MX2010014555A - Reoviridae aviar unico. - Google Patents

Abstract

La presente invención es concerniente con nuevas cepas únicas de reoviridae aviar que fueron aisladas a partir de casos severos de Síndrome de Impedimento o Atrofia de Crecimiento de Animal Pequeño. La presente invención también es concerniente con el aislamiento y usos de nuevos reoviridae aviares únicos, análisis de diagnóstico que utilizan componentes específicos de nucleótidos o aminoácidos de tales virus, tal como la secuencia que codifica la proteína de cápsido Sigma C y con vacunas que protegen a las aves de enfermedades provocadas por tales virus.

Description

REOVIRIDAE AVIAR ÚNICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con nuevas cepas únicas de reoviridae aviares que fueron aisladas de varios casos de Síndrome de Atrofia o Impedimento de Crecimiento de Animal Pequeño. La presente invención también es concerniente con el aislamiento y usos de nuevos reoviridae aviares únicos, análisis de diagnóstico que ¦ utilizan componentes específicos de nucleótidos o aminoácidos de tales virus, tal como la secuencia que codifica la proteína de cápsido Sigma C y con vacunas que protegen a las aves de enfermedades provocadas por tales virus .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los Reoviridae tales como inter alia, reovirus, que se replican en el citoplasma, son no envueltos con una- simetría icosahedral y un cápsido de doble cubierta. El genoma viral consiste de 10 segmentos de AR de doble hebra (dsAR ) , que pueden ser separados en tres clases de tamaño: L (grande), M (medio) , y S (pequeño) . Las proteínas codificadas por el genoma también se separan en tres tamaños . Los segmentos de genoma específicos responsables por la codificación de proteína han sido identificados por la cepa S1133 de reovirus aviar.

Los reovirus aviares son miembros del género ortoreovirus de la familia de Reoviridae. Ubicuos en aves de corral comerciales, se pueden diferenciar mediante configuración antigénica, patotipo, patogenicidad relativa, crecimiento en cultivo celular, huevos de pollo émbrionados sensibles a tripsina, y especificidad de huésped y tejido.

Los . reovirus clásicos han sido aislados de una variedad de tejidos en pollos afectados por condiciones de enfermedad diversificada, en las que se incluyen artritis viral/tenosinovitis, síndrome de atrofia o incremento de crecimiento,' enfermedad respiratoria, enfermedad entérica, inmunosupresión y síndrome de mala absorción. Han sido encontrados frecuentemente en pollos que eran clínicamente normales . La naturaleza de la enfermedad que ocurre enseguida de la infección de reovirus es mucho muy dependiente de la edad del huésped, estatus inmune, patotipo de virus y ruta de exposición. Los reovirus también han sido aislados de pavos, patos, gansos, palomas, faisanes, pericos y otras especies aviares exóticas .

En pollos tipo carne jóvenes, las pérdidas económicas relacionadas con infecciones de reovirus están frecuentemente asociadas con mortalidad incrementada, artritis viral/tenosinovitis y una carencia general de desempeño incluyendo ganancia de peso disminuida, conversiones de alimento deficientes, velocidades de crecimiento desiguales y comercialización reducida de aves afectadas.

Síndrome de Mala Absorción Aviar El Síndrome de Mala Absorción Aviar (MAS) también conocido como Síndrome de Atrofia o Impedimento de Crecimiento de Animal Pequeño (RSS) es una enfermedad de las aves de corral crecientes, especialmente pollos o pavos, los pollos estabulados de cepa siendo afectados más comúnmente. Esta enfermedad ha sido reportada en los Países Bajos como Síndrome de Animal Pequeño y Síndrome de Impedimento de Crecimiento (RSS) pero también bajo nombres diferentes, por ejemplo síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento infecciosa, enteritis, síndrome de ave pálida, enfermedad de helicóptero, proventriculitis infecciosa, enfermedad de hueso quebradizo y necrosis de cabeza femoral.

