MX2011001615A - Metodo para el diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica basado en un perfil metabolomico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). El método se basa en la determinación de ciertos marcadores metabólicos en una muestra biológica del paciente que aumentan o disminuyen en los pacientes de EHNA con respecto a pacientes que muestran hígado graso (esteatosis).

Description

MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO DE ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHÓLICA BASADO EN UN PERFIL METABOLÓMICO Campo de la Invención La invención se refiere al campo de los métodos de diagnóstico y, más en particular, a un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) basado en la determinación de los niveles de una serie de marcadores metabólicos que se alteran en pacientes de EHNA con respecto a pacientes con hígado graso sencillo (esteatosis ) .

Antecedentes de la Invención La enfermedad hepática grasa no alcohólica (EHGNA) abarca un amplio rango de afecciones caracterizadas por la acumulación de grasa en las células hepáticas de personas que no beben alcohol de forma excesiva. En un extremo de la escala está el relativamente inocuo hígado graso sencillo, o esteatosis, que no produce daño hepático significativo. Si no se trata esta afección puede desarrollarse a afecciones más avanzadas, algunas de las cuales pueden! amenazar la vida. La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una evolución significativa en la EHGNA, que corresponde a una afección agresiva caracterizada por el hinchamiento y la sensibilidad del hígado. Con una inflamación intensa, en aumento se puede formar una acumulación de tejido cicatricial (fibrosis), produciendo finalmente cirrosis donde masas irregulares, conocidas como nodulos, sustituyen al tejido hepático liso y el hígado se vuelve más duro. El efecto de esto, junto con la cicatrización continua a partir de la fibrosis, significa que el hígado se quedará sin células sanas para apoyar las i funciones normales. Esto puede producir un fallo hepático total. La mayoría de las personas con hígado graso tienen sobrepeso o son obesas. Puesto que cada vez más personas llevan una vida inactiva y llevan peso extra con ellas, el número de casos de hígado graso, en partíicular de EHNA, está en aumento. Por tanto, existe una necesidad para pruebas diagnósticas que puedan proporcionar una evaluación consistente de la presencia de EHNA o esteatosis en un enfermo.

Actualmente no existe una prueba de laboratorio específica para EHNA, lo que hace extremadamente difícil el diagnóstico ya que incluso las personas que desarrollan fibrosis y cirrosis pueden sufrir daño hepático durante muchos años antes de que los síntomas sean aparentes.

La única prueba ampliamente aceptada para distinguir EHNA de otras formas de enfermedad es una biopsia hépática. Este proceso implica pasar una aguja de agujero fino a través de la piel y hasta el hígado, retirando una pequeña muestra de tejido que se somete a examen histológico. Aparte del evidente malestar inducido por este procedimiento agresivo, la evaluación con frecuencia es subjetiva y propensa a error de muestreo.

Hasta la fecha se han descrito varios métodos para la detección de EHGNA basados en medir propiedades físico-químicas. Por ejemplo, un escáner del hígado con equipo de imagen tal como imágenes de resonancia magnética (RM) permite detectar depósitos de grasa (esteatosis) en el hígado. El documento WO080 1128 describe un método para el diagnóstico de EHNA basado en la determinación de la impedancia eléctrica del hígado usando un par de electrodos que se colocan en - - contacto con el hígado usando cirugía abdominal abierta (laparotomía) . Sin embargo, este método requiere el contacto directo de los electrodos con el hígado, lo que lo hace más apropiado para la detección de EHNA en hígados explantados antes de que se trasplanten a un receptor y no permite distinguir las diferentes fases de EHGNA.

Otros métodos se basan en la presencia de diferentes polimorfismos en genes implicados en el metabolismo de lípidos. Estos polimorfismos se pueden detectar en líquidos corporales y, por tanto, se pueden considerar como métodos no agresivos o mínimamente agresivos. Por ^ejemplo, el documento WO06117945 describe un método para el: diagnóstico de EHNA detectando el polimorfismo genético T94A en FABP1 en una muestra biológica de un sujeto.

Otros métodos se basan en la determinación de. los niveles de expresión de una o más proteínas o metabolitos en líquidos corporales. En particular, el documento WO06082522 describe un método para detectar esteátosis en un paciente mediante la determinación de los niveles de ApoAl, a2-macroglobulina, alanina aminotransferasa, gamma glutamil transpeptidasa y triglicéridos .

El documento WO08021192 describe un método no agresivo para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades hepáticas tales como EHNA y esteátosis basado en la determinación de los niveles de ácidos grasos y eicosánoides en un , líquido corporal del paciente. Sin embargo, este método está limitado a la identificación de especies lipídicas y requiere pasos de fraccionamiento complejos de los líquidos corporales antes de que se puedan detectar los metabolitos. ¦ Lelliot et al (FASEB J. , 2005, 19: 1108-1119) describen un método para detectar EHNA inducida por tamoxifeno basado en la determinación de los perfiles metabólicos en sangre usando [1H]-R N. Sin embargo, este método se realiza en muestras obtenidas mediante biopsia hepática y de esta manera, es un método muy agresivo.

El documento WO07136822 describe un método para la detección de EHNA de otras EHGNA determinando el estado de fosforilación de uno o más miembros de la vía AKT/mTOR/IRS en tejido adiposo de un sujeto. Sin embargo, este método requiere la obtención de una muestra de tejido adiposo de un paciente, dando asi como resultado un método mínimamente agresivo.

Claramente existe una necesidad de métodos no agresivos alternativos a los métodos de diagnóstico existentes, que reduzcan las molestias del paciente y los costes [ de la estancia hospitalaria al tiempo que proporcionan una evaluación más consistente y estandarizada.

