MX2012010652A - Fragmentos de la subunidad pa de rna polimerasa dependiente de rna del virus pandemico h1n1 2009 de influenza a y su uso. - Google Patents

Fragmentos de la subunidad pa de rna polimerasa dependiente de rna del virus pandemico h1n1 2009 de influenza a y su uso.

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Abstract

La Presente invención se refiere a fragmentos de polipéptido que comprenden un fragmento amino-terminal de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA viral que posee actividad de endonucleasa, en donde la subunidad PA es de virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o es una variante del mismo. Esta invención también se refiere a (i) cristales de los fragmentos de polipéptido que son adecuados para la determinación estructural de los fragmentos de polipéptido que usan cristalografía de rayos X y(ii) métodos computacionales que usan las coordenadas estructurales del polipéptido para clasificar y diseñar compuestos que modulan, de manera preferente inhiben el sitio endonucleolíticamente activo dentro del fragmento de polipéptido. Además, esta invención se refiere a métodos para identificar compuestos que se enlazan a los fragmentos de polipéptido PA que poseen actividad de endonucleasa e inhiben de manera preferente la actividad endonucleolítica, de manera preferente en un entorno de alto rendimiento. Esta invención también se refiere a compuestos que son capaces de modular, de manera preferente de inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de subunidad PA o variante del mismo de la presente invención y composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos para el tratamiento de condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la de la familia Arenviridae, provocadas de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A. De manera preferente, los compuestos son identificables por los métodos dados a conocer en este documento o las composiciones farmacéuticas son producibles por los métodos dados a conocer en este documento.

Description

FRAGMENTOS DE LA SUBUNIDAD PA DE RNA POLIMERASA DEPENDIENTE DE RNA DEL VIRUS PANDEMICO H1N1 2009 DE INFLUENZA A Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a fragmentos de polipéptido que comprenden un fragmento amino-terminal de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA viral que posee actividad de endonucleasa, en donde la subunidad PA es del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o es una variante del mismo. Esta .invención también se refiere a (i) cristales de los fragmentos de polipéptido que son adecuados para la determinación estructural de los fragmentos de polipéptido que usan cristalografía de rayos X y (ii) métodos computacionales que usan las coordenadas estructurales del polipéptido para clasificar y diseñar compuestos que modulan, de manera preferente inhiben el sitio endonucleolíticamente activo dentro del fragmento de polipéptido. Además, esta invención se refiere a métodos para identificar compuestos que se enlazan a los fragmentos de polipéptido PA que poseen actividad de endonucleasa e inhiben de manera preferente la actividad endonucleolítica, de manera preferente en un entorno de alto . rendimiento. Esta invención también se refiere a compuestos que son capaces de modular, de manera preferente de inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de subunidad PA o variante del mismo de la presente invención y composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos para el tratamiento de condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocadas de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A. De manera preferente, los compuestos son identificables por los métodos dados a conocer en- este documento o las composiciones . farmacéuticas que son producibles por los métodos dados a conocer en este documento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La influenza ' es responsable de mucha morbilidad y mortalidad en el mundo y es considerada por muchos como perteneciente a las amenazas virales más significativas a los humanos. Las epidemias de Influenza Anuales se extienden en el mundo y nuevas cepas virulentas ocasionales provocan pandemias de mayor poder destructivo. Actualmente el medio primario para controlar epidemias de virus de influenza es la vacunación. Sin embargo, los virus de influenza mutantes se generan rápidamente los cuales escapan a los efectos de la vacunación. Debido al hecho de que toma aproximadamente 6 meses generar una nueva vacuna de influenza, los medios terapéuticos alternativos, es decir, medicación antiviral, son requeridos especialmente como la primera linea de defensa contra una pandemia que se extiende rápidamente.
Un excelente punto de partida para el desarrollo de una medicación antiviral son los datos estructurales de las proteínas virales esenciales. De esta manera, la determinación de la estructura cristalina de la neuraminidasa del antígeno de superficie del virus de Influenza (von Itzstein y colaboradores, 1993, Nature 363:418-423) condujo directamente al desarrollo de inhibidores de neuraminidasa con actividad antiviral que previene la liberación del virus de las células, sin embargo, no la producción de virus. Estos y sus derivados se han desarrollado subsecuentemente en los fármacos anti-Influenza, zanamivir (Glaxo) y oseltamivir (Roche) , que están actualmente siendo acopiados por muchos países como una primera línea de defensa contra una pandemia eventual. Sin embargo, estos medicamentos proporcionan solo una reducción en la duración de la enfermedad clínica. Alternativamente, otros compuestos anti-Influenza tales como amantadina y rimantadina fijan como objetivo una proteína de canal iónico, es decir, la proteína M2, en la membrana viral que interfiere con la pérdida de recubrimiento del virus dentro de la célula. Sin embargo, no han sido extensivamente usados debido a sus efectos secundarios y el rápido desarrollo de mutantes de virus resistentes (Magden y colaboradores, 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:612-621) . Además, los fármacos virales más inespecificos, tal como ribavirina, han mostrado que funcionan para el tratamiento de infecciones de Influenza (Eriksson y colaboradores, 1977, Antimicrob. Agents Chemother. 11:946-951). Sin embargo, lá ribavirina se aprueba solamente en pocos países, probablemente debido a graves efectos secundarios (Furuta y colaboradores, 2005, Antimicrob. Agents Chemother. 49:981-986). Claramente, son necesarios nuevos compuestos antivirales, dirigidos de manera preferente contra objetivos diferentes.
El virus de Influenza A, B, C e Isavirus así como también Thogotovirus pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae que, así como también la familia de Bunyaviridae, incluyendo el Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus, Flebovirus, y Tospovirus, son virus de RNA de hebra negativa. Su genoma se segmenta y viene en partículas de · ribonucleoproteína que incluyen la RNA polimerasa dependiente de RNA que lleva a cabo (i) el copiad inicial del RNA virión de hebra individual (vRNA) en los mRNAs virales y (ii) la replicación de vRNA. Para la generación del mRNA viral la polimerasa hace uso del así llamado mecanismo de "secuestro de terminación (cap-snatching)" (Plotch y colaboradores, 1981, Cell 23:847-858; ukkonen y colaboradores, 2005, Arch. Virol. 150:533-556; Leahy y colaboradores, 1997, J. ¦ Virol. 71:8347-8351; Noah y Krug, 2005, Adv. Virus Res. 65: 121-14-5). La polimerasa se compone de tres subunidades: PB1 (proteina básica de polimerasa) , PB2, y PA. Para el mecanismo de secuestro de terminación, la polimerasa viral se enlaza a través de subunidad PB2 a la terminación de RNA 5' de las moléculas de mRNA celulares que se1 escinden en los nucleótidos 10 a 13 por la actividad endonucleolitica de la polimerasa. Los fragmentos de RNA terminado sirven como cebadores para la síntesis de los mRNAs virales por el centro de nucleotidil-transferasa en la subunidad PBl- (Li y colaboradores, 2001, EMBO J. 20:2078-2086). Finalmente, los mRNAs virales se poli-adenilan en el extremo' 3' por el tartamudeo de la polimerasa en un motivo oligo-U en el extremo 5' de la plantilla. Estudios recientes han definido con precisión el dominio estructural de la PB2 responsable por el enlace de terminación (Fechter y colaboradores, 2003, J. Biol. Chem. 278:20381-20388; Guilligay y colaboradores, 2008 Nat . Struct. Mol. Biol. 15:500-506). La actividad endonucleolitica de la polimerasa hasta ahora se ha creído que reside en la subunidad PBl (Li y colaboradores, supra) .
Parece ser que ¦ el complejo de polimerasa es un fármaco diana antiviral apropiado puesto que es esencial para la síntesis de mRNA viral y replicación viral y contiene varios sitios activos funcionales que sean probablemente significativamente diferentes de aquellos encontrados en las proteínas de células hospederas (Magden y colaboradores, supra) . De esta manera, por ejemplo, se han hecho intentos para interferir con el ensamblaje de las subunidad de polimerasa por un péptido. de 25 aminoácidos que se asemeja al dominio de enlace ?? dentro de PB1 (Ghanem y colaboradores, 2007, J. Virol. 81:7801-7804). Por otra parte, se han hecho intentos para interferir con la transcripción viral por análogos de nucleósido, tal como 2' -desoxi-2' -fluoroguanosina (Tisdale y colaboradores, 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:2454-2458) y se ha mostrado que T-705, un compuesto de pirazina sustituido puede funcionar como un inhibidor específico de RNA polimerasa de virus de Influenza (Furuta y colaboradores, supra) . Adicionalmente, la actividad de endonucleasa de la polimerasa se ha fijado como objetivo y se ha identificado una serie de compuestos de ácido 2,4-dioxobutanoico 4-substituido como inhibidores selectivos de selectividad en los virus de Influenza (Tomassini y colaboradores, 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38:2827-2837). Además, la flutimida, 2 , 6-dicetopiperazina sustituida, identificada en los extractos de Delitschia confertaspora, una especie fúngica, ha mostrado que inhibe la endonucleasa del virus de Influenza (Tomassini y colaboradores, 1996, Antimicrob. Agents Chemother. 40:1189-1193). Sin embargo, la acción inhibidora de los compuestos en la actividad endonucleolitica de la polimerasa viral hasta ahora solo se estudió en el contexto del complejo trimérico completo de la polimerasa.
La subunidad ' PA de la polimerasa es funcionalmente la menos bien caracterizada, aunque se ha implicado en tanto el enlace de terminación y la actividad de endonucleasa, la replicación de RNA, y la actividad de proteasa controversial. PA (716 residuos en la Influenza A) se separable tripsinación en el residuo 213. La estructura cristalina recientemente terminada de la C-terminal dos tercios de PA se unen a un péptido N-terminal PB1 con la condición de que la primera visión estructural en tanto una parte grande de la subunidad PA, cuya función, sin embargo, todavía no es clara, y la naturaleza exacta de una de las interacciones de inter-subunidad críticas (He y colaboradores, 2008, Nature 454: 1123-1126; Obayashi y colaboradores, 2008, Nature 454: 1127-1131) . La mutación sistemática de residuos conservados en el dominio amina-terminal de PA ha identificado residuos importantes para la estabilidad de la proteína, el enlace del promotor, enlace de. terminación y actividad de endonucleasa del complejo de polimera.sa (Hará y colaboradores, 2006, J. Virol. 80:7789-7798). La enzimología de la endonucleasa dentro del contexto 'de partículas de ribonucleoproteína virales intactas (RNPs) se ha estudiado extensivamente.
Se ha descubierto recientemente que, contrario a la opinión general en el campo, la actividad endonucleolítica reside exclusivamente dentro de una subunidad PA de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus H3N2 de Influenza A (Dias y colaboradores, 2009) .
Los presentes inventores ahora han logrado caracterizar estructuralmente el dominio PA del virus H1N1 2009 pandémico de Influenza A por cristalografía de rayos X y han identificado el centro activo endonucleolítico dentro del dominio. Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que los fragmentos de polipéptido de la subunidad PA del virus se cristaliza fácilmente y que, de esta manera, los fragmentos de polipéptido son muy adecuados para estudiar la actividad endonucleolítica de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A en el contexto de los fragmentos de polipéptido a fin de simplificar el desarrollo de nuevos compuestos antivirales que fijan como objetivo la actividad de endonucleasa de la ' polimerasa viral así como también de optimizar los compuestos previamente identificados.
El logro de los presentes inventores para producir recombinantemente los fragmentos de polipéptido PA que poseen la actividad endonucleolitica de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A para llevar a cabo una clasificación de alto rendimiento in vitro para inhibidores de un sitio funcional en la polimerasa viral usando material fácilmente obtenible de un sistema de expresión sencillo. Adicionalmente , los datos estructurales del fragmento de polipéptido PA HlNl endonucleolitico asi como también el centro enzimáticamente activo del mismo permite el diseño dirigido de inhibidores y la clasificación in silico para compuestos potencialmente terapéuticos.
Los presentes inventores manejaron adicionalmente, por primera vez, la co-cristalización de un fragmento de polipéptido PA y de una variante del mismo de la subunidad PA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A con un inhibidor de enlace y descubrieron que, de esta manera, el desarrollo de nuevos compuestos antivirales fijaron como objetivo la actividad de endonucleasa de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A se puede mejorar. Particularmente, los datos de co-cristalización muestran, por primera vez, en detalle que los aminoácidos comprendidos en el sitio activo de un fragmento de polipéptido PA de la subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A- se implican especialmente en enlace del compuesto. Este nuevo conocimiento permite el diseño optimizado de modificaciones a inhibidores existentes a fin de mejorar su potencia ' o el diseño y optimización de inhibidores novedosos que bloquean efectivamente la actividad de endonucleasa .
Es un objetivo de la presente invención proporcionar (i) datos- estructurales de alta resolución del dominio amino-terminal endonucleolitico de la subunidad H1N1 PA de polimerasa viral mediante cristalografía de rayos X, (ii) datos estructurales de alta resolución del dominio amino-terminal endonucleolitico de la subunidad H1N1 PA de polimerasa viral co-cristalizada con un inhibidor conocido mediante cristalografía ' de rayos X, (iii) métodos computacionales así como métodos in vitro, de manera preferente en un entorno de alto rendimiento, para identificar compuestos que pueden modular, de manera preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la polimerasa viral del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A, de manera preferente al bloquear el sitio activo endonucleolitico dentro de la subunidad H1N1 PA, y (iv) composiciones farmacológicas que comprenden tales compuestos para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por virus usando el mecanismo de secuestro de terminación para síntesis de mRNA viral.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un fragmento de polipéptido que comprende un fragmento amino-terminal de la- subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA que posee actividad de endonucleasa, en donde ' la subunidad PA es de virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o es una variante de la misma, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácidos 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un fragmento de polipéptido aislado de acuerdo- con la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado de acuerdo con la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula hospedera recombinante que comprende el polinucleótido aislado de acuerdo con la presente invención o el vector recombinante de acuerdo con la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para . identificar compuestos, que modulan la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente ' de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo que comprende las etapas de: (a) construir un modelo de computadora de sitio activo definido por (i) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 1, (ii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 2, (iii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 3, (iv) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con ' la presente invención como se muestra en la Figura 4, (v) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 5, (vi) las coordenadas estructurales del . fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 15, o (vii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 16, (b) seleccionar un compuesto modulador potencial mediante un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) ensamblar fragmentos moleculares en el compuesto, (ii) seleccionar un compüesto de una base de datos de moléculas pequeñas., y (iii) diseñar el ligando de primera vez del compuesto; (c) emplear medios computacionales para llevar a cabo una operación de programa de ajuste entre los modelos de computadora del compuesto y el sitio activo a fin de proporcionar una configuración de energía minimizada del compuesto en el sitio activo; y (d) evaluar los resultados de la operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y el modelo de sitio activo, mediante lo cual evaluar la capacidad del compuesto para asociarse con el sitio activo.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para identificar compuestos, que modulan la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo que comprende las etapas de: (i) poner en contacto el fragmento de polipéptido o variante del mismo de acuerdo con la presente invención o la célula hospedera recombinante de acuerdo con la presente invención con un compuesto de prueba, y (ii) analizar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de subunidad PA o variante del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un compuesto que es capaz de modular, de manera preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de subunidad PA o variante del mismo de acuerdo con la presente invención. De manera preferente, el compuesto es identificable por los métodos (in vitro) de acuerdo con las presentes invenciones.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipiente ( s ) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable. De manera preferente, la composición farmacéutica es producible de acuerdo con los métodos (in vitro) de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra el sitio activo de la subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la presente invención, una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, o un anticuerpo de acuerdo con la presente invención para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la familia Bunyaviridae y/o- familia Arenviridae, provocadas preferentemente por infecciones virales con el virus pandémico Hl-Nl 2009 de Influenza A.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de ' ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1-(fenilmetil) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (E BL-R05-3) , ácido 4- [4- [ ( 4-clorofenil ) metil ] -1- (ciclohexilmetil) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (E BL-R05-2) , ácido 4- [ 3- [ (4-clorofenil ) metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1) , o [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- ( 3 , 4 , 5-trihidroxifenil ) croman-3-il ] 3,4, 5-trihidroxibenzoato (EGCG) para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la presente invención, una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, o un anticuerpo de acuerdo con la presente invención para tratar, mejorar,, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la familia Bunyaviridae y/o la de la familia Arenviridae, provocadas de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a ácido 4- [3- [ (4-clorofenil) metil] -1- (fenilmetil) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-3 ) , ácido 4- [4- [ (4-clorofenil)metil] -1- (ciclohexilmetil) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-bu.tenoico (EMBL-R05-2 ) , ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1) , o [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- (3,4, 5-trihidroxifenil) croman-3-il] 3, , 5-trihidroxibenzoato (EGCG) para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1-5 (anotación común) : Coordenadas estructurales atómicas 'refinadas para los aminoácidos 1 a 198 del fragmento de polipéptido PA de acuerdo con aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 (1 a 198 de PA HIN'l) , con o sin compuesto enlazados. Para cada estructura existen en general cuatro moléculas en la unidad asimétrica cristalográfica (ASU) indicada A, B, C y D. En las Figuras 1 a 5, sin embargo, solo se muestra una molécula seleccionada (véase posteriormente) . El titulo del archivo da información acerca del refinamiento estructural. "Átomo" se refiere al elemento cuyas coordenadas se miden. La primera en la columna define el elemento. Se proporciona el código de tres letras del aminoácido restrictivo y la posición de la secuencia de aminoácidos. Los primeros tres valores en la linea "Átomo" definen la posición atómica del elemento como se mide. El cuarto valor corresponde a la ocupación y el quinto valor (último) es el factor de temperatura (factor B) . El factor de ocupación se refiere a la fracción de las moléculas en las cuales cada átomo ocupa la posición especificada por las coordenadas. Un valor de "1" indica que cada átomo tiene la misma configuración, es decir, la misma posición, y todas las moléculas equivalentes del cristal. B es un factor que mide el movimiento del átomo alrededor de su centro atómico . Está nomenclatura corresponde al formato Protein Data Bank (PDB) .
Figura 1: Coordenadas estructurales del dominio H1N1 PA endonucleasa (es decir sin compuesto/ligando) en el formato de Protein Data Bank (PDB) . Solamente la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir un ion de magnesio y un ion de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad simétrica se incluyen. Las cadenas B, C y D son muy similares.
Figura 2: Coordenadas estructurales del dominio H1N1 PA endonucleasa con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetil) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-3) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar. Solo la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EMBL-R05-3 tiene el descriptor de residuo ci3.
Figura 3: Coordenadas estructurales del dominio H1N1 PA endonucleasa · con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1-( fenilmetil ) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-3) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar. Solo la cadena D (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EMBL-05-03 tiene una configuración diferente que en la cadena A (Figura 2) . El compuesto tiene el descriptor de residuo ci3.
Figura 4: Coordenadas estructurales del dominio H1N1 PA endonucleasa con ácido 4- [4- [ (4-clorofenil)metil] -1-(ciclohexilmetil) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-2) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar. Solo la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones' de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. Las cadenas B, C y D son muy similares. El compuesto EMBL-R05-2 tiene el descriptor de residuo ci2.
Figura 5: Coordenadas estructurales del dominio H1N1 PA endonucleasa con Monofosfato de ribo-Uridina enlazado (rUMP) en formato de Protein Data Bank (PDB) estándar. Solo la cadena A (con ¦ cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. Las cadenas B, C y D son muy similares. El compuesto rUMP tiene el descriptor de residuo U.
Figura 6: El diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 1 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA (cadena A) ) , que muestra los cationes divalentes (un manganeso y un magnesio) y residuos de sitio activo claves.
Figuras 7A-7B: (Fig. 7A) Diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 2 que ilustra el sitio activo de endonucl'easa .(El fragmento de polipéptido PA (cadena A) ) , que muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-3 , los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Arg84) o se acercan a él y (Fig. 7B) Diagrama que compara las coordenadas de la Figura 1 (cadena subyacente en el lado izquierdo) y la Figura 2 que muestra el cambio en la formación del rizo en la vecindad de Tyr24 en el enlace de EMBL-R05-3 (cadena A) . La cadena lateral Tyr24 se mueve para apilarse parcialmente con el clorobenceno de E BL-R05-3.
Figura 8: Diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 3 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA (cadena D) ) , que muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-3, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Arg84) o se acercan a él.
Figura 9: Diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 4 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA (cadena A) ) , que muestra el compuesto enlazado E BL-R05-2, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Phel05) o se acercan a él.
Figura 10: Diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 5 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA (cadena A) ) , que muestra el compuesto enlazado rUMP, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Lys34) o se acercan a él .
Figura 11: Geles PAGE al 15% y perfil de filtración en gel de una purificación típica de H1N1 PA1-198. La flecha indica rastros débiles de MBP residual.
Figura 12: Cristal congelado de H1N1 PA-Nter co-cristalizado con rUMP en el grupo espacial P212121.
Figura 13: Coordinación de iones divalentes en la estructura de endonucleasa nativa.
Figura 14: Densidad electrónica para rUMP y cationes divalentes (manganeso, Mnl y Mn2) en co-cristales con H1N1 PA-Nter. La ' densidad electrónica 2Fo-Fc reinada contorneada a 1.1 o. La densidad electrónica Fo-Fc imparcial contorneada a 2.8 s. Mapa de diferencia anómala contorneado a 4 o.
