MX2012007849A - Metodos para uso de un agente adenoviral anti-angiogenico especifico. - Google Patents

Metodos para uso de un agente adenoviral anti-angiogenico especifico.

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Abstract

Se proporcionan vectores de adenovirus anti-angiogénicos, y usos terapéuticos de los mismos, y más particularmente, pero no exclusivamente, protocolos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos en pacientes con un vector de adenovirus Ad5-PPE-1-3X-fas-quimera.

Description

METODOS PARA USO DE UN AGENTE ADENOVIRAL ANTI-ANGIOGENICO ESPECIFICO Campo de la Invención La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se refiere .a vectores de adenovirus anti-angiogénicos, y uso terapéutico de los mismos, y más particularmente, pero no exclusivamente, a protocolos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos en pacientes con un vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera.
Antecedentes de la Invención La angiogénesis es un proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos por el brote de vasos vecinos preexistentes. Este proceso es característica común y principal de varias patologías. Entre estas están enfermedades en las cuales la angiogénesis excesiva es una parte de la patología y . de esta manera es un objetivo de terapia, más significativamente, ..cáncer. La angiogénesis se presenta en tumores y permite su crecimiento, invasión y proliferación metastásica. En 1971, Folkman propuso que el crecimiento tumoral y la metástasis son dependientes de la angiogénesis, y sugirió que la inhibición de la angiogénesis puede ser una estrategia para detener el crecimiento tumoral.
Existen varias moléculas implicadas en la ¦ angiogénesis, desde moléculas de la superficie celular a' Reí'.: 232458 factores de transcripción a factores de crecimiento. La hipoxia es un factor ambiental importante que conduce a la neovascularización, que induce la liberación de varias citocinas pro-angiogénicas , incluyendo factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) y sus receptores, miembros de la familia angiopoyetina, factor de crecimiento básico de fibroblastos y endotelina-1 (ET-1) . Estos factores median la inducción. de la angiogénesis a través del control de la activación, proliferación y migración de células endoteliales .
Las formas recombinantes de inhibidores endógenos de la angiogénesis se han sometido a prueba para el tratamiento del cáncer, sin embargo la farmacocinética potencial, desventajas biotecnológicas y económicas del suministro crónico de estos inhibidores recombinantes han conducido a los científicos a desarrollar otros procedimientos. El desarrollo del anticuerpo monoclonal anti-VEGF bevacizumab' ha validado el objetivo anti-angiogénico como una modalidad terapéutica complementaria de quimioterapia. Varios inhibidores de molécula pequeña, incluyendo inhibidores de tirosina-cinasa multiobj etivo de segunda generación, también han mostrado ser una promesa como agentes anti-angiogénicos para el cáncer.
Las desventajas del suministro crónico de inhibidores recombinantes, anticuerpos, y moléculas pequeñas, así como también la actividad limitada manifestada cuando estos fármacos se administran como monoterapia han conducido al desarrollo de terapias génicas anti-angiogénicas . La terapia génica es una modalidad emergente para tratar enfermedades humanas heredadas y adquiridas. Sin embargo, una variedad de obstáculos ha impedido el desarrollo de una terapia génica exitosa, incluyendo duración de expresión, inducción de la respuesta inmunitaria, citotoxicidad de los vectores y especificidad de tejido.
Dos estrategias generales para la terapia génica anti-cáncer han propuesto: la terapia génica dirigida al tumor o sistémica. La falta de éxito en la fijación de objetivo de los productos de la terapia génica para células cancerosas o su entorno por tratamientos sistémicos, y el peligro de inmunidad anti-fármaco o anti-vector significativa ha provocado que muchas terapias se administren al tumor mismo, a pesar de las desventajas de la administración sistémica. "Vacunas adenovirales" , diseñadas para inducir inmunidad a un antígeno o epítopo recombinante expresado en el cuerpo del paciente, se han tratado pero producen resultados mayormente decepcionantes. De esta manera, se han propuesto estrategias elaboradas, potencialmente peligrosas y costosas para eludir las respuestas inmunes patológicas del hospedero a la administración sistémica y repetida de vectores adenovirales recombinantes terapéuticos, incluyendo inmunosupresión, tolerancia oral a antígenos de vectores y modificación génica de los vectores (véase Bangari y colaboradores, Current Gene Therapy 2006/6: 215-226).
La patente de E.U.A No. 5,747,340 enseña el uso de un promotor específico de células endoteliales de murino que muestran selectividad hacia células angiogénicas y aplicaciones terapéuticas del mismo.
La Solicitud Internacional WO/2008/132729 da a conocer un vector de adenovirus no de replicación (Ad5, El suprimido) , que contiene un promotor de pre-proendotelina de murino modificado (PPE-1-3X) y un transgen fas-quimera [receptor del factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) Fas y humano] que se ha desarrollado, en el cual el promotor de murino modificado (PPE-1-3X) , es capaz de restringir la expresión del transgen fas-quimera a vasos sanguíneos angiogénicos , conduciendo a la apoptosis objetivo de estos vasos .
La terapia génica específica endotelial con el promotor PPE-1-3X no incrementa la especificidad de interacciones virales con el hospedero (por ejemplo transíección) pero restringe la expresión del transgen a aquellos tejidos que reconocen endogénicamente el promotor modificado - células endoteliales angiogénicas. El receptor quimérico puede desencadenar la ruta de Fas al enlazar el TNFa, que es menos tóxico en tejidos no tumorales que utilizando el mecanismo de ligando Fas/Fas, que se expresa en gran medida en tejidos normales no tumorales tal como el hígado. Además, se descubrió que el TNFa que es abundante en el microentorno de tumores que se agregan a la especificidad de la actividad del transgen en el tumor y sus alrededores.
Estudios preliminares han mostrado que una sola inyección sistémica de una PPE-l-3X-fas-quimera da por resultado la expresión del transgen restringido al órgano que lleva tumor, provocando el retraso del crecimiento tumoral, necrosis de los vasos sanguíneos en la masa tumoral metastásica y reducción en la carga tumoral en modelos de ratón de melanoma B16 y carcinoma pulmonar de Lewis.
Sin embargo, aún falta un procedimiento efectivo para l administración de una cantidad terapéutica de un vector de adenovirus angiogénico recombinante en el entorno clínico. Como tal, existe una mayor necesidad por definir los parámetros de protocolos clínicamente viables para el tratamiento anti-angiogénico-adenoviral de condiciones asociadas con la neovascularización, tal como cáncer, sin las desventajas de los métodos actuales como se describe en este documento .
Breve Descripción de la Invención De acuerdo de con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación, el vector comprende un polinucleótido que comprende un transgen fas-quimera enlazado transcripcionalmente a un promotor de pre-proendotelina de murino, en donde . la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos 1X108 de partículas de virus.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que comprende un transgen fas-quimera en lazado transcripcionalmente a un promotor de pre-proendotelina de murino, el vector de adenovirus que comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto, en por lo menos dos dosis separadas, una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que comprende un transgen fas-quimera enlazado transcripcionalmente a un promotor de pre-proendotelina de raurino, en donde el tiempo entre la administración de la primera dosis y la por lo menos una segunda dosis es suficiente para la formación del anticuerpo anti-Ad5 en el sujeto.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una sola dosis intravenosa .de 3X1012 o 1X1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de repli'cación que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un cáncer de tiroides en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una sola dosis intravenosa de 3X1012 o 1X1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un cáncer neuroendocrino en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una sola dosis intravenosa de 3X1012 o 1X1012 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación vector que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención la administración de la dosis de vector de adenovirus vector inhibe la angiogénesis del tumor.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención la administración de la dosis de adenovirus inhibe el crecimiento del tumor.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método se proporciona un método para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición terapéutica que comprende un vector adenoviral a un sujeto en necesidad de la misma que comprende administrar la composición al sujeto por lo menos dos veces, en donde la administración no induce un incremento dependiente de dosis en anticuerpos contra el vector adenoviral en el sujeto.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un kit para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende una dosificación unitaria de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación vector que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10, en donde el vector de adenovirus no de replicación se formula para administración intravenosa e instrucciones para la administración del adenovirus.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención la dosificación unitaria comprende aproximadamente 3X1012 de partículas de virus, por lo menos aproximadamente 1X108 a aproximadamente 1X1016 de partículas de virus, por lo menos aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus, opcionalmente por lo menos aproximadamente 3X1012 de partículas de virus.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO : 3.
De acuerdo con todavía otras modalidades de la presente invención el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 2.
De acuerdo con aún otras modalidades de la presente invención el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO : 4.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención . el promotor de pre-pro-endotelina comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el promotor de pre-pro-endotelina comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 7.
De acuerdo con todavía otras modalidades de la presente invención el promotor de pre-pro-endotelina comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 8.
De acuerdo con todavía otras modalidades de la presente invención el promotor de pre-pro-endotelina comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5.
De acuerdo con aún otras modalidades de la presente invención el promotor de pre-pro-endotelina comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el promotor de pre-pro-endotelina comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el vector de adenovirus no de replicación es un vector de adenovirus 5.
De acuerdo con todavía otras modalidades de la presente invención el vector de adenovirus 5 comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el tumor sólido es un tumor canceroso.
De acuerdo con aún otras modalidades de la presente invención el tumor sólido es un tumor primario.
De acuerdo con todavía . otras modalidades de la presente invención el tumor sólido es un tumor metastásico.
De acuerdo con algunas modalidades el tumor sólido es un tumor de tiroides.
De acuerdo con algunas modalidades el tumor sólido es un tumor neuroendocrino .
De acuerdo con algunas modalidades la administración de la dosis del vector de adenovirus inhibe la angiogénesis del tumor.
De acuerdo con algunas modalidades la administración de la dosis del vector de adenovirus inhibe el crecimiento del tumor.
De acuerdo con algunas modalidades el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración.
De acuerdo con algunas modalidades una cantidad de anticuerpos anti-adenovirus en suero se incrementa después de la administración, y el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el vector de adenovirus se administra sistémicamente .
De acuerdo con aún otras modalidades de la presente invención el vector se administra sistémicamente por una vía seleccionada del grupo que consiste de administración intra-articular, administración intravenosa, administración 'intraperitoneal, administración subcutánea, infusión, administración oral, administración rectal, administración nasal e inhalación.
De acuerdo con aún otras modalidades de la presente invención la administración del vector de adenovirus es en por lo menos dos dosis sistémicas separadas.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención la administración del vector de adenovirus es en una primera dosis y por lo menos una segunda dosis adicional, en donde la primera dosis es suficiente para inducir anticuerpos anti-Ad5 en el sujeto, y en donde el tiempo entre la administración de la primera dosis y la por lo menos una segunda dosis es suficiente para la formación de anticuerpos anti-Ad5 en el sujeto.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el sujeto está recibiendo adicionalmente un agente quimioterapéutico así como también tratamiento con las partículas de virus del vector de adenovirus no de replicación.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el agente quimioterapéutico se administra antes de, concomitantemente con, o después del tratamiento con las partículas del virus.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención el agente quimioterapéutico es sunitinib.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o prueba de las modalidades de la invención, se describen métodos y/o materiales ejemplares a continuación. En caso de conflicto, la descripción de patente, incluyendo definiciones, lo controlarán. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser necesariamente limitantes.
Breve Descripción de las Figuras Algunas modalidades de la invención se describen en este documento, a manera de ejemplo solamente, con referencia a las figuras e imágenes acompañantes. Con referencia específica ahora a las figuras e imágenes con detalle, se hace hincapié que los datos mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de planteamiento ilustrativo de las modalidades de la invención. En este aspecto, la descripción tomada con las figuras hace evidente a aquellas personas expertas en la técnica como se pueden practicar las modalidades de la invención.
En las figuras: Las FIGURAS 1A-1D son una gráfica con fotos que ilustran la inhibición de la enfermedad metastásica mediante la administración sistémica del vector de adenovirus Ad5-PPE-1-3X fas-quimera en el modelo de Cáncer Pulmonar de Lewis. Las FIGURAS 1A-1C son fotos de pulmones ejemplares de ratones tratados con control (solución salina) y vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera. Observar la inhibición dependiente de dosis, potente del desarrollo metastásico por el vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera, como es reflejado en tanto la morfología macroscópica y el peso de los pulmones extirpados (FIGURA 1C) ; la FIGURA 2 es un histograma que muestra el título del pre-tratamiento del anticuerpo anti-Ad5 neutralizantes pre-tratamiento en el suero de pacientes en 6 cohortes (3X1012 de vp) , como una función de su progresión de enfermedad en el día 28 después de la administración del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera adenovirus vector. Observar la falta de correlación entre la enfermedad progresiva (azul) , enfermedad estable (rojo) y título de anticuerpo (Y-axis) ; las Figuras 3A y 3B son hxstogramas que muestran el título de pre-tratamiento de anticuerpos anti-Ad5 neutralizantes en el suero de pacientes como una función de su progresión de su enfermedad en el día 56 después de la administración del vector de adenovirus Ad5-PPE-1-3X fas-quimera. La Figura 3A representa valores para 6 cohortes. La Figura 3B representa los valores para 6 y 7 cohortes. Observar la falta de correlación entre la enfermedad progresiva (azul) , enfermedad estable (rojo) y el título de línea base de anticuerpos neutralizantes; la FIGURA 4 es un barrido CT de línea base (pre-dosis) de un sujeto con cáncer de tiroides papilar avanzado quien recibió una sola dosis (3X1012 de partículas de virus) del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera que muestra una metástasis paratraqueal que provoca la obstrucción parcial de la tráquea (flechas rojas) ; la FIGURA 5 es un CT cervical de seguimiento del mismo sujeto como se describe en la FIGURA 4, 6 meses después de la administración del vector de adenovirus Ad5-PPE-1-3X- fas-quimera, que muestra la regresión de la lesión metastásica (flechas rojas) con licuefacción central (flecha azul) ; las Figuras 6A-6C son barridos CT abdominales que ilustran la regresión de una lesión metastásica después de la administración de una sola dosis de del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera (3X1012 de partículas de virus) en un sujeto con cáncer neuroendocrino avanzado. La FIGURA 6A es un escaneo CT abdominal que muestra la lesión metastásica (encerrada en un círculo) en el hígado a.21 días después de la administración. La FIGURA 6B es un escaneo CT abdominal que muestra la regresión significativa de la lesión (encerrada en un círculo) en el hígado a 50 días después de la administración. La FIGURA 6C es un escaneo CT abdominal que muestra regresión aún. mayor de la regresión (encerrada en un círculo) en el hígado a 112 días después de la administración; las Figuras 7A-7C son escaneos CT abdominales que ilustran la regresión de una lesión metastásica después de la administración de una sola dosis del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera (3X1012 de partículas de virus) como se describe en las Figuras 6A-6C. Las Figuras 7A-7C son escaneos CT de la misma serie, mismo sujeto como en las Figuras 6A-6C, que muestran la misma lesión desde una orientación diferente (corte de CT en un nivel diferente) ; la FIGURA 8 es una gráfica que ilustra la respuesta de la enfermedad de pacientes individuales en las cohortes 1-5, medida en los días 0, 28 y 56, y expresada como porcentaje de cambio en los registros RECIST, relativos con aquellos observados en el día · 0. Mayor incremento en los registros RECIST es típicamente indicativo de enfermedad progresiva (línea sólida = enfermedad estable, línea punteada = enfermedad progresiva) ; la FIGURA 9 es una gráfica que ilustra la respuesta de la enfermedad de pacientes individuales en las cohortes 6 y 7, medida en los días 0, 28 y 56, y expresada como porcentaje de cambio en los registros RECIST, relativos con aquellos observados en el día 0. Mayor incremento en los registros RECIST es típicamente indicativo de enfermedad progresiva (línea sólida = enfermedad estable, línea punteada enfermedad progresiva). Observar la tendencia a menor cambio en los registros RECIST entre las cohortes 6 y 7 ; las Figuras 10A y 10B son una línea de tiempo que muestra los efectos de administración de una sola dosis del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera (3X1012 de partículas de virus) en la progresión de la enfermedad en dos pacientes de cáncer de tiroides .(véase el Ejemplo II en este documento). La Figura 10A representa la supervivencia de un paciente con cáncer de tiroides papilar metastásico refractario, que recibe dos dosis del vector de adenovirus Ad5-PPE-1-3X-fas-quimera casi dos años de diferencia, y se ha mantenido sin progresión la mayor parte de ese tiempo. La Figura 10B muestra la supervivencia sin progresión de un paciente con cáncer de tiroides medular, quien permaneció estable y sin progresión cuando se supervisó a 120 días después de recibir una sola dosis del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera. SD = enfermedad estable. PD enfermedad progresiva. PR = respuesta parcial; la FIGURA 11 es una gráfica que. ilustra la respuesta inmunitaria humoral a una sola administración del adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera, en las cohortes 1 a 7 (cohorte l=diamantet; cohorte 2= cuadrado ¦; cohorte 3= triangulo A; cohorte 4= "X"; cohorte 5= estrella; cohorte 6= círculo ·; cohorte 7= línea vertical |) . Los niveles del anti-Adenovirus 5 igG de pacientes individuales se sometieron a ensayo (como se detalla en el Ejemplo II) en el día 0 (administración), y los días 7, 14, 21 y 28 después de la infusión. Observar la meseta de la respuesta inmunitaria tan pronto como el día 7 en algunos cohortes (por ejemplo 1, 3, 4) y después en otros (por ejemplo cohortes 2, 5, 6, 7) ; las Figuras 12A y 12B muestran la farmacocinética del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera, después de la administración intravenosa. La FIGURA 12A es una gráfica que representa la farmacocinética del Vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera en la sangre, desde la administración hasta el día 56, después de la infusión. Muestras de sangre entera de pacientes que reciben 1010 (?, línea negra sólida) , 3X1010 (¦, línea negra punteada) , 1011 ( A, línea negra discontinua) , 3X10 (X, línea gris sólida) , 1012 (a , línea gris punteada) y 3X1012 (·, línea gris discontinua) de partículas de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera se analizaron por RT-PCR en puntos de tiempo indicados para el ADN del adenovirus 5. Los niveles de adenovirus fueron reducidos por lo menos dos órdenes de magnitud, o fueron indetectables por el día 56. La FIGURA 12B representa los niveles promedio de partículas de virus, analizadas por RT-PCR, en sangre entera muestreada al final de la infusión con el vector de virus; las Figuras 13A y 13B ilustran los efectos del vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera y sunitinib en modelo de cáncer metastásico de pulmón Lewis . Los ratones con metástasis de pulmón inducida recibieron ya sea el vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera o el sunitinib oral, en las dosificaciones indicadas, o una combinación de las dos terapias . Los ratones de control recibieron vehículos de virus vacíos (simulados) . Las metástasis de pulmón se evaluaron de acuerdo con la masa tumoral en gramos (carga tumoral) a 22 días después de la remoción del tumor primario. La Figura 13A es un histograma de los valores en la Figura 13B. Observar el efecto aumentado de la terapia de combinación a 80 mg/kg de sunitinib, y 109 partículas de virus Ad5-PPE-1-3X fas-quimera.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y/o científicos usados en este documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden usar en la práctica o probar de las modalidades de la invención, métodos y/o materiales ejemplares se describen a continuación. En caso de conflicto, la descripción de patente, incluyendo las definiciones, lo controlarán. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser necesariamente limitantes.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se refiere a vectores de adenovirus anti-angiogénicos, el uso terapéutico de los mismos, y más particularmente, pero no exclusivamente, a protocolos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos en pacientes con un vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera.
Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención con detalle, se va a entender que la invención no se limita necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicado o ser llevada a cabo en varias formas.
La angiogénesis es requerida para el desarrollo de crecimientos neoplásicos e hiperproliferativos . La terapia génica para la terapia angiogénica en condiciones asociadas con la neovascularización, tal como cáncer, se ha investigado sin embargo, a pesar de resultados prometedores en experimentos in vi tro y en modelos animales, ha tenido poco éxito con la terapia génica angiogénica en el entorno clínico, probablemente debido a obstáculos que incluyen duración de la expresión del gen transferido, inducción de la respuesta inmunitaria del hospedero, citotoxicidad de los vectores y especificidad de expresión del tejido.
Los presentes inventores han desarrollado . un procedimiento clínicamente seguro y efectivo para la administración de un vector de adenovirus recombinante terapéutico que comprende una secuencia efectora fas-quimera citotóxica bajo control transcripcional de un promotor de pre-pro endotelina de murino modificado específico endotelial angiogénico, que se puede utilizar para el tratamiento de una variedad de cánceres y otras enfermedades hiperproliferativas , dependientes neovasculares , por ejemplo, para tumores sólidos.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación, el vector comprende un polinucleótido que comprende un transgen fas-quimera enlazado transcripcionalmente a . un promotor de pre-pro endotelina de murino, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos 1X108 de partículas de virus, tratando en consecuencia el tumor sólido.
Como se utiliza en este documento, las frases "cáncer", "malignidad", "tumor sólido" o "trastorno hiperproliferativo" se utilizan como términos sinónimos, y se refieren a cualquiera de una variedad de enfermedades que se caracterizan por proliferación anormal, descontrolada de células, la capacidad de las células afectadas de propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y sistema linfático a otras partes del cuerpo (es decir, metástasis) así como también cualquiera de una variedad de rasgos estructurales y/o moleculares característicos. Una célula "cancerosa" o "célula maligna" o "célula de tumor sólido" se en entiende como una célula que tiene propiedades estructurales específicas, que carecen de diferenciación y es capaz de invasión y metástasis. "Cáncer" se, refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasma o tumores malignos encontrados en mamíferos, incluyendo carcinomas y sarcomas. Ejemplos son cánceres del pecho, pulmón, pulmón de células no pequeñas, estómago, cerebro, cabeza y cuello, meduloblastoma, huesos, hígado, colon, genitourinario, vejiga, urinario, ríñones, testículos, útero, ovario, cérvico, próstata, melanoma, mesotelioma, sarcoma, (véase DeVita, y colaboradores, (eds.), 2001, Cáncer Principies and Practice of Oncology, 6th. Ed. , Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa. ; esta referencia se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos) .
