MX2011004670A

MX2011004670A - Modulacion de la expresion del receptor 2 tipo larga distancia por oligonucleotidos antisentido.

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Publication number: MX2011004670A
Application number: MX2011004670A
Authority: MX
Inventors: Sudhir Agrawal; Ekambar Kandimalla; Lakshmi Bhagat; Dong Yu; Daqing Wang; Mallikarjuna Putta
Original assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-11-04
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2011-05-25
Also published as: CA2742596A1; AU2009313600A1; EP2352527A1; US20100111935A1; CN102271714A; WO2010053971A1; KR20110081336A; JP2012508241A

Abstract

Se proporcionan compuestos de oligonucleótido antisentido, composiciones y métodos para la subregulación de la expresión de TLR2; las composiciones comprenden oligonucleótidos antisentido dirigidos a ácidos nucleicos que codifican TLR2; las composiciones también pueden comprender oligonucleótidos antisentido dirigidos a ácidos nucleicos que codifican TLR2 en combinación con otros compuestos y/o composiciones terapéuticos y/o profilácticos; se proporcionan métodos para usar estos compuestos y composiciones para la subregulación de la expresión de TLR2, y para la prevención o el tratamiento de enfermedades en las que resultaría benéfica la modulación de la expresión de TLR2.

Description

MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL RECEPTOR 2 TIPO LARGA DISTANCIA POR OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO Esta solicitud reclama el beneficio de la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61/111 ,143, presentada el 04 de noviembre de 2008, cuya descripción se incorpora a la presente explícitamente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al receptor 2 tipo larga distancia (TLR2). En particular, la invención se refiere a oligonucleótidos antisentido que se hibridan específicamente con ácidos nucleicos que codifican para TLR2, modulando de esta manera la expresión y actividad de TLR2, y su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con TLR2, o en donde la modulación de la expresión de TLR2 sería benéfica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores tipo larga distancia (TLRs) están presentes en muchas células del sistema inmune, y se ha mostrado que están implicados en la respuesta inmune innata (Hornung, V. et al. (2002) J. Immunol. 168:4531-4537). Los TLRs son un medio clave por el cual los mamíferos reconocen y montan una respuesta inmune a moléculas extrañas, y proveen también un medio por el cual las respuestas inmunes innata y adaptativa son enlazadas (Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001 ) Nature Rev. Immunol. 1 : 135-145). En vertebrados, esta familia consiste de por lo menos 11 proteínas denominadas TLR1 a TLR1 1 , las cuales son conocidas por reconocer patrones moleculares asociados con el patógeno (PAMP) de bacterias, hongos, parásitos y virus, e inducen una respuesta inmune mediada por muchos factores de transcripción.

Algunos TLRs se localizan sobre la superficie de la célula para detectar e iniciar una respuesta a los patógenos extracelulares, y otros TLRs se localizan dentro de la célula para detectar e iniciar una respuesta a los patógenos intracelulares. El cuadro 1 provee una representación de los TLR, los agonistas conocidos para los mismos y los tipos celulares conocidos por contener el TLR (Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303: 1529-1531 ; Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499; Lee J et al. (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:6646-6651 ); (Alexopoulou, L. (2001 ) Nature 413:732-738).

CUADRO 1 La vía de transducción de señales mediada por la interacción entre un ligando y un TLR es compartida entre la mayoría de los miembros de la familia de TLR, e implica un receptor de IL-1 de larga distancia (dominio de TIR), el marcador de diferenciación mieloide 88 (MyD88), cinasa asociada con IL-1 R (IRAK), factor regulador del interferón (IRF), factor asociado con el receptor del FNT (TRAF), cinasa 1 activada por 1GF , cinasa ???, ??? y NF- ?? (véase, por ejemplo: Akira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278:38105 y Geller et al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5:29-38). Más específicamente, para los TLRs 1 , 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 11 , esta cascada de señalización comienza con un ligando de PAMP que interactúa con el TLR unido a la membrana (al cual activa), el cual existe como un homodímero en la membrana endosómica o la superficie de la célula. Después de la activación, el receptor sufre un cambio de conformación que permite el reclutamiento del dominio de TIR que contiene a la proteína MyD88, la cual es una proteína adaptadora que es común a todas las vías de señalización de TLR, salvo TLR3. MyD88 recluta a IRAK4, que fosforila y activa a IRAK1. La IRAK1 activada se une con TRAF6, que cataliza la adición de poliubiquitina en TRAF6. La adición de ubiquitina activa el complejo TAK/TAB, el cual a su vez fosforila los IRF, resultando en la liberación y transporte de NF-kB al núcleo. NF-?? en el núcleo induce la expresión de genes proinflamatorios (véase, por ejemplo, Trinchieri y Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7 : 179-190).

La localización selectiva de los TLR y la señalización generada de la misma, provee cierto entendimiento de su papel en la respuesta inmune. La respuesta inmune incluye tanto la respuesta innata como la adaptativa con base en el subjuego de células incluidas en la respuesta. Por ejemplo, las células auxiliares T (Th) implicadas en funciones clásicas mediadas por células, tales como la hipersensibilidad de tipo retardado y la activación de linfocitos T citotóxicos (CTLs), son células Th1. Esta respuesta es la respuesta innata del cuerpo al antígeno (por ejemplo, en infecciones virales, patógenos intracelulares y células tumorales), y resulta en una secreción de IFN-gamma y una activación concomitante de CTLs. El TLR2 es conocido por localizarse en la membrana celular y se activa por lipidos, proteínas y azúcares presentes en la pared celular de los patógenos, incluyendo pero no limitándose a lipopolisacáridos y peptidoglicanos. El TLR2 ha demostrado discriminarse entre los tipos de patógenos dentro de fagosomas (Underhill et al. (1999) Nature 401 :811 -815). Se cree que esta capacidad para distinguir entre los patógenos permiten que el TLR2 genere diferentes respuestas a citocinas y quimiocinas en diferentes células inmunes, que a su vez pueden determinar la naturaleza de las respuestas inmune innatas y adaptativas.

Como un resultado de su entorno en la regulación de la respuesta inflamatoria, los TLR mostraron desempeñar el papel en la patogénesis de muchas enfermedades, incluyendo la autoinmunidad, enfermedad infecciosa e inflamación (Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-318; Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6:223-235; Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:813-823; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975- 979; Tse and Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30:53-62; Tobías & Curtiss (2008) Semín. Immunopathol. 30:23-27; Ropert et al. (2008) Semín. Immunopathol. 30:41-51 ; Lee et al. (2008) Semín. Immunopathol. 30:3-9; Gao et al. (2008) Semín. Immunopathol. 30:29- 40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30 :1 1-21). Mientras que la activación de los TLRs está implicada en el montaje de una respuesta inmune, una estimulación no controlada o no deseada del sistema inmune a través de los TLRs puede exacerbar ciertas enfermedades en sujetos inmunocomprometidos, o puede causar inmunoestimulación no deseada. De este modo, la expresión y/o la actividad de TLR de subregulación pueden proveer medios útiles para la intervención de enfermedades.

A la fecha, las estrategias de investigación dirigidas selectivamente a inhibir la actividad de TLR han involucrado pequeñas moléculas (W0/2005/007672), anticuerpos (ver por ejemplo: Duffy, K. et al. (2007) Cell Immunol. 248: 103 -114), tecnologías de iARN catalítico (por ejemplo, ARN inhibidores pequeños), ciertas moléculas antisentido (Caricilli et al. (2008) J. Endocrinology 199:399), y la inhibición competitiva con oligonucleótidos modificados o metilados (ver por ejemplo: Kandimalla et al. US2008/0089883; Barrat and Coffman (2008) Immunol. Rev. 223:271- 283). Por ejemplo, se ha mostrado que la cloroquina y la hidroxilcloroquina bloquean la señalización de TLR endosómica subregulando la maduración de los endosomas (Krieg, A. M. (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:709). También, Huang et al. mostró el uso de ARNsi de TLR4 para invertir la supresión mediada por el tumor de la proliferación de células T y la actividad de las células asesinas naturales (Huang et al. (2005) Cáncer Res. 65:5009-5014), y el uso del ARNsi de TLR9 para prevenir la inflamación del ojo inducida por bacterias (Huang et al. (2005) Invest. Opthal. Vis. Sci. 46 :4209-4216).

Adicionalmente, muchos grupos han utilizado oligodesoxinucleótidos sintéticos que tienen dos secuencias de triplete, un triplete "CCT" proximal y un triplete "GGG" distal, una secuencia poli "G" (ej.

"GGGG" o "GGG") o secuencias "GC" que interactúan con ciertas proteínas intracelulares, dando como resultado la inhibición de la señalización de TLR y la producción y la liberación concomitantes de citocinas pro-inflamatorias (ver por ejemplo: Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621 -631 ; Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 6:3273-3280), Gursel, I., et al. (J. Immunol., 171 : 1393-1400 (2003), Shirota, H., et al., J. Immunol., 173: 5002-5007 (2004), Chen, Y., et al., Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. (2002) 32: 1212-1222 ; Kandimalla et al. WO2007/7047396). Sin embargo, se ha mostrado que sartas de oligonucleótidos que contienen guanosina forman estructuras tetraplex, actúan como aptámeros e inhiben la actividad de la trombina (Bock LC et al., Nature, 355: 564-6, 1992; Padmanabhan, K et al., J Biol Chem., 268(24): 17651-4, 1993). De esta manera, la utilidad de estas moléculas de oligodesoxinucleótidos inhibidoras puede no ser factible en pacientes.