Kouwenhoven et al. (Avian Pathology 17:879-892, (1988)) definió adicionalmente MAS por cinco criterios: 1) deterioro de crecimiento hasta 3 semanas después de la infección de pollos de un día de edad; 2) excreción de mucoide anaranjado amarillo a deposiciones húmedas; 3) actividad de fosfatasa alcalina en el plasma incrementada (ALP) ; 4) concentración de carotenoide en el plasma disminuida (PCC) ; y 5) placas de crecimiento epifiseal macroscópicamente ampliadas de la tibia próxima. La condición ha sido caracterizada adicionalmente, por crecimiento impedido, desarrollo pobre de plumaje, alimento mal digerido, carencia de pigmentación de piel, enteri'tis, atrofia pancreática, proventriculitis, atrofia tímica y bursal y cambios de huesos .

La transmisión de la enfermedad es efectuada por inoculación oral de homogenados intestinales de pollos afectados a pollos estabulados de cepa de un día de edad. En aquel experimento, se demostró que los bajos niveles de carotenoide en el plasma y actividades de ALP elevadas son herramientas apropiadas para la. diagnosis de MAS o RSS. En experimentos adicionales,. MAS fue transmitido mediante inoculación oral de homogenados de hígado de pollos afectados a pollos estabulados de cepa de un día de edad. A pesar de años de investigación, la etiología de MAS todavía no ha sido plenamente establecida y la condición es todavía un problema económico mayor para la industria de aves de corral. Se cree que virus son responsables, pero bacterias · u otros microorganismos no han sido excluidos como agentes causales .

Los virus que han sido encontrados en aves con brotes de MAS o RSS posiblemente incluyen reovirus, rotavirus, parvovirus, virus entero-seme antes y virus toga-semejantes (McNulty y McFerran, 1993, y Pantin-Jackwood MJ and al., AVIAN DISEASES 52:235-244, 2008) . McNulty (World Poultry 14:57-58 (1998); y Pantin-Jackwood MJ (2008)), resumen el. estado del arte en cuanto a MAS, y han postulado que la identificación del agente causante viral es desconocida y recomienda el control mediante manejo cuidadoso de los sitios de producción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee nuevos serotipos de reoviridae aviares únicos aislados, designado AVS-A, AVS-B y AVS-A/B, que han sido depositados con la American Type Culture Collection ("ATCC" 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209 USA) bajo el Tratadó de Budapest el 26 de junio de 2008 y tienen los números de acceso PTA-9301 , PTA-9302, y PTA- 9297 respectivamente. También, secuencias de nucleótidos que codifican epítopos antigénicos de estos nuevos serotipos, correspondientes a las proteínas del núcleo interno, por ejemplo s? de los nuevos serotipos de reoviridae aviares han sido caracterizados. Los serotipos de reoviridae AVS-A y AVS-B comprenden una secuencia de ORF que codifica proteínas del núcleo internas (proteínas s?) como se resume en una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, los nuevos serotipos de reoviridae aviares aislados de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

La presente invención también es concerniente con secuencias de nucleótidos recién caracterizadas del genoma de reoviridae, que comprende más precisamente la secuencia del segmento genómico Ll (3958 pares de bases)- con un cuadro de lectura abierta predicho en los nucleótidos 21-3882 que codifican la proteína ?? (SEQ ID NO: 3), la secuencia del segmento genómico L2 (3829 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre nucleótidos 14-3793 que codifican la proteína ?? (SEQ ID NO: 4), la secuencia del segmento genómico L3 (3'907 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 13 a 3870 que codifican la proteína X (SEQ ID NO: 5), la secuencia del segmento genómico Mi (2283 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 13 a 2211 que codifican la proteína µ? (SEQ ID NO: 6)) la secuencia del segmento genómico M2 (2158 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 30 a 2060 que codifican la proteína µ? (SEQ ID NO: 7), la secuencia del segmento genómico M3 (1996 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 25 a 1932 que codifican la proteína pNS (SEQ ID NO : , 8), la secuencia del segmento genómico SI (1645 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 632 a 1612 que codifican la proteína aC (SEQ ID NO: 9), la secuencia del segmento genómico S2 (1324 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 16 a 1266 que codifican la proteína s? (SEQ ID NO: 10) , la secuencia del segmento genómico S3 (1202 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 31 a 1134 que codifican la proteína s? (SEQ ID NO: 11), y la secuencia del segmento genómico S4 (1192 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 24 a 1127 que codifican la proteína aNS (SEQ ID NO: 12). Así, la presente invención también provee secuencias de nucleótidos de nuevos reoviridae únicos como se resume en SEQ ID NOs : 3-12, también como porciones de la misma que codifican las proteínas reovirales enlistadas anteriormente, secuencias que tienen por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 3-12, y/o secuencias aptas de hibridizacion bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 3-12.

