MX2012008552A - Loci geneticos en los cromosomas 3 y 4 del maiz que se asocian con la resistencia al moho por fusarium en la mazorca. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. Las plantas de maíz generadas por los métodos de la invención son, además, una característica de la invención.

Description

LOCI GENETICOS EN LOS CROMOSOMAS 3 Y 4 DEL MAIZ QUE SE ASOCIAN CON LA RESISTENCIA AL MOHO POR FUSARIUM EN LA MAZORCA Campo de la Invención La presente descripción se refiere a las composiciones y métodos útiles para mejorar la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas de plantas de maíz.

Antecedentes de la Invención El moho por Fusarium (también denominado putrefacción por Fusarium) en las mazorcas es una enfermedad devastadora del maíz causada por especies del complejo Gibberella fuijkuroi, particularmente, F. verticillioides, F. proliferatum y/o F. sujgrlutinans Se encuentra, predominantemente, en el suroeste de los Estados Unidos, Europa del Sur, México, Brasil, Argentina y Sudáfrica y afecta tanto la producción como la calidad del grano. El moho por Fusarium en las mazorcas puede dar como resultado, además, la contaminación por diversas micotoxinas, que incluyen fumonisinas (FUM) , moniliformina (MON) , y/o beauvericina, que al parecer causan varias enfermedades humanas y animales. Por ejemplo, las fumonisinas están relacionadas con varias toxicosis animales, que incluyen leucoencefalomalacia (Marasas et al., (1988) Onderstepoort J.

Vet. Res. 55:197-204; Wilson et al. (1990) American Association oí Veterinary Laboratory Diagnosticians : Ref . : 232335 Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colo., Madison, Wis., Estados Unidos) y edema pulmonar porcino (Colvin et al. (1992) Mycopathologia 117:79-82). Se sospecha, además, que las fumonisinas son carcinógenas (Geary et al., (1971) Coord. Che . Rev. 7:81; Gelderblom et al. (1991) Carcinogenesis 12:1247-1251; Gelderblom et al. (1992) Carcinogenesis 13:433-437) y se han relacionado con defectos de nacimiento en seres humanos (Missmer et al. (2006) Environ Health perspect 114 :237-41) .

El uso de la selección fenotípica para introgresar la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas en líneas susceptibles consume mucho tiempo y es difícil y, dado que el moho por Fusarium en las mazorcas es sensible a las condiciones ambientales, la selección para la resistencia de un año a otro basada únicamente en el fenotipo es poco confiable. Además, los sitios especializados para el ensayo de enfermedades pueden ser costosos para operar y las plantas deben cultivarse hasta la madurez para clasificar el nivel de resistencia o susceptibilidad.

La selección mediante el uso de marcadores moleculares que se asocian con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, sin embargo, tiene la ventaja de permitir al menos cierta selección basada únicamente en la composición genética de la progenie. Además, la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas puede determinarse muy temprano en el ciclo de vida de la planta, incluso desde la etapa de semilla. El aumento en la velocidad de selección que puede obtenerse por el uso de marcadores moleculares asociados con el rasgo de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas significa que la resistencia de ese cultivo de plantas al moho por Fusarium en las mazorcas puede ocurrir más rápidamente; de ese modo, se genera plantas resistentes comercialmente aceptables en un período de tiempo relativamente corto. Por lo tanto, se prefiere proporcionar composiciones y métodos para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

Se han reportado algunos ejemplos de resistencia genética al moho por Fusarium en las mazorcas (Pérez-Brito et al. (2001) Agrociencia 35:181-196; Ali et al. (2005) Genome 48:521-533; Robertson-Hoyt et al. (2006) Crop Sci. 46:1734-1743; Zhang et al. (2005) J Appl Genet 47:9-15; Robertson-Hoyt et al. (2007) Phytopathology 97:311-317; Ding et al. (2008) Mol Breeding 22:395-403).

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan composiciones y métodos para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

En una modalidad, se proporcionan los métodos para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. En estos métodos se detecta la presencia de al menos un alelo marcador en una planta de maíz. El alelo marcador puede incluir cualquier alelo marcador que se enlaza a y se asocia con cualquiera de los siguientes alelos marcadores: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un WG" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, un "G" en PHM13926.32, un "C" en PHM10892.3, un "G" en PHM939.47, y un "A" en PHM939.48. Una planta de maíz que tiene el alelo marcador unido a y asociado con cualquiera de los alelos marcadores enumerados anteriormente se selecciona después .

En otras modalidades, el alelo marcador puede unirse a cualquiera de los siguientes alelos marcadores: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un nC" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "Á" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, un "G" en PHM13926.32, un "C" en PHM10892.3, un "G" en PHM939.47, y un "A" en PHM939.48 por 30 cM, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, o 0.1 cM basado en un mapa de meiosis sencilla.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. En estos métodos se detecta la presencia de al menos un alelo marcador en una planta de maíz . El alelo marcador puede ser cualquiera de los siguientes alelos marcadores: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, un "G" en PHM13926.32, un "C" en PHM10892.3, un "G" en PHM939.47, y un "A" en PHM939.48. Una planta de maíz que tiene al menos uno de los alelos marcadores enumerados anteriormente se selecciona después .

En otra modalidad, se proporcionan métodos para identificar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas mediante la detección de un locus marcador en el genoma de la planta de maíz con el uso de la secuencia del locus marcador, una porción de la secuencia del locus marcador o un complemento de la secuencia del locus marcador, o de una porción de este, como una sonda marcadora. En estos métodos, la sonda marcadora híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident . :1, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de iden .: 1 en base al método de alineamiento Clustal V, y la sec- con núm. de ident.:7, o una secuencia de nucleótidos que es .95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:7 en base al método de alineamiento Clustal V, y el locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusariu-T! en las mazorcas . Las plantas de maíz que tienen al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas se seleccionan después .

En otra modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas mediante la selección de al menos un locus marcador en una primera planta de maíz, cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz, evaluar la progenie en el al menos un locus marcador, y seleccionar las plantas de la progenie que tienen el mismo alelo en el al menos un locus marcador que la primera planta de maíz. El locus marcador puede detectarse mediante el uso de la secuencia del locus marcador, una porción de la secuencia del locus marcador, o un complemento de la secuencia del locus marcador, o de una porción de este, como una sonda marcadora. La sonda marcadora híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident . : 1 o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:! en base al método de alineamiento Clustal V -y la sec . con núm. de ident.:7 o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:7 en base al método de alineamiento Clustal V, y el locus marcador comprende por lo menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para identificar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium' en las mazorcas mediante la detección de un locus marcador en el genoma de la planta de maíz con el uso de la secuencia del locus marcador,- una porción de la secuencia del locus marcador o un complemento de la secuencia del locus marcador, o de una porción de este, como una sonda marcadora. En estos métodos, la sonda marcadora híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident.:10, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident . :10 en base al método de alineamiento Clustal V, y la sec. con núm. de ident.: 22, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident. :22 en base al método de alineamiento Clustal V, y el locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. Las plantas de maíz que tienen al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas se seleccionan después .

En otra modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas mediante la selección de al menos un locus marcador en una primera planta de maíz, cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz, evaluar, la progenie en el al menos un locus marcador, y seleccionar las plantas de la progenie que tienen el mismo alelo en el al menos un locus marcador que la primera planta de maíz. El locus marcador puede detectarse mediante el uso de la secuencia del locus marcador, una porción de la secuencia del locus marcador, o un complemento de la secuencia del locus marcador, o de una porción de este, como una sonda marcadora . La sonda marcadora híbrida baj o condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec . con núm. de ident.:10 o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident . : 10 en base al método de alineamiento Clustal V y la sec. con núm. de ident.: 22 o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 22 en base al método de alineamiento Clustal V, y el locus marcador comprende por lo menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

En otra modalidad se proporcionan métodos para identificar las plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusariu en las mazorcas mediante la detección de por lo menos un alelo marcador asociado con la resistencia aumentada en la planta de maíz. El locus marcador se puede seleccionar de cualquiera de los siguientes loci marcadores: PHM12969, PHM1695, PHM12209, PHM2204, PHM9905, PHM13926, PHM10091, y PHM18211, así como cualquier otro marcador que se une a esos marcadores, y el locus marcador puede encontrarse dentro del intervalo en el cromosoma 3 que comprende y está flanqueado por PHM12969 y PHM18211. El locus marcador comprende por lo menos, un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

En otra modalidad se proporcionan los métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. En un aspecto, se obtiene una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador en donde el alelo se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. El locus marcador se puede encontrar dentro del intervalo en el cromosoma 3 que comprende y está flanqueado por PHM12969 y PHM18211. Después, la primera planta de maíz se puede cruzar con una segunda planta de maíz y las plantas progenie resultantes del cruce se pueden evaluar para detectar la presencia del alelo de la primera planta de maíz. Las plantas progenie que tienen el alelo de la primera planta de maíz se pueden seleccionar como plantas con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas .

En otra modalidad, se proporcionan métodos' para identificar las plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas mediante la detección de al menos un alelo marcador asociado con la resistencia aumentada en la planta de maíz . El locus marcador se puede seleccionar de cualquiera de los siguientes loci marcadores: PHM2015, PHM10326, PHM497, PH 4483, PHM5273, PHM939, PHM10892, PHM9363, PHM18162, PHM9942, PHM5247, PH 3985, PHM6226, y PHM10262, así como cualquier otro marcador que se une a esos marcadores, y el locus marcador puede encontrarse dentro del intervalo en el cromosoma 4 que comprende y está flanqueado por PHM10892 y PHM10262. El locus marcador comprende por lo menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas .

En otra modalidad se proporciona los métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. En un aspecto, se obtiene una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador, en donde el alelo se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. El locus marcador se puede encontrar dentro del intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PH 10892 y PHM10262. La primera planta de maíz se puede cruzar con una segunda planta de maíz y las plantas progenie resultantes del cruce se pueden evaluar para detectar la presencia del alelo de la primera planta de maíz. Las plantas progenie que tienen el alelo de la primera planta de maíz se pueden seleccionar como plantas con resistencia aumentada al moho por Fusariu en las mazorcas.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para identificar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas mediante la detección de los alelos en dos loci marcadores separados . El primer locus marcador se localiza dentro de un intervalo en el cromosoma 3 que comprende y está flanqueado por PHM12969 y PHM18211, y el segundo locus marcador se localiza dentro de un intervalo en el cromosoma 4 que comprende y está flanqueado por PHM10892 y PHM10262. Cada locus marcador comprende por lo menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

En otra modalidad se proporcionan los métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. En un aspecto, se obtiene una primera planta de maíz que tiene por lo menos un alelo de un primer locus marcador y por lo menos un alelo de un segundo locus marcador. El primer locus marcador se localiza dentro de un intervalo en el cromosoma 3 que comprende y está flanqueado por PHM12969 y PHM18211, y el segundo locus marcador se localiza dentro de un intervalo en el cromosoma 4 que comprende y está flanqueado por PHM10892 y PHM10262. El al menos un alelo del primer locus marcador y el al menos un alelo del segundo locus marcador se asocian cada uno con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. La primera planta de maíz se puede cruzar con una segunda planta de maíz y las plantas progenie resultantes del cruce se pueden evaluar para detectar la presencia de los alelos de la primera planta de maíz. Las plantas progenie que tienen los alelos de la primera planta de maíz se pueden seleccionar como plantas con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas .

Además, son de interés las plantas de- maíz que se identifican y/o seleccionan por cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.

Las plantas pueden ser del grupo heterótico "tallo duro" .

Breve Descripción de las Figuras La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada y de las figuras acompañantes, así como del listado de secuencias que forman parte de la presente solicitud. El listado de secuencias contiene el código de una sola letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para los aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (núm. 2) : 345-373 (1984) , que se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias nucleótidas y de aminoácidos cumplen con las reglas que se exponen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.

La FIG. 1 muestra el arreglo del mapa físico de los BAC secuenciados (internamente derivados) en el cromosoma 3 que se ensambla a la región definida por y que incluye PHM12969 (sec. con núm. de ident.:l) y PHM18211 (sec. con núm. de ident.:7). Se indican las posiciones de los marcadores PHM descritos en la presente descripción.

Las FIGS . 2A y 2B muestran el arreglo del mapa físico de los BAC secuenciados (internamente derivados) en el cromosoma 4 que se ensambla a la región definida por y que incluye PHM10892 (sec. con núm. de ident.:10) y PHM10262 (sec. con núm. de ident.:22). Se indican las posiciones de los marcadores PHM descritos en la presente descripción.

La FIG. 3 muestra un análisis de asociación de una subpoblación tallo duro, en donde los marcadores del cromosoma 3 se probaron para el significado de la asociación con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, eje X: Distancia expresada en cM en Chr. 3. eje Y: valor de la probabilidad. Los marcadores en el cromosoma 3 que co-segregan con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas en la subpoblación tallo duro a un nivel p de < 0.001 (la región definida por y que incluye PHM12969 y PHM18211) se muestran en la región enmarcada.

La FIG. 4 muestra un análisis de asociación de una subpoblación tallo duro, en donde los marcadores del cromosoma 4 se probaron para el significado de la asociación con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. Eje X: Distancia expresada en cM en Chr. 4. eje Y: valor de la probabilidad. Los marcadores en el cromosoma 4 que co-segregan con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas en la subpoblación tallo duro a un nivel p de < 0.001 (la región definida por y que incluye PH 10892 y PH 10262) se muestran en la región enmarcada.

La Fig. 5 muestra la escala de FUSER usada como guía para clasificar la infección del moho por Fusarium en las mazorcas .

Breve Descripción del Listado de Secuencias La sec . con núm. de ident . : 1 es la secuencia de referencia para PHM12969.

La sec. con núm. de ident .: 2 es la secuencia de referencia para PHM2204.

La sec. con núm. de ident .: 3 es la secuencia de referencia para PHM9905.

La sec. con núm. de ident. :4 es la secuencia de referencia para PHM12209.

La sec . con núm. de ident.:5 es la secuencia de referencia para PHM13926.

La sec. con núm. de ident. :6 es la secuencia de referencia para PHM10091.

La sec. con núm. de ident.: 7 es la secuencia de referencia para PHM18211.

La sec. con núm. de ident.: 8 'es la secuencia de referencia para PHM1695.

La sec. con núm. de ident. :9 es la secuencia de referencia para PHM939.

La sec. con núm. de ident.: 10 es la secuencia de referencia para PHM10892.

La sec. con núm. de ident.: 11 es la secuencia de referencia para PHM5273.

