas de vidrio permitieron el paso de iones de H+, pero también sirvieron para mantener separados los contenidos de cada cámara . La membrana NAFION se cortó en círculos pequeños, se intercaló entre los empaques de caucho y se selló con epoxi entre las dos cámaras. El montaje de membrana NAFION, empaques de caucho y bridas de vidrio, se mantuvo conjuntamente con una abrazadera de unió metálica (Thomas Scientific) .

Los electrodos de ánodo y cátodo se construyeron de varillas de grafito de 2.5cm x 1.3cm (Alfa Aesar) , que se perforaron para alojar un conectador de epoxi reforzado con vidrio (Teledyne Impulse, XSA-BC) . Se usó epoxi de plata (Fulton Radio, Inc.) para producir un sello conductor hermético entre el grafito y el conectador de modo que los electrones tienen menos de 0.5 O de resistencia. El conectador incrustado se conectó mediante un sello hermético agua a un conectador moldeado de caucho con un alambre trenzado de aproximadamente dos (2) pies (0.61 metros) (Teledyne Impulse, RMA-FS) .

Los alambres de ánodo y cátodo se incrustaron en un tapón de caucho No. 6 en la boca de cada cámara. Entre los experimentos se refrescaron los electrodos de grafito al remojar libremente en HCl 1N para remover las trazas metálicas, y NaOH 1N para remover el material orgánico. El grafito entonces se pulió con una lija 400 y se enjuagó en H20 doblemente destilada.

Se colocó un electrodo de referencia de Ag/AgCl (Bioanalytical systems, Inc. MF-2078) en la cámara de ánodo usando el orificio de rociado (por ejemplo, 222?) . Esto permitió que se controlará el potencial del electrodo de ánodo (por ejemplo, 206) usando el potenciostato (Bio-Logic USA, modelo VSP) . El cable del electrodo de referencia (por ejemplo, 213C) se incrustó a través de un agujero en el tapón septo del orificio de rociado. El agujero se selló con silicón a prueba de agua (General Electric) .

Organismo Bioprocesador Consolidado ("CBP") El organismo CBP, Cuda, se seleccionó para estos experimentos en base a su fortaleza de crecimiento con AFEX-CS bajo condiciones anaeróbicas, capacidad para co-fermentar azúcares de seis y cinco carbonos, rendimientos etanologénicos (> 40% de rendimiento máximo teórico) , y variedad de subproductos de fermentación (acetato, formiato, y a un menor grado, H2) que pueden servir como donadores de electrones para la bacteria electricigénica (en el caso de Gsu) , como se describe en el Ejemplo 1.

Para estos experimentos de MFC, se cultivó previamente C. uda durante 24 horas en medio DB con 0.2% de celobiosa a 30°C. Se recolectaron 36 mL (40% vol/vol) de células por centrifugación, se resuspendieron en medio DB que contiene el AFEX-CS, y se inocularon en la cámara de ánodo 204.

Electricígeno Se usó G. sulfurreducens ATCC 51573 (Gsu) como el electricígeno. En esta forma, se conoce que el Gsu convierte efectivamente los productos de fermentación (tal como H2, acetato, y formiato) a electricidad en las MFC y celdas electroquímicas. Como lo describe la prueba en el Ejemplo 1 y posterior, las velocidades de crecimiento de Gsu estuvieron sin afectar en la presencia de AFEX-CS. Adicionalmente , como se muestra en el Ejemplo 1, este organismo fue capaz de crecer en co-cultivo con Cuda y acoplar la conversión de todos los subproductos de fermentación a la reducción de un aceptador de electrones químico tal como fumarato. De esta manera, se tuvo como hipótesis que también puede acoplar a la transferencia de electrones de subproductos de fermentación al electrodo de ánodo de una MFC activada por AFEX-CS.

Prueba Las condiciones para cultivar Gsu en la MFC con acetato (1-6 mM) como donador de electrones se optimizaron como se describe en el Ejemplo 2 y se describen en detalle bajo Procedimientos. Estas son condiciones que permitieron la producción relativamente "rápida" y reproducible de electricidad (es decir, iniciando aproximadamente una (1) a dos (2) horas después de la inoculación de la MFC 118 con el electricígeno Gsu) y también tienen las más altas eficiencias culombianas (70 a 75% de acetato convertido en electricidad) . Las eficiencias de conversión de donador de electrones a corriente (eficiencias culombianas) se calculan usando el software EC-lab de la integral de la curva de producción de corriente con el paso del tiempo para obtener los culombios totales transferidos al electrodo de ánodo durante la producción de electricidad. Los moldes de donador de electrones (por ejemplo, acetato) usados por el electricígeno se calculan al medir su concentración en las muestras de fluido de sobrenadante de cultivo por HPLC, como se describe en el Ejemplo 1. Entonces se usa la siguiente ecuación para calcular la eficiencia culombiana: I = corriente en culombios por segundo T = tiempo de experimento F = constante de Faraday b = el mol de electrones intercambiado por mol de substrato Van = volumen del compartimiento de ánodo Ac = concentración de substrato en mol/L Los controles con AFEX-CS y Gsu no produjeron corriente en tanto que los controles con AFEX-CS/Gsu/acetato (3 mM) produjeron corriente con rendimientos y eficiencias culombianas comparables al Gsu/acetato (3 mM) (no mostrado) .