Sumario de la Invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico diferencial del tipo de EHGNA en un paciente que comprende determinar en una muestra biólógica de dicho paciente el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en las tablas 2 y 3 y comparar los niveles de dichos marcadores con los niveles de los mismos marcadores en una muestra positiva para EHNA y/o en una muestra positiva para esteatosis en donde (i) al paciente se le diagnostica que tiene EHNA cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólico ( s ) definidos en la tabla 2 aumentan con respecto a los niveles de los mismos marcadores metabólicos en un muestra positiva para esteatosis y/o cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólicos definidos en la tabla 3 disminuyera con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos en un muestra positiva para esteatosis, y/o (ii) al paciente se le diagnostica que tiene esteatosis cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólico (s) definidos en la tabla 2 disminuyen con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos en una muestra positiva para EHNA y/o cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólicos definidos en la tabla 3 aumentan con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos : en una muestra positiva para EHNA.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la determinación de la eficacia de una terapia para EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que padece EHNA y que ha sido tratado con dicha terapia el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 o la tabla 3 en donde la terapia se considera eficaz para el 1 tratamiento de EHNA cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 2 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en un muestra de referencia y/o cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 3 aumenta (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en un muestra de referencia.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para la identificación de compuestos adecuados ; para el tratamiento de EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que padece EHNA y que ha sido tratado con un compuesto candidato el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en i la tabla 2 o la tabla 3 en donde el compuesto se considera eficaz para el tratamiento de EHNA o esteatosis cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólicó (s) definidos en la tabla 2 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismo(s) marcador(es) metabólicó (s) en un muestra de referencia y/o cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólicó ( s ) definidos en la tabla 3 aumenta(n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólicó ( s ) en un muestra de referencia. [ En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método para la identificación de compuestos capaces de inducir EHNA que comprende determinar en una muestra biológica del sujeto que ha sido tratado con el compuesto candidato el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 o la tabla 3 en donde el compuesto se considera capaz de inducir EHNA cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólicó (s) definidos en la tabla 2 aumenta (n) con respecto al/a los nivel (es) del/de los mismo (s) marcador (es ) metabólicó (s) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólicó (s) definidos en la tabla 3 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólicó (s) en un muestra' de referencia.

Breve Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1.- Análisis por PLS-DA: Sujetos sanos frente a pacientes con EHGNA. Sanos (¦) , esteatosis de grado 1 (A) , esteatosis de grado 2 (o), esteatosis de grado 3 (0), EHNA ( + ) Figura 2. Análisis por OPLS: Sujetos con esteatosis de grado 1 frente a sujetos con EHNA. La selección de biomarcadores candidatos (marcados) se logra filtrando los correspondientes perfiles de carga.

Descripción Detallada de las Modalidades Representativas de la Invención I . Diagnóstico de EHNA o de una predisposición a EHNA Los autores de la presente invención han dado un paso significativo para abordar la necesidad de métodos no agresivos para el diagnóstico de EHNA realizando perfiles metabólicos de muestras de suero de ' pacientes como una alternativa no agresiva para el diagnóstico de EHNA. Los autores de la presente invención han identificado una serie de marcadores metabólicos presentes en el suero de pacientes que padecen EHNA que están presentes a niveles diferentes con respecto al suero de pacientes con hígado graso sencillo (esteatosis) . Estos marcadores metabólicos se pueden usar después en un método de diagnóstico rápido no agresivo para EHNA.

De esta manera, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método (de aquí en adelante1 "el primer método de la invención") para el diagnóstico diferencial del tipo de EHGNA en un paciente que comprende determinar en una muestra biológica de dicho paciente el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos ert las tablas 2 y 3 y comparar los niveles de dichos marcadores con los niveles de los mismos marcadores en una muestra positiva para EHNA y/o en una muestra positiva para esteatosis en donde (i) al paciente se le diagnostica que tiene EHNA cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólico (s) definidos en la tabla 2 aumentan con respecto a los niveles de los mismos marcadores metabólicos en un muestra positiva; para esteatosis y/o cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólicos definidos en la tabla 3 disminuyen con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos en un muestra positiva para esteatosis, y/o (ii) al paciente se le diagnostica que tiene esteatosis cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólico (s) definidos en la tabla 2 disminuyen con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos en una muestra positiva para EHNA y/o cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólicos definidos en la tabla 3 aumentan con respecto al nivel de los mismos marcadores; metabólicos en una muestra positiva para EHNA.

La expresión "método para diagnosticar" como se denomina según la presente invención significa .que el método puede consistir esencialmente en los ; pasos mencionados anteriormente o puede incluir pasos adicionales. Sin embargo, se debe entender que el método, en una , forma de realización preferida, es un método que se lleva a cabo in vitró, es decir, no se practica en el cuerpo humano o del animal.

Diagnosticar como se usa aquí se refiere a evaluar la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad. Como entenderán los expertos en la materia, tal evaluación, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que padece la enfermedad o que tiene una predisposición a la misma. El experto en la materia puede determinar si una parte es estadísticamente significativa sin más dilación usando varias herramientas de evaluación estadística' bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba t de Student, prueba de Mann- hitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John , Wiley & Sons Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05.

El término "EHGNA", como se usa aquí, se refiere a un grupo de afecciones que tienen en común la acumulación de grasa en los hepatocitos. EHGNA varía desde el hígado graso sencillo (esteatosis) , a esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) , a cirrosis (cicatrización avanzada, irreversible del hígado) . El término "EHNA", como se usa aquí, se refiere colectivamente al estado donde el hígado desarrolla un trastorno hepático (por ejemplo, inflamación, hinchazón, fibrosis, cirrosis o cáncer), o al estado en que el hígado puede inducir tal afección patológica, y "EHNA" se distingue de "esteatosis sencilla"; es decir, una afección en que la grasa simplemente se acumula en el hígado y que no progresa a otra afección de desarrollo de trastorno hepático.