La sec. con núm. de ident.: 12 es la secuencia de referencia para PHM497.

La sec. con núm. de ident.: 13 es la secuencia de referencia para PHM4483.

La sec. con núm. de ident.: 14 es la secuencia de referencia para PHM2015.

La sec. con núm. de ident.: 15 es la secuencia de referencia para PHM10326.

La sec. con núm. de ident.: 16 es la secuencia de referencia para PHM9363.

La -sec. con núm. de ident.:17 es la secuencia de referencia para PHM18162.

La sec. con núm. de ident.:18 es la secuencia de referencia para PHM9942.

La sec. con núm. de ident.:19 es la secuencia de referencia para PHM5247.

La sec. con núm. de ident.:20 es la secuencia de referencia para PHM3985.

La sec. con núm. de ident.:21 es la secuencia de referencia para PHM6226.

La sec. con núm. de ident.:22 es la secuencia de referencia para PHM10262.

La sec. con núm. de ident.:23 es el iniciador directo externo para PHM12969.

La sec. con núm. de ident.:24 es el iniciador directo interno para PHM12969.

La sec. con núm. de ident.:25 es el iniciador inverso interno para PHM12969.

La sec. con núm. de ident.:26 es el iniciador inverso externo para PHM12969.

La sec. con núm. de ident.:27 es el iniciador directo externo para PHM2204.

La sec. con núm. de ident.:28 es el iniciador directo interno para PHM2204.

La sec. con núm. de ident.:29 es el iniciador inverso interno para PHM2204.

La sec. con núm. ident.:30 es el iniciador inverso externo para PHM2204.

La sec. con núm. de ident..-31 es el iniciador directo externo para PHM9905.

La sec. con núm. de ident.:32 es el iniciador directo interno para PHM9905.

La sec. con núm. ident.:33 es el iniciador inverso interno para PHM9905.

La sec. con núm. ident.:34 es el iniciador inverso externo para PHM9905.

La sec. con núm. de ident.:35 es el iniciador directo externo para PHM12209.

La sec. con núm. de ident.:36 es el iniciador directo interno para PHM12209.

La sec. con núm. ident.:37 es el iniciador inverso interno para PHM12209.

La sec. con núm. de ident.:38 es el iniciador inverso externo para PHM12209.

La sec. con núm. ident.:39 es el iniciador directo externo para PHM1392S.

La sec. con núm. de ident.:40 es el iniciador directo interno para PHM13926.

La sec. con núm. de ident.:41 es el iniciador inverso interno para PHM13926.

La sec. con núm. de ident . : 42 es el iniciador inverso externo para PHM13926.

La sec . con núm. de ident . : 3 es el iniciador directo externo para PHM10091.

La sec. con núm. de ident . : 44 es el iniciador directo interno para PHM10091.

La sec. con núm. de ident . : 45 es el iniciador inverso interno para PHM10091.

La sec. con núm. de ident . : 46 es el iniciador inverso externo para PHM10091.

La sec. con núm. de ident . : 47 es el iniciador directo externo para PHM18211.

La sec. con núm. de ident . : 48 es el iniciador directo interno para PHM18211.

La sec. con núm. de ident . : 49 es el iniciador inverso interno para PHM18211.

La sec. con núm. de ident . : 50 es el iniciador inverso externo para PHM18211.

La sec. con núm. de ident . : 51 es el iniciador directo externo para PHM1695.

La sec. con núm. de ident . : 52 es el iniciador directo interno para PHM1695.

La sec. con núm. de ident . : 53 es el iniciador inverso interno para PHM1695.

La sec. con núm. de ident . : 54 es el iniciador inverso externo para PHM1695.

La sec. con núm de ident..-55 es el iniciador directo externo pará PHM939.

La sec. con núm de ident.:56 es el iniciador directo interno para PHM939.

La sec. con núm de ident.:57 es el iniciador inverso interno para PHM939.

La sec. con núm de ident.:58 es el iniciador inverso externo para PHM939.

La sec. con núm de ident.:59 es el iniciador directo externo para PHM10892 La sec. con núm de ident.:60 es el iniciador directo interno para PHM10892 La sec . con núm de ident.:61 es el iniciador inverso interno para PHM10892 La sec . con núm de ident.:62 es el iniciador inverso externo para PHM10892 La sec. con núm de ident.:63 es el iniciador directo externo para PHM5273.

La sec. con núm de ident.:64 es el iniciador directo interno para PHM5273.

La sec. con núm de ident.:65 es el iniciador inverso interno para PHM5273.

La sec . con núm de ident . : 66 es el iniciador inverso externo para PHM5273.

La sec . con núm. de ident.:67 es el iniciador directo externo para PH 497.

La sec . con núm de ident.:68 es el iniciador directo interno para PHM497.

La sec . con núm de ident.:69 es el iniciador inverso interno para PHM497.

La sec . con núm de ident.:70 es el iniciador inverso externo para PHM497.

La sec . con núm de ident.:71 es el iniciador directo externo para PHM4483.

La sec . con núm de ident.:72 es el iniciador directo interno para PHM4483.

La sec . con núm de ident.:73 es el iniciador inverso interno para PHM4483.

La sec . con núm de ident.:74 es el iniciador inverso externo para PHM4483.

La sec . con núm de ident.:75 es el iniciador directo externo para PHM2015.

La sec . con núm de ident.:76 es el iniciador directo interno para PHM2015.

La sec . con núm ident.:77 es el iniciador inverso interno para PHM2015.

La sec . con núm de ident.:78 es el iniciador inverso externo para PHM2015.

La sec . con núm de ident.:79 es el iniciador directo externo para PHM10326 La sec. con núm de ident.:80 es el iniciador directo interno para PHM10326 La sec . con núm de ident.:81 es el iniciador inverso interno para PHM10326 La sec . con núm de ident.:82 es el iniciador inverso externo para PHM10326 La sec. con núm de ident.:83 es el iniciador directo externo para PHM9363.

La sec . con núm de ident.:84 es el iniciador directo interno para PHM9363.

La sec . con núm de ident.:85 es el iniciador inverso interno para PHM9363.

La sec . con núm de ident.:86 es el iniciador inverso externo para PHM9363.

La sec . con núm de ident.:87 es el iniciador directo externo para PHM18162 La sec . con núm de ident.:88 es el iniciador directo interno para PHM18162 La sec . con núm de ident.:89 es el iniciador inverso interno para PH 18162 La sec . con núm de ident.:90 es el iniciador inverso externo para PHM18162 La sec . con núm de ident.:91 es el iniciador directo externo para PH 9942.

La sec. con núm. de ident.:92 es el iniciador directo interno para PHM9942.

La sec. con núm. de ident.:93 es el iniciador inverso interno para PHM9942.

La sec. con núm. de ident . : 94 es el iniciador inverso externo para PHM9942.

La sec. con núm. de ident.: 95 es el iniciador directo externo para PHM5247.

La sec. con núm. de ident.: 96 es el iniciador directo interno para PH 5247.

La sec. con núm. de ident.: 97 es el iniciador inverso interno para PHM5247.

La sec. con núm. de ident.: 98 es el iniciador inverso externo para PHM5247.

La sec. con núm. de ident. : 99 es el iniciador directo externo para PHM3985.

La sec. con núm. de ident. ¡100 es el iniciador directo interno para PHM3985.

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La sec. con núm. de ident. :111 es el iniciador 1 del marcador PHM12209-20-U.

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Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona composiciones alélicas en el maíz y métodos para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. Las siguientes definiciones se proporcionan como una ayuda para comprender la presente invención.

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las modalidades particulares, la cuales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitativa. Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones anexas, los términos en singular y las formas singulares "un", "una" y "el" y "la", por ejemplo, incluyen los referentes en plural a menos que el contenido lo indique claramente de cualquier otra forma. Así, por ejemplo, la referencia a "planta", "la planta" o "una planta" también incluye una pluralidad de plantas; además, dependiendo del contexto, el uso del término "planta" puede incluir, además, la progenie idéntica o genéticamente similar de esa planta; el uso del término "un ácido nucleico" incluye, opcionalmente , como una materia práctica, muchas copias de esa molécula de ácido nucleico; de manera similar, el término "sonda", opcionalmente, (y típicamente) abarca muchas moléculas sondas similares o idénticas .

A menos que se indique de cualquier otra forma, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha, en la orientación 51 a 3 ' . Los intervalos numéricos que se indican en la descripción incluyen los números que definen el intervalo e incluye cada número entero o cualquier fracción no entera dentro del intervalo definido. A menos que se definan de cualquier otra forma, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Si bien los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción se pueden usar en la práctica para probar la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente descripción. Al describir y reivindicar la presente invención, la siguiente terminología se usará de acuerdo con las definiciones establecidas más abaj o .

El término "alelo" se refiere a una de dos o más secuencias de nucleótidos diferentes que ocurren en un locus específico.

Un "amplicón" es un ácido nucleico amplificado, por ejemplo, un ácido nucleico que se produce por la amplificación de un ácido nucleico patrón por cualquier método de amplificación disponible (por ejemplo, PCR, LCR, transcripción, o similares) .

El término "amplificar", en el contexto de la amplificación del ácido nucleico, es cualquier proceso por el cual se producen las copias adicionales de un ácido nucleico seleccionado (o una forma transcrita de este) . Los métodos de amplificación típicos incluyen varias polimerasas basados en los métodos de replicación, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por' sus siglas en inglés) ( métodos mediados por la ligasa tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) , y métodos de amplificación basados en el AR (por ejemplo, por transcripción) .

El término "ensamblar" se aplica a un BAC y su propensión para unirse y formar tramos contiguos de ADN. Un BAC "se' asemeja" a un contigo basado en un alineamiento de secuencia, si el BAC es secuenciado, o a través del alineamiento de su huella de BAC con respecto a las huellas de otros BAC. Los ensambles se pueden encontrar por medio del uso del Maize Genome Browser, que está disponible al público en internet .

Un alelo se "asocia con" un rasgo cuando es parte de o se une a una secuencia de ADN o alelo que afecta la expresión de un rasgo. La presencia del alelo es un indicador de cómo se expresará el rasgo.

Un "BAC", o cromosoma artificial bacteriano, es un vector de clonación derivado del factor F de origen natural de Escherichia coli. Los BAC pueden aceptar insertos grandes de la secuencia de ADN. En el maíz, un número de BAC, o cromosomas artificiales bacterianos, cada uno con un inserto grande de ADN genómico de maíz, se agruparon en cóntigos (fragmentos genéticos contiguos de traslapamiento, o "ADN contiguo" ) .

El "retrocruzamiento" se refiere al proceso por el cual las progenies híbridas se retrocruzan repetidamente con uno de los genitores. En un esquema de retrocruzamiento, el genitor "donante" se refiere a la planta genitor con el gen deseado o locus a introgresar. El genitor "recipiente" (que se usa una o más veces) o genitor "recurrente" (que se usa dos o más veces) se refiere a la planta genitora en la cual el gen o locus se introgresa. Por ejemplo, ver Ragot, M. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing: a practical example, in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol . 72, págs. 45-56, y Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, págs. 41-43. El cruce inicial da lugar a la generación Fl; el término "BC1" se refiere entonces al segundo uso del genitor recurrente, "BC2" se refiere al tercer uso del genitor recurrente, y así sucesivamente.

Un centimorgan ("cM") es una unidad de medida de la frecuencia de recombinación. Un cM es igual a una oportunidad de 1 % de que un marcador en un locus genético se separe de un marcador en un segundo locus debido al entrecruzamiento en una sola generación.

Como se usa en la presente descripción, el término "intervalo cromosómico" designa un tramo lineal contiguo de ADN genómico que reside en la planta en un solo cromosoma. Los elementos genéticos o genes localizados en un solo intervalo cromosómico están físicamente enlazados. El tamaño de un intervalo cromosómico no está particularmente limitado. En algunos aspectos los elementos genéticos localizados dentro de un solo intervalo cromosómico están genéticamente enlazados, típicamente, con una distancia de recombinación genética de, por ejemplo, menor o igual que 20 cM o, alternativamente, menor o igual que 10 cM. Esto es, dos elementos genéticos dentro de un solo intervalo cromosómico experimentan la recombinación a una frecuencia menor o igual que 20 % o 10 %.

Un "cromosoma" puede mencionarse también como un "grupo de enlace" .

El término "complemento" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un secuencia de nucleótidos determinada, es decir, las secuencias se relacionan por las reglas del apareamiento de base.

El término "ADN contiguo" se refiere a los fragmentos genéticos contiguos superpuestos .

El término "cruzados" o "cruce" se refiere a la fusión de gametos mediante polinización para producir progenie (por ejemplo, células, semillas o plantas). El término abarca tanto los cruces sexuales (la polinización de . una planta por otra) y autofecundaciones (autopolinización, por ejemplo, cuando el polen y el óvulo son de la misma planta) . El término "cruzamiento" se refiere al acto de fusionar los gametos a través de la polinización para producir la progenie .

Un organismo "diploide" (tal como una planta) tiene dos conjuntos (genomas) de cromosomas.

"Resistencia a la enfermedad" es una característica de una planta, en donde la planta evita los síntomas de la enfermedad que son el resultado de interacciones planta- patógeno, tales como interacciones entre el maíz y las especies de fusarium F. verticillioides, F. proliferatum y/o F. subglutinans. Es decir, evita que los patógenos causen en la planta enfermedades y síntomas relacionados con las enfermedades o, alternativamente, minimiza o reduce los síntomas de las enfermedades causadas por el patógeno. Un experto en la técnica podrá apreciar que las composiciones y métodos descritos se pueden usar con otras composiciones y métodos disponibles en la técnica para proteger las plantas de un ataque de patógenos .

Una "doble haploide" se desarrolló mediante duplicación del conjunto de cromosomas haploides . Una planta haploide doblada se considera una planta homocigota.

Una "línea élite" es cualquier línea que resulta del ' cultivo y selección para un rendimiento agronómico superior. "Resistencia aumentada" se refiere · a un nivel incrementado de resistencia contra un patógeno particular, un amplio espectro de patógenos o una infección causada por el o los patógenos . Un nivel incrementado de resistencia contra los patógenos fúngicos Fusarium verticillioides (Fv) , Fusarium proliferatum (Fp) , y Fusarium suigrlutinans (Fs) , por ejemplo, constituye una resistencia fúngica "aumentada" o mejorada. Las modalidades de la invención mejorarán o aumentarán la resistencia de la planta al patógeno fúngico, de manera que la resistencia de la planta a un patógeno o patógenos fúngicos aumentará, lo que a su vez aumentará la resistencia a la enfermedad provocada por el patógeno fúngico. El término "mejorar" se refiere a superar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, subir, y similares. En la presente descripción, las plantas de la invención se describen como que tienen "resistencia aumentada" a las especies Fusarium F. verticillioides, F. proliferatum y F. subglutinans y/o al moho en las mazorcas causado por estos patógenos, como resultado de alelos específicos en el locus de la invención.