Figuras 15-16 (anotación común) : Coordenadas estructurales atómicas refinadas para los aminoácidos 1 a 198 del fragmento de polipéptido PA de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina (1 a 198 de PA H1N1 ?52-64: Gly) con compuestos enlazados. Para cada estructura existe una molécula en la unidad asimétrica cristalográfica (ASU) . El titulo del archivo da información acerca del refinamiento estructural. "Átomo" se refiere al elemento cuyas coordenadas se miden. La primera letra en la columna define el elemento. Se proporciona el código de tres letras del aminoácido respectivo y la posición de la secuencia de aminoácidos. Los primeros 3 valores en la linea "Átomo" define la posición atómica del elemento como se mide. El cuarto valor corresponde a la ocupación y el quinto valor (último) es el factor de temperatura (factor B) . El factor de ocupación se refiere a la fracción de las moléculas en las cuales cada átomo ocupa la posición especificada por las coordenadas. Un valor "1" indica que cada átomo tiene la misma conformación, es decir, la misma posición, en todas las moléculas equivalentes de cristal. B es un factor térmico que mide el movimiento del átomo alrededor de su centro atómico. Esta nomenclatura corresponde al formato Protein Data Bank (PDB) .
Figura 15: Coordenadas estructurales del dominio H1N1 PA endonucleasa con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-1) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar. La cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto E BL-R05-1 tiene el descriptor de residuo cil.
Figura 16: Coordenadas estructurales del dominio HlNl PA endonucleasa con 3-galato de epigalocatequina enlazado (EGCG) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar. La cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EGCG tiene el descriptor de residuo tte.
Figura 17: Diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 15 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA) , que muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-1, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Arg84) o se acercan a él.
Figura 18A-18B: ' (Fig. 18A) Diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 16 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA) , que muestra el compuesto enlazado EGCG, los cationes divalentes (dos iones de manganeso) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto o se acercan a él. (Fig. 18B) EGCG enlazado, los cationes divalentes (dos iones de manganeso) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto o se acercan a él. Las interacciones menores que 3.3Á (líneas punteadas grises), interacciones posibles adicionales meno que 4Á (líneas punteadas gris oscuro) .
Figura 19: Superposición de todos los compuestos inhibidores de diceto ( EMBL-R05-- , EMBL-R0512, y EMBL-R05-3A y D) y EGCG en el sito activo . PA. Como se muestra en la Figura 19, el modo de enlace de los tres inhibidores diceto a los metales se conserva (aunque existe alguna variabilidad en la posición exacta) pero los dos "brazos" de cada compuesto se insertan en diferentes combinaciones de las cavidades 1 a 4. EMBL-R05-1 tiene una configuración similar a E BL-R05-3D, con los dos brazos que ocupan las cavidades 2 y 3. El EMBL-R05-3A ocupa las cavidades 2 y 4. EMBL-R05-2, que difiere notablemente de R05-1 y R05-3 en el punto de sustitución o en el anillo de piperidinilo (Tabla 2) ocupa la cavidad 3 y únicamente la cavidad 1 (Figura 7B) . El compuesto de té verde EGCG ocupa las cavidades 3 y 4. Los compuestos más potentes y específicos tal vez se podrían diseñar para ocupar más de dos de las cavidades.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes que la presente invención se describa con detalle a continuación, se va a entender que esta invención no se limita a la metodología/ protocolos y reactivos particulares descritos en este documento ya que estos pueden variar. También se entiende que la terminología usada en este documento es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención que se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se define de otra manera, todos los términos técnicos o científicos usados en este documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se listan con modalidades específicas, sin embargo, se debe entender que se pueden combinar de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los ejemplos diversamente descritos y modalidades preferidas no se deben considerar para limitar la presente invención a solo las modalidades explícitamente descritas. Esta descripción se debe entender para apoyar y abarcar modalidades que combinan las modalidades explícitamente descritas con cualquier número de elementos dados a conocer y/o preferidos. Adicionalmente, cualquier cambio y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud se deben considerar dados a conocer por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto lo indique de otra manera. Por ejemplo, si una modalidad preferida del fragmento de polipéptido de la presente corresponde a los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y en otra modalidad preferida El fragmento de polipéptido PA de acuerdo con la presente invención se puede fijar como objetivo con una etiqueta de péptido que es de manera preferente escindible del fragmento de polipéptido PA, usando de manera preferente una TEV proteasa, es una modalidad preferida de la invención que el fragmento de polipéptido que corresponde a los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 se etiquete con una etiqueta de péptido que es escindible del polipéptido PA usando una TEV proteasa.
De manera preferente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations ) " , H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds'., Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza, (1995).
Para practicar la presente invención, a menos que se indique de otra manera, se emplean métodos convencionales de técnicas de química, bioquímica, y DNA recombinante que se explican en la literatura en el campo (es decir, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, J. Sambrook y colaboradores eds . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989) .
A lo largo de la especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprenden", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá para implicar . la inclusión de un numero entero establecido o etapa o grupo de números enteros o etapas pero no exclusión de ningún' otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Como se usa en esta especificación las reivindicaciones adjuntas, "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes' plurales, a menos que el contexto lo indique claramente de otra.
Varios documentos son citados por todo el texto de esta especificación. Cada uno de los documentos citados en este documento (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones .científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etcétera), ya sea supra o infra, se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad. Nada en este documento se va a considerar como una admisión de que la invención no tiene derecho a antedatar tal descripción en virtud de la invención.
Definiciones término "fragmento de polipéptido" se refiere a una parte de una proteina que se compone de una cadena de aminoácidos individuales. El término "proteínas" comprende fragmentos de polipéptido que resume una estructura secundaria y terciaria y se refiere adicionalmente a proteínas que están constituidas de varias cadenas de aminoácido, es decir, varias subunidades, que forman estructuras cuaternarias. El término "péptido" se refiere a cadena de aminoácidos cortas de hasta 50 aminoácidos que no asumen necesariamente estructuras secundarias o terciarias. Un "peptoide" es un péptido mimético que resulta del ensamblaje u oligoméricos de glicinas N-sustituidas.
Los residuos · en dos o más polipéptido se dice que "corresponden" entre sí si los residuos ocupan una posición análoga en las estructura del polipéptido. Como es bien sabido en la técnica, las posiciones análogas en dos o más polipéptido pueden determinar al alinear frecuencias de polipéptido con base a la secuencia de aminoácidos o similitudes estructurales. Tales herramientas de alineación son bien conocidas por la persona experta en la técnica y se pueden obtener, por ejemplo, en la red mundial, por ejemplo, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) o Alineación (http : //www . ebi . ac. uk/e'mboss /alineación/índex . html) usando ajustes estándares, de manera preferente para Alineación EMBOSS :: aguja, Matriz:- Blosum62, Apertura de espacio 10.0, Extensión de espacio 0.5. Aquellas personas expertas en la técnica entienden que puede ser necesario introducir espacios en cualquier secuencia para producir una alineación satisfactoria. Los residuos en dos o más subunidades PA se dice que "corresponden" si los residuos se alinean en la mejor alineación de secuencia. La "mejor alineación de secuencia" entre dos polipéptido se define como la alineación que produce el número más grande de residuos idénticos alineados. La "región de mejor alineación de secuencia" termina y, de esta manera, determina las medidas y limites de la longitud de la secuencia de comparación para el propósito de determinación del registro de similitud, si la similitud de secuencia, de manera preferente identidad, entre dos secuencias alineadas desciende menos que 30% de manera preferente menor que 20%, de manera más preferente menor que 10% sobre una longitud de 10, 20 o 30 aminoácidos.
La presente invención se refiere a fragmentos de subunidad PA de RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A que posee actividad de endonucleasa . El término "subunidad PA de RNA polimerasa dependiente de RNA" se refiere a la subunidad PA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2. El término "variante de subunidad PA de RNA polimerasa dependiente de RNA" se refiere a una variante de subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A que comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácidos 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácidos que corresponde a la misma y tiene de manera preferente por lo menos 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de similitud de secuencia, de manera preferente identidad de secuencia sobre la longitud completa del fragmento que usa la mejor alineación de secuencia y/o sobre la región de la mejor alineación de secuencia, en donde la mejor alineación de secuencia es obtenible con herramientas conocidas en la técnica, por ejemplo, Alineación, usando ajustes estándares, de manera preferente EMBOSS :: aguja, Matriz: Blosum62, Apertura de espacio 10.0, Extensión de espacio 0.5, con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. Se prefiere que cuando una variante de subunidad PA se alinee con una subunidad PA de acuerdo con SEQ ID' NO: 2 esa alineación estará sobre la longitud completa de los dos polipéptidos y, de esta manera, ese registro de alineación se determinara en esta base. Es, sin embargo, posible que la variante de subunidad PA pueda comprender supresiones o adiciones C-terminal/N-términal o internas, por ejemplo, a través de funciones de N- o C-terminal. En este caso, solo la mejor región alineada se usa para la evaluación de la similitud e identidad, respectivamente. De manera preferente, los fragmentos derivados de esas variantes muestran la similitud e identidad indicadas, respectivamente, de manera preferentemente dentro de la región requerida para la actividad de endonucleasa . Por consiguiente, cualquier alineación entre SEQ ID NO: 2 y una variante de subunidad PA debe comprender de manera preferente el sitio activo de endonucleasa. De esta manera, la similitud e identidad de secuencia anteriores a SEQ ID NO: 2 se presenta por lo menos sobre una longitud de 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300 o más de aminoácidos, que comprende de manera preferente el sitio activo de endonucleasa.
Los fragmentos de polipéptido de la presente invención, de esta manera, se basan en la subunidad PA de RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o variantes de la misma como se define en lo anterior. Por consiguiente, en la siguiente especificación los términos "fragmento ( s ) de polipéptido" y "fragmento ( s ) de polipéptido PA" comprenden siempre fragmentos derivados de tanto la proteina PA como se expone en ID NO: 2 como de variantes de proteínas PA de la misma, como se expone en lo anterior, que poseen actividad de endonucleasa .
Sin embargo, la especificación también usa los términos "variante de fragmento de polipéptido PA" o "variantes de fragmento PA" para referirse específicamente a fragmentos de polipéptido PA o fragmentos PA que poseen actividad de endonucleasa que se derivan de variantes de subunidad PA de RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A. Los fragmentos de polipéptido PA de la presente invención, de esta manera, comprenden de manera preferente, consisten esencialmente o consisten de secuencia de la subunidad PA de virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de origen natural, sin embargo, también se prevé que las variantes de fragmento de polipéptido PA comprendan el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma y contiene además de manera preferente sustituciones de aminoácidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos, y/o tienen por lo menos 60%, 65%, 70%, 80%,' 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%, 98%, 99% de similitud de secuencia, de manera preferente identidad de secuencia sobre la longitud completa del fragmento que usa la mejor alineación de secuencia y/o sobre la región de la mejor alineación de secuencia, en donde la mejor alineación de secuencia es obtenible con herramientas conocidas en la técnica, por ejemplo, Alineación , usando ajustes estándares, de manera preferente EMBOSS :: aguja, Matriz: Blosum62, Apertura de espacio 10.0, Extensión de espacio 0.5, con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. Se entiende que los fragmentos PA de la presente invención puede comprender aminoácidos adicionales no derivados de PA, similar, por ejemplo, etiquetas, enzimas, etc., tales aminoácidos adicionales no se consideraran en tal alineación, es decir, se excluyen del cálculo de registro de alineación. En una modalidad preferida, el registro de alineación indicada en lo anterior se obtiene cuando se alinea la secuencia del fragmento con SEQ ID NO: 2 por lo menos sobre una longitud de 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, .170, 180, o 190 aminoácidos, en donde la secuencia de ID NO: 2 comprende de manera preferente el sitio activo de endonucleasa .
En una modalidad preferida, las variantes del fragmento del polipéptido PA comprenden por lo menos dos residuos de aminoácido que corresponden a los residuos de aminoácido 1 a 190 de la subunidad virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con Influenza A 2009 SEQ ID NO: 2 y tiene por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de similitud de secuencia, de manera preferente identidad de secuencia sobre la longitud completa del fragmento que usa la mejor alineación de secuencia y/o sobre la región de la mejor alineación de secuencia, en donde la mejor alineación de secuencia es obtenible con herramientas conocidas en la técnica, por ejemplo, Alineación, que usa ajustes estándares, de manera preferente EMB.OSS : : aguj a, Matriz: Blosum62, Apertura de espacio 10.0, Extensión de espacio 0.5, con residuos de aminoácido 1 a 190 de la secuencia de aminoácidos expuestos en SEQ ID NO: 2. De manera más preferente, las variantes de polipéptido PA comprenden por lo menos los residuos de aminoácido que corresponden a los residuos de aminoácido 1 a 198 de la subunidad PA de virus pandémico de HlNl 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o consisten de residuos de aminoácido 1 a 198 de la subunidad PA de virus pandémico de HlNl 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ED NO: 2 y tienen por lo menos 70%, de manera más preferente 75%, de manera más preferente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de similitud de secuencia, de manera preferente identidad de secuencia sobre la longitud completa sobre el fragmento que utiliza la mejor alineación de secuencia y/o sobre a región de la mejor alineación de secuencia, en donde la mejor alineación de secuencia es obtenible con herramientas conocidas en la técnica, por ejemplo, Alineación, que usa ajustes estándares, de manera preferente EMBOSS :: aguja, Matriz: Blosum62, Apertura de espacio 10.0, Extensión de espacio 0.5, con los residuos de aminoácido 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. También se prefiere que las variantes de fragmento de polipéptido PA comprendan por lo menos los residuos de aminoácido que corresponden a los residuos de aminoácido 1 a 200 de la subunidad PA de virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o consisten de residuos da aminoácido 1 a 200 de la subunidad PA de virus pandémico H1N1 2009 de' Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y tienen por lo menos 60%, de manera más preferente 65%, de manera más preferente 70%, de manera más preferente 75%, de manera más preferente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de similitud de secuencia, de manera preferente identidad de secuencia sobre la longitud completa del fragmento que usa la mejor alineación de secuencia y/o sobre la región de la mejor alineación de secuencia, en donde la mejor alineación de secuencia es obtenible con herramientas conocidas en la técnica, por ejemplo, Alineación, que usa ajustes estándares, de manera preferente EMBOSS :: aguja, Matriz: Blosum62, Apertura de espacio 10.0, Extensión de espacio 0.5, con residuos de aminoácido 1 a 200 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. Se debe observas que todas las variantes de fragmento de polipéptido PA preferidas mencionadas en lo anterior comprenden el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
En el contexto de la presente invención, el término "PA-Nter" se refiere a un fragmento de polipéptido que consiste de residuos de aminoácidos 1 a 198 de la secuencias de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 (PA H1N1 1 a 198) y opcionalmente de una ligadura amino terminal adicional, es decir MGSGMA (SEQ ID NO: 3) . En el contexto de la siguiente invención, el término "mutante PA-Nter" se refiere a un fragmento de polipéptido (variante) que consiste de residuos de aminoácido 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 con aminoácido 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina (1 a 198 de PA HlNl ?52-64: Gly) y opcionalmente de una ligadura amino terminal adicional, es decir MGSGMA (SEQ ID NO: 3) .
El término "similitud de secuencia" significa que los aminoácidos en la misma posición de la mejor alineación de secuencia son idénticos o similares, de manera preferente idénticos. "Aminoácidos similares" posee características similares, como polaridad, solubilidad, hidrofilicidad hidrofobicidad, carga, tamaño. Aminoácidos similares son de manera preferente leucina, isoleucina, valina; fenilalanina, triptófano, y tirosina; lisina, arginina, histidina; acido glutámico y acido aspártico; glicina, alanina, cerina; treonina, asparagina, glutamina, metionina. La persona experta conoce bien las herramientas de búsqueda de similitud de secuencia, por ejemplo, disponibles en la red mundial (por ejemplo, www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html) .
El término "soluble", como se menciona en este documento, se refiere a un fragmento de polipéptido que permanece en el sobrenadante después de la centrifugación durante 30 minutos a 100,000 x g en una solución amortiguadora acuosa bajo condiciones fisiológicamente isotónicas, por ejemplo, cloruro de sodio o sacarosa 0.14 M, en una concentración de proteína de por lo menos 200 µg/ml, de manera preferente de por lo menos de 500 µ?/p??, de manera preferente de por lo menos 1 mg/ml, de manera más preferente de por lo menos 2 mg/ml, aun más de manera más preferente de por lo menos 3 mg/ml, aun más de manera preferente de por lo menos 4 mg/ml, de manera mucho más preferente de por lo menos •5 mg/ml en ausencia de desnaturalizantes tales como guanidina o urea en concentraciones efectivas. Un fragmento de proteína que se somete a prueba para su solubilidad se expresa de manera preferente en uno de los sistemas de expresión celular indicada a continuación.
El término "purificado" en referencia con un polipéptido, no requiere pureza absoluta tal como una preparación homogénea, más bien representa una indicación de que el polipéptido es más puro en el ambiente natural. En general un polipéptido. purificado esta sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se asocian naturalmente de manera preferente en un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo, por lo menos 85% puro, mas preferente por lo menos 90% 0 95% puro, de manera más preferente por lo menos 99% puro. La expresión "purificado a un grado que es adecuado para cristalización" se refiere a un polipéptido que es 85% a 100%, de manera preferente 90% a 100%, de manera más preferente de 95% a 100% o 98% a 100% puro y se puede concentrar a mayor que 3 mg/ml, de manera preferente mayor que 10 mg/ml, de manera más preferente mayor que 18 mg/ml sin precipitación un artífice experto puede codificar un polipéptido usando técnicas estándares para purificación de proteínas. Un polipéptido sustancialmente puro producirá una banda principal individual en un gel de poliacrilamida no reductor .
El término "asociado" se usa en el contexto para identificar compuestos con los métodos de la presente invención se refiere a. una condición de proximidad de entre una porción (es decir entidad química o compuesto o porciones o fragmentos de los mismos) un sitio activo de endonucleasa de la subunidad PA. La asociación puede ser no covalente, es decir, done la yuxtaposición se favorece energéticamente por, por ejemplo, enlace de hidrogeno, interacciones van der alls, electrostáticas o puede ser covalente.
El término "actividad de endonucleasa" o "actividad endonucleolítica" se refiere a una actividad enzimática que da por resultado la incisión de enlace de fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos . En el contexto de la presente invención, los fragmentos de polipéptido poseen una actividad endonucleolítica que es de manera preferente no selectiva para el tipo de polinucleótido, es decir, los fragmentos de polipéptido de acuerdo con la presente invención muestran de manera preferente actividad endonucleolítica para DNA' y RNA, de manera preferente para DNA de hebra individual (ssDNA) o RNA de hebra individual (ssRNA) . En este contexto, "hebra individual" significa que un estiramiento de manera preferente por lo menos 3 nucleótidos, de manera preferente 5 nucleótidos, de manera más preferente de por lo menos 10 dentro de la cadena de polinucleótidos son de hebra individual, es decir, no deba ser pareado a otro nucleótido. De manera preferente la actividad endonucleótica de dos fragmentos de polipéptido de acuerdo con la presente invención no son dependientes de los sitios de reconocimiento, es decir, secuencias de nucleótidos especificas, sino da por resultado la escisión no especifica de cadenas de polinucleótidos. Por ejemplo, la persona experta puede someter a prueba la actividad endonucleolitica de los fragmentos de polipéptido de acuerdo con la presente invención al incubar sustratos de RNA o DNA tal como RNA en forma de asidera de sartén o un DNA de hebra individual lineal o circular, con o sin el fragmento de polipéptido respectivo , por ejemplo, a 37 °C durante un cierto periodo de tiempo tal como 5, 10, 20, 40, 60, o 80 minutos, y someter a prueba la integridad de los polinucleótidos, por ejemplo, mediante electroforesis en gel.
El término "nucleótido" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto que consiste de una purina, desasaforina, o base de nucleósido de pirimidina, por ejemplo, adenina, guanina, citocina, uracilo, timina, desazadenina, desasaguanosina, y similares, enlazadas en una pentosa en la posición 1, incluyendo formas de 2'-desoxi y 2' -hidroxilo, como por ejemplo, como se describe por Kornberg y Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992) e incluyen además pero no se limita a, nucleósido sintéticos que tienen porciones base modificadas y/o porciones de azúcar modificadas, por ejemplo, descritas generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, N.Y., 1980).
El término "polinucleótido aislado" se refiere a polinucleótidos que (i) se aislaron de su medio ambiente natural, (ii) se amplificaron por la reacción en cadena de la polimerasa, o (iii) se sintetizaron total o parcialmente, y significa un polímero de hebra individual o doble hebra de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos e incluye moléculas de DNA y RNA, tanto de hebras de sentido como de anti sentido. El término comprende cDNA, cRNA, DNA genómico, y DNA recombinante . Un polinucleótido puede consistir de un gen completo o una porción del mismo.
El término "vector recombinante" como se usa en este documento incluye cualquier vector conocido para la persona experta incluyendo vectores plásmidos, vectores cósmidos, vectores fago tales como fago lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o vaculovirales , o vectores de cromosoma artificial tales como cromosomas artificiales bacteriano (BAC) , cromosomas artificiales de levadura (YAC) , o cromosomas artificiales de PI (PAC) . Los vectores incluyen vectores de expresión' así como de clonación. Los vectores dé expresión comprenden plásmidos asi como también vectores virales y contienen en general una secuencia de codificación deseada y secuencias de DNA apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo hospedero particular (por ejemplo, . bacterias, levadura, planta, insecto, o mamífero) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se usan en general para diseñar y amplificar un cierto fragmento de DNA deseado y pueden carecer de secuencia funcionales necesarias para la expresión de DNA deseados.