El término "marcador metabólico", como se usa aquí, se refiere a compuestos de molécula pequeña, tal como sustratos de enzimas de rutas metabólicas, intermediarios dé tales rutas o los productos obtenidos mediante una ruta metabólica. Las rutas metabólicas son bien conocidas en la técnica y pueden variar entre especies. Preferiblemente, dichas rutas incluyen al menos el ciclo del ácido cítrico, la cadena respiratoria, fotosíntesis, fotorrespiración, glucólisis, gluconeogénesis, la ruta de .la hexosa monofosfato, ruta oxidativa de la pentosa fosfato, producción y ß-oxidación de ácidos grasos, ciclo de la urea, rutas de biosíntesis de aminoácidos, rutas de degradación de proteínas tal como la degradación por el proteasoma, rutas de degradación de aminoácidos, biosíntesis o degradación de: lípidos, policétidos (incluyendo por ejemplo flavonoides e isoflavonoides ) , isoprenoides (incluyendo por ejemplo, terpenos, esteróles, esferoides, caroténoides, xantofilas) , hidratos de carbono, fenilpropanoídes y derivados, alcaloides, bencenoides, índoles, compuestos de indol-azuf e, porfirinas, antocianos, hormonas, vitaminas, cofactores tales como grupos prostéticos o transportadores de electrones, lignina, glucosinolatos, purinas, pirimidinas, nucleósidos, nucleótidos y moléculas relacionadas tal como ARNt, micro ARN (miARN) o ARNm. De acuerdo con esto, los metabolitos de compuestos de molécula pequeña están preferiblemente compuestos de las siguientes clases de compuestos: alcoholes, alcanos, alquenos, alquinos, compuestos aromáticos, cetonas, aldehidos, ácidos carboxílieos , ésteres, aminas, iminas, - - amidas, cianuros, aminoácidos, péptidos, tioles, tioésteres, ésteres de fosfato, ésteres de sulfato, tioéteres, sulfóxidos, éteres, o combinaciones o derivados de los compuestos mencionados anteriormente. Las moléculas pequeñas entre los metabolitos pueden ser metabolitos primarios, que se requieren para la función celular normal, función de órganos o crecimiento, desarrollo o salud del animal. Además, los metabolitos de molécula pequeña comprenden además metabolitos secundarios que tienen función ecológica esencial, por ejemplo metabolitos que permiten a un organismo adaptarse a su medio ambiente. Además, los metabolitos no están limitados a dichos metabolitos primarios y secundarios y abarcan además compuestos artificiales de molécula pequeña. Dichos compuestos artificiales de molécula pequeña derivan de moléculas pequeñas proporcionadas de forma exógena que se administran o son tomadas por un organismo pero no son metabolitos primarios o secundarios como se han definido anteriormente. Por ejemplo, los compuestos artificiales de molécula pequeña pueden ser productos metabólicos obtenidos de fármacos por rutas metabólicas del animal. Por otra parte, los metabolitos incluyen además péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y polinucleótidos , tales como ARN o ADN. Más preferiblemente, un metabolito tiene un peso molecular de 50 Da (Dalton) a 30.000 Da:, más preferiblemente menos de 30.000 Da, menos de 20.000 Da, menos de 15.000 Da, menos de 10.000 Da, menos de 8.000 Da, menos de 7.000 Da, menos de 6.000 Da, menos de 5.000 Da,, menos de 4.000 Da, menos de 3.000 Da, menos de 2.000 Da,' menos de 1.000 Da, menos de 500 Da, menos de 300 Da, menos de 200 Da, menos de 100 Da. Preferiblemente, un metabolito tiene, sin embargo, un peso molecular de al menos 50 Da. Lo más preferiblemente, un metabolito según la presente invención tiene un peso molecular de 50 Da hasta 1.500 Da. En formas de realización preferidas, los marcadores metabólicos que se pueden usar en el contexto de la presente invención son aquellos marcadores indicados en las tablas 2 y 3.

Se entenderá que el método de la invención se puede llevar a cabo determinando el nivel de un número variable de metabolitos definidos en las tablas 2 y 3 en la muestra biológica del sujeto en estudio. Por el ejemplo,: el/los nivel (es) de un biomarcador, dos o más biomarcadores, tres o más biomarcadores, cuatro o más biomarcadores, cinco o más biomarcadores, seis o más biomarcadores, siete o más biomarcadores, ocho o más biomarcadores, nueve o más biomarcadores, diez o más biomarcadores, etc., incluyendo una combinación de todos los marcadores metabólicos identificados en la tabla 2 y/o en la tabla 3. La determinación de niveles de combinaciones de los biomarcadores puede permitir mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de EHNA, y puede permitir una mejor diferenciación de EHNA dé otras enfermedades que puedan tener marcadores similares o superpuestos.

"Muestra" o "muestra biológica" significa material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar el biomarcador deseado y puede comprender material celular y/o no celular del sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier tejido o liquido biológico adecuado tal como, por ejemplo, tejido prostético, sangre, plasma sanguíneo, suero, orina o líquido cefalorraquídeo (LCR) .: Preferiblemente, las - - muestras usadas para la determinación de los perfiles de metabolitos son muestras que se pueden obtener usando procedimientos mínimamente agresivos. En una forma de realización preferida, las muestras son muestras de suero.