La presente invención es concerniente además con una composición que comprende nuevos serotipos de reoviridae aviares únicos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos, porciones de las mismas como se resume en SEQ ID NOs: 3-12 o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs: 3-12 o una secuencia apta de hibridizacion bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 3-12.

En otra modalidad, se provee una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de infecciones de reovirus aviar, que comprende los aislados de reoviridae o una parte de la secuencia de nucleotidos de aislados de reoviridae revelados en . la presente y un portador aceptable farmacéutico.

La invención también es concerniente con una vacuna que comprende materiales antigénicos derivados de los nuevos serotipos de reoviridae aviares únicos aislados en donde los materiales comprenden secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleotidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12 o por una secuencia que tiene por lo menos 85%, -90%, 93%, 95% o 97% de homología con secuencias de nucleotidos como se resumen en SEQ ID NOs: 1-12 o por una secuencia apta de hibridización bajo ' condiciones severas con una o más secuencias de nucleotidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-12.

La presente invención también provee antisuero que es inducido en un animal por los serotipos de reoviridae aviares únicos revelados en la presente. En otra modalidad, también se proveen anticuerpos que se enlazan a los aislados de reoviridae aviares únicos revelados en la presente .

La presente invención provee además un método para producir una - respuesta inmune en aves de corral que comprende administrar una composición que comprende los nuevos serotipos de reoviridae aviares únicos revelados en la presente o secuencias de aminoácidos de los mismos codificados por secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12 o por una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs: 1-12 o por una secuencia apta de hibridizacion bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-12.

La presente invención también provee un método para proteger las aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de reovirus aviar, que comprende la etapa de administrar la vacuna revelada en la presente- a las aves de corral .

La presente invención también provee un método para detectar la presencia de nuevos aislados de reoviridae aviares en aves de corral, que comprende las etapas de: obtener una muestra del ave dé corral; poner en contacto la muestra con anticuerpos o sondas que se enlazan a los aislados de reoviridae aviares revelados en la presente; y. detectar enlace de los anticuerpos o sondas a la muestra, en donde el enlace detectado indicaría la presencia de aislados de reoviridae de la presente invención en las aves de corral .

La presente invención también es concerniente con un método para cuantificar nuevos aislados de reoviridae aviares en aves de corral , que comprende las etapas de poner en contacto una muestra del ave de corral con un anticuerpo que se enlaza a los nuevos aislados de reoviridae o la secuencia de aminoácidos codificada por secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12 o por una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos resumidas en SEQ ID NOs : 1 -12 o por una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-12, y medir la cantidad de enlace del anticuerpo a un componente de la muestra.

La presente invención también provee un recipiente que comprende por lo menos una dosis de la composición de vacuna como se revela en la presente. La presente invención provee además un kit que comprende el recipiente y un manual de instrucciones, que incluye información en cuando a la administración de por lo menos una dosis de la vacuna a aves de corral para disminuir la severidad del MAS o RSS y secuelas que incluyen supresión inmune.

La presente invención provee además kits de diagnóstico que comprenden sondas que son aptas de hibridización bajo condiciones severas con secuencias de nucleótidos como se revela en la presente o que comprende anticuerpos que son aptos de enlazarse con serotipos de reoviridae de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleotidos que codifica la proteína s? (proteína de núcleo interna) de serotipo de reoviridae AVS-A de la presente invención.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleotidos que codifica la proteína s? (proteína de núcleo interno) de serotipo de reoviridae AVS-B de la presente invención.

La Figura 3 muestra la designación de segmento de genoma (L1-L3, M1-M3, S1-S4; a la izquierda), longitudes de cada segmento de genoma (expresadas en pares de bases; números en la derecha) , la ubicación y tamaño de los cuadros de lectura abierta predichos y los nombres de proteína son indicados (cuadro sombreado) .

La Figura 4 muestra la secuencia del segmento genómico Ll (3958 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 21 a 3882 que codifican la proteína ?? (SEQ ID NO: 3) .