También se incluyeron controles de Cuda que crecen solo con AFEX-CS.

Celdas Electroquímicas Activadas por Consorcio Como se muestra en la Figura 6, cuando se cultivó con acetato tres (3) mM en una MFC, Gsu produjo corriente a partir de acetato. Cuando sustancialmente se usó todo el acetato, declinó agudamente la corriente. Una vez que ha cesado la corriente, se adicionaron AFEX-CS y Cuda a la cámara de ánodo y se reasumió inmediatamente la corriente, alcanzando salidas aproximadamente dos veces a aquellas obtenidas con el acetato uno (1) mM. Los subproductos de fermentación y etanol así como cualquier azúcar que permanezca en la degradación del rastrojo de maíz se midieron diariamente .

Se probó el crecimiento del co-cultivo en la celda de combustible con y sin rociado de gas nitrógeno. El uso de gas nitrógeno rociado facilitó la difusión de ácidos orgánicos a través de las biopelículas de ánodo e incrementó los rendimientos de electricidad. También ayudó a remover solventes volátiles tal como etanol del medio mediante rociado de gas, removiendo de este modo las posibles cuestiones de tolerancia de solventes, que comprometen potencialmente la viabilidad de Cuda y Gsu en la producción máxima en la producción máxima teórica de etanol deseada para aplicaciones a una mayor escala.

Como se predice, el co-cultivo convirtió mucho de los ácidos orgánicos en electricidad, pero no incrementa la producción de etanol. También fue ineficiente la fermentación, puesto que algunos de los azúcares no se usaron en comparación a los controles de Cuda (cultivados solo con AFEX-CS) o co-cultivos en los cuales se mantuvo el rociado a todo lo largo del experimento. El rociado del medio con gas N2 removió el etanol conforme se estuvo produciendo, conduciendo a una eficiencia de fermentación de casi 100%, un incremento de aproximadamente 1.6 veces en la producción de electricidad, y remoción de sustancialmente todo el formiato y la mayoría del acetato (a menos aproximadamente 15 mM) que se convirtieron en electricidad. La predicción teórica estima un incremento de aproximadamente dos veces en la producción de etanol bajo estas condiciones (o el equivalente de más de 80% del rendimiento teórico máximo) .

Los cultivos de control de Cuda cultivados sólo con AFEX-CS tienen una eficiencia de fermentación de 100% sin niveles detectables de azúcares solubles en el medio y sustancialmente todo el contenido teórico de electrones de los componentes de glucosa y xilosa del rastrojo de maíz con AFEX (13.91 mmol de electrones) dio cuenta del acetato (21%), formiato (37%) , y etanol (43%) (ver Figura 7) .

Se conoce que los subproductos de fermentación afectan negativamente las velocidades de hidrólisis y fermentación por los organismos CBP. Específicamente, se conoce que el hidrógeno es un inhibidor de retroalimentación de la hidrólisis de celulosa, en tanto que los ácidos orgánicos conducen rápidamente a acidificación del medio, disminuyendo de este modo la fortaleza de crecimiento y los rendimientos de fermentación.

La remoción de los ácidos orgánicos ayudó a dar soporte al crecimiento de Gsu y producción de corriente y también impidió la acidificación del medio. En cultivos de control con Cuda y AFEX-CS solos, el pH cayó a 5.5 pero permaneció cerca a neutral en la MFC con los co-cultivos o con Gsu solo. Como resultado de la estabilidad del pH, se espera que se incremente la viabilidad celular y los rendimientos de etanol .

Mejora de la Cepa para Desempeño Incrementado También se investigó el uso de planteamientos de ingeniería genética para manipulación de la naturaleza de las capacidades metabólicas de los compañeros de consorcio. Estos planteamientos se pueden usar potencialmente para personalizar el esquema de bioprocesamiento y para controlar las relaciones de biocombustible y electricidad producidas usando esta plataforma. Para lograr esto, se obtuvo un mutante de Gsu que tiene una supresión en los genes que codifica para la hidrogenasa de captación Hyb de Gsu (más adelante en la presente llamado Gsu Hyb) a partir de Dr. Coppi 1 s Laboratory (University of Massachusetts , Amherst) y se probó en co-cultivo con Cuda usando AFEX-CS como substrato para Cuda y fumarato como aceptador de electrones terminal para Gsu Hyb. Los controles con co-cultivos de Cuda y Gsu genéticamente alterados se usaron para comparación.

Se determinó que el hidrógeno, aun cuando está presente a muy bajos niveles o muy baja concentración (es decir, menos de 1 mM) se usa preferencialmente como un donador de electrones por biopelículas de ánodo de Gsu durante la producción de electricidad. Una molécula de H2 proporciona 2 electrones para la generación de energía en tanto que el acetato proporciona 8. De estas manera, se tiene como hipótesis que el crecimiento de Gsu e indirectamente la generación de electricidad se pueden incrementar cuando se co-cultiva un mutante de Gsu incapaz de usar H2 como un donador de electrones pero capaz de otro modo de usar ácidos orgánicos .