"Asociado al cáncer" se refiere a la relación de un ácido nucleico y su expresión, o falta del mismo, o una proteína y su nivel o actividad, o falta de la misma, al principio de la malignidad en una célula sujeto. Por ejemplo, el cáncer se puede asociar con la expresión de un gen particular que nos se expresa, o se expresa en un nivel inferior, en una célula sana normal. A la inversa, un gen asociado al cáncer puede se runo que no se expresa en una célula maligna (o en una célula que se somete a la transformación) , o se expresa en un nivel inferior en la célula maligna que se expresa en una célula sana normal.
"Enfermedad hiperproliferativa" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el cual las células proliferan más rápidamente que el crecimiento de tejido normal. De esta manera, una célula de hiperproliferación es una célula que está proliferándose más rápidamente que las células normales.
"Neovascularización" y "angiogénesis" se refiere al crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis patológica o neovascularización se refieren a un nuevo crecimiento de vasos sanguíneos desbalanceado, incluyendo proliferación de células endoteliales y periendoteliales no autolimitantes . "Enfermedades angiogénicas" son condiciones de angiogénesis no reguladas, por ejemplo, cáncer, neovascularización ocular, artritis, diabetes, enfermedades de la piel, enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, psoriasis y sinovitis.
"Cáncer avanzado" significa cáncer que ya no se localiza en el sitio de tumor primario, o un cáncer que es de Etapa III o IV de acuerdo con el American Joint Committee on Cáncer (AJCC) .
"Bien tolerado" se refiere a la ausencia de cambios adversos en el estado sano que se produce como un resultado del tratamiento y afectaría las decisiones del tratamiento.
"Metastásico" se refiere a células tumorales, por ejemplo, tumor sólido humano o malignidad de tiroides, que son capaces de establecer lesiones tumorales secundarias en los pulmones, hígado, hueso o cerebro de ratones inmunodeficientes en la inyección en la almohadilla de grasa mamaria y/o la circulación del ratón deficiente inmune.
Un "tumor sólido" incluye, pero no se limita a, sarcoma, melanoma, carcinoma, u otro cáncer de tumor sólido. "Sarcoma" se refiere a un tumor que está constituido en una sustancia similar al tejido conjuntivo embriónico y se compone en general de células estrechamente empacadas incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma de parte blanda alveolar, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, carcinoma corio, sarcoma embrional, sarcoma tumoral de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma facial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de célula gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágica pigmentada múltiple idiopática, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocítico, sarcoma sinovial, y sarcoma telangiectáltico .
"Melanoma" se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo melanoma acra- lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de cioudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma maligno lentigo, melanoma maligno, melanoma metastásico, melanoma nodular, melanoma subungueal y melanoma de propagación superficial.
"Carcinoma" se refiere a un crecimiento nuevo maligno constituido de células epiteliales que tienden a infiltrarse a los tejidos circundantes y dan .origen a metástasis. Carcinomas ejemplares incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma cístico adenoide, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza' adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células básales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas , carcinoma bronquioalveolar, carcinoma, bronquiiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, carcinoma comedo, carcinoma corpus, carcinoma cribriforme, carcinoma. encuirasa, carcinoma cutáneo, carcinoma cilindrico, carcinoma de células cilindricas, carcinoma de los conductos, carcinoma durum, carcinoma embrional, carcinoma, encefaloide, carcinoma epiermoide, carcinoma epiteliale adenoides, carcinoma exofitico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibrosum, carcinoima gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcionoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz del cabello, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma de hialina, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrional infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial , carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial , carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma .. muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidernoide, carcinoma mucoso, carcinoma de la mucosa, carcinoma mixomatodes, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma osificanos, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de' células espinosas, carcinoma pultaceoso, carcinoma de células renales de riñon, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatodos , carcinoma de schneiderian, carcinoma cirroso, carcinoma scroti, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simplex, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidales., carcinoma de células fusiformes, carcinoma espongioso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cadena, carcinoma telangiectatico, carcinoma telangiectodes , carcinoma de células transicionales , carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso, y carcinoma vifloso.
Cánceres adicionales incluyen, por ejemplo Leucemia, Enfermedad de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, tromboctosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores cerebrales primarios, cáncer · de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreática maligno, carcinoide maligno, cáncer de la vejiga urinaria, lesiones de la piel premalignas, cáncer testicular, linfornas, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides papilar, neuroblastoma, cáncer neuroendocrino, cáncer esofágico, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligno, cáncer cervical, cáncer endometrial , cáncer cortical adrenal , y cáncer de próstata.
Los presentes inventores han mostrado que la administración sistémica del vector adenoviral Ad5-PPE-1-3X-fas-c se correlacionó con una reducción en la masa tumoral y enfermedad estable prolongada en un paciente que sufre de cáncer de tiroides papilar metastásico (véase el Ejemplo II y figuras 4 y 5 que siguen) . De esta manera, de acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un cáncer de tiroides en un paciente en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una sola o múltiples dosis intravenosa de 3X1012 o 1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10. La progresión de la enfermedad en el cáncer de tiroides se puede evaluar o supervisar por métodos que incluyen, pero no se limitan a, análisis radiográficos de masa tumoral y densidad (por ejemplo criterios RECIST) , medición de niveles de hormona de tiroides y asociados con tiroides, niveles de tiroglobulina y similar.
Los presentes inventores han mostrado que la administración sistémica del vector adenoviral Ad5 -PPE- 1-3X-fas-c se correlacionó con una reducción en una lesión hepática metastásica y enfermedad estable prolongada en un paciente que sufre de cáncer neuroendocrino metastásico (véase el Ejemplo II y figuras 6A-6C, 7A-7C que siguen) . De esta manera, de acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un cáncer neuroendocrino en un paciente en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una sola o múltiples dosis 3X1012 o 1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación vector que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10. Los métodos para evaluar o supervisar la progresión de la enfermedad en cáncer neuroendocrino incluyen análisis radiográfico de masa y densidad tumoral (por ejemplo criterios RECIST) , medición de los niveles de enzima de hígado (donde el tumor es una metástasis de hígado) , y similar.
El método de la presente invención como se reivindica se ha indicado como efectivo en el tratamiento de otros cánceres. De esta manera, de acuerdo con aspectos adicionales de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar un cáncer ovárico, un cáncer de pulmón de células pequeñas y/o carcinoma de células renales en un paciente en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto, una sola o múltiple dosis intravenosa de 3X1012 o 1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10. Los métodos para evaluar o supervisar el progreso de · la enfermedad en estos cánceres incluyen análisis radiográficos de masa y densidad tumoral (por ejemplo Criterios RECIST) , medición de la función de los órganos (por ejemplo función de los ríñones en carcinoma de células renales) , medición de biomarcadores específicos, función endocrina y similar.
Los sujetos contemplados que se tratan incluyen mamíferos, por ejemplo humanos. De acuerdo con una modalidad, el sujeto ha recibido un tratamiento previo para el tumor sólido (por ejemplo radioterapia y/o quimioterapia) y el tumor maligno ha reincidido. De acuerdo con otra modalidad, el sujeto no ha recibido un tratamiento previo para el tumor maligno.
La frase "vector viral" se refiere a una partícula viral competente de replicación o deficiente de replicación que es capaz de transferir moléculas de ácido nucleico en un hospedero .
Los presentes inventores contemplan el uso de Vectores Defectuosos de Replicación y Células Empaquetadoras Productoras de Vector Defectuosas de Replicación. Ejemplos de estos vectores son vectores adenovirales , vectores AAV y vectores retrovirales y otros descritos por Shir y colaboradores, Cellular and Molecular Neurobiology, Volumen 21, No. 6, Diciembre de 2001, los contenidos de la cual se incorporan en este documentó a manera de referencia.
El término "virus" se refiere a cualquiera de los parásitos intracelulares vinculados que no tienen un mecanismo sintetizador de proteínas o generador de energía. El genoma viral puede ser ARN o ADN contenido con una estructura recubierta de proteína de una membrana de lípidos. Ejemplos de virus útiles en la práctica de la presente invención incluyen baculoviridiae , parvoviridiae, picornoviridíae , herepesviridiae , poxviridiae, adenoviridiae , picotrnaviridiae . El término virus recombinante incluye virus quiméricos (o aún multiméricos ) , es decir vectores construidos usando secuencias de codificación complementarias de más de un subtipo viral. (Véase, por ejemplo Feng, y colaboradores. Nature Biotechnology 15:866-870). El término "adenovirus" es sinónimo con el término "vector adenoviral" y se refiere a virus del género adenoviridiae . El término adenoviridiae se refiere colectivamente a adenovirus animales del género mastadenovirus que incluyen pero no se limitan a humano, bovino, ovino, equino, canino, porcino, murino y subgéneros de adenovirus . de simio. En particular, los adenovirus humanos incluyen el subgénero A-F así como también los serotipos individuales de los mismos de los serotipos individuales y los subgéneros A-F que incluyen pero no se limitan a adenovirus humanos tipos 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (AdllA y Ad 11P) , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, y 91. El término adenovirus de bovino incluye pero no se limita a adenovirus de bovino tipos 1, 2, 3, 4, 7, y 10. El término adenovirus canino incluye pero no se limita a canino tipos 1 (cepas CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) y 2. El término adenovirus equinos incluye pero no se limita a equinos tipos 1 y 2. El término adenovirus porcino incluye pero no se limitan a porcinos tipos 3 y 4. En una modalidad de la invención, el adenovirus se deriva de los serotipos 2 o 5 del adenovirus humano. Para propósitos de esta invención, los vectores de adenovirus pueden ser competes de replicación o deficientes de. replicación en una célula objetivo. En algunas modalidades, los vectores de adenovirus son condicionalmente o selectivamente adenovirus de replicación, en donde un gen [es] requerido para la replicación viral se enlazan operativamente a una célula y/o promotor específico de contexto. Ejemplos de vectores virales selectivamente de replicación o condicionalmente de replicación son 'conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, US 7,691,370). En una modalidad, el vector de adenovirus es un adenovirus condicionalmente de replicación en donde el gen El está bajo control transcripcional del promotor de pre-proendotelina PPE-1 (PPE-1, SEQ ID NO: 13) . En otra modalidad, el vector de adenovirus es un adenovirus condicionalmente de replicación o selectivamente de replicación en donde el gen El está bajo control transcripcional del promotor de pre-proendotelina modificado PPE-1-3X (PPE-1-3X, SEQ ID NO: 12) . En algunas modalidades, lo vectores de adenovirus adecuados para el uso con la presente invención incluyen todos los serotipos de adenovirus que tienen la estructura de proteína de exón. Los vectores virales adecuados para el uso terapéutico incluyen vectores adenovirales, vectores retrovirusales , AAV, vectores del virus de herpes y similar. La ingeniería y producción de vectores virales es bien conocido en la técnica, como se describe con detalle en, por ejemplo, patente de E.U.A. No: 7,732,129 o 6,649,158, que se incorporan en este documento a manera de referencia, en sus totalidad. En modalidades específicas, el adenovirus es un adenovirus tipo C (Ad5, Ad2) , un adenovirus tipo B (Ad3, Adl6, Ad21, Ad35, Ad50) , en adenovirus tipo E (Ad4) o un adenovirus tipo F(Ad41) .
Como se utiliza en este documento, la frase vector adenoviral se refiere a un vector en el cual, entre las moléculas de ácido nucleico en la partícula viral, las secuencias necesarias para funcionar como un vector viral se basan en el genoma adenoviral .
De acuerdo con una modalidad el vector adenoviral es un vector adenoviral de serotipo 5 no de replicación (Ad5) .
De acuerdo con otra modalidad, el vector adenoviral comprende una secuencia como se expone en SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 11.
Se apreciará que la presente invención también contempla el uso de virus oncolíticos que se reproducen en células cancerosas y exterminan subsecuentemente las células inicialmente infectadas por lisis . Estos virus comienzan a infectar células adyacentes repitiendo de esta manera el ciclo. Ejemplos contemplados de virus oncolíticos incluyen, pero no se limitan a virus de Herpes Simplex, Ads condicionalmente replicativos (CRAds, por sus siglas en inglés) y reovirus.
Se han desarrollado dos estrategias principales para el desarrollo de vectores CRAd, que se enfocan principalmente en la ingeniería genética de los genes tempranos 1 (El) para restringir la replicación del virus a células objetivo y de proteger el tejido normal. Los. CRADs de tipo de complementación genética (tipo 1), tal como Ad524, tienen una mutación en la región adenoviral inmediatamente temprana (E1A) o temprana (E1B) , que se complementa en células tumorales pero no en células normales. En los CRAds de tipo transcomplementación (tipo 2) , la replicación del virus se controla a través de un promotor específico de tumor/tej ido .
El reovirus es un virus oncolítico de origen natural que requiere rutas de señalización Ras activadas de células tumorales para su replicación. Pas rutas Ras se activan en la mayoría de tumores malignos a través de la señalización cadena arriba por las tirosinas cinasas receptoras .
Como se menciona los vectores virales de este aspecto de la presente invención comprenden una secuencia efectora fas-quimera citotóxica bajo el control transcripcional de un promotor de pre-pro endotelina de murino modificado específico eñdotelial angiogénieo.
Típicamente, estos vectores virales se construyen utilizando tecnología de recombinación genética - es decir vectores virales recombinantes .
El polipéptido Fas-quimera (Fas-c) ( es una fusión previamente descrita de dos "receptores muertos" , construidos de las región extracelular de TNFR1 (SEQ ID NO: 2) y las regiones transmembrana intracelulares de Fas (SEQ ID NO: 3) [Boldin MP y colaboradores. J Biol Chem (1995) 270 (14) : 7795-8; los contenidos de los cuales se incorporan en este documento a manera de referencia] .
De acuerdo con una modalidad el Fas-c se codifica por un polinucleótido como se expone en SEQ ID NO: 4.
Se apreciará que la presente invención también contempla el uso de un constructo viral (por ejemplo un constructo adenoviral) que comprende un promotor específico de células endoteliales/periendoteliales enlazado operativamente a otro polipéptido citotóxicos para el tratamiento de tumores sólidos.
Estos polipéptidos, incluyen pero no se limitan a polipéptidos suicidas tales como p53 y egr-l-TNF-alfa, prof rmaco/enzimas citotóxicas para la terapia de susceptibilidad a fármacos tal como ganciclovir/timidina-cinasa y 5-fluorocitosina/citosina-desaminasa, y polipéptidos anti-metastásicos tal como 5 E1A.
El términos "promotor" como se utiliza en este documento se refiere a una secuencia de ADN que dirige la transcripción de una secuencia de polinucleótidos enlazado opera ivamente a la misma en la célula en una manera constitutiva o inducible. El promotor puede comprender elementos potenciadores que estimulan la transcripción del promotor enlazado.
El promotor pre-pro endotelial como se utiliza en este documento se refiere al promotor de pre-proendotelina-1 (PPE-l) , de origen mamífero. En una modalidad, el promotor de pre-proendotelina 1 es un promotor de pre-pro endotelina 1 de murino (PPE-l, SEQ ID NO: 13) y modificaciones del mismo. Se apreciará que otros promotores específicos endoteliales se pueden utilizar con la presente invención; por ejemplo, el promotor TIE-1, el promotor TIE-2 , el promotor de Endoglina, el promotor de von Willerband, el promotor KDR/flk-1, el promotor FLT-1, el promotor Egr-1, el promotor ICAM-1, el promotor VCA -1, el promotor PECAM-1 y el promotor de proteína similar a carboxipeptidasa aórtica (ACLP, por sus siglas en inglés).
De acuerdo con una modalidad, el promotor comprende por lo menos una copia de un elemento potenciador que confiere actividad transcripcional específica* de células endoteliales. De acuerdo con una modalidad, el. elemento potenciador se encuentra naturalmente posicionado entre el -364 pb y -320 pb del promotor PPE-l de murino (como se expone en SEQ ID NO: 6) . En una modalidad, el promotor comprende por lo menos dos y de manera más preferente tres de los elementos potenciadores descritos en lo anterior. De acuerdo con una modalidad específica, el promotor comprende dos de los elementos potenciadores descritos en lo anterior en una hebra del ADN promotor y uno del elemento potenciador descrito en lo anterior en la hebra complementaria del ADN promotor.
En todavía otra modalidad, el promotor comprende un elemento potenciador modificado como se expone en SEQ ID NO: 8, opcionalmente en combinación con otros elementos potenciadores. De esta manera, de acuerdo con esta modalidad, el promotor comprende una secuencia como se expone en SEQ ID NO : 7.
De acuerdo con otra modalidad, el promotor comprende además por lo menos un elemento de respuesta de hipoxia - por ejemplo que comprende una secuencia como se expone en SEQ ID NO : 5.
Un promotor ejemplar que se puede utilizar en el contexto de la presente invención comprende una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12. Esta secuencia comprende SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:- 7 (que por sí misma comprende dos copias de SEQ ID NO: 6 cualquier lado de una copia de SEQ ID NO: 8) .
De acuerdo con una modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el vector viral consiste en una secuencia como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10.
La secuencia de Ad5-PPE-l-3X-fas-c, como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10 comprende una' secuencia que es una copia antisentido de SEQ ID NO: 7, localizada en' las coordenadas de ácido nucleico 894-1036, una secuencia que es una sola copia antisentido de SEQ ID NO: 8 localizada en las coordenadas de nucleótidos 951-997; una secuencia que es una primera ' copia antisentido de SEQ ID NO: 6 localizada en las coordenadas de los nucleótidos 907-950; una secuencia que es una segunda copia antisentido de SEQ ID NO: 6 localizada en las coordenadas de los nucleótidos 993-1036; y una tercera copia de SEQ ID NO: 6 en la orientación de sentido en la posición 823-866.
En algunas modalidades de la invención, el vector viral comprende secuencias de polinucleótidos adicionales capaces de potenciar inhibir la actividad transcripcional de un promotor específico endotelial. De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, la secuencia de polinucleótidos adicional incluye un polinucleótido aislado que comprende por lo menos 6 nucleótidos del elemento X de un promotor de pre-proendotelina (PPE-1) , el elemento X que tiene una secuencia de tipo natural como se expone por SEQ ID NO: 6, en doríde por lo menos 6 nucleótidos comprenden por ?? menos 2 secuencias consecutivas derivadas de SEQ ID NO: 6, cada una de las por lo menos 2 secuencias consecutivas comprende por lo menos 3 nucleótidos, por lo menos uno del por lo menos 3 nucleótidos que se posicionan junto a por lo menos una posición de nucleótidos en SEQ ID NO: 6, la por lo menos una posición de nucleotido en SEQ ID NO: 6 se selecciona del grupo que consiste de: (i) por lo menos un nucleotido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) ; (ii) por lo menos un nucleotido de la secuencia 5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) ; (iii) por lo menos un nucleotido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) ; (iv) por lo menos un nucleotido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) ; (v) por lo menos un nucleotido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) ; (vi) por lo menos un nucleotido de la secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) ; y (v) por lo menos un nucleotido de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) ; en donde la por lo menos una posición de nucleótidos es mutada como se compara a SEQ ID NO: 6 mediante por lo menos na sustitución de nucleotido, por . lo menos una supresión de nucleotido y/o por lo menos una inserción de nucleotido, con la condición de que una mutación de la por lo menos una posición de nucleótidos no dé por resultado nucleótidos GGTA en la posición 21-24 de SEQ ID NO : 6 y/o en nucleótidos CATG en la posición 29-32 de SEQ ID NO: 6, tal que cuando el polinucleótidó aislado se integra en. el promotor PPE-1 y se coloca cadena arriba de . un gen reportero (por ejemplo, secuencia de codificación de luciferasa) el nivel de expresión del gen reportero se regula por incremento o se regula por decremento como es comparado cuando SEQ ID NO: 6 se integra similarmente en el promotor PPE-1 y se coloca cadena arriba del gen reportero que codifica la secuencia.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótidó aislado no es de origen natural en un genoma o una secuencia de cromosomas enteros de un organismo.
Como se utiliza en este documento la frase "de origen natural" se refiere a como es encontrado en la naturaleza, sin ningunas modificaciones hechas por el hombre.
Como se describe en lo anterior, por lo menos 6 nucleótidos del elemento X comprenden por lo menos 2 secuencias consecutivas derivadas de SEQ ID NO: 6.
Como se utiliza en este documento la frase "secuencia consecutiva derivada de SEQ ID NO: 6" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (un polinucleótidó)' en el cual los nucleótidos se presentan en el mimos orden como en la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6 de .las cuales se derivan. Se debe observar que el orden de nucleótidos se determina por el enlace químico (enlace de fosfodiéster) formado entre un 3 '-0H de un nucleótido precedente y el 5'-fosfato del siguiente nucleótido.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, cada una de las por lo menos 2 secuencias consecutivas comprende por lo menos 3 nucleótidos, por ejemplo, 3 nucleótidos, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos, 11 nucleótidos, 12 nucleótidos, 13 nucleótidos, 14 nucleótidos, 15 nucleótidos, 16 nucleótidos, 17 nucleótidos, 18 nucleótidos, 19 nucleótidos, 20 nucleótidos, 21 nucleótidos, 22 nucleótidos, 23 nucleótidos, 24 nucleótidos, 25 nucleótidos, 26 nucleótidos, 27 nucleótidos, 28 nucleótidos, 29 nucleótidos, 30 nucleótidos, 31 nucleótidos, 32 nucleótidos, 33 nucleótidos, 34 nucleótidos, 35 nucleótidos, 36 nucleótidos, 37 nucleótidos, 38 nucleótidos, 39 nucleótidos, 40 nucleótidos, 41 nucleótidos de SEQ ID'NO:6.