F. verticillioides, F. proliferatum y F. subglutinans son los patógenos fúngicos que producen moho (o putrefacción) por Fusarium en las mazorcas de maíz. En la presente descripción, los patógenos fúngicos se mencionan, además, colectivamente como Fusarium.

Un "alelo favorable" es el alelo en un locus particular que confiere o contribuye a un fenotipo agronómicamente preferible, por ejemplo, resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. Un alelo favorable de un marcador es un alelo marcador que se segrega con el fenotipo favorable .

"Fragmento" significa una porción de una secuencia de nucleótidos. Los fragmentos se pueden usar como sondas de hibridación o iniciadores PCR por medio del uso de los métodos descritos en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, "resistencia fúngica" se refiere a resistencia o tolerancia mejorada a un patógeno fúngico cuando se compara con la de una planta silvestre. Los efectos pueden variar desde un ligero incremento en la tolerancia a los efectos del patógeno fúngico (por ejemplo, inhibición parcial) hasta la resistencia total, de tal manera que la planta no sea afectada por la presencia del patógeno fúngico.

El "moho por Fusarium en las mazorcas", algunas veces denominado putrefacción por Fusarium en las mazorcas, es la enfermedad causada por especies del complejo Gibberella fuijkuroi , particularmente, F. verticillioides, F. proliferatum y/o F. sujglutinans .

Un "mapa genético" es una descripción de las relaciones del enlace genético entre los loci en uno o más cromosomas (o grupos de enlace) dentro de un especie dada, generalmente representada en una forma diagramática o tabular. Para cada mapa genético, las distancias entre loci se mide por cuán frecuentemente aparecen sus alelos juntos en una población (es decir, sus frecuencias de recombinación) . Los alelos pueden detectarse por medio del uso del marcadores de proteínas o ADN, o fenotipos observables. Un mapa genético es un producto de la población de mapeo, los tipos de marcadores usados, y el potencial polimórfico de cada marcador entre poblaciones diferentes. Las distancias genéticas entre los loci pueden diferir de un mapa genético a otro. Sin embargo, la información puede correlacionarse de un mapa a otro por medio del uso de marcadores comunes. Una persona con experiencia en la técnica puede usar las posiciones de los marcadores comunes para identificar las posiciones de los marcadores y otros loci de interés en cada mapa genético individual. El orden de los loci no debe cambiar entre los mapas, aunque, frecuentemente, hay pequeños cambios en el orden de los marcadores debido a, por ejemplo, marcadores que detectan loci duplicados alternos en poblaciones diferentes, diferencias en las. aproximaciones estadísticas que se usan para ordenar los marcadores, nueva mutación o error de laboratorio.

El término "marcador genético" se referirá a cualquier tipo de marcador basado en el ácido nucleico e incluye, pero no se limita a, polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , repetición de secuencia simple (SSR) , ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) , secuencia polimórfica amplificada y olivada (CAPS, por . sus siglas en inglés) (Rafalski y Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280), polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP, por sus siglas en inglés) (Vos et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414), polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) (Brookes, 1999, Gene 234:177-186), región amplificada caracterizada por secuencia (SCAR, por sus siglas en inglés) (Paran y Michelmore, 1993, Theor. Appl . Genet. 85:985-993), sitio de secuencia identificada (STS, por sus siglas en inglés) (Onozaki et al., 2004, Euphytica. 138:255-262),-polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP, por sus siglas en inglés) (Orita et al., 1989, Proc Nati Acad Sci Estados Unidos 86:2766-2770), repetición de secuencias intersimples (ISSR, por sus siglas en inglés) (Blair et al., 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780-792), polimorfismo de inter retrotransposones amplificados (IRAP, por sus siglas en inglés) , polimorfismos amplificados mediante microsatélites-retrotransposones (REMAP, por sus siglas en inglés) (Kalendar et al., 1999, Theor. Appl. Genet. 98:704-711), un producto del clivaje de ARN (tal como una etiqueta Lynx) , y similares.

La "frecuencia de recombinacion genética" es la frecuencia de un evento de entrecruzamiento (recombinación) entre dos loci genéticos. La frecuencia de recombinación se puede observar mediante el seguimiento de la segregación de los marcadores y/o rasgos después de la meiosis .

"Genoma" se refiere al ADN total, o todo el conjunto de genes, portado por un cromosoma o conjunto de cromosomas.

El término "genotipo" es la constitución genética de un individuo (o grupo de individuos) en uno o más loci genéticos, en contraste con el rasgo observable (el fenotipo) . El genotipo está definido por el o los alelos de uno o más loci conocidos que el individuo ha heredado de sus genitores. El término genotipo se puede usar para referirse a la constitución genética de un individuo en un solo locus, en múltiples loci o, más generalmente, el término genotipo se puede usar para referirse a la composición genética de un individuo para todos los genes en su genoma.

"Germoplasma" se refiere al material genético de o desde un individuo (por ejemplo, una planta) , un grupo de individuos (por ejemplo, una línea, variedad o familia de plantas) o un clon derivado de una línea, variedad, especie o cultivo. El germoplasma puede ser parte de un organismo o célula o puede estar separado del organismo o célula. Generalmente, el germoplasma proporciona material genético con una composición molecular específica que proporciona una base física para algunas o todas las cualidades hereditarias de un organismo o cultivo celular. Como se usa en la presente invención, el germoplasma incluye células, semillas o tejidos de los cuales se puede cultivar plantas o partes de plantas, tales como hojas, tallos, polen o células que se pueden cultivar para obtener una planta completa.

Una planta mencionada como un "haploide" tiene un solo conjunto (genoma) de cromosomas.

Un "haplotipo" es el genotipo de un individuo en una pluralidad de loci genéticos, es decir, una combinación de alelos. Típicamente, los loci genéticos descritos por un haplotipo están física y genéticamente unidos, es decir, en el mismo segmento cromosómico. El término "haplotipo" puede referirse a polimorfismos en un locus particular, tales como un solo locus marcador, o polimorfismos en múltiples loci a lo largo de un segmento cromosómico. En la presente invención, un "haplotipo favorable" es uno que se asocia con una puntuación más alta de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, lo que significa que una planta que tiene ese haplotipo tiene menos síntomas. Un "haplotipo desfavorable" es uno que se asocia con una reducción en la puntuación de la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. Las puntuaciones pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el uso de la escala de la Fig. 5.

Un "grupo heterótico" comprende un conjunto de genotipos que se desempeñan bien cuando se cruzan con genotipos de un grupo heterótico diferente (Hallauer et al. (1998) Corn breeding, p. 463-564. En G.F. Sprague y J.W. Dudley (ed.) Corn and corn improvement) . Las líneas endogámicas se clasifican en grupo heteróticos y se subdividen, además, en familias con un grupo heterótico, basado en muchos criterios tales como pedigrí, asociaciones basadas en el marcador molecular, y el desempeño en combinaciones híbridas (Smith et al. (1990) Theor. Appl. Gen. 80:833-840). Los dos grupo heteróticos más ampliamente usados en los Estados Unidos se mencionan como "Iowa Tallo duro Synthetic" (además mencionado en la presente descripción como "tallo duro") y "Lancaster" o "Lancaster Sure Crop" (algunas veces mencionado como NSS, o no Tallo duro) .

El término "heterocigoto" significa una condición genética en donde alelos diferentes residen en el loci correspondiente en cromosomas homólogos .

El término "homocigoto" significa una condición genética, en donde alelos idénticos residen en el loci correspondiente en cromosomas homólogos .

El término "híbrido" se refiere a la progenie obtenida entre el cruce de al menos dos genitores genéticamente no similares .

"Hibridación" o "hibridación del ácido nucleico" se refiere al apareamiento de las cadenas de ARN y ADN complementarias así como el apareamiento de cadenas simples de ADN complementarias .

El término "hibridar" significa formar pares de base entre las regiones complementarias de las cadenas de ácido nucleico.

Un "mapa genético IBM" puede referirse a cualquiera de los siguientes mapas: IBM, IBM2 , IBM2 vecinos, IBM2 FPC0507, IBM2 2004 vecinos, IBM2 2005 vecinos, IBM2 2005 marco de vecinos, IBM2 2008 vecinos, IBM2 2008 marco de vecinos, o la última versión en el sitio web maizeGDB. Los mapas genéticos IBM se basan en una población B73 x Mol7 en la cual la progenie del cruce inicial se aparearon aleatoriamente por múltiples generaciones antes de construir las líneas endogámicas recombinantes para el mapeo. Las versiones más nuevas reflejan la adición de loci mapeados de los BAC y genéticos así como el refinamiento del mapa mejorado debido a la incorporación de la información obtenida a partir de otros mapas físicos o genéticos, los datos limpios, o el uso de nuevos algoritmos.

El término "endogámico" se refiere a una línea que se produjo para homogeneidad genética.

El término "indel" se refiere a una inserción o deleción, en donde una línea se puede referir con una inserción en relación con la segunda línea, o la segunda línea se puede referir con una deleción en relación con la primera línea.

El término "introgresión" o "introgresar" se refiere a la transmisión de un alelo deseado de un locus genético de un fondo genético a otro. Por ejemplo, la introgresión de un alelo deseado en un locus especifico se puede transmitir a por lo menos una progenie por medio de un cruce sexual entre dos progenitores de la misma especie, en donde por lo menos uno de los progenitores tiene el alelo deseado en su genoma. Alternativamente, por ejemplo, la transmisión de un alelo puede ocurrir mediante la recombinación entre dos genomas donantes, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, en donde por lo menos uno de los protoplastos donantes tiene el alelo deseado en su genoma. El alelo deseado puede ser, por ejemplo, un alelo seleccionado de un marcador, un QTL, un transgen o similares. En cualquier caso la progenie que comprende el alelo deseado se puede retrocruzar repetidamente a una línea con un trasfondo genético deseado y seleccionar para el alelo deseado, para obtener el alelo arreglado en un trasfondo genético seleccionado. Por ejemplo, el locus del cromosoma 3 y/o el locus del cromosoma 4 descritos en la presente descripción se pueden introgresar en un genitor recurrente que no es resistente o solo parcialmente resistente a las especies Fusarium que causan moho en las mazorcas y/o al moho en las mazorcas en sí. Entonces la línea del genitor recurrente con el (los) gen(es) o locus (loci) introgresado tiene resistencia aumentada a las especies Fusarium que causan el moho en las mazorcas y/o al moho en las mazorcas en sí.

El proceso de "introgresión" se menciona, frecuentemente, como "retrocruzamiento" cuando el proceso se repite dos o más veces.

Como se usa en la presente descripción, el término "enlace" se usa para describir el grado con el cual un locus marcador se asocia con otro locus marcador o algún otro locus (por ejemplo, un locus de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas) . La relación del enlace entre un marcador molecular y un locus que afecta un fenotipo se da como una "probabilidad" o "probabilidad ajustada" . El enlace puede expresarse como un límite o intervalo deseado. Por ejemplo, en algunas modalidades, cualquier marcador se une (genéticamente y físicamente) a cualquier otro marcador cuando los marcadores se separan por menos de 50, 40, 30, 25, 20, o 15 unidades del mapa (o cM) de un mapa de meiosis sencilla (un mapa genético basado en una población que se somete a una ronda de meiosis (por ejemplo una F2) ) . En algunos aspectos es ventajoso definir un intervalo o enlace entre paréntesis, por ejemplo, entre 10 y 20 cM, entre 10 y 30 cM, o entre 10 y 40 cM. Mientras más estrechamente un marcador se enlace a un segundo locus, será un mejor indicador para el segundo locus de ese marcador. Así, los "loci estrechamente enlazados" tales como un locus marcador y un segundo locus exhiben una frecuencia de recombinación ínter-locus de 10 % o menos, preferentemente, aproximadamente 9 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 8 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 7 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 6 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 5 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 4 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 3 % o menos y, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 2 % o menos. En modalidades muy preferidas los loci relevantes exhiben una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1 % o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.75 % o menos, con mayor preferencia, aproximadamente 0.5 % 0 menos, o- todavía con mayor preferencia, aproximadamente 0.25 % o menos. También se dice que dos loci localizados en el mismo cromosoma y a tal distancia de modo que la recombinación entre ellos ocurra a una frecuencia menor que 10 % (por ejemplo, aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.75 %, 0.5 %, 0.25 % o menor) son "proximales" entre sí. Ya que un cM es la distancia entre dos marcadores que muestra una frecuencia de recombinación de 1 %, cualquier marcador se enlaza estrechamente (genética y físicamente) a cualquier otro marcador que esté muy próximo, por ejemplo, a o menos de 10 cM de distancia. Dos marcadores estrechamente enlazados en el mismo .cromosoma se pueden posicionar 9, 8, 7, 6, 5, 4, -3, 2, 1, 0.75, 0.5 o 0.25 cM o menos entre sí.

El término "desequilibrio de enlace" se refiere a una segregación no aleatoria de los loci o rasgos genéticos (o ambos) . En cualquier caso, el desequilibrio de enlace implica que los loci relevantes se encuentran con suficiente proximidad física a lo largo de un cromosoma, de modo que se segregan juntos con una frecuencia mayor que la aleatoria (es decir, no aleatoria) (en el caso de los rasgos de cosegregación, los loci en los que se basan los rasgos se encuentran con suficiente proximidad entre sí) . Los marcadores que muestran desequilibrio de enlace se consideran unidos. Los loci unidos cosegregan más del 50 % del tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 51 % a aproximadamente 100 % del tiempo. En otras palabras, dos marcadores que cosegregan tienen una frecuencia de recombinación de menos de 50 % (y por definición, se separan al menos 50 cM en el mismo cromosoma.) Como se usa en la presente descripción, el enlace puede ser entre dos marcadores o, alternativamente, entre un marcador y un fenotipo. Un locus marcador se puede "asociar con" (enlazar a) un rasgo, por ejemplo, resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. El grado de enlace de un marcador molecular a un rasgo fenotípico se determina, por ejemplo, como una probabilidad estadística de cosegregación de ese marcador molecular con el fenotipo.