Como los muestran las barras 804 en la Figura 8, aunque Cuda ("A") produce bajos niveles de H2 durante la fermentación, se observó un incremento de aproximadamente 1.2 veces en el crecimiento de la cepa mutante Gsu Hyb ("B") en el consorcio con Cuda. Los rendimientos de etanol (802) permanecieron sustancialmente igual, sin embargo. Estos resultados demuestran que es posible manejar genéticamente Gsu para manipular la naturaleza de la interacción metabólica, por ejemplo, transferencia interespecie de ácidos orgánicos, incluyendo con transferencia interespecie de H2, entre los compañeros del consorcio para incrementar la salida energética total del sistema.

Tomados conjuntamente, estos resultados demuestra que las celdas de combustible activadas por un electricígeno y un organismo CBP se pueden usar de manera efectiva como plataformas par la producción de etanol celulósico.

Procedimiento El potencial del electrodo de ánodo (de trabajo) se controló por el potenciostato, que se conectó mediante alambres (por ejemplo, 213A, 213B y 213C) y una pinza de conexión al electrodo de ánodo, el electrodo de ánodo, al electrodo de cátodo y el electrodo de referencia (por ejemplo, 206, 207 y 216, respectivamente) . El potenciostato se conectó a una computadora PC equipada con el software EC-lab (Biol-Logic EUA) , que permitió el monitoreo en tiempo real de la corriente producida en el electrodo de ánodo 202. El potenciostato 216 tiene cuatro tableros potenciostáticos/galvanostáticos de modo que se pueden correr simultáneamente cuatro celdas electroquímicas 118.

En tanto que estaba corriendo el experimento, se rociaron continuamente las cámaras de ánodo y cátodo con gases anaeróbicos al conectar líneas de distribución de gas (Norprene tubing, Colé Parmer) a un adaptador terminal de manguera Luer Lok (Fisher Scientific) y luego a una aguja 214 calibre 23 (Bencton Dickinson) . Se colocaron filtros de jeringa estériles de 0.22 um (Fisher Scientific) entre el adaptador de manguera Luer Lok y la aguja para esterilizar los gases. Se insertaron agujas (por ejemplo, 223A y 223B) a través de los tapones septo de los orificios de rociado (por ejemplo, 222A y 222B) .

Se adicionaron salidas de gas, por ejemplo, 220A y 220B, a las cámaras de ánodo y cátodo para liberar el C02 (producido durante la conversión de ácido orgánicos de electricidad por el electricígeno) y el H2 (producido de la reacción electroquímica de electrones y protones en el cátodo), respectivamente, así como cualquier gas (N2 y C02) usado para rociar el medio de crecimiento (por ejemplo, 208). Las salidas de gas se construyeron usando cánulas metálicas de 12 cm (Popper) , que se colocaron a través de los tapones (por ejemplo, 218A y 218B) que sellaron las aberturas superiores de las cámaras de ánodo y cátodo. La parte superior de las salidas de gas (es decir, las cánulas) se unieron cada una a una llave de paso unidireccional macho a hembra (Fisher Scientific) para abrir o cerrar las respectivas salidas de gas conforme se necesite.

También se logró la agitación con barras de agitación ortogonales de 1/2 de pulgada por 1/8 de pulgada (1.277 cm x 0.32 cm) (Fisher Scientific), que se colocaron en las cámaras de ánodo y cátodo, al colocar las cámaras en una placa de agitación de 10 posiciones (Fisher Scientific, IKAMAG) .

Los experimentos de celdas electroquímicas se corrieron en la incubadora (descritos en el Ejemplo 1) de modo que la temperatura se puede controlar para soportar el crecimiento del consorcio microbiano. El consorcio de Cuda/Gsu usado en esta prueba se incubó a 30 °C.

La celda electroquímica, ajustada como se describe anteriormente, pero sin el electrodo de referencia ni el medio, se sometió a autoclave para esterilizarla. El electrodo de referencia entonces se esterilizó por inmersión por etanol al 70%, se dejó secar y se adicionó asépticamente a la cámara de ánodo. Se adicionaron 90mL de medio DB anaeróbico (preparado como se describe en el Ejemplo 2) asépticamente a las cámaras de ánodo 204 y de cátodo 208 (aquí llamado medio DB) . Se adicionó acetato (1 mM) a la cámara de ánodo 204 para iniciar el crecimiento del electricígeno 120. Las celdas electroquímicas se incuban a 30°C y se rocían con mezcla de gas anaeróbico (N2:C02, 80:20) para amortiguar el pH del media 7. La agitación se inició a 500 rpm.

Se cultivó un electricígeno 120 como una película del electrodo de ánodo 208 colocado en la cámara de ánodo 202. El electrodo de ánodo 202 se puso en equilibrio en el potencial deseado (un potencial de ánodo de +0.24V se usó para producir un sistema ilimitado de cátodos) con respecto al electrodo de referencia de Ag/AgCl 214 usando un potenciostato 212. De esta manera, se usó un sistema ilimitado de cátodo para resultados controlados y reproducibles . El sistema se dejó llegar al equilibrio durante un mínimo de aproximadamente dos horas .