Como se describe, el polinucleótido aislado comprende por lo menos 2 secuencias consecutivas derivadas de SEQ ID NO: 6. De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 secuencias consecutivas derivadas de SEQ ID NO: 6.
Como se utiliza en este documento la frase "tipo natural" con respecto a una secuencia de nucleótidos se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos como se presente en SEQ ID NO: 6. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a secuencia 4 de tipo natural (SEQ ID NO: 15) , secuencia M5 de tipo natural (SEQ ID NO: 16) , secuencia 8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19), secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO:-17), secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18), secuencia MI de tipo natural (SEQ ID NO: 20) y secuencia M3 de tipo natural (SEQ ID NO: 21) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la mutación es una inserción de por lo menos un nucleótido en una posición de nucleótidos con respecto¦ a SEQ ID NO: 6. De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la inserción incluye por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleótidos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15, por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 25, por lo menos aproximadamente 30, por lo menos aproximadamente 35, por lo menos aproximadamente 40, por lo menos aproximadamente 45, por lo menos aproximadamente 50, por lo menos aproximadamente 55, por lo menos aproximadamente 60, por lo menos aproximadamente 65, por lo menos aproximadamente 70, por lo menos aproximadamente 75, por lo menos aproximadamente 80, por lo menos aproximadamente 85, por lo menos aproximadamente 90, por lo menos aproximadamente 95, por lo menos aproximadamente 100, por lo menos aproximadamente 200, por lo menos aproximadamente 300, o más nucleótidos . se debe observar que la secuencia que se inserta por' la mutación se puede derivar de cualquier fuente (por ejemplo, especie, tejido o tipo de célula), y no se limita a la fuente de la secuencia del elemento X.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la mutación es una combinación de cualquiera de los tipos de mutación descritos en lo anterior, es decir, sustitución, inserción y supresión. Por ejemplo, mientras que una posición de nucleótidos en SEQ ID NO: 6 se puede someter a una mutación de sustitución, otra posición de nucleótidos en SEQ ID NO: 6 se puede someter a una supresión o inserción. Adicional o alternativamente, mientras que una posición de nucleótidos en SEQ ID NO: 6 se puede someter a una mutación de supresión, ora posición de nucleótidos' en SEQ ID NO: 6 se puede someter a una sustitución o inserción. Adicional o alternativamente, mientras que una posición de nucleótidos en SEQ ID NO: 6 se puede someter a una mutación de inserción, otra posición de nucleótidos en SEQ ID NO : 6 se puede someter a una sustitución o supresión. Se debe observar que son posibles varias otras combinaciones .
De acuerdo con modalidades específicas de la invención, la mutación en el polinucleótido aislado de la invención no da por resultado nucleótidos GGTA en la posición 21-24 de SEQ ID NO : 6 y/o en nucleótidos CATG en la posición 29-32 de SEQ ID NO : 6.
Como se utiliza en este documento la frase "integrado en el promotor PPE-1" se refiere a una secuencia de nucleótidos (el polinucleótido aislado) que se conjuga covalentemente dentro de la secuencia del promotor PPE-1.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende además por lo menos una copia de una secuencia de ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste de: (i) secuencia M4 de tipo natural expuesta por -SEQ ID NO: 15 (CATTC) , (ii) secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , (iii) secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) , (iv) secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , (v) secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT.) ; (vi) secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) , y (vii) secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado se integra en (dentro) , cadena abajo de, o cadena arriba de cualquier secuencia promotora conocida (o desconocida) para regular en consecuencia (por ejemplo, incrementar, disminuir, modular la especificidad de tejido, modular la expresión inductiva o constitutiva) la actividad promotora transcripcional del promotor.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado es para incrementar la expresión de un polinucleótido heterólogo enlazado operativamente al mismo en células endoteliales . Este polinucleótido puede, incluir secuencias de tipo natural de M4 y/o M5 en presencia o ausencia de secuencias adicionales del elemento X, y/o en presencia de otras secuencias mutadas del elemento X.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M4 de tipo natural .expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y por lo menos una copia de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la por lo menos una posición de nucleótidos que se muta como es comparada con SEQ ID NO: 6 es por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) . Se debe observar que este polinucleótido aislado puede incluir además una secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y/o una secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados, que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por' SEQ ID NO: 15 (CATTC) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 55-62.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y una mutación en por lo menos un' nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 63-66.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 67-70.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado que comprende además por lo menos una copia de la secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen por lo ' menos una copia de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC), por lo menos una copia de la secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) , y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 71-105.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) y una mutación en por lo menos un nucleótido de' la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 106-136.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG), por lo menos una copia de la secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 137-152.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención., el polinucleótido aislado reduce la expresión de un polinucleótido heterólogo enlazado operativamente al mismo en células endo.teliales . Este polinucleótido puede incluir mutaciones en M4 y/o M5 en presencia o ausencia de secuencias adicionales del elemento X, y/o en presencia de otras secuencias imitadas del elemento X.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la por lo menos una posición de nucleótidos que se muta como es comparada con SEQ ID NO : 6 es por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluye una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 46 (CATTC) se proporcionan en SEQ ID NOs: 153-162.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la por lo menos una posición de nucleótidos que se muta como es comparada con SEQ ID NO: 6 es por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) se proporcionan en SEQ ID NOs: 163-171.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la por lo menos una posición de nucleótidos que se muta como es comparada con SEQ ID NO: 6 es por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) se proporcionan en SEQ ID NOs : 172-180.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleotido aislado es para incrementar la expresión de un polinucleótido heter logo enlazado operativamente al mismo en células diferentes a las células endoteliales .¦ Tal polinucleótido puede incluir mutaciones en M4 y/o M5 y secuencias de tipo natural de M6 y/o M7 , en presencia o ausencia de secuencias adicionales del elemento X, y/o en presencia de otras secuencias mutadas del elemento X.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende una mutación en M4 (SEQ ID NO: 15) y/o en M5 (SEQ ID NO: 16) y por lo menos una copia de M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y/o por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) se proporcionan en SEQ ID NOS: 181-182.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) se proporcionan en SEQ ID NOS: 183-189.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO:- 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) se proporcionan en SEQ ID NOS : 190-191.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende además por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido .de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 192-195.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ED NOS: 196-198.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS: 199-202.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende además por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:203-205.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NÓS: 206-207.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS: 208-209.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado reduce la expresión en las células de un polinucleótido heterólogo enlazado operativamente al mismo. Tal polinucleótido puede incluir mutaciones en M4 , M5, M6 y/o M7 , en presencia o ausencia de secuencias adicionales del elemento X, y/o en presencia de otras secuencias mutadas del elemento X.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una mutación en M4 de tipo natural (SEQ ID NO: 15) y/o en M5 de tipo natural (SEQ ID NO: 47) y en M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y una mutación en por lo menos un nucleótido en la posición de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) se proporcionan en SEQ ID NOs : 210^-213.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia 6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) se proporcionan en SEQ ID NOs: 214-222.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) se proporcionan en SEQ ID NOs: 223-231.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende además por lo menos una mutación en M7 tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 232-236.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 237-240.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 241-248.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende además por lo menos una mutación en la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una mutación en M7 tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG)' y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por. SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 249-258.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia 6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y una mutación en por lo menos un nucleótido. position de la secuencia 7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 259-26 .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y una mutación en por lo menos un nucleótido position de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS:265-270.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) con secuencias de tipo natural o mutadas adicionales derivadas del elemento X (SEQ ID NO: 6) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen s una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 271-279.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 280-287.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia 8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs:288-291.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs:294-298.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) ,. por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOS: 299-301.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta po SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 302-303.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 304-308.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia 8 de tipo natural expuesta por SEQ . ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 309-311.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuenci M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia 8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 312-315.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NO: 316.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO-: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG), por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NO: 317.
Ejemplos no limitantes de poiinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia 6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NO: 318.
Ejemplos no limitantes de poiinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 319-3'27.
Ejemplos no limitantes de poiinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID' NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 328-333.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 334 -337.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs: 338 -344.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia 7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 345-348.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expúesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs:349-354.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia 6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de ' tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 355-361.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación, en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia 8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 362-365.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia 8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) se proporcionan en SEQ ID NOs : 366-369.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO:. 21 (CTTTT) con secuencias de tipo natural o imitadas adicionales derivadas del elemento X (SEQ ID N0:6).
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen s una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS : 378-384.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS : 628-634.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:370-377.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 385-390.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 391-396.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos .aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID , NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 397-401.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:402-409.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 410-417.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG), por lo menos una copia de la secuencia M7 de. tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 418-423.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia 3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:424-425.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por, SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ. ED NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 538-540.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por ló menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG), por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NO: 426.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 427-435.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia ' M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido of la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 436-444.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAÁTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 445 -451.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la' secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 452-458.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 59-465.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NO: 466.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos üna copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 467-471.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido .de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: .21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:472-477.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:478-483.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende además por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) con secuencias de tipo natural o imitadas adicionales derivadas del elemento X (SEQ ID NO: 6).
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen s una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:484-495.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 , de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:496-507.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secúencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG),. por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 508-515.
Ejemplos no limitantes de .polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 516-519.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS: 520-523.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido .de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG), por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) , y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ED NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 524-525.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ED NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ED NOs: 526-529.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 530-533.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por' lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 534-535.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia 7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT)se proporcionan en SEQ ID NOs:536-537.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC). y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:538-539.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una- mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NO: 540.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en . por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuéncia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS : 541-547.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG), por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs : 548-554.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un ' nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ED NOs:555-559.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos' aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ED NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs:560-566.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ED NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) sé proporcionan en SEQ ID NOS:567-573.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por . SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos uña posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT), por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ED NO: 1-9 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de . tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS : 574-578.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS:579-583.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG), una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOs: 584-588.
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , una mutación en por lo menos una posición de nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) , por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) se proporcionan en SEQ ID NOS: 589-592.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural (SEQ ID NO: 21) y por lo menos una copia de secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) , con por lo menos una mutación in la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y/o en la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 50).
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) , con una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) , y/o una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) se proporcionan en SEQ ID NOs : 593 - 600..
Los presentes inventores han previsto que un polinucleótido aislado que incluye la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) y/o la secuencia M3 de tipo natural (SEQ ID NO: 21) además de potenciadores específicos de tejido (por ejemplo, secuencia M4 de tipo natural y/o secuencia M5 de tipo natural) , y/o potenciadores inducidos (por ejemplo, potenciadores desarrolladamente relacionados o relacionados con estrés) se espera que ejerzan un efecto regulador más específico al suprimir la expresión en células no objetivo o bajo condiciones no inducidas.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y secuencia potenciadora específica endotelial.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) , por lo menos una copia de secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 y por lo menos una copia de secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) y una secuencia potenciadora específica endotelial.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de .tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) y por lo menos una copia de secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NÓ: 15.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) y por lo menos una copia de secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 2.1 (CTTTT) , por lo menos una copia de secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 y por lo menos una copia de secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) , por lo menos una copia de secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y secuencia potenciadora específica endotelial.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) , por lo menos una copia de secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) , por lo menos una copia de secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos una copia de secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) , por lo menos una copia de secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC), por lo menos una copia de secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 y por lo menos una copia de secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) , por lo menos una copia de secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) y por lo menos un elemento potenciador tal como la secuencia 6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y/o la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, "el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipo natural con secuencias de flanqueo adicionales tales como .por lo menos una copia de una secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID ÑO: 19), por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) y/o la secuencia M9 de tipo natural (SEQ ID NO: 14, CTGGA) ; y/o el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de la secuencia M8 de tipio silvestre y por lo menos una mutación en M7, con o sin M9' (SEQ ID NO: 22) . Estos polinucleótidos se pueden utilizar como un represor no específico.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado es para incrementar la expresión de un polinucleótido heterólogo enlazado operativamente al mismo en células/tejidos.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado comprende por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) y/o por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) .
* De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótido aislado que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) se proporcionan en SEQ ID NOs : 23-26.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótido aislado que incluyen por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) se proporcionan en SEQ ID NOs : 27-28.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) , por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de la secuencia MI de tipo natural (SEQ ID NO: 20) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótido aislado que incluyen por lo menos una copia de de la secuencia MI de tipo natural (SEQ ID NO: 20) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) se proporcionan en SEQ ID NOs: 43-54 y 601-632.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado incluye por lo menos una copia de de la secuencia MI de tipo natural (SEQ ID NO: 20) , por lo menos una copia de la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y/o por lo menos una copia de la secuencia M7 de tipo natural (SEQ ID NO: 18) y una mutación en por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) .
Ejemplos no limitantes de polinucleótidos aislados que incluyen una mutación en ,por lo menos un nucleótido de la secuencia M8 de tipo natural (SEQ ID NO: 19) y por lo menos una copia de de la secuencia MI de tipo natural (SEQ ID NO: 20) , la secuencia M6 de tipo natural (SEQ ID NO: 17) y/o secuencia M7 tipo natural (SEQ ID NO: 18) se proporcionan en SEQ ID NOS : 29-42.
Ejemplos adicionales de polinucleótidos aislados reguladores que se pueden utilizar de acuerdo con algunas modalidades de la invención se proporcionan ( ; SEQ ID NOs : 633-644) en la sección de Ejemplos que sigue.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprenden un primer polinucleótido que comprende el promotor de pre-proendotelina (PPE-1) expuesto por SEQ ID NO: .13 y un segundo polinucleótido que comprende por lo menos una copia de una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste de: (i) secuencia M4 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 15 (CATTC) , (ii) secuencia M5 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 16 (CAATG) , (iii) secuencia M8 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 19 (GCTTC) , (iv) la secuencia M6 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 17 (GGGTG) , (v) la secuencia 7 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 18 (ACTTT) ; (vi) de la secuencia MI de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 20 (GTACT) , y (vii) secuencia M3 de tipo natural expuesta por SEQ ID NO: 21 (CTTTT) ; con la condición de que el segundo polinucleótido no sea SEQ ID NO: 6 (elemento X), y en donde el polinucleótido aislado no sea. SEQ ID NO: 12 (PPE-1-3X) .
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, cada una de las secuencias M , M5 , M8 , M6 , M7 y/o MI de tipo natural se colocan en una orientación de cabeza a cola (5'-3') con respecto al promotor PPE-1 expuesto por SEQ ID NO: 13.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, cada una de las secuencias M4, M5, M8, M6, M7 y/o MI de tipo natural se coloca en una orientación de cola a cabeza (3'?5') con respecto al promotor PPE-1 expuesto por SEQ ID NO: 13.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las secuencias M4, M5 , M8 , M6 , M7 y/o MI de tipo natural se colocan en varias orientaciones (cabeza a cola o cola a cabeza) y/u orden secuencia con respecto a las secuencias M4, M5, M8, M6, M7 y/o MI de tipo natural, y/o con respecto a la orientación de SEQ ID NO: 13.
La construcción de estos vectores virales se puede efectuar utilizando técnicas de biología molecular conocidas tales como aquellas descritas por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992) , en Ausubel and colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989) , Chang y colaboradores, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995) , Vega y colaboradores, Gene Targeting,- CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths , Boston Mass. (1988) y Gilboa y colaboradores [Biotechniques 4 (6) : 504-512, 1986] .
La construcción del vector viral de SEQ ID NO: 9 se describe en la Solicitud Internacional WO/2008/132729, los contenidos de la cual se incorporan en este documento a manera de referencia.
Como se utiliza en este documento, el término "administración" se refiere a proporcionar o administrar a un sujeto o un agente, tal como una' composición' viral anti-angiogénica, mediante cualquier vía efectiva.
El vector viral de este aspecto de la presente invención se puede administrar per se o como parte de una composición farmacéutica que también incluye un portador fisiológicamente aceptable. El propósito de una composición farmacéutica es para facilitar la administración del ingrediente activo a un organismo.
Como se utiliza en este documento una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en este documento con otros componentes químicos tales portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es para facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En este documento, el término "ingrediente activo" se refiere al vector viral de la presente invención contable para el efecto biológico.
A partir de ahora, la frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que se pueden utilizar intercambiablemente se refieren a un portador o un diluyente que no provoca irritación significativa a un organismo y no se suprime la actividad biológicas y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye bajo estas frases.
En este documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte agregada a- una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos' azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles .
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora en este documento a manera de referencia.
Vías de administración adecuadas pueden, por ejemplo, incluir suministro oral, rectal, transmucosa, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, que incluyen inyecciones intramusculares, intradérmicas , intraperitoneal, subcutáneas e intramedulares así como también intratecal, intraventricular directa, intracardíaca, por ejemplo, en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteriá coronaria común, inyecciones intravenosa, intraperitoneal, intranasal, o intraocular, vías sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal e inhalación. La inyección de los vectores virales en un líquido cefalorraquídeo también se puede utilizar como un modo de administración.
Los vectores virales o composiciones de los mismos se pueden administrar en un entorno de paciente interno o paciente ambulatorio. En una modalidad particular, los vectores virales o composiciones de los mismos se administran en una inyección o en un goteo intravenoso.
La presente invención también contempla el diseño de los vectores virales a fin de evita, suprimir o manipular la respuesta inmunitaria, dando por resultado idealmente la expresión sostenida y tolerancia inmunitaria al producto transgénico - estos métodos se describen por ejemplo por Nayak y colaboradores, Gene Therapy (12 de Noviembre de 2009), incorporada en este documento a manera de referencia.
Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica en una manera local antes que sistémica, por ejemplo, a través de inyección de la composición farmacéutica directamente en el tejido o masa tumoral de un paciente y aún más directamente en las células tumorales mismas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden manufacturar por procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado, disolución, granulación,, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de esta manera en una manera convencional que utiliza uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que, se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la vía de administración seleccionada.
Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, de manera preferente en soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución amortiguadora de sal fisiológica. Para la administración transmucosa, penetrantes apropiados a la barrera que se penetra se utilizan en la formulación. Estos penetrantes son en general conocidos en la técnica.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera, convencional .
Para administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para el uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío de aerosol desde un paquete presurizado o un nebulizador con el uso de un propulsante- adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida. Cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un dispensador se pueden formular conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo, adecuada tal como lactosa o almidón.
La composición farmacéutica descrita en este documento se puede formular para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección por bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se puede presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en contendores de múltiples dosis con opcionalmente, un conservador adicionado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosas, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección basadas en aceite o agua apropiadas. Solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tal como aceite de ajonjolí, o ásteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas . Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias, que incrementan la viscosidad de la suspensión, . tal como carboximetil celulosa de sodio, sorbitos o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
AlteARNtivamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución basada en agua sin pirógeno, estéril, antes del uso.
La composición farmacéutica de la presente invención también se puede formular en composiciones rectales tales ' como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones . en done los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito intencionado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de ingredientes activos, (es decir, partículas virales) efectivas para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de un trastorno (por ejemplo, cáncer de tiroides, cáncer neuroendocrino) o prolongar la supérvivencia del sujeto que se trata.
La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está muy dentro de la capacidad de aquellas personas expertas en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en este documento. La eficacia terapéutica de administración del vector adenoviral de la presente invención se puede evaluar de acuerdo con una variedad de criterios, incluyendo presentación clínica, parámetros bioquímicos, evaluación radiológica y similar. En algunas modalidades, la eficacia se evalúa de acuerdo con uno o más de los siguientes parámetros ejemplares: Biodistribución: por ejemplo, niveles de ADN del virus en muestras de sangre y orina, expresión del transgen fas-c (ARNm) en la sangre; Anticuerpos : por ejemplo, niveles de anticuerpos anti-Ad-5 Ig, IgG y anti-Ad5 neutralizantes totales en suero; Biomarcadores angiogénicos : por ejemplo, niveles del Factor de von Willebrand, TNFa, VEGFR1 y VEGFR2 en la sangre; Niveles de citocina: por ejemplo, niveles de citocina en sangre periférica (por ejemplo IL-6, IL-8- véase la Tabla 6) ; Respuesta del tumor: Las dimensiones del tumor se pueden medir en el escaneo CT (o MRI) , u otro medio radiográfico. La respuesta del tumor después se puede evaluar de acuerdo con criterios aceptados, tales como criterios de evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos. (RECIST) .
El criterio se puede evaluar en cualquier momento después de la administración, y también se pueden comparar a valores de pre-dosis. En una modalidad, los criterios de evaluación se evalúa antes de la administración de vector de adenovirus, y luego en los días 4±1, 7+1, 14+1, 28 ± 2, día 56 ±3, día 112+4, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadaménte 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 1 año o más después de la dosificación. En algunas modalidades, los criterios de evaluación se evalúan en los días 7 + 1, 14 + 1, 28 + 2, día 56 ± 3, día 112 + 4, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 1 año y aproximadamente cada 3 meses después hasta 2, hasta 3, hasta 4 o más años después de la dosificación.
La determinación de la seguridad de la dosificación o régimen de dosificación está muy dentro de la capacidad de la persona experta en la técnica. La seguridad se puede evaluar de acuerdo con una variedad de criterios, incluyendo, pero no limitado a, presentación clínica, patología de tejidos y órganos, presencia de signos vitales anormales (por ejemplo pirexia, fatiga, escalofríos, taquicardia, hipertensión, constipación- y similar) , valores hematológicos (por ejemplo hemoglobina, hematocrito, RCV y similar), anormalidades químicas o urinalisis (enzimas elevadas tales como ALT fosfatasa alcalina, AST, bilirrubina y similar) y ECG, EEG, etcétera.
Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula que incluye un sitio de enlace a antígeno que se enlaza específicamente ( inmunoreacción con) un antígeno. El término "anticuerpo" incluye moléculas intactas así como también fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv que son capaces de enlazarse a macrófagos . Estos fragmentos de anticuerpo funcionales se definen como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de- enlace a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, se puede producir mediante la digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab' , el fragmento de una molécula de anticuerpo que se puede obtener al tratar el anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; dos fragmentos de Fab1 se obtienen por molécula de anticuerpo; (3) (Fab') 2, el fragmento del anticuerpo que se puede obtener al. tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción subsecuente; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos de Fab' mantenidos juntos por dos enlaces de disulfuro; (4) Fv, definido como un fragmento genéticamente diseñado que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y (5) anticuerpo de cadena individual (SCA) , una molécula genéticamente diseñada que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, enlazadas por un enlazador de pdlipéptido adecuado como una molécula de cadena individual genéticamente fusionada.
Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales así como también fragmentos de los mismos son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988, incorporada en este documento a manera de referencia) .
Como se utiliza en este documento, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un mamífero, incluyendo composiciones que se inyectan y o se absorben en un mamífero. Un antígeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular específica, incluyendo aquellos inducidos por inmunógenos heterólogos. El término "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. En un ejemplo, un antígeno es un antígeno de cáncer. Un antígeno objetivo es un antígeno contra el cual una respuesta inmunitaria se desea, por ejemplo para lograr un efecto terapéutico, tal como regresión del tumor.
Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente desde ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animal para lograr una concentración o título deseado. Esta información se puede utilizar para determinar más con precisión las dosis útiles en humanos.
La cantidad terapéuticamente efectiva del ingrediente activo se puede formular en una dosis unitaria. Como se utiliza en este documento "dosis unitaria" se refiere a una unidad físicamente discreta que contiene una cantidad predeterminada de un material activo calculado para producir individual o colectivamente un efecto deseado tal . como un efecto anti-cáncer. Una sola dosis unitaria o una pluralidad de dosis unitarias se pueden utilizar para proporcionar el efecto deseado, tal como un efecto terapéutico anti-cáncer. En algunas modalidades, la dosificación unitaria es 1X108 a aproximadamente 1XÍ016 de partículas de virus, por lo menos aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus, y de manera opcional de aproximadamente 1X1011, aproximadamente 3X1011, aproximadamente 5X1011, aproximadamente 1X1012, aproximadamente 3X1012, aproximadamente 5X101.2, aproximadamente 1X1013, aproximadamente 3X1013 o más de partículas de virus.
La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en este documento se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitxo, en cultivos celulares o animales experimentales. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden seleccionar por el médico individual en vista de la condición del paciente. (Véase por ejemplo, Fingí, y colaboradores, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics" , Ch. 1 p.l).
La cantidad e intervalo de dosificación se puede justar individualmente para proporcionar niveles del ingrediente activo suficiente para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración efectiva mínima, MEC, por sus siglas en inglés) . La MEC variará para cada preparación, pero se puede estimar desde los datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán en las características individuales y la vía de administración. Se pueden utilizar ensayos de detección para determinar las concentraciones en plasma. ¦ Dependiendo de la gravedad y sensibilidad de la condición que se trata, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con el curso del , tratamiento que se prolonga desde varios' días a varias semanas o hasta que se efectúe una cura o se logre la disminución del estado enfermo.
La cantidad de una composición que se administra, por supuesto, será dependiente del sujeto que se trata, la gravedad de la aflicción, la manera de administración, la evaluación del médico que prescribe, etcétera.
De acuerdo con una modalidad, de aproximadamente io3 a aproximadamente 1016 de partículas de virus se administran al sujeto.
De acuerdo con otra modalidad, de aproximadamente 105 a aproximadamente 1013 de partículas de virus se administran al sujeto.
De acuerdo con una modalidad, de aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 de partículas de virus se administran al sujeto.
De acuerdo con una modalidad, de aproximadamente lxlO12 a aproximadamente 5xl012 de partículas de virus se administran al sujeto.
De acuerdo con todavía otra modalidad, de aproximadamente íxio9 a aproximadamente 1X1O16 de partículas de virus, por lo menos de aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus se administran al sujeto.
De acuerdo con todavía otra modalidad el sujeto se administra intravenosamente con lxlO12 - lxlO13 de partículas de virus de SEQ ID NO: 9. o SEQ ID NO: 10.
De acuerdo con todavía otra modalidad el sujeto se administra intravenosamente con por lo menos dos dosis de lxlO12 - 1X1013 de partículas de virus de SEQ ID NO: 9. o SEQ ID NO: 10. De acuerdo con todavía otra modalidad el sujeto se administra intravenosamente con por lo menos tres o más dosis de lxlO12 - lxlO13 de partículas de virus de SEQ ID NO: 9. o SEQ ID NO: 10. En una modalidad particular, las por lo menos dos dosis se administran por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos aproximadamente 3 días, por lo . menos aproximadamente 5 días, por lo menos aproximadamente 7 días, por lo menos aproximadamente 2 semanas, por lo menos aproximadamente 3 semanas, por lo menos aproximadamente 4 semanas, por lo menos aproximadamente 2 meses, por lo menos aproximadamente 6 meses, por lo menos aproximadamente 9 meses, por lo menos aproximadamente 1 año, por lo menos aproximadamente 1.25 años, por lo menos aproximadamente 1.5 año, por lo menos aproximadamente 1.75 año, por lo menos aproximadamente 2 años , por lo menos aproximadamente 2.5 años, por lo menos aproximadamente 3 años o más de diferencia.
Las composición de la presente invención, si se desea, se pueden presentar en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede, por ejemplo, comprender lámina delgada de metal o plástico, tal como un paquete en láminas al vacío. Al paquete o dispositivo dispensador se le puede acompañar por instrucciones para la administración. Al paquete o dispensador también se le puede adaptar un aviso asociado con el recipiente en una forma prescrita en por una agencia gubernamental que regula la manufactura, uso o venta del producto farmacéutico, que el aviso es un reflejo en la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Este aviso, por ejemplo, puede ser de una etiqueta probada por la Administración de Alimentos y Fármacos de EUA para prescripción de fármacos o de un inserto de producto probado. Las composiciones que comprende una preparación de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se puede preparar, colocar en un recipiente apropiado, y etiquetar para el tratamiento de una condición indicada, como se detalla adicionalmente en lo anterior .
De esta manera, de acuerdo con algunos aspectos de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un kit para tratar un tumor sólido en un sujeto en necésidad del mismo, que comprende una dosificación unitaria de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NOs : 9 o 10, en donde el vector de adenovirus no de replicación se formula para administración intravenosa, e instrucciones para la administración del adenovirus.
El vector de adenovirus se puede utilizar en combinación con otros tratamientos. Por ejemplo la captación de vectores adenovirales en células EC se puede aumentar al tratar los vectores con anticuerpos diseñados o péptidos pequeños . Este tratamiento "adenocuerpo" , mostró ser efectivo en dirigir los constructos de adenovirus a los receptores EGF en las células (Watkins y colaboradores 1997, Gene Therapy .4:1004-1012). Además, Nicklin y colaboradores han mostrado que un. péptido pequeño, aislado a través de la expresión en fago, incrementó la especificidad y eficiencia de los vectores en células endoteliales y disminuyó la expresión en células de hígado en el cultivo (Nicklin y colaboradores 2000, Circulation 102:231-237). En un estudio reciente, un vector adenoviral re-orientado con FGF redujo la toxicidad de tk en ratones (Printz y colaboradores 2000, Human Gene Therapy 11:191-204).
Se ha mostrado que la radiación de dosis baja puede provocar rompimientos en las hebras de ADN principalmente en la fase G2/ , el daño de la membrana celular potencia el efecto transiente, y de esta manera puede potenciar otras terapias citotóxicas y antineoplásicas , cuando se administra en combinación. Las células endoteliales vasculares pueden ser particularmente adecuadas para esta combinación, o adjunto, terapias, puesto que se ha mostrado que la radiación de dosis baja fija como objetivo específicamente el sistema apoptótico de las células endoteliales microvasculares (Kolesnick y colaboradores, Oncogene. 2003; 22:5897-906). Se ha mostrado que la angiostatina potencia los efectos terapéuticos de la radiación de dosis baja (Gorski y colaboradores. Can Res 1998;58:5686-89). Sin embargo, los efectos de la radiación aún se entienden deficientemente, puesto que la irradiación también ha mostrado que incrementa los "factores de reparación de tejidos" pro-angiogénicos (Itasaka y colaboradores, Am Assoc Cañe Res, 2003; resumen 115) . Similarmente , ciertos agentes quimioterapéuticos han mostrado que activan las rutas citotóxicas y apoptóticas específicas [doxorubicina, cisplatino y mitomicina C inducen la acumulación del receptor Fas, FADD, y otras señales apoptóticas en la ruta FADD/MORT- 1 (Micheau y colaboradores, BBRC 1999 256 : 603-07) ] .
Por ejemplo la Solicitud Internacional WO/2008/132729 enseña la administración combinada de doxorubicina y el constructo AdPPE-1 (3x) -Fas-c-quimera en células endoteliales (BAEC, por sus siglas en inglés) . De esta manera, los vectores virales y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos de la presente invención se pueden utilizar para tratar tumores sólidos solos o en combinación con uno o más de otro régimen terapéutico establecido experimental para estos trastornos.
El régimen terapéutico para1 el tratamiento de tumores sólidos adecuados para la combinación con los vectores virales de la presente invención incluye, pero no se limita a quimioterapia, radioterapia, fototerapia y terapia fotodinámica, cirugía, terapia nutricional, terapia ablativa, radioterapia combinada y quimioterapia, braquioterapia, terapia por haz de protones, inmunoterapia, terapia celular y terapia radioquirúrgica de haz de protones. Los vectores de la presente invención se pueden administrar con ingredientes adicionales que pueden mejorar la captación del constructo de ácido nucleico por las células, la expresión del polipéptido quimérico por el constructo de ácido nucleico en las células, la actividad del polipéptido quimérico expresado o la eficacia del tratamiento en cualquier aspecto de la enfermedad. Los protocolos pára el uso de los vectores de adenovirus anti-angiogénicos recombinantes para el tratamiento del cáncer se conocen en la técnica. Muchos ensayos clínicos de terapia génica anti-angiogénica basada en adenovirus están actualmente siendo conducidos, principalmente implican un adenovirus arigiogénico recombinante en combinación con otras terapias del cáncer, y se administran intra-tumoralmente, tal como una vacuna de adenovirus-p53 con quimioterapia para cáncer de pulmón de células pequeñas (NCT0049218) , gen suicida de adenovirus con quimioterapia para cáncer de pulmón de células pequeñas (NCT00964756) , un constructo de adenovirus-endostatina con quimioterapia para cáncer de cabeza y cuello (NCT0.0634595 ) , un adenovirus-gen suicida con quimioterapia para melanoma maligno (NCT00005057) y un constructo dé adenovirus-tk con quimioterapia para carcinoma hepatocelular (NCT00844623 ) .
Los fármacos anti-cáncer que se pueden coadministrar con los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a Acivicina; Aclarubicina; Clorhidrato de Acodazol; Acronina; Adriamicina; Adozelesina,- Aldesleuquina,-Altretamina; Ambomicina; Acetato de Ametantrona; Aminoglutetimida; Amsacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa; Asperlina; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Clorhidrato de Bisantreno; Dimesilato de Bisnafida; Bevacizumab, Bizelesina; Sulfato de Bleomicina; Brequinar Sódico; Bropirimina ; Busulfan,- Cactinomicina; Calusterona; Caracemida; Carbetimer; Carboplatino; Carmustina Clorhidrato de Carubicina; Carzelesina; Cedefingol; Clorambucilo ; Cirolemicina; Cisplatino; Cladribina; Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; ' Dactinomicina; Clorhidrato de Daunorubicina; Decitabina; Dexormaplatino ; Dezaguanina; Mesilato de Dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel; Doxorubicina; Clorhidrato de Doxorubicina; Droloxifeno; Citrato de Droloxifeno; Propionato de Drornostanolona; Duazomicina; Edatrexato; Clorhidrato de Eflornitina; Elsamitrucina; Enloplatino; Enpromato; Epipropidina ; Clorhidrato de Epirubicina; Erbulozol; Clorhidrato de Esorubicina; Estramustina; Fosfato de Estramus ina Sódlico; Etanidazol; Etoposido; Fosfato de Etoposido; Etoprina; Clorhidrato de Fadrozol; Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; Fosfato de Fludarabina Fluorouracilo; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecina Sódica Gemcitabina; Clorhidrato de Gemcitabina; Hidroxiurea; Clorhidrato de Idarubicina; Ifosfamida; Ilmofosina; Interferón Alfa-2a; Interferón Alfa-2b; Interferón Alfa-nl; Interferón Alfa-n3; Interferón Beta- la; Interferón Gamma-Ib; Iproplatino; Clorhidrato de Irinotecano; Acetato de Lanreotido; Letrozol; Acetato de L'euprolida; Clorhidrato de Liarozol; Lometrexol Sódico; Lomustina; Clorhidrato de Losoxantrona; Masoprocol; Maytansina; Clorhidrato de Meclorethamina; Acetato de Megestrol; Acetato de Melengestrol ; Melfalan;" Menogaril; Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato Sódico; Metopriná; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcina; Mitocromina,- Mitogilina,- Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Clorhidrato de Mitoxantrona; Ácido Micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatino; Oxisuran; pazotinib; Paclitaxel; Pegaspargasa; Peliomicina; Pentamustina; Sulfato de Peplomicina; Perfosfamida; Pipobroman; Piposulfano; Clorhidrato de Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfimer Sódico; Porfiromicina; Prednimustina; Clorhidrato de Procarbazina; Puroraicina; Clorhidrato de Puromicina; Pirazofurina; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Clorhidrato de Safingol; Semustina; Simtrazeno; Sorafinib; Sparfosato' Sódico; Sparsomicina; . Clorhidrato de Spirogermanio;. Spiromustina; Spiroplatino; Streptonigrina; Streptozocina; Sulofenur; Sunitinib; Talisomicina; Taxol ; Tecogalan Sódico; Tegafur,- Clorhidrato de Teloxantrona; Temoporfin; Teniposida; Teroxirona; Testolactona; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofuirina; Tirapazamina; Clorhidrato de Topotecano; Citrato de Toremifeno; Acetato de Trestolona; Fosfato de Triciribina; Trimetrexato ; Glucoronato de Trimetrexato; Triptorelina; Clorhidrato de Tubulozol; Mostaza de Uracilo; Uredepa; Vapreotido; Verteporfina; Sulfato de Vinblastina; Sulfato de Vincristina; Vindesina; Sulfato de Vindesina; Sulfato de Vinepidina; Sulfato de Vinglicinato ; Sulfato de Vinleurosina,- Tartrato de Vinorelbina; Sulfato de Vinrosidina; Sulfato de Vinzolidina; Vorozol; Zeniplatino; Zinostatina; Clorhidrato de Zorubicina. Agentes anti-neoplásicos adicionales incluyen aquellos dados a conocer en el capítulo 52, (Paul Calabresi y Bruce A. Chabner) , y la introducción a los mismos, 1202-1263, de Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" , Octava Edición, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions División).
Los presentes inventores han mostrado que al administrar una sola dosis de los vectores virales de la presente invención (por ejemplo Ad5PPE-l-3X-fas-quimera) en combinación con el fármaco quimioterapéutico sunitinib (Sutent) , puede mejorar la eficacia del tratamiento de quimioterapia, o del efecto del vector viral en un cáncer metastásico, en el modelo de Carcinoma pulmonar de Lewis (véase el Ejemplo VI a continuación). De esta manera, en algunas modalidades los vectores virales de la presente invención se administran en combinación con uno o más de los fármacos quimioterapéuticos, tal como sunitinib (Sutent) .
Los agentes quimioterapéuticos se pueden administrar junto con los vectores virales de la invención, antes del tratamiento con los vectores virales de la presente invención, o después del tratamiento con los vectores virales de la presente invención. En una modalidad particular, el agente quimioterapéutico se administra por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos aproximadamente 3 días, por lo menos aproximadamente 5 días, por lo menos aproximadamente 7 días, por lo menos aproximadamente 2 semanas, por lo menos aproximadamente 3 semanas, por lo menos aproximadamente 4 semanas, por lo menos aproximadamente 2 meses, por lo menos aproximadamente 6 meses, por lo menos aproximadamente 9 meses, por lo menos aproximadamente 1 año antes de la iniciación del tratamiento con el vector viral de la presente invención. En otra modalidad particular, el agente quimioterapéutico se administra por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos aproximadamente 3 días, por lo menos aproximadamente 5 días, por lo menos aproximadamente 7 días, por lo menos aproximadamente 2 semanas, por lo menos aproximadamente 3 semanas, por lo menos aproximadamente 4 semanas, por lo menos aproximadamente 2 meses, por lo menos aproximadamente 6 meses, por lo menos aproximadamente 9 meses, por lo menos aproximadamente i año después de la iniciación del tratamiento con el vector viral de la presente invención. En otra modalidad particular, el agente quimioterapéutico se administra durante, o junto con la iniciación del tratamiento con el vector viral de la presente invención.
Los vectores virales de la presente invención también se pueden administrar con un agente que potencia la expresión de transgenes en la expresión transitoria mediada adenoviral. Por ejemplo la Solicitud Internacional WO/2008/132729 enseña la administración de un corticosteroide (por ejemplo dexametasona y/o Cisteína de N-Acetilo (NAC) antes de la administración del constructo AdPPE-1 (3x) -Fas-c quimera, o tratamiento concomitante con un inhibidor de endotelina tal como bosentan.
Además, los vectores virales de la presente invención también se pueden administrar con un agente que lleva a cabo la inmunosupresión transiente, tal como por ejemplo desoxispergualina (DSG) o ciclofosfamida (véase por ejemplo Smith y colaboradores, Gene Ther. 1996 Jun; 3 (6) : 496-502) a fin de permitir la dosificación repetitiva.
Los protocolos de la terapia génica basada en adenovirus se ha limitado comúnmente a dosis solas, por razones que pertenecen a la seguridad y eficacia del fármaco, preocupándose particularmente de la respuesta inmunitaria anti-adenovirus del paciente, ya que la mayoría de poblaciones se exponen repetidamente y se sintetizan a varios antígenos adenovirales . Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente ninguna correlación entre los niveles de los anticuerpos anti-adenovirus en suero de pacientes después de la administración del adenovirus de la invención, y la dosis de adenovirus administrado. La evaluación de títulos de anticuerpo, incluyendo anticuerpos neutralizantes anti-Ad5, IgG y anticuerpos anti-Ad5 totales en los pacientes (véase el Ejemplo II, y figuras 2 y 3A-3B) no revelaron efecto de los niveles de línea base del anticuerpo anti-adenovirus neutralizante en la progresión de la enfermedad después de la dosificación. La evaluación de los títulos de anticuerpo Ad5 anti-adenovirus totales y la IgG anti-Ad5 específica en suero de pacientes antes de, y después de la administración de los vectores adenovirales Ad5-PPE-l-3X-fas-c revelaron títulos de anticuerpo incrementados después de la administración del vector de adenovirus, pero no indicaron correlación con las dosis administradas (véase la Tabla 4 en el Ejemplo II que sigue) , sugiriendo que las dosis repetidas del adenovirus como se describe en este documento no pueden conducir a una respuesta inmunitaria que limite la utilidad clínica del adenovirus en el hospedero. Además, se descubrió que la administración del Ad5PPE-l-3X-fas quimera fue efectivo en reducir la progresión de la enfermedad aún en sujetos con altos niveles de anticuerpos anti-Ad5 neutralizantes y anticuerpos anti-Ad5 totales detectados antes de la primera inyección del constructo (véase las figuras 2 y 3) . Todavía además, los ensayos de los niveles de Ad5-PPE-l-3X-fas-c en sangre y orina (biodistribución) después de la administración revelaron altos niveles de los constructos de adenovirus de la invención 28 días después de la administración, aún en presencia de niveles de anticuerpo anti-Ad5. totales elevados o IgG (véanse las Tablas 4 y 7 del Ejemplo II que sigue, específicamente, ver los sujetos 2, 9 y 10) . En un sujeto [036] , por ejemplo, se detectaron niveles significativos de expresión transgénica en un aspirado de una lesión metastásica tanto como 28 días después de la administración del vector de adenovirus, a pesar de un incremento masivo de veces (X3125) en el ' título de anticuerpo anti-Ad5 (véase las Tablas 4 y 9 en el Ejemplo II que sigue) .
De esta manera, en algunas modalidades, la administración de la dosis del vector de adenovirus de la presente invención inhibe el crecimiento de un tumor. En otras modalidades, la administración del vector de adenovirus inhibe la angiogénesis del tumor.
De esta manera, los vectores de adenovirus de la presente invención se pueden administrar en una, por lo menos dos, tres o más dosis, con intervalos entre los mismos suficientes para la formación de anticuerpos, sin provocar una respuesta de anticuerpo antiviral dependiente de dosis. Estos intervalos son típicamente 21-28 días, pero pueden ser tan pocos como 1 o 2 días, o tantos como 7 días, 10 días, 2 semanas, tres semanas, cuatro, seis, ocho diez o más semanas. De esta manera, de acuerdo con otro aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición terapéutica que comprende un vector adenoviral a un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar la composición al sujeto por lo menos dos veces, en donde la administración no induce un incremento dependiente de dosis en anticuerpos contra el vector . de adenoviral en el sujeto. De acuerdo con otro aspecto de una modalidad de la presente invención, el tiempo entre la administración entre una primera dosis y por lo menos una segunda dosis es suficiente para la formación de anticuerpos an i-Ad5.
