MX2011002759A - Metodo de tratamiento. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para inducir la apoptosis, los cuales comprenden el tratamiento de un paciente con un inhibidor de TNFa así como también con un inhibidor IAP y un agonista del receptor de TRAIL. Los métodos mejoran el riesgo de efectos no deseados, por lo mismo resultando en un índice terapéutico mejorado para inhibidores de IAP en combinación con un agonista del receptor de TRAIL.

Description

METODO DE TRATAMIENTO Campo de la Invención Esta invención se relaciona al campo del tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la Invención El inhibidor de proteínas de apoptosis (IAP por sus siglas en inglés) es una familia de proteínas que suprime la apoptosis por medio de mecanismos únicos. Por ejemplo, el inhibidor X enlazado de proteína de apoptosis (XIAP por sus siglas en inglés) evita la apoptosis por secuestrar y bloquear la actividad de tanto caspasas iniciadoras y efectoras. Las caspasas son proteasas específicas a aspartilo dependientes a cisteína que funcionan escindiendo los substratos celulares durante el proceso de apoptosis. En contraste, otros miembros de la familia IAP como el inhibidor celular de la proteína de apoptosis 1 (cIAPl por sus siglas en inglés) y el inhibidor celular de proteína de apoptosis 2 (cIAP2 por sus siglas en inglés) evitan la apoptosis que es inducida a través del . factor de necrosis tumoral alfa (TNFa por sus siglas en inglés) y la activación de la trayectoria de señalización del receptor 1 del TNFa (TNFR1 por sus siglas en inglés) . A pesar de los mecanismos únicos para bloquear la apoptosis, todos los miembros IAP contienen uno o más dominios de repetición baculoviral de enlace a zinc (BIR por Ref.: 218727 sus siglas en inglés) , los cuales median las interacciones proteína-proteína y la función anti-apoptótica.

La proteína mitocondrial Smac (segundo activador mitocondrial de caspasas) es un regulador endógeno de proteínas IAP y es liberado en el citosol durante la apoptosis. El Smac puede enlazar con alta afinidad al dominio BIR3 de cIAPl, clAP2 y XIAP. La actividad pro-apoptótica de Smac depende del patrón de enlace de IAP de cuatro aminoácidos ubicado en la terminación N de la proteína madura. Este patrón, Ala-Val-Pro-Ile, es suficiente para enlazar al dominio BIR3 de cIAPl, cIAP2 y XIAP y compite con la caspasa 9 que enlaza en este sitio. Las interacciones Smac-IAP por lo mismo evitan la inhibición de IAP a partir de la caspasa 9.

Hay una necesidad continua en la técnica para tratamientos de cáncer los cuales impliquen los inhibidores IAP.

Sumario de la Invención La invención proporciona un método de tratamiento del cáncer, el cual comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una cantidad efectiva terapéuticamente de (a) un inhibidor de TNFcc; (b) un inhibidor IAP; y (c) un agonista del receptor de TRAIL. El inhibidor de TNFa puede ser administrado por una cantidad suficiente de tiempo para lograr la inhibición de TNFa antes a la administración del inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL. Cada uno del inhibidor IAP, el inhibidor de TNFa, y el agonista del receptor de TRAIL puede, pero no necesita, ser una molécula pequeña. "Molécula pequeña" como se usa en la presente es un compuesto químico orgánico sintético o semi-sintético el cual tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 Daltones. i El inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL pueden ser administrados simultánea o secuencialmente . En algunas modalidades el cáncer es el cáncer de ovario, cáncer de mama, o cáncer de colon.

En algunas modalidades el inhibidor IAP es un mimético de Smac . El inhibidor TNFa puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, como Infliximab (por ejemplo, infliximab REMICADE®) y Adalimumab (por ejemplo, adalimumab HUMIRA ®) , o puede ser una proteína de fusión de receptor-construcción, como etanercept (por ejemplo, etanercept ENBREL®) .

En algunas modalidades el agonista del receptor de TRAIL es un anticuerpo, como HGS-ETR1 o "mapatumumab" y HGS-ETR2 o "lexatumumab" (Human Genome Sciences; Georgakis et al., Br J Haematol. 2005 Agosto; 130 (4) : 501-10) , HGS-TR2J (Human Genome Sciences), Apomab (Genentech; Adams et al., Cell Death Differ. 2008 Abril: 15 (4) : 751-61) , CS-1008 (Daiichi Sankyo: ver Yada et al., Ann Oncol. 2008 Junio: 19 (6) : 1060-7) , LBY135 (Novartis; Natoni et al., Br J Haematol. 2007 ov; 139 (4) : 568-77) , y TRA-8 (University of Alabama-Birraingham, Ichikawa et al . , Nat . Med. 2001 Agosto; 7 (8) : 954-60) . El anticuerpo puede ser un anticuerpo DR4, un anticuerpo DR5, o un anticuerpo el cual enlaza tanto a DR4 y DR5. En otras modalidades el agonista del receptor de TRAIL es un TRAIL humano recombinante . En otras modalidades el agonista del receptor de TRAIL es un pepticuerpo (una molécula la cual comprende un dominio Fe de anticuerpo unido a por lo menos un péptido) . La producción de los pepticuerpos es generalmente descrito en la publicación PCT de WO 00/24782, publicado el 4 de Mayo, de 2000. Ver US 2008/0213277. En otras modalidades el agonista del receptor de TRAIL es un avimero. Ver la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2006/0286603 y 2006/00223114.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una gráfica la cual demuestra que se reduce la actividad de caspasa 3/7 de suero inducida por el compuesto X en ratones desnudos, que no portan tumor por inhibición de TNFa. En el eje X, la y "+" abajo de cada barra indica si se agrega o no el compuesto X en una dosis de 15 mg/kg, los números abajo de cada barra indican el grupo de ratón: y las líneas abajo de los números agrupan los grupos de ratón de acuerdo a su pretratamiento (las abreviaciones son explicadas en el Ejemplo 1) . El eje Y es la actividad de la caspasa 3/7 expresada como unidades de luz relativas (RLU por sus siglas en inglés) .

La Figura 2 es una gráfica la cual demuestra los cambios de peso corporal en ratones del tipo silvestre y desnudos dobles del receptor TNF después del tratamiento con el compuesto X dado en 30 mg/kg i. P. diariamente x 5. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2.

La Figura 3 es la gráfica la cual demuestra que los niveles de caspasa 3 séricas inducidas por el compuesto X son reducidos en los ratones desnudos dobles con receptor TNF. (niveles de caspasa 3/7 sérica de ratón en ratones del tipo silvestre o DKO p55/p75) . Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2. El eje Y indica los niveles de caspasa 3/7 sérica expresados como RLU por segundo.

La Figura 4 es la gráfica que demuestra que las disminuciones en cuentas de plaqueta inducidas por el compuesto X son mayores en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2. Los números en el eje Y son los números (xlO3) de plaquetas por µ?· La Figura 5 es una gráfica la cual demuestra que las disminuciones en las cuentas de reticulocitos inducidas por el compuesto X son mayores en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF (Después del tratamiento con el compuesto X en ratones WT o TNFR KO, los datos son expresados como la media +/-desviación estándar (n=5) ) . Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2. Los números en el eje Y en los números (xlO9) de reticulocitos por µ.

La Figura 6 es la gráfica la cual demuestra que la apoptosis de células de criptas del intestino delgado inducida por el compuesto X es mayor en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2. El eje Y indica el grado de apoptosis (0-5) como se explica en el Ejemplo 2.

Las Figuras 7A y 7B son las secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina las cuales demuestran que la apoptosis celular de criptas del intestino delgado inducidas por el compuesto X es mayor en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. La Figura 7A, es la sección del intestino delgado de un ratón del tipo silvestre en el día 5 después del tratamiento con el compuesto X (ver el Ejemplo 2) . La Figura 7B, es la sección de un intestino delgado de un ratón desnudo doble del receptor TNF en el día 5 después del tratamiento con el compuesto X (ver el Ejemplo 2) .

La Figura 8 es la gráfica la cual demuestra que la apoptosis celular basal epidérmica inducida por el compuesto X es mayor en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2. El eje Y indica el grado de apoptosis (0-5) como se explica en el Ejemplo 2.

Las Figuras 9A-9B son las secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina las cuales demuestran que la apoptosis celular basal epidérmica inducida por el compuesto X es mayor en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. La Figura 9A, es la sección de células epiteliales básales de la piel de un ratón del tipo silvestre en el día 5 después del tratamiento con el compuesto X (ver el Ejemplo 2) , el cual muestra la apoptosis ligera. La Figura 9B, es la sección de células epiteliales básales de la piel de un ratón desnudo doble del receptor TNF en el día 5 después del tratamiento con el compuesto X (ver el ejemplo 2) , que no muestra presencia de apoptosis .

La Figura 10 es la gráfica la cual demuestra que la atrofia cortical tímica inducida por el compuesto X es mayor en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 2. El eje Y indica el grado de apoptosis (0-5) como se explica en el Ejemplo 2.