Un enfoque potencial para inhibir, suprimir o subregular la expresión TLR es tecnología antisentido. La historia de desarrollar tecnología antisentido indica que aunque el diseño y prueba de oligonucleótidos antisentido que hibridan ARN objetivo es un ejercicio relativamente sencillo, sólo unos cuantos oligonucleótidos antisentido trabajan según lo destinado y no es predecible la optimización de los oligonucleótidos antisentido que tienen verdadero potencial como candidatos clínicos. Un experto en la técnica reconocería que al momento de optimizar oligonucleótidos antisentido, la concepción de la correcta secuencia y longitud de los oligonucleótidos, y el uso de las químicas apropiadas de ácido nucleico y oligonucleótido no es fácilmente evidente. Sin embargo, la formulación de estos componentes es crucial para la utilidad de cualquier oligonucleótido antisentido (Stein and Cheng, 1993, Science 261 : 1004-1012). Un experto en la técnica reconocería además que sin concebir la correcta secuencia, la correcta longitud, y utilizando las químicas apropiadas de ácido nucleico y oligonucleótido, el oligonucleótido antisentido puede tener efectos fuera de objetivo y puede ocasionar, entre otras cosas, que la molécula sea inestable, inactiva, no específica, y tóxica. Como resultado de la naturaleza impredecible de los oligonucleótidos antisentido, hasta la fecha, solamente un oligonucleótido antisentido ha recibido la aprobación para uso en humanos, y actualmente ningún oligonucleótido antisentido está siendo comercializado para uso humano.

Por consiguiente, existe la necesidad en el campo de oligonucleótidos antisentido optimizados que subregulen o inhiban de manera más eficiente la expresión génica. En particular, existe la necesidad en el campo de oligonucleótidos antisentido que subregulen la expresión de TLR2 y que sean estables, activos, de objetivo específico, no tóxicos y que no activen una respuesta inmune innata. Una molécula con tales características superaría los problemas que anteriormente han evitado que se desarrollen oligonucleótidos antisentido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida, entre otras cosas, a oiigonucleótidos antisentido sintéticos optimizados que son dirigidos hacia un ácido nucleico que codifica para TLR2, y que inhiben eficientemente la expresión de TLR2 a través de la inhibición de la traducción del ARNm y/o a través de un mecanismo mediado por ribonucleasa H.

En un primer aspecto, los oiigonucleótidos antisentido optimizados de acuerdo con la invención incluyen aquellos que tienen las SEQ ID NOs: 1 1 , 23, 69, 94, 98, 11 1 , 127 o 158.

En otro aspecto, la invención provee una composición que comprende por lo menos un oligonucleótido antisentido optimizado de acuerdo con la invención, y un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable.

En otro aspecto, la invención provee un método para inhibir la expresión de TLR2. En este método, un oligonucleótido o múltiples oiigonucleótidos de la invención se ponen en contacto o se hibridan específicamente con el ARNm de TLR2 ya sea in vitro o en una célula.

En otro aspecto, la invención provee métodos para inhibir la expresión de TLR2 en un mamífero, en particular un humano, dichos métodos comprendiendo administrar al mamífero un compuesto o composición de conformidad con la invención.

En otro aspecto, la invención provee un método para inhibir una respuesta inmune mediada por TLR2 en un mamífero, el método comprendiendo administrar al mamífero un oligonucleótido antisentido de TLR2 de conformidad con la invención, en una cantidad farmacéuticamente efectiva.

En otro aspecto, la invención provee un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene una enfermedad mediada por TLR2, dicho método comprendiendo administrar al mamífero, en particular un humano, un oligonucleótido antisentido de TLR2 de la invención, o una composición del mismo, en una cantidad farmacéuticamente efectiva.

En otro aspecto, la invención provee métodos para prevenir una enfermedad o trastorno en un mamífero, en particular un humano, en riesgo de que contraiga o que desarrolle una enfermedad o trastorno mediado por TLR2. Tales métodos comprenden administrar al mamífero un oligonucleótido antisentido de conformidad con la invención, o una composición del mismo, en una cantidad profilácticamente efectiva.

En otro aspecto, la invención provee un método para inhibir la expresión y la actividad de TLR2 en un mamífero, que comprende administrar al mamífero un oligonucleótido antisentido complementario al ARNm de TLR2 y un antagonista de la proteína de TLR2, un inhibidor de cinasa o un inhibidor de la proteína de transducción y transcripción de señal (STAT).

Los oligonucleótídos y métodos en cuestión descritos en la presente son también útiles para examinar la función del gen de TLR2 en una célula o en un mamífero control o en un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno asociado con TLR2 o inmunoestimulación a través de TLR2. A la célula o al mamífero se le administra el oligonucleótido, y se examina la expresión del ARNm o proteína de TLR2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un esquema sintético para la síntesis lineal de los oligonucleótidos antisentido de la invención. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.

La figura 2 muestra la secuencia nucleotídica de ARNm de TLR2 humano [SEQ. ID NO:171] (Genbank No. de Acceso N 003264).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a mejorar los oligonucleótidos antisentido de TLR2, las composiciones que comprenden tales oligonucleótidos y los métodos de su uso para inhibir o suprimir una respuesta inmune mediada por TLR2. De manera más específica, los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la invención son estables, activos, de objetivo específico, no tóxicos y no activan una respuesta inmune innata. Se proveen también composiciones farmacéuticas y otras composiciones que comprenden los compuestos de conformidad con la invención. Se proveen además métodos para subregular la expresión de TLR2 en células o tejidos, que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención solos o en combinación con otras composiciones profilácticas o terapéuticas.

Específicamente, la invención provee oligonucleótidos antisentido diseñados para ser complementarios a una región genómica o una molécula de ARN transcrita de los mismos. Estos oligonucleótidos antisentido de TLR2 son estables, de objetivo específico y tienen secuencias únicas que resultan en la molécula que se inhibe máximamente efectiva o suprime la señalización mediada por TLR2 en respuesta a los ligandos de TLR2 endógenos y/o exógenos o agonistas de TLR2.

Los oligonucleótidos antisentido de TLR2 de conformidad con la invención, inhiben respuestas inmunes inducidas por agonistas de TLR2 naturales o artificiales en varios tipos de células y en varios modelos experimentales in vitro e in vivo. Como tales, las composiciones antisentido de conformidad con la invención son útiles como herramientas para estudiar el sistema inmune, así como para comparar los sistemas inmunes de diversos mamíferos, tales como humanos y ratones.

Provistos además son métodos para tratar a un mamífero, en particular un humano que tiene, que se sospecha que tiene o que está propenso a desarrollar, una condición o enfermedad asociada con la activación de TLR2, administrando una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención. Ya que TLR2 se ha identificado como un importante iniciador de respuestas inflamatorias (véase, por ejemplo: Leemans et al., (2005) J. Clin. Invest. 115:2894-2903), los oligonucleótidos antisentido optimizados y composiciones de acuerdo con la invención se pueden usar para aplicaciones en inmunoterapia tales como, pero no limitadas a, tratamiento de cáncer, trastornos autoinmunes, asma, alergias respiratorias, alergias a alimentos, alergias de la piel, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis, pleuresía, infecciones crónicas, enfermedades inflamatorias, síndrome inflamatorio del intestino, sepsis, malaria e infecciones por bacterias, parásitos y virus en aplicaciones en veterinaria y en humanos pediátricos y adultos. Además, los oligonucleótidos antisentido de TLR2 de la invención son útiles en la prevención y/o el tratamiento de varias enfermedades, ya sea solos, en combinación con o co-administrados con otros fármacos o composiciones profilácticas o terapéuticas, por ejemplo, vacunas de ADN, antígenos, anticuerpos y alérgenos; y en combinación con agentes quimioterapéuticos (tanto quimioterapia tradicional como terapias dirigidas modernas) y/o antagonistas de TLR2 para la prevención y el tratamiento de enfermedades. Los oligonucleótidos antisentido de TLR2 de la invención son útiles en la combinación con compuestos o fármacos que tienen propiedades inmunoestimuladoras mediadas por TLR2 no deseadas.

Los objetivos de la presente invención, sus diversas características, así como la propia invención se puede entender de manera más completa a partir de la siguiente descripción, cuando se lea junto con los dibujos anexos en los cuales los siguientes términos tienen el significado atribuido.

El término "2'-0-sustituido", significa sustitución de la posición 2' de la porción de pentosa con un grupo -O-alquilo inferior que contiene 1 a 6 átomos de carbono saturados o insaturados (por ejemplo, pero no limitado a, 2'-0-metilo), o con un grupo -O-arilo o alilo que tiene 2 a 6 átomos de carbono, en donde dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede ser no sustituido o puede ser sustituido (por ejemplo, con grupos 2'-0-etoxi-metilo, halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o amino), o con un grupo hidroxi, un grupo amino o un grupo halo, pero no con un grupo 2'-H. En algunas modalidades, los oligonucleótidos de la invención incluyen cuatro o cinco ribonucleótidos de 2'-0-alquilo en su terminal 5', y/o cuatro o cinco ribonucleótidos de 2'-0-alquilo en su terminal 3'. En las modalidades ejemplares, los nucleótidos de los oligonucleótidos sintéticos son enlazados por cuando menos un enlace internucleótido de fosforotioato. Los enlaces de fosoforotioato pueden ser enantiómeros Rp y Sp mezclados o pueden ser estereorregulares o sustancialmente estereorregulares en la forma Rp o Sp (ver lyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry 6:1051-1054).

El término "3"', cuando se usa direccionalmente, se refiere generalmente a una región o posición en un polinucleótido u oligonucleótido 3' (hacia el extremo 3' del nucleótido) de otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido.

El término "5"\ cuando se usa direccionalmente, se refiere generalmente a una región o posición en un polinucleótido u oligonucleótido 5' (hacia el extremo 5' del nucleótido) de otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido.