El método de la invención incluye el paso de determinar los niveles del marcador o los marcadores metabólicos en una muestra y comparar dichos niveles a los niveles de los mismos marcadores en una muestra de referencia en donde dicha muestra de referencia es una muestra positiva para esteatosis o una muestra positiva para EHNA. Los términos "muestra positiva para esteatosis" o "muestra positiva para EHNA" se refieren, respectivamente, a muestras aisladas de pacientes que han sido diagnosticados con cualquiera de estas afecciones. Preferiblemente, el diagnóstico se ha llevado a cabo mediante biopsia hepática de modo que el paciente se clasifica como que padece hígado graso o esteatosis si el tejido muestra grasa sin inflamación y daño mientras que el paciente se clasifica como que tiene EHNA cuando el examen microscópico del tejido muestra grasa junto con inflamación y daño a las células hepáticas. La muestra positiva para esteatosis y/o la muestra positiva para EHNA pueden ser el resultado de mezclar muestras de un individuo o una población de dos o más individuos. La población, por ejemplo, puede comprender tres, cuatro, cinco, diez, 15, 20, 30, 40, , 50 o más individuos.

Los niveles del metabolito o metabolitos en estudio en la "muestra de referencia" pueden ser una cantidad o concentración absoluta o relativa del biomarcador, la presencia o ausencia del biomarcador, un intervalo de cantidad o concentración del biomarcador, una cantidad o concentración mínima y/o máxima del biomarcador, una cantidad o concentración media del biomarcador, y/o una cantidad o concentración mediana del biomarcador; y, además, los "niveles de referencia" de combinaciones de biomarcadores también pueden ser razones de cantidades o concentraciones absolutas o relativas de dos o más biomarcadores uno respecto al otro. Los niveles de referencia positivos y negativos apropiados de biomarcadores para un estado particular de enfermedad, fenotipo o falta de los mismos se pueden determinar midiendo los niveles de biomarcadores deseados en uno o más sujetos apropiados, y tales niveles de referencia se pueden ajustar a poblaciones específicas de sujetos (por ejemplo, un nivel de referencia puede estar unido a la edad de modo que se pueden hacer comparaciones entre niveles de biomarcadores en muestras de sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para un estado particular de enfermedad, fenotipo o falta de los mismos en un cierto grupo de edad) . Tales niveles de referencia también se pueden ajustar a técnicas específicas que se usan para medir los niveles de biomarcadores en muestras biológicas (por ejemplo, LC-MS, GC-MS, etc.), donde los niveles de biomarcadores pueden ser diferentes basados en la técnica específica que se usa. En una forma de realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de un sujeto sano o de un sujeto sin historia previa de EHGNA.

Se considera que un marcador metabólico aumenta : en una muestra del sujeto en estudio cuando los niveles aumentan con respecto a la muestra de referencia en al menos el 5%; en al menos el 10%, en al menos el 15%, en al menos el 20%, en al menos el 25%, en al menos el 30%, en al: menos el 35%; en al menos el 40%, en al menos el 45%, en al menos el 50%, en al menos el 55%, en al menos el 60%, en al menos el 65%, en al menos el 70%, en al menos el 75%, en al menos el 80%, en al menos el 85%, en al menos el 90%, en al menos el 95%, en al menos el 100%, en al menos el 110%, en al menos el 120%, en al menos el 130%, en al menos el 140%, en al menos el 150%, o más. De forma similar, se considera que el marcador metabólíco disminuye cuando sus niveles diminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos el 5%, en al menos el 10%, en al menos el 15%, en al menos el 20%, en al menos el 25%, en al menos el 30%, en al menos el 35%', en al menos el 40%, en al menos el 45%, en al menos el 50%, en al menos el 55%, en al menos el 60%, en al menos el 65%, en al menos el 70%, en al menos el 75%, en al menos el 80%, én al menos el 85%, en al menos el 90%, en al menos el 95%, en al menos el 100% (es decir, ausente) .

Además, la determinación de los metabolitos en los métodos según la presente invención, comprende, preferiblemente, un paso de separación de los metabolitos presentes en la muestra antes del! paso de análisis. Preferiblemente, dicho paso de separación de compuestos produce una separación en el tiempo de los metabolitos comprendidos en la muestra. Las técnicas adecuadas para la separación que se usan preferiblemente según la presente invención, por tanto, incluyen todas las técnicas de separación cromatográficas tal como cromatografía líquida (LC) , cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , cromatografía de gases (GC) , cromatografía en capa fina, cromatografía de exclusión molecular o de afinidad. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y los puede aplicar el experto en la materia sin más dilación. Lo más preferiblemente, el método de la presente invención prevé el uso de LC y/o GC . Los dispositivos adecuados para tal determinación de metabolitos son bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, se usa espectrometría de masas en particular cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC-MS) , cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC-MS), espectrometría de masas por infusión directa o espectrometría de masas de resonancia de ión ciclotrónico por transformada de Fourier (FT-ICR-MS) , electroforesis capilar/espectrometría de masas (CE-MS) , cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS) , espectrometría de masas en cuadrupolo, cualquier espectrometría de masas acoplada de forma secuencial, tal como MS-MS o MS-MS-MS, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS), pirólisis- espectrometría de masas (Py-MS), espectrometría de masas por movilidad de iones o espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF) , espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS), ESI-MSMS, ESI-MS/ (MS ) n, espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS ) , espectrometría de masas por desorción/ionización láser aumentada por superficie tiempo de vuelo (SELDI-TOFMS) , desorción/ionización sobre silicona (DIOS), espectrometría de masas de ión secundario (SIMS), tiempo de vuelo en cuadrupolo (Q-TOF) , espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI-MS) , APCI-MSIMS, APCI-(MS)n, espectrometría de masas de fotoionización a presión atmosférica (APPI-MS) , APPI-MSIMS, y APPI- (MS) n, espectrometría de masas en cuadrupolo, espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS) y espectrometría de masas por trampa de : iones, donde n es un número entero mayor que cero. Lo más preferiblemente, se usa LC-MS como se describe en detalle posteriormente. Dichas técnicas se divulgan en, por ejemplo, Nissen, Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37-57, ; US 4.540.884 o US 5.397.894, el contenido de la divulgación de las cuales se incorpora aquí mediante referencia.