Las Figuras 11A-11B son secciones histológicas teñidas con hematoxilina . y eosina que demuestran que la atrofia cortical tímica inducida por el compuesto X es mayor en los ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. La Figura 11A, es el timo de un ratón del tipo silvestre en el día 5 después del tratamiento con el compuesto X (ver el Ejemplo 2) , el cual muestra la atrofia cortical tímica (flechas) , apoptosis de linfocito cortical tímico. La Figura 11B, el timo de un ratón desnudo doble del receptor TNF en el día 5 después del tratamiento con el compuesto X (ver el Ejemplo 2) , el cual muestra que la corteza tímica no está atrofiada y es normal en apariencia (flechas) .

La Figura 12A es la gráfica la cual demuestra los cambios de peso corporal en ratones del tipo silvestre y ratones desnudos dobles del receptor del TNF después del tratamiento con el compuesto X. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 3.

La Figura 12B es la gráfica la cual demuestra que los niveles de caspasa 3 inducidas por el compuesto X son reducidos en los ratones desnudos dobles del receptor TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 4. El eje Y indica los niveles de caspasa 3/7 sérica expresados como unidades de luz relativas ( LU) .

La Figura 13A es la gráfica la cual demuestra que las disminuciones en cuentas de reticulocitos inducidas por el compuesto X son mayores en ratones desnudos dobles del tipo silvestre que del receptor de TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 4. Los números en el eje Y son los números (xlO9) de reticulocitos por µ?.

La Figura 13B es la gráfica la cual demuestra que las disminuciones en cuentas de plaquetas inducidas por el compuesto X son mayores en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 4. Los números en el eje X son los números (xlO3) de plaquetas por µ?.

La Figura 13C es la gráfica la cual demuestra que las disminuciones en cuentas celulares de glóbulos blancos inducidas por el compuesto X son mayores en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las cuentas de glóbulos rojos y niveles de hemoglobina están relativamente sin cambios en ratones del tipo silvestre contra ratones desnudos dobles del receptor TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 4. Los números en el eje X son las cuentas relativas de cada marcador medidas como se indica en la leyenda de . la gráfica.

La Figura 13D es la gráfica la cual demuestra que los incrementos en cuentas de neutrófilos y disminuciones en cuentas de linfocitos inducidas por el compuesto X son relativamente equivalentes en ratones del tipo silvestre que en los ratones desnudos dobles del receptor del TNF. Las abreviaciones en el eje X son explicadas en el Ejemplo 4. Los números en el eje Y son el porcentaje (%) de cada tipo celular presente.

Las Figuras 14A-14F son las gráficas que demuestran la viabilidad de células cancerígenas de colon HCT116 (Figuras 14A, B) , células de melanoma A375 (Figuras 14C, D) , y células cancerígenas de ovario SKOV-3 (Figuras 14E, F) después del tratamiento con un inhibidor IAP ("compuesto X" , mostrado en el Ejemplo 1) y los efectos de inhibición de TNFa en la sinergia de ligando inducido por apoptosis relacionada a TNF (TRAIL por sus siglas en inglés) y el compuesto X in vitro. El eje X de cada gráfica es la concentración del compuesto X en nM. El eje Y es el porcentaje de células sobrevivientes comparado con células de control (no tratadas) ("POC" porcentaje de control). Las concentraciones del TRAIL son indicadas en la parte derecha de cada gráfica.

La Figura 15 es la gráfica la cual muestra los efectos en la actividad de caspasa 3 tumoral SKOV3 después de varios tratamientos de ratones que portan tumor. Ver el Ejemplo 5.

Descripción Detallada de la Invención En la presente se ha descubierto que el tratamiento con un inhibidor de TNFa junto con la terapia de combinación de un inhibidor IAP y un agonista del receptor de TRAIL induce efectivamente la apoptosis mientras restringe o atenúa el riesgo de efectos no deseados. Los métodos de la invención pueden resultar en un intervalo más amplio de actividad antitumoral y un índice terapéutico mejorado, por ejemplo, para inhibidores de IAP.

Inhibidores de IAP Un "inhibidor IAP" de acuerdo a la invención es un agente que enlaza a un dominio BIR de IAP. El enlace a un dominio BIR de IAP es determinado substancialmente como se describe por Nikolovska-Coleska et al., Analytical Biochemistry 332, 261-73, 2004, usando como el substrato fluorogénico el péptido etiquetado fluorescentemente AbuRPF-K (5-Fam) -NH2) . Las afinidades de enlace de los compuestos son reportados como un valor KD (µp?) . Brevemente, se mezcla un agente con 5 nM del péptido etiquetado fluorescentemente (es decir, un péptido Smac N terminal mutado- AbuRPF-K( 5-Fam) -NH2) y 40 nM del dominio BIR respectivo por 15 minutos en temperatura ambiente en 100 mi de amortiguador de fosfato de potasio 0.1M, pH 7.5 el cual contiene 100 mg/ml de gamma-globulina bovina. Después de la incubación, se miden los valores de polarización (mP) usando un filtro de excitación de 485 nm y un filtro de emisión de 520 nm. Un agente el cual enlaza a un dominio BIR de IAP con una Kd de 10 µ? o menos, preferentemente 1 mM de menos es un inhibidor IAP de acuerdo a la invención.

Los inhibidores de IAP pueden ser moléculas pequeñas o pueden ser péptidos o moléculas a base de proteínas. En algunas modalidades un inhibidor IAP es un Smac mimético. Ejemplos de inhibidores de IAP útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las solicitudes de patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2006/0128632; US 2006/0052311; US 2005/0234042; solicitud internacional WO 2006/133147; WO 2008/045905; WO 2008/016893; US 2005/0261203; US 2006/0014700; solicitud US 2005/0261203; US 2006/0014700; US 2006/0167066; solicitud WO 2006/014361; WO 2005/094818; WO 2007/106192; US 2008/0146808; US 2007/0299052; patente 7,345,081; 7,244,851; solicitud Us 2005/0261203; US 2006/0167066; US 2006/0014700; US 2006/025347, US 2006/0194741; US 2007/0042428; WO 2006/091972; WO 2007/021825; US 2008/021066; US 2006/0194741; US 2008/0020986; WO 2005/069888; WO 2005/069894; WO 2006/010118; WO 2007/130626; WO 2006/017295; WO 2006/128455; WO 2006/020060; WO 2007/136921; US 2008/0171693; patente 7,342,093; solicitud US 2007/0032437; US 2005/0227302; US 2004/0171105; US 2005/0233411; US 2002/0132786, US 2003/0073629 y US 2005/0176649.

Agonistas del Receptor de TRAIL El agonista del receptor de TRAIL es un agente que enlaza a un receptor de TRAIL, como el receptor 1 TRAIL (TRAIL 1, también conocido como "receptor 3 de muerte" o DR4) , el receptor 2 de TRAIL (TRAIL 2, también conocido como "receptor 5 de muerte" o DR5) , o tanto DR4 y DR5, y lleva a la apoptosis en por lo menos un tipo de célula mamífera (por ejemplo humana) (como una línea celular tumoral sensible a TRAIL) cuando se usa en una cantidad efectiva para inducir la apoptosis bajo condiciones fisiológicas. Los agonistas del receptor de TRAIL de acuerdo a la invención no enlazan a receptor de señuelo de TRAIL. Los agonistas del receptor de TRAIL de acuerdo a la invención comprenden anticuerpos los cuales requieren reticulación para actividad apoptótica in vitro.

El enlace a un receptor de TRAIL puede ser evaluado por citometría de flujo. La actividad funcional de un agonista del receptor de TRAIL puede ser monitoreada por medición de la inducción de apoptosis en células Colo205 usando viabilidad celular estándar y ensayos de activación de caspasa. En algunas modalidades, los agonistas del receptor de TRAIL a DR4 y/o DR5 se enlazan a DR4 y DR5 como se evalúa por citometría de flujo y resultan en una disminución 60-100% en viabilidad celular y un incremento de 5-12 veces en actividad de caspasa 3. En algunas modalidades el agonista del receptor de TRAIL es un polipéptido de TRAIL soluble.

Citometría de Flujo En enlace de un agente a un receptor de TRAIL es detectado por citometría de flujo. En alguna modalidad, las células Colo205 son incubadas en amortiguador de bloqueo (FBS al 10%/suero de cabra al 5%/amortiguador FACS) , lavado en amortiguador FACS (1% BS/PBS) , y se vuelve a suspender en 10 µ9/p?1 de anticuerpo primario (anticuerpos DR4 o TRAIL-R1 y/o DR5 o TRAIL-R2, los cuales están comercialmente disponibles, por ejemplo de eBiosciences , San Diego, CA) o control de isotipo por 45 minutos en 4°C. Después del lavado, se vuelven a suspender las células en 10 µ<3/t?1 de anticuerpo secundario bioestañado por 45 minutos en 4°C, lavado otra vez e incubado con 10 µg/ml de estreptavidina-ficoeritrina (BD Pharmingen, San Diego, CA) por 45 minutos en 4°C. ^ Las células son entonces analizadas en un citómetro de flujo. El enlace de agonista de receptor de TRAIL puede también ser mostrado por medir la afinidad de enlace de un agonista al dominio extracelular de proteína DR4 (TRAIL-Rl) y/o DR5 (TRAIL-R2) inmovilizada en una placa de 96 pozos usando un formato a base de ELISA, como se describe en (Pukac et al., Br. J. Cáncer 92, 1430-41, 2005) .