El desequilibrio de enlace se evalúa más comúnmente con el uso de la medida r2, que se calcula con la fórmula descrita por Hill, W.G. and Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 38:226-231(1968). Cuando r2 = 1, el DE completo existe entre los dos loci marcadores, lo que significa que los marcadores no se separan por recombinación y tienen la misma frecuencia del alelo. Los valores para r2 anteriores de 1/3 indican un DE suficientemente fuerte para ser útiles para el mapeo (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). De ahí que los alelos están en desequilibrio de enlace cuando los valores de r2 entre los loci marcadores pareados son mayores que o iguales que 0.33, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o 1.0.

Como se usa en la presente descripción, "equilibrio de enlace" describe una situación en donde dos marcadores independientemente se segregan, es decir, se clasifican entre la progenie al azar. Los marcadores que muestran equilibrio de enlace se consideran no unidos (ya sea qué estén o no en el mismo cromosoma) .

Un "locus" es una posición en un cromosoma en donde se localiza un nucleótido, gen, secuencia, o marcador.

El "logaritmo del valor de probabilidades (LOD, por sus siglas en inglés)" o "puntuación LOD" (Risch, Science 255:803-804 (1992)) se usó como un mapeo del intervalo para describir el grado de enlace entre dos loci marcadores. Una puntuación LOD de tres entre dos marcadores indica que el enlace es 1000 veces más probable que el no enlace, mientras que una puntuación LOD de dos indica que el enlace es 100 veces más probable que el no enlace. Las puntuaciones LOD mayores que o iguales a dos se pueden usar para detectar el enlace .

"Maíz" se refiere a una planta de Zea mays L. sesp. mays y se conoce como "elote" .

El término "planta de maíz" incluye: las plantas completas de maíz, células vegetales de maíz, protoplasto vegetal de maíz, célula vegetal de maíz o cultivo de tejido de maíz a partir del cual las plantas de maíz pueden regenerarse, callos de la planta de maíz, y células vegetales de maíz que están intactas en las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz, tales como semillas de maíz, mazorca de maíz, flores de maíz, cotiledones de maíz, hojas de maíz, tallos de maíz, yemas de maíz, raíces del maíz, puntas radiculares del maíz y similares.

Un "marcador" es una secuencia de nucleótidos o producto codificado de esta (por ejemplo, una proteína) que se usa como un punto de referencia. Para que los marcadores sean útiles en las recombinaciones de detección, necesitan detectar las diferencias, o polimorfismos, dentro de la población que se monitorea. Para los marcadores moleculares, esto significa diferencias al nivel de ADN debido a las diferencias de la secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, SSR, RFLP, FLP, SNP) . La variabilidad genómica puede ser de cualquier origen, por ejemplo, inserciones, ! deleciones, duplicaciones, elementos repetitivos, mutaciones puntuales, eventos de recombinación, o la presencia y secuencia de elementos transponibles . Un marcador puede derivarse de la secuencia de nucleótidos genómica o de los ácido nucleicos expresados (por ejemplo, EST) y pueden referirse, además, a los ácido nucleicos usados como sonda o pares de iniciadores capaces de amplificar los fragmentos de secuencia a través del uso de métodos basados en la PCR. Un gran número de marcadores moleculares del maíz se conocen en la técnica, y son publicados o disponibles a partir de varias fuentes, tales como el recuso de internet Maize GDB y el recuso de internet del Arizona Genomics Institute . corren por la Universidad de Arizona.

Los marcadores correspondientes a los polimorfismos alélicos entre los miembros de una población se pueden detectar mediante métodos bien establecidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, secuenciación de ADN, métodos de amplificación específica de secuencia basada en PCR, detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) , detección de marcadores de isozima, detección de polimorfismos polinucleótidos mediante hibridación específica de alelo (ASH, por sus siglas en inglés) , detección de secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, detección de replicación de secuencia autosostenida, detección de repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés) , detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) o detección de polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) . Los métodos bien establecidos también son conocidos para la detección de etiquetas de secuencia expresada (EST, por sus siglas en inglés) y marcadores de SSR derivados de secuencias EST y ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD, por sus siglas en inglés) .

Un "alelo marcador", alternativamente, un "alelo de un locus marcador" , se puede referir a uno de una gran variedad de secuencias nucleótidas polimórficas que se encuentran en un locus marcador en una población que es polimórfica para el locus marcador.

La "selección asistida por marcadores" (MAS, por sus siglas en inglés) es un proceso para seleccionar fenotipos en base a los genotipos marcadores .

La "contraselección asistida por marcadores" es un proceso en el cual se usa genotipos marcadores para identificar las plantas , que no se seleccionarán, lo que permite retirarlas de un programa de cultivo o siembra.

Un "marcador haplotipo" se refiere a un combinación de alelos en un locus marcador.

Un "locus marcador" es un lugar del cromosoma específico en el genoma de una especie, en donde se puede encontrar un marcador específico. Un locus marcador se puede usar para rastrear la presencia de un segundo locus enlazado, por ejemplo, un locus enlazado que codifica o contribuye a la expresión de un rasgo fenotípico. Por ejemplo, un locus marcador puede usarse para monitorear la segregación de alelos en un locus, tal como un QTL o un solo gen, que están genéticamente o físicamente enlazados al locus marcador.

Una "sonda marcadora" es una secuencia o molécula de ácido nucleico que se puede usar para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico complementaria a una secuencia del locus marcador, a través de hibridación de ácido nucleico. Las sondas marcadoras que comprenden 30 o más nucleótidos contiguos del locus marcador ("toda o una porción" de la secuencia del locus marcador) se pueden usar para hibridación de ácido nucleico. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que tenga la capacidad de distinguir (es decir, genotipar) el alelo en particular presente en un locus marcador.

Los términos . "secuencia nucleótida" , "polinucleótido" , "secuencia de ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que contiene, opcionalmente, bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un "nucleótido" es una unidad monomérica de la cual se construye polímeros de ADN o ARN y consiste en una base de purina o pirimidina, una pentosa y un grupo de ácido fosfórico. Se hace referencia a los nucleótidos (habitualmente encontrados en su forma 5 ' -monofosfato) mediante su designación con una sola letra, de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido.

Los términos "fenotipo", "rasgo fenotípico" o "rasgo" se refieren a uno o más rasgos de un organismo. El fenotipo se puede observar a simple vista o mediante cualquier otro medio de evaluación conocido en la técnica, por ejemplo, microscopía, análisis bioquímico o un ensayo electromecánico. En algunos casos, un fenotipo se controla directamente por un solo gen o locus genético, es decir, un "solo rasgo de genes". En otros casos, un fenotipo es el resultado de muchos genes .

Cada marcador con una designación "PHM" seguido por un número (y sin extensiones) representa dos conjuntos de iniciadores (externo e interno) que cuando se usan en una PCR interna, amplifican una pieza específica de ADN. El grupo externo se usa en el primer ciclo de PCR, después del cual las secuencias internas se usan para un segundo ciclo de PCR en los productos del primer ciclo. Esto incrementa la especificidad de la reacción. La temperatura de hibridación para los marcadores PHM (que consisten de dos grupos de iniciadores) es 55 °C.

Un "mapa físico" del genoma es un mapa que muestra el orden lineal de puntos de referencia identificables (que incluyen genes, marcadores, etc.) en el ADN cromosómico. Sin embargo, en contraste con los mapas genéticos, las distancias entre los puntos de referencia son absolutas (por ejemplo, se miden en pares de bases y fragmentos genéticos contiguos aislados y traslapados) y no en base a la recombinación genética.

Una "planta" puede ser una planta completa, cualquier parte de esta o un cultivo celular o tisular derivado de una planta. Así, el término "planta" puede referirse a cualquiera de los siguientes: plantas completas, componentes de la planta u órganos (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), tejidos vegetales, semillas, células vegetales, y/o la progenie de esta. Una célula vegetal es una célula de una planta, tomada de una planta o derivada a través del cultivo de una célula tomada de una planta.

Un "polimorfismo" es una variación en el ADN que es muy común para deberse meramente a una nueva- mutación. Un polimorfismo debe tener una frecuencia de al menos 1 % en una población. Un polimorfismo puede ser un solo polimorfismo de nucleótido, o SNP, o un polimorfismo de inserción/deleción, también mencionado en la presente descripción como un "indel".

El valor de "probabilidad" o "valor p" es la probabilidad estadística de que la combinación particular de un fenotipo y la presencia o ausencia de un alelo marcador particular sea aleatoria. Así, mientras menor es el puntaje de probabilidad, mayor es la probabilidad de que un fenotipo y un marcador particular se cosegreguen. En algunos aspectos, el puntaje de probabilidad se considera "significativa" o "no significativa". En algunas modalidades, un puntaje de probabilidad de 0.05 (p=0.05 o una probabilidad de 5 %) de la distribución aleatoria se considera un indicio significativo de cosegregación. Sin embargo, una probabilidad aceptable puede ser cualquier probabilidad menor que 50 % (p=0.5). Por ejemplo, una probabilidad significativa puede ser menor que 0.25, menor que 0.20, menor que 0.15, menor que 0.1, menor que 0.05, menor que 0.01 o menor que 0.001.

El término "progenie" se refiere a las crías generadas de un cruce .

Una "planta progenie" se genera de un cruce entre dos plantas.

Un "marcador de producción" o "marcador SNP de producción" es un marcador que se desarrolló para propósitos de gran productividad. Los marcadores SNP de producción se desarrollan para detectar los polimorfismos específicos y se diseñan para usar con una variedad de químicas y plataformas. Los nombres de los marcadores usados aquí comienzan con un prefijo PHM para denotar el 'marcador híbrido pionero' , seguido por un número que es específico para la secuencia de la cual se diseñó, seguido por un "." o un "-" y, después, un sufijo que es específico para el polimorfismo de ADN. Una versión del marcador puede seguir, además, (A, B, C, etc.) que denota la versión del marcador diseñado para ese polimorfismo específico.

El término "locus de rasgos cuantitativos" o "QTL" se refiere a una región de ADN que se relaciona con la expresión diferencial de un rasgo fenotípico en por lo menos un antecedente genético, por ejemplo, en por lo menos una población de cultivo. Los QTL están estrechamente unidos al gen o genes en los cuales se basa el rasgo en cuestión.

Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como una base para la comparación de la secuencia. La secuencia de referencia se obtiene por el genotipado de un número de líneas en el locus, que alinean la secuencia de nucleótidos en un programa de alineamiento de la secuencia (por ejemplo, Sequencher) y, después, se obtiene la secuencia de consenso del alineamiento.

Un "cruce de prueba" es una prueba de la progenie derivada del cruzamiento de cada progenitor con el mismo espécimen de prueba, usualmente, una línea homocigota. El progenitor que se examina puede ser una variedad de polinización abierta, un cruce o una línea endogámica.

La frase "bajo condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda o polinucleótido se híbrida a una secuencia de ácido nucleico específica, típicamente, en una mezcla compuesta de ácidos nucleicos pero, prácticamente, a ninguna otra secuencia. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes.

Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10 °C más bajas que la temperatura de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica, con una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la cual 50 % de las sondas complementarias con el objetivo se hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.0 M de iones sodio, típicamente, aproximadamente de 0.01 a 1.0 M de concentración de iones sodio (u otras sales) con un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos) . Además, pueden lograrse las condiciones rigurosas mediante la adición de agentes desestabilizadores, tales como la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es por lo menos el doble de la hibridación basal, preferentemente, 10 veces la hibridación basal. Las condiciones de hibridación rigurosas ilustrativas son frecuentemente: 50 % formamida, 5x SSC, y 1 % SDS, con incubación a 42 °C, o, 5x SSC, 1 % SDS, con incubación a 65 °C, con lavado en 0.2x SSC, y 0.1 % SDS a 65 °C. Para la PCR, una temperatura de aproximadamente 36 °C es típica para la amplificación de baja rigurosidad, aunque las temperaturas de hibridación pueden variar entre aproximadamente 32 °C y 48 °C, según la longitud del iniciador En numerosas referencias se proporciona lineamientos adicionales para determinar los parámetros de hibridación .

Un "alelo desfavorable" de un marcador es un alelo marcador que segrega con el fenotipo de planta desfavorable, lo que proporciona, por lo tanto, el beneficio de identificar plantas que pueden eliminarse de un programa de cultivo o plantación.

Las alineaciones de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se pueden determinar mediante varios métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan a, el programa MEGALIGN® del paquete integrado para bioinformática LASERGEÑE® (ADN.STAR® Inc., Madison, WI) . A menos que se indicara de otra manera, se realizó múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente descripción con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151 153 (1989)) con los parámetros predeterminados (PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN10 , PENALIZACION DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. En el caso de los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias, mediante el uso del programa Clustal V, es posible obtener valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" mediante la observación de la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa; A menos que se indique de otra manera, los porcentajes de identidad y divergencias proporcionadas y reivindicadas en la presente se calcularon de esta manera.

Las técnicas estándar de clonación molecular y de DNA recombinante usadas en la presente invención son muy conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Clonación molecular: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook" ) .

Antes de describir la presente invención detalladamente, se debe comprender que esta no se limita a modalidades particulares. También es necesario aclarar que la terminología que se usa en la presente invención tiene el propósito de describir modalidades en particular, pero no pretende ser limitante. Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, los términos en singular y las formas singulares "un", "una" y "el", por ejemplo, incluyen los referentes en plural, a menos que el contenido lo indique claramente de otra manera. Así, por. ejemplo, la referencia a "planta", "la planta" o "una planta" también incluye una gran variedad de plantas . Según el contexto, el uso del término "planta" también puede incluir progenie genéticamente similar o idéntica de la planta. El uso del término "un ácido nucleico" incluye, opcionalmente , varias copias de esa molécula de ácido nucleico.

Ahora, en cuanto a las modalidades: Resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas El moho por Fusarium en las mazorcas (también denominado putrefacción por Fusarium en las mazorcas) es una enfermedad devastadora del maíz causada por especies del complejo Gibberella fuijkuroi , particularmente, F. verticillioid.es, F. proliferatum y/o F. subglutinans . La identificación de los marcadores moleculares y alelos de los marcadores moleculares que se asocian con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas permite la selección de la resistencia en base únicamente en la composición genética de la progenie. Los métodos para identificar y seleccionar las plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas a través de la evaluación de la composición genética (según se evaluó con el uso de marcadores moleculares y sus alelos) se presentan en la presente descripción.