La Figura 5 muestra la secuencia del segmento genómico L2 (3829 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 14 a 3793 que codifican la proteína ?? (SEQ ID NO: 4) .

La Figura 6 muestra la secuencia del segmento genómico L3 (3907 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 13 a 3870 que codifican la proteína c (SEQ ID NO: 5) .

La Figura 7 muestra la secuencia del segmento genómico Mi (2283 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 13 a 2211 que codifican la proteína uA (SEQ ID NO: 6) .

La Figura 8 muestra la secuencia del segmento genómico M2 (2158 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 30 a 2060 que codifican la proteína µ? (SEQ ID NO: 7).

La Figura 9 muestra la secuencia del segmento genómico M3 (1996 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 25 a 1'932 que codifican la proteína pNS (SEQ ID NO: 8) .

La Figura 10 muestra la secuencia del segmento genómico SI (1645 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 632 a 1612 que codifican la proteína oC (SEQ ID NO: 9) .

La Figura 11 muestra la secuencia del segmento genómico S2 (1324 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 16 a 1266 que codifican la proteína s? (SEQ ID NO: 10) .

La Figura 12 muestra la secuencia del segmento genómico S3 (1202 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 31 a 1134 que codifican la proteína s? (SEQ ID NO: 11) .

La Figura 13 muestra la secuencia del segmento genómico S4 (1192 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 24 a 1127 que codifican la proteína aNS (SEQ ID NO: 12) .

La Figura 14 muestra las relacionas filogénicas entre reovirus aviar. Los nuevos serotipos aislados por los inventores de casos clínicos de Síndrome de Atrofia o Impedimento de Crecimiento de Animal Pequeño son subrayados .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los reoviridae aviares muestran heterogeneidad antigénica considerable y el surgimiento de nuevas clases antigénicas y patogénicas de reoviridae aviares pueden tener implicaciones importantes para el uso de vacunas de reoviridae en aves de corral. La presente especificación identifica ahora una nueva clase antigénica de reoviridae aviar. Además, se demuestra que los aislados de reoviridae aviares pertenecientes a esta nueva clase antigénica son aptos de inducir condiciones de enfermedad pronunciada asociadas con Síndrome de Mala Absorción Aviar (MAS) también conocido como Síndrome de Atrofia o Impedimento de Crecimiento de Animal Pequeño (RSS) .

En una modalidad, la presente invención provee una nueva clase antigénica de reoviridae aviar como agente causante de una variedad de condiciones de enfermedad en aves de corral afectadas, esto es, enfermedad de RSS, incluyendo enteritis. En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna que proporciona efectivamente protección' en aves de corral contra enfermedades provocadas por reoviridae aviar de' la nueva clase antigénica. En todavía otra modalidad, la presente invención provee una vacuna que proporciona efectivamente protección en aves de corral contra una variedad de condiciones de enfermedad en aves de corral afectadas, esto es, enfermedad de RSS, incluyendo enteritis.

Estos serotipos de reoviridae aviares únicos recién aislados, designados AVS-A, AVS-B, y AVS-A/B, que han sido depositados con la American Type Culture Collection ("ATCC" 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209 USA) bajo el Tratado de Budapest el 26 de junio de 2008 y tienen los números de acceso PTA-9301, PTA-9302, y · PTA-9297 respectivamente. El serotipo de reoviridae AVS-A/B presenta epítopos antigénicos comunes a los serotipos AVS-A y AVS-B, y así corresponde a una reclasificación natural del mismo.

La presente invención es concerniente así con composiciones que comprenden los serotipos de reoviridae aviares únicos recién aislados como se describen anteriormente. Las composiciones de la invención pueden comprender además un portador, adyuvante o diluyente aceptables farmacéuticamente. La composición puede comprender un reovirus aislado, un reovirus vivo que es atenuado, o un reovirus aislado que está desactivado. Las composiciones pueden comprender por lo menos 102 unidades de titulación de los aislados de reoviridae.