En todavía otra modalidad, los vectores de adenovirus de la presente invención son efectivos cuando se administran a sujetos que tienen niveles elevados de anticuerpos anti-Ad5 en suero. En algunas modalidades particulares los niveles de anticuerpos anti-Ad5 se elevan comparado con los sujetos de niveles anti-Ad5 de línea base antes de la dosificación. En todavía otras modalidades, los vectores de' adenovirus de la presente invención se detectan en la sangre de los sujetos que tienen niveles de anticuerpos anti-Ad5 elevados como son comparados con los sujetos de niveles anti-Ad5 de línea base antes de la dosificación, en el día 4 después de la administración, día 7 después de la administración, día 15 después de la administración, día 21 después de la administración, día 28 después de la administración, día 37 después de la administración, día 56 después de la administración o día 112 después de la administración o más. Estos anticuerpos anti-Ad5 pueden ser anticuerpos neutralizantes, anticuerpos anti-Ad5 totales, o subtipo de anticuerpo anti-Ad5 específico, tal como Anti-Ad5 IgG.
De esta manera, en algunas modalidades, el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración. De acuerdo con otras modalidades una cantidad de anticuerpos anti-adenovirus en suero se incrementa después de la administración, y el adenovirus se detecta en la sangre del ' sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
Se espera que durante la vida de una patente que madura a partir de esta solicitud muchos agentes quimioterapéuticos relevantes se desarrollarán y el alcance del término agente quimioterapéutico se propone para incluir todas estas nuevas tecnologías a priori.
Como se utiliza en este documento el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.
Los términos "comprende" , "que comprende" , "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a" .
El término "que consiste de" significa "que incluye y se limita a" .
El término "que consiste esencialmente de" significa que la composición, método o estructura pueden incluir ingredientes adicionales, etapas y/o partes, pero, solamente si los ingredientes adicionales, etapas y/o partes no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reclamados.
Como se utiliza en este documento, la forma singular "un", "una" y "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
Por toda esta solicitud, varias modalidades de esta invención se pueden presentar en un formato de intervalo. Se debe entender que la descripción en el formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no se debe considerar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo se debe considerar por tener todos los sub-intervalos posibles específicamente dados a conocer así como también valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe ser considerado por tener sub-intervalos específicamente dados a conocer tal como de 1 a 3 ,' de 1 a 4, de l a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etcétera, así como también números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Esto aplica sin considerar la amplitud del intervalo .
Siempre que un intervalo numérico se indique en este documento, se propone para incluir cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se utilizan en este documento intercambiablemente y se proponen para incluir el primero y segundo a segundo números indicados y todos los números fracciónales e integrales entre los mismos .
Como se utiliza en este documento el término "método" se refiere a manera, medios, técnica y procedimientos para lograr una tarea dada que incluye, pero no se limita, a aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sea conocidas a, o fácilmente desarrolladas de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las técnicas clínicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
Como se utiliza en este documento, el término "que trata" incluye suprimir, inhibir sustancialmente, desacelerar o revertir la progresión de una condición, mejorar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una condición o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar separadamente o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuada en cualquier otra modalidad descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no van a ser consideradas características esenciales de aquellas modalidades, a menos que la modalidad sea inoperativa sin esos elementos.
Varias modalidades y aspectos de. la presente invención como se exponen en lo anterior y como se reclaman en la sección de reivindicaciones posterior encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas modalidades de la invención en una forma no limitante.
En general, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante . Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989) ; "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M . , ed. (1994); Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Güide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y colaboradores, "Recombinant ADN", Scientific American Books, Nueva York; Birren y colaboradores, (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols . 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) ; metodologías como se expone en las patentes de E.U.A. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" , Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Células - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994) , Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E . , ed. (1994); Stites y colaboradores. (eds) , "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ; Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensivamente en la patente y en la literatura científica, véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J. , eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Células and Enzymes" IRL Press, (1986) ; "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A 1 Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990) ,· Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas de las cuales se incorporan a manera de referencia como si se expusieran completamente en este documento. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en la presente se creen que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en la presente se incorpora en ese documento a manera de referencia.
Ejemplo I ¦Eficacia de la Ad5PPE-l-3X-fas quimera en el Modelo de Carcinoma Pulmonar de Lewis A fin de evaluar los intervalos de dosificación efectivos el adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera para el tratamiento de tumores sólidos, tumores metastásicos se indujeron en modelo de carcinoma pulmonar de Lewis de ratón, y un intervalo de dosis del adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera (SEQ ID NO: 10) se administró sistémicamente .
MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES Construcción y clonación del vector viral : El vector se construyó utilizando una cadena principal que contiene la mayoría del genoma del adenovirus 5, así como también homología parcial a un plásmido adaptador, que permite la recombinación.
La unidad transcripcional de El temprano se detectó del plásmido de cadena principal, y se modificó adicionalmente al suprimir el pWE25 y el sitio marcador de selección de resistencia Amp.
El plásmido adaptador, que contiene las secuencias de Ad5, promotor C V, MCS, y SV40 poliA se modificó para suprimir la supresión del promotor CMV, y el promotor PPE-1 y el fragmento Fas-c se insertaron por digestión de restricción.
El promotor PPE-1 modificado (PPE-1-3X, SEQ ID NO: 12) y el transgen fas-quimera (Fas-c, SEQ ID NO: 4) se utilizaron para la construcción del vector adenoviral . El elemento PPE-1- (3X) -Fas-c (2115 pb) se construyó a partir del elemento PPE- 1- (3X) -luc . Este elemento contiene el 1.4kb del promotor PPE-1- (3X) pre-proendotelina de murino, el gen de Luciferasa, el sitio SV40 poliA y el primer intrón del gen ET-1 de murino, originados del plásmido pEL8 (8848bp) utilizados por Harats y colaboradores (Harats D. y colaboradores, JCI, 1995). El cásete ???-3-Luc se extrajo del plásmido pEL8 utilizando la enzima de restricción BamHI . El gen del Luciferasa se sustituyó por el gen Fas-c [compuesto de los dominios extracelulares e intra-membrana de TNF-R1 humano (Receptor del Factor de Necrosis Tumoral 1, SEQ ID NO: 2) y del dominio intracelular Fas (p55) (SEQ ID NO: 3) (Boldin y colaboradores, JBC, 1995)] para obtener el cásete PPE-l-3x-Fas-c .
Plásmido PPE-1 (3x) -Fas-c - El cásete se introdujo adicionalmente en el plásmido de cadena principal mediante digestión de restricción, que resulta con el plásmido PPE-1 (3x) -Fas-c .
Plásmido Adaptador-PPE- 1 (3x) -Fas-c - El elemento PPE-l-3x-Fas-c se extrajo del primer constructo de generación del plásmido PPE-l-3x-Fas-c , y se amplificó con cebadores de PCR designados introduciendo los sitios de restricción SnaBl y EcoRl en el extremo 5' y 3' respectivamente. Estos sitios se utilizaron para clonar el fragmento PPE-Fas-c en el plásmido adaptador digerido con SnaBl y EcoRl, dando por resultado el adaptador PPE-l-3x-Fas-c utilizado para la transfeccion de las células hospederas (por ejemplo, células PER.C6) .
Modelo de Carcinoma Pulmonar de Lewis Células de Carcinoma Pulmonar de Lewis (LLC, por sus siglas en inglés) D122 recientemente recolectadas (5xl05 por ratón) se administraron a ratones C57BL/6 (3 meses de edad) , mediante inyección subcutánea en la almohadilla plantar. Se desarrollaron tumores primarios en las patas a aproximadamente 14 días. Cuando los tumores alcanzaron un diámetro de por lo menos 7 mm, los ratones se anestesiaron y el segmento distante de la extremidad se amputó. Cinco días después de la amputación de la extremidad, los ratones aleatorizaron a uno de los siguientes grupos: Tratamiento Dosis- partículas de virus (vp/ratón) Grupo 1 adenovirus Ad5PPE-1-3X-fas-quimera 101 Grupo 2 adenovirus Ad5PPE-1-3X-fas.-quimera 101 Grupo 3 adenovirus Ad5PPE-1-3X-fas-quimera 109 Grupo 4 adenovirus Ad5PPE-1-3X-fas-quimera 108 Grupo 5 adenovirus Ad5PPE-1-3X-fas-quimera 107 Grupo 6 adenovirus Ad5PPE-1-3X-fas-quimera 10s Grupo 7 Vehículo Vehículo =PBS, 10% de glicerol Se inyectaron intravenosamente virus a la cola del ratón. Los ratones se sacrificaron en la muerte de 5 ratones de control (inyectados con vehículo) (aproximadamente 24 días después de la administración del virus/control) . Los ratones en los cuales el tumor primario emergió después del tratamiento, se retiraron del estudio. En el sacrificio, los pulmones del animal se removieron, se lavaron y se pesaron, y se recolectó la sangré para la prueba de función del hígado.
Se cortaron tej idos de hígado y tumoral y se congelaron en formaldehído . al 4% o en un compuesto OCT para análisis histológico me'diante tinción con hematoxilina-eosina o tinción anti-PECA l (anti-CD31) , respectivamente. Las diferencias del peso del tumor se evaluaron utilizando la prueba U de Mann- hitney.
• El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia dependiente de dosis del adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera y para evaluar la dosis efectiva mínima.
Resultados Dosis clínicamente significativas (106 a 1011 vp/ratón) de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera no causan efectos sistémicos no específicos Se observó la mortalidad en todos los grupos antes del sacrificio programado sin tendencia de respuesta a la dosis. Los signos clínicos de la supervivencia de los ratones no revelaron ninguna anormalidad. No se observó una tendencia de respuesta a la dosis en los pesos de los ratones.
No se observaron diferencias significativas estadísticas en la función del riñon en todos los grupos, excepto por un incremento en el ácido úrico observado en la cohorte de dosis más baja en el día 5 después de la dosificación. No se observaron diferencias significativas estadísticas en los niveles de SGOP y SGPT de ratones tratado versus no tratados .
El examen macroscópico en la necropsia (cerebro, hígado, corazón, bazo, gónadas, ríñones, intestino delgado, pulmones) , no reveló ninguna normalidad excepto para la metástasis encontrada en los pulmones. No se encontraron diferencias estadísticas en el peso de los órganos (hígado, bazo, intestino delgado, corazón, ríñones, pulmones, y cerebro) , excepto por el corazón y el bazo donde se observó un incremento en el peso (no dependiente de dosis) en ratones tratados con adenovirus comparados co los ratones no tratados .
Las observaciones microscópicas (en el pulmón, hígado y corazón) mostraron inflamación leve a moderada y cambios regenerativos del hígado después del tratamiento con 108 ?011 vp/ratón.
El adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera {10s a 1011 vp/ratón) suprime el crecimiento tumoral metastásico Las Figuras 1A-1C muestran pulmones ejemplares de los grupos de tratamiento y control en la completación del estudio. En el pulmón, se descubrió metástasis grande en ratones tratados con vehículo (FIGURA 1A) . Estas metástasis se redujeron en una forma dependiente de dosis en los ratones tratados con adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera (Figuras 1B-1C) , con el efecto más potente en la cohorte de dosis más alta (1011 vp/ratón) (FIGURA 1C) , en el cual la mayoría de los pulmones parecieron ser normales o con solamente metástasis pequeñas. Este efecto disminuyó a niveles no observables en títulos bajos del virus (107 vp/ratón y 106 vp/ratón) . El efecto anti-tumor protector del adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera se confirmó por la diferencia en peso dé los pulmones de los ratones tratados con adenovirus Ad5PPE-l-3X-f.as quimera, que se redujo significativamente cuando se compararon con los ratones de control pero disminuyó a un nivel no observable en títulos de virus bajos (FIGURA ID) .
De esta manera, una inyección sistémica sola de una cantidad clínicamente significativa del adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera fue sumamente efectiva en reducir la carga tumoral en el modelo de Carcinoma Pulmonar de Lewis en forma dependiente de dosis. 1011 vp/ratón dio por resultado una disminución del 70% en la carga tumoral. No se observó eficacia del tratamiento en dosis más baja (106 vp/ratón -107 vp/ratón) .
Ejemplo II Administración de Ad5PPE-l-3X-fas quimera en el entorno clínico ¡ A fin de determinar la seguridad y eficacia de la administración del AD5PPE-l-3X-fas-quimera en el entorno clínico, los resultados tales como toxicidad, efectos adversos, título de anticuerpo, biodistribución, progresión de la enfermedad y recurrencia de la enfermedad y supervivencia se supervisaron en sujetos con tumores primarios sólidos y metastásicos que reciben infusión intravenosa de un intervalo de dosis del vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera.
MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES Población de Sujetos Se enrolan sujetos con cáncer de órganos sólidos avanzados y/o o metastásicos de 18 años de edad y mayores, sin opciones restantes para medidas curativas o paliativas estándares .
Los criterios para la inclusión del sujeto en el grupo de tratamientos son: 1. Sujetos de por lo menos 18 años de edad; 2. Malignidad histológicamente confirmada que sea metastásica o no resecable y por el cual las medidas curativas o paliativas estándares no existen o ya no son efectivas; 3. Estado del desempeño de Karnof de > 70%; 4. Perfil hematológico adecuado: ANC >1500/µ1, hemoglobina >10g/dl, plaquetas >100, 000/µ1, . e INR dentro de los límites normales; 5. Función renal adecuada (CCT >60 mL/min/1.73 m2) ; 6. Función hepática adecuada: (ALT y AST<2.5 x ULN) y bilirrubina total dentro de los límites normales.
Los criterios para la exclusión del sujeto del grupo de tratamiento son: 1. Evento cardíaco reciente (dentro de 12 meses) o enfermedad cardíaca/vascular; 2. Cirugía reciente (dentro de 4 semanas); 3. Retinopatía Proliferativa; 4. Enfermedad del hígado; 5. Metástasis del SNC; 6. terapia anti-angiogénica reciente (dentro de 6 semanas) ; 7. Terapia inmunosupresora actual/reciente (dentro de 4 semanas) ; Quimio/radioterapia reciente o agente investigación (dentro de 4 semanas) ; 9. Co-morbidad descontrolada.
Composición: Ad5 -PPE- 1-3X- fas-quimera El Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera (SEQ ID NO: 10) es un producto terapéutico génico perjudicial vascular, que consiste de un vector de^ adenovirus no de replicación (Ad5, El suprimido, SEQ ID NO: 1) que contiene un promotor de pre-proendotelina de murino modificado (PPE-l-3x, SEQ ID NO: 12) y un transgen fas-quimera [Fas y receptor del factor de necrosis tumoral humano (TNF) ] (SEQ ID NO: 4) . Se formula como una solución de vector estéril y se suministra congelado (abajo de -65°C) , en viales de uso individual. Cada vial contiene 0.5 mL de solución de vector en un titulo viral específico .
Dosificación El escalamiento de dosis se hace por cohorte como sigue : Dosis (partículas de virus) Sujetos por Cohorte ,10 Cohorte 1 1 x10 3 ,10 Cohorte 2 3x10 3 1x10" 3x1011 1x101z 3x1012 1x1013 Puesto que no se observó toxicidad limitante de dosis después de la dosificación de 3 sujetos en cada uno de los primeros 6 cohortes, 9 sujetos adicionales se enrolaron en la cohorte 6 de acuerdo con el protocolo y después de la probación de Institutional Review' Boards . Se trataron 27 sujetos (3 en cada uno de las cohortes 1-5 [total de 15 sujetos] y 12 en la cohorte 6) . Puesto que no se observo toxicidad limitante de dosis, 6 pacientes más se enrolaron al cohorte. 7. Se trataron un total de 37 sujetos. Se observó un caso de fiebre de grado 3 NCI, poco después de la administración de la dosis más alta (cohorte 7) .
El Ad5 - PPE- 1 - 3X- fas -quimera se administra como una infusión intravenosa. Se utilizó el mismo volumen de fármaco y volumen de solución salina para cada sujeto dentro de cada cohorte, y cada sujeto se infundió con el mismo 'volumen del fármaco. La duración de infusión fue entre 3 y 5 minutos en las cohortes 1-5 y 15 minutos en la cohorte 6 y 50 minutos para la cohorte 7. En general, estos números reflejan las instrucciones especificadas en el manual de farmacia proporcionado con el estudio.
Criterios de la evaluación del sujeto Biodistribución : Se recolectaron muestras de sangre y orina antes de la dosificación, al final de la infusión (muestras de sangre solamente), 3 horas, 6 horas, y en los días 4(±1), 7(±1), 14 (±1), 28 (±2) y en el día 56 (±3) para evaluación en los niveles del ADN del virus (en sangre y orina) y la expresión del transgen (ARN mensajero en la sangre) . Solamente las muestras con ADN viral detectables se someten a prueba para la expresión transgénica.
Anticuerpos : Se recolectaron muestras de suero antes de la dosificación para análisis de los niveles de anticuerpos anti-Ad-5 Ig, igG y anti-Ad5 neutralizante totales, y en día 28 y en el día 56 para análisis de los niveles de Anti-Ad-5 Ig, IgG anti-Ad5.
. Ensayo Ad-5-IgG: Muestras de suero se diluyeron y se analizaron para la inmunoglobulina G (IgG) específica de adenovirus por ELISA. Para el ELISA, las placas immulon-IV de enlace alto, de fondo redondo plano de 96 . pocilios recubrieron con 50 ul de Ad5-antígeno (Upenn Vector Core) a (5?10?8 partículas/pocilio) en solución amortiguadora de carbonato de pH 9.5 (solución amortiguadora de recubrimiento) durante toda la noche a 4°C, se lavaron dos veces en PBS/0.05% de Tween, se bloquearon en PBS/HSA al 1% durante 1 hora a 24°C, y luego se lavaron dos veces en PBS/0.05 de Tween. Las muestras apropiadamente diluidas (3 veces) se agregaron a las placas recubiertas con antígeno y se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS/0.05% de Tween y se incubaron con Ig anti-humana de cabra conjugadas . con peroxidasa (dilución 1:5000, .Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces como lo anterior y el substrato TMB . (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) se agregó a 100 ul/pocillo durante 30 minutos. La reacción se detuvo cuando se adicionaron 100 ul de H2S04 2N, y las densidades ópticas se leyeron a 450nm en un lector de microplacas girable VersaMAX (Molecular Devices). El título es la dilución que logra 0.5 de OD máxima .
Ensayo de anticuerpo anti-Ad5 neutralizante: La capacidad del suero para bloquear la infección de adenovirus de células Hela (ATCC) in vitro se analizó utilizando la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) que expresa adenovirus como un reportero (Upenn Vector Core) . Varias diluciones de suero de prueba y, como un control/estándar, sueros AB agrupados (Sigma) , se pre-incubaron con moi de 1000 de virus reporteros durante 1 hora a 37°C se agregaron a 90% de cultivo celular confluente. Las células se incubaron durante 16 horas y la expresión de GFP se cuantificó por la fluoroformación de imagen utilizando el victor2 (Wallace/PerkinElmer) y visualmente. El título neutralizante de los sueros se calculó como la dilución recíproca del suero con 50% de la fluorescencia máxima a 1000 MOI .
Biomarcadores angiogénicos : Las muestras de sangre se recolectaron antes de la dosificación, y en las siguientes visitas posteriores, para evaluación de los niveles del Factor von Willebrand y los niveles de TNFa, en los días 4±1, 7±1, 14+1, 28 + 2 y en el día 56 +3 después de. la dosificación.
Niveles xe citocinas: Los niveles de citocinas en sangre periférica (véase la Tabla 6 posterior) se midieron en pacientes de la cohorte 6 . en la línea base, y en los siguientes tiempos después de la dosificación con el Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera, a 6 horas, 4 días, 7 días, 14 días, 28 días, y 56 días después de la dosificación.
Respuesta del tumor: El posible efecto del tratamiento con . fármacos en la respuesta del tumor se evaluó al medir las dimensiones del tumor en el escaneo CT (o MRI) de acuerdo con los Criterios de Evaluación de Respuesta en los Criterios de Tumores Sólidos (RECIST) en la clasificación y en la semana 4 y 8 después de la dosificación, o de acuerdo con los criterios RECIST en la clasificación, día -1/0 y en el día 7+1, semana 4 (día 28 + 2) y semana 8 (día 56 + 3) después de la dosificación de línea base.
Criterios RECIST: Evaluación de las lesiones objetivo .Respuesta completa (CR, por sus siglas en inglés ) ·. Desaparición de todas las lesiones objetivo.
Respuesta parcial (PR, por sus siglas en inglés ) : Por lo menos una disminución de 30% en. la suma del LD de lesiones objetivo, tomando como referencia la suma LD de línea base.
Enfermedad estable (SD, por sus siglas en inglés) : Ni la reducción suficiente para calificar la PR tampoco el incremento suficiente para calificar PD, tomando como referencia la suma de la LD desde que el tratamiento comenzó.
Enfermedad progresiva (PD, por sus siglas en inglés) : Por lo menos un incremento del 20% en la suma de la LD de lesiones objetivo, tomando como referencia la suma de la LD más pequeña registrada puesto que el tratamiento comenzó con la aparición de una o más nuevas lesiones.
Evaluación de lesiones no objetivo Respuesta completa (CR) : Desaparición de todas las lesiones no objetivo y normalización del nivel marcador de tumor .