El término "aproximadamente" por lo general significa que el número exacto no es crítico. Así, los oligonucleótidos que tienen uno o dos residuos de nucleósido menos, o de uno a varios residuos de nucleósido adicionales, están contemplados como equivalentes para cada una de las modalidades que se describieron antes.

El término "agonista" generalmente se refiere a una sustancia que une a un receptor de una célula e induce una respuesta. Un agonista generalmente imita la acción de una sustancia que sucede de manera natural tal como un ligando.

El término "antagonista" generalmente se refiere a una sustancia que atenúa los efectos de un agonista.

El término "inflamación de vías respiratorias" incluye generalmente, sin limitación, inflamación en el tracto respiratorio causada por alérgenos, incluyendo asma.

El término "alérgeno" generalmente se refiere a un antígeno o porción antigénica de una molécula, comúnmente una proteína, que obtiene una respuesta alérgica con la exposición a un sujeto. Generalmente, el sujeto es alérgico al alérgeno como se indicó, por ejemplo, mediante la prueba de pápulas y reacción eritematosa o cualquier método conocido en la técnica. Se dice que una molécula es un alérgeno incluso si únicamente un pequeño subconjunto de sujetos muestra una respuesta inmune alérgica con la exposición a la molécula (por ejemplo, IgE).

El término "alergia" generalmente incluye, sin limitación, alergias a alimentos, alergias respiratorias y alergias en la piel.

El término "antígeno" generalmente se refiere a una sustancia que se reconoce y une selectivamente a un anticuerpo o mediante un receptor antígeno de células T. Los antígenos pueden incluir, pero no estar limitados a péptidos, proteínas, nucleósidos, nucleótidos y combinaciones de los mismos. Los antígenos pueden ser naturales o sintéticos y generalmente inducen una respuesta inmune que es específica para ese antígeno.

El término "trastorno autoinmune" se refiere generalmente a trastornos en los cuales el "auto" antígeno sufre ataque por el sistema inmune. Dicho término incluye, sin limitación, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo I, síndrome de intestino irritable, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, choque séptico, alopecia universal, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, penfigoide ampollar, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad celíaca, dermatomiositis, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurada, púrpura trombocitopénica idiopática, cistitis intersticial, morfea, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, esquizofrenia, síndrome de Sjógren, arteritis temporal ("arteritis de células gigantes"), vasculitis, vitíligo, vulvodinia y granulomatosis de Wegener, asma autoinmune, choque séptico y psoriasis.

El término "cáncer" se refiere generalmente a, sin limitación, cualquier crecimiento o tumor maligno causado por proliferación y/o división celular anormal o sin control. Los cánceres pueden suceder en humanos y/o mamíferos y puede surgir en cualquier y todos los tejidos. Tratar un paciente que tiene cáncer puede incluir la administración de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención de tal manera que la proliferación y/o división celular anormal o descontrolada, o metástasis se ven afectadas.

El término "vehículo" abarca generalmente cualquier excipiente, diluyente, llenador, sal, regulador de pH, estabilizador, solubilizador, aceite, lípído, vesícula que contenga lípido, microesferas, encapsulación liposomal u otro material bien conocido en la técnica para su uso en formulaciones farmacéuticas. Se entenderá que las características del vehículo, excipiente o diluyente dependerán de la vía de administración para una aplicación particular. La preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos materiales se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

El término "co-administración" o "co-administrado" se refiere generalmente a la administración de por lo menos dos sustancias diferentes suficientemente cercanas en tiempo para modular una respuesta inmune. El término co-administración se refiere a administración simultánea, asi como del orden temporalmente espaciado, de hasta varios días, de por lo menos dos sustancias diferentes en cualquier orden, ya sea en una dosis individual o en dosis separadas.

El término "en combinación con" significa generalmente administrar un compuesto de conformidad con la invención y otro agente útil para tratar la enfermedad o condición, que no suprima la actividad antisentido de TLR2 del compuesto en el curso de tratamiento de un paciente. Dicha administración puede hacerse en cualquier orden, incluyendo administración simultánea, así como orden temporalmente espaciado desde unos cuantos segundos hasta varios días. Dicho tratamiento de combinación puede incluir también más de una administración individual del compuesto de conformidad con la invención y/o independientemente del otro agente. La administración del compuesto de conformidad con la invención y el otro agente puede ser por la misma vía o vías diferentes.

Los términos "individuo" o "sujeto" o "paciente" o "vertebrado" se refieren generalmente a un mamífero, tal como un humano.

Los términos "inhibir" o "suprimir" o "subregular" cuando se utilizan con referencia a la expresión, se refieren en general a una disminución de una respuesta o una diferencia cualitativa en una respuesta, que de otro modo podrían surgir a partir de la provocación y/o estimulación de un respuesta.

El. término "inhibidor de cinasa" generalmente se refiere a las moléculas que antagonizan o inhiben la señalización celular que depende de la fosforilación y/o trayectorias de crecimiento en una célula. Los inhibidores de cinasa pueden ser los que suceden naturalmente o de manera sintética e incluyen moléculas pequeñas que tienen el potencial de administrarse como terapéuticos orales. Los inhibidores de cinasa tienen la capacidad de inhibir rápidamente y específicamente la activación de las molécula de cinasa objetivo. Las proteínas cinasas son objetivos de fármaco atractivo, en parte porque regulan una amplia variedad de trayectorias de señalización y crecimiento e incluyen muchas diferentes proteínas. De este modo, tienen gran potencial en el tratamiento de enfermedades que incluyen la señalización de cinasa, incluyendo cáncer, enfermedad cardiovascular, trastornos inflamatorios, diabetes, degeneración macular y trastornos neurológicos. Los ejemplos de inhibidores de cinasa incluyen, pero no se limitan a, sorafenib (Nexavar®), Sutent®, dasatinib, Dasatinib™, Zactima™, Tykerb™ y STI571.

El término "síntesis lineal" se refiere generalmente a una síntesis que se inicia en un extremo de un oligonucleótido y progresa linealmente hacia el otro extremo. La síntesis lineal permite la incorporación de unidades monoméricas idénticas o no idénticas (en términos de longitud, composición de bases y/o modificaciones químicas incorporadas) en un oligonucleótido.

Se pretende expresamente que el término "mamífero" incluya animales vertebrados de sangre caliente que incluyen, sin limitación, humanos, primates no humanos, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ganado, vacas, cerdos, ovejas y conejos.

El término "nucleósido" se refiere generalmente a compuestos que consisten de un azúcar, usualmente ribosa o desoxirribosa, y una base de purina o pirimidina.

El término "nucleótido" se refiere generalmente a un nucleósido que comprende un grupo que contiene fósforo unido al azúcar.

El término "nucleósido modificado" se refiere generalmente a un nucleósido que incluye una base heterocíclica modificada, una porción de azúcar modificada, o cualquier combinación de las mismas. En algunas modalidades, el nucleósido modificado es un nucleósido de purina o pirimidina no natural, como se describe en la presente. Para los propósitos de la invención, los términos un nucleósido modificado, un análogo de purina o pirimidina o purina o pirimidina de ocurrencia no natural pueden usarse recíprocamente, y se refieren a un nucleósido que incluye una base de ocurrencia no natural y/o una porción de azúcar de ocurrencia no natural. Para los propósitos de la invención, se considera que una base es no natural, si no es guanina, citosína, adenina, timina o uracilo, y un azúcar se considera como no natural, si no es ß-ribo-furanósido o 2'-desoxirribo-furanósido.

El término "oligonucleótido modificado", como se usa en la presente, describe un oligonucleótido en el cual por lo menos dos de sus nucleótidos se unen covalentemente por medio de un enlace sintético, es decir, un enlace diferente de un enlace de fosfodiéster entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido en el cual el fosfato del nucleótido 5' ha sido reemplazado con cualquier número de grupos químicos. El término "oligonucleótido modificado" abarca también oligonucleótidos que tienen por lo menos un nucleótido con una base y/o azúcar modificado, tal como un ribonucleótido 2'-0-sustituido, una 5-metilcitosina y un ribonucleótido 3'-0-sustituido.

El término "ácido nucleico" abarca una región genómica o una molécula de ARN transcrita del mismo. En algunas modalidades, el ácido nucleico es ARNm.

El término "enlace nucleotídico" se refiere generalmente a un enlace químico que une dos nucleosidos a través de sus azúcares (por ejemplo, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5', 5'-5'), consistiendo de un átomo de fósforo y un grupo cargado o neutro (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato o metilfosfonato) entre nucleosidos adyacentes.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleósido formado de una pluralidad de unidades de nucleósido enlazadas. Las unidades de nucleósido pueden ser parte de virus, bacterias, restos de células o composiciones basadas en oligonucleótidos (por ejemplo, ARNsi o microARN). Dichos oligonucleótidos pueden obtenerse también de fuentes de ácido nucleico existentes, incluyendo ADN genómico o ADNc, pero se producen de preferencia por métodos de síntesis. En ciertas modalidades, cada unidad de nucleósido incluye una base heterocíclica y un grupo de pentafuranosilo, trehalosa, arabinosa, nucleósido 2'-desoxi-2'-sustituido, arabinosa 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinosa 2'-0-sustituida o azúcar hexosa. Los residuos de nucleósido pueden acoplarse entre sí por medio de cualquiera de los numerosos enlaces intemucleósido conocidos. Dichos enlaces intemucleósido incluyen, sin limitación, enlaces de fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioéter, fosforamidato unido por puentes, metilenfosfonato unido por puentes, fosforotioato unido por puentes e intemucleósido de sulfona. El término "compuesto basado en oligonucleótidos" abarca también polinucleósidos que tienen uno o más enlaces intemucleósido estereoespecíficos (por ejemplo, enlaces de (Rp)- o (Sp)- fosforotioato, alquilfosfonato o fosfotriéster). Como se usa en la presente, se pretende expresamente que los términos "oligonucleótido" y "dinucleótido" incluyan polinucleósidos y dinucleósidos que tengan cualquiera de dichos enlaces intemucleósido, si o no el enlace comprenda un grupo fosfato. En ciertos ejemplos de modalidades, estos enlaces intemucleósido pueden ser enlaces de fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato, o combinaciones de los mismos.