La invención también es concerniente con secuencias de nucleotidos que codifican epítopós antigénicos de los nuevos serotipos, correspondientes a las proteínas de núcleo interno de los nuevos serotipos de reoviridae han sido caracterizados. Los serotipos de reoviridae AVS-A y AVS-B comprenden una secuencia de ORF que codifica una proteína de núcleo interno como se resume en una o más de los siguientes secuencias de nucleotidos: SEQ ID NOs : 1 y 2 o una secuencia que comprende por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con una secuencia de nucleotidos como se resume en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, los nuevos serotipos de reoviridae aviares aislados de la invención comprenden una secuencia de nucleotidos apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y_ SEQ ID NO: 2.

La presente invención también es concerniente con nuevas secuencias de nucleotidos aisladas de genoma de reoviridae, que comprende más precisamente la secuencia del segmento genómico Ll (3958 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 21 a 3882 que codifican la proteína del núcleo interno ?? (SEQ ID NO: 3), la secuencia del segmento genómico L2 (3829 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 14 a 3793 que codifican la proteína de núcleo interno ?? (SEQ ID NO: 4), la secuencia del segmento genómico L3 (3907 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 13 a 3870 que codifican la proteína X (SEQ ID NO: 5), la secuencia del segmento genómico Mi (2283 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 13 a 2211 que codifican la proteína de núcleo interno µ? (SEQ ID NO: 6), la secuencia del segmento genómico M2 (2158 pares de bases) •con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 30 a 2060 que codifican la proteína de cápsido externa, proteína µ? (SEQ ID NO: 7) , la secuencia del segmento genómico M3 (1996 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 25 a 1932 que codifican la proteína no estructural, proteína NS (SEQ ID NO: 8), la secuencia del segmento genómico SI (1645 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 632 a 1612 que codifican la proteína C sigma de cápsido externa, proteína oC (SEQ ID NO: 9), la secuencia del segmento genómico S2 (1324 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 16 a 1266 que codifican la proteína de núcleo interno proteína s? (SEQ ID NO: 10), la secuencia del segmento genómico S3 (1202 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleotidos 31 a 1134 que codifican la proteína de cápsido externo o proteína s? (SEQ ID NO: 11) , y. la secuencia del segmento genómico S4 (1192 pares de bases) con un cuadro de lectura abierta predicho entre los nucleótidos 24 a 1127 que codifican la proteína oNS (SEQ ID NO: 12) . Así, la presente invención también provee secuencias de nucleótidos de nuevos reoviridae únicos como se resume en SEQ ID NOs : 3-12, también como porciones de las mismas que codifican péptidos de reoviridae o porciones de los mismos, secuencias que tienen por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 3-12, y/o secuencias aptas de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3-12.

La presente invención también es concerniente con secuencias de nucleótidos o porciones de las mismos que codifican epítopos antigénicos de los serotipos de reoviridae aviares como se resume en SEQ ID NOs: 3-12 o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs: .3-12 o una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas¦ con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3-12.

La secuencia de nucleótidos más preferida de acuerdo con la presente invención comprende la secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: '9 que codifica la proteína de capsido externa, proteína s? de reoviridae, o la secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 11 que codifica la proteína de cápsido externo s?, y/o la secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 7 que codifica la proteina de cápsido externa µ?. De acuerdo con una modalidad preferida, los epítopos antigénicos son codificados por secuencias de nucleótidos escogidas de entre SEQ ID NOs : 7, 9 ó 11 , o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs: 7, 9 ó 11, y/o una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 7, 9 ó 11. De acuerdo con una modalidad más preferida, los epítopos antigénicos son codificados por una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 9 o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO : 9, y/o una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 9.

La presente invención es concerniente además con una composición que comprende nuevos serotipos de reoviridae aviares únicos aislados que comprenden secuencias de aminoácidos antigénicas codificadas por secuencias de nucleótidos, o porciones de las mismas como se resume en SEQ ID NOs : 1-12 o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las . secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs: 1 -12 o una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-12.

En general, el antisuero apropiado criado contra los aislados de reoviridae vivos revelados en la presente puede ser preparado al inocular pollos de 3 a 4 semanas de edad subcutánea, intramuscular o intravenosamente con una cepa de virus viva que tiene un título infeccioso de entre 102 - 109 TC ID50/animal; más preferiblemente entre 103 - 106 TC ID50/animal. La sangre puede ser recolectada de 3 a 4 semanas después de la infección, preferiblemente 4 semanas después de la infección. Los pollos pueden también ser reinfectados con la misma cepa de virus vivo 3 a 4 semanas después de la primera infección con aproximadamente la misma dosis como la usada en la primera infección. La sangre es recolectada entre 2 y 4 semanas después de la segunda infección.