"Célula hospedera recombinante", como usa en este documento, se refiere a una célula hospedera que comprende un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de interés es decir el fragmento de polipéptido PA H1N1' pandémico de Influenza A o variantes del mismo de acuerdo con la invención. Este polinucleótido se puede encontrar dentro de la célula hospedera (i) dispersado libremente como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma celular del hospedero o DNA mitocondrial . La célula recombinante se puede usar para la expresión de un polinucleótido de interés o para amplificación del polinucleótido o el vector recombinante de la invención. El término "célula hospedera recombinante" incluye la progenie de la célula original que se ha transformado, transíectado, o infectado con el polinucleótido o el vector recombinante de la invención. Una célula hospedera recombinante puede ser una célula bacteriana tal como una célula de E. coli, una celular de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, una célula de planta, una célula de insecto tal como SF9 o células High Five, o una célula de mamífero. Ejemplos preferidos de células de mamíferos son células de ovario de hámster chino (CHO) , células de riñon de mono africano (COS), células de riñon embriónico humano (HEK293) , células HELA y similares.
Como se usa en este documento, el término "cristal" o "cristalino" significa una estructura (tal como un agregado solido tridimensional)' en el cual el plano enfrenta la intersección en ángulos definidos y en el cual existe una estructura regular (tal como estructura interna) de las especies químicas constituyentes. El término "cristal" puede incluir cualquiera de: una forma de cristal físico solido tal como un cristal experimentalmente preparado, una estructura cristalina derivada del crista (incluyendo elementos estructurales secundarios y/o terciarios y/o cuaternarios) un modelo 2D y/o 3D basado, en la estructura cristalina, una representación del mismo tal como una representación esquemática del mismo' o una representación gramática del mismo o un conjunto de datos del mismo para una computadora. En un aspecto, el · cristal es útil en técnicas de cristalografía de rayos x. En este punto los cristales usados pueden soportar la exposición a haces de rayos x y se usan para producir datos de patrón de difracción necesarios para resolver la estructura cristalográfica de rayos x. un cristal se puede cristalizar por ser capaz de difractar rayos x en un patrón definido por una de las formas de cristal representadas en T. L. Blundell y L. N. Johnson, "Protein Crystallography", Academic Press,- Nueva York (1976) .
El término "célula unitaria" se refiere a un bloque en forma cubica o paralelepípedo básico. El volumen completo de un cristal se puede construir mediante el ensamblaje regular de tales bloques. Cada célula unitaria comprende una representación completa de la unidad de patrón, la repetición del cual construye el cristal.
El término "grupo espacial" se refiere al arreglo de elementos de simetría de un cristal. En una designación e grupo espacial la mayúscula indica el tipo de reticulado y los otros símbolos representan operaciones de simetría que se pueden llevar a cabo en los contenidos de la unidad asimétrica sin cambiar su apariencia.
El término "coordenadas estructurales" se refiere a un conjunto de valores que definen la posición de uno o más residuos de aminoácido con referencia a un sistema de ejes. El término se refiere a un conjunto de datos que define la estructura tridimensional de una molécula o moléculas (por ejemplo, coordenadas Cartesianas, factores de temperatura, y ocupaciones) . Las coordenadas estructurales se pueden modificar ligeramente y aún volverse casi estructuras dimensionales idénticas. Una medición de un conjunto único de coordenadas estructurales es la desviación de la raiz cuadrada media de la estructura resultante. Las coordenadas estructurales que se vuelven estructuras tridimensionales (en particular, una estructura tridimensional de un centro enzimáticamente activo) que se desvia de uno al otro por una desviación de la raiz cuadrada media de menor que 3Á, 2 Á, 1.5 Á, 1.0 Á, o 0.5 ? se puede observar por una persona de experiencia ordinaria en la técnica como muy similar.
El término "desviación de la raiz cuadrada media" significa la raiz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones de la media. Es una forma de expresar la desviación o variación de la tendencia u objeto. Para propósitos de esta invención, la "desviación de la raiz cuadrada media" define la variación en la cadena principal de una variante del fragmento de polipéptido PA o el centro enzimáticamente activo en el mismo de la cadena principal del fragmento de polipéptido PA o el centro enzimáticamente activo en el mismo como se define por las coordenadas estructurales del fragmento PA-Nter del polipéptido PA de acuerdo con Figura 1.
Como se usa en este documento, el término "construcción de un modelo de computadora" incluye el análisis cuantitativo y cualitativo de la estructura molecular y/o función con base en la información estructural atómica y los modelos de interacción. El término "modelación" incluye modelos de minimización dinámica y de energía molecular basada numérica convencional y, modelos gráficos de computadora interactivos, modelos mecánicos moleculares modificados, geometría de distancia y otros modelos de restricción basados en estructura.
El término "operación de programa de ajustes" se refiere a una operación que usa las coordenadas estructurales de una entidad química, un centro enzimáticamente activo, una bolsa de enlace, molécula o complejo molecular, o porción de los mismos, para asociar la entidad química con el centro enzimáticamente activo, la bolsa de enlace, molécula o complejo molecular, o una porción de los mismos. Esto se puede lograr al colocar, al rotar o al traducir la entidad química en el centro enzimáticamente activo para igualar la forma y complementariedad electrostática del centro enzimáticamente activo. Las interacciones covalentes, interacciones no covalentes tales como enlace de hidrógeno, interacciones electrostáticas, hidrofóbicas , van der Waals, e interacciones electrostáticas no de complementariedad tales como interacciones de carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo repulsivas se pueden optimizar. Alternativamente, se puede minimizar la energía de deformación del enlace de la entidad química al centro enzimáticamente activo.
Como se usa en este documento, el término "compuesto de prueba" se refiere a un agente que comprende un compuesto, molécula, o complejo que está siendo sometido a prueba para su capacidad de inhibir la actividad endonucleolítica del fragmento de polipéptido de interés, es decir, el fragmento de polipéptido ?? de la invención o variantes del mismo que poseen . actividad endonucleolítica. Los compuestos de prueba pueden ser cualquier agente incluyendo, pero no restringido a, péptidos, peptoides, polipéptidos, proteínas (incluyendo anticuerpos) , lípidos, metales, nucleótidos, análogos de nucleótido, nucleósidos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicos o inorgánicas pequeñas, compuestos químicos, elementos, sacáridos, isótopos, carbohidratos, agentes de imagen, lipoproteínas, glicoproteínas, enzimas, sondas analíticas, poliaminas y combinaciones y derivados ' de los mismos. El término "moléculas pequeñas" se refiere, a moléculas que tienen un peso molecular entre 50 y aproximadamente 2,500 Daltons, de manera preferente en el intervalo de 200-800 Daltons. Además, un compuesto de prueba de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente una etiqueta detectable. Tales etiquetas incluyen, pero no se limitan a, etiquetas enzimáticas, radioisótopos o compuestos o elementos radioactivos, compuestos fluorescentes o metales, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes . Es pueden usar métodos bien conocidos para unir tal etiqueta detectable a un compuesto de prueba. El compuesto de prueba de la invención también puede comprender mezclas complejas de sustancias, tales como extractos que contienen productos naturales, o los productos de síntesis de combinación mezclada. Estos también se . pueden someter a prueba y el componente que muestra la actividad endonucleótica del fragmento de polipéptido objetivo se puede purificar de la mezcla en una etapa subsecuente. Los compuestos de prueba se pueden derivar o seleccionar de bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, las bibliotecas de compuestos sintéticos son comercialmente disponibles de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, RU) , ChemBridge Corporation (San Diego, CA) , o Aldrich (Milwaukee, WI). Una biblioteca de compuestos naturales es, por ejemplo, disponible de TimTec LLC (Newark, DE) . Alternativamente, se pueden usar librerías de compuestos naturales en la forma de células bacterianas, 'fúngicas, de plantas y animales y extractos de tejido. Adicionalmente, los compuestos de prueba se pueden producir sintéticamente usando química de combinación ya sea como compuestos individuales o como mezclas. Una colección de compuestos hechos usando la química de combinación es referida en este documento como una biblioteca de combinación.
En el contexto de la presente invención, "un compuesto que modula la. actividad endonucleolitica" puede incrementar o disminuir, de manera preferente inhibir la actividad endonucleolitica de la subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo. De manera preferente, el compuesto es específico para la actividad endonucleolitica de la subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o variante de la misma y no modula de manera preferente disminuye la actividad endonucleolitica de otras endonucleasas, en particular endonucleasas de mamífero.
El término "un compuesto que disminuye la actividad endonucleolitica" significa un compuesto que disminuye la actividad endonucleolitica de la subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A o una variante de la misma por 50%, de manera más preferente 60%, de manera aún más preferente 70%, de manera aún más preferente por 80%, de manera aún más preferente por 90%, y de manera mucho más preferente por 100% comparado con la actividad endonucleolitica de la subunidad PA o una variante de la misma sin el compuesto pero de otra manera con las mismas condiciones de reacción, es decir, condiciones amortiguadoras, tiempo de reacción y temperatura.
Es mucho más preferido que el compuesto que disminuye la actividad endonucleolitica de la subunidad PA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A o una variante del mismo inhiba la actividad, es decir, disminuye la actividad por lo menos 95%, de manera preferente por 100% comparada con la actividad sin el compuesto. Se prefiere particularmente que el compuesto que disminuye o inhibe la actividad endonucleolitica de la subunidad PA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza- A o una variante del mismo disminuya o inhiba específicamente la actividad endonucleolitica de la subunidad PA o una variante de la misma pero no inhiba la actividad endonucleolitica de las otras endonucleasas tal como RNasa H o endonucleasas de restricción al mismo grado, de manera preferente no en todos. Por ejemplo, la persona experta puede establecer las siguientes muestras con las mismas condiciones reguladoras y de reacción asi como también concentraciones de substrato y endonucleasa : (1) substrato tal como RNA en forma de asidera de sartén, fragmento de polipéptido PA HlNl endonucleoliticamente activo o variante del mismo, (2) substrato tal como RNA en forma de asidera de sartén, fragmento de polipéptido PA HlNl endonucleoliticamente activo o variante del mismo, compuesto de prueba, (3) substrato tal como RNA en forma de asidera de sartén, endonucleasa de referencia tal como RNAasa H, (4) substrato tal como RNA en forma de asidera de sartén, nucleótido de referencia tal como RNAasa H, compuesto de prueba. Después de la incubación de las muestras, la persona experta puede analizar el substrato, por ejemplo, mediante electroforesis en gel. Los compuestos de prueba que dan por resultado el substrato escindido en la muestra (4) y el substrato intacto en la muestra (2) se refieren .
El término "en un entorno de alto rendimiento" se refiere a ensayos de clasificación de alto rendimiento y técnicas de varios tipos que se usan para clasificar bibliotecas de compuestos de prueba para su capacidad de inhibir la actividad de endonucleasa del fragmento del polipéptido de interés. ' Típicamente, los ensayos de alto rendimiento se llevan a. cabo en un formato de múltiples pocilios e incluyen ensayos sin células asi como también basados en células.
El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos tanto monoclonales como policlonales , es decir, cualquier proteina de inmunoglobulina o porción de la misma que es capaz de reconocer un antigeno o hapteno, es decir, el fragmento de polipéptido pandémico HlNl PA 2009 de Influenza A que posee actividad endonucleolitica o un péptido del mismo. En una modalidad preferida, el anticuerpo es capaz de enlazarse enzimáticamente (endonucleoliticamente) al centro activo dentro del fragmento de polipéptido pandémico HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo. Las porciones de enlace a antigeno del anticuerpo se pueden producir mediante técnicas de DNA recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. En algunas modalidades, las porciones de enlace a antígeno incluyen Fab, Fab' , F(ab')2, Fd, Fv, dAb, y fragmentos de región de determinación de complementariedad (CDR) , anticuerpos de cadena individual (scFv) , anticuerpos quiméricos tales como anticuerpos humanizados, diacuerpos, y polipéptidos que contienen por lo menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir enlace de antígeno específico al polipéptido.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una . sal de un compuesto identificable por los métodos de la presente · invención o un compuesto de la presente invención. Sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de adición de adición ácidas que pueden, por ejemplo, ser formadas al mezclar una solución de compuestos de la presente invención .con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico. Adicionalmente, donde el compuesto lleva una porción acida, las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de la misma pueden incluir sales de metal alcalino (por ejemplo, sales de sodio o potasio) ; sales de metal alcalinotérreo (por ejemplo, sales de calcio o magnesio) ; y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados (por ejemplo, cationes de amonio, de amonio cuaternario y de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo y sulfonato de arilo) . Ejemplos ilustrativos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, butirato, edetato de calcio, canforato, canforsulfonato, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, clavulanato, ciclopentanopropionato, digluconato, diclorhidrato, dodecilsulfato, edetato, edisilato, estoiato, esilato, etanosulfonato, formato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glutamato, glicerofosfato, glicolilarsanilato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, hidroxinaftoato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, lauril-sulf to, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, 2 -naftalensulfonato, napsil.ato, nicotinato, nitrato, sal de N-metilglucamina-amonio, ' oleato, oxalato, pamoato (embonato) , palmitato, pantotenato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato/difosfato, picrato, pivalato, poligalacturonato, propionato, salicilato, estearato, sulfato, subacetato, succinato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato, trietyoduro, undecanoato, valerato, y similares (véase, por ejemplo, S. M. Berge y colaboradores, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19 (1977)).
El término "excipiente" cuando se usa en este documento se propone para indicar todas las sustancias en una formulación farmacéutica que no tienen ingredientes activos tales como, por ejemplo, portadores, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes activos de superficie, conservadores, emulsionantes, amortiguadores, agentes saborizantes o colorantes.
El término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de baja fusión, mantequilla de cacao, y similares .
Descripción Detallada De Modalidades Preferidas Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que un dominio independientemente plegado pequeño derivado de la N-terminal de la subunidad PA de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A muestra las propiedades funcionales de la endonucleasa reportada para el complejo trimérico, aunque esta actividad se pensó que es detectable solo en el complejo trimérico. Por otra parte, los inventores descubrieron que este fragmento de polipéptido PA se puede producir fácilmente por medios recombinantes y, de esta manera, es adecuado para estudios in vitro en la actividad endonucleolitica y submodulación . Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que el dominio derivado de la N-terminal de la subunidad PA de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A se cristaliza fácilmente y que, de esta manera, el dominio es muy delicado para identificación, selección y diseño de nuevos compuestos antivirales que fijan como objetivo la actividad de endonucleasa de la polimerasa pandémica H1N1 2009 de Influenza A 2009 asi como también la optimización de compuestos previamente identificados por métodos de computador.
Es un aspecto de la presente invención proporcionar un fragmento de polipéptido que comprende un fragmento amino-terminal de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA viral que posee actividad de endonucleasa, en donde la subunidad PA es del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o es una variante del mismo, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
En una modalidad preferida de la presente invención, la variante comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina. En una modalidad preferida adicional de la presente invención, la variante comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con aminoácidos 52 a 72 remplazados por el aminoácido glicina. En otra modalidad preferida adicional de la presente invención, la variante comprende los aminoácidos 1 a 19S de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con aminoácidos 52 a 69 remplazados por el aminoácido glicina.
Se prefiere que el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención sea soluble, de manera preferente en una solución acuosa. La longitud mínima del fragmento de polipéptido de la presente invención se determinar por su capacidad de escindir cadenas de polinucleótidos tal como RNA en forma de asidera de sartén o DNA de hebra individual, es decir, la longitud mínima del polipéptido se determina por su actividad endonucleolítica . De manera preferente, la actividad de endonucleasa no es dependiente en el tipo de polinucleótido, y de esta manera, se puede ejercer en el. DNA y RNA, de manera preferente en el DNA de hebra individual y RNA. De manera preferente, la actividad de endonucleasa no dependiente en los sitios de reconocimiento específicos dentro del polinucleótido de substrato.
En una modalidad preferida, el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención es adecuado para la cristalización, es decir, de manera preferente el fragmento de polipéptido es cristalizable . De manera preferente, los cristales obtenidos del fragmento de polipéptido de acuerdo con la invención son adecuados para la determinación estructural del fragmento de polipéptido usando cristalografía de rayos X. De manera preferente, los cristales son mayores que cubos de 25 mieras y de manera preferente son suficientemente estables en radiación para permitir más de 85% de integridad de datos de difracción en la resolución de manera preferente 3.5Á o mejor que se recolectan en la exposición a los . rayos X monocromáticos.
En una modalidad, el fragmento de polipéptido es cristalizable usando (i) una solución de proteína acuosa, es decir solución de cristalización, con una concentración de proteína de 5 a 20 mg/ml, por ejemplo of 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 1 1, 1 1.5,- 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, o 20 mg/ml, de manera preferente de 8 a 15 mg/ml, de manera mucho más preferente de 10 a 15 mg/ml en un sistema amortiguador tal como HEPES o Tris-HCl en concentraciones que varían de 10 mM a 3 M, de manera preferente de 10 mM a 2 M, de manera más preferente de 20 mM a 1 M, en pH 3 a pH 9, de manera preferente pH 4 a pH 9, de manera más preferente de pH 7 a pH 9, y (ii) una solución precipitante/depósito que comprende una o más sustancias tales como formiato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de litio, acetato de magnesio, acetato de sodio, acetato de manganeso, cloruro de sodio, glicerol o etilenglicol .
Opcionalmente , la solución de proteínas puede contener una o más sales tales como sales monovalentes, por ejemplo, NaCl, KC1, o LiCl, de manera preferente NaCl, en concentraciones que varían de 10 mM a 1 , de manera preferente de 20 mM a 500 mM, de manera más preferente de 50 mM a 200 mM, y/o sales divalentes, por ejemplo, MnCl2, CaCl2, MgCl2, ZnCl2, o CoCl2, de manera preferente MgCl2 y -MnCl2, en concentraciones que varí.an de 0.1 a 50 mM, de manera preferente de 0.5 a 25 mM, de manera más preferente de 1 a 10 mM o de 1 a 5 mM.
De manera preferente, la solución precipitante/de depósito comprende formiato de sodio en concentraciones que varían de 0.5 a 2 M, de manera preferente de 1 a 1.8 M, un sistema amortiguador tal como HEPES en concentraciones que varían de 10 mM a 1 M, de manera preferente de 50 mM a 500 mM, de manera más preferente de 75 a 150 mM, de manera preferente en pH 4 a 8, de manera más preferente pH 5 a 7 , y/o etilenglicol en concentraciones que varían de 1% a 20%, de manera preferente 2% a 8%, de manera más preferente 2 a 5%.
El fragmento de polipéptido PA o variante del mismo es de manera preferente 85% a 100% puro, de manera más preferente 90% a 100% puro, de manera aún más preferente 95% a 100% puro en la solución de cristalización. Para producir cristales, la solución de proteínas adecuadas para la cristalización se puede mezclar con un volumen igual de la solución de precipitante.
En una modalidad preferida, el medio de cristalización comprende de 0.05 a 2 µ?, de manera preferente de 0.8 a 1.2 µ?, de solución de proteína adecuada para la cristalización mezclada con un volumen preferentemente igual, similar de solución precipitante que comprende formiato de sodio 1.0 a 2.0 M, HEPES .80 a 120 m , pH 6.5 a pH 7.5, y 2 a 5% de glicol o glicerol.
En otra modalidad, la solución precipitante comprende, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de formiato de sodio 1.6 , HEPES 0.1 M a pH 7.0, y 5% glicol o glicerol, y la solución de cristalización/de proteína comprende, de manera preferente consiste esencialmente o consiste de 10 a 15 mg/ml en HEPES 20 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, MnCl2 2.0 mM, y MgCl2 2.0 mM.
En otra modalidad, el fragmento de polipéptido PA es co-cristalizable con un compuesto, de manera preferente con un compuesto que modula, inhibe de manera preferente, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido PA, de manera preferente con un compuesto de acuerdo con las Tablas 1 o 2, usando (i) una solución de proteína acuosa con una concentración del fragmento de ' polipéptido PA de 5 a 20 mg/ml, por ejemplo, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 1 1, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, o 20 mg/ml, de manera preferente de 8 a 15 mg/ml, de manera mucho más preferente de 10 a 15 mg/ml en un sistema amortiguador tal como HEPES o Tris-HCl en concentraciones que varían de 10 mM a 3 M, de manera preferente de 10 mM a 2 M, de manera más preferente de 20 mM a 1 M, en pH .3 a pH 9, de manera preferente pH 4 a pH 9, de manera más preferente pH 7 a pH 9, y (ii) una solución precipitante/de depósito que comprende una o más sustancias tales como formiato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de litio, acetato de magnesio, acetato de manganeso, cloruro de sodio, etilenglicol , glicerol, o PEG. Para la co-cristalización, un compuesto, de manera preferente un compuesto que modula, ¦ por ejemplo inhibe, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido PA, de manera preferente un compuesto de acuerdo con las Tablas 1 o 2, se agrega a la solución de proteínas acuosa a una concentración final de entre 0.5 y 5 mM, de manera preferente de entre 1.5 m 5 mM, es decir de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4.5 o 5 mM.
Opcionalmente , la solución de proteínas puede contener una o más sales tales como sales monovalentes, por ejemplo, NaCl, KC1, o LiCl, de manera preferente NaCl, en concentraciones que varían ¦ de 10 mM a 1 M, de manera preférente de 20 mM a 500 mM, de manera más preferente de 50 mM a 200 mM, y/o sales divalentes, por ejemplo, MnCl2, CaCl2, MgCl2, ZnCl2, o CoCl2, de manera preferente MgCl2 y MnCl2, en concentraciones que varían de 0.1 a 50 mM, de manera preferente de 0.5 a 25 mM, de manera más preferente de 1 a 10 mM o de 1 a 5 mM.