Se pretende que el término "complementario a una región genómica o una molécula de ARN transcrita del mismo", signifique un oligonucleótido que se une a la secuencia de ácido nucleico bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, por apareamiento de bases de Watson-Crick (interacción entre el oligonucleótido y un ácido nucleico de cadena sencilla) o por apareamiento de bases de Hoogsteen (interacción entre el oligonucleótido y un ácido nucleico de doble cadena), o por cualquier otro medio que incluye en el caso de un oligonucleótido, unión a ARN, y causando la formación de un pseudonudo. La unión por apareamiento de bases de Watson-Crick o de Hoogsteen bajo condiciones fisiológicas, se mide como una materia práctica observando la interferencia con la función de la secuencia de ácido nucleico.

El término "péptido" se refiere generalmente a polipéptidos que son de composición y longitud suficientes para afectar una respuesta biológica, por ejemplo, producción de anticuerpos o actividad de citocinas, si o no el péptido es un hapteno. El término "péptido" puede incluir aminoácidos modificados (si o no de ocurrencia natural o no natural), en donde dichas modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, fosforilación, glucosilación, pegilación, lipidización y metilación.

El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de un compuesto de conformidad con la invención, o la actividad biológica de un compuesto de conformidad con la invención.

El término "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo de células, tejido u organismo. De preferencia, el sistema biológico es un organismo vivo, como un mamífero, particularmente un humano.

El término "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere generalmente a una cantidad suficiente para prevenir o reducir el desarrollo de un efecto biológico no deseado.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" se refiere generalmente a una cantidad suficiente para afectar un efecto biológico deseado, tal como un resultado benéfico que incluye, sin limitación, prevención, disminución, mejora o eliminación de signos o síntomas de una enfermedad o trastorno. De esta manera, la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente por ejemplo, pero no limitado a, curación de condiciones crónicas caracterizadas por inmunoestimulación. De esta manera, una "cantidad farmacéuticamente efectiva" dependerá del contexto en el cual esté siendo administrada. Una cantidad farmacéuticamente efectiva puede administrarse en una o más administraciones profilácticas o terapéuticas. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico, ya sea administrados en combinación, en serie o simultáneamente.

El término "tratamiento" se refiere generalmente a un procedimiento destinado para obtener un resultado benéfico o deseado, el cual puede incluir alivio de síntomas, o retraso o mejora de la progresión de una enfermedad.

La invención provee oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un ácido nucleico que es específico para TLR2 de humano (SEQ ID NO: 171). Los oligonucleótidos antisentido de conformidad con la invención son optimizados con respecto a (i) la región elegida como objetivo de la secuencia que codifica para el ARNm de TLR2, la región no traducida 5' o la región no traducida 3', (i¡) sus modificaciones químicas, o (iii) ambos. En algunas modalidades, los compuestos son complementarios a una región dentro de los nucleótidos 220 a 2574 de la región codificante, o nucleótidos 1-219 de la región no traducida 5' o 2575-3417 de la región no traducida 3' del ARNm de TLR2 (SEQ ID NO : 171 ).

Los oligonucleótidos antisentido de conformidad con la invención son útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades en donde la inhibición de una respuesta inmune mediada por TLR2 sería benéfica. Los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia TLR2 de conformidad con la invención que son útiles incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos antisentido que comprenden nucleótidos de ocurrencia natural, nucleótidos modificados, oligonucleótidos modificados y/u oligonucleótidos modificados en la estructura de base. Sin embargo, los oligonucleótidos antisentido que inhiben la traducción de proteínas codificadas por el ARNm pueden producir efectos biológicos no deseados que incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos antisentido insuficientemente activos, biodisponibilidad inadecuada, farmacocinética o farmacodinámica sub-óptima e inmunoestimulación. Así, el diseño óptimo de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención requiere de muchas consideraciones más allá del simple diseño de una secuencia complementaria. De esta manera, se pretende que la preparación de los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia TLR2 de conformidad con la invención incorpore cambios necesarios para limitar la interferencia de la estructura secundaria con la actividad antisentido, aumente la especificidad del objetivo del oligonucleótido, reduzca al mínimo la interacción con los factores de unión o competencia (por ejemplo, proteínas), optimice la absorción celular, estabilidad, biodisponíbilidad, farmacocinética y farmacodinámica, y/o inhiba, prevenga o suprima la activación de células inmunes.

Se determinó que la región que codifica el TLR2 humano comprende aproximadamente 2.8kB que es más abundante en los leucocitos de sangre periférica y corresponde a la proteína de aminoácidos 784 en humanos (Chaudhary et al. (1998) Blood 91 : 4020-4027). Los oligonucleótidos de la invención se diseñaron para hibridarse específicamente con porciones óptimamente disponibles de la secuencia de ácido nucleico de TLR2 que actúa más efectivamente como un objetivo para inhibir la expresión de TLR2. Estas regiones elegidas como objetivo del gen de TLR2 incluyen porciones de la región no traducida 5' o de exones conocidas. Además, límites de intrón-exón, regiones no traducidas 3' e intrones, son objetivos potencialmente útiles para la inhibición antisentido de la expresión de TLR2.

Las secuencias de nucleótidos de algunos oligonucleótidos no limitativos representativos específicos para TLR2 de humano, tienen SEQ ID NOS: 1 -170. Las secuencias de nucleótidos de los oligonucleótidos optimizados de conformidad con la invención, incluyen aquellas que tienen SEQ ID NOS: 11 , 23, 69, 94, 98, 111 , 127 o 158.

Los oligonucleótidos de la invención tienen una longitud de por lo menos 14 nucleótidos, pero de preferencia tienen una longitud de 15 a 60 nucleótidos, de preferencia de 20 a 50 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, estos oligonucleótidos contienen aproximadamente 14 a 28 nucleótidos o aproximadamente 16 a 25 nucleótidos o aproximadamente 18 a 22 nucleótidos o 20 nucleótidos. Estos oligonucleótidos se pueden preparar mediante los métodos conocidos en la técnica, como la química de fosforamidato o H-fosfonato, que se pueden llevar a cabo manualmente o por un sintetizador automático. Los oligonucleótidos antisentido de TLR2 sintéticos de la invención pueden ser modificados también de muchas maneras, sin que se comprometa su capacidad para hibridar con el ARNm de TLR2. Dichas modificaciones pueden incluir por lo menos un enlace internucleótido del oligonucleótido, siendo un alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, éster de fosfato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidato o éster de carboximetilo, o una combinación de éstos, y otros enlaces internucleótido entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido en los cuales el enlace de fosfodiéster del nucleótido 5' ha sido reemplazado con cualquier número de grupos químicos.

Por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,149,797 describe oligonucleótidos quiméricos tradicionales que tienen una región de núcleo de fosforotioato interpuesta entre regiones de flanqueo de metilfosfonato o fosforamidato. La patente de los Estados Unidos No. 5,652,356 describe oligonucleótidos quiméricos "invertidos" que comprenden una o más regiones de oligonucleótido no iónico (ej. enlace internucleósidos de alquilfosfonato y/o fosforamidato y/o fosfotriéster) flanqueados por una o más regiones de oligonucleótido fosforotioato. Se pueden preparar varios oligonucleótidos con enlaces internucleótido modificados de acuerdo con métodos estándar. Los enlaces fosforotioato pueden ser enantiómeros Rp y Sp mezclados, o se pueden hacer estereorregulares o sustancialmente estereorregulares en cualquiera de las formas Rp o Sp de acuerdo con procedimientos estándar.

También se considera que los oligonucleótidos que están auto-estabilizados son oligonucleótidos modificados útiles en los métodos de la invención (Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 20 :2729-2735). Estos oligonucleótidos comprenden dos regiones: una región de hibridación objetivo; y una región auto-complementaria que tiene una secuencia de oligonucleótidos complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos que está dentro del oligonucleótido autoestabilizado.

Otras modificaciones incluyen aquellas que son internas o están en los extremos de la molécula de oligonucleótido, e incluyen adiciones a la molécula de los enlaces de fosfato internucleósido, tales como compuestos de colesterol, colesterilo o diamina con números variables de residuos de carbono entre los grupos amino y modificaciones terminales de ribosa, desoxirribosa y fosfato que rompen, o se entrelazan con, las cadenas opuestas o con enzimas u otras proteínas asociadas que se unen al genoma. Ejemplos de dichos oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificada, tal como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido 3'-5' -sustituido que tiene un azúcar que en sus posiciones 3' y 5', está unido a un grupo químico diferente de un grupo hidroxilo (en su posición 3') y diferente de un grupo fosfato (en su posición 5').