El electricígeno 120 (Gsu) se subcultivó a aproximadamente 30°C en 100 mi de medio DB anaeróbico estándar complementado con la concentración deseada de donador de electrones (por ejemplo acetato 10-30 mM) y aceptador de electrones (por ejemplo, fumarato 40-50 mM) . Las células de 36 mi (o 40% del volumen de la cámara de ánodo 204) de cultivos de fase estacionaria temprana (por ejemplo, aquellos que han cesado el crecimiento exponencial) del electricígeno 120 Gsu se recolectaron por centrifugación (6,000 rpm, 8 min, rotor fijo, 25°C) , se lavaron una vez con medio DB sin acetato ni fumarato, y se resuspendieron en medio DB. Las células entonces se inyectaron asépticamente en la cámara de ánodo 204 con una jeringa y una aguja y a través del orificio de septo de brazo lateral 222. Se removieron periódicamente muestras del medio en la cámara de ánodo 204 con una jeringa y una aguja y a través del orificio de septo de brazo lateral 222 para análisis por HPLC de ácidos orgánicos y azúcares.

Se inició la producción de corriente después de aproximadamente 12-18 horas que han transcurrido desde el inicio del experimento al adicionar aproximadamente uno (1) mM de acetato como el donador de electrones . La corriente se incrementó exponencialmente en las siguientes 24-48 horas hasta que sustancialmente todo el acetato se usó por el electricígeno 120. Se determinó la generación de corriente como que está directamente relacionada al crecimiento del electricígeno como una película en el electrodo de ánodo 202. En los ejemplos presentados aquí, sustancialmente todo el acetato se consumió en 40-48 horas después de que se inició la corriente medible y fue aparente visualmente una película electricigénica naranja 120 en el electrodo de ánodo 202. Una vez que se usó el acetato, declinó abruptamente la corriente.

El organismo CBP y el AFEX-CS se adicionaron a la cámara de ánodo una vez que la corriente alcanzó cero (0) mA. Ejemplo 4 El equipo y materiales de inicio como se describe en los ejemplos anteriores se usaron en el presente. Las Figuras 9-13T muestras como se afectan las eficiencias de conversión y los rendimientos de corriente dependiendo del tipo de procedimiento usado de inoculación.

Inoculación Secuencial En un experimento, se adicionó un organismo CBP (Cuda) a una película de un electricígeno (Gsu) (que se pre-cultivó en el electrodo de ánodo con acetato 1 mM) a lo máximo de la producción de corriente, durante la declinación de la corriente una vez que se ha usado todo el acetato, o cuando la corriente cesó (0 mA) , como se muestra en la Figura 9. Se usó rociado para facilitar el mezclado en tanto que el electricígeno estaba formando una película en el ánodo. Una vez que se adicionó el organismo CBP, se cerraron los orificios de rociado y de salida de la cámara de ánodo.

En los experimentos mostrados en la Figura 9 se alcanzaron rendimientos de etanol en el intervalo de 40-50% y rendimientos de conversión de subproductos de fermentación en electricidad en el intervalo de 8-13% de los rendimientos máximos teóricos, respectivamente, después de 24, 26, y 22 horas de inoculación con los insolubles y el organismo CBP. Esto contrasta con los rendimientos de etanol de más de 80% alcanzados cuando se mantuvo el rociado a todo lo largo del experimento, como se muestra en la Figura 8, para evaporar el etanol producido por el organismo CBP y reducir al mínimo sustancialmente la inhibición de crecimiento del organismo CBP debido a la acumulación de etanol.

Estos resultados muestran que los biocatalizadores , tal como C. uda y el AFEX-CS, se pueden adicionar secuencialmente en cualquier momento dado durante la producción de corriente por el electricígeno . En este ejemplo, se mostró la recuperación de corriente cuando se adicionaron AFEX-CS y C. uda en varios momentos, cuando Gsu está en su máxima corriente ("a lo máximo", línea punteada) cuando está a la mitad en la declinación ("en declinación", doble línea) y cuando la corriente ha alcanzado cero mA ("en corriente 0", línea negra gruesa) . (Ver la Figura 9) .

Estos resultados también muestran que se espera la mejora de la tolerancia a etanol del organismo CBP para incrementar sustancialmente los rendimientos de etanol a niveles de más de 80% del teórico máximo.

Inoculación Sustancialmente Simultánea En este experimento, se adicionaron de manera sustancialmente simultánea los biocatalizadores (Cuda y Gsu) , conjuntamente con los insolubles (AFEX-CS) en la cámara de ánodo. Se adicionó uno (1) mM de acetato a uno de los inóculos para poner en marcha el crecimiento de Gsu. Se mantuvo el rociado a todo lo largo del experimento para evaporar el etanol y para promover el crecimiento del electricígeno en el electrodo de ánodo.

Como se muestra en la Figura 10, la generación de corriente empezó después de 2-4 horas de incubación y se incrementa exponencialmente después de 9-14 horas en cultivos con o sin complementación de acetato, respectivamente. Se alcanzan corrientes máximas después de 40-46 h en ambos experimentos .

La Figura 11 muestra la eficiencia etanologénica de los organismos probados en la Figura 10, que son de al menos aproximadamente 80% del rendimiento máximo teórico, con todos los subproductos de fermentación (acetato, formiato, lactato y H2) que se han convertido en electricidad. Esto es en contraste a la eficiencia etanologénica de controles de Cuda sola, como se muestra en la Figura 11, que produjo menos de 40% del rendimiento teórico máximo.

La Figura 12 es una gráfica de barras que muestra la eficiencia de conversión de subproductos de fermentación en electricidad para las inoculaciones secuenciales y simultáneas de las Figuras 9 y 10, respectivamente, en las modalidades de la presente invención.