Mapeo genético Se reconoció desde hace mucho tiempo que la correlación específica de los loci genéticos con fenotipos particulares, tales como resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, se puede mapear en el genoma de un organismo. El productor de plantas puede usar venta osamente los marcadores moleculares para identificar individuos deseados al detectar alelos marcadores que muestran una probabilidad estadísticamente significativa de cosegregación . con un fenotipo deseado, y se manifiesta como desequilibrio de enlace Al identificar un marcador molecular o grupos de marcadores moleculares que cosegregan con un rasgo de interés, el productor es capaz de seleccionar rápidamente un fenotipo deseado por la selección del alelo marcador molecular adecuado (un proceso llamado selección asistida por marcadores, o MAS) . Esos marcadores se pudieran usar también por los productores para diseñar genotipos in silicio y practicar la selección de todo el genoma .

Se dispone de una gran variedad de métodos bien conocidos en la técnica para detectar marcadores moleculares o grupos de marcadores moleculares que se cosegregan con un rasgo de interés, tal como la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. La idea básica sobre la que descansan estos métodos es la detección de marcadores, para los cuales los genotipos alternativos (o alelos) tengan fenotipos promedio significativamente diferentes. Así, se hace una comparación entre los loci marcadores de la magnitud de la diferencia entre los genotipos (o alelos) alternativos o del nivel de importancia de esa diferencia. Se deduce que los genes de rasgos están localizados más cerca del marcador o marcadores que tienen la mayor . diferencia genotípica relacionada .

Esos dos métodos usados para detectar los loci de los rasgos de interés son: 1) Análisis de asociación basado en la población y 2) Análisis de enlace tradicional. En un análisis de asociación basado en la población, las líneas se obtienen a partir de poblaciones preexistentes con fundadores múltiples, por ejemplo, líneas élite endogámicas . Los análisis de asociación basados en la población descansan en la desintegración del desequilibrio de enlace (DE) y en la idea de que en una población no estructurada, solamente las correlaciones entre los genes de control de un rasgo de interés y los marcadores estrechamente enlazados a esos genes permanecerán después de muchas generaciones de apareamiento aleatorio. En realidad, la mayoría de poblaciones preexistentes tiene s.ubestructura poblacional. Así, el uso de un método de asociación estructurada ayuda a controlar la estructura poblacional mediante la asignación de individuos en las poblaciones con el uso de datos obtenidos de los marcadores distribuidos aleatoriamente por todo el genoma, y así se minimiza el desequilibrio debido a la estructura poblacional dentro de las poblaciones de individuos (también denominadas subpoblaciones) . Los valores fenotípicos se comparan a los genotipos (alelos) en cada locus marcador para cada línea en la subpoblación. Una relación marcador-rasgo significativa indica la estrecha proximidad entre el locus marcador y uno o más loci genéticos involucrados en la expresión de ese rasgo.

. Los mismos principios subyacen al análisis del enlace tradicional; sin embargo, el LD se genera- al crear una población a partir de un número pequeño de fundadores. Los fundadores se seleccionan para maximizar el nivel de polimorfismo dentro de la población construida, y los sitios polimórficos se evalúan por su nivel de cosegregación con un fenotipo determinado. Un número de métodos estadísticos se han usado para identificar asociaciones de rasgos marcadores significativos. Uno de esos métodos es una aproximación de mapeo del intervalo (Lander y Botstein, Genetics 121:185-199 (1989) , en el cual se probó cada una de las muchas posiciones a lo largo de un mapa genético (a intervalos de 1 cM) para la posibilidad de que un gen de control de un rasgo de interés se localice en esa posición. La información de genotipo/fenotipo se usa para calcular el puntaje LOD para cada posición del análisis (registro de índice de probabilidad) . Cuando la puntuación LOD excede un valor umbral, existe evidencia significativa de la localización de un gene de control del rasgo de interés en esa posición en el mapa genético (el cual caerá dentro de dos loci marcadores particulares) .

La presente invención proporciona loci marcadores del maíz que demuestran una cosegregación estadísticamente significativa con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, según se determinó por análisis por asociación. La detección de estos loci o loci unidos adicionales se puede usar en programas de cultivo de maíz asistidos por marcadores para producir plantas con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

Composiciones de los marcadores Los marcadores asociados con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas en maíz se identifican en la presente descripción, y los métodos involucrados en la detección de la presencia de uno o más alelos marcadores asociados con la resistencia aumentada en el germoplasma de una planta de maíz. La planta de maíz puede ser un híbrido o endogámica y puede ser del grupo heterótico tallo duro.

Para el QTL identificado en el cromosoma 3, el locus marcador puede seleccionarse de cualquiera de los loci marcadores proporcionados en la TABLA 1, que incluyen PHM12969, PHM1695, PHM12209, PHM2204, PHM9905, PHM13926, PHM10091, y PHM18211; cualquiera de los loci marcadores SNP proporcionados en la TABLA 5, que incluyen un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G", en PHM13926.28, y un "G" en PHM13926.32, así como cualquier otro marcador unido a estos marcadores (los marcadores enlazados pueden determinarse a partir del recurso MaizeGDB) .

Para el QTL identificado en el cromosoma 4, el locus marcador puede seleccionarse de cualquiera de los loci marcadores proporcionados en la TABLA 2, que incluyen PHM2015, PHM10326, PHM497, PHM4483, PHM5273, PHM939, PHM10892, PHM9363, PH 18162, PHM9942, PHM5247, PH 3985, PHM6226, y PHM10262; cualquiera de los loci marcadores proporcionados en la TABLA 6, que incluyen un "C" en PHM10892.3, un "G" en PH 939.47, y un "A" en PHM939.48; así como cualquier otro marcador enlazado a estos marcadores (los marcadores enlazados pueden determinarse a partir del recurso MaizeGDB) .

Sitios de los QTL en el mapa físico Los elementos genéticos o genes que se localizan en un tramo lineal contiguo del ADN genómico en un solo cromosoma están físicamente enlazados.

Para los QLT en el cromosoma 3 , los dos marcadores con la distancia física más larga entre ellos que se mantiene asociado con el fenotipo de interés, la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, son PHM12969 y PHM18211. PHM12969 se localiza en los BAC c0437dl8, c0094gl8, y b0219jl4. PHM18211 se localiza en los BAC c0482dl9 y c0060e22. Estas dos regiones BAC delinean el QLT de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas en el mapa físico del maíz (FIG. 1) . Cualquier polinucleótido que se ensambla al ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident.:l (la secuencia de referencia para PHM12969) o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec . con núm. de ident.:l en base al método de alineamiento Clustal V y la sec. con núm. de ident.:,7 (la secuencia de referencia para PHM18211) o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident . : 7 en base al método de alineamiento Clustal V, puede alojar loci marcadores que se asocian con el rasgo de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. La FIG. 1 muestra el arreglo del mapa físico de los BAC secuenciados que constituyen el tramo contiguo de ADN entre y que incluyen PHM12969 y PHM18211.

Para los QLT que se localizan en el cromosoma 4, los dos marcadores con la distancia física más larga entre ellos que se mantiene asociado con el fenotipo de interés, la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, son PHM10892 y PHM10262. PHM10892 se localiza en el BAC b0269h08, mientras que PHM10262 se localiza en los BAC c0237f22 y C0069Í21. Estas dos regiones BAC delinean el QLT de resistencia al moho por Fusarium en la mazorca en el mapa físico del maíz (FIG. 2) . Cualquier polinucleótido que se ensambla al ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident. :10 (la secuencia de referencia para PHM10892) o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 10 en base al método de alineamiento Clustal V y la sec. con núm. de ident. :22 (la secuencia de referencia para PHM10262) o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:22 en base al método de alineamiento Clustal V, puede alojar loci marcadores que se asocian con el rasgo de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. La FIG. 2 muestra el arreglo del mapa físico de los BAC secuenciados que constituyen el tramo contiguo de ADN entre y que incluyen PHM10892 y PHM10262.

Relaciones de enlace Una medida común del enlace es la frecuencia a la cual los rasgos se cosegregan. Esto se puede expresar como un porcentaje de cosegregación (frecuencia de recombinación) o en centimorgans (cM) . El cM es una unidad de medida de la frecuencia de recombinación genética. Un cM es igual a la posibilidad de 1 % de. que un rasgo en un locus genético se separe de un rasgo en otro locus debido al entrecruzamiento en una sola generación (lo cual significa que los rasgos se segregan juntos 99 % del tiempo) . Debido a que la distancia cromosómica es aproximadamente proporcional a la frecuencia de eventos de entrecruzamiento entre rasgos, existe una distancia física aproximada que se correlaciona con la frecuencia de recombinación.

Los loci marcadores son por sí mismos rasgos y se pueden evaluar de conformidad con análisis de asociación estándar mediante la localización de los loci marcadores durante la segregación. Así, un cM es igual a la posibilidad de 1 % de que un locus marcador se separe de otro locus debido al entrecruzamiento en una solo generación.

Mientras más cerca esté el marcador de un gen de control de un rasgo de interés, más efectivo y ventajoso es ese marcador como un indicador de ese rasgo deseado. Los loci estrechamente unidos muestran una frecuencia de entrecruzamiento interlocus de aproximadamente 10 % o menor, preferentemente, aproximadamente 9 % o menor, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 8 % o menor, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 7 % o menor, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 6 % o menor, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 5 % o menor, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 4 ¾ o menor, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 3 % o menor, y todavía con mayor preferencia, aproximadamente 2 % o menor. En modalidades muy preferidas, los loci relevantes (por ejemplo, un locus marcador y un locus objetivo) exhiben una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1 % o menor, por ejemplo, aproximadamente 0.75 % o menor, con mayor preferencia, aproximadamente 0.5 % o menor, o todavía con mayor preferencia, aproximadamente 0.25 % o menor. Así, los loci están separados aproximadamente 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 CM, 5 CM, 4 CM, 3 cM, 2 cM, 1 CM, 0.75 CM, 0.5 cM O 0.25 cM o menos. El de otra manera, dos loci que se localizan en el mismo cromosoma y a una distancia tal que se produzca la recombinación entre los dos loci a una frecuencia de menos de 10 % (por ejemplo, aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 ¾, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.75 %, 05 %, 025 %, o menos) se dice también que están "próximos a" uno a otro.

Aunque alelos marcadores particulares pueden mostrar cosegregación con el fenotipo de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, es importante destacar que el locus marcador no es necesariamente responsable de la expresión del fenotipo de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. Por ejemplo, no es un requisito que la secuencia de polinucleótidos marcadora sea parte de un gen que imparte resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas (por ejemplo, que sea parte del marco de lectura abierta del gen) . La asociación entre un alelo marcador específico y el fenotipo de resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas se debe a la fase de enlace por "acoplamiento" original entre el alelo marcador y el alelo en la línea de maíz ancestral de la cual se originó el alelo. Eventualmente, con una recombinación repetida, los eventos de entrecruzamiento entre el marcador y el locus genético pueden cambiar esta orientación. Por esta razón, el alelo marcador favorable puede cambiar según la fase de enlace que exista dentro del progenitor resistente usado para crear las poblaciones de segregación. Esto no cambia el hecho de que el marcador puede usarse para monitorear la segregación del fenotipo . Únicamente cambia el alelo marcador que se considera favorable en una población de segregación específica.

Para los QLT en el cromosoma 3 , los marcadores identificados en las TABLAS 1 y 5, así como cualquier marcador dentro de 50 cM de los marcadores identificados en las TABLAS 1 y 5, pueden usarse para predecir la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas de una planta de maíz. Esto incluye cualquier marcador dentro de 50 cM de los marcadores PHM, PHM12969, PHM1695, PHM12209, PHM2204, PHM9905, PHM13926, PHM10091, y PHM18211, y dentro de 50 CM de los marcadores SNP, un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, y un "G" en PHM13926.32.

Para los QLT en el cromosoma 4, los marcadores identificados en las TABLAS 2 y 6, así como cualquier marcador dentro de 50 cM de los marcadores identificados en las TABLAS 2 y 6, pueden usarse para predecir la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas de una planta de maíz. Esto incluye cualquier marcador dentro de 50 cM de los marcadores PHM, PHM2015, PHM10326, PHM497, PHM4483, PHM5273, PHM939, PHM10892, PHM9363, PHM18162, PHM9942, PHM5247, PHM3985, PHM6226, y PHM10262, y dentro de 50 cM de los marcadores SNP, un "C" en PHM10892.3, un "G" en PH 939.47, y un "A" en PHM939.48.

Intervalos cromosómicos Se proporciona los intervalos cromosómicos que se correlacionan con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas . Una variedad de métodos muy conocidos en la técnica están disponibles para identificar los intervalos cromosómicos . Los límites de tales intervalos cromosómicos se establecen para abarcar los marcadores que estarán unidos a uno o más QTL. En otras palabras, el intervalo cromosómico se diseña de tal manera que cualquier marcador que se encuentre dentro de ese intervalo (incluso los marcadores terminales que definen los límites del intervalo) se pueda usar como un marcador para la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. Cada intervalo comprende por lo menos un QTL y, además, puede claramente comprender más de un QTL. La proximidad estrecha de múltiples QTL en el mismo intervalo puede ofuscar la correlación de un marcador particular con un QTL particular, ya que un marcador puede demostrar enlace con más de un QTL. Por el contrario, por ejemplo, si dos marcadores en proximidad estrecha muestran cosegregación con el rasgo fenotípico deseado, algunas veces no está claro si cada uno de esos marcadores identifica el mismo QTL o dos QTL diferentes. No obstante, para realizar o practicar la invención, no es necesario saber cuántos QTL se encuentran en un intervalo en particular.

Los intervalos descritos a continuación muestran una agrupación de marcadores que se cosegregan con resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas . La agrupación de marcadores ocurre en dominios relativamente pequeños en los cromosomas, lo cual indica la presencia de uno o más QTL en esas regiones cromosómicas . El intervalo QTL se diseñó para abarcar marcadores que cosegregan con la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas. Los intervalos se definen por los marcadores en sus terminales, en donde el intervalo abarca los marcadores que se mapean dentro del intervalo, así como los marcadores que definen los terminales. Un intervalo descrito por los marcadores terminales que definen los puntos finales del intervalo incluirá los marcadores terminales y cualquier marcador que se localiza dentro de ese dominio cromosómico, ya sea que esos marcadores se conozcan actualmente o no.

Para los QLT en el cromosoma 3, puede definirse un intervalo por y que incluye los marcadores PHM12969 y PHM18211. Para el QTL en el cromosoma 4, se puede definir un intervalo por y que incluye PHM10892 y PHM10262. Cualquier marcador que se localiza dentro de esos intervalos puede encontrar uso como un marcador para la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas.