Medición de la Inducción de Apoptosis Para monitorear la viabilidad celular, se colocan en placas las células Colo205 en 2 x 104 células/pozo y se tratan con un agonista del receptor de TRAIL en un intervalo de concentraciones relevantes para la modalidad del agonista (anticuerpo, proteína recombinante) como se describe en Gliniak, Cáncer Res. 59, 6153-58, 1999; Motoki et al., Clin. Cáncer Res. 11, 3126-35, 2005; o Pukac et al., 2005. Después de 24-48 horas, se evalúa la viabilidad por detectar el porcentaje de células muertas en un pozo.

Ensayo de Actividad de Caspasa 3 Para el ensayo de actividad de caspasa 3 , se colocan en placas las células Colo205 en 1.8 x 104 células/pozo y se tratan con un agonista del receptor de TRAIL en un intervalo de concentraciones relevantes para la modalidad del agonista (anticuerpo, proteína recombinante) como se describe en Gliniak, Cáncer Res. 59, 6153-58, 1999; Motoki et al., Clin. Cáncer Res. 11, 3126-35, 2005; o Pukac et al . , 2005.

Después de 18 horas, se mide la actividad de la caspasa 3 (por ejemplo, usando el ensayo de Caspasa Glo 3/7 (Promega, Madison, WI) de acuerdo al protocolo del fabricante) .

Los agonistas del receptor de TRAIL incluyen TRAIL por si mismo (incluyendo TRAIL recombinante) , así como también anticuerpos (particularmente anticuerpos monoclonales agonistas), pepticuerpos, avímeros, compuestos miméticos de péptido, moléculas pequeñas, y proteínas. Los anticuerpos monoclonales HGS-ETR1 ( "mapatumumab" , anticuerpo DR4), HGS-ETR2 ("lexatumumab" , anticuerpo DR5) , HGS-TR2J (anticuerpo DR5) , Apomab (anticuerpo DR5 humano) , Apo2L/TRAIL humano recombinante (el cual activa tanto DR4 y DR5) , CS-1008 (anticuerpo DR5 humanizado) , AMG 655 (anticuerpo DR5) , LBY135 (anticuerpo DR5) , y TR8 (anticuerpo DR5) son ejemplos de agonistas del receptor de TRAIL. Ver también la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 7,115,717; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 7,361,341; solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2007/029411; 2005/0249729 y 2002/0155109.

Inhibidores de TNFa Un inhibidor de TNFa de acuerdo a la invención es un agente el cual disminuye la capacidad de TNFa para matar células por 60-100%, lo cual puede ser ensayado como se describe en Moler et al., J Immunol . 1993 Agosto 1; 151 (3) ,-1548-61. Los inhibidores de TNFa inhiben o bloquean típicamente por lo menos la actividad biológica de TNFa, como evitan que se enlace el TNF a un receptor de TNF, bloqueando la producción de TNFa por procesamiento intracelular (por ejemplo, por bloquear la transcripción, translación, o modificación post- ranslación, expresión en la superficie celular, secreción o ensamble del trímero bioactivo de TNFa) . En algunas modalidades los inhibidores TNFa actúan por inducir la regulación de trayectorias metabólicas como aquellas las cuales implican la regulación ascendente o descendente de la producción de TNFa. En otras modalidades los inhibidores de TNFa modulan la sensibilidad celular a TNFa por disminuir la sensibilidad.

Los inhibidores de TNFa pueden ser anticuerpos, pepticuerpos , avimeros, compuestos miméticos de péptido, moléculas pequeñas, o proteínas. Los métodos de tamización los cuales pueden ser usados para determinar el efecto inhibitorio de un inhibidor de TNFa incluyen ensayos in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro incluyen un ensayo de citotoxicidad de TNFa, como un radioinmunoensayo, el cual determina una disminución en muerte celular por contacto con TNF ; y ensayos para inducción de TNFa de citosinas. La muerte celular puede ser determinada usando los valores ID50 los cuales representan la concentración de un inhibidor de TNFa lo cual disminuye la proporción de muerte celular por 50%.

Los inhibidores de TNFa incluyen, pero no se limitan a, inmunosupresores de espectro amplio (por ejemplo, esteroides, incluyendo glucocorticoides sintéticos como dexametasona) , curcumina, anticuerpos, y construcciones de fusión. Los anticuerpos como Infliximab (infliximab REMICADE®) , Adalimumab (adalimumab HUMIRA®) , y proteínas de fusión de receptor-construcción como Etanercept (etanercept ENBREL®) son ejemplos de inhibidores de TNFa. Ver también los inhibidores de TNFa descritos en las solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2008/0033149; 2008/0157233; y 2007/0141057. Los inhibidores de TNFa también incluyen anticuerpo y otros agentes los cuales enlazan al receptor de TNF, por lo mismo inhibiendo los efectos biológicos de TNFa.

Inhibidores de IAP, Inhibidores de TNFa y/o Agonistas del Receptor de TRAIL los cuales son Moléculas Pequeñas Los inhibidores de IAP, inhibidores de TNFa y agonistas del receptor de TRAIL los cuales son moléculas pequeñas pueden ser administrados como sales, ásteres, amidas o profármacos aceptables farmacéuticamente.

El término "sales" se refiere a sales inorgánicas y orgánicas de compuestos de la presente invención. Las sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento final y purificación de un compuesto, o por hacer reaccionar por separado un compuesto purificado en su base libre o forma de ácido con una base orgánica o inorgánica adecuada o ácido y aislando la sal de esta manera formada. Las sales representativas incluyen sales de bromohidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, acetato, oxalato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y similares. Las sales pueden incluir cationes en base a los metales alcalinos y alcalino térreos, como sodio, libio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como también cationes de amonio no tóxicos, de amonio cuaternario y aminas que incluyen, pero no se limitan a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Ver, por ejemplo, S. M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci, 66:1-19 (1977) .

Ejemplos de ásteres aceptables farmacéuticamente incluyen esteres alquilo de Ci-C8. Los ésteres aceptables también incluyen ésteres cicloalquilo de C5-C7, así como también ésteres arilalquilo como bencilo. Los ésteres alquilo de Ci-C4 son usados comúnmente. Los ésteres de compuestos pueden ser preparados de acuerdo a métodos que son bien conocidos en la técnica.

Ejemplos de amidas aceptables farmacéuticamente incluyen amidas derivadas de amoniaco, alquilaminas de Ci-C8 primarias, y dialquilaminas de Ci-C8 secundarias. En el caso de las aminas secundarias, la amina puede también estar en la forma de un grupo heterocicloalquilo de 5 ó 6 miembros el cual contiene por lo menos un átomo de nitrógeno. Las aminas derivadas de amoniaco, alquilaminas primarias de C!-C3 y dialquil aminas secundarias de Ci-C2 son usadas comúnmente. Las amidas de los compuestos pueden ser preparadas de acuerdo a los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica .

El término "profármaco" significa un compuesto que es transformado in vivo para producir un inhibidor IAP, un inhibidor de TNFa, o un agonista del receptor de TRAIL. La transformación puede ocurrir por varios mecanismos, como a través de la hidrólisis en la sangre. Una discusión del uso de los profármacos es proporcionada por T. Higuchi y . Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 de A. C.S. Symposium Series y en Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Roche, Ed. , Americam Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Para ilustrar, si el compuesto contiene un grupo funcional de ácido carboxílico, un profármaco puede comprender un éster formado por el reemplazo del átomo de hidrógeno del grupo ácido con un grupo como alquilo de (Ci-C8) , alcanoiloximetilo (C2-C12) , 1- (alcanoiloxi) etilo que tiene de 4 a 9 átomos de carbono, 1-metil-l- (alcanoiloxi) etilo que tiene de 5 a 10 átomos de carbono, alcoxicarboniloximetilo que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, 1- (alcoxicarboniloxi) etilo que tiene de 4 a 7 átomos de carbono, 1-metil-l (alcoxicarbonil) etilo que tiene de 5 a 8 átomos de carbono, N- (alcoxicarbonil) aminometilo que tiene de 3 a 9 átomos de carbono, 1- (N- (alcoxicarbonil) aminometilo que tiene de 4 a 10 átomos de carbono, 3-ftalidilo, 4-crotnolactonilo, gamma-butirolacton-4-ilo, di-N,N-alquilamino (Ci-C2) alquilo (C2-C3) (como - beta-dimetilaminoetilo) , carbamoilo-alquilo (C1-C2) , N,N-dialquilcarbamoilo (Ci-C2) -alquilo (Ci-C2) y piperidino-, pirrolidino o morfolino alquilo (C2C3) .