Respuesta incompleta / Enfermedad estable (SD) : Pérsistencia de una o más lesión(s) no objetivo o/y mantenimiento del nivel marcador del tumor arriba de los límites normales. 13 Enfermedad progresiva (PD) : Aparición de una o más nuevas lesiones y/o progresión inequívoca de lesiones no objetivo existentes.
Evaluación de la mejor respuesta total La mejor respuesta total es la respuesta registrada desde el inicio del tratamiento hasta la progresión/recurrencia de la enfermedad (tomando como referencia para la PD las mediciones más pequeñas registradas desde que el tratamiento comenzó) . En general, la mejor asignación de respuesta del paciente dependerá del logro de tanto los criterios de medición como de confirmación.
Los pacientes con un deterioro global del estado de salud que requiere descontinuación del tratamiento sin evidencia objetiva de la progresión de la enfermedad en este tiempo se deben clasificar por tener "deterioro sintomático" . Se debe hacer cada esfuerzo para documentar la progresión objetivo a un después de la descontinuación del tratamiento.
En algunas circunstancias puede ser difícil distinguir la enfermedad residual del tejido normal. Cuando la evaluación de la respuesta completa depende · de esta determinación, se recomienda que la lesión residual sea investigada (aspirado/biopsia con aguja fina) para confirmar el estado de respuesta completa.
RESULTADOS : Disposición de Pacientes La disposición de pacientes se resume en este punto. 26 sujetos en 6 cohortes se enrolaron entre Noviembre de 2007 y Agosto del 2009, y un total de 33 sujetos se habían Inscrito por Diciembre de 2010. Cada uno de los 3 sujetos en las cohortes 1-4 descontinuaron el estudio prematuramente: 2 sujetos debido a muerte, 8 debido a renuncia voluntaria del sujeto, 2 para buscar otros protocolos de tratamiento. De las 2 muertes, el paciente no. 1 se reportó como un efecto adverso serio, mientras que el paciente no. 9 murió 88 días después de la dosificación y por lo tanto, como se define en el protocolo, no se reportó como un SAE. En la cohorte 5, un sujeto completó el estudio (hasta el día 56), uno se retiró antes del día 56 y uno se designó como "Otro" se retiró debido a la progresión de la enfermedad. Cinco pacientes de la cohorte 6 completaron el estudio, 5 se retiraron debido a la progresión de la enfermedad (2 tuvieron metástasis cerebral) , y uno murió aproximadamente 2 meses después de recibir el tratamiento del estudio. Cuatro pacientes de la cohorte 7 completaron el estudio; dos se retiraron debido a la progresión de la enfermedad.
Entre los 33 pacientes iniciales Inscritos, 31 atendieron la visita del día 28, y 19 atendieron la visita del 56. Los sujetos se contactaron para seguimiento cada 2-3 meses después de un período de hasta 3 años o más después de la dosificación para supervisión.
Perfil de Población de Pacientes Demografía La demografía y las características de línea base se resumen en la Tabla 1 que sigue. Total, 54% de los sujetos fueron hombres y 46% mujeres. Todos menos cinco de los sujetos (4 Hispanos y 1 Asiático) Inscritos fueron Caucásicos. La edad media de los sujetos Inscritos fue de 58.5 años, con el más joven de 35.1 años de edad y el más viejo de 74.1 años. El registro Karnofsky medio en la entrada fue de 85.4; el registro más bajo en la entrada fue de 70 (el mínimo permitido por los criterios de inclusión del protocolo) y el más alto 100.
Tabla 1: Resumen de Demografía/Características de Línea Base Historia Médica La historia médica se resume co la misma: Como se espera en una población de pacientes con una edad media de 58.5 años, todos los sujetos tenían otras condiciones médicas en la linea base. Las condiciones médicas más comunes (definidas como aquellas presentes en por lo menos tres sujetos) fueron: hipertensión (13 sujetos) ;.l. fatiga (10 sujetos) ; constipación (6 sujetos) ; diarrea y anemia (5 sujetos cada uno); nausea, GERD, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, alergia estacional, y colecistectomía (4 sujetos cada uno); dolor abdominal, tos, hipotiroidismo, dolos de espalda baja, y neumonía (3 sujetos cada uno) .
Diagnosis Primaria La frecuencia del tipo de tumor en la línea base se resumen en la Tabla 2 que sigue. Los tipos de tumor más frecuentes fueron adenocarcinoma colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, melanoma, sarcoma, y carcinoide/neuroendocrino. Un sujeto tuvo los siguientes tipos de tumor: carcinoma de células transicionales de la vejiga, cáncer del esófago distante, carcinoma de células Merkle, carcinoma de células pequeñas de pulmón, carcinoma de células renales, tumor estromal gastrointestinal, tumor del cordón sexual testicular, y carcinoma de tiroides papilar.
Tabla 2: Diagnosis de Tumor Primario (cohortes 1-7) Quimioterapia Previa La quimioterapia previa se resume por el número y frecuencia de quimioterapia a continuación. Todos los sujetos Inscritos en el ensayo tuvieron quimioterapia previa con c múltiples agentes, con 3.7 líneas de quimioterapia previas media (intervalo de 1-8.) . Las medicaciones más frecuentemente utilizadas fueron: 5-FU (10.9%) , Bevacizumab (10.9%), Capecitabina (8.6%) , Leucovorin (8.0%), Irinotecano (8.0%), Cetuximab (5.2%) , Oxaliplatino (4.6%), Temozolomida (3.4%), Cisplatino (3.4%) , Folfox (3.4%), Sunitinib (2.9%), Dacarbazina (2.3%), y Docetaxel (2.3%).. La mayoría de sujetos (16/26, 61.5%), recibieron por lo menos un agente anti-angiogénico previo: Bevacizumab (12 pacientes) , Sunitinib (4 pacientes) , y Sorafenib (2 pacientes) . El uso de estos agentes quimioterapéuticos refleja los tipos de tumores de que ocurren en esta población de pacientes.
Otras Intervenciones Anti-tumor Esencialmente todos los sujetos tuvieron cirugía previa para su tumor. Los detalles de la cirugía y de otras intervenciones anti-tumor, excluyendo quimioterapia, se resumen a continuación: El número promedio de procedimientos quirúrgicos previos relacionados con el tumor fue >2/sujeto, con pocos sujetos que habían tenido 4 procedimientos quirúrgicos. También, 12 de los sujetos tuvieron terapia de radiación previa. Todos los cursos de terapia de radiación se llevaron a cabo por lo menos .8 meses antes del tratamiento del estudio excepto para el sujeto no. 13, quien el último curso de radioterapia terminó aproximadamente 4.5 meses previamente . El protocolo requirió no radioterapia durante por lo menos 4 semanas antes del enrolamiento.
Evaluación del Tumor en la Línea Base Todos . los sujetos tuvieron evaluaciones CT de lesiones objetivo de tumor con mediciones de tamaño de tumor en la línea base para pos -tratamiento de comparación subsecuente. Para estas mediciones, se utilizó el diámetro más grande de cada lesión objetivo.
Resumen de la Población de Pacientes La mayoría de sujetos Inscritos en este estudio fueron caucásicos con una distribución de género casi igual y una edad promedio de 58.5 años. El registro de Karnofsky de entradas medio fue de 85.4, y todos los sujetos tuvieron condiciones médicas concurrentes. Los tipos de tumor más frecuentes fueron adenocarcinoma colorectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, melanoma, sarcoma y carcinoide/neuroendocrino. Todos los sujetos Inscritos en el ensayo tuvieron cirugía relacionada al cáncer previo y quimioterapia con múltiples agentes, el más común de los cuales fueron 5-FU, Bevacizumab, Capecitabina, Leucovorin, Irinotecan, Cetuximab, Oxaliplatin, Temozolomida, Cisplatino, Folofox, Sunitinib, Dacarbazina, y Docetaxel; la mayoría también tuvo terapia anti-angiogénica previa y terapia de radiación. · EVALUACIONES DE SEGURIDAD Eventos Adversos La incidencia y frecuencia de eventos adversos se resumen en la Tabla 3 que sigue: total, eventos experimentados mediante por lo menos 4 sujetos (15.4%) incluyeron: pirexia (50%); fatiga (46.2%); aPTT prolongado (38.5%); escalofríos, hiponatremia y hemoglobina disminuida (26.9% cada uno); constipación (23.1%); nausea, vomito, anorexia, y dispoena (19.2% cada uno); linfopenia, aspartato-aminotransferasa elevadas, hiperglicemia, mialgia, e hiperhidrosis (15.4% cada uno). La pirexia y escalofríos ocurrieron en dosis más altas solamente (cohortes 4-6) . En la cohorte 6, 9 de 11 sujetos experimentaron pirexia y 6 de 11 también tuvieron escalofríos. En la cohorte 7, un sujeto experimentó una fiebre de grado 3. Todos los pacientes, la pirexia y. los escalofríos ocurrieron en el .día del tratamiento del estudio (después de la infusión) , fueron transientes, y se resolvieron dentro de 24 horas.
Tabla 3: Eventos Adversos Más Frecuentes (cohorte 1-6) La mayoría de los eventos de pirexia (11 de 14) y escalofríos (7 de 8) que ocurrieron en los grupos de dosis más altos se consideraron posiblemente, probable o definitivamente relacionados con el fármaco del estudio. Los únicos otros eventos considerados relacionados definitivamente con el fármaco del estudio incluyeron dos eventos de nausea y un evento cada uno de anemia, vómito, fatiga, hiperhidrosis, anorexia, y dolor de cabeza. Ninguno de estos eventos se clasificó como NCI Grado 3 o mayor. De esta manera, no ocurrieron toxicidades de limitación de dosis. La mayoría de los otros eventos adversos se consideraron no relacionados o improbablemente relacionados con el fármaco del estudio.
De los eventos adversos más comunes, la fatiga se consideró no relacionada en 9/12 sujetos e improbable en un sujeto; aPTT prolongada no relacionada en 7/10 sujetos; hemoglobina disminuida se consideró no relacionada en todos los 7 sujetos; y constipación no relacionada en todas las ocurrencias. Nota: El investigador local comentó que la prueba de laboratorio local de aPTT es sumamente sensible (como se utiliza para la clasificación de un anticoagulante de lupus) ; de hecho, todos los eventos adversos de elevación de aPTT ocurrieron en pacientes de esa clínica.
Se reportaron los siguientes eventos adversos Grado 3 o más altos; todos se consideraron no relacionados o improbables relacionados con el fármaco de investigación: Sujeto no. 001 (cohorte 1): progresión de enfermedad Grado 3; sujeto no.007 (cohorte 3) : hiponatremia e hipercalemia Grado 3; sujeto no.008 (cohorte 3) : hemoglobina Grado 3 disminuida; sujeto no.009 (cohorte 3): fatiga Grado 3; sujeto no.013 (cohorte 4): hipocalemia, hiponatremia, hipocloremia , y fatiga Grado 3 ; sujeto no.025 (cohorte 6): ideación suicida Grado 4; sujeto no.027 (cohorte 6): debilidad Grado 3; sujeto no.033 (cohorte 6): dolor abdominal Grado ¦ 4 e hiperglicemia Grado 3; sujeto no.035 -(cohorte 6): bilirrubina total elevada, AST elevada, ALT elevada, y fosfatasa alcalina elevada Grado 3; y sujeto no.036 (cohorte 6): hiponatremia Grado 3. La progresión de la enfermedad en el sujeto no .1 fue un evento adverso serio; todos los otros eventos no fueron serios. Todos los sujetos con hiponatremia Grado 3 (no.007, no.013, y no.036) con o sin otros eventos metabólicos de Grado 3 tuvieron malignidades gastrointestinales.
Eventos Adversos Serios No se reportaron eventos adversos serios (SAEs) relacionados con el tratamiento con el fármaco del estudio. Prueba de Laboratorio : Hematología y Coagulación Ninguna tendencia significativa en los cambios medios se presentó después del tratamiento en cualquiera de las cohortes para las siguientes pruebas: conteo de basófilos, conteo de eosinófilos, conteo de linfocitós, hematocrito, hemoglobina, conteo de neutrófilos, conteo de plaquetas, RBC, y PT. Una tendencia para el aPTT incrementado después del tratamiento se observó en cada cohorte, aunque la mayoría de valores medio permaneció dentro del intervalo normal. Los conteos de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas en inglés) medios y medianos tendieron a disminuir en las cohortes 3-6 desde el día de dosificación hasta el día 4, pero los valores individuales permanecieron dentro de los límites normales en todos los sujetos excepto para dos sujetos en la cohorte 6: (1) sujeto no.26 tuvo un WBC bajo (3700 K/yL) en el día de la dosificación que disminuyó a 2700 ?/µ??, en el Día 4 pero luego se incrementó a por lo menos 4000 K/ L para el resto del estudio y (2) sujeto no.32 tuvo un WBC de 6.3 ?/µ?. en el día de la dosificación que disminuyó a 4.5 ?/µ?, en el Día 4 y después varió entre 4.3 y 6.0 K/iL.
Los valores para las pruebas de hematología que se consideraron descubrimientos clínicamente significativos incluyendo: El sujeto no.8 (en la cohorte 3) tuvo un hematocrito de 32.3% y hemoglobina de 10.6 g/dL en el día de la dosificación que disminuyó gradualmente a través del tiempo a 25.5% y 7.9 g/dL, respectivamente, en el día 28. Este conteo de plaquetas del sujeto fue de 443,000 K/pL en el día de la dosificación y se incrementó a 516, 000 K/ L en el día 28.
El sujeto no.14 (en la cohorte 4) tuvo un hematocrito de 34.2% y hemoglobina de 10.8 g/dL en la clasificación; estos valores disminuyeron gradualmente a través del tiempo de 26.4% y 8.3 g/dL, respectivamente, en el día 14. Este aPTT del sujeto fue de 33.1 segundos en la clasificación, 34.4 segundos en el día 4, y luego se incrementó a 49.6 segundos en el día 7 y 53.6 segundos en el día 14.
El sujeto no.33 (en la cohorte 6) tuvo un hematocrito de 38.3% en la clasificación y 33.1% en el día de la dosificación y hemoglobina de 12.3 g/dL en la clasificación y 10.9 g/dL en el día de la dosificación; ambos estabilizados para la duración del estudio. Este control de plaquetas del sujeto fue de 116, 000 K/pL en el día de la dosificación y disminuyó a 89, 000 K/pL en el día 4 pero se incrementó subsecuentemente a 129,000 K/pL en el Día 28. El PTT fue normal a 31 segundos en el día de la dosificación pero se incrementó a 44.5 y 48.2 segundos en los Días 14 y 4 28, respectivamente.
Resumiendo el cambio en los valores de laboratorio de hematología y coagulación desde el día de dosificación hasta el día 28 para las cohortes combinadas: El cambio no sugirió ninguna tendencia para que los valores cambiaran abajo o arriba del intervalo normal a 28 días después del tratamiento. En particular, para tanto el hematocrito como la hemoglobina, no se observó tendencia para que los valores cambiaran abajo del intervalo normal.
Química Resumen de la prueba de química en suero: No hubo tendencia significativa en los cambios medios ocurridos después del tratamiento en ninguno de las cohortes para las siguientes pruebas: ALT, AST, albúmina, fosfatada alcalina, calcio, creatinina, glucosa, potasio, sodio, bilirrubina, proteína total, y BU . Los niveles medios de los siguientes se incrementaron, debido a un alto nivel observado en el sujeto: ALT y AST en la cohorte 6 en el Día 28 debido a los niveles de 406 U/L y 232 U/L, respectivamente, en el sujeto no.35; bilirrubina total en la cohorte 6 en el Día 28 debido a un nivel de 7.4 en el sujeto no.35. Los niveles de fosfatasa alcalina muy altos en los siguientes sujetos se contó para niveles medios elevados en sus cohortes respectivos: sujetos no .4 (cohorte 2), no.24 (cohorte 5), y no.22, 26, 30, 35, y 36 (todos en la cohorte 6) .
Pruebas químicas: Los sujetos no. y no.22 tuvieron pruebas ALT y AST elevadas en el día de la dosificación que disminuyeron/normalizaron subsecuentemente. El sujeto no.35 en la cohorte 6 tuvo niveles elevados de ALT y AST en el día 28: 406 U/L y 232 U/L, respectivamente, pero estos niveles se normalizaron por el día 56. Este sujeto (no.35) se hospitalizó por obstrucción del conducto biliar debido a progresión del tumor y también tuvo niveles marcadamente elevados de bilirrubina total, 7.4 mg/dL, y fosfatasa alcalina, 1176 U/L, en el día 28. De otra manera, todas las elevaciones de ALT y AST fueron <3X los límites superiores de normal y tendieron a ser esporádicos. Ningún sujeto diferente a no.35 tuvo un nivel de bilirrubina total a normal durante la participación en el estudio. La fosfatasa alcalina elevada en el día de dosificación fue común, presumiblemente debido a un tumor y/o enfermedad metastásica, pero un incremento progresivo significativo en esta prueba de laboratorio se presentó solamente en dos sujetos (no.4 quien tuvo un nivel de 383 U/L en la clasificación, 493 U/L en el día de la dosificación y 609 U/L en el Día 28 y el no.36 quien tuvo un nivel de 163 U/L en el día de la dosificación y 377 U/L en el Día 28). Ninguno de los sujetos desarrolló niveles después del tratamiento clínicamente significativos para cualquiera de las otras pruebas químicas .
Resumen del cambio en los valores de química en suero del día de la dosificación al día 28 para las cohortes combinados: 5/15 sujetos quienes tuvieron un nivel normal en el día de la dosificación tuvieron un nivel bajo de sodio en suero en el día 28. Sin embargo, los niveles de sodio fueron anormales solo intermitentemente, usualmente solo ligeramente abajo del normal, y no clínicamente significativo. Las tablas de cambio no sugieren ninguna otra tendencia para los que los valores cambien abajo o arriba del intervalo normal a 28 días después del tratamiento.
Urinalisis La frecuencia de una anormalidad en la urinalisis en el día de la dosificación (89.5%) y en la clasificación (76.0%) fue alta, pero no se observaron tendencias en las visitas después de la dosificación. Una revisión de los datos indicó que no se presentaron anormalidades clínicamente significativas en la urinalisis, . aunque pocos sujetos tuvieron cantidades pequeñas de proteína en su orina, y el sujeto no.30 en la cohorte 6 tuvo 2+ de proteinuria en el día 28.
Anticuerpos a Adenovirus 5 Las muestras de suero de sujeto sometidos a prueba para anticuerpos a Adenovirus 5 (total e IgG) ; se incrementan en títulos entre la pre- y pos-dosis para anticuerpos IgG se resumen en la Tabla 4 y Figura 11. Las muestras pos-dosis se recolectaron en el día 28 o .56 en todos menos en 3 sujetos; estos 3 tuvieron muestras pos-dosis sometidas a pruebas temprano debido a la no disponibilidad de las muestras en el día 28. Todos los títulos de anticuerpo IgG pos-dosis se incrementaron por lo menos 7 veces; 8 de 33 sujetos tuvieron por lo menos un incremento de 100 veces en los anticuerpos' IgG sobre el título de pre-dosis. Todos los títulos del anticuerpo totales pos-dosis a adenovirus 5 se incrementaron por lo menos 5 veces; 10 de 26 sujetos tuvieron por lo menos un incremento de 625 veces en los anticuerpos totales sobre el título de pre-dosis. No hubo correlación entre el incremento de veces (títulos de anticuerpo IgG y totales) y nivel de dosis (P> 0.05, pruebas de correlación de Pearson y Spearman) . Los datos recolectados en el día 56 para los sujetos de la cohorte 7 indicaron una tendencia de niveles disminuidos de IgG, comparados con el día 28 (véase la Tabla 4 que sigue) .
Tabla 4: Resumen del Incremento del Anti-Adenovirus 5 en Títulos de Anticuerpo IgG y Títulos de Anticuerpo Totales Todos los sujetos también se evaluaron para su nivel de anticuerpos Adenovirus 5 neutralizantes en la línea, base (Tabla 5) . Los resultados muestran que el 35% tuvo niveles de línea base sumamente elevados (>210) y 41% de los sujetos tuvieron niveles bajos (< 18) de anticuerpos neutralizantes.
Tabla 5: Resumen de. títulos de Anticuerpos Neutralizantes Anti-Adenovirus 5 en la Línea Base No se podría discernir una correlación entre la presencia de los anticuerpos anti-Ad5 neutralizantes en la línea base y la progresión de la enfermedad en los .días 28 (FIGURA 2) o 56 (Figuras 3A, 3B Tabla 5) (Correlación de Producto-Momento de Pearson; P> 0.050; Correlación de Rango-Orden de Spearman; P>0.050) .
Niveles de citocina en sangre periférica en la cohorte 6 Se midieron los niveles de citocina en sangre periférica en los pacientes de la cohorte 6 en la línea base, y en los siguientes tiempos después de la dosificación con AD5-PPE-1-3X-FAS-QUIMERA- : 6 horas, 4 días, 7 días, 14 días, 28 días, y 56 días después de la infusión. Los resultados se resumen en la Tabla 6 que sigue.
Tabla 6 : Resumen de los niveles de Citocina en Sangre Periférica Medios en la cohorte 6 Un incremento significativo en los niveles IL-6 medios se presentó 6 horas después de la infusión; este nivel regresó a la línea base en el día 4. Se observó un incremento más pequeño en los niveles TNFRII, alcanzando un máximo entre los días 4 y 14. No se presentaron elevaciones mayores con las otras citocinas medidas.
Signos Vitales No se observaron tendencias significativas después del tratamiento para BP sistólica, BP diastólica, y frecuencia respiratoria, y ningún sujeto desarrolló ninguna anormalidad clínicamente significativa.