Los intervalos cromosómicos se pueden definir, además, por marcadores que se enlazan a (muestran desequilibrio de enlace con) un marcador QTL y r2 es una medida común de desequilibrio de enlace (DE) en el contexto de los. estudios de asociación. Si el valor r2 de DE entre un locus marcador del cromosoma 3 localizado dentro del intervalo de PHM12969 y PHM18211 y otro locus marcador del cromosoma 3 muy próximo es mayor que 1/3 (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002) ) , los loci están en desequilibrio de enlace entre sí.

Alelos marcadores y combinaciones haplotípicas Un marcador de la invención puede ser, además, una combinación de alelos en uno o más loci marcadores. Los alelos descritos más abajo pueden usarse en conjunto para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

Los alelos SNP favorables (es decir, asociados con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas) en el QTL en el cromosoma 3 se identificaron en la presente descripción e incluyen: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, y un "G" en PHM13926.32.

Los alelos SNP favorables (es decir, asociados con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas) en el QTL en el cromosoma 4 se identificaron en la presente descripción e incluyen: un "C" en PHM10892.3, un "G" en PHM939.47, y un "A" en PHM939.48.

El técnico con experiencia esperaría que pudieran haber sitios polimórficos adicionales en los loci marcadores en y alrededor de los marcadores del cromosoma 3 y 4 identificados en la presente descripción, en donde uno o más sitios polimórficos están en desequilibrio de enlace (DE) con un alelo en uno o más de los sitios polimórficos en el haplotipo. Se dice que dos alelos particulares en sitios polimórficos diferentes están en DE si la presencia del alelo en uno de los sitios tiende a predecir la presencia del alelo en el otro sitio en el mismo cromosoma (Stevens, Mol. Diag. 4 : 309-17 (1999) ) .

Selección asistida por marcadores Los marcadores moleculares pueden usarse en una variedad de aplicaciones de cultivo de plantas (por ejemplo, ver Staub et al. (1996) Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter.. 1: 3-8). Una de. las principales áreas de interés es aumentar la eficiencia del retrocruzamiento e introgresión de genes por medio del uso de la selección asistida por marcadores (MAS) . Un marcador molecular que muestra enlace con un locus que afecta un rasgo fenotípico deseado proporciona una herramienta útil para la selección del rasgo en una población de plantas . Esto es particularmente cierto cuando el fenotipo es difícil de ensayar, por ejemplo, muchos rasgos de resistencia a la enfermedad, u ocurre en una etapa tardía en el desarrollo de la planta, por ejemplo, características del grano. Ya que los ensayos del marcador de ADN son menos trabajosos y toman menos espacio físico que el fenotipado en el campo, se pueden evaluar poblaciones mucho más grandes, lo que aumenta las oportunidades de encontrar un recombinante con el segmento objetivo de la línea donante que se mueve a la línea receptora. Mientras más cerca del enlace, más útil es el marcador, ya que es menos probable que ocurra la recombinación entre el marcador y el gen que provoca el rasgo, lo que puede resultar en falsos positivos. Al contar con marcadores de flanqueo, disminuyen las oportunidades de que ocurra la selección de los falsos positivos ya que pudiera ser necesario un evento de doble recombinación. La situación ideal es tener un marcador en el gen en sí mismo, de manera que recombinación no ocurra entre el marcador y el gen. Un marcador de este tipo se llama un "marcador perfecto" .

Cuando un gen se introgresa por MAS, no es solamente el gen lo que se introduce sino también las regiones de flanqueo (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). Esto se menciona como "arrastre de enlace" . En el caso en donde la planta donante no se relaciona mucho con la planta receptora, estas regiones de flanqueo portan genes adicionales que pueden codificar para rasgos agronómicamente indeseables. Este "arrastre por enlace" puede, además, resultar en un rendimiento reducido u otras características agronómicas negativas incluso antes de los múltiples ciclos de retrocruzamiento en la línea élite de maíz. Alguna veces esto se menciona como "arrastre de rendimiento" . El tamaño de la región de flanqueo puede disminuirse por retrocruzamiento adicional, aunque este no siempre es exitoso porque los productores no tienen control del tamaño de la región o los puntos de ruptura de la recombinación (Young et al. (1998) Genetics 120:579-585). En el cultivo clásico, usualmente, es solo por casualidad que se seleccionen recombinaciones que contribuyan a una reducción del tamaño del segmento donante (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264). Aun después de 20 retrocruzamientos en retrocruzamientos de este tipo, se puede esperar encontrar una pieza considerable del cromosoma donante enlazada todavía al gen que se selecciona. Con los marcadores, sin embargo, es posible seleccionar aquellos individuos raros que experimentaron la recombinación cerca del gen de interés. En 150 plantas retrocruzadas, hay un 95 % de oportunidad de que al menos una planta experimente un cruce dentro de 1 cM del gen, basado en una distancia de mapa de meiosis. Los marcadores permitirán la identificación inequívoca de esos individuos. Con un retrocruzamiento adicional de 300 plantas, habría un 95 % de oportunidad de un cruce dentro de 1 cM de distancia de mapa de meiosis del otro lado del gen, lo que genera un segmento alrededor del gen objetivo de menos de 2 cM basado en una distancia de mapa de meiosis simple. Esto se puede realizar en dos generaciones con los marcadores, mientras que esto hubiera requerido un promedio de 100 generaciones sin marcadores (Ver Tanksley et al., supra) . Cuando se conoce la localización exacta de un gen, los marcadores de flanqueo que rodean el gen se pueden usar para seleccionar las recombinaciones en diferentes tamaños de población. Por ejemplo, en tamaños de población pequeños, las recombinaciones se pueden esperar lejos del gen, de manera que se requerirán marcadores de flanqueo más distales para detectar la recombinación.

La disponibilidad de mapas de enlace integrados del genoma del maíz que contienen densidades aumentadas de marcadores públicos del maíz ha facilitado el mapeo genético del maíz y MAS. Ver, por ejemplo, los mapas IBM2 vecinos, que están disponibles en línea en el sitio web MaizeGDB.

Los componentes clave para la implementacion de MAS son: (i) definir la población dentro de la cual se determinará la asociación marcador-rasgo, la que puede ser una población segregante, o una población aleatoria o estructurada; (ii) monitorear la segregación o asociación de los marcadores polimórficos con relación al rasgo, y determinar el enlace o asociación por medio del uso de métodos estadísticos; (iii) definir un conjunto de marcadores deseables basado en los resultados del análisis estadístico, y (iv) el uso y/o extrapolación de esta información al conjunto real del germoplasma de cultivo para permitir tomar las decisiones de selección basadas en el marcador. Los marcadores descritos en esta descripción, así como otros tipos de marcadores, tales como SSR y FLP, se pueden usar en los protocolos de selección asistida por marcadores.

Los SSR pueden definirse como pasadas relativamente cortas de ADN repetidos en tándem con longitudes de 6 bp o menos (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; ang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6) Polymorphisms arise due to variation in the number of repeat units, probably caused by slippage during DNA replication (Levinson and Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221) . La variación en las longitudes repetidas puede detectarse mediante el diseño de iniciadores de PCR para las regiones de flanqueo no repetitivas conservadas (Weber y May (1989) Am J H m Genet . 44:388-396). Los SSR son muy adecuados para el mapeo y MAS ya que estos son multi-alélicos, codominantes , reproducibles y dóciles para la automatización de gran productividad. (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. En: Non-mammalian genomic analysis : a practical guide. Academic press. págs . 75-135).

Se puede generar' varios tipos de marcadores SSR, y los perfiles SSR de líneas resistentes se pueden obtener por electroforesis en gél de los productos de amplificación. El puntaje del genotipo marcador se basa en el tamaño del fragmento amplificado. Un servicio SSR para el maíz está disponible al público sobre bases contractuales por ADN Landmarks en Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.

Además, se pueden generar varios tipos de marcadores FLP. Más comúnmente, los iniciadores de amplificación se usan para generar polimorfismos de longitud del fragmento. Esos marcadores FLP son de muchas maneras similares a los marcadores SSR, excepto que la región amplificada por los iniciadores no es, típicamente, una región muy repetitiva. Aun así, la región amplificada, o amplicón, tendrá suficiente variabilidad entre el germoplasma, frecuentemente, debido a inserciones o deleciones, de tal manera que los fragmentos que se generan por los iniciadores de amplificación, se puedan distinguir entre individuos polimorfos, y se conoce que esos indel ocurren, frecuentemente, en el maíz (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b), supra) .

Los marcadores de SNP detectan sustituciones de nucleótidos de un solo par de base. De todos los tipos de marcadores moleculares, los SNP son los más abundantes, y tienen así el potencial para proporcionar la resolución del mapa genético (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48 : 539-547) . Los SNP se pueden ensayar a un nivel de productividad aún más alto que los SSR, en un modo llamado de extrema productividad, ya que no requieren de grandes cantidades de ADN y la automatización del ensayo puede ser directa. Los SNP también tienen la promesa de ser sistemas de costos relativamente bajos. Estos tres factores juntos hacen los SNP altamente atractivos para su uso en MAS. Varios métodos se encuentran disponibles para genotipar el SNP, que incluyen, pero no se limitan a, la hibridación, extensión del iniciador, ligación de oligonucleótidos , clivaje por nucleasas, minisecuenciación y esferas codificadas. Tales métodos se revisaron en: Gut (2001) HUÍTI Mutat 17, págs . 475-492; Shi (2001) Clin Chem 47, págs. 164-172 ; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, págs. 95-100 ; Bhattramakki and Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. En: R. J. Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Una amplia variedad de tecnologías comercialmente disponibles usan estos y otros métodos para interrogar los SNP que incluyen Masscode.TM. (Qiagen) , Invader.RTM. (Third Wave Technologies), SnapShot . RTM . (Applied Biosystems) , Taqman.RTM. ' (Applied Biosystems) y Beadarrays . TM . (Illumina) .

Un número de SNP juntos dentro de una secuencia, o a través de secuencias enlazadas, pueden usarse para describir un haplotipo para cualquier genotipo particular (Ching et al. (2002), BMC Genet . 3:19 págs . Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333). Los haplotipos pueden ser más informativos que los SNP solos y pueden ser más descriptivos que cualquier genotipo particular. Por ejemplo, un solo SNP puede ser un alelo "T" para una línea o variedad . específica con resistencia al moho por Fusariuw en las mazorcas, pero el alelo "T* también puede estar en la población de cultivo de maíz que se usa para genitores recurrentes. En este caso, un haplotipo, por ejemplo una combinación de alelos en los marcadores SNP enlazados, puede ser más informativo. Una vez que un haplotipo único se asigna a una región cromosómica donante, ese haplotipo puede usarse en esa población o cualquier subconjunto de esta para determinar si un individuo, tiene un gen particular. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO2003054229. El uso de plataformas de detección de marcadores, de gran productividad automatizada conocidas para las personas con experiencia en la técnica hace este proceso altamente eficaz y efectivo.

Muchos de los marcadores PHM pueden usarse fácilmente como marcadores FLP para seleccionar los loci genéticos en los cromosomas 3 y/o 4, debido a la presencia de polimorfismos de inserción/deleción. Los iniciadores para los marcadores PHM se pueden usar, además, para convertir estos marcadores en SNP u otros marcadores estructuralmente similares o funcionalmente equivalentes (SSR, CAP, indeles, etc.) en las mismas regiones. Una aproximación muy productiva para la conversión de SNP es descrita por Rafalski (2002a) Current opinión in plant biology 5 (2) : 94-100 y además Rafalski (2002b) Plant Science 162: 329-333. Con el uso de PCR, los iniciadores se usan para amplificar segmentos de ADN de individuos (preferentemente, endogámicos) que representan la diversidad en la población de interés. Los productos de PCR se colocan en secuencia directamente en una o ambas direcciones. Las secuencias resultantes se alinean y los polimorfismos se identifican. Los polimorfismos no se limitan a los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) , sino incluyen, además, indeles, CAP, SSR y VNTR (número variable de repeticiones en tándem.) . Específicamente, en comparación con la información del mapeo fino que se describe en la presente invención, es posible usar fácilmente la información proporcionada en la presente invención para obtener SNP polimorfos adicionales (y otros marcadores) dentro de la región amplificada por los iniciadores enumerados en la presente descripción. Los marcadores dentro de la región del mapa que se describe se pueden hibridizar con BAC u otras bibliotecas genómicas o se pueden alinear electrónicamente con las secuencias del genoma para encontrar nuevas secuencias en la misma localización aproximada al igual que los marcadores descritos.

Además de SSR, FLP y SNP, tal como se describió anteriormente, también se usa ampliamente otros tipos de marcadores moleculares que incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de secuencia expresada (EST) , marcadores SSR derivados de secuencias EST, ADN polimorfo amplificado aleatoriamente) y otros marcadores a base de ácidos nucleicos .

Los perfiles de isozima y las características morfológicas vinculadas, en algunos casos, se usan, además, indirectamente como marcadores. Aunque no detectan directamente las diferencias de ADN, f ecuentemente, están influenciados por diferencias genéticas específicas. Sin embargo, los marcadores que detectan la variación de ADN son por mucho más numerosos y polimorfos que los marcadores morfológicos o isozimas (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter 1:3-8) .

Los alineamientos de secuencia o cóntigos pueden usarse también para encontrar secuencias corriente arriba o corriente abajo de los marcadores específicos enumerados en la presente invención. Estas secuencias nuevas, cercanas a los marcadores descritas en la presente descripción, se usan para descubrir y desarrollar marcadores funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, los mapas físicos y/o genéticos diferentes se alinean a los marcadores equivalentes localizados no descritos dentro de esta descripción pero que están dentro de regiones similares. Estos mapas pueden estar dentro de las especies de maíz, o a través de otras especies que se alinean genéticamente o físicamente con el maíz, tales como arroz, trigo, cebada o sorgo.

Generalmente, la MAS usa marcadores polimórficos que se identificaron por tener una probabilidad significativa de cosegregación con la resistencia al moho por Fusariu en las mazorcas. Se supone que esos marcadores mapean cerca de un gen o genes que dan a la planta su fenotipo de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas, y se consideran indicadores para el rasgo deseado, y de ahí que se denominan marcadores QTL. Las plantas se evalúan para la presencia de un alelo favorable en el marcador QTL, y se espera que las plantas que contienen un genotipo deseado en uno o más loci transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado, a su progenie. Los medios para identificar las plantas de maíz que tienen resistencia aumentada al moho por Fusarium en la mazorca mediante la identificación de las plantas que tienen un alelo especificado en uno cualquiera de los loci marcadores descritos en la presente descripción, que incluyen los loci marcadores en el cromosoma 3, PHM12969, PHM1695, PHM12209, PHM2204, PHM9905, PHM13926, PHM10091, y PHM18211, y los loci marcadores .en ¦ el cromosoma 4, PHM2015, PHM10326, PHM497, PHM4483, PHM5273, PHM939, PHM10892, PHM9363, PHM18162, PHM9942, PHM5247, PHM3985, PHM6226, y PHM10262, se presentan en la presente invención.