Otros ejemplos de modificaciones a azúcares incluyen modificaciones a la posición 2' de la porción de ribosa que incluyen, pero no están limitadas a, 2'-O-sustituido con un grupo -O-alquilo que contiene 1 a 6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo o -O-alilo que tiene 2 a 6 átomos de carbono, en donde dicho grupo -O-alquilo, -O-arilo o -O-alilo puede ser no sustituido o puede ser sustituido, por ejemplo, con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo ciano, nitro acil aciloxi, alcoxi, carboxi, carboalcoxilo o amino. Se pretende que ninguna de estas sustituciones excluya el grupo 2'-hidroxilo nativo en el caso de la ribosa, o 2?-?- en el caso de la desoxirribosa.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más ribonucleótidos. Por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,652,355 describe oligonucleótidos híbridos tradicionales que tienen regiones de ribonucleótidos 2'-0-sustituidos flanqueando una región de núcleo de ADN. La patente de los Estados Unidos No. 5,652,356 describe un oligonucleótido híbrido "invertido" que incluye un oligonucleótido que comprende una región de ARN 2 -O-sustituida (o 2' OH, no sustituida) que se encuentra entre dos regiones de oligodesoxirribonucleótido, una estructura que está "invertida" con relación a los oligonucleótidos híbridos "tradicionales". Ejemplos no limitantes de oligonucleótidos particularmente útiles de la invención tienen ribonucleótidos 2 -O-alquilados en sus terminales 3', 5', o 3' y 5', con por lo menos cuatro o cinco nucleótidos contiguos modificados de esta manera. Ejemplos no limitativos de grupos 2'-O-alquilados, incluyen 2 -O-metilo, 2'-O-etilo, 2'-O-propilo, 2'-O-butilos y 2'-O-metoxi-etilo.

Otros oligonucleótidos modificados son bloqueados con un sustituyente voluminoso que confiere resistencia a nucleasas en sus extremos 3' y/o 5', o tienen una sustitución en un oxígeno que no forma puentes por nucleótido. Dichas modificaciones pueden ser en algunos o todos los enlaces ¡nternucleósido, así como en cualquier extremo o ambos extremos del oligonucleótido y/o en el interior de la molécula.

Los oligonucleótidos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más oligonucleótidos antisentido u otros compuestos que contienen ácido nucleico que no sean dirigidos hacia la misma región que la molécula antisentido de la invención. Dichos otros compuestos que contienen ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a ribozimas, moléculas de ARNi, ARNsi, ARNmi y aptámeros. Además, los oligonucleótidos de la invención pueden ser administrados en combinación con uno o más compuestos o composiciones que podrían activar una respuesta inmune mediada por TLR2 pero para la presencia del oligonucleótido antisentido de TLR2 de acuerdo con la invención. Además, los oligonucleótidos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más de vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, antagonistas de TLR, ARNsi, ARNmi, oligonucleótidos antisentido, aptámeros, péptidos, proteínas, vectores de terapia génica, vacunas de ADN, adyuvantes, inhibidores de cinasa, inhibidores de proteína STAT o moléculas co-estimuladoras, o combinaciones de los mismos.

Se muestra una lista no limitante de oligonucleótidos antisentido de TLR2 en SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 170 y el siguiente cuadro 2. Los oligonucleótidos antisentido optimizados de acuerdo con la invención incluyen aquellos que tienen SEQ ID NOS: 11 , 23, 69, 94, 98, 111 , 127 o 158. En el cuadro 2, los compuestos antisentido de TLR2 a base de oligonucleótido tienen todos enlaces fosforotioato (PS). Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que pueden usarse enlaces de fosfodiéster (PO), o una mezcla de enlaces de PS y PO.

CUADRO 2 SEQ ID NO./ Posición de Unión La orientación de la Secuencia COMO NO. Antisentido es 5'-3' GCGCTTTCTCGCTGCCTCCG CGCCGAGCAGCCGCCTGGCT CGAGCAGTCACCTGAGAGAA 61 ACCAAACACTGGGAGAACTC 81 CTn'GGATCCTGCTTGCAAC TGGGAGTCACTATAGGTCTC ACTTGGTCACTAAGAGCTCC TGAGCCCCACAGGTACCTTC TGAAAGAGCAATGGGCACAA CAACTACCAGTTGAAAGCAG 207 GTJC=CATTGTCCAGTGCUUC CATCCACAAAGTATGTGGCA ATGACCCCCAAGACCCACAC 261 CTTCCTTGGAGAGGCTGATG AGAAGCCTGATTGGAGGATT CCA ITGCGGTCACAAGACAG 321 CTGAGCTGCCCTTGCAGATA GGGAATGGAGTTTAAAGATC ACAGCTTCTGTGAGCCCTGA J81 TGGACAGCiTCAAGGCTTTTT ATGTAGGTGATCCTG1TGT CTCTGTAGGTCACTG'ITGCT AGCCTGGAGGTTCACACACC TCTTCCTCTATTGTGTTAAT 501 TGCCCAGGGAAGAAAAAGAA TTAGATAAGTAATTATAGGA TGAACCAGGAAGACGATAAA TGTTAAAGAAGAAAGGGGCT 601 TTTCCCAGTAAGTTTAAGAA CCCCTAGGG'nTTGTAAGGA ATGAGAAAAAAGAGATGTTT TGTCCATATnCCCACTCTC 721 AAACTTnTGGCTCATAGCT 801 AGCAGTAAAATATGCTGCT1" 861 901 9 1 TGTI TCACCAGTGGATAGTr AACTrTTTAATCAATGAATT TTTTCACATTTCTAAATGTA AAACAAACTTTCATCGGTGA TTCAAAAGTTTCATAACCTG C'l 'AAC AATCC G AAATCl'G 1081 TTACCAACTCCATTAAGGGT ACCTGGATCTATAACTCTGT ATTGTTAACGTTTCCACTTT TTGGAATATGCAGCCTCCGG ATCATAAAATAAGTAAAACC AGTGAATATAAAGTGCTCAG TTCTTTTAACTCTTTCTGTA TTTACTGTTTTCTACTGTGA AAACAAGGAACCAGAAAAAC GAGATCCAAGTATTCTAATG 1321 TCAACCATCAAATTTTCACT 68 1341 CTGAATTTTTCAAGTATTCT 69 1357 CAGGCATCCTCACAGGCUGA 70 1381 AAAATTAAAGTTTGTAGAGA 71 1401 ATGCCAAATGATTTTGCCTT 72 1421 C CTCCGGTTlTlTCCAATG 73 1441 TTTTTCAGAGTGAGCAAAGT 74 1461 TGATATCAATGTTAGTCAAG 75 1481 AGAATGAAAACTATTCTTAC 76 1501 CACTGACA A GTTTC AGGC AT 77 1521 AA ??'? TCATCTITl CTGGC 78 1 541 TCGTGTGCTGGATAAGTTCA 79 1 561 CAGCCTGTTACACTGTGTAT 80 1581 TTTCCAGTGTCTTGGGAATG SI 1601 GTTGTTGCTAACATCTAAAA 82 1621 AAAGAAAATAAATTGAGATT 83 1641 CTTTGAGTTGCGGCAAATTC 84 1661 ATTTCTGGAAATATAAAGTT 85 1681 TCTGGTAGAGTCATCAACTT 86 1701 ACATGGGTAAGAGGGAGGCA 87 1 721 ACTGATTTTCAATACTAGTA 88 1741 AACGTAGTTATTGCATTCCT 89 1761 AG rCAAGTl GCTCCri AGAA 90 1781 AGTCTTCAGTGTGTGAAATG 91 1801 TTATTGCCACCAGCTTCCAA 92 1821 ATTCACAGGAGCAAATGAAG 93 1841 CTCCTGAGTGAAGGAGAGGA 94 1854 CCAGTGCTTGCTGCTCCUGA 95 1881 TTGCTGGCCAATCAATCAAG 96 1901 TGGAGAGTCACACAGGTAAT 97 1921 TGCTGGCCACGCACATGGGA 98 1934 GACATCCTGAACCTGCUGGC 99 1941 AGAGGCGGACATCCTGAACC 100 1961 CCTGTGACATTCCGACACCG 101 1981 ATGCCAGACACCAGTGCTGT 102 2001 GCAGGAACAGAGCACAGCAC 103 2021 GACCCCCGTGAGCAGGATCA 104 2041 CCATGGAAACGGTGGCACAG 105 2061 TCATTTTCATATACCACAGG 106 2081 GGCCTGGAGCCAGGCCCACA 107 2101 GCTTTCCTGGGCTTCCTTTT 108 2121 AGCAGATGTTCCTGCTGGGA 109 2141 GTAAGAAACAAAT(K:ATCAT 110 2161 CAGTAGGCATCCCGCTCACT 11 1 2181 GGACCATAAGGTTCTCCACC 112 2201 ATTGAAGTTCTCCAGCTCCT 113 2221 AGACACAACTTGAAGGGGGG 114 2241 GAATGAAGTCCCGCTTATGA 11 5 2261 GTCAATGATCCACTTGCCAG 116 2281 TCAATGGAGTCAATGATA' r 117 2301 AGACAGTTTTGTGGCTCTTT 1 18 2321 AAAGTTTTCAGAAAGCACAA 1 19 2341 TTGCACCACTCACTCTTCAC 120 2361 GGGAGAAGTCCAGTTCATAC 121 2381 CTCATCAAAAAGACGGAAA I 122 2401 AGAATGGCAGCATCATTGTT 123 2421 CAATGGGCTCCAGAAGAATG 124 24 1 CTGGGG A A TGGCTTTTTTCT 125 2461 TTCCGCAGCTTGCAGAAGCG 126 2481 AGGTCT1 GGTGTTCA ITATC 127 2489 CUCCAGGTAGGTCTTGG.IJGU 128 2501 GTCCATGGGCCACTCCAGGT 129 2521 AATCCTTCCCGCTGAGCCTC 130 2541 CAGCTCTCAGATTTACCCAA 131 2561 GGGAACCTAGGACTTTATCG 132 2581 CAAAGACTGGTCTTAAATA T 133 2601 ACATAAAGATCCCAACTAGA 134 26 1 GAACTTAACTATAACTAGTG 135 2641 TTATATAATTATGTCTGAAT 136 2661 ACGGTACATCCACGTAGTTT 137 2681 AGTAAGCAAGTCCTCAAATG 138 2701 A'nTGAAG'lTTTGTAGTrn' 139 2721 AAAACA GCACCCCAG AC AAA 140 27 1 TAAATCTGGCATATGTTTAT 141 2761 AAAAACCAAAAACCAATTTT 142 2781 GGTTATCTCATAGAAAAAAG 143 2801 AGTAATAGACTTATGATCAT 144 2821 AGGGACTATATTCAGATATC 145 2841 ACCAATTCCCTTGGATACCA 146 2861 ATATCCACGAGGATCCTGCA 147 2881 TTGATCATCTATGAAT TTG 148 2901 ATGCCACTCTTATAAGGGAC 149 2921 ACAGGTTATATGCAAATACT 150 2941 AAGTATACAGG AG AATGTAC 151 2961 AGTAATCTAGAGATGATTTA 152 2981 ACATTGTATTGGGTATCATA 153 3001 CAACTATTTACATAGTATTT 154 3021 TATAAATAAAAAGACAGTA 155 30 1 AATAAAAAATAACAATAATA 156 3061 TATGTTTTAAAAATTTTGAA 157 3081 AACCAACTGTGGATCAAAAG 158 3097 CUGCATCCATGAAGTCAACC 159 3121 GTTGGCCCTCTATATCCATG 160 3141 GCCAGTTGCTACAGATTACA 161 3161 GCTGTTTCCTAATGAACTAA 162 3181 AGAATCTTAAGTTCATTTGT 163 3201 AAAGAATGACACAGTCATTG 164 3221 AGGAGTCTCTTAGCAGGAAG 165 3241 AATGCCTTTTGTGGCCACAG 166 3261 GACAGCTAGGTAGGACAGAG 167 3281 GATCAGCTGCACAGAGAAGT 168 3301 CTTTGCCTTGTTGCTCTTGA 169 3321 TTTGGGGAGTGCCCCAAATA 170 3341 TTCTAGGAATAGCAACAAGT AS en una abreviatura de antisentido. Los nucleótidos subrayados son 2'-0-metilribonucleótidos; todos los demás son 2 -desoxirribonucleótidos. En el ejemplo de oligonucleótidos antisentido de conformidad con la invención, cuando un dinucleótido de "CG" está contenido en la secuencia, dicho oligonucleótido es modificado para remover o prevenir las propiedades inmunoestimuladoras del oligonucleótido.