El antisuero apropiado puede también ser criado contra cepas de reoviridae aviar desactivadas reveladas en la presente al inocular pollos de 3 a 4 semanas de edad subcutánea o intramuscularmente con la preparación de virus desactivado. El título infeccioso de la preparación antes de la desactivación puede ser de entre 107 - 1011 TC ID50/animal; más preferiblemente entre 108 - 1010 TC ID50/animal. La sangre puede ser recolectada 4 a 6 semanas después de la inoculación, preferiblemente 5 semanas después de la inoculación. Los pollos pueden también ser re-inoculados con la misma preparación de virus desactivada 3 a 6 semanas después de la primera inoculación. La sangre es recolectada entre 3 y 5 semanas después de la segunda inoculación.

La presente invención también provee · una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones . de enfermedad resultantes de una infección de reoviridae aviar, tal como enfermedad de RSS que incluye condiciones de enfermedad entérica, que comprende un reoviridae aviar de acuerdo con la invención y un portador o diluyente aceptable farmacéutico .

Los aislados de reoviridae o parte de su genoma de acuerdo con la presente invención pueden ser incorporados a la vacuna como un virus atenuado vivo o desactivado como vacunas de sub-unidad o como parte de una vacuna recombinante. La propiedad de los aislados de reoviridae aviares para inducir condiciones de enfermedad RSS-asociadas como se describe en la presente son reducidas significativamente o completamente ausentes si el aislado de reoviridae aviar está en forma atenuada viva o desactivada o como vacunas de sub-unidad o como parte de una vacuna recombinante.

La vacuna puede comprender materiales antigénicos derivados de los serotipós de reoviridae aviares únicos aislados en donde dichos materiales comprenden secuencias de aminoácidos que son codificadas por secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12, porciones de las mismas o por una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12 o por una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-12.

La atenuación de un aislado . de reoviridae aviar de acuerdo con la invención puede ser obtenida mediante métodos bien conocidos en el arte para este propósito, tal como se revela en Gouvea et al. (Virology 126:240-247, (1983)). Brevemente, después del aislamiento del virus de un animal objetivo, una suspensión de virus es inoculada sobre cultivos celulares primarios (aviares), tales como células de hígado de embrión de pollo (CEL) , células de riñon de pollo (CK) , o líneas de célula mamíferas tales como la línea de célula VERO, línea de célula BG -70 o línea de célula aviar tal como QT-35, QM-7,' LMH u otro cultivo celular susceptible. Si el aislado no es apto para producir el efecto citopático (CPE) , entonces el virus se hace pasar repetidamente (por ejemplo, 3-10 veces) hasta que se observa CPE. Tan pronto como CPE está visible, las células y fluidos de cultivo celular son recolectados, congelados y deshelados, clarificados mediante centrifugación y el sobrenadante que contiene el aislado de reoviridae aviar es aplicado en alícuotas y almacenado a -20°C. Este proceso puede ser repetido (por ejemplo, 10-100 veces) para atenuar adicionalmente el virus.

En una modalidad, una vacuna de acuerdo con la presente invención puede ser preparada mediante métodos convencionales, tal como por ejemplo usados comúnmente para vacunas de reoviridae vivas y desactivadas disponibles comercialmente . Por ejemplo, la preparación de composiciones de vacuna veterinarias es descrita en "Vaccines for Veterinary Applications" (ed. : Peters, A.R. et al., Butterworth-Heinemann Ltd, 1993).

En una modalidad, la vacuna de acuerdo con la presente invención que contiene virus atenuado vivo puede ser preparada y comercializada en forma , de una suspensión (congelada) o en forma liofilizada. La vacuna puede contener adicionalmente un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente usado acostumbradamente para tales composiciones. Los portadores incluyen estabilizadores, conservadores y soluciones reguladoras del pH. Estabilizadores apropiados son, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como sorbítol, manitol, almidón, sacarosa, dextrana, glutamato o glucosa) , proteínas (tal como suero de leche seca, albúmina o caseína) o productos de degradación de las mismas. Soluciones reguladoras del pH apropiadas son por ejemplo fosfatos de metal alcalino. Conservadores apropiados son timerosal, mertiolato y gentamicina. Los diluyentes incluyen agua, solución reguladora del H acuosa (tal como solución salina de pH regulado) , alcoholes y polioles (tal como glicerol) .