De manera preferente, la solución precipitante/de depósito comprende sulfato de amonio en concentraciones que varían de 0.1 a 2.5 M, de manera preferente de 0.1 a 2.0 M, un sistema amortiguador tal como Bis-Tris en concentraciones que varían de 10 m a 1 M, de manera preferente de 50 mM a 500 mM, de manera más preferente de 75 a 150 mM, de manera preferente en pH 4 a 7, de manera más preferente pH 5 a 6, y/o PEG tal como PEG 3350 en concentraciones que varían de 1% a 30%, de manera preferente 15% a 30%, de manera más preferente 20 a 25%.
El fragmento de polipéptido ?? o variante del mismo es de manera preferente 85% a 100% puro, de manera más preferente 90% a 100% puro, de manera aún más preferente 95% a 100% puro en la solución de proteína. Para co-cristalización, la solución de proteína acuosa que comprende el fragmento de polipéptido PA o variante del mismo y el compuesto se pueden mezclar con un volumen igual de la solución precipitante.
En una modalidad preferida, la solución de proteina comprende, de manera preferente consiste esencialmente o consiste de 10 a 15 mg/ml de fragmento de polipéptido PA en HEPES 20 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, MnCl2 2.0 mM, y MgCl2 2.0 m y ácido 4- [3- [ (4-clorofenil) metil] -1- (fenilmetil) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-3) en una concentración final de 1.5 mM, y la solución de depósito/solución precipitante comprende, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de sulfato de amonio 2.0 M y Bis-Tris 0.1 M a pH 5.5 (véase también la Tabla 1) .
En otra modalidad preferida, la solución de proteina comprende, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de 10 a 15 mg/ml de fragmento de polipéptido PA en HEPES 20 mM a pH 7.5, NaCl 150 mM, MnCl2 2.0 mM, y MgCl2 2.0 mM y . ácido 4- [4- [( 4-clorofenil) metil] - 1 - ( ciclohexilmetil ) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-2) en una concentración final de 1.5 mM, empapada preferentemente en cristales que · se desarrollaron inicialmente con Monofosfato de ribo-Uridina (rUMP) , y la solución de depósito/solución precipitante comprende, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de sulfato de amonio 0.1 M, Bis-Tris 0.1 M a pH 5.5 y 25% (p/v) de PEG 3350 (véase también la Tabla 1) .
En una modalidad preferida adicional, la solución de proteina comprende, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de 10 a 15 mg/ml de fragmento de polipéptido PA en HEPES 20 mM a- pH 7.5, NaCl 150 mM, MnCl2 2.0 mM, y MgCl2 2.0 mM y . Monofosfato de ribo-Uridina (rUMP) en una concentración ' final de 5 mM, y la solución de depósito/solución precipitante comprende, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de sulfato de amonio 0.1 M, Bis-Tris, 0.1 M a pH 5.5 y 25% (p/v) PEG 3350 (véase también la Tabla 1).
Otras soluciones de depósito/soluciones precipitantes preferidas para la co-cristalización del fragmento de polipéptido PA o variante del mismo, por ejemplo con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico , (EMBL-R05-1 ) o con [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- (3,4, 5-trihidroxifenil) chroman-3-il] 3, 4 , 5-trihidroxibenzoato (EGCG) , se pueden tomar adicionalmente de la Tabla 1.
Los cristales se pueden desarrollar mediante cualquier método conocido por la persona experta en la técnica incluyendo, pero no limitado a, técnicas de gota colgante y asentada,, técnica de gota de emparedado, diálisis, y microlote o dispositivos de lotes de microtubos. Seria fácil evidente para una persona de experiencia en la técnica variar las condiciones de cristalización dadas a conocer en lo anterior para identificar ostras condiciones de cristalización que producirían cristales de fragmentos de polipéptido PA de las invenciones o variantes de los mismos solos o en complejo con un compuesto. Tales variaciones incluyen, pero no se limitan a, ajuste de pH, concentración de proteína y/o temperatura de cristalización, cambiar la identidad o concentración de la sal y/o precipitante usados, usar un método diferente para cristalización, o introducir aditivos tales como detergentes (por ejemplo, TWEEN 20 (monolaurato) , LDOA, Brij 30 (éter laurílico 4))., azúcares (por ejemplo, glucosa, maltosa) , compuestos orgánicos (por ejemplo, dioxano, dimetilformamida ) , iones de lantánido, o compuestos poli-iónicos que ayudan en las cristalizaciones. Los ensayos de cristalización de. alto rendimiento también se pueden usar para ayudar en el descubrimiento u optimización de la condición de cristalización.
Se puede usar la microsiembra para incrementar el tamaño y calidad de los cristales. En breve, los microcristales se trituran para producir una solución de semillas madre. La solución de semillas madre se diluye en serie. Usando una aguja, barra de vidrio o hebra de cabello, una muestra pequeña para cada solución diluida, se agrega a un conjunto de gotas equilibradas que contienen una concentración de proteínas igual a o menor que una concentración necesaria para crear cristales en la presencia de semillas. El objetivo es terminar con un solo cristal de semilla que actuará para nuclear el crecimiento de cristales en la gota.
La manera de obtener las coordenadas estructurales como se muestra en las Figuras 1 a 5, interpretación de las coordenadas y su utilidad en el entendimiento de la estructura de la proteína, como se describe en este documento, se entiende comúnmente por la persona experta y por referencia a los textos estándares tales como J. Drenth, "Principies of protein' X-ray crystallography" , 2da Edición, Springer Advanced Texts in Chemistry, Nueva York (1999); y G. E. Schulz y R. H. Schirmer, "Principies of Protein Structure", Springer Verlag, Nueva York (1985). Por ejemplo, los datos de difracción de rayos X primer se adquiere, usando frecuentemente cristales crioprotegidos (por ejemplo, con 20% a 30% de glicerol) congelados a 100 K, por ejemplo, usando una línea de haz en una instalación de sincrotrón o un ánodo de rotación como una fuente de rayos X. posteriormente, el problema de fase se resuelve por un método generalmente conocido, por ejemplo, difracción anómala de múltiple longitud de onda (MAD) , reemplazo isomorfo múltiple (MIR) , difracción anómala de longitud de onda individual (SAD) , o reemplazo molecular (MR) . La subestructura se puede resolver usando SHELXD (Schneider y Sheldrick, 2002, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. ( Pt 10 Pt 2), 1772-1779), fases calculadas con SHARP (Vonrhein y colaboradores, 2006, Methods Mol. Biol. 364:215-30), y mejoradas con aplanamiento de solvente y promedio de simetría no cristalográfica, por ejemplo, con RESOLVE (Terwilliger, 2000, Acta Cryst . D. Biol. Crystallogr. 56:965-972). La autoconstrucción de modelos se puede hacer, por ejemplo, con ARP/wARP (Perrakis y colaboradores, 1999, ¦ Nat . Struct. Biol. 6:458-63) y refinamiento con, por ejemplo REFMAC (Murshudov, 1997, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 53: 240-255).
De manera preferente, el fragmento de PA amino-terminal comprendido dentro del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención corresponde a, de manera preferente consiste esencialmente de o consiste de, por lo menos los aminoácidos 1 a 190, de manera preferente los aminoácidos 1 a 198, de manera preferente los aminoácidos 1 a 200, de la subunidad PA de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma.
En una modalidad preferida, el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención se purifica a un grado que es adecuado para cristalización, de manera preferente en su 85% a 100%, de manera más preferente 90% a 100%, de manera mucho más preferente 95% a 100% puro. En otra modalidad preferida, el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención se purifica a un grado que es adecuado para co-cristalización, de manera preferente es 85% a 100%, de manera más preferente 90% a 100%, de manera mucho más preferente 95% a 100% puro.
En otra modalidad, el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención es capaz de enlazarse a cationes divalentes. De manera preferente, el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención se enlaza a uno o más catión (es) divalente, de manera preferente se enlaza a dos cationes divalentes. En este contexto, el catión divalente se selecciona de manera preferente del grupo que consiste de manganeso, cobalto, calcio, magnesio, y zinc, y es de manera más preferente manganeso o cobalto, de manera mucho más preferente manganeso y/o magnesio. De esta manera, en una modalidad preferida, el fragmento de polipéptido de la presente invención está presente en el complejo con (i) dos cationes de manganeso, (ii) dos cationes de magnesio, o (iii) un catión de manganeso y uno de magnesio. En una modalidad preferida, los cationes divalentes se coordinan por aminoácidos que corresponden a los aminoácidos Glu80 y Aspl08 (segunda edición) y aminoácidos que corresponden a los aminoácidos His41, Aspl08, Ilel20 y Glull9 (primer catión) como se expone en SEQ ID NO: 2. En una modalidad preferida, el catión divalente es manganeso para el sitio 1 y manganeso o magnesio para el sitio 2, es decir manganeso para el sitio 1 y magnesio para el sitio 2 (véase la Figura 6) o manganeso para el sitio 1 y manganeso para el sitio 2 (véase las Figuras 7 a 10, 17 y 18) En una modalidad adicional, el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención es un fragmento de polipéptido, en donde la N-terminal es idéntica a o corresponde a la posición de aminoácido 15 o inferior, por ejemplo, en la posición 15, 14, 13, 12, 1 1, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1, y la C-terminal es idéntica a o corresponde a un aminoácido en la posición seleccionada de las posiciones 186 a 200, por ejemplo, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, o 200 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2, de manera preferente la C-terminal es idéntica a o corresponde a un aminoácido en una posición seleccionada de 190 a 200, de manera más preferente 190 a 198 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2, o es una variante de la misma, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma y retiene la actividad de endonucleasa .
En una modalidad preferida de la presente invención, la variante comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina. En una modalidad más preferida de la presente invención, la variante consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos GSGMA (SEQ ID NO: 3) .
En una modalidad preferida adicional de la presente invención, la variante comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 72 remplazados por el aminoácido glicina. En una modalidad más preferida de la presente invención, la variante consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 72 remplazados por el aminoácido glicina y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos MGSGMA (SEQ ID NO: 3) .
En otra modalidad preferida adicional de la presente invención, la variante comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de' aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 69 remplazados por el aminoácido glicina. En una modalidad más preferida de la presente invención, la variante consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 69 remplazados por el aminoácido glicina y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos MGSGMA (SEQ ID NO: 3) .
De manera preferente, el fragmento de polipéptido tiene o corresponde a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consisten de aminoácidos 5 a 190, 10 a 190, 15 a 190, 20 a 190, 5 a 198, 10 a 198, 15 a 198, 20 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y variantes de la misma, en donde las variantes comprenden el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que . corresponde a la misma y retiene la actividad de endonucleasa .
En una modalidad adicional, el fragmento de polipéptido (variante) de acuerdo con la presente invención (a) consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos GSGMA (SEQ ID NO: 3) y tiene la estructura definida por (i) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 1, (ii) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 2, (iii) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 3, (iv) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 4, o (v) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 5, o (b) consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de .aminoácidos MGSGMA (SEQ ID NO: 3) y tiene la estructura definida por (vi) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 15, o (vii) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 16.
Se prefiere que el fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención tenga la estructura cristalina definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 1 sin co-cristalización con un compuesto (estructura nativa).
Se prefiere además que el fragmento de polipéptido (variante) de acuerdo con la presente invención tenga la estructura cristalina definida por las coordenadas estructurales como se muestra en las Figuras 2 a 5, 15 o 16 después de la co-cristalización con un compuesto, de manera preferente con un compuesto que module, inhiba de manera preferente, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido.
Se prefiere particularmente que el fragmento de polipéptido (variante) ¦ tenga la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en las Figuras 2 a 5, 15 o 16 después de la co-cristalización con un compuesto de acuerdo con las- Tablas 1 o 2, es decir la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en las Figuras 2 y 3 después co-cristalización con ácido 4- [3-[ (4-clorofenil) metil ] -1- ( fenilmetil ) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-3) , la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 4 después de la co-cristalización con ácido 4- [4-[ (4-clorofenil)metil]-l- (ciclohexilmetil ) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, (EMBL-R05-2 ) , la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 5 después de la co-cristalización con onofosfato de ribo-uridina (rUMP) , la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 15 después de ' la co-cristalización con ácido 4- [3- [(4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1 ) , o la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 16 después de la co-cristalización con [(2R,3R)-5, 7-dihidroxi-2- (3, 4, 5-trihidroxifenil) chroman-3-il ] 3,4,5-trihidroxibenzoato (EGCG) .
Considerando lo anterior, la persona experta entenderá fácilmente que el fragmento de polipéptido (variante) tiene una estructura de cristal que se define solamente por las coordenadas estructurales de sus aminoácidos y opcionalmente de sus cationes divalentes enlazados comprendidos en las Figuras 1, 2 a 5, 15 o 16 y que no se definen por las coordenadas estructurales del compuesto respectivo usado para la co-cristalización que también está comprendida en las Figuras 2 a 5, 15 o 16, es decir el compuesto EMBL-R05-3 tiene el descriptor de residuo ci3 en las Figuras 2 y 3, el compuesto EMBL-R05-2 tiene el descriptor de residuo ci2 en la Figura 4, el compuesto rU P tiene el descriptor de residuo U en la Figura 5, el compuesto EMBL-R05-1 tiene el descriptor de residuo cil en la Figura 15 y el compuesto EGCG tiene el descriptor de residuo tte en la Figura 16.
También se prefiere' que el fragmento de polipéptido (variante) que tiene la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 1 tiene una forma cristalina con grupo espacial C2 y dimensiones de células unitarias de a = 26.36 nm ± 0.5 nm, b = 6.62 nm ± 0.3 nm, c = 6.63 nm ± 0.3 nm, a = 90 grados, ß = 96 + 2 grados, ? = 90 grados, que tiene la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en las Figuras 2 a 5 tiene una forma cristalina con grupo espacial ?2?2?2? y dimensiones de células unitarias de a = 5.46 ± 0.3 nm, b= 12.25 '± 0.4 nm, c=13.0 ± 0.3 nm, a = 90 grados, ß = 90 grados, ? = 90 grados, que tiene la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 15 tiene una forma cristalina con grupo espacial P 6222 y dimensiones de células unitarias de a = 7.50 nm ± 0.3 nm, b = 7.50 nm ± 0.3 nm, c = 12.00 nm ± 0.5 nm, a = 90 grados, ß = 90 grados, ? = 120 grados, o que tiene la estructura definida por las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 16 tiene una forma cristalina con grupo espacial P6422 y dimensiones de células unitarias de a = 9.99 nm ± 0.5 nm, b = 9.99 nm ± 0.5 nm, c = 8.27 nm ± 0.3 nm, a · = 90 grados, ß = 90 grados, ? = 120 grados.
De manera preferente, el cristal del fragmento de polipéptido (variante) difracta los rayos X a una resolución de 2.8Á o mayor, de manera preferente 2.6Á o mayor, de manera más preferente 2.5Á o mayor, de manera aún más preferente 2.4Á o mayor, de manera mucho más preferente 2.1Á o mayor o 1.9Á o mayor. Por ejemplo, el cristal del fragmento de polipéptido (variante) difracta los rayos X a una resolución de 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8Á o mayor.
Es otro aspecto de la presente invención proporcionar un polinucleótido aislado que codifica los fragmentos de polipéptido PA mencionados en lo anterior (aislados) y variantes de los mismos de acuerdo con la presente invención.
En una modalidad preferida de la presente invención, el polinucleótido aislado codifica el fragmento de polipéptido PA que comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.
En otra modalidad preferida de la presente invención, el polinucleótido aislado codifica la variante de fragmento de polipéptido PA que comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina.
En una modalidad preferida adicional de la presente invención, el polinucleótido aislado codifica la variante de fragmento de polipéptido PA que comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 72 remplazados por el aminoácido glicina .
En otra modalidad preferida de la presente invención, el polinucleótido aislado codifica la variante de fragmento de polipéptido PA que comprende los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 69 remplazados por el aminoácido glicina.
Los métodos de biología molecular aplicados para obtener tales fragmentos de nucleótido aislado son generalmente conocidos por la persona experta en la técnica (para métodos de biología molecular estándares véase Sambrook y colaboradores, Eds . , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), que se incorpora en este documento a manera de referencia) . Por ejemplo, el RNA se puede aislar de células infectadas con virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A y cDNA generado al aplicar la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) usando ya sea cebadores aleatorios (por ejemplo, hexámeros aleatorios de decámeros) o cebadores específicos para la generación de los fragmentos de interés. Los fragmentos de interés posteriormente se pueden amplificar por PCR estándar usando cebadores específicos de fragmento.
Los polinucleótidos aislados que codifican los fragmentos de subunidad PA de RNA polimerasa dependiente de RNA de virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A se derivan de SEQ ID NO: 1. En este contexto, "derivado" se refiere al hecho de que SEQ ID NO: 1 codifica el polipéptido PA de longitud completa y, de esta manera, los polinucleótidos que codifican los fragmentos de polipéptido PA preferidos pueden comprender supresiones en los extremos 3' y/o 5' de los polinucleótidos como es requerido por los fragmentos de polipéptido PA respectivamente codificados.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende polinucleótido aislado de acuerdo con la presente invención. La persona experta en la técnica conoce bien las técnicas usadas para la incorporación de las secuencias de polinucleótidos de interés en los vectores (véase también Sambrook y colaboradores, 1989, supra) . Tales vectores incluyen cualquier vector conocido por la persona experta incluyendo vectores plásmidos, vectores cósmidos, vectores fago tales como fago lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o baculovirales , o vectores de cromosomas artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC) , cromosomas artificiales de levadura ' (YAC) , o cromosomas artificiales PI (PAC) . Los vectores pueden ser vectores de expresión adecuados para expresión procariótica o eucariótica. Los plásmidos pueden incluir un origen de replicación (ori) , un ciclo de clonación múltiple, y secuencias reguladoras tales como promotor (constitutivo o inducible) , sitio de iniciación de transcripción, sitio de enlace ribosomal, sitio de terminación de transcripción, señal de poliadenilación, y marcador de selección tal como resistencia a antibióticos o marcador auxotrófico con base en la complementación de una mutación o supresión. En una modalidad la secuencia de polinucleótidos de interés se enlaza operablemente a las secuencias reguladoras.
En otra modalidad, el vector incluye secuencias de nucleótidos que codifican etiquetas de epitopo, péptido o proteina que facilita la purificación de los fragmentos de polipéptido de interés. Tales etiquetas de epitopo, péptido o proteina incluyen, pero no se limitan a, etiqueta de hemaglutinina (HA-) , FLAG-, myc-tag, etiqueta de poli-His-, glutationa-S-transferasa- (GST-) , proteina de enlace a maltosa- (MBP-) , NusA-, y etiqueta de tioredoxina-, o etiquetas de proteina fluorescente tal como proteina fluorescente verde (mejorada) ((E)GFP), proteina fluorescente amarilla (mejorada) ( (E) ' YFP) , proteina fluorescente roja (RFP) derivada de especies Discosoma (DsRed) o monomérica proteina de fluorescencia ciano (mR FP) , (CFP) , y similares.
En una modalidad preferida, las etiquetas de epítopo, péptido, o proteína se pueden escindir del fragmento de polipéptido de interés, por ejemplo, usando una proteasa tal como trombina, Factor Xa, PreScission, TEV proteasa, y similares. De manera preferente, la etiqueta se puede escindir con una TEV proteasa. Los sitios de reconocimiento para tales proteasa son bien conocidos por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, la secuencia consenso de siete aminoácidos del sitio de reconocimiento TEV proteasa es Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser, donde X puede ser cualquier aminoácido y está en el contexto de la presente invención de manera preferente Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO: 12) . En otra modalidad, el vector incluye secuencias funcionales que conducen a la secreción del fragmento de polipéptido de interés en el medio de cultivo de las células hospederas recombinantes o en el espacio periplásmico de las bacterias. El fragmento de secuencia señal codifica usualmente un péptido señal comprendido de aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la secreción de la proteína de la célula. La proteína se secreta ya sea en el medio de crecimiento (bacteria gram-positiva) o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interior y exterior de la célula (bacteria gram-negativa bacteria) . De manera preferente existen sitios de procesamiento, que se .pueden escindir ya sea in vivo o in vitro codificados entre el fragmento de péptido señal y el gen extraño.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedera recom inante que comprende el polinucleótido aislado de acuerdo con la presente invención o el vector recombinante de acuerdo con la presente invención. Las células hospederas recombinante pueden ser células procarióticas tales como células arquea y bacterianas o células eucarióticas tales como células de levadura, de plantas, de insectos o de mamíferos. En una modalidad preferida la célula hospedera es una célula bacteriana tal como una célula de E. coli. La persona experta en la técnica conoce bien los métodos para introducir el polinucleótido aislado o el vector recombinante en la célula hospedera. Por ejemplo, las células bacterianas se pueden transformar fácilmente usando, por ejemplo, transformación química, por ejemplo, método de cloruro de calcio o electroporación . Las células de levadura se pueden transformar, por ejemplo, usando el método de transformación de acetato de litio o electroporación. Otras células eucarióticas se pueden transfectar, por ejemplo, usando kits de transfección basados en liposoma comercialmente disponibles tal como LipofectamineMR (Invitrogen) , kits de transfección basados en lípidos comercialmente disponibles tal como Fugene (Roche Diagnostics ) , transfección basada en polietilenglicol, precipitación de fosfato de calcio, pistola génica (biolistica) , electroporación, o infección viral. En una modalidad preferida de la invención, la célula hospedera recombinante expresa el fragmento de poJ.inucleótido de interés. En aún una modalidad más preferida, la expresión conduce a fragmentos de polipéptido solubles de la invención. Estos fragmentos de polipéptido se pueden purificar usando métodos de purificación de ' proteínas bien conocidos por la persona experta en la técnica, tomando opcionalmente ventaja de las etiquetas de epítopo, péptido, o proteína mencionadas en lo anterior.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para identificar compuestos, que modulan la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A o una variante del mismo que comprende las etapas de: (a) construir un modelo de computadora de sitio activo definido por (i) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 1, (ii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 2, (iii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 3, (iv) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con ' la presente invención como se muestra en la Figura 4, (v) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 5, (vi) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido (variante) de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 15, y/o (vii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido (variante) de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 16, (b) seleccionar un compuesto modulador potencial mediante un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) ensamblar fragmentos moleculares en el compuesto, (ii) seleccionar un compuesto de una base de datos de moléculas pequeñas, y (iii) diseñar desde¦ sus componentes básicos el ligando del compuesto; (c) emplear medios computacionales para llevar a cabo una operación de programa de ajuste entre modelos de computadora del compuesto y el sitio activo a fin de proporcionar una configuración con energía minimizada del compuesto en el sitio activo; y (d) evaluar los resultados de la operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y el modelo de sitio activo, mediante lo cual evaluar la. capacidad del compuesto para asociarse con el sitio activo.