En otro aspecto, la invención provee una composición que comprende por lo menos un oligonucleótido antisentido optimizado de conformidad con la invención, y un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Dicha composición puede contener, además del oligonucleótido sintético y el vehículo, diluyentes, llenadores, sales, reguladores de pH, estabilizadores, solubilizantes, y otros materiales conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la invención también puede contener otros factores activos y/o agentes que aumentan la inhibición de la expresión de TLR2. Por ejemplo, pueden usarse combinaciones de oligonucleótidos sintéticos, cada una de las cuales es dirigida hacia diferentes regiones del ARNm de TLR2, en las composiciones farmacéuticas de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede contener además análogos de nucleótido tales como azidotimidina, didesoxicitidina, didesoxiinosina, y similares. Dichos factores y/o agentes adicionales pueden estar incluidos en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergístico, aditivo o mejorado con el oligonucleótido sintético de la invención, o para reducir al mínimo los efectos laterales causados por el oligonucleótido sintético de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en el cual los oligonucleótidos sintéticos de la invención se combinan, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes antipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas laminares que están en solución acuosa. Lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípídos, saponina, ácidos biliares, y similares. Un vehículo de lípidos particularmente útil es lipofectína. La preparación de dichas formulaciones liposomales está dentro del nivel de capacidad de la técnica, como se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. Nos. 4,235,871 ; 4,501 ,728; 4,837,028; y 4,737,323. La composición farmacéutica de la invención también puede incluir compuestos como ciclodextrinas y similares, que mejoren el suministro de los oligonucleótidos dentro de las células, o polímeros de liberación lenta.

En otro aspecto, la invención provee un método para inhibir la expresión de TLR2. En este método, un oligonucleótido o múltiples oligonucleótidos de la invención se ponen en contacto o se hibridan específicamente con el ARNm de TLR2 ya sea in vitro o en una célula.

En otro aspecto, la invención provee métodos para inhibir la expresión de TLR2 en un mamífero, en particular un humano, dichos métodos comprendiendo administrar al mamífero un compuesto o composición de conformidad con la invención. Un experto en la técnica reconocería que los compuestos y composiciones antisentido de acuerdo con la invención se pueden administrar a través de una variedad de medios. Uno de dichos medios para administración es de acuerdo con el Ejemplo 3. La actividad antisentido de un compuesto o una composición de acuerdo con la invención puede determinarse al medir el ARNm de TLR2 y la concentración de proteínas de TLR2. Se prevé que los datos demuestren que la administración de un oligonucleótido antisentido de TLR2 ejemplar de acuerdo con la invención pueda causar subregulación de la expresión de TLR2 in vivo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir una respuesta inmune mediada por TLR en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero un oligonucleótido antisentido de TLR2 de acuerdo con la invención en una cantidad farmacéuticamente efectiva, en donde las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, suministro en mucosas, oral, sublingual, transdérmica, tópica, por inhalación, intranasal, en aerosol, infraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por cañón de genes, parche dérmico o en forma de gota ocular o enjuague bucal. Un experto en la técnica reconocería que dicha administración se puede realizar de acuerdo con el Ejemplo 3 o a través de métodos conocidos. La actividad antisentido de compuesto o una composición de acuerdo con la invención puede determinarse al medir los biomarcadores relacionados con la señalización de TLR2, por ejemplo, pero no limitándose a, la medición de IL-12. Se prevé que los datos demuestren que la administración de un oligonucleótido antisentido de TLR2 ejemplar de acuerdo con la invención pueda ocasionar la subregulación de la expresión de TLR2 in vivo y prevenir la inducción de IL-12 por un agonista de TLR2. Más generalmente, se prevé que los datos demuestren la capacidad de un oligonucleótido antisentido de TLR2 de acuerdo con la invención para inhibir la inducción de citocinas proinflamatorias mediante un agonista de TLR2.

En otro aspecto, la invención provee un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene una enfermedad mediada por TLR2, dicho método comprendiendo administrar al mamífero, en particular un humano, un oligonucleótido antisentido de TLR2 de la invención en una cantidad farmacéuticamente efectiva.

En ciertas modalidades, la enfermedad es cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de vías respiratorias, trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, malaria, enfermedad de Lyme, infecciones oculares, conjuntivitis, trastornos de la piel, psoriasis, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, síndrome de fatiga crónica, sarcoidosis, rechazo de trasplante, alergia, asma, o una enfermedad causada por un patógeno. Trastornos autoinmunes preferidos incluyen, sin limitación, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo I, síndrome de intestino irritable, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, choque séptico, alopecia universal, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, penfigoide ampollar, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad celíaca, dermatomiositis, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurada, púrpura trombocitopénica idiopátíca, cistitis intersticial, morfea, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, esquizofrenia, síndrome de Sjógren, arteritis temporal ("arteritis de células gigantes"), vasculitis, vitíligo, vulvodinia y granulomatosis de Wegener. En ciertas modalidades, los trastornos inflamatorios incluyen, sin limitación, inflamación de vías respiratorias, asma, enfermedades autoinmunes, inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad de Behcet, hipersensibilidades, enfermedad inflamatoria del intestino, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, colitis ulcerativa, uveítis, conjuntivitis y vasculitis.

En otro aspecto, la invención provee métodos para prevenir una enfermedad o trastorno en un mamífero, en particular un humano, en riesgo de que contraiga o que desarrolle una enfermedad o trastorno mediado por TLR2. Dicho método comprende administrar al mamífero una cantidad profilácticamente efectiva de un oligonucleótido antisentido o composición de conformidad con la invención. Dichas enfermedades y trastornos incluyen, sin limitación, cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, malaria, enfermedad de Lyme, infecciones oculares, conjuntivitis, trastornos de la piel, psoriasis, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, síndrome de fatiga crónica, sarcoidosis, rechazo de trasplante, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno en un vertebrado. Los trastornos autoinmunes incluyen, sin limitación, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo I, síndrome de intestino irritable, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, choque séptico, alopecia universal, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, penfigoide ampollar, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad celíaca, dermatomiositis, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurada, púrpura trombocitopénica idiopática, cistitis intersticial, morfea, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, esquizofrenia, síndrome de Sjógren, arteritis temporal ("arteritis de células gigantes"), vasculitís, vitíligo, vulvodinia y granulomatosis de Wegener. Los trastornos inflamatorios incluyen, sin limitación, inflamación de vías respiratorias, asma, enfermedades autoinmunes, inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad de Behcet, hipersensíbilidades, enfermedad inflamatoria del intestino, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, colitis ulcerativa, uveitís, conjuntivitis y vasculitís.

En otro aspecto, la invención provee un método para inhibir la expresión y la actividad de TLR2 en un mamífero, que comprende administrar al mamífero un oligonucleótido antisentido complementario al ARNm de TLR2 y un antagonista de la proteína de TLR2, un inhibidor de cinasa o un inhibidor de la proteína (STAT). Asimismo, la expresión de TLR2 es inhibida por el oligonucleótido antisentido, mientras que cualquier proteína de TLR2 expresada residualmente es inhibida por el antagonista. Los antagonistas preferidos incluyen fragmentos de unión a anticuerpos anti-TLR2 o peptidomiméticos de los mismos, compuestos a base de ARN, compuestos a base de oligonucleótido, e inhibidores de molécula pequeña de la actividad de TLR2 o de una actividad de proteína de señalización.