Además, los alelos favorable (es decir, asociados con el moho aumentado en la mazorca por Fusarium) identificados en la presente descripción incluyen: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13 , un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, un "G" en PHM13926.32, un »C" en PHM10892.3, un "G" en PHM939.47, y un "A" en PHM939.48.

Los intervalos QTL que se presentan en la presente invención son útiles en MAS para seleccionar las plantas que demuestran una resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. De manera similar, los intervalos QTL pueden usarse para contra-seleccionar plantas que son más susceptibles al moho por Fusarium en las mazorcas. Cualquier marcador que mapea dentro del intervalo QTL (que incluye los terminales de los intervalos) pueden usarse para este propósito. El intervalo cromosómico 3 se define por e incluye PHM12969 y PHM18211, mientras que el intervalo cromosómico 4 se define por e incluye PHM10892 y PHM10262. Pueden seleccionarse plantas con alelos marcadores deseables dentro de los intervalos del cromosoma 3 y/o cromosoma 4. Los marcadores QTL que tienen las asociaciones más fuertes con la resistencia al moho por Fusarium son particularmente útiles para la selección asistida por marcador .

Los haplotipos se pueden usar, además, en la MAS para introducir resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas en líneas susceptibles de maíz o variedades. Un haplotipo del cromosoma 3 asociado con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas puede comprender al menos uno de los siguientes: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23 , un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en ???2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, y un "G" en PHM13926.32, o cualquier otro alelo marcador que se enlaza a y se asocia con cualquiera de los alelos marcadores identificados en la presente descripción como que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. Un haplotipo del cromosoma 4 asociado con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas puede comprender al menos uno de los siguientes: un "C" en PHM10892.3, un "G" en PHM939.47, y un "A" en PHM939.48, o cualquier otro alelo marcador que se enlaza a y se asocia con cualquiera de los alelos marcadores identificados en la presente descripción como que se asocia con la resistencia aumentada al moho por. Fusarium en las mazorcas.

Cualquier alelo que está en desequilibrio de enlace con un haplotipo que comprende al menos uno de los siguientes: un "C" en PHM12209.il, un "T" en PHM12209.20, un "C" en PHM12209.21, un "G" en PHM12209.22, un "C" en PHM12209.23, un "A" en PHM9905.il, un "T" en PHM9905.13, un "G" en PHM9905.35, un "T" en PHM2204.88, un "A" en PHM2204.105, un "C" en PHM13926.25, un "G" en PHM13926.27, un "G" en PHM13926.28, y un "G" en PHM13926.32, o un haplotipo que comprende al menos uno de los siguientes: un "C" en PHM10892.3, un "G" en PH 939.47, y un "A" en PHM939.48 puede usarse además en la MAS para seleccionar plantas con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

Plantas de maíz Las composiciones y métodos presentados en la presente descripción pueden usarse para identificar y/o seleccionar plantas del género Zea ( y más específicamente, Zea ays L. ssp. Mays) que tienen resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas. Las plantas pueden ser híbridas, endogámicas, endogámicas parciales, o miembros de poblaciones definidas o indefinidas. Estas pueden ser de cualquier grupo heterótico, que incluyen, pero sin limitarse a, los grupos tallo duro y no tallo duro.

En consecuencia, las plantas de maíz que se identifican y/o seleccionan por cualquiera de los métodos presentados en la presente descripción son además una característica de la invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada. Se entiende que los ejemplos y modalidades que se describen en la presente invención son únicamente para ilustrar y que los expertos en la técnica reconocerán varios reactivos o parámetros que se pueden alterar sin apartarse del espíritu de la invención o del alcance de las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1 Detección del QTL : Análisis de mapeo por asociación Se realizó una estrategia de mapeo por asociación para identificar los marcadores asociados con la resistencia al moho por Fusarium en maíz. En este análisis de asociación, se analizó una colección de 475 líneas de maíz por secuenciación de ADN a 4000-10000 genes (loci genéticos) . Las líneas abarcaron el germoplasma élite, cultivares comercialmente liberados, y otras variedades públicas.

Las puntuaciones fenotípicas se obtuvieron mediante el uso de la escala FUSERS proporcionada en la FIG. 5. Se asignó una puntuación promedio para cada línea basado en los datos acumulados en múltiples lugares y durante múltiples años.

Se realizó un análisis de asociación en base a la estructura con el uso de métodos estándar, de mapeo por asociación, en donde la estructura poblacional se controla con el uso de los datos del marcador. El programa de análisis de grupos en base al modelo, Structure, desarrollado por Pritchard et al., (Genetics 155:945-959 (2000)) se usó con los datos del haplotipo para 880 endogámicas élites de maíz en doscientos marcadores para estimar los coeficientes de mezcla y asignar las endogámicas a siete subpoblaciones . Esto reduce la incidencia de positivos falsos que pueden surgir debido al efecto de la estructura de la población en las estadísticas del mapeo por asociación. La estadística de Kuiper para analizar si dos distribuciones son las mismas se usó para probar un marcador dado para asociación entre haplotipo y fenotipo en una subpoblación dada (Press et al., Numérica! Recipes in C, segunda edición, Cambridge University Press, NY (2002)).

Un pico de asociaciones marcador-rasgo significativas se identificó en el cromosoma 3 (FIG. 3) en un grupo tallo duro. La TABLA 1 proporciona una lista de los marcadores de maíz que se asocian significativamente con el fenotipo de resistencia al moho por Fusarium en el nivel p = 0.001, que representa un intervalo de ~4 cM en los mapas genéticos internamente derivados. En los mapas genéticos internamente derivados, este intervalo cromosómico se delinea por, e incluye los marcadores PH 12969 en la posición 224.43 (valor p= 1.4 x 10"4) y PHM1695 en la posición 228.76 (valor p = 1.28 x 10"4) . El marcador más asociado es PHM2204 en la posición 226.71 con un valor p de 2.05 x 10"6. Las posiciones se dan en cM, la posición cero es el primer marcador (el más distal desde el centrómero) conocido al principio del cromosoma. Las posiciones de mapeo en la Tabla 1 no son absolutas y representan un aproximado de la posición del mapa en base al mapa genético (PHB, por sus siglas en inglés) derivado internamente.

Tabla 1: Marcadores del cromosoma significativamente asociados con la¦ resistencia al moho por Fusarium en la mazorca a p = 0.001 en el grupo de la subpoblacion tallo duro Posición (cM) Secuencia Nombre del relativa del mapa de Secuencias marcador en el mapa PHB Valor P referencia del iniciador Sec . con Secs . con núm. de núms . de PHM12969 224. .43 1. .40E- 04 ident . : 1 ident . : 23-26 Sec . con Secs . con núm. de núms . de PHM2204 226. .71 2. .05E- 06 ident . :2 ident . : 27-30 Sec . con Secs . con núm . de núms . , de PHM9905 226. .83 1. .47E- 05 ident . : 3 ident . :i31-34 Sec . con Secs . con núm. de núms . , de PHM12209 226. , 95 6. .26E- 05 ' ident . : 4 ident . : 35-38 Sec . con Secs . con núm. de núms . . de PHM13926 227. .97 4. .94E- 06 ident . : 5 ident . : :39-42 Sec . con Secs . con núm . de núms . . de PHM10091 227. .97 2. .60E- 04 ident . : 6 ident . : : 43-46 Sec. con Secs . con núm. de núms , . de PHM18211 228. .29 8 .20E- 04 ident . : 7 ident . : :47-50 Sec . con Secs . con núm. de núms , . de PHM1695 228 , .76 1 .28E- 04 ident . : 8 ident . : :51-54 Un pico de asociaciones marcador-rasgo significativas se identificó además en el cromosoma 4 (FIG. 4) en el mismo grupo tallo duro. La TABLA 2 proporciona una lista de los marcadores de maíz que se asocian significativamente con el fenotipo de resistencia al moho por Fusarium en el nivel p = 0.001, que representa un intervalo de ~2 cM en los mapas genéticos internamente derivados. En los mapas genéticos internamente derivados, este intervalo cromosómico se delinea por, e incluye los marcadores PHM939 en la posición 198.06 (valor p = 7.00 x 10"5) y PHM10262 en la posición 201.25 (valor p = i.38 x 10"4) . El marcador más asociado es PHM10892 en la posición 198.06 con un valor p de 4.44 x 10"7. Las posiciones se dan en cM, la posición cero es el primer marcador (el más distal desde el centrómero) conocido al principio del cromosoma. Las posiciones de mapeo en la Tabla 2 no son absolutas y representan un aproximado de la posición del mapa en base al mapa genético (PHB) derivado internamente .

Tabla 2: Marcadores del cromosoma significativamente asociados con la resistencia al moho por Fusarium en la mazorca a p = 0.001 en el grupo de la subpoblacion tallo duro Posición (cM) relativa del Nombre del mapa en el mapa Secuencia de Secuencias del marcador PHB Valor P referencia iniciador Sec. con núm. Secs. con de ident. : 10 núms . de PHM10892 198.06 4.44E-07 ident. : 59-62 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 9 núms . de PH 939 198.06 7. OOE-05 ident . : 55-58 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 11 núms . de PHM5273 198.27 2.06E-04 ident . : 63-66 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 12 núms . de PHM497 198.54 1.16E-04 ident. :67-70 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 13 núms . de PHM4483 199.67 1.00E-03 ident. : 71-74 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 14 núms . de PHM2015 199.72 3.12E-04 ident. : 75-78 Sec. con núm. Secs . con de ident . : 15 núms . de PHM10326 199.78 8.80E-04 ident. : 79-82 Sec . con núm . Secs. con de ident . : 16 núms . de PHM9363 199.78 5.20E-04 ident. : 83-86 Sec . con núm . Secs. con de ident . : 17 núms . de PHM18162 200.62 9.20E-04 ident . : 87-90 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 18 núms . de PHM9942 200.88 2.96E-04 ident . : 91-94 Sec. con núm. Secs. con de ident . : 19 núms . de PHM5247 200.93 2.40E-04 ident . : 95-98 Secs. con Sec. con núm. núms . de PHM3985 201.06 1.78E-04 de ident. :20 ident. : 99-102 Secs. con núms . de Sec. con núm. ident . : 103- PHM6226 201.25 9.20E-04 de ident.: 21 106 Secs. con núms . de Sec. con núm. ident . : 107- PHM10262 201.25 1.38E-04 de ident . :22 110 Hubo 145 líneas asignadas por el programa de análisis de grupo basado en el modelo, Structure, para la subpoblación tallo duro en la que se detéctaron los QTL para la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas.

Ejemplo 2 Posiciones en el mapa físico Las secuencias de consenso para cada uno de los marcadores PHM se sometieron al BLAST en una base de datos que consiste en BAC secuenciados de maíz públicos. Las TABLAS 3 y 4 muestran los BAC para cada marcador que se identificó, por contener ese marcador, y asi delinear las regiones del mapa físico donde se localizan los QTL.

Tabla 3: Aciertos de BAC para los marcadores PHM en el cromosoma 3 Nombre del marcador Aciertos de BAC PHM12969 c0437dl8, c0094gl8, b0219jl4 PHM1695 c0467nl0 PHM12209 C0467nl0, b0184dl7 PHM2204 C0289fl6, b0184dl7 PHM9905 C0289Í16, b0184dl7 PHM13926 b0444e07 PHM10091 c0146b03, b0444e07 PHM18211 C0482dl9, c0060e22 Tabla 4 : Aciertos de BAC para los marcadores PHM en el cromosoma 4 Nombre del marcador Aciertos de BAC PHM10892 b0269h08 PHM939 C0184j24 PHM5273 C0184j24 PHM497 C0516gl0 PHM4483 C0239C09, C0215Í19 PHM2015 b0185p07 PHM10326 b0194j21 PHM9363 b0408e05 PHM18162 c0067jl9, b0408e05 PHM9942 C0197Í23 PHM5247 c0510k02, c0112k06 PHM3985 c0483hl8, b0200m05 PHM6226 c0237f22 PHM10262 C0237Í22, C0069Í21 Ejemplo 3 Análisis del haplotipo para 113 líneas Tallo duro En el estudio de asociación en el Ejemplo 2, los cuatro marcadores más asociados en la región del cromosoma 3 fueron PHM12209, PHM9905, PHM2204, y PHM13926. Los polimorfismos SNP que se asocian con cualquier fenotipo favorable o desfavorable de resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas pueden identificarse al crear un haplotipo que puede identificarse y seleccionarse en las plantas. La TABLA 5 muestra los polimorfismos SNP en los loci marcadores PHM12209, PHM9905, PHM2204, y PHM13926 que se asocian con el fenotipo favorable, o la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas, y que pueden usarse en combinaciones haplotípicas para identificar plantas con resistencia aumentada al moho por Fusarium en la mazorca.

Tabla 5: SNP en los loci marcadores PHM12209, PHM9905, 4. v PHM13926 Marcador SNP de Genotipos alta seleccionados Polimorfismo Posición productividad para haplotipo desarrollado favo able PHM12209.11 208 N/A c PHM12209.20 297 PHM12209-20-U t PH 12209.21 328 PHM12209-21-U c PHM12209.22 344 N/A g PHM12209.23 365 PHM12209-23-U c PHM9905.11 516 N/A a PH 9905.13 531 N/A t PHM9905.35 912 N/A g PHM2204.88 750 N/A t PHM2204.105 1166 N/A a PHM13926.25 309 N/A o c PHM13926.27 315 N/A g PHM13926.28 336 N/A g PHM13926.32 360 N/A g En el estudio de asociación en el Ejemplo 2, los dos marcadores más asociados en la región del cromosoma 4 fueron PHM10892 y PHM939, y los marcadores SNP que se usaron para la búsqueda del haplotipo se muestran en la TABLA 6. La TABLA 6 muestra los polimorfismos SNP en los loci marcadores PHM10892 y PHM939 que se asocian con el fenotipo favorable, o la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas, y que pueden usarse en combinaciones haplotípicas para identificar plantas con resistencia aumentada al moho por Fusarium en la mazorca.