Similarmente, si un compuesto comprende un grupo funcional de alcohol, puede ser formado un profármaco por el reemplazo del átomo de hidrógeno del grupo de alcohol con un grupo como alcanoiloximetilo (d-C6) , 1- (alcanoiloxi (Ci-C6) etilo, 1-metil-l- (alcanoiloxi (Ci-C6) ) etilo, alcoxicarboniloximetilo (Ci-C6) , N-(alcoxicarbonilaminometilo (Ci-C6) , succinoilo, alcanoilo (Cj.-C6) , alfa-aminoalcanoilo (Ci-C4) , arilacilo y alfa-aminoacilo, o alfa-aminoacil-alfa-aminoacilo, donde cada grupo alfa-aminoacilo es seleccionado independientemente de los L aminoácidos que se presentan en forma natural, -P(O) (OH)2, -P(O) (Oalquilo (Ci-C6) ) 2 o glicosilo (el radical el cual resulta de la remoción de un grupo hidroxilo de la forma hemiacetal de un carbohidrato) .

Un inhibidor IAP, un agonista del receptor de TRAIL, o un inhibidor de TNFa pueden contener centros asimétricos o quirales, y por lo tanto, existen en formas estereoisoméricas diferentes. Se contempla que todas las formas estereosioméricas de los compuesto así como también mezclas de los mismos, incluyendo mezclas racémicas y mezclas no racémicas, puedan ser usados en la presente invención. Además, la presente invención contempla todos los isómeros geométricos y posicionales . Por ejemplo, si el compuesto contiene un doble enlace, tanto las formas cis y trans (designado como S y E, respectivamente) , así como también las mezclas, son contemplados.

La mezcla de los estereoisómeros , como las mezclas diastereoméricas , puede ser separada en sus componentes estereoquímicos individuales en la base de sus diferencias físico químicas por métodos conocidos como la cromatografía y/o cristaliazación fraccional. Los enantiómeros pueden también ser separados por convertir la mezcla enantiómeríca en una mezcla diasteromérica por reacción con un compuesto activo ópticamente apropiado (por ejemplo, un alcohol) , separando los diastereómeros y convirtiendo (por ejemplo, hidrolizando) los diastereómeros individuales a los enantiómeros puros correspondientes. También, algunos compuestos pueden ser atropisómeros (por ejemplo, biarilos substituidos) .

Los inhibidores de IAP, inhibidores de TNFa y los agonizas del receptor de TRAIL pueden existir en formas no solvatadas así como también solvatadas con solventes aceptables farmacéuticamente como agua, etanol, y similares. La presente invención contempla y comprende tanto las formas solvatadas y no solvatadas .

Es también posible que los inhibidores de IAP, los inhibidores de TNFa y agonistas del receptor de TRAIL puedan existir en diferentes formas tautoméricas diferentes. Todos los tautómeros de los compuestos son contemplados, como todas las formas tautoméricas de una porción de imidazol y todas las formas ceto-enol o imina-enamina de los compuestos.

La presente invención también contempla el uso de inhibidores de IAP etiquetados isotópicamente, inhibidores de TNFa, y agonistas del receptor de TRAIL en los cuales se reemplazan uno o más átomos por un átomo el cual tiene una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o número de masa encontrado usualmente en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden ser incorporados en los compuestos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro, como 2H, 3H, 13C,14C, 15N, 160, 170, 31P, 32P, 35S, 18F, y 36C1.

Tratamientos antitumorales En algunas modalidades, otros agentes antitumorales o tratamientos pueden ser usados en lugar de un inhibidor IAP. En otras modalidades, la combinación de un inhibidor de TNFa, un agonista del receptor de TRAIL, y un inhibidor IAP pueden ser usados junto con otros agentes y tratamientos anti-tumorales . Los tratamientos incluyen radioterapia, quimioterapia, terapia de hormonas, cirugía, inmunoterapia, terapia con agentes antitumorales biológicos y similares.

Los agentes antitumorales pueden ser seleccionados de agentes antineoplásticos, agentes anti-angiogénicos , agentes quimioterapéuticos y agentes de terapia de cáncer con péptido. En aún otra modalidad, los agentes antineoplásticos son seleccionados de agentes del tipo antibiótico, agentes alquilantes, agentes antimetabolito, agentes hormonales, agentes inmunológicos, agentes del tipo de interferón, inhibidores de quinasa, agentes misceláneos y combinaciones de los mismos. Los compuestos/agentes activos farmacéuticamente pueden ser moléculas químicas orgánicas pequeñas o pueden ser macromoléculas como proteínas, anticuerpos, pepticuerpos , ADN, AR o fragmentos de las macromoléculas .

Ejemplos de agentes activos farmacéuticamente específicos que pueden ser usados en el tratamiento de cánceres y que pueden ser usados en combinación con métodos de la presente invención incluyen: metotrexato, tamoxifen; fluorouracilo; 5-fluorouracilo ; hidroxiurea; mercaptopurina; cisplatina, carboplatina; daunoru icina; doxorubicina; etopósido; vinblastina; vincristina; pacitael; tioguanina; idarubicina; dactinomicina; imatinib; gemcitabina; altretamina; asparaginasa; bleomicina; capecitabina; carmustina; cladibrina; ciclofosfamina; citarabina; decarazina; docetaxel; idarubicina; ifosfamida; irinotecan; fludarabina; mitosmicina; mitoxano; mitoxantrona; topotecan; vinorelbina; adriamicina; mitram; imiqimod; alemtuzmab; exemestano; bevacizumab; cetuximab; azacitidina; clofarabina; decitabina; desatinib; dexrazoxano,- docetaxel; epirubicina; oxaliplatina; erlotinib; raloxifeno; fulvestrant; letrozol; gefitinib; gemtuzumab; trastuzumab; gefitinib; ixabepilona; lapatinib; lenalidomida; pemetrexed rituximab; dasatinib; talidomida; bexaroteno; temsirolimus ; bortezomib; vorinostat; capecitabina; ácido zoledrónico; anastrozol; sunitinib; aprepitant y nelarabina o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

Agentes farmacéuticamente activos adicionales que pueden ser usados en el tratamiento de cánceres y que pueden ser usados en combinación con uno o más métodos de la presente invención incluyen: epoetina alfa; darbepoetina alfa panitumumab; pegfilgrastim; palifermin; filgrastim, denosumab; ancestim: AMG 102; AMG 386; AMG 479; AMP 665; AMG 745 ; AMG 951 y AMG 706 una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

Además, las substancias de la presente invención pueden ser usadas en combinación con otros agentes que pueden ser usados para tratar el cáncer como acemannan; aclarubina; aldesleucina; alitretinoina; amifostina,- amrubicina; amsacrina; anagrelida; arglabina, trióxido arsénico; BAM 002 (Nóvelos) ; bicalutamida; broxuridina; celmoleuqina; cetrorelix; cladribina; clotrimazol; DA 3030 (Dong-A) ; daclizumab; denileucina diftitox; deslorelina; dilazep docosanol ; doxercalciferol ; doxifluridina; bromocriptina; citarabina; HIT diclofenac; interferón alfa; tretinoina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; emitefur; epirubicina; epoetina beta; fosfato de etopósido; exisulind; fadrozol; finasterida; fludarabina; fosfato; formestano; fotemustina; nitrato de galio; gemtuzumab zogamicina; combinación' de gimeracil/oteracil/tegafur; glicopina; goserelina; heptaplatina; gonadotropina coriónica humana; alfa fetoproteína fetal humana; ácido ibandrónico; interferon alfa; interferón alfa natural; interferon alfa-2; interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-Nl; interferon alfa-n3; interferon alfacon-1; interferon alfa natural; interferon beta; interferon beta-la; interferon beta- Ib; interferon gamma natural; interferon gamma-la; interferon gamma-Ib; interleucina-1 beta; iobenguano; irsogladina; lanreotida; LC9018 (Yakult) ; leflunomida; lenograstim; sulfato de lentinan; letrozol; leucocito alfa interferón; leuprorelina; levamisol + fluorouracil ; liarozol, lobaplatina; lonidamina; lovastatina; masoprocol; melarsoprol; metoclopramida; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN de doble cadena desacoplado; mitoguazona; mitolactol; mitoxantrona; molgramostim; nafarelina; naloxona + pentazocina; nartograstim; nedaplatina; nilutamida; noscapina; proteína estimulante de eritropoyesis novedosa; NSC 631570 octreotida; oprevequina; osaterona; paclitaxel; ácido pamidrónico; peginterferon alfa-2b; pentosan polisulfato de sodio; pentostatina; picibanil; pirarubicina; anticuerpo policlonal antitimocito de conejo; interferon alfa-2a de polietilenglicol ; porfimero sódico; raltitrexed; rasburicasa; etidronato de renio Re 186; retinamida RII, romurtida; samario (153 Sm) lexidronam; sargramostim,· sizofiran; sobuzoxano; sonermin; cloruro de estroncio 89; suraraina; tasonerm, tazaroteno, tegafur, temoporfin; teniposido; tetraclorodecaóxido; timalfasina; tirotropina alfa; toremifeno; tositumomab-yoduro 131; treosulfano; tretinoina; trilostano; trimetrexato; triptorelina; factor de necrosis tumoral alfa natural; ubenimex; vacuna de cáncer de vejiga; vacuna de Maruyama, vacuna de lisado de melanoma; valrubicina; verteporfina; virulizina; estimalamero de zinostatina; abarelix; AE 941 (Aeterna) ; ambamustina; oligonucleótido antisentido; bcl-2 (Genta) ; APC 8015 (Dendreon) ; dexaminoglutetimida; diaziquona; EL 532 (Elan) ; EM 800 (Endorecherche) ; eniluracilo; etanidazol; fenretinida; filgrastim SD01 (Amgen) ; galocitabina; inmunogen de gastrina 17; terapia de genes HLA-B7 (Vical) ; factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos ; diclorhidrato de histamina; tiuxetan ibritumomab; ilomastat; IM 862 (Cytran) ; interleucina-2 ; iproxifeno; LDI 200 (Milkhaus) ; leridistim; lintuzumab; anticuerpo monoclonal CA 125 (Mab) (Biomira) ; cáncer Mab (Japan Pharmaceutical Development) ; HER-2 y Fe Mab (Medarex) ; MAb 105AD7 idiotípico (CRC Technology) ; CEA Mab idiotipico (Trilex) ; LYM-l-yodina 131 MAb (Techniclone) ; mucin-itrio epitelial polimórfico 90 MAb (antisoma) ; marimastat; menogaril; mitumomab; motexafin gadolinio; MX 6 (Galderma) ; nolatrexed; proteína P 30; pegvisomant; porfiromicina; prinomastat ; RL 0903 (Shire) ; rubitecan; satraplatina; fenilacetato de sodio,- ácido esparfósico; SRL 172 (SR Pharma) ; SU 5416 (SUGEN) ; TA 077 (Tanabee) ; tetratiomolibdato; taliblastina; trombopoyetina; etiletiopurpurina de estaño; tirapazamina; vacuna de cáncer (Biomira) ; vacuna de melanoma (New York University) ; vacuna de melanoma (Sloan Kettering Institute) ; vacuna de oncolisato de melanoma (New York Medical College) ; vacuna de lisados celulares de melanoma viral (Royal Newcastle Hospital) ; o valspodar. Los agentes declarados anteriormente pueden también ser administrados como sales farmacéuticamente aceptables cuando sea apropiado.