Las elevaciones significativas en la temperatura (>38 grados centígrados) se presentaron en 5 sujetos a 6 horas después de la infusión: un sujeto en la cohorte 5: no.20 (38.3 grados centígrados) y 4 sujetos en la cohorte 6: no.26 (39.1 grados centígrados) , no.27 (39.7 grados centígrados), no.32 (39.8 grados centígrados), y no.36 (39 grados centígrados) . En cada uno, la temperatura se había normalizado antes de o por el día 4 (que fue el primer registro de temperatura después de aquel, de 6 horas después de la infusión) . La f ecuencia cardíaca media se incrementó a 101.2 latidos/minuto en la cohorte 6 a 6 horas después de la dosificación. Esto fue debido a una frecuencia cardíaca más rápida en los sujetos que habían experimentado pirexia en este cohorte (frecuencia cardíaca de 107-140 latidos/minuto) . El peso se resume en .este punto: no se presentó un cambio mayor en el peso, excepto para una disminución en el peso medio en el seguimiento (75.0 kg en la clasificación, 75.0 kg en el día 56, y 63.5 kg en el seguimiento) .
Exámenes Físicos No hubo cambios relacionados con el tratamiento o clínicamente significativos en los exámenes que son evidentes de los datos de los exámenes físicos por sujeto en la clasificación en el día 56.
ECGs Los parámetros ECG en la clasificación se resumen en este punto: En la clasificación, 15 sujetos tuvieron ECGs normales, y 11 tuvieron anormalidades que se consideraron no clínicamente significativas. El protocolo original específico que un ECG de seguimiento se debe realizar en .el día 56 de la visita de seguimiento. Ya que la mayoría de sujetos se retiró del estudio antes del día 56, en las cohortes 1-5 solamente el sujeto no .7 tuvo un ECG de seguimiento y este mostró cambios ECG considerados no clínicamente significativos.
El protocolo se enmendó posteriormente para obtener el ECG de seguimiento en la visita del día 28. En la cohorte 6, hubo 4 ECGs de seguimiento obtenido: dos fueron normales y dos tuvieron descubrimientos no clínicamente significativos, menores sin cambios mayores del ECG de clasificación.
Biodistribución de Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera Debido a un error, no todas las muestras de sangre entera se extrajeron de algunos de los pacientes en las cohortes 5 y 6 [3]) . Las muestras de orina se sometieron a prueba para 11 de los 12 pacientes de la cohorte 6 y para los 12 pacientes adicionales de las cohortes más bajos sometidos a prueba para niveles en la sangre .
Análisis de las Muestras de Orina para Verificar la Presencia de Adenovirus: Niveles máximos del ADN del Vector de Adenovirus detectados en la oARN se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7 : Niveles máximos del Vector de Adenovirus en la Orina (cohortes 1-6) VP- partículas virales; BLQ<20 copias; BLD<1.4 copias Análisis de las Muestras de Sangre Entera para la Verificación de Presencia del Vector de Adenovirus Los niveles promedio del ADN del Vector de Adenovirus, como es detectado por la RT-PCR en sangre entera para las cohortes 1-6 se resume a través del tiempo en la Figura 12A. La Tabla 8 que sigue muestra los valores medios para las cohortes 1-6. Antes de la infusión del vector de adenovirus, ninguno de los pacientes sometidos a prueba mostró amplificación del gen adenoviral (abajo de los niveles detectables) . Un incremento dependiente de dosis en los niveles máximo promedio del ADN del vector de adenovirus encontrado en la sangre entera es evidente a partir de los datos. Al final de la infusión todos los pacientes tuvieron niveles de virus en sangre individuales en el intervalo de. 1.9xl03 y 5.5xl07 copias/^g de ADNg, correlacionándose positivamente con la dosis recibida.
En los pacientes de la cohorte 6 (Figura 12A, línea punteada gris), los niveles promedio del adenovirus disminuyeron de un intervalo de 2.1 x 105-5.5 x 107 (final de la infusión) a un intervalo de .1.1 xl04-2.6xl05 copias/pg de ADNg (tres horas después de la infusión, véase la Figura 12B) . Los niveles del adenovirus continuaron disminuyéndose 6 horas después de la infusión y disminuyeron subsecuentemente por todos los puntos de tiempo finales. Por el día 56, los niveles de ADN de Adenovirus ya sea todos se redujeron 2 veces log, o fueron indetectables .
Tabla 8: Presencia del Vector de Adenovirus en Sangre Entera: Valores Medios Análisis de los niveles de expresión del transgen fas -quimera en sangre entera Ninguno de los 21 sujetos sometidos a prueba tuvo niveles detectables de ADNc transgénico (como es determinado por la RT-PCR, que representa niveles de ARNm en sangre) en sangre entera. Sin embargo, en un paciente 01-036 (cáncer esofágico) se sometió a prueba una muestra de . una metástasis subcutánea y se encontraron niveles detectables de la expresión transgénica de adenovirus en el aspirado en los días .4 (1.4x10s copias/pg de ARN) y 28 (3.9xl05 copias/ g de ARN) , después del tratamiento (Tabla 9) , proporcionando evidencia directa de la especificidad de la expresión transgénica en el tejido tumoral objetivo.
Tabla 9: Aspirado del tumor del paciente 01-036 (copias/ g AR ) Resumen de los Resultados de Seguridad No se observaron signos de problemas de seguridad significativos con el Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera en este estudio. La dosis terapéutica máxima (MTD, por sus siglas en inglés) se determinó que es 103 de partículas de virus por dosis, en vista de una toxicidad limitante de dosis de una fiebre grado 3 NCI, poco después de la dosificación en la dosis más alta sometida a prueba (cohorte 7) . Diferente a los resultados de laboratorio anormales, los eventos adversos más frecuentes fueron pirexia, fatiga, escalofríos, y constipación. La pirexia y escalofríos se presentaron más frecuentemente en los grupos de dosis más alta y se consideraron usualmente relacionados con la medicación del estudio. Aunque no se observó una tendencia para que los valores hematológicos cambiaran fuera del intervalo normal, varios sujetos tuvieron descensos en la los valores de hemoglobina y hematocritos después del tratamiento de estudio. No se presentaron anormalidades químicas o de 1 urinalisis después del tratamiento clínicamente significativas durante el estudio con la excepción de una fosfatasa alcalina notablemente elevada y elevaciones de ALT, AST, y bilirrubina total que se presentan en un sujeto con obstrucción del conducto biliar debido a la progresión del cáncer. No se observaron cambios después del tratamiento clínicamente significativos en los signos vitales, excepto por la ocurrencia de fiebre 6 horas después de la infusión en un sujeto de la cohorte 5 y 4 de la cohorte 6; los sujetos de la cohorte 6 con fiebre también habían incrementado las frecuencias cardíacas, dando por resultado un incremento medio en la frecuencia cardíaca para la cohorte 6 a 6 horas después de la infusión. No se observaron cambios relacionados con el tratamiento en los exámenes físicos o ECGs .
Todos los sujetos tuvieron una pre-dosis de anticuerpos anti-Adenovirus 5 (total e IgG) con títulos de anticuerpo totales se incrementan por lo menos 5 veces después del tratamiento. La Figura 11 muestra los anticuerpos anti-Adenovirus 5 en cada uno de las cohortes 1-6, medidos en la línea base, día 7, día 14 y día 28, e ilustra la tendencia de los anticuerpos anti-Adenovirus 5 en la meseta entre 7 y 14 días después de la infusión, a pesar de la variabilidad observada entre los pacientes en los niveles de título de anticuerpo de línea base. Los niveles de los anticuerpos anti-Adenovirus 5 (total e IgG) tendieron a incrementarse después de la dosificación, alcanzando un máximo en el día 28 y tendiendo a disminuir en el día 56 (FIGURA 11) . En general, el incremento de veces fue mayor para los títulos de anti-Adenovirus 5 totales que para los títulos IgG, pero no se discernió una correlación entre el incremento de veces en los anticuerpos anti-Adenovirus 5 y el nivel de dosificación. 34.6% de los sujetos tuvieron niveles sumamente elevados de anticuerpos neutralizantes a Adenovirus 5, medidos en la línea base, 23.1% tuvo niveles moderadamente elevados, y 42.3% tuvo niveles bajos. Sin embargo, no hubo correlación discernible entre el título de anticuerpos neutralizantes en la línea base y una respuesta clínica (medida como enfermedad estable) . Un incremento significativo en los nivele en sangre de IL-6 medios se presentó 6 horas después de la dosificación con Ad5-PPE-1-3X- fas-quimera; este . nivel regresó a la línea base en el día 4. No se presentaron elevaciones mayores con las otras citocinas medidas (II-8, VEGF, FGF, y TNF-alfa) . La mayoría de sujetos con niveles detectables de Adenovirus 5 en la orina, la presencia fue transiente, con · niveles detectables solo dentro de las 24 horas iniciales después de la infusión intravenosa (IV) del Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera. El vector de adenovirus Ad5-PPE-l-3X- fas -quimera estuvo presente en altos números de copia en sangre entera directamente después de la infusión IV. Los niveles del vector de adenovirus disminuyeron subsecuentemente con el tiempo en la sangre entera. Las muestras con el vector presentes en la sangre entera se sometieron a prueba para la expresión del transgen fas-quimera (RT-PCR para el ARNm de transgen) . Ninguno de los 21 sujetos sometidos a prueba tuvo niveles detectables del ADNc del transgen (ADNc es el producto de reacción RT-PCR que representa los niveles de ARNm en sangre) en sangre entera.
EVALUACIÓN DE LA EFICACIA PRELIMINAR Progresión o recurrencia de la enfermedad Se evaluó la progresión de la enfermedad de acuerdo con el deterioro clínico y crecimiento radiográfico, basado en los criterios RECIST. En las cohortes 1-5, en el día 56, 3/14 pacientes tuvieron enfermedad estable. En la cohorte 6, en el día 56 . (n=12) , 1 PR, 4 SD (enfermedad estable) y 7 tuvieron enfermedad progresiva. De esta manera, en el día 56, 5/12 (42%) tuvo enfermedad estable o mejor. En la cohorte 7, en el día 56, 4 de 6 sujetos (67%) tuvieron enfermedad estable. En las cohortes 1-6, en el día 28, 21/26 (80.8%) de los sujetos se consideraron que no tienen deterioro, uno se había deteriorado, (5.6%), y 4 no tuvo observación para este punto final. Solamente 8 sujetos de las cohortes 1-6 tuvieron observaciones en la visita del. Día 56, y todos de estos fueron negativos por deterioro.
La progresión de la enfermedad también se evaluó por la frecuencia del crecimiento radiográfico (medida de acuerdo con el % de crecimiento en la suma de diámetro más grande de las lesiones objetivo como se define en los criterios de registro RECIST) . Donde no se presentaron nuevas lesiones y no hubo ya sea crecimiento en la suma del diámetro más grande de las lesiones objetivo o ese crecimiento no fue más del 20%, el sujeto se consideró que tiene enfermedad radiográfica estable en esa visita.
Reducción en el cáncer de tiroides papilar metastásico refractario después de múltiples infusiones de 3X1012 de partículas de virus de Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera De estos pacientes, el Sujeto 026, una mujer de 69 años de edad hispana, se enroló con cáncer de tiroides papilar metastásico que fue resistente al yodo radioactivo y se dosificó en la cohorte 6 el 16 de Marzo de 2009. El escaneo CT de línea base mostró una lesión de masa en el cuello con presión en la vía respiratoria (FIGURA 4, flechas) . El escaneo del Día 28 mostró enfermedad estable, y un escaneo de seguimiento 6 meses después (FIGURA 5, flechas) y 12 meses después del tratamiento mostró una mayor reducción de 30% en el diámetro grande de la masa y sin presión en la vía respiratoria, con lucencia radiográfica indicativa de necrosis central (FIGURA 5, flecha azul). Adicionalmente , los niveles de tiroglobulina habían disminuido en este paciente: el nivel en la línea base fue de 426 ng/mL y 10 meses después había disminuido a 326 ng/mL (niveles normales <55 mg/mL) .
Una segunda dosis se administró uno y medio años después de la primera dosificación, y el paciente estuvo libre de progresión en el día 120 después de la infusión. Los niveles de tiroglobulina en el momento de la segunda dosificación fueron de 281 ng/mL, elevándose a 477 ng/mL del día 28, y descendiendo a 382 ng/mL en el día 56 después de la infusión. No se observaron toxicidades limitantes de dosis, efectos secundarios graves o tormenta de citocinas por todo el período de tratamiento (Figura 10A) .
En otro paciente con una lesión de cáncer de tiroides medular, la administración de 3X1012 de partículas de. virus de Ad5-PPE-1-3X-fas-quimera dio por resultado una reducción notable en los niveles de la calcitonina biomarcadora de cáncer de tiroides : los niveles se elevaron en gran medida antes de la administración (14, 331 pg/ml, normal = < 10 pg/ml), se incrementaron (16,324 pg/ml) a 56 días después de la infusión, pero mostraron reducción marcada (6600 pg/ml) a 120 días después de la infusión. A 120 días después' del tratamiento el paciente aún estuvo libre de progresión (Figura 10B) .
Reducción en la lesión metastásica de cáncer neuroendocrino avanzado después de una sola infusión de 3X1012 de partículas de virus de Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera.
Otro paciente en la cohorte 6, Inscrito con cáncer neuroendocrino avanzado, se dosificó en la cohorte 6 el 16 de Marzo de 2009. En el escaneo CT del día 21 mostró varias metástasis hepáticas (Figuras 6A y 7A, círculos rojos) . Los escaneos CT de seguimiento a 50 (Figuras 6B y 7Bf círculos rojos) y 112 (Figuras 6C y 7C, círculo rojo) días después de la dosificación mostraron regresión continuada . de una de estas lesiones metastásicas . De acuerdo con los criterios RECIST, este paciente se registró como "enfermedad estable", y tiene una clasificación "enfermedad estable" mantenida para cuatro meses posteriores.
Resumen de la Eficacia Aunque este estudio de infusión individual con pacientes que tienen cáncer de órganos sólidos avanzado o metastásico es pequeño, ciertas tendencias se pueden discernir de los datos de eficacia.
En la evaluación del día 56, tres de los 14 pacientes en las cohortes 1-5 tuvieron enfermedad radiográfica estable (SD) ; entre estos 12 pacientes de la cohorte 6, cinco tuvieron enfermedad estable en el día 56, y un paciente (con carcinoma de tiroides papilar) tuvo una respuesta casi parcial en el día 56 (de los 12 pacientes en la cohorte 6) , que se volvió una respuesta parcial después (PR) .
Entre los 5 pacientes de la cohorte 7, 5 permanecieron clasificados por tener "enfermedad estable" (SD) . Cuando el porcentaje de cambio en los registros RECIST se gráfica para los días 0, 28 y 56, y se correlacionan con las evaluaciones de la enfermedad estable y progresiva, se puede observar que tres de 14 (21%) en las cohortes 1-5 fueron estables en el día 56 (Figura 8) . En las cohortes 6 y 7 (Figura 9) , sin embargo, 9 de 17 pacientes fueron estables en el día 56.
En este estudio de dosis variante, abierto que evalúa una sola infusión IV de seguridad y eficacia de administración del Ad5PPE-l-3X-fas-quimera (SEQ ID NO: 9). en el entorno clínico, 3 sujetos con cáncer avanzado metastásico se habían Inscrito en cada uno de los primeros 5 cohortes de dosis ascendente y 12 sujetos se habían Inscrito en el sexto cohorte. Tomados conjuntamente, los datos indican que el Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera es seguro para la administración sistémica, en todas las dosis sometidas a prueba, ya que no se había observado una señal de seguridad o toxicidades limitantes de dosis (DLT, por sus siglas en inglés) en ninguna de las dosis utilizadas. Aunque se reportaron dos eventos adversos serios, estos se relacionaron con la progresión del cáncer y no se relacionaron con el tratamiento de estudio. Varios sujetos quienes recibieron el Ad5-PPE-1-3X- fas-quimera en una de las 2 dosis más altas desarrollaron pirexia transiente y escalofríos poco después de recibir el tratamiento de estudio, los eventos se presentan comúnmente después de la administración' de los vectores de adenovirus . Las anormalidades clínicamente significativas en la prueba de laboratorio no fueron frecuentes y se consideraron no relacionadas con el tratamiento con Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera.
La dosis máximamente tolerada (MTD) se determinó como 1013 de partículas de virus por dosis, en vista del incidente individual de la toxicidad limitante de dosis (fiebre Grado 3 NCI) observada en la cohorte que recibe la dosis más alta sometida a prueba (cohorte 7) . Aunque es un estudio de una infusión pequeña entre los pacientes con múltiples tipos de cáncer refractario, avanzado, la evidencia para la eficacia de la infusión del Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera incluye pacientes con enfermedad radiográfica estable y una respuesta parcial prolongada entre los pacientes que reciben 3X1012 de partículas de virus del Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera (cohorte 6) (Tabla 10) .
Tabla 10 : Respuesta de la enfermedad a una sola dosis de Ad5PPE-l-3X-fas-quimera: porcentaje de enfermedad estable en el día 56, por indicación (cohortes 6 y 7) .
En un paciente que padece de cáncer esofágico se muestreó la metástasis subcutánea y los niveles detectables de la expresión del transgen Ad5-PPE-l-3X-fas-quimera se encontraron en el aspirado en los días 4 y 28 después del tratamiento.
Ejemplo III Efecto de la administración del Ad5PPE-l-3X-fas quimera en cáncer de tiroides en el entorno clínico A fin de determinar la eficacia de la administración del Ad5PPE-l-3X-fas-quimera en el cáncer de toroides en el entorno químico, los resultados tales como toxicidad, efectos adversos, título anticuerpo, biodistribución, progresión de la enfermedad y recurrencia de la enfermedad y supervivencia se supervisaron en sujetos con tumores de cáncer de tiroides que reciben infusión intravenosa del vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera.
MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES Indicaciones : Pacientes con cáncer progresivo avanzado y de tiroides diferenciado (DTC, por sus siglas en inglés) refractario de yodo radioactivo (papilar, folicular, células de Hurthle) .
Objetivos de seguridad: Para evaluar la seguridad de una sola dosis sistémica del vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera en pacientes con cáncer de tiroides avanzado.
Eficacia y objetivos farmacodinámicos : 1. Para evaluar la respuesta al tratamiento para pacientes con DTC avanzado con enfermedad medible utilizando Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (Criterios RECIST) ; 2. Para evaluar el perfil farmacocinético y farmacodinámico del vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera; 3. Evaluación de los cambios en los biomarcadores candidatos en respuesta al tratamiento con el vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera. 4. Para explorar las influencias de las alteraciones genéticas tumorales pre-tratamiento en respuesta al tratamiento con el vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera utilizando, materiales de tumor de archivo.
Puntos Finales de Eficacia 1. El punto final de eficacia primaria es la proporción de pacientes quienes han logrado una respuesta objetiva a la gente de estudio (de acuerdo co los Criterios RECIST) . 2. Puntos finales secundarios incluirán cambios en los niveles de tiroglobulina en respuesta al tratamiento (solamente en pacientes negativos de anticuerpos anti-tiroglobulina) .
Diseño del estudio: Un estudio de una sola dosis, abierto, prospectivo en dos grupos de pacientes (enrolamiento paralelo) : Grupo A-Tratamiento de 12 pacientes evaluables con enfermedad de cáncer de tiroides progresivo a pesar del tratamiento con yodo radioactivo, pero sin tratamiento de terapias anti-angiogénicas objetivo (por ejemplo inhibidores de tirosina cinasa o anticuerpos monoclonales anti-VEGF) . Los sujetos también pueden haber tenido tratamiento con otra quimioterapia de cáncer.
Grupo B -Tratamiento de 12 pacientes evaluable s co cáncer de tiroides progresivo a pesar del tratamiento previo con yodo radioactivo y con por lo menos una terapia anti-angiogénica. Los sujetos también pueden haber tenido el tratamiento con otra quimioterapia de cáncer.
Duración del plan de tratamiento y estudio: Los vectores de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera se administraron como una sola infusión de intravenosa de 3xl012 de vp (partículas de virus) . El período de seguimiento de eficacia después de la infusión será hasta que se presente la progresión de la enfermedad. Las visitas de evaluación de seguridad y eficacia después del tratamiento serán cada cuatro semanas hasta la semana 12 o la progresión de la enfermedad (lo que se presente más tarde) . Después, las evaluaciones de re-estadificación se presentarán cada 2 meses hasta por lo menos un año después del enrolamiento del estudio o hasta la progresión (lo primero) . La re-estadificación formal de las lesiones indicadoras se realiza cada 8 semanas .
Tamaño de la población: Los grupos A y B de este estudio cada uno enrolará 12 sujetos evaluables, para un total de 24 sujetos evaluables. El sujeto evaluable son sujetos para quienes los criterios de evaluación seleccionados se pueden aplicar a través de la duración del estudio. El ensayo se diseña de acuerdo con el método estadístico de Simón de 2 etapas. Si por lo menos se observa una respuesta en los 12 pacientes iniciales, los 24 pacientes adicionales se enrolarán de ese grupo (hasta un total de 37 pacientes por grupo o 74 en total) .