En una forma de realización preferida, la determinación de los niveles de los metabolitos se lleva a cabo mediante espectrometría de masas (MS) . En una forma de realización aún más preferida, la muestra biológica se fracciona mediante cromatografía líquida antes de la determinación de los niveles de.l marcador o los marcádores metabólicos. En una forma de realización preferida, la cromatografía líquida se realiza en una columna C8 a 40°C. La columna se puede eluir con un gradiente lineal de 10 minutos usando una fase móvil a una velocidad de flujo de 140 µL/min, que consiste en solvente A al 100% (típicamente ácido fórmico al 0,05%) durante 1 minuto seguido por un aumento incremental de solvente B (típicamente acetonitrilo: que contiene ácido fórmico al 0,05%) hasta el 50% durante un minuto más, aumentando hasta el 100% de B durante los siguientes 6 minutos antes de volver a la composición inicial listo para la inyección posterior que se produjo en un sistema de 45 s de un tiempo de reciclado.

II. Método para la determinación de la eficacia de una terapia para EHGNA La invención también proporciona un método para la determinación de la eficacia de la terapia para EHNA.. De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un método (de aquí en adelante "el segundo método de la invención") para la determinación de la eficacia de 'una terapia para EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que padece EHNA y que ha sido tratado con dicha terapia el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 o la tabla 3 en donde la terapia se considera eficaz para el tratamiento de EHNA cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico ( s ) definidos en la tabla 2 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico ( s ) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 3 aumenta (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) en una muestra de referencia.

Los diferentes aspectos del segundo método de la invención (los métodos usados para la determinación, de los niveles de los marcadores, la naturaleza de la muestra que se va a estudiar, los umbrales para considerar que un marcador ha aumentado o disminuido) son esencialmente como se han definido previamente con respecto al primer método de la invención.

El término "muestra de referencia", como se usa con respecto al segundo método de la invención para la determinación de la eficacia de una terapia para EHNA, se refiere a una muestra que deriva de un, paciente en donde la eficacia de la terapia se está ensayando pero obtenida del paciente antes de la administración de la terapia. ?? : otra forma de realización, la muestra de referencia es una muestra de un paciente que padece EHNA que bien no ha sido tratado o que ha sido tratado con terapia control, preferiblemente, el mismo excipiente, soporte o vehículo que se usa en la terapia cuya eficacia para el tratamiento de EHNA se va a evaluar.

El término "terapia" como se usa aquí, abarca el tratamiento de EHNA existente así como el tratamiento preventivo (es decir, profilaxis) . Terapia incluye, pero no está limitada a, administrar un agente para tratar EHNA, tratar afecciones metabólicas asociadas tales como diabetes e hiperlipidemia, mejorar la resistencia a insulina, seguir una dieta equilibrada y saludable, evitar el alcohol y evitar medicamentos innecesarios.

III. Método para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de EHNA Los autores de la presente invención también han desarrollado un método para la identificación de un compuesto adecuado para el tratamiento de EHNA. La identificación de una serie de metabolitos cuyos niveles aumentan o disminuyen con respecto a muestras positivas para esteatosis permite el cribado de compuestos en un modelo de EHNA que son capaces de restablecer los niveles de los marcadores a los encontrados en muestras positivas para esteatosis.

De esta manera, en otro aspecto, la. invención se refiere a un método (de aquí en adelante "el tercer método de la invención") para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un paciente que padece EHNA y que ha sido tratado con un compuesto candidato, el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en las tabla 2 o la tabla 3 en donde el compuesto se considera eficaz en el tratamiento de EHNA o esteatosis cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico ( s ) definidos en la tabla 2 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismos marcador (es) metabólico (s ) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles de' uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 3 aumenta (n) con respecto al nivel del/de los . mismos marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia.

Los diferentes aspectos del tercer método de la invención (los métodos usados para la determinación de los niveles de los marcadores, la naturaleza de la muestra que se va a estudiar, los umbrales para considerar que un marcador ha aumentado o disminuido) son esencialmente como se: han definido previamente con respecto al primer método de la invención.

El término "muestra de referencia", como se usa en relación al tercer método de la invención, se refiere a una muestra que deriva del paciente en donde, se ensaya la terapia pero obtenida del paciente antes de la . administración de la terapia. En otra forma de realización, la muestra de referencia es una muestra de un paciente que padece EHNA que bien no se ha tratado o que se ha tratado con una terapia control, preferiblemente, el mismo excipiente, soporte o vehículo que se usa en el compuesto candidato que se criba.

Los ejemplos de los animales adecuados para su uso en el método de cribado de la invención incluyen, pero no están limitados a, ratones, ratas, conejos, monos, cobayas, 1 perros y gatos. Según esta forma de realización, se administra el compuesto de prueba o un compuesto control (por ejemplo, por vía oral, rectal o parenteral tal como intraperitoneal o intravenosa) a un animal adecuado y se determina el efecto sobre los niveles de uno o más de los metabolitos mostrados en las tablas 2 o 3. Los ejemplos de agentes que sé pueden probar según el tercer método de la invención incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucleicos (por ejemplo ADN y ARN) , hidratos de carbono, lipidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas y, otros fármacos. Los agentes se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos planteamientos en los métodos de librerías combinatorias conocidos en la técnica. Los compuestos de prueba incluyen además, por ejemplo, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, anti-idiotípicos , quiméricos y de cadena sencilla así como fragmentos Fab, F(ab')2, librerías de expresión de Fab, y fragmentos de unión a epítopos de anticuerpos) . Además, los agentes o librerías de compuestos se pueden presentar, por ejemplo, en solución, sobre bolas, chips, bacterias, esporas, plásmidos o fagos.