Formulaciones Farmacéuticas y Métodos de Administración Las formulaciones farmacéuticas de los agentes descritos anteriormente comprenden típicamente un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente apropiado para un método particular de administración. El término "aceptable farmacéu icamente" significa que la substancia activa farmacéuticamente referida, o un excipiente particular, es adecuado para administración a un paciente. Los pacientes incluyen animales, particularmente mamíferos como perros, gastos, vacas, caballos, borregos y humanos.

Las composiciones adecuados para administración parental comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril de un compuesto o una composición de la invención, la cual es preferentemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede ser formulada de acuerdo a métodos conocidos usando agentes de dispersión o humectación adecuados, agentes de emulsificación y suspensión. Varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol y ácido sórbico pueden también ser incluidos. La preparación inyectable estéril puede también ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente aceptable parentalmente no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1, 3-butanodiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden ser empleados son agua, solución de Ringer, y solución de cloruro de sodio isotónico. Además, los aceites fijos, estériles son empleados convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo soso puede ser empleado incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico pueden ser usados en la preparación de inyectables. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser llevada a cabo por el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. La formulación de portador adecuada para administraciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, etc puede ser encontrada en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Las formas de dosis sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y granulos. En las formas de dosis sólidas, un compuesto o una mezcla de compuestos se mezcla con por lo menos un excipiente aceptable farmacéuticamente inerte. El término "excipiente" significa cualquier aditivo, portador, diluyente, adyuvante aceptable farmacéuticamente u otro ingrediente, diferente al ingrediente farmacéutico activo (API por sus siglas en inglés) , el cual es incluido típicamente para formulación y/o administración a un paciente. Los excipientes adecuados incluyen (a) agentes de relleno o extensores, como por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, (b) aglutinantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alignatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa, y acacia, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes de desintegrantes, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos, y carbonato de sodio, (e) retardantes de solución, como por ejemplo parafina, (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternarios, (g) agentes de humectación, como por ejemplo, alcohol cetílico, y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes, como por ejemplo, caolina y bentonita, y (i) lubricantes, como por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, o mezclas de los mismos. Las formas de dosis sólidas como las tabletas, grageas, cápsulas, pildoras, y gránulos pueden también ser preparados con recubrimientos y cubiertas, como recubrimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. La forma de dosis sólida puede también contener agentes opacificantes , y pude también ser de la composición que libera el compuesto activo o compuestos en una cierta parte del tracto intestinal en una forma retrasada. Ejemplos de composiciones de embebido las cuales pueden ser usadas son substancias y ceras poliméricas. Los compuestos activos pueden también estar en forma micro-encapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes mencionados anteriormente. Las formas de dosis sólidas pueden contener generalmente de 1% a 95% (p/p) de compuestos activos. En ciertas modalidades, los compuestos activos están en el intervalo de 5% a 70% (p/p) .

Las formas de dosis sólidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires aceptables farmacéuticamente. Además del compuesto o la mezcla de compuestos, las formas de dosis líquidas pueden contener diluyentes inertes usadas comúnmente en la técnica, como el agua u otros solventes, agentes de solubilización y emulsificantes , como por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1,3-butilenglicol , dimetilformamida, aceites, en particular, aceite de semilla de algodón, aceite de nuez molida, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de ajonjolí, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ásteres de ácidos grasos de sorbitan o mezclas de estas substancias . Además de los diluyentes inertes, la composición puede también incluir adyuvantes, como los agentes de humectación, agentes de emulsificación y suspensión, edulcorantes, saborizantes y agentes perfumantes.

Composiciones para administración rectal son preferentemente supositorios los cuales pueden ser preparados por mezclar compuestos usados en la presente invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados como la manteca de cacao, polietilenglicol o cera para supositorio, de bajo punto de fusión, las cuales son sólidas en temperaturas ordinarias pero líquidas en temperatura corporal y por lo tanto, se fusionan en el recto y la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

Las formas de dosis para administración tópica de un compuesto usado en esta invención incluyen ungüentos, polvos, aspersiones, e inhalantes. Un compuesto activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador aceptable fisiológicamente y cualesquiera conservadores, amortiguadores o propelantes como puede ser requerido. Las formulaciones oftálmicas, ungüentos, polvos y soluciones para los ojos son también contemplados para estar dentro del alcance de esta invención.

Los compuestos y composiciones usados en la presente invención pueden también beneficiarse de una variedad de sistemas de suministro, incluyendo sistemas de suministro de liberación en tiempo, liberación retrasada o liberación sostenida. La opción puede ser particularmente benéfica cuando los compuestos y la composición son usados junto con otros métodos de tratamiento como se describe con más detalle posteriormente.

Muchos tipos de sistemas de suministro de liberación son disponibles y conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Ellos incluyen sistemas de base de polímero como poli (lacturo-glicoluro) , copolioxaltos, policaprolactonas , poliesteramidas , poliortoésteres , ácido polihidroxibutírico y polianhídridos . Las microcápsulas de los polímeros mencionados anteriormente que contienen fármacos son descritos en, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 5,075,109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no polímero que son: lípidos incluyendo esteróles como el colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutrales como los mono-di y triglicéridbs ; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas a base de péptido; recubrimientos de cera; tabletas comprimidos usando enlazadores y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas erosiónales en los cuales el compuesto activo está contenido en una forma dentro de una matriz como aquella descrita en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,452,775; 4,667,014; 4,748,034 y 5,239,660 y (b) sistemas difusionales en los cuales un componente activo permea en una velocidad controlada a partir de un polímero como el descrito en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No. 3,832,253 y 3,854,480. Además, los sistemas de suministro de hardware en base a bomba pueden ser usados, algunos de los cuales son adaptados para implantación.

El uso de un implante de liberación sostenido a largo plazo puede ser deseable. La liberación a largo plazo, como se usa en la presente, significa que el implante es construido y dispuesto para suministrar niveles terapéuticos del compuesto activo por al menos 30 días, y preferentemente 60 días. Los implantes de liberación sostenida a largo plazo son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica e incluyen algunos de los sistemas de liberación descritos anteriormente.

Las formulaciones farmacéuticas pueden ser administradas en la forma convencional por rutas incluyendo rutas sistémicas, tópicas y orales. Por ejemplo, la administración puede ser, pero no se limita a, rutas parentales, subcutáneas, "intravenosas, intramusculares, intraperitoneales, transdérmicas , orales, bucales, intravaginales u oculares, por inhalación, por inyecciones de depósito, o por implantes. La administración puede ser por medio de bolo o por infusión (en el intervalo de, por ejemplo 15-30 minutos hasta 7 días) . Los modos específicos de administración dependerán de la indicación que es tratada y otros factores que incluyen el compuesto particular que es administrado. La cantidad del compuesto a ser administrado es aquella cantidad la cual es efectiva terapéuticamente. El término "cantidad efectiva terapéuticamente" significa una cantidad de un compuesto o biológico o combinaciones de los mismos que mejora, atenúa o elimina uno o más síntomas de una enfermedad o afección particular, o evita o retrasa el inicio de uno de más síntomas de una enfermedad o afección particular .

La dosis a ser administrada dependerá de las características del sujeto que es tratado, por ejemplo, el paciente particular tratado, edad, peso, salud, tipos de tratamiento concurrente, si los hay. Las dosis de inhibidores de IAP están en el intervalo de 0.5 a 50 mg/kg. Las dosis de inhibidores de TNFoc están en el intervalo de 0.1 a 50 mg/kg.