En otra modalidad, las vacunas vivas de acuerdo con la presente invención pueden contener un adyuvante. Ejemplos de compuestos y composiciones apropiados con actividad adyuvante son en general conocidos en el arte para la preparación de vacunas .

Aunque la administración mediante inyección, por ejemplo, intramuscular, subcutánea de la vacuna viva de acuerdo con la presente invención es posible. La vacuna viva es preferiblemente administrada mediante las técnicas de aplicación en masa no caras usadas comúnmente para vacunación de reovirus aviar. Estas técnicas incluyen agua potable y vacunación de atomización. Métodos alternativos para la administración de la vacuna incluyen administración in ovo, colirio e inmersión de vaso de precipitados.

En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna contra condiciones de enfermedad entéricas, tales como aquellas observadas con RSS, que comprende los aislados de reoviridae revelados en la presente en forma desactivada. La ventaja principal de una vacuna desactivada son los niveles elevados de anticuerpos protectores de larga duración que pueden ser obtenidos. Esta propiedad hace a tal vacuna desactivada en particular apropiada para vacunación de pollos y pavos de inventarios de cría.

El objetivo de la desactivación de los virus cosechados después de la etapa de propagación es eliminar la reproducción de los virus infecciosos. En general, esto puede ser obtenido mediante medios químicos o físicos . La desactivación química puede ser efectuada mediante el tratamiento de los virus con por ejemplo, enzimas, formaldehído, beta-prppiolactona, etileno-imina o un derivado de los mismos. Si es necesario, el compuesto desactivador es neutralizado después de esto. El material desactivado con formaldehído puede por ejemplo ser neutralizado con tiosulfato. La desactivación física se puede llevar a cabo preferiblemente ~ al someter los virus a radiación rica en energía, tal como luz ultravioleta o rayos gamma. Si se desea, después del tratamiento el pH puede ser ajustado a un valor de aproximadamente 7.

Una vacuna que contiene los aislados de reoviridae aviar desactivados revelados en la presente puede comprender por ejemplo, uno o más de los portadores o diluyentes aceptables armacéuticamente mencionados anteriormente apropiados, para este propósito. Preferiblemente, la vacuna desactivada de acuerdo con la presente invención comprende uno o más compuestos con actividad adyuvante. Compuestos o composiciones apropiadas para este propósito incluyen hidróxido de aluminio, fosfato u óxido, emulsión aceite en agua o agua en aceite basada en, por ejemplo un aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52® o un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y saponinas . En general, las vacunas desactivadas con usualmente administradas parenteralmente, por ejemplo intramuscular o subcutáneamente.

La vacuna de acuerdo con la presente invención' comprende una dosificación efectiva de los aislados de reoviridae revelados en la presente como el componente activo, esto es, una cantidad de material de reoviridae aviar inmunizante que inducirá inmunidad en las aves vacunadas o su progenie contra el ataque por un virus virulento. La inmunidad es definida en la presente como la inducción de un nivel de protección significativamente más alto en una población de aves después de la vacunación, en comparación con un grupo sin vacunar. Las dosis y horarios típicos para vacunación son en general conocidos en el arte.

Las vacunas de reoviridae de acuerdo con la presente invención pueden ser usadas efectivamente en aves de corral, esto es, pollos, también como otras aves de corral tales como pavos, gallina de guinea y codornices. Los pollos incluyen pollo estabulado de cepa, pollos de reproducción y pollos de sacrificio. Los pavos incluyen aves tipo carne y pavos de cría.

La presente invención también provee vacunas combinadas que comprenden, además del reoviridae aviar de la presente invención, uno o más componentes de vacuna de otros patógenos infecciosos para aves de corral. En general, tales otros patógenos infecciosos para aves de corral son antígenamente distintos de los reoviridae aviares únicos de la presente invención. En una modalidad, los componentes de vacuna en la vacuna combinada son formas atenuadas vivas o desactivadas de los patógenos infecciosos para aves de corral . En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna combinada en donde todos los componentes de vacuna están en forma desactivada.