Tabla 6,. SNP en los loci marcadores PHM10892 y PH 939 útiles para identificar genotipos que se asocian con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

Los marcadores PHM pueden usarse para genotipar la progenie a través de la secuenciación de los productos PCR. Las secs. con núms . de ident .: 23-110 representan los iniciadores para cada uno de los loci marcadores PHM enumerados en las Tablas 1 y 2. Para el análisis del marcador PHM, las reacciones de PCR interna, se realizaron mediante el uso de iniciadores externos e internos para cada marcador PHM. En la primera reacción PCR se usaron, 0.90 µ? de tampón PCR 10X, 0.18 µ? de mezcla dNTP 10 mM, 0.27 µ? de MgCl2 50 mM, 1.50 µ? de iniciador directo externo 2.5 µ?, 1.50 µ? de iniciador inverso externo 2.5 µ?, 0.04 µ? de platino Taq, 1.61 µ? de ddH20, y 3 µ? de 1.5 ng/µ? ADN. Las condiciones de termociclado constituyen: 95 °C en 5 minutos; 94 °C por 20 segundos, 55 °C por 30 segundos, y 72 °C por 2 minutos, repetido por 24 ciclos; 72 °C por 10 minutos; y se mantiene a 4 °C. El ADN producido a partir de la primera ronda de PCR se diluye después 1:9 con TE para usar en la segunda ronda de PCR. La mezcla de reacción para la segunda ronda de PCR es la misma excepto que se usan los conjuntos internos de iniciadores, y el ADN es el ADN diluido de la primera ronda de PCR. Las condiciones de termociclado para la segunda ronda de PCR constituyen: 95 °C en 5 minutos; 94 °C por 20 segundos, 55 °C por 30 segundos, y 72 °C por 2 minutos, repetido por 28 ciclos; 72 °C por 10 minutos; y se mantiene a 4 °C. Los productos PCR se secuencian después directamente.

Adicionalmente, los marcadores de gran productividad pueden desarrollarse para polimorfismos útiles. Estos marcadores distinguirán los genitores entre sí, preferentemente, mediante el uso de un ensayo de gran productividad, y se usan para genotipar las plantas de la progenie segregantes. Los marcadores de producción se desarrollaron, por ejemplo, a partir de los SNP PHM12209.20, PHM12209-21, PHM12209-23 , y PHM10892-3. Estos marcadores particulares se diseñaron para usar con la plataforma de gran productividad Invader Plus . Las secuencias del iniciador y la sonda para estos marcadores se muestran en la TABLA 7 y representan secs. con núms . de ident .: 111-126.

Tabla 7 : Información del marcador para marcadores SNP de gran productividad De las 124 líneas en la subpoblac-ión tallo duro, 113 tenían suficientes datos genotípicos y fenotípicos para analizar posteriormente.

Para el QTL en el cromosoma 3, cuarenta y siete líneas tenían el haplotipo favorable (es decir, todos los SNP identificados en la Tabla 5) y una puntuación FUSERS promedio de 5.1 (error estándar = 0.1), mientras que sesenta y seis líneas tenían otros haplotipos y una puntuación promedio de 4.3 (error estándar = 0.2).

Para el QTL en el cromosoma 4, veintidós líneas tenían el haplotipo favorable (es decir, todos los SNP identificados en la Tabla 6) y una puntuación FUSERS promedio de 5.5 (error estándar = 0.2). Noventa y una líneas tenían otros haplotipos y una puntuación FUSERS promedio de 4.4 (error estándar = 0.1).

Ejemplo 4 Validación dentro de un grupo endogámico Tallo grueso Una colección de 54 líneas endogámicas, que difieren en sus haplotipos en el loci de rasgos-marcador en el cromosoma 3 (c3) y cromosoma 4 (c4) se evaluaron para la resistencia al moho por Fusarium en las mazorcas en 2006 en Kauai, HI, en donde ocurre una infección natural. Para cada locus de rasgos-marcador, las líneas endogámicas se clasificaron por tener un haplotipo favorable o desfavorable basado en el genotipado actual de la entrada o las líneas endogámicas progenitoras directas. Para la asociación marcador- rasgos en c3, un haplotipo favorable comprendió un 'A' en PHM2204-97, mientras que un haplotipo desfavorable comprendió un 'G' en el mismo locus . Para la asociación marcador-rasgos en c4, Para la c4 asociación marcador-rasgos en 4C en PHM10892-3, mientras que un haplotipo desfavorable comprendió un x ?" en el mismo locus.

Las líneas endogámicas se evaluaron para la reacción al moho de la mazorca de acuerdo con la escala de puntuación FUSERS que se muestra en la FIG. 5. Hubo tres réplicas en el experimento. Los datos se analizaron y se obtuvieron las medias de los mínimos cuadrados (LS, por sus siglas en inglés) mediante el uso de procGLM (paquete estadístico SAS) .

La puntuación media del moho de la mazorca de las líneas endogámicas que portan un haplotipo favorable en el locus c3 no difieren significativamente de la puntuación media del moho de la mazorca de las líneas endogámicas que portan un haplotipo desfavorable. Sin embargo, las líneas endogámicas que portan un haplotipo favorable en el locus C4 tuvieron una puntuación, en promedio, significativamente superior que las líneas endogámicas que portan un haplotipo desfavorable en el mismo locus. Las puntuaciones medias FUSERS LS para cada haplotipo del locus se muestran en la TABLA 8.

Tabla 8 : Media de los mínimos cuadrados FUSERS obtenida en Kauai, HI en 2006 probabilidad para la comparación de haplotipos dentro de un a locus de rasgos marcador ' ns no significativo, *** significativo a p<0.001 Ejemplo 5 Validación dentro de un segundo grupo de líneas endogamicas tallo grueso , Una colección de líneas endogamicas tallo grueso, con haplotipos que difieren en los loci de asociación marcador-rasgos en el c3 y c , se evaluaron para la resistencia al moho por Fusariu en las mazorcas en 2007 en los lugares de Estados Unidos (Cairo, GA, y Woodland, CA) , en donde ocurre la infección natural. Para cada locus de rasgos -marcador, las líneas endogámicas se clasificaron por tener un haplotipo favorable o desfavorable basado en el genotipado actual de la entrada o las líneas endogámicas progenitoras directas. Para la asociación marcador- rasgos en c3 , un haplotipo favorable comprendió un (A' en PHM2204-97 mientras que un haplotipo desfavorable comprendió un 'G' en el mismo locus. Para la asociación marcador- rasgos en c4, Para la c4 asociación marcador-rasgos en ' C en PHM10892-3 mientras que un haplotipo desfavorable comprendió un ¾ ?" en el mismo locus.

Se obtuvo una puntuación fenotípica para cada entrada mediante la calificación de todas las mazorcas individuales dentro de una fila mediante el uso de la escala FUSERS proporcionada en la FIG. 5 y el cálculo de una puntuación total de la fila con la siguiente fórmula: FUSINDEX= [(1 x número de mazorcas con fenotipo desfavorable) + (5 x número de mazorcas intermedias) + (9 x número de mazorcas con fenotipo favorable)] / número total de mazorcas En el 2007, la presión de la enfermedad fue ligera en el Cairo y suficiente para una puntuación efectiva en el sitio Woodland. Las puntuaciones fenotípicas se obtuvieron para 43 líneas endogámicas en el Cairo y 45 líneas endogámicas en Woodland, con 32 de esas líneas endogámicas evaluadas en los dos lugares. Hubo tres réplicas en el Cairo y seis en Woodland. El paquete estadístico ASReml se usó para analizar los datos y obtener las puntuaciones FUSERS medias prelas .

A través de los lugares, la puntuación FUSINDEX promedio de las líneas endogámicas que tienen el haplotipo favorable en c3 fue significativamente superior que la puntuación FUSINDEX promedio de las líneas endogámicas que portan el haplotipo desfavorable. Esta diferencia en las puntuaciones promedio fue además muy significativa en el lugar Woodland individual .

A través de los lugares, la puntuación FUSINDEX promedio de las líneas endogámicas que tienen el haplotipo favorable en c4 fue significativamente superior que la puntuación FUSINDEX promedio de las líneas endogámicas que portan el haplotipo desfavorable.- Esta diferencia en las puntuaciones promedio fue, además, significativa en el lugar del Cairo y muy significativa en el lugar Woodland.

El efecto de interacción de los dos loci no fue significativo, lo que indica que los loci exhibieron efectos aditivos en el fenotipo. Las puntuaciones FUSINDEX medias prelas para cada clase de haplotipo en cada asociación locus marcador se muestran en la TABLA 9. Las puntuaciones FUSINDEX medias prelas para cada clase de haplotipo combinado c3/c4 se muestran en la TABLA 10.

Tabla 9. Puntuaciones FUSINDEX medias prelas obtenidas en el 2007 para las clases de haplotipo en cada locus de rasgos-marcador probabilidad para la comparación de haplotipos dentro de- un locus de rasgos marcador ns no significativo, * significativo en p<0.05, *** significativo en p<0.001 Tabla 10. Puntuaciones FUSINDEX medias prelas obtenidas en el 2007 para las cuatro clases de haplotipo combinados.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para seleccionar una planta decmaíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz un primer alelo marcador que se enlaza a y se asocia con un segundo alelo marcador seleccionado del grupo que consiste en: i . un en PHM12209.11, ii . un en PHM12209.20, iii . un »C" en PHM12209.21, iv . un "G" en PH 12209.22, v. un "C" en PHM12209.23, vi . un "A" en PHM9905.11, vii . un en PHM9905.13, viii . un "G" en PH 9905.35, ix. un en PHM2204.88, X. un "A" en PHM2204.105, xi . un "C" en PHM13926.25, xii . un "G" en PHM13926.27, xiii . un "G" en PHM13926.28, xiv. un "G" en PHM13926.32, XV. un "C" en PHM10892.3, xvi. un "G" en PHM939.47, xvii. y un "A" en PHM939.48; y b. seleccionar dicha planta de maíz con el primer alelo marcador .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer alelo marcador se enlaza al segundo alelo marcador por 20 cM basado en un mapa de meiosis sencilla.

3. El método de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque el primer alelo marcador se enlaza al segundo alelo marcador por 1 cM basado en un mapa de meiosis sencilla.

4. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarii en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz al menos un alelo marcador seleccionado del grupo que consiste en: i. un "C" en PHM12209.il, ii. un "T" en PHM12209.20, iii. un "C" en PHM12209.21, iv. un "G" en PHM12209.22, v. un "C" en PHM12209.23, vi. un "A" en PHM9905.il, vii. un "T" en PHM9905.13, viii. un "G" en PHM9905.35, ix. un en PHM2204.88, X. un "A" en PH 2204.105, xi . un en PHM13926.25, xii . un "G" en PHM13926.27, xiii . un "G" en PHM13926.28, xiv. un "G" en PHM13926.32, XV. un "C" en PHM10892.3, xvi . un "G" en PHM939.47, xvii . y un " A" en PHM939.48; b. seleccionar la planta de maíz que tiene al menos un alelo marcador.

5. Un método para identificar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz un locus marcador, caracterizado porque: i . una sonda marcadora que comprende todo o una porción del locus marcador o complemento de este, híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident.:l, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:l en base al método de alineamiento Clustal V, y la sec. con núm. de ident.:7, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:7 en base al método de alineamiento Clustal V; y ii. el locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; e b. identificar la planta de maíz que tiene al menos un alelo asociado con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas.

6. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. identificar una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador, caracterizado porque : i. una sonda marcadora que comprende todo o una porción del locus marcador o complemento de este, híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident.:l, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:l en base al método de alineamiento Clustal V, y la sec. con núm. de ident.:7, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:7 en base al método de alineamiento Clustal V; y ii . el locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; y b. cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz; c. evaluar las plantas de la progenie para el al menos un alelo de la primera planta de maíz; y d. seleccionar las plantas de la progenie que tienen el al menos un alelo de la primera planta de maíz.

7. Un método para identificar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz un locus marcador en donde : i. una sonda marcadora que comprende todo o una porción del locus marcador o complemento de este, híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec . con núm. de ident.:10, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:10 en base al método de alineamiento Clustal V, y la sec . con núm. de ident.:22, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:22 en base al método de alineamiento Clustal V; y ii . el locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; y b. identificar la planta de maíz que tiene al menos un alelo asociado con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas .

8. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. identificar una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador, en donde: i. una sonda marcadora que comprende todo o una porción del locus marcador o complemento de este, híbrida bajo condiciones rigurosas el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident.:10, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.:10 en base al método de alineamiento Clustal V, y la sec. con núm. de ident. :22, o una secuencia de nucleótidos que es 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 22 en base al método de alineamiento Clustal V; y ii. el locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia aumentada al moho por _Fusarium en las mazorcas; y b. cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz; c. evaluar las plantas de la progenie para el al menos un alelo de la primera planta de maíz; y d. seleccionar las plantas de la progenie que tienen el al menos un alelo de la primera planta de maíz.

9. Un método para identificar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz al menos un alelo de un locus marcador, en donde: i . el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM12969 y PHM18211; y ii. el al menos un alelo se asocia con la resistencia aumentada al moho por. Fusarium en las mazorcas; y b. identificar la planta de maíz que tiene al menos un alelo asociado con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en la mazorca.

10. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. identificar una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador, en donde: i. el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM12969 y PHM18211; y ii. el al menos un alelo se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; b. cruzar la primera planta de maíz con una segunda, planta de maíz ; c. evaluar las plantas de la progenie para el al menos un alelo de la primera planta de maíz; y d. seleccionar las plantas de la progenie que tienen el al menos un alelo de la primera planta de maíz.

11. Un método para identificar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz al menos un alelo de un locus marcador, en donde: i. el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM10892 y PHM10262; y ii. el al menos un alelo se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; y ¦ b. identificar la planta de maíz que tiene al menos un alelo asociado con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en la mazorca.

12. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas; caracterizado porque comprende: a. identificar una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador, en donde: i. el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM10892 y PHM10262; y ii. el al menos un alelo se asocia con la resistencia aumentada al moho por Fusarium en las mazorcas ; b. cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz; c . evaluar las plantas de la progenie para el al menos un alelo de la, primera planta de maíz; y d. seleccionar las plantas de la progenie que tienen el al menos un alelo de la primera planta de maíz.

13. Una planta de maíz caracterizada porque . se identifica con cualquiera de los métodos de conformidad con las reivindicaciones 5, 7, 9, 14, y 11.

14. Una planta de maíz caracterizada porque se selecciona por cualquiera de los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1-4, 6, 8, 10, y 12.