Las dosis de los agonistas del receptor de TRAIL está en el intervalo de 0.1 a 75 mg/kg. La frecuencia de tratamientos (por ejemplo, diario, semanalmenté , etc.) puede ser determinada por una persona con experiencia en la técnica (por ejemplo, el médico) por experimentación de rutina.

Los métodos de la invención pueden ser usados para inducir la apoptosis para tratar el cáncer, incluyendo tanto tumores sólidos y no sólidos, así como también varios tumores. "Tratar" como se usa en la presente, significa reducir, estabilizar o inhibir la progresión de un síntoma, como el tamaño de tumor. Los cánceres los cuales pueden ser tratados con inhibidores de IAP incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: adenocarcinoma de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer de mama, mesotelioma, neuroma periférica, cáncer de vejiga, glioblastoma, melanoma, carcinoma adrenocortical linforma relacionada al SIDA, cáncer anal, cáncer de vejiga, meningioma, glioma, astrocitoma, cáncer de mama, cáncer cervical, trastornos mieloproliferativos crónicos (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica) , cáncer de colon, cánceres endocrinos, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofageal, sarcoma de Ewing, tumores de células germinales extracraniales , tumores de células germinales extragonadales, cáncer de ducto biliar extrahepático, cáncer de vesícula, cáncer gástrica, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores trofoblásticos gestacionales, leucemia celular vellosa, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer hipofaringeal, melanoma intraocular, carcinoma de células de islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer laringeal, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, cáncer de labios, cáncer de cavidad oral, cáncer hepático, cáncer de mama masculino, mesotelioma maligna, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de célula de Merkel, cáncer de cuello escamoso metastásico, mieloma múltiple y otros neoplasmos de células de plasma, fungoides de micosis y el síndrome de Séxary, síndromes mieodisplásticos , cáncer nasofaríngea, neuroblastoma, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer orofaringeo, cánceres óseos, incluyendo osteosarcoma e histiocitoma fibroso malgino óseo, cáncer epitelial ovárico, tumores de células germinales ováricos, tumores potenciales malignos bajos ováricos, cáncr pancreático, cáncer sinusoidal paranasal, cáncer paratiroide, cáncer penil, feocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de célula renal, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer glandular salival, cáncer de la piel, cáncer de intestino pequeño, sarcoma de tejido suave, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales , pineoblastoma, cáncer testicular, timoma, carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de célula transicional de la pelvis renal y uréter, cáncer uretral, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, y tumor de Wilm y otros tumores de riñon infantiles.

El inhibidor de TNFa se administra típicamente como un pretratamiento de tal forma, preferentemente, que se logra la inhibición de TNF máxima antes de que sean administrados el inhibidor IAP y agonista de receptor del TRAIL. Una variedad de ensayos para medir la inhibición de TNF son conocidos en la técnica y pueden ser usados para monitorear la inhibición de TNF. Estos ensayos incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayos y ensayos de enlace competitivos. Ver la solicitud de los Estados Unidos de Norteamérica 2008/0167223.

El pretratamiento con el inhibidor de TNFa ocurre típicamente entre aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas antes a la administración del inhibidor IAP y agonista del receptor de TRAIL, sin embargo inhibidores de TNF de actuación muy rápida pueden ser administrados esencial y simultáneamente con el inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL (coadministrado). En algunas modalidades, el inhibidor de TNFa puede ser administrado después de la administración del inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL si se observan efectos no deseados asociados con TNFa elevado lo cual puede ser mejorado por administración de un inhibidor de TNFa. Ver Blick et al., Cáncer Res. 47, 2986- 89, 1987; Kurzrock et al., J. Clin. Oncol . 6, 1328-34, 1988 ; Spriggs et al, J. Nat'l. Cáncer Inst. 80, 1039-44; 1988; y Widenmann et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 115, 189-92, 1989.

El inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL pueden ser administrados separadamente o pueden estar presentes en la misma composición farmacéutica. En algunas modalidades los dos agentes están presentes en diferentes composiciones farmacéuticas y pueden ser administrados esencial y simultáneamente o dentro de varios minutos entre si.

Todas las patentes, solicitudes de patente y referencias citadas en esta descripción son expresamente incorporados en la presente para referencia. La descripción anterior generalmente describe la presente invención. Un entendimiento más completo puede ser obtenido por referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales son proporcionados para propósitos de ilustración solamente y no son propuestos para limitar el alcance de la invención. Un entendimiento más completo puede ser obtenido por referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales son proporcionados para propósitos de ilustración solamente y no son propuestos para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Inhibición de TNFa Reduce la Elevación inducida por Inhibidor IAP de Actividad de Caspasa 3/7 en Suero de Ratones Naive El inhibidor IAP, el compuesto X, tiene la siguiente fórmula estructural: En la cual "Me" es metilo. El compuesto X y sus síntesis son descritos en la solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2006/0194741 (en el cual el compuesto X es el compuesto no. 116) . El compuesto X resulta en caspasa 3/7 elevada en el suero de ratones naive (que no porta tumor) . Este experimento demuestra que la inducción de actividad de caspasa 3/7 por el inhibidor IAP puede ser bloqueada por inhibición de TNFa.

Los ratones desnudos NCr que no portan tumor (Taconic Farms, Inc., Germantown, NY) son inyectados intraperitonealmente de acuerdo al siguiente esquema: Grupo de Pre-tratamiento Tratamiento ratones 1 Con-FC (500 pg) Vehículo 2 Con-FC (500 g) Compuesto X(15 mg/kg) ¦3 PEG-huTNFRl-FC (100 g) Compuesto X(15 mg/kg) 4 PEG-huTNFRl-FC (200 g) Compuesto X(15 mg/kg) 5 PEG-huTNFRl-FC (300 g) Compuesto X(15 mg/kg) 6 PEG-huTNFRl-FC (400 g) Compuesto X(15 mg/kg) 7 PEG-huTNFRl-FC (500 g) Compuesto X(15 mg/kg) 8 PEG-huTNFRl-FC (500 Vehículo 9 Anti-muTNFa (500 g) Vehículo 10 Anti-muTNFa (500 g) Compuesto X(15 mg/kg) 11 Hámster Igc (500 g) Vehículo 12 Hámster Igc (500 g) Compuesto X(15 mg/kg) tabla anterior, "anti-muTNFalfa" anticuerpo monoclonal generado contra TNFa, y "PEG-huTNFRl-FC" es una fusión humana PEGilada de TNFR1 con una porción FC de inmunoglobulina; "con-FC" es la porción FC sola (control) . Las fusiones de TNFR1 y una porción FC de inmunoglobulina pueden ser preparadas usando métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,808,029: 5,605,690; ó 6,142,866. Métodos de PEGilación son bien conocidos en la técnica. Todos los volúmenes de inyección son loo µ? y cada grupo consiste de 3 ratones.

Las inyecciones de pretratatniento son administradas dos horas antes a las inyecciones de tratamiento. Seis horas después de las inyecciones de tratamiento, los ratones son sacrificados, y se recolecta el suero y se almacena en -80 °C. La actividad de caspasa 3/7 en las muestras de suero es evaluada usando el sistema de ensayo CASPASE-GLO® 3/7 (Promega, Madison, WI) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Este ensayo proporciona substrato de aminoluciferina de caspasa 3/7 proluminiscente (Asp-Glu-Val- r Asp) y una luciferasa termoestable en un reactivo optimizado para actividad de caspasa 3/7, actividad de luciferasa, y lisis celular. Agregar el reactivo provoca lisis celular, seguido por escisión de caspasa del substrato, lo cual libera aminoluciferina libre; la luciferina de amino libre es consumida por la luciferasa, generando una señal luminiscente la cual es proporcional a la actividad de caspasa 3/7. Las unidades de luz relativas (RLU) son determinadas usando un lector de placa de Wallac Envision (Perkin Elmer) .

Los resultados son mostrados en la Figura 1. La inyección intraperitoneal del compuesto X del inhibidor IAP resulta en actividad de caspasa 3/7 elevada en el suero de ratones naive (grupos 2 y 12) . Sin embargo, la actividad de la caspasa 3/7 es reducida drásticamente si los ratones son inyectados primero con un anticuerpo neutralizante para TNFoc de murino (grupo 10) . Además, la administración de una dosis incrementada de la proteína recombinante PEG-huTNFRl-FC también inhibe la actividad de caspasa 3/7 inducida por el compuesto X en el suero de ratones naive (grupos 3-7) .

Estos experimentos demuestran que la elevación inducida por el inhibidor IAP de actividad de caspasa 3/7 en el suero de ratones naive se reduce por la inhibición de TNFa.