Criterios de Inclusión: 1. Pacientes de >18 años de edad; 2. DTC avanzado histológica o citológicamente confirmado (papilar, folicular, células de Hurthle) ; 3. Ausencia de sensibilidad al yodo radioactivo terapéutico; 4. Sin tratamiento previo con agentes anti-angiogénicos (pacientes del Grupo A solamente) ; 5. Enfermedad medible, definida como por lo menos una lesión que se puede medir con precisión en por lo menos una dimensión (diámetro más grande que se registra) como >20 mm con técnicas convencionales o como >10 mm con escaneo CT espiral (Nota: Enfermedad que es medible por el examen físico solamente que no sea elegible, y son requeridos CT y/o MRI en la evaluación de las lesiones indicadoras) ; 6. Expectación de vida >3 meses; 7. Estado del desempeño ECOG (PS) 0, 1, o 2; estado del desempeño de Karnofsky de >60%; 8. Evidencia objetivo de la progresión del tumor en el período de 6 meses antes de la visita de clasificación, como se evalúa por: Incrementar progresivamente los marcadores de tumor adecuados, donde sea apropiado,- y rogresión inequívoca de enfermedad medida de manera objetable en la formación de imágenes apropiadas sucesivas (por ejemplo escaneo CT) . En casos de inseguridad de la progresión del tumor, el investigador principal del estudio estará disponible para ayudar en las decisiones. 9. Los pacientes con perfil hematológico normal/aceptable, como es mostrado por un control de leucocitos periféricos >3000 células/mcL, un conteo de neutrófilos absoluto >1500 células/ L, hemoglobina >10g/dl, plaqueta >100,000/µ1, y Relación Normalizada Internacional (INR) <1.2x el Límite Superior de lo Normal (ULN, por sus siglas en inglés) ; 10. Pacientes con función renal adecuada, es decir creatinina en suero <1.5 veces de los límites normales superiores; y función hepática adecuada, como es definida por la ALT y AST <2.5x el límite superior de lo normal y bilirrubina total abajo del límite superior de lo normal; 11. Hombres y Mujeres de potencial de maternidad deben utilizar, por todo el curso del ensayo un método de anticoncepción estándar; 12. Capacidad de entender y disponibilidad para firmar un documento de consentimiento informado escrito; 13. Disponibilidad para cumplir con los requisitos del estudio.
Criterios de Exclusión : 1. Mujeres embarazadas o en lactancia; 2. Enfermedad que sea medible por examen físico solamente ; 3. Presencia de cualquiera de lo siguiente: • Radioterapia o quimioterapia <4 semanas antes de la visita de línea base; · · Radioterapia a >25% de médula ósea; • Cirugía mayor <4 semanas antes de la visita de línea base; • Se permitirá la terapia concurrente y/o anterior con octreotido, que ha sido mostrada la progresión de tumor proporcionada en esta terapia; • Será permitida la terapia concurrente y/o anterior con biofosfonatos ; 4. Cualquiera de otros agentes de investigación en curso dentro de 4 semanas antes del enrolamiento; 5. Pacientes, quienes padecieron de un evento cardíaco agudo dentro de por lo menos 12 meses, incluyendo infarto al miocardio, arritmia cardíaca, admisión para angina inestable, angioplástía cardíaca, o colocación de stents; 6. Prolongación QTc (definida como intervalo QTc >500 msegs) u otras anormalidades ECG significativas (por ejemplo véntricularectopía frecuente, evidencia de isquemia al miocardio en curso) ; 7. Pacientes con enfermedad vascular activa, ya sea al miocardio o periférica; 8. Pacientes con retinopatía proliferativa y/o vascular; 9. Pacientes con . enfermedad de hígado activa conocida (alcohólica, inducida por fármaco/toxina, genética, o autoinmunitaria) diferente se relaciona con la metástasis tumoral; 10. Pacientes con enfermedad metastásica del SNC conocida (Excepción: pacientes con metástasis del SNC tratadas estables por examinaciones radiográficas >6 meses después de la terapia definitiva administrada, son elegibles) ; 11. Pacientes que se someten a prueba positivos a uno de los siguientes virus: VIH, HBV o HCV; 12. Cualquiera de las siguientes condiciones: • Heridas serias o sin sanación, úlcera, o fractura de huesos ; • Historia de fístula abdominales, perforación gastrointestinal, diverticulitis activa, abscesos intra-abdominales o sangrado del tracto gastrointestinal dentro de 28 días del enrolamiento ,- · Cualquier historia de accidente cerebrovascular (CVA) dentro de 6 meses del enrolamiento; • Uso actual de warfarina terapéutica (Nota: heparina de peso molecular bajo y warfarina de dosis baja profiláctica [Relación Normalizada Internacional (INR, por sus siglas en inglés) <1.2 X Límite Superior de (ULN) ] son permitidos) ; • Historia de trastorno de sangrado, incluyendo pacientes con hemofilia, coagulación intravascular diseminada (DIC) , o cualquier otra anormalidad de coagulación que predisponen potencialmente a los pacientes al sangrado; • Depresión deficientemente controlada o trastorno de ansiedad, o ideas de suicidio recientes (dentro de 6 meses previos) ; 13. Pacientes con un requerimiento en curso para un tratamiento inmunosupresor, incluyendo el uso de glucocorticoides o ciclosporina, o con una historia de uso crónico de cualquier medicación dentro de por lo menos 4 semanas antes del enrolamiento; 14. Enfermedad inter-actual no controlada que incluye, pero no se limita a infección en curso o activa, o enfermedad psiquiátrica/situaciones sociales que limitarían el cumplimiento con los requisitos del estudio.
Formulación, Dosificación y Administración: Él vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera se formula como una solución de vector estéril. La solución se suministra congelada (abajo de -65°C) , en viales de un solo uso. Cada vial contiene 0.5 mi de la solución de vector en un título viral específico. La solución de vector se descongela y se mantiene sobre hielo durante la dilución y manejo.
El vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera se administra como una sola infusión intravenosa, la dosis máxima que es lxlO12 - lxlO13 de partículas de virus (vp, por sus siglas en inglés) . Antes de la infusión, la solución para inyección se lleva a temperatura ambiente. Los viales se abren en un gabinete de seguridad biológica y se diluyen (por inyección) 1:4 con solución salina normal para infusión. Una sola infusión del vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera se administra en una velocidad de 1 ml/minuto. Se pueden administrar múltiples dosis en intervalos mínimos predeterminados.
Evaluación de la Seguridad: 1. Eventos adversos se registran en una base en curso. Los eventos se siguen hasta que se resuelven, o hasta el final del estudio, lo que se presente más pronto. 2. Los signos vitales se registran en la clasificación, antes de la dosificación, 30, 60 minutos, 4 y 6 horas después de la dosificación en todas las visitas de los pacientes. 3. Se conduce un examen físico en conjunción con cada visita de estudio. 4. Se conduce una evaluación de laboratorio de seguridad (signos vitales, hematología sanguínea y química, análisis de orina) en la clasificación, antes de la dosificación, y en todas las visitas de pacientes, comenzando desde el día 4+1 hasta la progresión de la enfermedad de la semana 12, lo que ocurra posteriormente. 5. Después de la progresión de la enfermedad o la semana 12 (lo que se presente después) , cada paciente se pone en contacto para un seguimiento de seguridad por teléfono cada dos meses hasta 1 año después del enrolamiento del estudio.
Biodistribución: Muestras de sangre y orina para la evaluación de niveles del ADN del vector de adenovirus y el transgen fas se recolectan para el ADN del vector de adenovirus: en varios puntos de tiempo después de la infusión.
Evaluación de la Eficacia : Respuesta del Tumor El efecto del tratamiento con el vector de adenovirus Ad5PPE-l-3X-fas quimera en la respuesta del tumor se evalúa al medir el tumor de acuerdo con los criterios RECIST (véase lo anterior) en la clasificación y las visitas subsecuentes hasta la progresión de la enfermedad. Se evalúan los cambios en el volumen del tumor y se analizan con base en los estudios radiológicos.
Ensayos Bioquímicos y de Laboratorio: Anticuerpos: Se recolectan muestras de suero antes, de la dosificación y en todas las visitas de pacientes, comenzando de la semana 1, para análisis de niveles de anticuerpos al adenovirus (tanto inmunoglobulina total, IgG total como Abs neutralizante de Ad-5) y al transgen fas-quimera .
Marcadores tumorales : TSH, anticuerpo anti-tiroglobulina, y tiroglobulina se someten a prueba en conjunción con todas las evaluaciones de seguimiento.
Medición del tumor: Evaluación del efecto biológico en la lesión indicadora (CT, MRI) .
Evaluación Estadística: Los pacientes se dividen en dos grupos de sujetos con base en el tratamiento previo de su cáncer de tiroides: Grupo A, resistentes al yodo radioactivo DTC y sin tratamiento a anti-angiogénicos ; Grupo B, resistentes al yodo radioactivo DTC con progresión en anti-angiogénicos. Estos dos grupos se evalúan independientemente para puntos finales de eficacia y toxicidad.
El reclutamiento de pacientes para cada grupo es en 2 etapas : Etapa 1: Ingresar 12 pacientes en el estudio. 12 sujetos para cada grupo. Si no se observan respuestas clínicas, la terapia se considera inefectiva en esta población de pacientes y el estudio se termina. Si por lo menos una respuesta se observa, el grupo de estudio continúa a la Etapa 2.
Etapa 2: Ingresar 25 pacientes evaluables adicionales en cada grupo de estudio. Si tres o pocas respuestas se observan después de que los 37 pacientes evaluables se han evaluado para respuesta, la terapia se considera insuficientemente efectiva en esta población de pacientes. Si 4 o más respuestas se observan, esto se considera evidencia adecuada de actividad prometedora y este tratamiento se puede recomendar para prueba adicional y en estudios subsecuentes en esta población de pacientes.
Si se encuentra menos toxicidad o el estudio se detiene en análisis interino, este estudio reclutará 37 sujetos elegibles para cada grupo y pacientes evaluables. A fin de tomar en cuenta la inelegibilidad, cancelación, violación principal de tratamiento, u otras razones o retiro temprano o renuncia, 4 pacientes adicionales se enrolarán para cada grupo. De esta manera 41 pacientes se enrolarán en este estudio para cada grupo. Total de 82 sujetos.
Las evaluaciones se llevarán a cabo de acuerdo con el programa en la Tabla 10 que sigue.
TABLA 10- PROGRAMA DE EVALUACIONES 18 Leyendas 1. Mujer de potencial de maternidad será sometida a prueba para embarazo con el uso de una prueba de embarazo en suero en la clasificación y Semana 12 2. Signos vitales (presión sanguínea, temperatura corporal y frecuencia cardíaca) se registrarán en la clasificación, antes de la dosificación a 30 y 60 minutos después de la dosificación y a 6 horas después de la dosificación, y en todas las visitas de pacientes posteriores. 3. La hematología incluirá: conteo completo de sangre con diferencial , PT y Fibrinógeno PTT 4. La química incluirá: electrolitos (sodio, potasio, calcio), creatinina; bilirrubina, fosfatasa alcalina, ALT y AST; proteína y albúmina total 5. Análisis de orina de rutina 6. Las muestras de sangre se recolectarán para los niveles de anticuerpos en suero contra el adenovirus y el transgen 7. Las muestras de sangre y orina se recolectarán para la determinación de biodistribución (niveles del ADN viral y transgen) . Véase el protocolo para detalles . 8. Evaluación de lesión indicadora (CT, MRI, etcétera) que se hace en cada visita hasta la progresión de la enfermedad . 9. TSH, anticuerpo anti- tiroglobulina, y se debe someter a prueba la tiroglobulina en cada visita hasta la progresión de la enfermedad. 10. Visitas en las Semanas 20, 28, 36, 44, y 52 que se conducen solamente si no se ha presentado la progresión de la enfermedad antes de la visita 11. Contacto telefónico se realizará cada 2 meses después de la semana 12 o la progresión de la enfermedad (lo que se presente después) hasta un año después del enrolamiento del estudio.
La tiroglobulina se va a someter a prueba cada 2 meses hasta 13 meses después de la dosificación o hasta la progresión, lo que se presente primero.
Ejemplo IV Efecto de la administración del Ad5PPE-l-3X-fás quimera combinado con Quimioterapia A fin de evaluar el efecto oncolítico terapéutico combinado del Ad5PPE-l-3X-fas quimera y la quimioterapia en el tamaño de tumor en el cáncer, se selecciono la administración sistémica del Ad5PPE-i-3X-fas quimera y la quimioterapia concomitante en el modelo de Carcinoma Pulmonar de Lewis que se forma en metástasis rápidamente.
El modelo de Cáncer pulmonar de Lewis proporciona un método para observar los efectos del tratamiento en cáncer metastásico, establecido.
El Sunitinib (Sutent) fija como objetivo la tiroxina cinasa, e inhibe la acción de VEGF, produciendo un efecto angiogénico, y se utiliza, entre otros, en tumores estromales y cáncer de células renales avanzado.
Efectos anti-metastásicos de una sola dosis sistémica de Ad5PPE-l-3X-fas quimera y sunitinib oral en ratones que llevan metástasis pulmonar: Ratones machos C57BL/6 (13 a 19 en cada grupo) de 8 semanas de edad se inocularon con 5X105 de células LLC en almohadilla plantar izquierda. La pata se amputó bajo anestesia general tan pronto como el tumor primario se desarrolló a 7 mm. 2 días (después de la amputación de la pata) una sola inyección intravenosa de Ad5PPE-l-3X-fas quimera (109 o 1011 de partículas de virus) se administró a través de la vena de la cola. Después de recibir el vector, se administró un régimen diario de sunitinib oral, 40 u 80 mg/kg una vez al día, en los días 1-5, 8-13 y 16-17. El sacrificio del ratón se programó para el día 22 después de la remoción del tumor primario. El bienestar del ratón se supervisó diariamente mediante observación y peso. Resultados (Carga tumoral) se relaciona con la masa tumoral, en gramos (conocida como Carga Tumoral) .
Las Figuras 13A y 13B detallan los resultados de los dos grupos de los ratones metastásicos que reciben la terapia de combinación, comparado con cada modo de tratamiento sólo. Mientras que un efecto de dosis de los tratamientos se podría discernir en la carga tumoral de los ratones que reciben 80 mg/kg de sunitinib comparados con aquellos que reciben 40 mg/kg de sunitinib, y en la carga tumoral de los ratones que reciben 1011 de Ad5PPE-l-3X fas-c comparados con aquellos que reciben 109 de Ad5PPE-l-3X fas-c, los resultados de la combinación de los dos modos de tratamiento revela una diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) entre el grupo de control y todos los grupos de tratamiento, la carga tumoral media en el grupo de control que es significativamente mayor que cada uno de los otros grupos. La dosis viral alta (1011 de partículas de virus) y el tratamiento de combinación de dosis baja (109 de partículas de virus y 80 mg/kg de sunitinib) , se descubrió que son más efectivos en la reducción en la carga tumoral, dando por resultados una carga tumoral estadísticamente más baja que aquella de ya sea de los grupos de 109 de partículas de virus y 40 mg/kg de sunitinib. Estos grupos de combinación también mostraron variabilidad reducida y registros generalmente inferiores, comparados con los otros grupos experimentales . Los resultados muestran que el tratamiento combinado del AdPPE-l-3X-fas-quimera sistémicamente suministrado + sunitinib oral es efectivo contra la enfermedad metastásica.
Tomados con untamente, estos resultados indican que cuando se administran en combinación con protocolos de quimioterapia clínicos actualmente empleados, el Ad5PPE-l-3X fas-c puede incrementar su efectividad terapéutica y permite potencialmente una dosificación y frecuencia reducida de tratamientos .
Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica. Por consiguiente, se propone abarcar todas esas alternativas, modificaciones y variaciones que se encuentran dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. 1 Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción se incorporan en este documento en su totalidad a manera de referencia en descripción, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fueran específica e individualmente indicadas a ser incorporadas en este documento a manera de referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se debe considerar como una admisión que está referencia sea disponible como técnica anterior a la presente invención. Al grado en que los títulos de las secciones' se utilicen, no se deben considerar como necesariamente limitantes.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (87)

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación, en donde el vector comprende un polinucleótido que comprende un transgen fas-quimera enlazado transcripcionalmente a un promotor de pre-proendotelina de murino, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos 1X108 de partículas de virus.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X109 a aproximadamente 1X1016 de partículas de virus.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 3X1012 de partículas de virus.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 2.
7. El método de conformidad ' con la reivindicación 1, caracterizado porque el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO : .3.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 8 ·
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 7.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor de pre-proendotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor de pre-proendotelina de murino comprende además un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de ' adenovirus no de replicación es un vector de adenovirus 5.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de adenovirus. comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor sólido es un cáncer.
18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor primario .
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor metastásico.
20. El método de conformidad con la reivindicación ¦ 1, caracterizado porque el vector de adenovirus se administra sistémicamente .
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el yector se administra sistémicamente por una vía seleccionada del grupo que consiste de administración intra-articular, administración intravenosa, administración intraperitoneal , administración subcutánea, infusión, administración oral, administración rectal, administración nasal e inhalación.
22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende administrar el vector de adenovirus en por lo menos dos dosis sistémicas separadas.
23. El método de conformidad . con la reivindicación 1, caracterizado porque el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración.
24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una cantidad de anticuerpos anti -adenovirus en suero se incrementa después de la administración, el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
25. Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido ' que comprende un transgen fas-quimera enlazado transcripcionalmente a un promotor de pre-proendotelina de murino, el vector de adenovirus que comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X108 a aproximadamente 1X1016 de partículas de virus.
27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 3X1012 de partículas de virus.
29. El método de conformidad cón la reivindicación · 25, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tumor sólido es un cáncer .
31. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor metastásico.
32. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor primario.
33. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el vector de adenovirus se administra sistémicamente .
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el vector se administra sistémicamente el vector se administra sistémicamente por una vía seleccionada del grupo que consiste de administración intra-articular, administración intravenosa, administración intraperitoneal , administración subcutánea, infusión, administración oral, administración rectal, administración nasal e inhalación.
35. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende administrar el vector de adenovirus en una primera dosis y por lo menos una. segunda dosis adicional, en donde la primera dosis es suficiente para inducir anticuerpos anti-Ad5 en el sujeto, y en donde el tiempo entre la administración de la primera dosis y la por lo menos una segunda dosis es suficiente para la formación de anticuerpos anti-Ad5 en el sujeto.
36. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque una cantidad de anticuerpos de anti -adenovirus en suero se incrementa después de la administración, y el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
38. Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, en por lo menos dos dosis separadas, una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que comprende un transgen fas-quimera enlazado transcripcionalmente a un promotor de pre-proendotelina de murino en donde la adminis ración no induce un incremento dependiente de 'dosis en los anticuerpos contra el vector adenoviral en el sujeto.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X108 a aproximadamente 1X1016 de partículas de virus.
40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 3X1012 de partículas de virus.
42. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus . .
43. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO : 2.
44. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3.
45. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el transgen fas-quimera comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4.
46. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6.
47. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 8.
48. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 7.
49. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
50. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor pre-pro endotelina de murino comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12.
51. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor pre-proendotelina de murino comprende además un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5.
52. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el vector de adenovirus no de replicación es un vector de adenovirus 5.
53. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el vector de adenovirus 5 comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
54. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el tumor sólido es un cáncer.
55. El método de conformidad con la reivindicación 3.8, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor primario .
56. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor metastásico.
57. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el vector de adenovirus se administra sistémicamente .
58. El . método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el vector se administra sistémicamente por una vía seleccionada del grupo que consiste de administración intra-articular , administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración subcutánea, infusión, administración oral, administración rectal, administración nasal e inhalación.
59. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el adenovirus se detecta . en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque una cantidad de anticuerpos anti-adenovirus en suero se incrementa después de la administración, el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
61. Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, el método caracterizado porque comprende administrar al sujeto una sola dosis intravenosa de 3X1012 o 1X1012 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación vector que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor canceroso.
63. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor primario.
64. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el tumor sólido es un tumor metastásico.
65. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la administración de la dosis del vector de adenovirus inhibe la angiogénesis de.l tumor.
66. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la administración de la dosis del adenovirus inhibe el crecimiento de tumor.
67. El método de conformidad con la reivindicación .61, caracterizado porque el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el sujeto tienen anticuerpos anti-adenovirus en suero elevados comparados con los niveles de anticuerpo anti-adenovirus antes del tratamiento, y el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
69. Un método para tratar un cáncer de tiroides en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una sola dosis intravenosa de 3X1012 o 1X1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
71. Un método para tratar un cáncer neuroendocrino en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una sola dosis intravenosa de 3X1012 o 1X1013 de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 9 o 10.
72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
73. Un kit para tratar un tumor sólido en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende una dosificación unitaria de partículas de virus de un vector de adenovirus no de replicación vector que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ED NO: 9 o 10, en donde el vector de adenovirus no de replicación se formula para administración intravenosa, e instrucciones para la administración del adenovirus.
74. El kit de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la dosificación unitaria comprende aproximadamente 3X1012 de partículas de virus.
75. El kit de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la dosificación unitaria comprende por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus .
76. Un método para administrar una composición terapéutica caracterizado porque comprende un vector adenoviral a un sujeto, que se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición al sujeto por lo menos dos veces, en donde la administración no induce un incremento dependiente de dosis en los anticuerpos an i-adenovirus contra el vector adenoviral en el sujeto.
77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X108 a aproximadamente 1X1016 de partículas de virus.
78. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1011 a aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
79. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 3X1012 de partículas de virus .
80. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos aproximadamente 1X1013 de partículas de virus.
81. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 4 días después de la administración.
82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque una cantidad de anticuerpos anti-adenovirus en suero se incrementa después de la administración, y el adenovirus se detecta en la sangre del sujeto por lo menos aproximadamente 21 días después de la administración.
83. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 72, caracterizado porque el sujeto está recibiendo adicionalmente un agente quimioterapéutico así como también tratamiento con las partículas de virus del vector de adenovirus no de replicación .
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se administra antes del tratamiento con las partículas de virus.
85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se administra concomitantemente con el tratamiento con las partículas de virus.
86. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se administra después del tratamiento con las partículas de virus.
87. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es sunitinib.
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