Si el compuesto es un compuesto de bajo peso molecular, entonces este se puede generar mediante varios métodos conocidos en la técnica, preferiblemente de forma sintética, en particular mediante química combinatoria, o mediante métodos bioquímicos, en particular, mediante expresión recombinante o purificación a partir de sondas biológicas. El compuesto es de bajo peso molecular ("moléculas pequeñas") o la librería está compuesta de moléculas con bajo peso molecular ("librería de moléculas pequeñas"). Una "molécula pequeña" se define como una colección compleja de compuestos, que se producen de forma no biológica, lo que significa que i no se producen mediante expresión recombinante, como por ejemplo la mayoría de las librerías de proteínas o péptidos. Las "moléculas pequeñas" se pueden generar mediante varios métodos conocidos en la técnica, pero se producen preferiblemente de forma sintética, más preferiblemente mediante química combinatoria, para generar una librería de compuestos con una diversidad química máxima dentro de las restricciones de las características predichas de un fármaco atractivo. Si el compuesto cuya idoneidad para el tratamiento de EHNA se va a ensayar es un péptido o una librería de péptidos, entonces estos se pueden generar mediante varios métodos conocidos en la técnica para su uso como compuestos candidatos, pero preferiblemente se producen mediante métodos bioquímicos, más preferiblemente mediante expresión recombinante en células procariotas o eucariotas.

El compuesto cuya idoneidad para la terapia de EHNA se va a ensayar se puede formular con un soporte farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica, que se puede administrar a un ser humano u otro animal. Un soporte farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua, tampón fosfato de sodio, solución salina tamponada con fosfato, solución salina normal o solución de Ringer u otra solución salina fisiológicamente tamponada, u otro solvente o vehículo, tal como un glicol, glicerol, un aceite tal como aceite de oliva, o un éster orgánico inyectable. Un soporte farmacéuticamente aceptable también puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o . aumentar la absorción del compuesto modulador. El experto en la materia sabría que la elección de un soporte farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición.

IV. Método para la identificación de compuestos capaces de inducir EHGNA en un sujeto La identificación de un perfil de marcadores metabólicos cuyos niveles se alteran en pacientes que padecen EHNA con respecto a sujetos con ácido graso sencillo (esteatosis) se puede usar en un método para la identificación de compuestos capaces de inducir EHNA en un sujeto poniendo en contacto un sujeto positivo para esteatosis con un compuesto del que se sospecha que produce EHNA y midiendo la variación en los niveles de uno o más de los marcadores indicados en las tablas 2 y 3.

De esta manera, en otro aspecto, lá invención se refiere a un método (de aquí en adelante "el cuarto método de la invención") para la identificación de compuestos capaces de inducir EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que ha sido tratado con un compuesto candidato el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 y/o la tabla 3 en donde el compuesto se considera capaz de inducir EHGNA cuando los niveles del/de los marcador (es) metabólico ( s ) definidos en la tabla 2 aumenta (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles del/de los marcador (es) metabólico ( s) definidos en la tabla 3 disminuye (n) , con respecto a los niveles del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s). en una muestra de referencia.

Los diferentes aspectos del cuarto método de la invención (los métodos usados para la determinación de los niveles de los marcadores, la naturaleza de la muestra que se va a estudiar, los umbrales para considerar que un marcador ha aumentado o disminuido) son esencialmente como se han definido previamente respecto al primer método de la invención .

El término "muestra de referencia", como se usa en relación al cuarto método de la invención, se refiere á una muestra que deriva del paciente en donde se ensaya el efecto de un compuesto candidato obtenida antes de la administración del compuesto candidato. En otra forma de realización, la muestra de referencia es una muestra de un sujeto positivo para esteatosis que bien no se ha tratado o que se ha trátado con una terapia control, preferiblemente, el mismo excipiente, soporte o vehículo que se usa en el compuesto candidato que se criba.

La invención se describe aquí a modo de los siguientes ejemplos que se deben considerar como meramente ilustrativos y no limitantes de la invención.

EJEMPLOS Recogida de muestras Se recogió el suero de una serie dé pacientes agrupados según el examen histológico de un biopsia hepática (Estándar europeo: esteatosis de grado 1, 2, 3 o '????) . En la tabla 1 se exponen detalles de las muestras. [ PESO ALTURA SUERO HOMBRE MUJER IMC TÉCNICA (kg) (can) Análisis Sano 5 5 71 ± 6 169 ± 4 25 ± 2 bioquímico Esteatosis 1 7 90 ± 3 160 ± 3 36 ± 1 Biopsia de grado 1 Esteatosis 2 5 99 + 9 162 + 5 38 + 3 Biopsia de grado 2 Esteatosis 1 2 116 ± 15 164 ± 4 42 + 3 Biopsia de grado 3 EHNA 1 10 93 ± 5 155 ± 2 39 ± 2 Biopsia Tabla 1: Tabla demográfica que incluye las características de los pacientes usados en el presente estudio.

Extracción de metabolitos Las proteínas se precipitaron de las muestras de suero (100 µ?) añadiendo cuatro volúmenes de metanol en microtubos de 1,5 mi. Después de agitar brevemente las muestras se incubaron durante la noche a -20°C. Se recogieron los sobrenadantes después de una centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos, se secaron y se resuspendieron en, 120 µ? de metanol al 80%; el metanol se añadió primero, seguido por una agitación corta, después el agua, y, una agitación final. Las muestras extraídas resultantes se transfirieron después a viales para el análisis por UPLC/MS. Se preparó una muestra de "control de calidad" (CC) mezclando volúmenes iguales (20 µ?) de cada una de las muestras cuando se hacían alícuotas para el análisis. Este suero "mezcla" se usó para proporcionar una muestra "media" representativa que contenía todos los analitos encontrados durante el análisis.