Ejemplo 2 Efectos de una Dosis Menor de un Inhibidor IAP en varias Mediciones de Apoptosis en Ratones del tipo silvestre contra Ratones Deficientes en TNFR La inhibición de una cIAP provoca la muerte celular por sobre regulación de la producción de TNFa. De esta forma, los ratones desnudos dobles TNF (p55/p75) (DKO) deben ser menos tendientes a apoptosis en respuesta a inhibición de cIAP , comparados con ratones del tipo silvestre (WT por sus siglas en inglés) . Para probar esta hipótesis, el compuesto X el inhibidor IAP se administra a ratones WT y a ratones desnudos dobles p55/p75 TNFR (TNFR DKO) . Se evalúa la actividad apoptótica por medir los niveles de caspasa 3 séricos, monitoreando las cuentas de células sanguíneas, y por análisis histológicos de apoptosis en tejidos específicos por inmunohistoquímica.

Los ratones WT C57B1/6 o TNFR DKO de aproximadamente seis semanas de edad son obtenidos a partir de Taconic Farms, Inc. Se formula el compuesto X en 12.5% de CAPTISOL®, una beta-ciclodextrina del éter sulfobutilo cargada aniónicamente , y se administra a ratones WT o TNFR DKO en 30 mg/kg, intraperitonealmente , diariamente por cinco días consecutivos. Los grupos incluyen ratones WT o TNFR DKO tratados con vehículo (n=5) o compuesto X (n=10) .

Se monitorea el peso corporal a través del estudio de los días 0 a 8. Cinco ratones son sometidos a necropsia a partir de los grupos tratados con el compuesto X en el día 5 aproximadamente 5 horas después de la quinta dosis diaria para evaluar los niveles de caspasa 3 sérica, cuentas completas sanguíneas (CBC por sus siglas en inglés) , y apoptosis específica a tejido. Se recolecta la sangre entera por medio de punción cardiaca, y se separa el . suero de acuerdo a los procedimientos estándar. Los niveles de caspasa 3 séricos son cuantificados usando el sistema de ensayo CASPASE-GLO® 3/7 Promega descrito anteriormente.

Los ratones restantes son permitidos para recuperarse y son sometidos a necropsia en el día 9 (5 ratones cada uno a partir de los grupos tratados con el vehículo y compuesto X). Los tejidos recolectados incluyen piel, corazón, pulmón, timo, estómago, intestino delgado, y colon. Los tejidos son fijados en formalina amortiguada neutral en 10%, embebidos en parafina, seccionados en 5 µp?, teñidos con hematoxilina y eosina, y examinados con microscopía de luz transmitida. Las lesiones histopatológicas son identificadas y graduadas subjetivamente en la siguiente escala: 0 (sin cambio) , 1 (cambio insignificante) , 2 (cambio ligero) , 3 (cambio moderado) , 4 (cambio marcado) y 5 (cambio severo) . El grado de severidad para cada categoría de lesión es promediada por 3 animales por grupo.

El tratamiento con el compuesto X en esta dosis resulta en pérdida mínima de peso corporal en tanto ratones WT y TNFR DKO (Figura 2) . Los ratones C57B1/6 son conocidos para ser menos sensibles a una variedad de agentes que algunas otras cepas de ratón. Su tolerancia para el compuesto X, medida por la pérdida de peso corporal, parece ser superior a otras cepas (>10% de pérdida de peso corporal es observada en ratones desnudos Balb/c y Ncr tratados como se describe anteriormente con el compuesto X) .

Los datos CBC sugieren una reducción en plaquetas y reticulocitos en el día 5, recuperando por el día 9 en tanto ratones WT y TNFR DKO, con los ratones WT que son más afectados que los ratones TNFR DKO en el día 5 (Figuras 4, 5 ) .

Los niveles de caspasa 3 sérica son superior en ratones WT en el día 5 comparados con los ratones TNFR DKO, indicando que la trayectoria de señalización de TNF es importante para inducir la apoptosis después de la inhibición de cIAP. Los niveles de caspasa 3 sérica regresan a su línea base en tanto los ratones tratados con el compuesto X ya sea WT y TNFR DKP por el día 9. Ver la Figura 3.

El tratamiento con el compuesto X induce la apoptosis de epitelio del tracto intestinal (Figuras 6, 7) y células básales epidérmicas (Figuras 8, 9) y provoca degeneración y apoptosis de linfocitos del timo (Figuras 10, 11) . La evidencia indirecta del grado de hematopoyesis extramedular en el bazo de animales de recuperación indica que las células hematopoyéticas de la médula ósea son también degeneradas después del tratamiento. Los efectos provocados por el tratamiento con el compuesto X son significativamente menos severos o son evitados efectivamente (atrofia cortical tímica y degeneración celular hematopoyética) en ratones TNFR DKO que en ratones WT.

Ejemplo 3 Efectos de una Dosis Superior de un Inhibidor IAP en varias Mediciones de Apoptosis en Ratones del tipo Silvestre contra Deficiente en TNFR Los ratones C57B1/6 son conocidos para ser menos sensibles a una variedad de agentes que algunas otras cepas de ratón. Su tolerancia para el compuesto X, medida por la pérdida de peso corporal, parece ser superior a otras cepas como se discute en el Ejemplo 2. Como un resultado, se repite el estudio con una dosis superior del compuesto X con el fin de producir una respuesta más robusta en los ratones C57B/1 similar a lo que ha sido previamente observado en otras cepas de ratón.

En este ejemplo, el compuesto X del inhibidor IAP es administrado a ratones del tipo silvestre (WT) y desnudos dobles p55/p75TNFR (TNFR DKO) en 40 mg/kg qdx5 i.p. comparados con 30 mg/kg en el Ejemplo 2, anterior. Se evalúa la toxicidad mediada por TNFoc por medir los niveles de caspasa 3 sérica y por monitorear las cuentas de células sanguíneas .

Los ratones WT o TNFR DKO C57B1/6 de aproximadamente dieciséis semanas son obtenidos de Taconic Farms, Inc. Se forma el compuesto X en 12.5% de CAPTISOL®, una beta-ciclodextrina de éter sulfobutilo cargado aniónicamente , y se administra a los ratones WT o TNFR DKO en 40 mg intraperitoneal , diariamente por cinco días consecutivos. Los grupos incluyen ratones WT o TNFR DKO con el vehículo (n=13) o el compuesto X (n=13 o 14) . Los pesos corporales son monitoreados a través del estudio de los días 1 a 5. Todos los ratones son sometidos a necropsia en eld ía 5 aproximadamente 4 a 6 horas después de la quinta dosis diaria para evaluar los niveles de caspasa 3 sérica, las cuentas sanguíneas completas (CBC por sus siglas en inglés) , y apoptosis específicos de tejido. La sangre entera es recolectada por medio de la punción cardiaca, y se separa el suero de acuerdo a los procedimientos estándar. Los niveles de caspasa 3 sérica son cuantificados usando el sistema de ensayo Promega CASPASE-GLO® 3/7 como se describe previamente .

El tratamiento con el compuesto X en 40 mg/kg resulta en 10% de pérdida de peso corporal en ratones WT comparados con 0% en ratones TNFR DKO (Figura 12A) . Los datos sugieren que la señalización a través de los receptores de TNF contribuye a pérdida de peso corporal inducida por el compuesto X.

Los niveles de caspasa 3 séricos son elevados en ratones T comparados con los ratones TNFR DKO, indicando que la trayectoria de señalización de TNF es importante para inducir la apoptosis después de la inhibición de cIAP (Figura 12B) .

Los datos CBC indican una reducción marcada en reticulocitos , plaquetas y células de glóbulos blancos en el día 5 en los ratones WT comparados con los ratones TNFR DKO. Las células de glóbulos rojos y cuentas de hemoglobina son relativamente no cambiadas después del tratamiento con el compuesto X en tanto los ratones WT y TNFR DKO (Figura 13A-C) . Los neutrófilos parecen ser incrementados y los linfocitos son disminuidos en tanto los ratones WT y TNFR DKO después del tratamiento con el compuesto X con relación a los controles de vehículo (Figura 13D) .

Ejemplo 4 Demostración que la Inhibición de TNFa no bloquea la sinergia de agonista del receptor de TRAIL con inhibidores de IAP in vitro Las células son sembradas en placas de 96 pozos de fondo plano (fondo limpio, paredes blancas) en una concentración de 1 x 104 células/pozo y se incuban durante la noche en 37°C, C02 al 5%. Al siguiente día células son estimuladas con TRAIL en una concentración en el intervalo de ng/ml a 1 µg/ml (4 veces de diluciones) en combinación con el compuesto X del inhibidor IAP en una concentración en el intervalo de 0.01 nM a 10 mM (diluciones diez veces) .

Un anticuerpo de bloqueo a TNFct humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) se agrega a algunos cultivos en una concentración final de 5 µ /?a1 dos horas antes a la adición de la combinación de TRAIL y el compuesto X. Los volúmenes de cultivo final son 100 µ? .

Después de 48 horas, se determina la viabilidad celular usando el ensayo de ATPLITE™, un sistema de monitoreo de trifosfato de adenosina (ATP por sus siglas en inglés) en base a luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (Perkin Elmer, Waltham, MA) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se mide las unidades de luz relativas (RLU) usando un lector de placa LJL Biosystems Analyst HT (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . El porcenta e de células sobrevivientes se calcula como a continuación: (experimental RLU/control RLU) x 100. Se determina la RLU de control por probar las células no tratadas. Los resultados son mostrados en la Figura 14.