En los varios métodos de conformidad con la invención, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un oligonucleótido sintético de la invención y efectivo para inhibir la expresión de TLR2, se administra a una célula. Esta célula puede formar parte de un cultivo celular, un cultivo de tejido neovascularizado, o puede formar parte de, o ser todo el cuerpo de un mamífero, como un humano u otro mamífero. La administración de composiciones terapéuticas del oligonucleótido antisentido de TLR2, se puede realizar usando procedimientos conocidos en dosis y por períodos efectivos para reducir los síntomas o subrogar marcadores de la enfermedad, dependiendo de la afección y de la respuesta, según lo determinen los expertos en la técnica. Podría ser preferible administrar en forma simultánea, o en forma secuencial una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más oligonucleótidos antisentido de TLR2 terapéuticos de la invención, a un individuo como un solo episodio de tratamiento. En algunos ejemplos de modalidades de los métodos de Ja invención descritos anteriormente, el oligonucleótido se administra localmente y/o sistémicamente. El término "localmente administrado" se refiere al suministro hacia un área o región definida del cuerpo, mientras que el término "administración sistémica" significa que abarca el suministro hacia el organismo entero.

En cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, se puede administrar uno o más oligonucleótidos antisentido de TLR2 solos o en combinación con cualquier otro agente útil en el tratamiento de la enfermedad o condición, que no disminuya el efecto ¡nmunomodulador del oligonucleótido antisentido de TLR2. En cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, el agente útil para tratar la enfermedad o afección incluye, pero no está limitado a, una o más vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótidos antisentido, agonistas de TLR, antagonistas de TLR, ARNsi, ARNmi, aptámeros, péptidos, proteínas, vectores de terapia génica, vacunas de ADN, adyuvantes o inhibidores de cinasa para mejorar la especificidad o magnitud de la respuesta inmune, o moléculas coestimuladoras como citocinas, quimiocinas, ligandos de proteína, factores transactivadores, péptidos y péptidos que comprenden aminoácidos modificados. Por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, se prevé que el oligonucleótido antisentido de TLR2 se puede administrar en combinación con uno o más agentes terapéuticos dirigidos y/o anticuerpos monoclonales. Alternativamente, el agente puede incluir vectores de ADN que codifican para un antígeno o alérgeno. En estas modalidades, el oligonucleótido antisentido de TLR2 de la invención puede producir efectos inmunomoduladores o supresores directos. Cuando se co-administra con una o más de otras terapias, el oligonucleótido sintético de la invención puede administrarse ya sea simultáneamente con los otros tratamientos, o secuencialmente.

En los diferentes métodos de acuerdo con la invención la vía de administración puede ser, sin limitación, suministro parenteral, suministro en mucosas, oral, sublingual, transdérmico, tópico, por inhalación, intranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por cañón de genes, parche dérmico o en forma de gota ocular o enjuague bucal.

Cuando se administra oralmente una cantidad terapéuticamente efectiva del oligonucleótido sintético de la invención, el oligonucleótido sintético estará en forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. La tableta, cápsula y polvo contienen de aproximadamente 5 a 95% de oligonucleótido sintético, y de preferencia de aproximadamente 25 a 90% de oligonucleótido sintético. Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya, aceite de ajonjolí o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente 0.5 a 90% en peso del oligonucleótido sintético, o de aproximadamente 1 a 50% de oligonucleótido sintético.

Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de oligonucleótido sintético de la invención se administra por la vía parenteral, suministro en mucosas, oral, sublingual, transdérmica, tópica, por inhalación, ¡ntranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por cañón de genes, parche dérmico o en forma de gota ocular o enjuague bucal, el oligonucleótido antisentido sintético estará en la forma de una solución acuosa libre de pirógenos parenteralmente aceptable. La preparación de dichas soluciones parenteralmente aceptables, que tienen el pH, la isotonicidad, la estabilidad adecuados y similares, están dentro de la técnica. Una composición farmacéutica para el suministro parenteral, suministro en mucosas, oral, sublingual, transdérmico, tópico, por inhalación, ¡ntranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por cañón de genes, parche dérmico o en forma de gotas para los ojos o enjuague bucal, deberá contener, además del oligonucleótido sintético, un vehículo isotónico como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer lactada u otro vehículo conocido en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservadores, reguladores de pH, antioxidantes u otros aditivos conocidos para los expertos en la técnica.

Cuando se administra por la vía parenteral, suministro en mucosas, oral, sublingual, transdérmica, tópica, por inhalación, intranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por cañón de genes, parche dérmico o en forma de gota ocular o enjuague bucal, pueden usarse dosis que varían de 0.01% a 10% (en peso/volumen). Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya, aceite de ajonjolí o aceites sintéticos. La administración tópica puede ser por liposomas o parche transdérmico de liberación determinada.

La cantidad de oligonucleótido sintético en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que está siendo tratada, y de la naturaleza de los tratamientos previos que el paciente ha recibido. Se contempla que las varias composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el método de la presente invención, deben contener de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 20 mg de oligonucleótido sintético por kg de peso corporal o peso del órgano.

La duración de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención variará, dependiendo de la severidad de la enfermedad que está siendo tratada y la condición y la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual.

Algunas enfermedades llevan por sí mismas a tratamiento agudo, mientras que otras requieren terapia a plazo más largo. La intervención aguda y a largo plazo en las enfermedades, es un propósito útil. Las inyecciones de oligonucleótidos antisentido contra TLR2 pueden ser un medio efectivo para inhibir ciertas enfermedades en situación aguda. Sin embargo, para terapia a largo plazo durante un período de semanas, meses o años, es probable que se considere el suministro sistémico (intraperitoneal, intramuscular, subcutáneo, intravenoso) con vehículos tales como solución salina, polímeros de liberación lenta o liposomas.

En algunas enfermedades crónicas, la administración sistémica de oligonucleótidos puede ser preferible. La frecuencia de las inyecciones de infusión continua a una vez por mes, varias veces por mes o con menos frecuencia, se determinará con base en el proceso de enfermedad y la vida media biológica de los oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos y métodos de la invención son también útiles para examinar la función del gen de TLR2 en una célula o en un mamífero control o en un mamífero que sufre de una enfermedad asociada con TLR2 o inmunoestimulación a través de TLR2. En dicho uso, a la célula o el mamífero se le administra el oligonucleótido, y se examina la expresión del ARNm o proteína de TLR2.

Sin la intención de limitarse a alguna teoría o mecanismo, se cree generalmente que la actividad de los oligonucleótidos de conformidad con la invención depende de la hibridación del oligonucleótido con el ácido nucleico objetivo (por ejemplo, con por lo menos una porción de una región genómica, gen o transcrito de ARNm del mismo), interrumpiendo de esta manera la función del objetivo. Dicha hibridación bajo condiciones fisiológicas se mide como una materia práctica, observando la interferencia con la función de la secuencia de ácido nucleico. De esta manera, un ejemplo de oligonucleótido usado de conformidad con la invención, es capaz de formar un dúplex estable (o triplex en el mecanismo de apareamiento de Hoogsteen u otro mecanismo de apareamiento por enlaces de hidrógeno) con el ácido nucleico objetivo; activar la RNasa H u otras enzimas in vivo, causando de esta manera la destrucción efectiva de la molécula de ARN objetivo; y es capaz de resistir la degradación nucleolítica (por ejemplo, actividad de endonucleasas y exonucleasas) in vivo. Muchas de las modificaciones a los oligonucleótidos descritas anteriormente, y otras que se conocen en la técnica, consignan específicamente y exitosamente cada uno de estos ejemplos de características.

Las patentes y publicaciones citadas en la presente reflejan el nivel de conocimiento en la técnica, y se incorporan de esta manera en su totalidad en la presente como referencia. Cualquier conflicto entre las enseñanzas de estas patentes y publicaciones y esta especificación, deberá resolverse a favor de la última. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de indagar, usando no más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes de las sustancias y procedimientos específicos descritos en la presente. Por ejemplo, se pueden usar oligonucleótidos antisentido que se traslapan con los oligonucleótidos. Se considera que dichos equivalentes están dentro del alcance de esta invención.

Los siguientes ejemplos ilustran los ejemplos de modos para hacer y poner en práctica la presente invención, pero no significa que limitan el alcance de la invención, puesto que pueden usarse métodos alternativos para obtener resultados similares.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de oligonucleótidos antisentido específicos de TLR2 Se sintetizaron entidades químicas de conformidad con la invención sobre una escala de 1 pmol a 0.1 mM, usando un sintetizador de ADN automatizado (OligoPilot II, AKTA (Amersham) y/o Expedite 8909 (Applied Biosystems)), siguiendo el procedimiento de síntesis lineal esbozado en la figura 1.

Se adquirieron 5'-DMT dA, dG, dC y T fosforamiditas de Proligo (Boulder, CO). Las fosforamiditas 5'-DMT 7-desaza-dG y araG se adquirieron con Chemgenes (Wilmington, MA). El soporte sólido del enlazador DiDMT-glicerol se obtuvo con Chemgenes. Se obtuvo 1-(2'-desoxi- -D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metil-purina amidita de Glen Research (Sterling, VA). Se obtuvieron 2'-0-metilribonucleósido amiditas de Promega (Obispo, CA). Todos los compuestos de conformidad con la invención fueron modificados en la estructura de base de fosforotioato.

Todas las fosforamiditas de nucleósido se caracterizaron por medio de espectros de 3 P y 1H RMN. Se incorporaron nucleósidos modificados en sitios específicos usando ciclos de acoplamiento normales recomendados por el proveedor. Después de la síntesis, los compuestos se desprotegieron usando hidróxido de amonio concentrado, y se purificaron por CLAR de fase invertida y después detritilación, seguida de diálisis. Los compuestos purificados como la forma de sal de sodio fueron liofilizados antes de su uso. La pureza se probó por medio de CGE y MALDI-TOF MS. Los niveles de endotoxina fueron determinados por medio de la prueba de LAL, y fueron inferiores a 1.0 EU/mg.