La Figura 13 es una gráfica de barras que muestra los rendimientos máximos de corriente para las inoculaciones secuenciales y simultáneas de las Figuras 9 y 10, respectivamente, en las modalidades de la presente invención.

Estos resultados muestran que la adición simultánea de los biocatalizadores no afecta las eficiencias de conversión. Adicionalmente , la complementación acetato permitió que Gsu genere corriente más rápidamente y se incrementen los rendimientos de corriente. La adición de los componentes de forma simultánea también reduce al mínimo las interrupciones de la reacción de bioprocesamiento y reduce los costos asociados con el ajuste de bioreactor.

Conclusiones Como lo muestra Las Figuras 9-13, la inoculación simultánea tiene una mayor eficiencia en la conversión de subproductos de fermentación en electricidad en comparación a la inoculación secuencial, pero fue un proceso más lento (velocidades reducidas por día) . La adición de acetato es ligeramente menos eficiente pero más rápida. De esta manera, se pueden usar estrategias de inoculación para personalizar los rendimientos y velocidades de generación de electricidad.

La inoculación en el punto medio de la declinación de la corriente parece ser óptima para ambos parámetros cuando se usa inoculación secuencial.

Ejemplo 5 Identificación de un Catalizador Microbiano que Fermenta glicerol Se seleccionó la bacteria Gram-positiva, Clostridia, (de la colección de cultivos identificar en el Ejemplo 1) para el uso en la fermentación etanologénica de glicerol. Los cultivos se complementaron con extracto de levadura al 0.6% para imitar el contenido reportado de azúcar del agua residual de biodiesel, que también contribuye al metabolismo termentador, a la etanologénesis , y a la generación de subproductos de fermentación.

Entre las más de 10 especies probadas, solo C. cellobioparum (Cce) creció bien, consumió sustancialmente todo el glicerol (0.25% (p/v) de la solución y fermentó a etanol, acetato, lactato y formiato y H2. Ver Figuras 15A y 15B. El etanol fue el producto principal de fermentación (aproximadamente 40% del rendimiento máximo teórico) y no se produjo en el mismo medio sin glicerol, confirmando de este modo que es produjo de la fermentación de glicerol. Los rendimientos y velocidades de crecimiento de Cce fueron naturalmente fuertes, sugiriendo que este organismo se ajusta de forma natural para el crecimiento fermentativo y etanologénesis de glicerol. También produjo sólo subproductos de fermentación que pueden servir como donadores de electrones para el electricígeno G. sulfurreducens (Gsu) . Por esta razón, se seleccionó Cce como el catalizador fermentable para la plataforma microbiana.

Estimulación de Fermentación de Glicerol en el Co-cultivo La remoción de H2 y ácidos orgánicos durante el co-cultivo de Cce con Gsu estimuló en su mayor parte el crecimiento fermentable como se muestra en la Figura 15A. Se removieron el acetato, formiato y H2 por Gsu al proporcionar fumarato como un aceptador de electrones. Sin embargo, el lactato permaneció en el caldo de fermentación. Como resultado, la acumulación de lactato hizo caer el pH del caldo de fermentación a 6.3, que también afectó de forma negativa el crecimiento de Gsu y Cce.

Mejora de Cepa por Evolución Adaptable También se probó la tolerancia a glicerol de los catalizadores microbianos, con los resultados mostrados en las Figuras 16A-16C. El catalizador fermentable, Cce, creció con hasta 7% (p/v) de glicerol en tanto que mantiene velocidades de crecimiento de al menos 75% de lo máximo (Figura 16A) . Después de pasadas sucesivas con concentraciones crecientes de glicerol, se produjo una cepa tolerante al alcohol de Cce (CceA) adaptada para el crecimiento con 10% de glicerol (Figura 16B) . El crecimiento del compañero electrogénico, Gsu, se inhibió en glicerol al 7% tanto en el monocultivo como en el o-cultivo (Figura 16A) .

Se mejoró la fortaleza de Gsu al seleccionar variantes que crecen con concentraciones inhibitorias (1%) de etanol (Figura 16C) . Después de seis meses de pasadas sucesivas a concentraciones crecientes de etanol, se aisló una cepa de Gsu (GsuA) tolerante al alcohol, que toleró 4% de etanol (Figura 16C) . GsuA también incrementó su tolerancia a glicerol a 10% de glicerol tanto en monocultivo como en el co-cultivo de CceA (Figura 16B) .

A pesar de la tolerancia mejorada a glicerol en CceA, el consumo de glicerol alcanzó una meseta una vez que la producción de etanol alcanzó niveles de aproximadamente 0.5%. Por lo tanto, se investigó la tolerancia al alcohol de CceA. Se confirmó la sensibilidad de la cepa a concentraciones de etanol en este intervalo (Figura 16C) .

Acoplamiento de fermentación de glicerol a producción de corriente en una BEC.

El acoplamiento de la fermentación de glicerol y la etanologénesis a la producción de corrientes se demostró en una BEC activada por el co-cultivo de CceA-GsuA. Para estos experimentos, se incubó GsuA a 30°C en la cámara de ánodo de una MFC, tipo H, de doble cámara, anóxica, equipada con electrodos de varilla de grafito puestas en equilibrio a un potencial constante de 240 mV. Este sistema anóxico puesto en equilibrio mantuvo consistencia entre las diferentes celdas de combustible, removió cualquier limitación potencial que resulta de la transferencia de electrones en el cátodo, y eliminó la posibilidad de intrusión de oxígeno en la cámara de ánodo que puede soportar el crecimiento aeróbico.