Como se muestra en la Figura 14A, la línea celular de carcinoma de colon HCT116 es resistente a la muerte celular inducida por el compuesto X pero muestra alguna sensibilidad a TRAIL, ya que solamente 40% de las células sobreviven en altas concentraciones (1 µg/ml) de TRAIL. Sin embargo, cuando se administran el TRAIL y el compuesto X son administrados esencial y simultáneamente parece haber un efecto incrementado en la muerte celular. Este efecto sinergístico en la muerte celular no es bloqueado en la presencia de un anticuerpo neutralizante al TNFoc humano (Figura 14B) .

La Figura 14C demuestra que la línea celular de melanoma A375 es parcialmente resistente a muerte por agente sencillo inducida por ya sea el compuesto X o TRAIL; sin embargo, la combinación de TRAIL y el compuesto X induce la muerte celular muy eficiente. Similar a la línea celular HCT116, este efecto sinergístico no es alterado en la presencia de un anticuerpo neutralizante al TNFoc humano (Figura 14D) .

La línea celular de carcinoma ovárico SKOV-3 es resistente a la muerte celular inducida por TRAIL pero parece tener alguna sensibilidad a la muerte celular inducida por el compuesto X (Figura 14E) . Este eficacia de un solo agente es mediada por medio de TNFoc, ya que la presencia de un anticuerpo neutralizante al TNFoc humano bloquea la muerte celular inducida por el compuesto X (Figura 14F) . En forma interesante, cuando se usan TRAIL y el compuesto X juntos en la presencia de un anticuerpo neutralizante al TNFa humano, se remueve la inhibición de muerte celular inducida por el compuesto X debido al anticuerpo, y la combinación exhibe muerte celular potente. Se obtienen resultados similares con las siguientes líneas celulares cancerígenas. Colo205 (adenocarcinoma de colon humano) , MDA-MB-468 (adenocarcinoma de mama humano) , HCT-15 (adenocarcinoma de colon humano) , MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano; obtenido de American Type Culture Collectión, ATCC) y MDA-MB-231 (subcepa BB) , la cual es una subcepa diferente.

Estos resultados demuestran que la inhibición de TNFa. no bloquean la actividad antitumoral incrementada de la combinación de los inhibidores de TRAIl y IAP in vitro.

Ejemplo 5 Tratamiento de Ratones con un Inhibidor de TNFa, un inhibidor IAP y un agonista del receptor de TRAIL Este ejemplo reporta los resultados de un experimento en el cual los ratones son tratados con un inhibidor de TNFa, un inhibidor IAP, y un agonista del receptor de TRAIL. El inhibidor de TNFa es "TNFR1-FC" (ver el ejemplo 1) . El inhibidor IAP es el compuesto X (ver el Ejemplo 1) . El agonista del receptor de TRAIL es un anticuerpo agonista (anticuerpo "M413", el cual es un anticuerpo monoclonal de ratón generado contra el receptor 2 de TRAIL, o DR5; ver Griffith et al., J. Immunol. 162, 2597- 605, 1999) para evaluar los efectos en activación de caspasa de tumor, lo cual puede predecir la actividad antituraoral.

Los ratones que portan el tumor SKOV3 son tratados como se describe en la gráfica en la Figura 15. Los ratones que reciben 500 g de TNFRl-FC total son pretratados 2 horas antes. Seis horas después del tratamiento con el compuesto X (15 mg/kg) , M413 (50 µg total) o ambos, se eutanizan los ratones por asfixia con C02, y se escinden los tumores y se congelan a presión en nitrógeno líquido. Los tumores son homogenizados usando perlas de acero inoxidable de 5 mm (Qiagen) en amortiguador de lisis RIPA (Termo Scientific, Rockford, IL) que contiene inhibidores de proteasa (Roche, Indianápolis, IN) en una proporción de aproximadamente 1 µ? de amortiguador/ 1 mg de tejido. Los lisados son corridos en Tissuelyser por 90 segundos en 30 Hz por ciclo por un total de 3-4 ciclos hasta que se disocia completamente el tejido tumoral. Los lisados son entonces filtrados a través de tubos Qiashredder (Qiagen) por centrifugación en 14,000 rpm por 10 minutos en 4°C a residuos de gránulos . Los sobrenadantes de lisado tumoral son transferidos a nuevos tubos y se determinan las concentraciones de proteína usando el ensayo BCA de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Termo) .

Los lisados tumorales son analizados para la presencia de caspasa-3 escindida por el ensayo de caspasa 3 escindida en MSD de acuerdo a las especificaciones del fabricante (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) . Se miden las unidades de luz relativa (RLU) usando el lector de placa Sector (Meso Scale Discovery) . Los resultados son mostrados en la Figura 15. Los ratones tratados con vehículo son mostrados en la banda 1, lo cual indica el nivel antecedente basal de caspasa 3 activada en tumores SK0V3.

Como se espera, el tratamiento de tumores SK0V3 con el compuesto X solo resulta en un incremento en caspasa 3 activada sobre el control del vehículo (banda 2) . El tratamiento con el anticuerpo DR5 M413 también incrementa la actividad de la caspasa 3 sobre el control del vehículo, pero no al grado que lo hace el compuesto X (Banda 3) . La combinación del compuesto X con M413 es similar a la actividad observada con el compuesto X solo, sugiriendo que la inducción de caspasa tumoral con el compuesto X está ya en un nivel máximo. El tratamiento de tumores con TNFRl-FC solo (Banda 5) no tiene efecto en la actividad de la caspasa tumoral. Sin embargo, cuando se agrega TNFRl-Fe 2 horas antes al compuesto X, este parcialmente bloquea la actividad de la caspasa tumoral inducida por el compuesto X (comparada con la banda 6 a banda 2) . Esto sugiere que TNF es requerido para la actividad de caspasa tumoral inducida por el único agente de compuesto X en tumores SKOV3 y bloquear el TNF usando TNFRl-FC puede disminuir este efecto.

Es posible que el bloqueo parcial en la activación de caspasa inducida por el compuesto X con TNFRl-Fc observada es debido a ya sea una cantidad limitante de TNFRlFc o requiere un tiempo de pretratamiento superior. El pretratamiento TNFRl-Fc no puede ser esperado para impactar los efectos de M413. Consistente con esto, hay una reducción mínima de activación de caspasa tumoral en la presencia de TNFRl-Fc y M 13 (Banda 7) . El pretratamiento de ratones con TNFRl-Fc puede bloquear la activación de caspasa tumoral SKOV mediada por el solo agente el compuesto X, como se muestra en la banda 6. Sin embargo, cuando el anticuerpo agonista DR5 M413 es agregado en combinación con el compuesto X en la presencia de TNFRl-c, se observa una inducción máxima de actividad de caspasa tumoral (Banda 8) . Esto sugiere que el bloqueo en la actividad del único agente el compuesto X (por bloquear TNF) no tiene efecto en la capacidad del compuesto X para cooperar con M413.

Estos datos soportan el hecho de que la actividad del único agente el compuesto X y la cooperatividad del compuesto X con un agonista del receptor de TRAIL como la función M413 son por medio de trayectorias distintas. Estos datos también soportan la idea que un bloqueador de TNF puede funcionar para permitir la actividad antitumoral del agonista del receptor TRAIL-compuesto X in vivo, mientras que reduce la posibilidad de efectos no deseados.

La invención descrita en la presente lleva por sí misma a un método para vender un inhibidor IAP, un inhibidor de TNFa o un agonista del receptor de TRAIL que comprende diseminar la información para pacientes prospecto o reales o prescriptores con relación a la combinación de terapias descritas en la presente. La información puede incluir, por ejemplo, que los efectos no deseados que pueden ser asociados con la terapia de inhibición de IAP pueden ser mitigados por administración de una dosis menor del inhibidor IAP mientras que se administra junto con un inhibidor de TNFa y un agonista del receptor de TRAIL, como se describe anteriormente .

La descripción mencionada anteriormente de varios aspectos de la invención ha sido presentada para propósitos de ilustración y descripción. No se propone para ser exhaustiva o para limitar la invención a la forma precisa descrita, y obviamente, muchas modificaciones y variaciones son posibles. Las modificaciones y variaciones que pueden ser aparentes para una persona experta en la técnica son propuestos para ser incluidas dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una cantidad efectiva terapéuticamente de: (a) un inhibidor de TNFa; (b) un inhibidor IAP; y (c) un agonista del receptor de TRAIL.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor IAP es una molécula pequeña.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de TNFa es una molécula pequeña .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista del receptor de TRAIL es una molécula pequeña.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL son administrados simultáneamente.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL son administrados secuencialmente.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo el cual consiste de cáncer ovárico, cáncer de mama y cáncer de colon.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor IAP es un mimético de Smac .

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de TNFa es un anticuerpo .

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo el cual consiste de infliximab o adalimumab.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de TNFa es administrado por una cantidad suficiente de tiempo para lograr la inhibición de TNFa antes a la administración del inhibidor IAP y el agonista del receptor de TRAIL. 0

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de TNFa es Etanercept.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista del receptor de TRAIL es un anticuerpo. c

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo DR4.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo DR5.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo DR4 y un anticuerpo DR-5.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista del receptor de TRAIL es un polipéptido de TRAIL soluble.