En una modalidad preferida, un modelo de computadora del sitio activo definido por (i) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención (es decir coordenadas estructurales de aminoácido) como se muestra en la Figura 1 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 1, (ii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención (es decir coordenadas estructurales de aminoácido) como se muestra en la Figura 2 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 2, (iii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente ' invención como se muestra en la Figura 3 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 3, (iv) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 4 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 4, (v) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de acuerdo con la presente invención como se muestra en la Figura 5 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 5, (vi) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido (variante) de acuerdo con la presente invención (es decir coordenadas estructurales de- aminoácido) como se muestra en la Figura 15 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 15, y/o (vii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido (variante) de acuerdo con la presente invención (es decir coordenadas estructurales de aminoácido) como se muestra en la Figura 16 y las coordenadas estructurales de los cationes divalentes como se muestra en la Figura 16 se construyen en la etapa a) del método de la presente invención.
De manera preferente, el compuesto modulador asociado con, se enlaza a de manera preferente, el sitio endonucleoliticamente activo dent.ro de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo. El compuesto modulador puede incrementar o disminuir, de manera preferente disminuir la actividad endonucleolitica .
En una modalidad preferida de este aspecto de la presente invención, el compuesto que modula la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico ' HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo disminuye la actividad, de manera más preferente el compuesto inhibe la actividad. De manera preferente, el compuesto disminuye la actividad endonucleolitica de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo por 50%, de manera más preferente por 60%, de manera aún más preferente por 70%, de manera aún más preferente por 80%>, de manera aún más preferente por 90%, y de manera mucho más preferente por 100% comparada con la actividad endonucleolitica de la subunidad PA o una variante de la misma sin el compuesto pero de otra manera con las mismas condiciones de reacción, es decir, condiciones amortiguadoras, tiempo 'de reacción y temperatura. Se prefiere particularmente que el compuesto disminuya o inhiba específicamente la actividad endonucleolitica de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo pero no disminuya o inhiba la actividad endonucleolitica de otras endonucleasas, en particular de endonucleasas de mamífero, al mismo grado, de manera preferente no en todos.
La presente invención permite el uso de técnicas de diseño molecular para identificar, seleccionar o diseñar compuestos que modulan potencialmente la actividad endonucleolitica de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo, con base en las coordenadas estructurales del sitio endonucleoliticamente activo (nativo) de acuerdo con las Figuras 1. Por primera vez, la presente invención permite adicionalmente la identificación optimizada, selección y diseño de compuestos que modulan potencialmente la actividad endonucleolitica de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza- A o variante del mismo, con base en las coordenadas estructurales del sitio endonucleoliticamente activo de acuerdo con las Figuras 2 a 5, 15 o 16. Las coordenadas estructurales se han logrado a partir de fragmentos de polipéptido (variantes de fragmento de polipéptido) de acuerdo con la presente invención que no se han co-cristalizado con un compuesto modulador, de manera preferente con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetil) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico EMBL-R05-3) (véase las Figuras 2 y 3) , con ácido 4- [4- [ (4-clorofenil) metil] -1- (ciclohexilme'til) -4-piperidinil] -2-hidroxí-4-oxo-2-butenoico ¦ (EMBL-R05-2 ) (véase la Figura 4), con Monofosfato de ribo-Uridina (rUMP) (véase la Figura 5) , con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil ) metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-.2-butenoico (EMBL-R05-1) (véase la Figura 15), o con [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- (3, 4, 5-trihidroxifenil) chroman-3-il] 3, , 5-trihidroxibenzoato (EGCG) (véase la Figura 16) (también véase las Tablas 1 o 2) . Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido (variante) de la presente invención sin compuesto enlazado (es decir fragmento de polipéptido nativo (variante) ) (véase, por ejemplo, la Figura 1) difieren de las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido (variante) de la presente invención con el compuesto enlazado (véase, por ejemplo, las Figuras 2 a 5, 15 o 16) conforme el fragmento de polipéptido (variante) cambia su configuración después del enlace del compuesto. De esta manera, este nuevo conocimiento tridimensional permite el diseño optimizado de modificaciones a inhibidores existentes a fin de mejorar su potencia o el diseño y optimización de inhibidores novedosos que bloquean efectivamente la actividad de endonucleasa .
Tales modelos predictivos son valiosos en vista de los costos más altos asociados con la preparación y prueba de muchos compuestos diversos que pueden modular posiblemente la actividad endonucleolitica. A fin de usar las coordenadas estructurales generadas por el fragmento de polipéptido PA pandémico H1N1 2009 de Influenza A (variante) es necesario convertir las coordenadas estructurales en una forma tridimensional. Esto se logra a través del uso de un software comercialmente disponible que es capaz de genera representaciones gráficas tridimensionales de moléculas o pociones de las mismas ' de un conjunto de coordenadas estructurales. Un ejemplo para tal programa de computadora es MODELER (Sali y Blundell,. 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815 as implemented in the Insight II Homology software package (Insight II (97.0), Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA) ) .
Una persona experta en la técnica puede usar varios métodos para clasificar entidades químicas o fragmentos para su capacidad de modular la actividad endonucleolítica de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variantes de polipéptido PA de subunidad PA pandémica H1N1 2090 de Influenza A. Este proceso se puede comenzar por una inspección vidual de, por ejemplo, un modelo de computadora tridimensional del sitio endonucleoliticamente activo de PA con base en las coordenadas estructurales de acuerdo con las Figuras 1 a 5, 15 o 16. Los fragmentos seleccionados o compuestos químicos posteriormente se pueden colocar en una variedad de orientaciones o acoplar dentro del sitio activo. El acoplamiento se puede lograr usando software tales como Cerius, Quanta, y Sybyl (Tripós Associates, St . Louis, MO) , seguido por minimización de energía y dinámica molecular con campos de fuerza de dinámica molecular estándar tales como OPLS-AA, CHARMM, y AMBER. Los programas de computadora especializados adicionales que pueden ayudar a la persona experta en la técnica en el proceso de seleccionar compuestos adecuados o fragmentos incluyen, por ejemplo, (i) AUTODOCK (Goodsell y colaboradores, 1990, Proteínas: Struct., Fund. , Genet. 8: 195-202; AUTODOCK es disponible de The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) y (ii) DOCK (Kuntz y colaboradores, 1982, J. Mol. Biol. 161:269-288; DOCK es disponible de the University of California, San Francisco, CA) .
Una vez que los compuestos o fragmentos adecuados se han seleccionado, se pueden diseñar o ensamblar en un solo compuesto o complejo. Esta construcción de modelo manual se lleva a cabo usando un software tal como Quanta o Sybyl. Los programas útiles que ¦ ayudan a la persona experta en la conexión de compuestos o fragmentos individuales incluyen, por ejemplo, (i) CAVEAT (Bartlett y colaboradores, 1989, in Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Publication, Royal Chem. Soc. 78: 182-196; Lauri y Bartlett, 1994, J. Comp. Aid. Mol. Des. 8:51-66; CAVEAT es disponible de the University of California, Berkley, CA) , (ii) sistemas de base de datos 3D tales como ISIS (MDL Information Systems, San Leandro, CA; reviewed in Martin, 1992, J. Med. Chem. 35:2145-2154), y (iii) HOOK (Eisen y colaboradores, 1994, Proteínas: Struct., Funct . , Genet . 19:199-221; HOOK es disponible de Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA) .
Otro procedimiento permitido por esta invención, es la clasificación computacional de bases de datos de moléculas pequeñas para compuestos que se pueden enlazar en totalidad o en parte al sitio endonucleolíticaménte activo de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o sitios activos de variantes del polipéptido PA pandémico H1N1 2009 de Influenza A. En esta clasificación, la calidad de ajusbe de tales compuestos al sitio activo se puede evaluar ya sea por complementariedad de forma o por energía de interacción estimada (Meng y colaboradores, 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524).
Alternativamente, un modulador potencial para la actividad endonucleolítica de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante de polipéptido pandémico H1N1 2009 de Influenza A de la misma, de manera preferente un inhibidor de la actividad endonucleolítica, se puede diseñar desde sus componentes básicos sobre la base de la estructura 3D del fragmento de polipéptido PA de acuerdo con las Figuras 1 a 5. Existen varios métodos de diseño de ligando de nuevo disponibles para la persona experta en la técnica. Tales métodos incluyen (i) LUDI (Bohm, 1992, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78; LUDI es. disponible de Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA) , (ii) LEGEND (Nishibata y Itai, Tetrahedron 47:8985-8990; LEGEND es disponible de Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA) , (iii) LeapFrog (disponible de Tripos Associates, St . Louis, MO) , (iv) SPROUT (Gillet y colaboradores, 1993, J.' Comp. Aid. Mol. Des. 7:127-153; SPROUT es disponible de the University of Leeds, RU) , (v) GROUPBUILD (Rotste'in y Murcko, 1993, J. ed. Chem. 36: 1700-1710), y (vi) GROW (Moon y Howe, 1991, Proteínas 11:314-328) .
Además, varias técnicas de modelación molecular (incorporadas en este documento a manera de referencia) que pueden soportar a la persona experta en la técnica en el diseño de primera . vez y modelación de moduladores y/o inhibidores potenciales del sitio endonucleolíticamente activo, de manera preferente compañeros de enlace del sitio endonucleolíticamente activo, se han descrito, e incluyen por ejemplo, Cohén y colaboradores, 1990, ' J. Med. Chem. 33:883-894; Navia y Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210; Balbes y colaboradores, 1994, Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, Lipkowitz and Boyd, Eds . , VCH, Nueva York, páginas 37-380; Guida, 1994, Curr. Opin. Struct. Biol. 4:777-781.
Una molécula diseñada o seleccionada por enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variantes de la misma se pueden optimizar además computacionalmente de modo que en su estado enlazado carece de manera preferente de interacción electrostática repulsiva con la región objetivo. Tales interacciones no de complementariedad (por ejemplo, electrostáticas) incluyen interacciones de carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo repulsivas. Específicamente, la suma de todos las interacciones electrostáticas entre el compuesto de enlace y la bolsa de enlace en un estado enlazado, hacen de manera preferente una contribución neutra o favorable a la entalpia del enlace. Los programas de computadora específicos que pueden evaluar una energía de deformación de compuesto e interacción electrostática son disponibles en la técnica. Ejemplos de programas adecuados incluyen (i) Gaussian 92, revisión C (Frisch, Gaussian, Incorporated, Pittsburgh, PA) , (ii) AMBER, versión 4.0 (Kollman, University of California, San Francisco, CA) , (iii) QUANTA/CHAR M (Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA) , (iv) OPLS-AA (Jorgensen, 1998, Enciclopedia of Computational Chemistry, Schleyer, Ed., Wiley, Nueva York, Vol. 3, páginas 1986-1989), y (v) Insight II/Discover (Biosysm Technologies Incorporated, San Diego, CA) . Estos programas se pueden implementar, por ejemplo, usando una estación de trabajo Silicon Graphics, IRIS 4D/35 o estación de trabajo IBM RISC/6000 modelo 550. Otros sistemas de hardware y paquetes de software son conocidos por aquellas personas expertas en la técnica.
Una vez que una molécula de interés se ha seleccionado o diseñado, como se describe en lo anterior, las sustituciones posteriormente se pueden hacer en algunos de sus átomos o grupos laterales a fin de mejorar o modificar sus propiedades de enlace. En general, las sustituciones iniciales son conservadoras, es decir, el grupo de reemplazo se aproximará al mismo tamaño, forma, hidrofobicidad y carga como el grupo original. Por su puesto, se debe entender que los componentes conocidos en la técnica para alterar la conformación se deben evitar. Estos compuestos químicos sustituidos posteriormente se pueden analizar para eficiencia de ajuste al sitio endonucleolíticamente activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma por los mismos métodos de computadora descritos con detalle en lo anterior.
En una modalidad del método descrito en lo anterior de la presente invención, el sitio endonucleolíticamente activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma compren los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Lys34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Tyr24 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Arg84 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Phel05 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la. misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Tyrl30 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, e Ile38 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Argl24 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, y Tyr24 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, . Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, y Arg84 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los. aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Gl'ull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, y Phel05 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, PhelOS, y Tyrl30 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl 30, e Ile38 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38 y Argl24 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
En todavía .. otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Glu26 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24 y Glu26 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Lysl34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, y Lysl34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, ¦ el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34-, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Gly26 y Lysl34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Del20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Gly26 y Lysl34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, yrl30, Ile38, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Glu26, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41,' Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Glu26, y Leu 106 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Lysl34, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, LysB4, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Lysl34, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Lysl34, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lysl34, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38 , · Argl24 , Glu26, Lysl34, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En todavía otra modalidad, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, • Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
En una modalidad adicional, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08," Del20, His41, y Glu26 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En una modalidad adicional, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Lysl34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En una modalidad adicional, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En una modalidad adicional,- el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En una modalidad adicional, el sitio activo comprende -los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, y Lysl34 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En una modalidad adicional, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, y Leul06 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma. En una modalidad adicional, el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de¦ la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
En una modalidad del método descrito en lo anterior de la invención, el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, y His que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Lys34 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 y Lys34 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glüll9, Aspl08, Ilel20, His41 y Tyr24 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, y Tyr que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Tyr24 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Arg84 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His y Arg que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Arg84 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Phel05 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His y Phe que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Phel05 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Tyrl30 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His y Tyr que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Tyrl30 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Ile38 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His y lie que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 y Ile38 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl'08, Ilel20, His41, y Argl24 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, y Arg que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Argl24 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16.
En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, y Tyr24 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, y Tyr que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, y Tyr24 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o- 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 , . Lys34 , Tyr24, y Arg84 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, Lys, Tyr, y Arg que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, y Arg84 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, y Phel05 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, y Phe que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, y Phel05 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, y Tyr 130 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, y Tyr que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24,. Arg84, Phel05, y Tyrl30 de SEQ ' ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ED NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, y Ile38 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, y lie que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, y Ile38 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Argl24 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, lie, y Arg que corresponde a los ' aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Argl24 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16.
En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Glu26 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, y Glu que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Hel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, PhelOS, Tyrl30, Ile38, y Glu26 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra · modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24,- Arg84, Phel05, Tyrl30, De38, y Lysl34 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, Be, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, lie, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, -Ile38, y Lysl34 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por. las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Leul06 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, y Leu que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Leul06, de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Lysl37 de SEQ ID NO:' 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Gly26 y Lysl34 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los. aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, Glu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Lysl34 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, He38, Leul06, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, Leu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Leul06, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, Glu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Leu 106 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, Glu, y Leu, que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, y Leul06 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Lys 134, y Leul06 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, lie, Lys, y Leu que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Lysl34, y Leul06 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34', Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Lysl34, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, lie, Lys, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Lysl34, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad' PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lysl34, y Leul06 de acuerdo con las .Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, lie, Glu, Lys, y Leu que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lysl34, y Leul06 de SEQ ED NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lys 134, Leul06, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, Glu, Lys, Leu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de SEQ ED NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En todavía otra modalidad, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, He, Arg, Glu, Lys, Leu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acüerdo con las Figuras 15 o 16.
En una modalidad adicional, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Glu26 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, y Glu que corresponde a los aminoácidos Glu80, 'G1U119, Aspl08, Ilel20, His41, y Glu26 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En una modalidad adicional, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Lysl34 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, -Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Lysl34 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En una modalidad adicional, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Leul06 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, y Leu que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Leul06 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En una modalidad adicional, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, G1Ú119, Aspl08, Ilel20, His41, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, lie, His, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo-con las Figuras 15 o 16. En una modalidad adicional, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, y Lysl34 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Glu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, y Lysl34 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En una modalidad adicional, el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, y Leul06 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Glu, Lys, y Leu que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, . y Leul06 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16. En una modalidad adicional, 'el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, Leu 106, y Lysl37 de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de la subunidad PA Glu, Glu, Asp, He, His, Glu, Lys, Leu, y Lys que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16.
Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que los aminoácidos His41, Glu80, Aspl08, Glull9, y Ilel20 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 dentro del sitio activo de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A son requeridos para el enlace de cationes divalentes (véase por ejemplo las Figuras 1 y 6) , mientras que los aminoácidos Tyr24, Lys34, Ile38, Arg84, Phel05, y Tyrl30 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 dentro del sitio activo de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A son requeridos para el enlace del compuesto (es decir el inhibidor) en las estructuras mostradas en las Figuras 2 a 5 (también véase las Figuras 7 a 10 y las Tablas 1 y 2) y son aquellos aminoácidos que conforman los cambios de la estructura no ligada (véase las Figuras 1 y 6) . Además, los inventores de la presente invención determinaron que los residuos de aminoácido Leul06, Lysl34, Lysl37 y Glu26 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 dentro del sitio activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A también son requeridos para hacer contacto con los compuestos sometidos a prueba (véase las Tablas 1 y 2, Figuras 2 a 5 y Figuras 7 a 10) . También véase las Figuras 15 a 19. Además, los inventores de la presente invención han descubierto que el aminoácido Argl24 dentro del sitio activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A es requerido para la interacción del compuesto (es decir el inhibidor) en las estructuras mostradas en las Figuras 16 y 18. Este conocimiento tridimensional de los residuos de interacción de compuesto/ligando y la plasticidad del sitio activo es importante para el diseño optimizado de las modificaciones a los inhibidores existentes a fin de mejorar su potencia. Además, el diseño, identificación y selección de nuevos compuestos antivirales que interactúan con estos aminoácidos es, de esta manera, altamente preferible.
Si la modelación por computadora de acuerdo con los métodos descritos ya mencionados indica el enlace de un compuesto al sitio activo de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o una variante de la misma, el compuesto se puede sintetizar y opcionalmente el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se puede formular con uno o más excipiente (s) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable. De esta manera, el método descrito en lo anterior puede comprender la etapa' adicional de (e) sintetiza el compuesto y formular opcionalmente el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con uno o más excipiente ( s) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable.
Opcionalmente, la capacidad del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o de una formulación del mismo para modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad endonucleolitica de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante de la misma se puede someter a prueba in vitro o in vivo que comprende la etapa adicional de (f) poner en contacto el compuesto con el fragmento de polipéptido PA o variante del mismo de acuerdo con la presente invención o la célula hospedera recombinante de acuerdo con la presente invención y determinar la capacidad del compuesto a (i) enlazarse al sitio activo y/o (ii) modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad endonucleolitica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo. La calidad del ajuste de tales compuestos al sitio activo se puede evaluar ya sea por la compleme'ntariedad de forma o por la energía de interacción estimada (Meng y colaboradores,. 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524). Los métodos para sintetizar los compuestos son bien conocidos por la persona experta en la técnica o tales compuestos pueden ser comercialmente disponibles .
Es otro aspecto. de la presente invención proporcionar un compuesto que sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante de la misma de acuerdo con la presente invención. Se prefiere que el compuesto sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA o variante de la misma de acuerdo con la presente invención al asociarla con, de manera preferente al enlazarla con, el sitio endonucleolíticamente activo de la subunidad PA o variante de la misma.
También es un aspecto de la presente invención proporcionar un compuesto que sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención. Se prefiere que el compuesto sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo de acuerdo con la presente invención al asociarla con, de manera preferente enlazarla a, el sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo.
Es un aspecto adicional de la presente invención proporcionar un compuesto que sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la Familia Orthomyxoviridae, De la de la familia · Bunyaviridae y/o De la familia Arenviridae. Se prefiere que el compuesto es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la Familia Orthomyxoviridae, De la de la familia Bunyaviridae y/o De la familia Arenviridae, al asociarla con, de manera preferente enlazarla a, el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA.
De manera preferente, el sitio endonucleoliticamente activo de las subunidades PA mencionadas en lo anterior o variantes de las mismas, o fragmentos de polipéptido de la subunidad PA o variantes' de los mismos tiene la estructura como se define en lo anterior.
De esta manera, se prefiere que el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
Es más preferido que el sitio activo comprenda los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Del20, His41, Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, y Ile38 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2. o los aminoácidos que corresponden a la misma, o comprenda los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Argl24 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
También es más preferido que el sitio activo comprenda los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
Es mucho más preferido que el sitio activo comprenda los aminoácidos Glu8Ó, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma, o comprenda los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, His41 Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, Argl24, Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma .
De manera preferente, el sitio endonucleoliticamente activo' de las subunidades PA mencionadas en lo anterior o variantes de las mismas, o fragmentos de polipéptido de la subunidad PA o variantes de los mismos se define por las coordenadas estructurales de la subunidad PA como se menciona' en lo anterior.
La capacidad de un compuesto de asociarse con, de manera preferente de enlazarse a, el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA mencionado en lo anterior o variante de la misma, o fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del- mismo y/o modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir la actividad endonucleolitica de la subunidad PA o variante de la misma, o fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo se pueden evaluar fácilmente. Por ejemplo, la subunidad PA purificada o para aumento de polipéptido déla subunidad PA y un substrato del mismo tal como RNA 'en forma de asidera de sartén o NAA de hebra individual ponen en contacto en presencia o ausencia de cantidades variantes del compuesto de prueba y se incuban durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, durante 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, o 90 minutos. Se seleccionan las condiciones de reacción tal que la subunidad PA o fragmento de polipéptido de la subunidad PA está endonucleoliticamente activos sin el compuesto de prueba. El substrato posteriormente se analiza para degradación/escisión endonucleolitica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel. Alternativamente,' tal compuesto puede comprender una molécula de substrato etiquetada que proporciona una señal cuando la molécula de substrato se escinde endonucleoliticamente pero no proporciona una señal si está intacta. Por ejemplo, la cadena de polinucleótidos de substrato se puede etiquetar con la molécula reportera fluorescente y un inactivador de fluorescencia tal que el reportero fluorescente se inactiva siempre y cuando la cadena de polinucleótidos de substrato esté intacta. En caso de que la cadena de polinucleótidos de substrato se escinde, el reportero fluorescente y el inactivador se separan, de esta manera, el reportero fluorescente emite una señal que se puede detectar, por ejemplo, por un lector ELISA. Métodos adecuados adicionales se describen posteriormente.
De manera preferente, el compuesto es identificable por el método descrito en lo anterior. De manera más preferente, el compuesto se identifica por el método descrito en lo anterior.
El compuesto identificable por el método descrito en lo anterior puede ser capaz de modular la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma. El compuesto identificable por el método descrito en lo anterior puede ser capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento del polipéptido de subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención. También es posible que el compuesto identificable por el método mencionado en lo anterior pueda ser capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera mucho más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la Familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae.
Los compuestos de la presente invención pueden ser cualquier agente incluyendo, pero no restringido a, péptidos, peptoides, polipéptidos , proteínas' (incluyendo anticuerpos), lípidos, metales, nucleótidos, nucleósidos, ácido nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, compuestos químicos, elementos, sacáridos, isótopos, carbohidratos, agentes formadores de imagen, lipoproteinas , glicoproteínas , enzimas, sondas analíticas, poliaminas y combinaciones y derivados de los mismos. El término "moléculas pequeñas" se refiere a moléculas que tiene un peso molecular entre 50 y aproximadamente 2,500 Daltons, de manera preferente en el intervalo de 200-800 Daltons. Además, un compuesto de prueba de acuerdo con la presente invención puede comprender opcionalmente una etiqueta detectable. Tales etiquetas incluyen, pero no se limitan a, etiquetas enzimáticas, compuestos o elementos de radioisótopos o radioactivos, compuestos o metales fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos .bioluminiscentes .
En una modalidad preferida del compuesto de acuerdo con la presente invención, el compuesto no es un ácido 2-dioxobutanoico 4-sustituido, ' un ácido 4-dioxobutanoico 4-sustituido, un ácido 2 , -dioxobutanoico 4-sustituido, una 2 , 6-dicetopiperazina o un derivado de la misma, una 2,6-dicetopiperazina sustituida o un derivado de la misma, pirazina-2 , ß-diona o pirazina-2, 6-diona sustituida tal como flutimida, un ácido N-hidroxámico, o una N-hidroximida .
En particular, el compuesto de acuerdo con la presente invención no es un compuesto de acuerdo con la Fórmula I : Me, Et, Ph acilo, carbamoilo, sulfonilo.
Fórmula En otra modalidad preferida del compuesto de acuerdo con la presente invención, el compuesto no es 4- [3-[ ( 4-clorofenil ) metil ] -1- ( fenilmetil ) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, ácido 4- '[4- [ (4-clorofenil ) m etil]-1- (ciclohexilmetil ) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, onofosfato de ribo-Uridina (rUMP) , desoxi-timidinmonofosfato (dTMP) , o ácido 2, 4-dioxo-4-fenilbutanoico (DPBA) .
En una modalidad preferida adicional del compuesto de acuerdo con la presente invención, el compuesto no es una catequina, de manera preferente no es un galato de '(-)-epigalocatequina (EGCG) , tal como [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2-(3, 4, 5-trihidroxifenil) cliroman-3-il ] 3,4,5-trihidroxibenzoato, un galato de (-) -epicatequina (ECG) , (-)-epigalocatequina (EGC) , (-) -epicatequina (EC) , o ácido gálico (GA) . En otra modalidad preferida del compuesto de la presente invención, el compuesto no es una fenetilfenilftalimida, un análogo . de fenetilfenilftalimida derivada de talidomida o raltegravir (también un derivado de ácido dicetobutanoico) .
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método (in vitro) para identificar compuestos, que modulan, de manera preferente disminuyen, de manera más preferente inhiben, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo que comprende las etapas de: (i) poner en contacto el fragmento de polipéptido o variante del mismo de acuerdo con la presente invención o la célula hospedera recombinante de acuerdo con la presente invención con un compuesto de prueba, y (ii) analizar la capacidad' del compuesto de prueba para modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo.
Se prefiere que los compuestos modulen, de preferente disminuyan, de manera más preferente inhiban, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo al asociarla con, de manera preferente enlazarla a, el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método (in vitro) para identificar compuestos, que se enlazan al sitio endonucleoliticamente activo, (y) de manera preferente modulan, de manera más preferente disminuyen, de manera mucho más preferente inhiben, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo que comprende las etapas de: (i) poner en contacto el fragmento de polipéptido o variante del mismo de acuerdo con la presente invención o la célula hospedera recombinante de acuerdo con la presente invención con un compuesto de prueba, y (ii) analizar la capacidad del compuesto de prueba para enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo, (y) de manera preferente modular, de manera más preferente disminuir, de manera mucho más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo.
En una modalidad., la interacción entre el fragmento de polipéptido PA pandémico H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo y un compuesto de prueba se pueden analizar en forma de un ensayo de interacción. Por ejemplo, el fragmento de polipéptido PA o variante del mismo de acuerdo con la invención se puede purificar y se puede inmovilizar en cuentas. En una modalidad, el fragmento de polipéptido PA inmovilizado en cuentas se puede poner en contacto, por ejemplo, con (i) otra proteina purificada, fragmento de polipéptido o péptido, (ii) una mezcla de proteínas, fragmentos de polipéptido, o péptidos, o (iii) un extracto de célula o tejido, y se puede verificar el enlace de proteínas, fragmentos de polipéptido, péptidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en combinación con tinción de Coomassie o técnica Western blot . Los compañeros de enlace desconocidos se pueden identificar por el análisis espectrométrico de masas.
En otra modalidad, la interacción entre el fragmento de polipéptido PA pandémico H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo y un compuesto de prueba se pueden analizar en forma de un experimento basado en ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) . En una modalidad, el fragmento de polipéptido PA o variante del mismo de acuerdo con la invención se puede inmovilizar sobre la superficie.de una placa ELISA y se pone en contacto con el compuesto de prueba. En enlace del compuesto de prueba se puede verificar, por ejemplo, para proteínas, polipéptidos , péptidos, y compuestos etiquetado con epitopos mediante anticuerpos específicos para el compuesto de prueba o la etiqueta de epitopos. Estos anticuerpos se pueden acoplar directamente a una enzima o detectar con un anticuerpo secundario acoplado a la enzima que - en combinación con los substratos apropiados - lleva a cabo reacciones quimioluminiscentes (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante) o reacciones colorimétricas (por ejemplo, fosfatasa alcalina) . En otra modalidad, el enlace de los compuestos que no se pueden detectar por anticuerpos se puede verificar por etiquetas acopladas directamente a los compuestos de prueba. Tres etiquetas pueden incluir etiquetas enzimáticas, compuestos o elementos de radioisótopo o radiactivos, compuestos fluorescentes o metales, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes . En otra modalidad, los compuestos de prueba se podrían inmovilizar sobre la placa de ELISA y poner en contacto con el fragmento de polipéptido PA o variantes del mismo de acuerdo con la invención. El enlace del polipéptido se puede verificar por un anticuerpo específico de fragmento de polipéptido PA y reacciones de quimioluminiscencia o colorimétricas como se describe en lo anterior.
En una modalidad adicional, los fragmentos . de polipéptido PA pandémico H1N1 2009 de Influenza A purificado o variantes se pueden incubar con un arreglo de péptidos y se puede analizar el enlace de los fragmentos de polipéptido Pas a manchas de péptidos especificas que corresponden a una secuencia de péptidos especifica, por ejemplo, por anticuerpos específicos de polipéptido PA, anticuerpos que se dirigen contra una etiqueta de epítopos fusionada al fragmento de polipéptido PA, o por una señal de fluorescencia emitida por una etiqueta fluorescente acoplada al fragmento de polipéptido PA.
En otra modalidad, la célula hospedera recombinante de acuerdo con la presente invención se pone en contacto con un compuesto de prueba. Esto se puede lograr mediante la co-expresión de proteínas o polipéptidos de prueba y verificación de interacción, por ejemplo, mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) o co-inmunoprecipitación . En otra modalidad, los compuestos de prueba ' directamente etiquetados se pueden agregar al medio de las células hospederas recombinantes . El potencial de compuesto de prueba para penetrar las membranas y enlazarse al fragmento de polipéptido PA puede ser, por ejemplo, verificado por la inmunoprecipitación del polipéptido y verificación de la presencia de la etiqueta.
En otra modalidad, la capacidad del compuesto de prueba de modular, de mañera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir la actividad endonucleolitica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo se evalúa. Por ejemplo, el fragmento de polipéptido de la subunidad PA purificado y un substrato del mismo tal como RNA en forma de asidera de sartén o DNA de hebra individual se ponen en contacto en presencia o ausencia de cantidades variantes del compuesto de prueba y se incuban durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, durante 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, o 90 minutos. Las condiciones de reacción son seleccionadas tal que el polipéptido de subunidad PA está endonucleoliticamente activos sin el compuesto de prueba. Posteriormente el substrato se analiza para degradación/ escisión endonucleolitica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel. Alternativamente, tal compuesto de prueba puede comprender una molécula de substrato etiquetada que proporciona una señal cuando la molécula de substrato se escinde endonucleoliticamente pero no proporciona una señal si está intacta. Por ejemplo, la cadena de polinucleótidos de substrato se puede etiquetar con una molécula reportera fluorescente y un inactivador de fluorescencia tal que el reportero fluorescente se inactiva siempre y cuando la cadena de polinucleótidos de substrato está intacta. En caso que la cadena de polinucleótidos de substrato se escinde, el reportero fluorescente y . el inactivador se separan, de esta manera, el reportero fluorescente emite una señal que se puede detectar, por 'ejemplo, por un lector ELISA. Este entorno experimental se puede aplicar en un formato de placa de múltiples pocilios y es adecuado para clasificación de alto rendimiento de compuestos con respecto a su capacidad de modular, disminuir, o inhibir la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variantes del mismo.
De manera preferente, la capacidad del compuesto de prueba de inhibir la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo se analiza en los métodos descritos en lo anterior.
En una modalidad preferida, los métodos descritos en lo anterior para . identificar compuestos que se asocian con, de manera preferente se enlazan a, el sitio endonucleoliticamente activo, modulan, disminuyen, y/o inhiben la actividad endonucleolitica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo se llevan a cabo en un entorno de alto rendimiento. En una modalidad preferida, los métodos se llevan a cabo en una placa de microtitulo de múltiples pocilios como se describe en lo anterior usando fragmentos de polipéptido PA o variantes de los mismos de acuerdo con la presente invención y compuestos de prueba etiquetados.
En una modalidad preferida, los compuestos de prueba se derivan de bibliotecas de compuestos sintéticos naturales. Por ejemplo, las bibliotecas de compuestos sintéticos son comercialmente disponibles de aybridge Chemical Co . (Trevillet, ' Cornwall, RU) , ChemBridge Corporation (San Diego, CA) , o Aldrich (Milwaukee, WI) . Una biblioteca de compuestos naturales es, por ejemplo, disponible de TimTec LLC (Newark, DE) . Alternativamente, se pueden usar bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, de plantas y animales. Adicionalmente, los compuestos de prueba se pueden producir sintéticamente usando química de combinación ya sea como compuestos individuales o como mezclas.
En otra modalidad, el efecto inhibidor del compuesto identificado en el ciclo de vida del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A se puede someter a prueba en un entorno in vivo. Una línea de células que es susceptible para infección del virus de Influenza tal como células de riñon embriónicas humanas 293T, células de riñon caninas Madin-Darby, o fibroblastos embriónicos de pollo se pueden infectar con el virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A en presencia o ausencia de compuestos identificado. En una modalidad preferida, el compuesto identificado se puede agregar al medio de cultivo de las células en varias concentraciones. La formación de placa viral se puede usar como lectura para la capacidad infecciosa del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A y se puede comparar entre las células que se han tratado con el compuesto y las células identificadas que no se han tratado.
En una modalidad adicional de la invención, el compuesto de prueba aplicado en cualquiera de los métodos descritos en lo anterior es una molécula pequeña. En una modalidad preferida, la molécula pequeña se deriva de una biblioteca, por ejemplo, una biblioteca inhibidora de moléculas pequeñas. En otra modalidad, el compuesto de prueba es un péptido o proteina. En una modalidad preferida, el péptido o proteina se deriva de una biblioteca de péptidos 3o proteínas .
En otra modalidad de los métodos descritos en lo anterior para identificación . computacional así como in vitro de compuestos que se asocian con, de manera preferente se enlazan a, el sitio endonucleolíticamente activo, modulan, disminuyen, y/o inhiben la actividad endonucleolítica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención, los métodos comprenden además la etapa de formular el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma con uno o más excipiente (s) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable.
Como ya se mencionó en lo anterior, es un aspecto de la presente invención proporcionar un compuesto que sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma de acuerdo con la presente invención. Se prefiere que el compuesto es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA o variante de la misma de acuerdo con la presente invención al asociarla con, de manera preferente enlazarla a, el sitio endonµcleoliticamente activo de la subunidad PA o variante de la misma.
También es un aspecto de la presente invención proporcionar un compuesto que sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención. Se prefiere que el compuesto sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más .preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo dé acuerdo con la presente invención al asociarla con, de manera preferente enlazarla a, el sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo.
Es un aspecto adicional de la presente invención proporcionar un compuesto que sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de " otros virus, de manera preferente de virus de la Familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae. Se prefiere que el compuesto sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, al asociarla con, de manera preferente enlazarla a, el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA.
La capacidad de un compuesto de asociarse con, de manera preferente enlazarse a, el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA mencionado en lo anterior o variante de la misma, o fragmento de polipéptido de la subunidad ?? o variante del mismo, y/o modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir la actividad endonucleolitica de la subunidad PA o variante de la misma, o fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo se puede evaluar fácilmente. Por ejemplo, la subunidad PA purificada o fragmento de polipéptido de la subunidad PA y un substrato del mismo tal como un RNA en forma de asidera de sartén o DNA de hebra individual se ponen en contacto en presencia o ausencia de cantidades variantes del compuesto de prueba . y se incuban durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, durante 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, o 90 minutos. Las condiciones de reacción son seleccionadas tal que la subunidad PA o fragmento de polipéptido de la subunidad PA está endonucleoliticamente activo sin el compuesto de prueba. El substrato posteriormente se analiza para degradación/escisión endonucleolítica, por ejemplo mediante electroforesis en gel. Alternativamente, tal prueba puede comprender una molécula de substrato etiquetada que proporciona una señal cuando la molécula de substrato se escisa endonucleoliticamente pero no proporciona una señal si está intacta. Por ejemplo, la cadena de polinucleótido de substrato se puede etiquetar con una molécula reportero fluorescente y un inactivador de fluorescencia tal que el reportero fluorescente se inactiva siempre y cuando la cadena de polinucleótidos de substrato esté intacta. En caso de que la cadena de polinucleótidos de substrato se escinda, el reportero fluorescente y el inactivador se separan, de esta manera, el reportero fluorescente emite una señal, que se puede detectar, por ejemplo, por un lector ELISA. Métodos adecuados adicionales se describen a continuación.
De manera preferente, el compuesto es identificable por los métodos descritos en lo anterior {in vitro) . De manera más preferente, el compuesto se identifica por los métodos descritos en lo anterior (in vitro).
El compuesto identificable por los métodos descritos en lo anterior (in vitro) puede ser capaz de modular la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma. El compuesto identificable por los métodos descritos en lo anterior {in vitro) también es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención.
También es posible que el compuesto identificable por los métodos descritos en lo anterior [in vitro) puede ser capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera mucho más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la familia Orthomyxoviridae , de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae.
Los compuestos de la presente invención pueden ser cualquier agente como se describe en lo anterior para los métodos de clasificación in silico. En una modalidad preferida del compuesto de acuerdo con la presente invención, el compuesto no es un ácido 2-dioxobutanoico 4-sustituido, ácido 4-dioxobutanoico 4-sustituido, un ácido 2,4-dioxobutanoico 4-sustituido, 2 , 6-dicetopiperazina o un derivado de la misma, una 2 , 6-dicetopiperazina sustituida o un derivado de la misma, una pirazina-2 , 6-diona o una pirazina-2 , 6-diona tal como flutimida, un ácido N-hidroxámico o una N-hidroximida .
En particular, el compuesto de acuerdo con la presente invención no es un compuesto de acuerdo con Fórmula I : Me, Et, Ph acilo, carbamoilo, sulfonilo.
Fórmula En otra modalidad preferida del compuesto de acuerdo con la presente invención, el compuesto no es ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetil ) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, ácido. 4-'[4- [ (4-clorofenil) metil] -1- (ciclohexilmetil) -4-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, ácido 4- [ (4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico, Monofosfato de ribo-Uridina (rUMP) , desoxi-timidinmonofosfato (dTMP) , o ácido 2 , -dioxo-4-fenilbutanoico (DPBA) .
En una modalidad preferida adicional del compuesto de acuerdo con la presente invención, el compuesto no es una catequina, de manera preferente no es un galato de (-)-epigalocatequina (EGCG) , tal como [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2-(3,4, 5-trihidroxifenil ) croman-3-il ] 3 , 4 , 5-trihidroxibenzoato, un galato de (-) -epicatequina (EGC) , (-) -epigalocatequina (EGC), (-) -epicatequina (EC) , o ácido gálico (GA) . En otra modalidad preferida del compuesto de la presente invención, el compuesto no es una fenetilfenilftalimida, u análogo de a fenetilfenilftalimida derivado de talidomida o raltegravir (también un derivado de ácido dicetobutanoico) .
Es un aspecto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprenda el compuesto mencionado en lo anterior de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. También es un aspecto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprenda el compuesto mencionado en lo anterior de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipiente ( s ) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable.
Como se mencionó en lo anterior, el compuesto comprendido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención (i) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante de la misma de acuerdo con la presente invención, por ejemplo enlazarla el sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad o variante de la misma, (ii) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención, por ejemplo enlazarla al sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido o variante del mismo, o (iii) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, por ejemplo al enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA. De manera preferente, el compuesto comprendido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención es identificable por los métodos descritos en lo anterior. De manera más preferente, el compuesto el compuesto comprendido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se identifica por los métodos descritos en lo anterior.
De manera ' preferente, la composición (es) farmacéutica es (son) producibles de acuerdo con los métodos mencionados en lo anterior.
Un compuesto . de acuerdo con la présente invención se puede administrar solo pero, en la terapia humana, se administrará en general en mezcla con un excipiente farmacéutico adecuado, diluyente, o portador seleccionados con respecto a la vía de administración propuesta y práctica farmacéutica estándar (véase a partir de ahora) .
En el aspecto de la modelación o clasificación computacional de un socio de enlace para el sitio endonucleoliticamente activo, un modulador, y/o inhibidor de la actividad endonucleolitica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención, puede ser posible de introducir en la molécula de interés, porciones químicas que se pueden ser benéficas para una molécula que se va a determinar como un compuesto farmacéutico. Por ejemplo, puede ser posible introducir en u omitir de la molécula de interés, porciones químicas que pueden no afectar directamente el enlace de la molécula al área objetivo pero que contribuyen, por ejemplo, a la solubilidad completa de la molécula en un portador farmacéuticamente aceptable, la biodisponibilidad de la molécula y/o la toxicidad de la molécula. Consideraciones y métodos para optimizar la farmacología de las moléculas de interés se pueden encontrar, por ejemplo, en "Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics" , 8th Edition, Goodman, Gilman, Rail, Nies, & Taylor, Eds . , Pergamon Press (1985); Jorgensen & Duffy, 2000, Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1155-1158. Adicionalmente, el programa de computadora "Qik Prop" se puede usar para proporcionar predicciones rápidas para descripciones físicamente significativas y propiedades farmacéuticamente relevantes de una molécula orgánica de interés. Un esquema de probabilidad de "Regla de Cinco" se puede usar para estimar la absorción oral de los compuestos recientemente sintetizados (Lipinski y colaboradores, 1997, Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3-25). Los programas adecuados para la selección y diseño de farmacóforos incluyen (i) DISCO (Abbot Laboratories, Abbot Park, IL) , (ii) Catalyst (Bio-CAD Corp., Mountain View, CA) , y (iii) Chem. DBS-3D (Chemical Design Ltd. , Oxford, RU) .