EJEMPLO 2 Reactivos y condiciones para el cultivo de células Pruebas para el cultivo de células HEK293 para actividad antisentido de TLR2 Se colocaron en placas las células HEK293 que expresan en forma estable el TLR2/TLR6 humano (Invivogen, San Diego, CA) en placas de 48 cavidades en 250 pL/cavidad de DMEM complementado con 10% de FBS desactivado con calor en un incubador de C02 al 5%. A 80% de confluencia, los cultivos fueron transfectados transitoriamente con 400 ng/mL de la forma secretada de plásmido reportero de fosfatasa alcalina embrionaria humana) (SEAP) (pNifty2-Seap) (Invivogen), en presencia de 4 pL/mL de lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) en medio de cultivo. El plásmido reportero SEAP es inducible por NF- ?. El ADN de plásmido y lipofectamine se diluyeron por separado en medio libre de suero, y se incubaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Después de la incubación, el ADN y lipofectamine diluidos se mezclaron, y las mezclas se incubaron adicionalmente a temperatura ambiente por 20 minutos. Alícuotas de 25 µ?_ de la mezcla de ADN/lipofectamine que contenía 100 ng de ADN de plásmido y 1 µ?_ de lipofectamine se añadieron a cada cavidad de la placa de cultivo de células, y las células fueron transfectadas por 6 horas. Después de la transfección, se reemplazó el medio con medio de cultivo fresco (sin antibióticos), se añadieron compuestos antisentido a las cavidades, y la incubación se continuó por 18 a 20 horas. Las células fueron estimuladas entonces con el agonista de TLR2/TLR6, FSL-1 , a 10 ng/ml por 6 horas.

Al final del tratamiento, se tomaron 20 µ?_ de sobrenadante de cultivo de cada cavidad y se pusieron a prueba para prueba de SEAP por el método de Quanti Blue de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invivogen). Los datos se ilustran en el cuadro A. Los datos en el cuadro A muestran la actividad de NF-kB en comparación con el control y demuestran (i) que los oligonucleótidos antisentido ejemplares de TLR2 humano de acuerdo con la invención no son inmunoestimuladores (sólo antisentido), y (ii) que los oligonucleótidos antisentído ejemplares de TLR2 humano de acuerdo con la invención inhiben la expresión de TLR2 y la activación (agonista más antisentido).

CUADRO A Activación de NF-?? expresada como número de veces el control (media+/-desviación estándar) en células TLR2/6-HEK293 de humano Antisentido solo Agonista (10ng/ml) más antisentido Tratamiento 1 µg/ml 10 µ9/??? 100 µ9/??? 1 µ?^? 10 µ9/??? 100 9/G?? PBS 0.99+/-0.16 28.43+?2.37 1 1 0.23+/-0.09 0.29+/-0.00 0.45+/-0.05 10.09+/-0.03 9.28+/-0.20 13.54+/-0.20 23 0.48+/-0.05 0.31 +/-0.02 0.48+/-0.09 12.66+/-1.14 13.78+/-0.20 15.16+/-0.58 69 0.47+/-0.02 0.39+/-0.00 0.56+/-0.02 12.71 +/-0.25 9.39+/-0.30 12.07+/-0.76 94 0.53+/-0.07 0.79+/-0.1 1 0.63+/-0.07 10.80+/-0.25 9.66+/-0.23 4.88+/-0.13 98 0.74+/-0.05 0.92+/-0.02 0.97+/-0.05 12.82+/-0.86 19.71+/-0.10 16.84+/-0.88 1 1 1 0.73+/-0.07 0.63+/-0.07 1.05+/-0.07 17.87+/-0.88 16.91 +/-0.03 19.45+/-0.23 127 0.90+/-0.32 0.95+/-0.02 1.06+/-0.18 18.25+/-0.76 12.83+/-0.03 1 1 .48+/-0.43 158 0.68+/-0.18 0.85+/-0.02 0.82+/-0.16 9.21 +/-0.56 9.38+/-0.33 1 1 .66+/-0.18 El cuadro A demuestra que los oligonucleótidos antisentido de TLR2 de humano ejemplares de acuerdo con la invención no son inmunoestimuladores (sólo antisentido). El cuadro A también demuestra la capacidad de los oligonucleótidos ejemplares de acuerdo con la invención de inhibir la expresión de TLR2 y la activación en las células HEK293 que se cultivaron y trataron de acuerdo con el ejemplo 2 (agonista más antisentido).

EJEMPLO 3 Actividad in vivo del oligonucleótido antisentido de TLR2 Ratones hembra C57BL/6 con 5-6 semanas de edad (N = 3/grupo) fueron inyectados con oligonucleótidos antisentido ejemplares de TLR2 de murino de acuerdo con la invención a 5 mg/kg, o PBS, por vía subcutánea una vez al día durante tres días. Después de la administración del oligonucleótido antisentido de TLR2, se inyectó subcutáneamente a los ratones con 0.25 mg/kg de un agonista de TLR2. Dos horas después de la administración del agonista de TLR2, se colectó sangre y se determinaron las concentraciones de ARNm de TLR2, proteína de TLR2 y concentraciones de IL-12 por medio de ELISA.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un oligonucleótido antisentido sintético de 20 a 50 nucleótidos de longitud complementario al ARNm de TLR2 (SEQ ID NO: 171 ) en donde el oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende SEQ ID NOS: 1 1 , 23, 69, 94, 98, 11 1 , 127 o 158, y en donde el oligonucleótido híbrida específicamente a, e inhibe la expresión de TLR2 humano.

2.- Una composición que comprende un oligonucleótido antisentido sintético de la reivindicación 1 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

3.- El uso de un oligonucleótido antisentido sintético de la reivindicación 1 , en la elaboración de un medicamento para inhibir la expresión de TLR2.

A - El uso de una composición de la reivindicación 2, en la elaboración de un medicamento para inhibir la expresión de TLR2.

5. - El uso de un oligonucleótido antisentido sintético de la reivindicación 1 , en la elaboración de un medicamento para inhibir la expresión de TLR2 en un mamífero.

6. - El uso de una composición de la reivindicación 2, en la elaboración de un medicamento para inhibir la expresión de TLR2 en un mamífero.

7.- El uso de un oligonucleótido antisentido sintético de la reivindicación 1 en una cantidad farmacéuticamente efectiva, en la elaboración de un medicamento para inhibir una respuesta inmune mediada por TLR2 en un mamífero.

8.- El uso de una composición de la reivindicación 2 en una cantidad farmacéuticamente efectiva, en la elaboración de un medicamento para inhibir una respuesta inmune mediada por TLR2 en un mamífero.

9. - El uso de un oligonucleótido antisentido sintético de la reivindicación 1 en una cantidad farmacéuticamente efectiva, en la elaboración de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene una o más enfermedades o trastornos mediados por TLR2.

10. - El uso de una composición de la reivindicación 2 en una cantidad farmacéuticamente efectiva, en la elaboración de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene una o más enfermedades o trastornos mediados por TLR2.

11. - El uso de un oligonucleótido antisentido sintético de la reivindicación 1 en una cantidad profilácticamente efectiva, en la elaboración de un medicamento para prevenir en un mamífero una o más enfermedades o trastornos mediados por TLR2.

12.- El uso de una composición de la reivindicación 2 en una cantidad profilácticamente efectiva, en la elaboración de un medicamento para prevenir en un mamífero una o más enfermedades o trastornos mediados por TLR2.

13. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en donde el mamífero es un humano.

14. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde una o más enfermedades o trastornos se seleccionan del grupo que consiste en cáncer, una enfermedad o trastorno autoinmune, inflamación de vías respiratorias, enfermedades o trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, malaria, enfermedad de Lyme, infecciones oculares, conjuntivitis, trastornos de la piel, psoriasis, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, síndrome de fatiga crónica, sarcoidosis, rechazo de trasplante, alergia, asma, y una enfermedad causada por un patógeno.

15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde la enfermedad o trastorno autoinmune se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo I, síndrome de intestino irritable, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, choque séptico, alopecia universal, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, penfigoide ampollar, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad celíaca, dermatomiositis, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurada, púrpura trombocitopénica idiopática, cistitis intersticial, morfea, miastenia grave, narcolepsía, neuromiotonía, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, esquizofrenia, síndrome de Sjógren, arterítis temporal ("arteritís de células gigantes"), vasculitis, vitíligo, vulvodinía y granulomatosis de Wegener.

16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en inflamación de vías respiratorias, asma, enfermedades o trastornos autoinmunes, inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad de Behcet, hipersensibilidades, enfermedad inflamatoria del intestino, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, colitis ulcerativa, uveítis, conjuntivitis y vasculitis.

17. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde el medicamento está adaptado para ser adminístrable por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en parenteral, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, suministro en mucosas, oral, sublingual, transdérmica, tópica, por inhalación, ¡ntranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por cañón de genes, parche dérmico, gota ocular y enjuague bucal.

18. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde el medicamento está además adaptado para ser adminístrable con una o más vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxícos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótídos antisentido, agonistas de TLR, antagonistas de TLR, ARNsi, ARNmi, aptámeros, proteínas, vectores de terapia génica, vacunas de ADN, adyuvantes, moléculas co-estimuladoras, inhibidores de cinasa o combinaciones de los mismos.

19. - El uso de un oligonucleótido antisentido complementario al ARNm de TLR2 y un antagonista de la proteína de TLR2, en la elaboración de un medicamento para inhibir la expresión y la actividad de TLR2 en un mamífero.

20. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde el antagonista de TLR2 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos antí-TLR o fragmentos de unión o peptidomiméticos del mismo, los compuestos a base de ARN, compuestos a base de oligonucleótidos, e inhibidores de pequeñas moléculas de la actividad de TLR2.