Cuando se adicionó acetato 1 mM al medio en la cámara de ánodo, la corriente se incrementó rápidamente a aproximadamente 1 mA y luego declinó conforme se agotó el acetato (Figura 17) . La eficiencia culombiana de GsuA fue comparable a Gsu (89.8 ± 3.3%) , demostrando que la evolución de la tolerancia al alcohol no tiene efecto en su actividad electrogénica .

Una vez que declinó la producción de corriente, se adicionó CceA a la cámara de ánodo de GsuA en la ubicación 1702 y se reasumió la producción de corriente (2.8- y 1.4-veces, respectivamente) en las BEC activadas por el c-cultivo de CceA-GsuA, en comparación a los controles de CceA.

Como se observa anteriormente, la producción de etanol alcanzó una meseta una vez que se alcanzaron concentraciones inhibitorias de crecimiento (0.6%) . Aunque se produjo corriente (3.2 + 0.3 mmol de electrones) de los subproductos de fermentación, declinó antes de que se removiera todo el acetato y formiato. Debido a que GsuA creció bien a estas concentraciones de alcohol, es improbable que la remoción ineficiente de donadores de electrones se provocará por la inhibición de etanol (Figura 16C) . Sin embargo, el lactato también se acumuló en el caldo de BEC y acidificó el medio (pH final de 5.5). En realidad, la eficiencia electrogénica de GsuA declinó una vez que el pH empezó a caer por abajo de 6. Estos resultados demuestran que se pueden usar BEC para estimular a fermentación de glicerol en tanto que se genera etanol y corriente.

Conclusión Varía la composición de la glicerina cruda, 80% concentrada, final. Ver, por ejemplo, Suehara, K. ét al. Biological treatment of wastewater discharged from biodiesel fuel production plant with alkali-catalyzed transesterification. J". Biosci . Bioeng. 100, 437-442, doi :S1389-1723 (05) 70489-8 [pii] 10.1263/jbb .100.437 (2005) y Williams, P. R., Inman, D., Aden, A. & Heath, G. A. Environmental and sustainability factors associated with next-generation biocombustibles in the U.S.: what do we really know? Environ. Sci . Technol . 43, 4763-4775 (2009), ambos de los cuales se incorporan en la présente como referencia. En base a estos informes, se hicieron cálculos entendidos por los expertos en la técnica para determinar el contenido de glicerol y alcohol en el agua residual de glicerina (después del pre-tratamiento ácido para remover aceite y precipitar el jabón y sales). Estos cálculos mostraron que el agua residual de glicerina contiene probablemente cerca de 10 a aproximadamente 20% de glicerol y de aproximadamente 2 a aproximadamente 6% de alcohol. Estos valores están dentro de los intervalos reportador para las soluciones diglicerol natural tratadas en laboratorio derivadas de arias plantas de biodiesel . Ver, por ejemplo, Moon, C, Ahn, J. H. , Kim, S. W. , Sang, B. I. & Um, Y. Effect of biodiesel -derived raw glycerol on 1 , 3 -propanediol production by different microorganisms . Appl . Biochem. Biotechnol. 161, 502-510, doi : 10.1007/sl2010-009-8859-6 (2010) , que se incorpora en la presente como referencia. Como tal, estos valores proporcionan confirmación que se ha alcanzado el objetivo de alcohol mínimo para GsuA y el objetivo de glicerol para ambas cepas.

La evolución adaptable de los catalizadores para mejorar su tolerancia al alcohol se espera que mejore adicionalmente el desempeño. Como se muestra en este ejemplo, la cepa de Gsu tolerante al alcohol, llamada GsuA, se desarrolló y creció en la presencia de 4% (v/v) de etanol y toleró cargas de 10% de glicerol. Se espera que el desempeño del catalizador se pueda mejorar aun adicionalmente mediante evolución adaptable y/o ingeniería genética para mejorar adicionalmente las tolerancias al alcohol y a glicerol. También se espera que estos planteamientos co-desarrollen productividad de glicerol y rendimientos de etanol.

Ejemplo 6 Los cultivos del Ejemplo 5 se transfirieron a la fase estacionaria, cuando se expresa la ADN-Polimerasa IV propensa a error y resalta la proporción de mutación. Ver, por ejemplo, Tompkins, J. D. et al. Error-prone polymerase, DNA polymerase IV, is responsible for transient hypermutation during adaptive mutation in Escherichia coli. J. Bacteriol. 185, 3469-3472 (2003), que se incorpora en la presente como referencia. La transferencia durante esta fase incrementa el potencial para que surjan variantes mutantes y acelerar un proceso de otro modo lento.

Se transfirió Gsu de esta manera a mayores concentraciones de etanol y se han demostrado variantes que crecen con 4.5% de etanol. De esta manera, se espera que este planteamiento sea efectivo para alcanzar una concentración industrial objetivo de 6% en agua residual de glicerina o superior .

Ejemplo 7 Se transfirió CceA de esta manera a mayores concentraciones de etanol y se han mostrado variantes que crecen con 2% de etanol.