La composición, farmacéutica contemplada por la presente invención se puede formular en varias formas bien conocidas por una persona de experiencia en la técnica. Por ejemplo, la composición farmacéutica de. la presente invención puede estar en forma sólida tal como en la forma de tabletas, pildoras, cápsulas ' (incluyendo cápsulas de gel blando) , bolsitas, pastillas, óvulos, polvos, gránulos, supositorios, o en forma liquida tal como en la forma de elixires, soluciones, emulsiones o suspensiones.
Las formas de administración sólidas pueden contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina, y almidón (de manera preferente maíz, papa, o almidón de tapioca) , desintegrantes tales como glicolato de almidón de sodio, croscarmelosa sódica, y ciertos silicatos complejos, y aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetil-celulosa (HPMC) , hidroxipropil-celulosa (HPC) , sacarosa, gelatina, y acacia. Adicionalmente, se pueden incluir agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco. Composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como agentes de relleno en cápsulas de gelatina. Excipientes preferidos en este aspecto incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche, o polietilenglicoles de peso molecular alto.
Para suspensiones acuosas, soluciones, elixires, y emulsiones adecuadas para la administración oral el compuesto se puede combinar con varios agentes edulcorantes o saborizantes , materia colorante o tintes, con agentes emulsionantes y/o de suspensión y con diluyente tales como agua, etanol, propilenglicol, y glicerina y combinaciones de los mismos.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener modificadores de velocidad de liberación incluyendo, por ejemplo, hidroxipropilmetil-celulosa, metil-celulosa , carboximetilce.lulosa de sodio, etil-celulosa, acetato de celulosa, óxido de polietileno, goma de xantano, Carbómero, copolimero de metacrilato de amonio, aceite de ricino hidrogenado, cera de carnauba, cera de parafina, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetil-celulosa, copolimero de ácido metacrilico, y mezclas de los mismos.
La composición farmacéutica de la presente invención puede estar en la forma de formulaciones de dosificación de dispersión o disolución rápida (FDDFs) y pueden contener los siguientes ingredientes: aspartame, acesulfame potásico, ácido cítrico, croscarmelosa sódica, crospovidona, ácido diascórbico, acrilato de etilo, etilcelulosa, gelatina, hidroxi.propilmetil-celulosa, estearato de magnesio, manitol, metacrilato de metilo, saborizante de menta, polietilenglicol, sílice ahumada, dióxido de silicio, glicolato de almidón de sodio, fumarato de estearilo de sodio, sorbitol, xilitol.
Para preparar supositorios, una cera de baja fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácido graso o mantequilla de cacao, primero se mezcla y el componente activo se dispersa' homogéneamente en el mismo, como por agitación. La mezcla homogénea fundida posteriormente se vacía en moldes dimensionados convenientes, se deja enfriar, y por consiguiente se solidifica.
La composición farmacéutica de la presente invención adecuada para la administración parenteral se usa mejor en la forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosas para hacer la solución isotónica con sangre. Las soluciones acuosas se deben amortiguar adecuadamente (de manera preferente a un pH de 3 a 9) , si es necesario.
La composición farmacéutica adecuada para la administración intranasal y la administración mediante inhalación se suministra mejor en la forma de un inhalador de polvo seco o un rocío de aerosol de un recipiente presurizado, bomba, roció o nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano (HFA 134A.T .) o 1, 1, 1, 2, 3, 3, 3-heptafluoropropano (HFA 227EA . TM . ) , dióxido de carbono u otro gas adecuado. El recipiente presurizado, bomba, rocío o nebulizador pueden contener una solución o suspensión, del compuesto activo, por ejemplo, usando una mezcla de etanol y el propulsor como el solvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitán.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo dirigido contra el sitio activo de la subunidad PA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
En una modalidad preferida, el anticuerpo reconoce el dominio de endonucleasa mediante el reconocimiento de un fragmento de polipéptido seleccionado del grupo de polipéptidos definidos por SEQ ID NO: 4 a 11, es decir, aminoácidos 20 a 30 (SEQ ID NO: '4), 32 a 40 (SEQ ID NO: 5), 41 a 51 (SEQ ID NO: 6), 80 a 90 (SEQ ID NO: 7), 100 a 1 10 (SEQ ID NO: 8), 115 a 125 (SEQ ID NO: 9), 130 a 140 (SEQ ID NO: 10), y 176 a 186 (SEQ ID NO: 11) de la secuencia de aminoácidos as expuesta en SEQ ID NO: 2.
En particular, el anticuerpo se enlaza específicamente a un epítopo que comprende uno o más de los aminoácidos indicados en lo anterior, que definen el sitio activo. En este contexto, el término epítopo tiene su significado reconocido en la técnica y se refiere de manera preferente a estiramientos de.4 a 20 aminoácidos, de manera preferente 5 a 18, 5 a 15, o 7 a 14 aminoácidos, por ejemplo estiramientos de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos.' Por consiguiente, los epítopos preferidos tienen una longitud de 4 a 20, 5 a 18, de manera preferente 5 a 15, o 7 a 14 aminoácidos, por ejemplo tienen una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos, y/o comprenden uno o más de Lys34, Glu26, Ile38, Tyr24, His41, Glu80, Arg84, Leul06, Aspl08, Glull9, Hel20, Argl24, Tyrl30, Lysl34, Phel05, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2 o uno o más aminoácido ( s ) correspondiente. De esta manera, en una modalidad preferida, el anticuerpo reconoce un fragmento de polipéptido de una longitud de entre 5 y 15 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de polipéptido comprende uno o más residuos de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Lys34, Glu26, Ile38, Tyr24, His41, Glu80, Arg84, Leul06, Aspl08, Glull9, Hel20, Tyrl30, Lysl34, Phel05, Lysl37, y Argl24. El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal o porciones del mismo. Las porciones de enlace a antigeno se pueden producir mediante técnicas de DNA recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. En algunas modalidades, las porciones de enlace a antígeno incluyen Fab, Fab' , F(ab' )2/ Fd, Fv, dAb, y fragmentos de región de terminación de complementariedad (CDR) , anticuerpos de cadena individual (scFv) , anticuerpos quiméricos tales como anticuerpos humanizados, diacuerpos, y polipéptidos que contienen por lo menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir enlace a antígeno específico al polipéptido. El anticuerpo de la presente invención se genera de acuerdo con protocolos estándares. Por ejemplo, un anticuerpo policlonal se puede generar al inmunizar un animal tal como ratón, rata, conejo, cabra, oveja, cerdo, ganado vacuno, o caballos con el antígeno de interés opcionalmente en combinación con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) , o ISCOM (complejos inmunoestimulantes ) de acuerdo con métodos estándares bien conocidos por la persona experta en la técnica. El antisuero policlonal dirigido contra el dominio de endonucleasa de PA pandémico HlNl 2009 de Influenza A 2009 o fragmentos del mismo se obtiene del animal por sangrado o sacrificio del animal inmunizado. El suero (i) se puede usar conforme se obtienen del animal, (ii) una fracción de inmunoglobulina se puede obtener de suero, o (iii) los anticuerpos específicos para el dominio de endonucleasa de PA pandémico HlNl 2009 de Influenza A o fragmentos del mismo se pueden purificar del suero. Anticuerpos monoclonales se pueden generar por métodos bien conocidos por la persona experta en la técnica. En breve, el animal se sacrifica después de la inmunización y el nodo linfático y/o células B esplénicas se inmortalizan por cualquier medio conocido en la técnica. Métodos para inmortalizar células incluyen, pero no se limitan a, transfiriéndolas con oncogenes, infectándolas con un virus oncogénico y cultivándolas bajo condiciones que seleccionan células inmortalizadas, sometiéndolas a compuestos carcinogénicos o de mutación, fusionándolas con una célula inmortalizada, por ejemplo, una célula de mieloma, e inactivándolas con un gen supresor de tumores. Las células inmortalizadas se clasifican usando el dominio de endonucleasa de PA HlNl o un fragmento del mismo. Las células que producen anticuerpos dirigidos contra el dominio de endonucleasa de PA H1N1 o un fragmento del mismo, por ejemplo, hibridomas, se seleccionan, se clonan, y se clasifican adicionalmente para características deseables que incluyen crecimiento robusto, alta producción de anticuerpos y características de anticuerpos deseables. Los hibridomas se pueden expandir (i) in vivo en animales singénicos, (ii) en animales que carecen de un sistema inmunitario, por ejemplo, ratones desnudos, o (iii) en un cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar, y expandir hibridomas también conocidos por aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica. La persona experta puede referirse a textos estándares tales como "Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Lañe, Eds . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1990), que se incorpora en este documento a manera de referencia, para el apoyo en materia de generación de anticuerpos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del compuesto (s) de acuerdo con la presente invención, la composición ( es ) farmacéutica de acuerdo con la presente invención, o el anticuerpo de acuerdo con la presente invención para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocados de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A.
El compuesto- (i) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante de la misma de acuerdo con la presente invención, por ejemplo enlazarla al sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA o variante de la misma, (ii) es' capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más' preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención, por ejemplo enlazarla al sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo,- o (iii) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae,. por ejemplo enlazarla al sitio endonucleolíticamente activo de la subunidad PA.
Se prefiere que el compuesto (s) sea (sean) identificable por los métodos descritos en lo anterior. Se prefiere además que la composición ( es ) farmacéutica sea (sean) producible de acuerdo con los métodos mencionados en lo anterior. De esta manera, preferentemente, la presente invención se refiere al uso de un compuesto identificable por los métodos descritos en lo anterior que es capaz de enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo, y/o sea capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir la actividad endonucleolitica del . fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo, o la composición farmacéutica producible de acuerdo con los métodos mencionados en lo anterior para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocados de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al compuesto (s) de acuerdo con la presente invención, la composición (s) farmacéutica de acuerdo con la presente invención, o el anticuerpo de acuerdo con la presente invención para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocados de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A.
El compuesto (i) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante de la misma de acuerdo con la presente invención, por ejemplo al enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA o variante de la misma, (ii) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica H1N1 2009 de Influenza A o variante del mismo de acuerdo con la presente invención, por ejemplo al enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo, o (iii) es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir, la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de otros virus, de manera preferente de virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de- la familia Arenviridae, por ejemplo al enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo de la subunidad PA.
Se prefiere que el compuesto (s) sea (sean) identificable por los métodos descritos en lo anterior. Se prefiere adicionalmente que la composición (s) farmacéutica sea (sean) producible de acuerdo con los métodos mencionados en lo anterior. De esta manera, de manera preferente, la presente invención se refiere a un compuesto identificable por los métodos descritos en lo anterior que sea capaz de enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo, y/o es capaz de modular, de manera preferente disminuir, de manera más preferente inhibir la actividad endonucleolitica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo, o la composición farmacéutica producible de acuerdo con los métodos mencionados en lo anterior para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocados de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del compuesto ácido 4- [3- [ ( 4 -clorofenil ) metil ] -1-(fenilmetil) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-3) , del compuesto. de ácido 4-[4-[(4-clorofenil) metil] -1- (ciclohexilmetil ) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-2 ) , del compuesto de ácido 4 - [3- [ (4 -clorofenil) metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1 ) , o del compuesto [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- (3, 4, 5-trihidroxifenil) croman-3-il] 3,4, 5-trihidroxibenzoato (EGCG) para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza- A, como los inventores de la presente invención han determinado que los compuestos son capaces de enlazarse al sitio endonucleoliticamente activo del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante del mismo, y son capaces de modular, es decir, la actividad endonucleolicica del fragmento de polipéptido de la subunidad PA pandémica HlNl 2009 de Influenza A o variante de la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a ácido 4- [3- [ (4-clorofenil) metil] -1- (fenilmetil) -3- ?57 piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (E BL-R05-3) , ácido 4- [4- [ (4-clorofenil)metil] -1- (ciclohexilmetil) -4-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-2 ) , ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1) , o [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- (3, , 5-trihidroxifenil) croman-Sil] 3, 4 , 5-trihidroxibenzoato (EGCG) para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de ácido 2 , 4-dioxobutanoico 4-sustituido o una catequina de té verde para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
Para tratar, mejorar, o prevenir las condiciones de enfermedad, el medicamento de la presente invención se puede administrar a un paciente animal, preferentemente un paciente mamífero, de manera preferente un paciente humano, oralmente, bucalmente, sublingualmente, intranasalmente, a través de vías pulmonares tales como inhalación, a través de vías rectales o parenteralmente, por ejemplo, intracavernosamente, intravenosamente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intraventricularmente , intrauretralmente, intraesternalmente, intracranealmente, intramuscularmente o subcutáneamente, se pueden administrar mediante infusión o técnicas de inyección sin agujas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en varias formas bien conocidas por una persona de experiencia en la técnica y como se describe en lo anterior.
La preparación farmacéutica está de manera preferente en forma de dosificación unitaria. En tal forma la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empaquetada, el paquete que contiene cantidades discretas de preparación, tales como tabletas empaquetadas,' cápsulas, y polvos en frasquitos o ampolletas. También, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, tableta, saquito, o pastilla sola, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empaquetada.
La cantidad de componente activo en una preparación de dosis unitaria administrada en el uso de la presente invención se puede variar o ajusfar de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1000 mg por mg por m2, de manera preferente aproximadamente 5 mg a aproximadamente 150 mg/m2 de acuerdo con la aplicación particular y la potencia del componente activo .
Los compuestos empleados en el uso médico de la invención se administran en una dosis inicial de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg diariamente. Un intervalo ' de dosis diaria de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg se prefiere, con un intervalo de dosis diaria de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg que es más preferida. Las dosificaciones, sin embargo, se pueden variar dependiendo de los requisitos del paciente, la gravedad de la condición que se trata, y el compuesto que se emplea. La determinación de la dosificación apropiada para una situación particular está de la experiencia del profesional. En general, el tratamiento se inicia con dosificaciones más pequeñas, que son menores que la dosis óptima del compuesto. Después, la dosificación se incrementa por aquellos incrementos hasta que el defecto óptimo bajo circunstancias se logre. Para conveniencia, la dosificación diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el dia, si se desea.
Varias modificaciones y variaciones de la invención serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica sin apartarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con las modalidades preferidas especificas, se debe entender que la invención como se reclama no se debe limitar indebidamente a tales modalidades especificas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvios para aquellas personas expertas en los campos relevantes se proponen para ser cubiertos por la presente invención.
Las siguientes figuras y ejemplos son meramente ilustrativos de la presente invención y no se deben considerar para limitar el alcance de la. invención como se indica por las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera.
EJEMPLOS Los Ejemplos se diseñan a fin de ilustrar adicionalmente la presente invención y servir a un mejor entendimiento. No se van a considerar como limitantes del alcance de la invención de. ninguna manera. 1. Métodos 1.1 Clonación, expresión y purificación de PA-Nter (1 a 198 de PA H1N1) y mutante PA-Nter (1 a 198 de PA HlNl ?52-64: Gly) de la cepa de Influenza A/Cali ornia/04/2009-???? La codificación de DNA para PA-Nter (residuos 1-198) (véase SEQ ID NO: 1 y 2) de la cepa de Influenza A/California/04/2009-H1N1 se sintetizó (1 a 198 de PA HlNl) y se sub-clonó en el vector de expresión pESPRITQ02 (EMBL) por GeneArt, Regensburg, Alemania. La secuencia se diseñó para contener una ligadura de polipéptido MGSGMA (SEQ ID NO: 3) entre el sitio de escisión del virus del grabado del tabaco (TEV) en la N-terminal para obtener 100% de escisión por la TEV proteasa.
Para mejorar adicionalmente las propiedades de cristalización, una supresión de parte del rizo flexible (52-73) se diseñó por la mutagénesis dirigida al sitio. Para este fin, una amplificación PCR del vector completo que contiene el gen de tipo natural se llevó a cabo usando dos cebadores que flanquean el sitio de mutación, uno de ellos fosforilado, y TurboPfu polimerasa (Stratagene) . Subsecuentemente se digirió el vector de plantilla con Dpnl (New England Biolabs) y el vector mutado se volvió a ligar. En el mutante PA-Nter, la secuencia de aminoácidos que abarca los aminoácidos 52-64 se remplazó por una sola glicina (1 a 198 de PA HlNl ?52-64: Gly) .
Los plásmidos de tipo natural y mutantes se transformaron a BL21(DE3) de E. coli (Stratagene) y la proteina se expresó en el medio LB durante toda la noche a 20 °C después de la inducción en un OD 0.8-1.0 con isopropil-ß-tiogalactopiranosido (IPTG). La proteina se purificó por una columna de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) . Una segunda etapa de IMAC se llevó a cabo después de la escisión por la TEV proteas-a etiquetada con His, seguido por la filtración en gel sobre una columna Superdex 75 (GE Healthcare) . Finalmente, la proteína se concentró a 10-15 mg/ml. Véase la Figura 11. 1.2 Compuestos Los compuestos usados para la co-cristalización se proporcionan en la Tabla 2. El compuesto rUMP se adquirió de Sigma. Los compuestos EMBL-R05-1, EMBL-R05-2, y EMBL-R05-3 (primeros descritos en {Tomassini, 1994 #397}) se sintetizaron a la medida por Shanghai ChemPartner. El EGCG se adquirió de Sigma (E4143) -. 1.3 Cristalización La clasificación de gota asentada inicial se llevó a cabo a 20°C mezclando 100 nL de solución de proteínas (15 mg/mL) con 100 nL de solución de depósito usando un robot Cartesian en la plataforma de cristalización EMBL Grenoble . Se clasificaron aproximadamente 600 condiciones. Subsecuentemente, se obtuvieron cristales más grandes a 20°C por el método de gota colgante mezclando las soluciones de proteínas y depósito en una relación de 1:1. La solución de proteínas contuvo 10-15 mg/mL de PA-N-ter en HEPES 20 mM a pH 7.5, NaCl 150 mM, MnCl2 2 mM, MgCl2 2 mM. Las composiciones de depósito refinadas para los cristales nativos y la co-cristalización con diferentes compuestos/ligandos se listan en la Tabla 1. Para co-cristalizaciones, los compuestos/ligandos rUMP, E BL-R05-3 y EGCG se agregaron a la solución de proteina a concentraciones finales de 5mM, 1.5mM y 5mM, respectivamente. Los cristales nativos y aquellos co-cristalizados con EMBL-R05-3 y EGCG se congelaron instantáneamente en nitrógeno liquido y su solución de depósito con 25% de glicerol adicional como crio-protector. Los co-cristales con rUMP se congelaron en su solución de depósito con rUMP adicional en una concentración de lOm y 20% de glicerol adicional' como crioprotector . La estructura con EMBL-R05-2 se obtuvo al empapar co-cristales de PA-N-ter y rUMP durante 2 horas con solución de depósito que contiene EMBL-R05-2 1.5mM y sin rUMP (el inhibidor desplaza el rUMP) seguido por crio-protección en la solución de depósito que contiene 20% de glicerol y EMBL-R05-2 1.5mM. La Figura 12 muestra un co-cristal típico con rUMP. La estructura con EMBL-R05-1 se obtuvo al empapar co-cristales de mutante PA-N-ter y dTMP durante 2 horas con solución de depósito que contienen el inhibidor seguido por crio-protección en la solución de depósito qué contiene 20% de glicerol y el inhibidor. También véase la Tabla 2 para los compuestos/ligandos.
Tabla 1 : Resumen de las condiciones de cristalización y los parámetros cristalográficos para varios compuestos Tabla 2 : Compuestos usados 1. Determinación de la estructura cristalina Se recolectaron datos de difracción en varias lineas de haces en la instalación de radiación Synchrotron Europea. Los conjuntos de datos se integraron con XDS y se escalaron con XSCALE. Se llevaron a cabo análisis de datos subsecuentes con la suite de programa CCP4i. La estructura inicial de H1N1 se resolvió con el reemplazo molecular con PHASER usando la estructura H3N2 PA N-ter previamente determinada (Días y colaboradores, Nature 2009) . Se determinaron estructuras co-cristalinas subsecuentes con PHASER usando la estructura H1N1. El refinamiento se llevó a cabo con REFMAC y/o la construcción de modelo con COOT o O. en las formas cristalinas C2 y P2i2i2i hay cuatro moléculas por unidad asimétrica. Sin embargo debido a las variaciones estructurales entre las moléculas debido a la plasticidad (en particular la región -53-73) y la resolución generalmente buena, no se aplicaron restricciones de NCS. 2. Resultados 2.1 Generación y recristalización del fragmento de polipéptido PA H1N1 o variante del fragmento de polipéptido PA H1N1 Los inventores de la presente invención descubrieron que un fragmento de polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 198 de SEQ ID NO: 2 de la cepa de Influenza A/California¦ 0 /2009-H1N1 (cepa pandémica 2009) (1 a 198 de PA H1N1) se cristalizaron fácilmente con y sin compuestos/ligandos relevantes (véase las Figuras 1 a 10) . Las propiedades de cristalización se podrían mejorar adicionalmente con una variante de fragmento de polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 198 de SEQ ID NO: 2 de la cepa de Influenza A/California/04/2009-???? (cepa pandémica 2009) con los aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina (1 a 198 de PA H1N1 ?52-64: Gly) (véase las Figuras 15 a 18) .