Cromatografía La cromatografía se realizó en una columna de 1 mm d.i. 100 mm ACQUITY™ 1,7 µ?? C8 BEH (Waters Corp., ilford, EE UU) usando un sistema ACQUITY™ UPCL. La columna se mantuvo a 40°C y se eluyó con un gradiente lineal de 10 minutos. La fase móvil, a una velocidad de flujo de 140 µ?/min, consistía en solvente A al 100% (ácido fórmico al 0,05%) durante un minuto seguido por un aumento incremental de solvente B (acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 0,05%) hasta el 50% durante un minuto más, aumentando hasta el 100% 'de B durante los siguientes 6 minutos antes de volver a la composición inicial en preparación para la posterior inyección que se produjo en un sistema de 45 s de tiempo de reciclado.

Espectrometría de masa Se introdujo el eluyente en el espectrómetro dé masas (Waters LCT Premier) mediante ionización de electrospray, con diferencias de potencial de capilar y de cono ajustadas en modos de ión positivo y negativo a 3200 V y 30 V, y 2B00 V y 50 V respectivamente. El gas de nebulización se fijó a 500 L/h a una temperatura de 200°C. El gas de cono se fijó a 50 L/h y la temperatura fuente se fijó ; a 120°C. Los datos centroides se adquirieron a partir de m/z 50-1000 usando un tiempo de acumulación de 0,2 s por espectro. Todos los espectros se corrigieron para la masa a tiempo real mediante referencia a la leucina encefalina, infüsionada a 50 yL/min a través de un electrospray de referencia independiente/ con muestras cada 5 s. Se analizó una mezcla de prueba apropiada de compuestos estándar antes y después de la serie completa de inyecciones de muestras al azar por triplicado para examinar la estabilidad del tiempo de retención, la precisión de la masa y la sensibilidad del sistema a lo largo del curso de la carrera que duró un máximo de 36 h por lote de muestras inyectadas.

Procesamiento de datos Todos los datos se procesaron usando el administrador de la aplicación MarkerLynx para el software MassLynx 4.1. En los datos de LC/MS se detectan los picos y se reduce el ruido tanto en los dominios LC como en los MS de modo que sólo los picos analíticos verdaderos son adicionalmente procesados por el software (por ejemplo, se rechazan los picos fuera de escala) . Se genera después una lista de las intensidades de los picos detectados para la primera muestra, usando pares de datos del tiempo de retención (TR) y m/z como el identificador para cada pico. Este proceso se repite para cada carrera LC/MS y los datos de cada análisis de LC/MS en el lote se clasifican después de modo que los datos correctos de la intensidad de los picos para cada par RT-m/z se alinean en la tabla final de datos. Las intensidades iónicas para cada pico detectado se normalizan, en cada muestra, respecto a la suma de las intensidades de los picos en esa muestra. Las intensidades normalizadas de los picos resultantes se multiplican después por 10.000 para formar una matriz única con pares RT-m/z para cada archivo en la hoja de datos.

Análisis de los perfiles metabólicos de los pacientes Se usó el análisis discriminante : de mínimos cuadrados parcial, PLS-DA, para comparar los perfiles metabólicos para muestras de sujetos que tenían EHGNA con los perfiles metabólicos de sujetos sanos controles. El resultado de este análisis se muestra en la figura 1 donde se ve una separación clara entre pacientes sanos y con , EHGNA en el' primer componente (ti) . El segundo componente (t2) explica la evolución a través de las diferentes fases de EHGNA, donde una puntuación más positiva corresponde a una gravedad creciente -desde esteatosis de grado 1 (t2 -vo) hasta EHNA (t2 +vo) .

Descubrimiento de biomarcadores Se usó el procedimiento de análisis de mínimos cuadrado ortogonal parcial a estructuras latentes (OPLS-DA) para el descubrimiento de biomarcadores. En este planteamiento el modelo PLS se rota de modo que la información de clase se encuentra en el primer componente predictivo, tp (variación correlacionada) , mientras que la variación no relacionada con la separación de clase se ve en los cqmponentes ortogonales (variación no correlacionada) . El ^diagrama de puntos correspondiente a este análisis se puede usar después para ver la correlación (eje y) entre los pares RT-m/z (correspondientes a los metabolitos) y la designación de clase modelada; el eje x explica la contribución relativa de los diferentes marcadores al modelo. El análisis por PLS-DA se llevó a cabo entre muestras de esteatosis de grado 1 y EHNA. La figura 2 muestra el diagrama de puntos correspondiente a este análisis, que revela un número de biomarcadores candidatos, marcados en ; rojo, tanto los que aumentan como los que disminuyen.

Las tablas 2 y 3 contienen las intensidades normalizadas de los picos, con los errores estándar asociados, de una serie de biomarcadores para distinguir pacientes con esteatosis frente a pacientes diagnosticados con EHNA. La tabla 2 contiene aquellos marcadores que aumentaban en pacientes de EHNA con respecto a los pacientes que padecían esteatosis de grado 1. La tabla 3 contiene aquellos marcadores que disminuían en pacientes de EHNA con respecto a pacientes que padecían esteatosis de grado 1. Las identidades de estos biomarcadores no se conocen en este momento. Tales identidades no son necesarias para la identificación de los biomarcadores en muestras de sujetos, ya que la información del par RT-m/z mostrada en la tabla es suficiente para permitir tal identificación.