Estos resultados sugieren que el planteamiento que se usa es rápido y efectivo. Puesto que la sensibilidad a etanol limitó la fermentación en glicerol por CceA, también se espera que la tolerancia al alcohol incremente la fortaleza de fermentación y rendimientos de etanol de 10% (p/v) de glicerol.

Ejemplo 8 (Profético) La hipótesis señalada en el Ejemplo 7 se monitorizará al cultivar periódicamente las variantes tolerantes al alcohol en cultivos con 10% de glicerol y midiendo el consumo de glicerol y la producción de etanol en el caldo de fermentación.

Ejemplo 9 (Profético) Se monitorizará el crecimiento de los cultivos transferidos (tal como Gsu en el Ejemplo 6 y CceA en el Ejemplo 7) como densidad óptica de los cultivos a 660 nm usando un espectrofotómetro . Una vez que se observa el crecimiento a una concentración objetivo de alcohol, los cultivos se mantendrán a través de varias pasadas a la misma concentración de etanol hasta que las velocidades de crecimiento y rendimientos regresen a los niveles nativos, sin cambio o hasta que se estabilicen.

En este punto, las alícuotas de cultivos que contienen las variantes adaptadas se colocarán en placa para aislar colonias individuales, que corresponden a variantes clónales. Se inoculará aproximadamente 10 colonias en medio líquido fresco con etanol para identificar las variantes que crecen más rápido. Después de pasadas repetidas en la fase exponencial, se enriquecen los que crecen rápido se conservarán anaeróbicamente a menos 80°C en sulfóxido de dimetilo (DIVISO) . La variante con las mejores velocidades de crecimiento y rendimiento se transferirá al siguiente incremento de concentración (0.5%) para iniciar una nueva ronda de evolución. El experimento terminará cuando no surjan por más tiempo variantes. Se espera lograr concentraciones de etanol en o por arriba del objetivo del 6%.

Ejemplo 10 (profético) La prueba adicional incluirá la prueba de cargas sólidas industriales (por arriba de 2%) , de otras combinaciones de electricígeno y organismos CBP, mejora de cepa a través de ingeniería genética y evolución adaptable, prueba de otros substratos, y producción de biocombustibles diferentes de etanol.

Conclusión Las modalidades descritas anteriormente proporcionan una tecnología de bioprocesamiento consolidado, económicamente y ambientalmente superior para la producción de etanol y energía eléctrica a partir de substratos en una celda bioelectroquímica, tal como una celda de combustible microbiana, en comparación al bioprocesamiento consolidado microbianamente catalizado, convencional. En base a las estimaciones de corriente, se espera que el bioprocesamiento CBP reduzca el costo de etanol celulósico tanto como por 51%, y proporcione rendimientos de etanol cercanos a 90% (o más de los rendimientos teóricos máximos, en tanto que la co-fermentación tanto de glucosa como de xilosa se espera que reduzca el costo final de combustible por al menos seis (6) por ciento adicional. Se espera que el procesamiento CBP reduzca el costo del biodiesel y proporcione rendimientos similares de etanol, en tanto que se espera que la co-fermentación tanto de glucosa como de xilosa deduzca el costo final por al menos un seis (6) por ciento adicional.

En una modalidad, se produce un rendimiento máximo de etanol por arriba de 80% y una co- fermentación sustancialmente completa de azúcares de 6 y 5 carbonos en tanto que se produce electricidad como un producto del valor agregado. En una modalidad, se integran estrategias de diversificación y procesamiento de materias primas en una fermentación de un paso, con la remoción de productos inhibitorios sin valor para la co-generación de energía. En una modalidad, se utiliza la mejora de las cepas por ingeniería genética y evolución directa.

En una modalidad, se puede usar un sistema de bioreactor electroquímico de cámara individual para la producción de biocombustible , que se puede construir usando termentadores y bioreactores comercialmente disponibles.

Diferente de los métodos convencionales, las modalidades descritas en la presente desacoplan la producción bioenergética del suministro de alimento y reducen los costos de procesamiento a través del uso de substratos de lignocelulosa de bajo costo, hidrólisis y fermentación en un paso, y conversión de subproductos de fermentación de bajo valor en electricidad. En una modalidad, las conversiones toman lugar en un recipiente o bioreactor individual, reduciendo de este modo los costos asociados con las separaciones químicas de productos de fermentación y el desarrollo de unidades secundarias de procesamiento.

Las modalidades descritas en la presente, que generan directamente electricidad y/o etanol a partir de agua que contiene glicerina, tal como una corriente de glicerina del producto de biodiesel, proporcionan una alternativa barata a la refinación de agua residual de glicerina. El proceso no sólo proporciona el tratamiento del agua residual de glicerina, sino también genera biocombustible y energía que se pueden vender, transportar o usar en la instalación de producción de biodiesel.

Las modalidades descritas en la presente proporcionan una tecnología de bioprocesamiento consolidado competitivo para la producción de biocombustible y energía eléctrica en una celda de combustible microbiana o una celda electroquímica. Los nuevos procesos descritos en la presente integran estrategias de diversificación y procesamiento de materias primas, hidrólisis y fermentación en un paso, el uso de subproductos de fermentación para la generación de electricidad, y mejora de cepas de microrganismos a través de ingeniería genética y evolución directa.

En una modalidad, los nuevos sistemas y métodos descritos en la presente se personalizan para otros tipos de biomasa y/o otros tipos de biocombustible, al seleccionar un organismo CBP particular y compañero electricigénico . En una modalidad, se usa ingeniería genética y evoluciona adaptable de estos compañeros bacterianos para modular los rendimientos y velocidades de producción de electricidad y biocombustible.