De esta manera, en contraste con los numerosos intentos no exitosos llevados a cabo en la técnica previa, los inventores de la presente invención fueron capaces de obtener estructuras de fragmentos de polipéptido PA H1N1 o variantes de fragmento de polipéptido PA H1N1 con y sin compuestos/ligandos .
Las estructuras de los fragmentos de polipéptido PA H1N1 o variantes de fragmento de polipéptido PA H1N1 con o sin compuestos/ligandos se describen a continuación. Todas las estructuras muestran con detalle como estos compuestos/ligandos se enlazan directamente a los iones de metal asi como también interactuando con una variedad de residuos en el sitio activo. Adicionalmente varios de los residuos de interacción cambian la conformación en el enlace de ligando, la información que no estuvo disponible en lo anterior. Este conocimiento tridimensional de los residuos de interacción de ligando y las regiones de plasticidad del sitio activo es critico para el diseño optimizado de modificaciones para inhibidores existentes para mejorar su potencia o para diseño y optimización basado en estructura de inhibidores novedosos que bloquean efectivamente la actividad de endonucleasa . 2.2 Estructura nativa de HlNl PA Las coordenadas estructurales del dominio de endonucleasa HlNl PA nativa (es decir sin compuesto/ligando) (l a 198 de PA HlNl) (cadena A) en el formato de Protein Data Bank (PDB) estándar se muestran en la Figura 1. Solo la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir uno de magnesio y uno ion de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. Las cadenas B, C y D son muy similares. Un diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura' 1 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (fragmento de polipéptido PA (cadena A) ) se muestra en la Figura 6. Muestra los cationes divalentes (un manganeso y un magnesio) y residuos de sitio, activo claves. 2.3 Estructura enlazada a EMBL-R05-3 Las coordenadas estructurales del dominio de endonucleasa HlNl PA (1 a 198 de PA HlNl) (cadena A) con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetil) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-óxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-3) en el formato de Protein. Data Bank (PDB) estándar se muestran en la Figura 2. Solo la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EMBL-R05-3 tiene el descriptor de residuo ci3. Un diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 2 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA (cadena A) ) se muestra en la Figura 7A. Muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-3 , los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Arg84) o se acercan a él.
Un diagrama qué compara las coordenadas de la Figura 1 (cadena subyacente en el lado izquierdo) y la Figura 2 que muestra el cambio en la formación del rizo en la vecindad de Tyr24 en el enlace de EMBL-R05-3 (cadena A) se muestra en la Figura 7B. El rizo alrededor de Tyr24 se ordena deficientemente en la estructura nativa. La cadena lateral Tyr24 se mueve para apilarse parcialmente con el clorobenceno de EMBL-R05-3. Esto indica una plasticidad del sitio activo y un modo de ajuste inducido del enlace de ligando. Una conclusión importante para diseñar más inhibidores potentes es asegurar que las extensiones ("brazos") a cualquier andamio de enlace a iones optimiza las interacciones en una o más cavidad(es). La igualación imperfecta conducirá a flexibilidad residual y potencia sub-óptima como parece ser el caos para los compuestos actuales, ninguno de los cuales muestran modos de enlace de ocupación completa, muy bien definidos .
Las coordenadas estructurales, adicionales del dominio de endonucleasa H1N1 PA (1 a 198 de PA H1N1) (cadena D) con ácido 4- [ 3- [ ( 4-clorofenil ) metil ] -1- ( fenilmetil ) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-3) en el formato de Protein Data Bank (PDB) estándar se muestran en la Figura 3. Solo la cadena D (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EMBL-05-3 tiene una configuración diferente que en la cadena A (Figura 2).. El compuesto tiene el descriptor de residuo ci3. Un diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 3 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de · polipéptido PA (cadena D) ) se muestra en la Figura 8. Muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-3, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Arg84) o se acercan a él. 2. Estructura enlazada a EMBL-R05-2 Las coordenadas estructurales del dominio de endonucleasa H1N1 PA (1 a 198 de PA H1N1) (cadena A) con ácido 4- [4- [ ( 4-clorofenil) metil] -1- (ciclohexilmetil) -4-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-2) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar se muestra en la Figura 4. Solo la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. Las cadenas B, C y D son muy similares. El compuesto EMBL-R05-2 tiene el descriptor de residuo ci2. A diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 4 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA (cadena A)) se muestra en la Figura 9. Muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-2, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Phel05) o se acercan a él. 2.5 Estructura enlazada a Monofosfato de Ribo-Uridina (rUMP) Las coordenadas estructurales del dominio de endonucleasa H1N1 PA (l a 198 de PA H1N1) (cadena A) con Monofosfato de ribo-Uridina enlazado (rUMP) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar se muestran en la Figura 5. Solamente la cadena A (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. Las cadenas B, C y D son muy similares. El compuesto rUMP tiene el descriptor de residuo U.
Los ensayos de co-cristalización con rUMP proporcionaron cristales bien ordenados, grandes en un grupo espacial ortorrómbico (Figuras 12 y 14) .
Un diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 5 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (fragmento de polipéptido. PA (cadena A) ) se muestra en la Figura 10. Muestra el compuesto enlazado rUMP, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Lys34) o se acercan a él. El rUMP se enlaza con dos oxígenos del fosfato que completa la esfera de coordinación de Mnl, uno de ellos también coordina Mn2. La base se apila bien en Tyr24 y Lys34 hace un enlace de nitrógeno a la posición 02. Los grupos hidroxilo de ribosa no hacen enlaces de hidrógeno a la proteína, consistente con el hecho de que la desoxirribosa se enlaza igualmente bien y la proteína es una DNAasa así como también una RNAasa {Dias, 2009 #448}.
La confirmación observada para rUMP es muy diferente de aquella publicada previamente (entrada PDB 3hw3 {Zhao, 2009 #444}). La .última estructura se obtuvo al empapar nucleótidos en cristales existente de la endonucleasa en ausencia de manganeso y la densidad electrónica es muy deficiente. En esta estructura, la molécula de agua remplaza Mnl y un ion de magnesio remplaza Mn2. Esta diferencia en la ligación de metal se refleja en ' la confirmación alterada de Glull9. La ribosa y las posiciones base son muy diferentes de las posiciones en la estructura proporcionada en este documento y son capaces de interactuar con Lys34 o Tyr24. Las diferencias entre las dos estructuras puede reflejar en primer lugar la falta de manganeso y en segundo lugar el hecho de que el empapamiento de los cristales en pre-crecimiento no permiten que el sitio activo se adapte al ligando como es más probable el caso para la co-cristalización . 2.6 Estructura enlazada a EMBL-R05-1 Las coordenadas estructurales del dominio de endonucleasa H1N1 PA (1 a 198 de PA HlNl ?52-64: Gly) con ácido 4- [3- [ (4-clorofenil) metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico enlazado (EMBL-R05-1) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar se muestran en la Figura 15. La cadena (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EMBL-R05-1 tiene el descriptor de residuo cil. Un diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 15 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA) se muestra en la Figura 17. Muestra el compuesto enlazado EMBL-R05-1, los cationes divalentes (dos manganesos) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto (notablemente Tyr24 y Arg84) o se acercan a él. 2.7 Estructura enlazada a EGCG 3-Galato de epigalocatequina (EGCG) , es el éster de epigalocatequina y ácido gálico y es la catequina más abundante en el té .verde. Se ha reportado recientemente que el EGCG inhibe la endonucleasa de la influenza {Kuzuhara, 2009 #629}. La co-cristalización ' de 1 a 198 de PA H1N1 ?52-64: Gly con galato de ( - ) -Epigalocatequina proporcionó una nueva forma de cristal (Tabla 1) difractándose a una resolución de 2.65Á. El compuesto se obsérvó claramente en el sitio activo. Una densidad extra potente también existe alrededor de un eje cristalográfico de dos veces y representa más probablemente otras moléculas de EGCG atrapadas por el empaquetamiento de cristal.
Las coordenadas estructurales del dominio de endonucleasa H1N1 PA (1 a 198 de PA H1N1 ?52-64: Gly) con 3-galato de epigalocatequina enlazado (EGCG) en el formato Protein Data Bank (PDB) estándar se muestra en la Figura 16. La cadena (con cationes divalentes asociados, es decir dos iones de manganeso, y moléculas de agua) de la unidad asimétrica se incluye. El compuesto EGCG tiene el descriptor de residuo tie. Un ¦ diagrama que usa las coordenadas estructurales de la Figura 16 que ilustra el sitio activo de endonucleasa (El fragmento de polipéptido PA) se muestra en la Figura 18A. Muestra el compuesto enlazado EGCG, los cationes divalentes (dos iones de manganeso) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto o se acercan a él. La Figura 18B muestra el EGCG enlazado, los cationes divalentes (dos iones de manganeso) y residuos de sitio activo claves que interactúan con el compuesto o se acercan a él. Se muestran las interacciones menores que 3.3Á (lineas punteadas grises), interacciones posibles adicionales menores que 4Á (lineas punteadas gris oscuro). 2.8 Superposición de todos los compuestos inhibidores de diceto Una superposición de todos los compuestos inhibidores de diceto (EMBL-R05-1, EMBL-R05-2, y EMBL-R05-3A y D) y EGCG enlazados en el sito activo PA se muestran en la Figura 19. Como se muestra en la Figura 19, el modo de enlace de los tres inhibidores de diceto a los metales se conserva (aunque existe una variabilidad en la posición exacta, pero los dos "brazos" de cada compuesto se inserta en diferentes combinaciones de las cavidades 1 a 4. El EMBL-R05-1 tiene una configuración similar a EMBL-R05-3D, con los dos brazos que ocupan las cavidades 2 y 3. El EMBL-R05-3A ocupa las cavidades 2 y 4. El EMBL-R05-2 , que difiere notablemente de R05-1 y R05-3 en el punto de sustitución en el anillo de piperidinilo (Tabla 2) ocupa el residuo 3 y únicamente la cavidad 1 (Figura 7B) . El compuesto de Té verde EGCG ocupa las cavidades 3 y 4. Compuestos más potentes y específicos podrían tal vez ser diseñados para ocupar más de dos de las cavidades. 2.9 Enlace de cationes divalentes En la estructura nativa (Figura 1 y Figura 6), se observan dos cationes divalentes en el sitio activo. Estos se identifican (usando la magnitud de la densidad electrónica y la dispersión anómala, datos no mostrados) para ser un átomo de manganeso en el sitio 1 (Mnl en la Figura 13), ligados por His41, Aspl08, Glull9, Ilel20 y dos moléculas de agua (W4 y W5) y un ion de magnesio en el sitio 2 (Mg2 en la Figura 13) , ligado por Glu80 y Aspl08' y cuatro moléculas de agua (Wl, W2 , W3 y W4). En las otras estructuras (Figuras 2-5 y Figuras 7-10 asi como también las Figuras 15-18) los iones en amos sitios 1 y sitio 2 son iones de manganeso (Mnl y Mn2), como se identifica por la magnitud de la densidad electrónica y la dispersión anómala (por ejemplo para rUMP, véase la Figura 14) .

Claims (38)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un fragmento de ' polipéptido, caracterizado porque comprende un fragmento amino-terminal de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA viral que posee actividad de endonucleasa, en donde la subunidad PA es del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o es una variante del mismo, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
2. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es soluble.
3. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque es cristalizable .
4. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el fragmento amino-terminal corresponde a por lo menos los aminoácidos 1 a 190 de la subunidad PA de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2.
5. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el fragmento de polipéptido se purifica a un grado que es adecuado para la cristalización.
6. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dos cationes divalentes se enlazan, en donde el catión divalente es de manera preferente manganeso y/o magnesio.
7. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la N-terminal es idéntica a o corresponde a la posición de aminoácido 1 y la C-terminal es idéntica a corresponde a un aminoácido en una posición seleccionada de las posiciones 190 a 198 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2, o es una variante de la misma, en donde la variante comprende el aminoácido serina en una posición de aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma y retiene la actividad de endonucleasa .
8. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque (a) consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos ¡ GSGMA (SEQ .ID NO: 3) y tiene la estructura definida por (i) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 1, (ii) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 2, (iii) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 3, (iv) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 4, o (v) las coordenadas estructurales como se muestra en la Figura 5, o b) consiste de los aminoácidos 1 a 198 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 con los aminoácidos 52 a 64 remplazados por el aminoácido glicina y opcionalmente de una ligadura amino-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos MGSGMA (SEQ ID NO: 3) y que tiene la estructura definida por (vi) las coordenadas estructurales como se muestran en la Fig ra 15, o (vii) las coordenadas estructurales como se muestran en la Figura 16.
9. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento de polipéptido que tiene la estructura definida por (i) tiene una forma cristalina con grupo espacial C2 y dimensiones de células unitarias de a = 26.36 nm ± 0.5 nm, b - 6.62 nm ± 0.3 nm, c = 6.63 nm ± 0.3 nm, a = 90 grados, ß = 96 ± 2 grados, ? = 90 grados, (ii) a (v) tiene una forma cristalina con grupo espacial P2i2i2i y dimensiones de células unitarias de a = 5.46 ± 0.3 nm, b= 12.25 ± 0.4 nm, c=13.0 ± 0.3 nm, a = 90 grados, ß = 90 grados, ? = 90 grados, (vi) tiene una forma cristalina con grupo espacial P 6222 y dimensiones de células unitarias de a = 7.50 nm ± 0.3 nm, b = 7.50 nm ± 0.3 nm, c = 12.00 nm ± 0.5 nm, a = 90 grados, ß = 90 grados, ? = 120 grados, o (vii) tiene una forma cristalina con grupo espacial P6^22 y dimensiones de células unitarias de a = 9.99 nm ± 0.5 nm, b = 9.99 nm ± 0.5 nm, c = 8.27 nm ± 0.3 nm, = 90 grados, ß = 90 grados, ? = 120 grados.
10. El fragmento de polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porgue el cristal difracta los rayos X a una resolución de 2.6 Á o mayor, de manera preferente 2.1 Á o mayor o 1.9 Á o mayor.
11. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica un fragmento de polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Un vector recombinante , caracterizado porque comprende el polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 11.
13. Una célula hospedera recombinante, caracterizada porque comprende el polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 11 o el vector recombinante de la reivindicación 12.
14. Un método para identificar compuestos, que modulan la actividad de endonucleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza- A o una variante del mismo caracterizado porque comprende las etapas de: (a) construir un modelo de computadora de sitio activo definido por (i) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 1, (ii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 2, (iii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 3, (iv) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 4, (v) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 5, (vi) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 15, o (vii) las coordenadas estructurales del fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 como se muestra en la Figura 16, b) seleccionar un compuesto modulador potencial mediante un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) ensamblar fragmentos moleculares en el compuesto, (ii) seleccionar un compuesto de una base de datos de moléculas pequeñas, y (iii) diseñar desde sus componentes básicos el ligando del compuesto; c) emplear medios computacionales para llevar a cabo una operación de programa de ajuste entre modelos de computadora del compuesto y el sitio activo a fin de proporcionar una configuración con energía minimizada del compuesto en el sitio activo; y d) evaluar los resultados de la operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y el modelo de sitio activo, mediante lo cual evaluar la capacidad del compuesto para asociarse con el sitio activo.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el sitio activo comprende los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el sitio activo comprende además los aminoácidos Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Argl24 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
17. El método de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16, caracterizado porque comprende además los aminoácidos Glu26, Lysl34, Leul06, y Lysl37 de la subunidad PA de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos que corresponden a la misma.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el sitio activo se define por las coordenadas estructurales de los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos Glu, Glu, Asp, lie, y His de la subunidad PA que corresponde a los aminoácidos Glu80, Glull9, Aspl08, Ilel20, y His41 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el sitio activo se define además por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Argl24 de la SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos Lys, Tyr, Arg, Phe, Tyr, lie, y Arg de la subunidad PA que corresponde a los aminoácidos Lys34, Tyr24, Arg84, Phel05, Tyrl30, Ile38, y Argl24 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16.
20. El método de conformidad con las reivindicaciones 18 o 19, caracterizado porque el sitio activo se define adicionalmente por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de Glu26, Lys 134, Leul06, y Lys 137 de SEQ ID NO: 2 de la subunidad PA de acuerdo con las Figuras 1 a 5 o por las coordenadas estructurales de los aminoácidos Glu, Lys, Leu, y Lys de la subunidad PA que corresponde a los aminoácidos Glu26, Lys 134, Leu 106, y Lysl37 de SEQ ID NO: 2, respectivamente, de acuerdo con las Figuras 15 o 16.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, caracterizado porque además comprende la etapa de: (e) sintetizar el compuesto y formular opcionalmente el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con uno o más excipiente ( s ) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque además comprende la etapa de: (f) poner en contacto el compuesto y el fragmento de polipéptido o variante del mismo de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 10 o de la célula hospedera recombinante de acuerdo con . la reivindicación 13 y determinar la capacidad del compuesto para modular la actividad de endonueleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo.
23. Un método para identificar compuestos, que modulan la actividad de endonueleasa de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA del virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o una variante del mismo' caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto el fragmento de polipéptido o variante del mismo de cualquiera de las · reivindicaciones 1 a 10 o la célula hospedera recombinante de la reivindicación 13 con un compuesto de prueba, y (ii) analizar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de endonueleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo.
24.' El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la capacidad del compuesto de prueba para inhibir la actividad de endonueleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo se analiza.
25. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el método se lleva a cabo en un entorno de alto rendimiento.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25,. caracterizado porque el compuesto de prueba es una molécula pequeña.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque el compuesto de prueba es un péptido o proteína.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque el método comprende además la etapa de formular el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con uno o más excipiente ( s ) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable.
29. Un compuesto, caracterizado porque es capaz de modular, de manera preferente inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de la subunidad PA o variante del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
30. El compuesto de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el compuesto es identificable por el método con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22 o por el método de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28.
31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el compuesto de las reivindicaciones 29 o 30 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipiente ( s ) y/o portador (es) farmacéuticamente aceptable.
32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la composición farmacéutica es producible de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 21 o 28.
33. Un anticuerpo dirigido contra el sitio activo de la subunidad PA del virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo, caracterizado porque la variante comprende el aminoácido serina en una posición de- aminoácido 186 de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o en una posición de aminoácido que corresponde a la misma.
34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el anticuerpo reconoce un fragmento de polipéptido de una longitud entre 5 y 15 aminoácidos de la' secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de polipéptido comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de Lys34, Glu26, Ile38, Tyr24, His41, Glu80, Arg84, Leul06, Aspl08, Glull9, Ilel20, Tyrl30, Lysl34, Phel05, Lysl37, y Argl24.
35. Uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 o 30, una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 31 o 32, o un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 33 o 34 para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocados de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
36. Uso de ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1-(fenilmetil) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-3) , ácido 4- [4- [ (4-clorofenil)metil] -1-( ciclohexilmetil ) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4 -???-2-butenoico (EMBL-R05-2) , ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1) , o [ (2R, 3R) -5, 7-dihidroxi-2- (3, 4, 5-trihidroxifenil ) croman-3-il ] 3,4, 5-trihidroxibenzoato (EGCG) para la manufactura de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
37. Un compuesto de conformidad con las reivindicaciones 29 o 30, caracterizado porque una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 31 o 32, o un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 33 o 34 para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridáe, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la familia Arenviridae, provocados de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A.
38. Ácido 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- (fenilmetil) -3-pi'peridinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-3) , ácido 4- [4- [ (4-clorofenil)metil] -1- (ciclohexilmetil ) -4-piperidinil] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (E BL-R05-2) , ácido- 4- [3- [ (4-clorofenil)metil] -1- ( fenilmetilsulfo) -3-piperidinil ] -2-hidroxi-4-oxo-2-butenoico (EMBL-R05-1) , o ' [ ( 2R, 3R) -5, 7 -dihidroxi-2- ( 3 , 4 , 5-trihidroxifenil ) croman-3-il] 3 , , 5-trihidroxibenzoato (EGCG) caracterizados, para tratar, mejorar, o prevenir condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus pandémico HlNl 2009 de Influenza A. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente nvención se refiere a fragmentos de polipéptido que comprenden un fragmento amino-terminal de la subunidad PA de una RNA polimerasa dependiente de RNA viral que posee actividad de endonucleasa, en donde la subunidad PA es de virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A o es una variante del mismo. Esta invención también se refiere a (i) cristales de los fragmentos de polipéptido que son adecuados para la determinación estructural de los fragmentos de polipéptido que usan cristalogra ía de rayos X y (ii) métodos computacionales que usan . las coordenadas estructurales del polipéptido para clasificar y diseñar compuestos que modulan, de manera preferente inhiben el sitio endonucleolíticamente activo dentro del fragmento de polipéptido. Además, esta invención se refiere a métodos para identificar compuestos que se enlazan a los fragmentos de polipéptido PA que poseen actividad de endonucleasa e inhiben de manera preferente la actividad endonucleolítica, de manera preferente en un entorno de alto rendimiento. Esta invención también se refiere a compuestos que son capaces de modular, de manera preferente de inhibir, la actividad de endonucleasa del fragmento de polipéptido de subunidad PA o variante del mismo de la presente invención y composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos para el tratamiento de condiciones de enfermedad provocadas por infecciones virales con virus de la familia Orthomyxoviridae, de la de la familia Bunyaviridae y/o de la de la familia Arenviridae, provocadas de manera preferente por infecciones virales con virus pandémico H1N1 2009 de Influenza A. De manera preferente, los compuestos son identificables por los métodos dados a conocer en este documento o las composiciones farmacéuticas son producibles por los métodos dados a conocer en este documento.
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