Esteatosis veces de Metabolito Tr m/z EHNA de grado 1 1 aumento Metabolito 1 2,80 541, 2647 13,7 (1,19) 11, 06 (1, 02) 1,239 Metabolito 2 3, 06 567,3160 6, 58 (1, 09) 3,87 (0,62) 1,700 Metabolito 3 3, 32 528, 2631 53,2 (11,25) 34,04 (4,45) 1, 563 Metabolito_4 4, 67 450,2983 0, 89 (0, 24) 0,48 (0,13) 1,854 Metabolito 5 5, 94 305,2472 17,03 (2,79) 13, 52 (1, 78) ; 1,260 Metabolito 6 6, 40 449, 3633 3,03 (0,81) 1,56 (0,43) 1,942 Metabolito_7 7,29 773, 5780 20,53 (1,38) 18,09 (0,87) ¦ 1,135 Metabolito 8 7, 60 775, 5955 6,62 (0, 58) 5,29 (0,29) 1,251 Esteatosis veces de Metabolito Tr m/z EHNA de grado 1 alimento Metabolito_9 7,73 731, 6121 2,81 (0,68) 1,77 (0,35) 1, 588 Metabolito_10 7,87 792, 5976 4,62 (1,1) 3,04 (0,61) 1,520 Tabla 2 : Intensidades de pico normalizadas en pacientes de EHGNA y pacientes de esteatosis de grado 1 y tiempos de retención de los marcadores metabólicos que aumentan en pacientes de EHNA con respecto a pacientes de esteatosis grado 1.

Tabla 3 : Intensidades de pico normalizadas en pacier EHGNA y pacientes de esteatosis de grado 1 y tiempos retención de los marcadores metabólicps que disminuyen en pacientes de EHNA con respecto a pacientes de esteatosis de grado 1.

Diagnóstico La identificación de biomarcadores para EHNA permite el diagnóstico de EHNA en sujetos que presentan uno o más síntomas de EHNA. Un método para diagnosticar (o ayudar en el diagnóstico) si un sujeto tiene EHNA comprende (1) analizar una muestra de suero de un sujeto para determinar el/los nivel (es) de uno o más biomarcadores de EHNA en la muestra y (2) comparar el/los nivel (es) del uno o más biomarcadores en la muestra con los niveles de referencia positivos para EHNA y/o negativos para EHNA del uno o más biomarcadores para diagnosticar (o ayudar en el diagnóstico) si un sujeto tiene EHNA. El uno o más biomarcadores que se usan se seleccionan de las tablas 2 y 3. Cuando se usa tal método para ayudar en el diagnóstico de EHNA, los resultados del método se pueden usar junto con otros métodos (o los resultados de los mismos) útiles en la determinación clínica de, si un sujeto tiene EHNA.

Claims (10)

REIVI DICACIO ES

1. Un método para el diagnóstico diferencial del tipo de EHGNA en un paciente que comprende determinar en una muestra biológica de dicho paciente el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en las tablas 2 y 3 y comparar los niveles de dichos marcadores con los niveles de los mismos marcadores en una muestra positiva para EHNA ¦ y/o en una muestra positiva para esteatosis en donde (i) al paciente se le diagnostica que tiene EHNA cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólico (s) definidos en la tabla 2 aumentan con respecto a los niveles de los mismos marcadores metabólicos en un muestra positiva para esteatosis y/o cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólicos definidos en la tabla 3 disminuyen con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos en un muestra positiva para esteatosis, y/o (ü) al paciente se le diagnostica que tiene esteatosis cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólico (s) definidos en la tabla 2 disminuyen con respecto al nivel de : los mismos marcadores metabólicos en una muestra positiva para EHNA y/o cuando los niveles de uno o más del marcador o marcadores metabólicos definidos en la tabla 3 aumentan con respecto al nivel de los mismos marcadores metabólicos en una muestra positiva para EHNA.

2. Un método para determinar la eficacia' dé una terapia para EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que padece EHNA y que ha sido tratado con dicha terapia el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 o la tabla 3 en donde la terapia se considera eficaz para el tratamiento de EHNA cuando los 'niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 2 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles, de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s ) definidos en la tabla 3 aumenta (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia.

3. Un método para identificar compuestos adecuados para el tratamiento de EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que padece EHNA y que ha sido tratado un compuesto candidato el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 ,o la tabla 3 en donde el compuesto se considera eficaz para el tratamiento de EHNA o esteatosis cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 2 disminuye (n) con respecto al nivel' del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles de uno . o más del/de los marcador (es) metabólico ( s ) definidos en la tabla 3 aumenta (n) con respecto al nivel , del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia.

4. Un método según se define en las reivindicaciones 2 ó 3 en donde la muestra de referencia se selecciona del grupo de (i) una muestra del paciente antes de que se ponga en contacto con la terapia o con el compuesto candidato y (ii) una muestra de un paciente que padece EHNA que bien no se ha tratado o que ha sido tratado con una terapia control.

5. Un método para la identificación de compuestos capaces de inducir EHNA que comprende determinar en una muestra biológica de un sujeto que ha sido tratado un compuesto candidato el/los nivel (es) de uno o más de los marcadores metabólicos definidos en la tabla 2 o la tabla 3 en donde el compuesto se considera capaz de inducir EHNA cuando los niveles de uno o más del/de, los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 2 aumenta (n) con respecto al/a los nivel (es) de los mismo (s) marcador (es) metabólico (s) en una muestra de referencia y/o cuando los niveles de uno o más del/de los marcador (es) metabólico (s) definidos en la tabla 3 disminuye (n) con respecto al nivel del/de los mismo (s) marcador (es) metabólico ( s ) en una muestra de referencia.

6. Un método según se define en la reivindicación 5 en donde la muestra de referencia se selecciona del grupo de (i) una muestra del paciente antes de que se ponga en contacto con el compuesto candidato y (ii) una muestra de un paciente positivo para esteatosis o de un paciente positivo para esteatosis tratado con un compuesto control que se sabe que no produce EHNA.

7. Un método según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la muestra biológica es suero .

8. El método según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende analizar los niveles de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez o al menos quince de los biomarcadores seleccionados de las tablas 2 y 3.

9. Un método según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde la determinación del nivel de uno o más marcadores biológicos se lleva a cabo mediante espectrometría de masas ( S) .

10. Un método según se define en la reivindicación 1 a 9 en donde la muestra biológica se fracciona mediante cromatografía líquida antes de la ; determinación de los niveles del marcador o los marcadores metabólicos.