Aunque se han ilustrado y descrito en las presentes modalidades específicas, a apreciar por los expertos en técnica que cualquier procedimiento que se calcula que logre el mismo propósito se puede sustituir por las modalidades específicas mostradas. Se propone que esta solicitud cubra cualquiera de las adaptaciones o variaciones de la presente materia. Por ejemplo, aunque los subproductos de fermentación se han descrito como que incluyen ácidos principalmente orgánicos y/o principalmente hidrógeno, se va a entender que también pueden ser útiles en la presente otros subproductos de fermentación, por lo tanto, se propone de forma manifiesta que las modalidades de esta invención se limiten solo por las reivindicaciones y equivalentes de la misma.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una celda de combustible, caracterizada porque comprende : un electrodo de ánodo, un electrodo de cátodo y un electrodo de referencia conectados electrónicamente entre sí; un primer biocatalizador que comprende un organismo bioprocesador consolidado capaz de fermentar biomasa para producir un subproducto de ferment ción; y un segundo biocatalizador que comprende un electricígeno capaz de transferir sustancialmente todos los electrones en el subproducto de fermentación al electrodo de ánodo para producir electricidad.

2. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la biomasa es biomasa celulósica .

3. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la biomasa es un poliol .

4. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el poliol es agua que contiene glicerina.

5. La celda de combustible de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque además comprende : una membrana de intercambio capaz de transferir electrones y protones; y un dispositivo electrónico conectado al electrodo de ánodo, el electrodo cátodo y el electrodo de referencia.

6. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el electrodo de ánodo, el electrodo de cátodo y el electrodo de referencia están localizados en una cámara individual.

7. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el electrodo de ánodo y el electrodo de referencia están localizados en una primera cámara y el electrodo de cátodo está localizado en una segunda cámara .

8. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el organismo bioprocesador consolidado comprende uno o más Celulomonas .

9. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque al menos una de la una o más Celulomonas es Celulomonas uda (C. uda) , Clostridium o una cepa relacionada a Clostridium.

10. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la cepa relacionada a Clostridium es C. lentocellum o Acetivibrio cellulolyticus .

11. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque al menos una de la una o más Celulomonas es A. cellulolyticus , C. cellobioparum (Cce) o una combinación de los mismos.

12. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el Cce es una cepa de Cce tolerante a glicerol o alcohol o una combinación de los mismos .

13. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque al menos una de la una o más Celulomonas es una Celulomona tolerante al alcohol .

14. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el electricígeno es Geobacter sulfurreducens.

15. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el subproducto de fermentación incluye hidrógeno, uno o más ácidos orgánicos o una combinación de los mismos.

16. La celda de combustible de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el subproducto de la fermentación es principalmente hidrógeno.

17. Un sistema, caracterizado porque comprende: una instalación de producción de biocombustible configurada para producir un biocombustible y una corriente residual de biomasa, en donde el biocombustible se produce de la biomasa; y un sistema de celda de combustible configurado para producir alcohol y electricidad de la corriente residual de biomasa, el sistema de celda de combustible que comprende: un electrodo de ánodo, un electrodo de cátodo y un electrodo de referencia conectado electrónicamente entre sí; un primer biocatalizador que comprende un organismo bioprocesador consolidado capaz de fermentar biomasa para producir un subproducto de fermentación; y un segundo biocatalizador que comprende un electricígeno capaz de transferir sustancialmente todos los electrones en el subproducto de fermentación hacia el electrodo de ánodo para producir electricidad.

18. El sistema de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la instalación de producción de biocombustible es una instalación de producción de biodiesel y el agua residual de biomasa es una corriente residual de biomasa que contiene glicerina.

19. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, caracterizado porque además comprende un sistema de computadora conectado a la celda de combustible para monitorizar y controlar la actividad de la celda de combustible.

20. El sistema de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el electrodo de ánodo, el electrodo de cátodo y el electrodo de referencia están localizados en una cámara.

21. Un método, caracterizado porque comprende: un paso consolidado de hidrólisis y fermentación para convertir una biomasa a un biocombustible con un primer organismo en una cámara de ánodo, en donde el reactor de ánodo contiene un electrodo de ánodo y el paso de conversión produce un subproducto de fermentación; transferir electrones en el subproducto al electrodo de ánodo con un segundo organismo para producir una película; y permitir que la película divida catalíticamente los electrones y protones, en donde los electrones fluyen hacia un electrodo de cátodo para producir electricidad y los protones permean una membrana de intercambio protónico que conecta la cámara de ánodo y la cámara del cátodo, en donde los electrones y protones reaccionan para producir gas hidrógeno .

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el segundo organismo es G. sulfurreducens.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primero y segundo organismos se adicionan secuencialmente .

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primero y segundo organismos se adicionan de manera sustancialmente simultánea.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque además comprende aplicar un potencial al electrodo de ánodo.

26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primer organismo comprende una o más Celulomonas.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque el biocombustible es etanol .

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque el biocombustible es combustible de biodiesel .

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque la biomasa es una biomasa no alimenticia.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la biomasa no alimenticia es rastrojo de maíz.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la biomasa no alimenticia es agua que contiene glicerina.