En otra modalidad, se provee una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de reoviridae aviar, que comprende los aislados de reoviridae revelados en la presente y un portador aceptable farmacéutico. En general, la vacuna puede comprender el reoviridae aviar en forma atenuada viva o desactivada. La vacuna puede comprender además un adyuvante .

En otra modalidad, la vacuna puede ser una vacuna combinada y comprende uno o más componentes de vacuna contra un segundo patógeno infeccioso para aves de corral . s La vacuna combinada comprende uno o más de los serotipos nuevos de reoviridae, un astrovirus, otro reovirus aviar clásico, un virus de' bronquitis infecciosa (IBV) , virus de enfermedad de Newcastle (NDV) , virus de enfermedad bursal infecciosa (IBDV) , adenovirus de gallina (FAV) , virus de EDS (adenovirus tipo III) y virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) . Preferiblemente, la vacuna combinada comprende astrovirus como un segundo patógeno.

La invención así también provee una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones de enfermedad y particularmente síndrome de MAS o nefritis resultante de una co-infección de reoviridae aviar y astrovirus, que comprende los reoviridae revelados en la presente, un astrovirus y un portador aceptable farmacéutico.

En general, la vacuna puede comprender los aislados de reoviridae y astrovirus y en formas atenuada viva o desactivada. La vacuna puede comprender además un adyuvante.

La presente invención también provee una vacuna de sub-unidad que comprende los aislados de reoviridae de la presente invención. Los genes de aislados de reoviridae revelados en la presente que producen proteínas protectoras contra la enfermedad podrían ser clonados a vectores de expresión o portadores en general conocidos en el arte. La expresión de estas proteínas protectoras podría luego ser producida como vacuna de sub-unidad de acuerdo con procedimientos estándar bien conocidos en el arte.

La presente invención también provee vacunas recombinantes que comprenden los aislados de reoviridae de la presente invención. Los genes de los aislados de reoviridae revelados en la presente que producen proteínas protectoras contra enfermedad podrían ser clonados en vectores vivos o desactivados u otros portadores en general conocidos en el arte para expresión de estas proteínas como vacunas. Además, estos virus por sí mismos podrían ser usados como vacunas atenuadas vivas (vectores) para portar genes que producen proteínas protectoras de otros agentes que permiten la protección contra el vector, también como el gen insertado. Más precisamente, la invención es concerniente con secuencias de nucleotidos : SEQ ID NOs : 1-12 o una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con una secuencia de nucleotidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12. Preferiblemente, los nuevos serotipos de reoviridae aviares aislados de la invención comprenden una secuencia de nucleotidos apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-12.

La presente invención también provee antisuero que es inducido en un animal por los aislados de reoviridae y un astrovirus revelado en la presente. La presente invención también provee anticuerpos que se enlazan a los aislados de reoviridae y astrovirus revelados en la presente. En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos quiméricos o anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos bisespecífieos , anticuerpos sintéticos, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab)2, Fv o fragmentos de scFv, o derivados modificados químicamente de los mismos .

Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados, por ejemplo, mediante las técnicas que son bien conocidas para la persona experimentada en el arte. Tales técnicas involucran la fusión de células de mieloma de ratón a células de bazo derivadas de mamíferos- inmunizados. Además, anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser obtenidos al utilizar métodos que son descritos, por ejemplo, en Harlow and Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Anticuerpos útiles o su(s) cadena (s) de inmunoglobulina correspondiente (s) puede (n) ser modificados aisladamente utilizando técnicas convencionales conocidas en el arte, por ejemplo al utilizar cancelaciones, inserciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos y/o recombinaciones y/o cualesquier otras modificaciones conocidas en el arte ya sea solas o en combinación. Métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son bien conocidos para la persona experimentada en el arte (véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.).

La presente invención también provee un método para proteger a las aves de corral contra condiciones de enfermedad, y particularmente RSS severa y secuelas resultantes de una coinfección de reoviridae aviar y astrovirus, que comprende la etapa de administrar la vacuna revelada en la presente a las aves de corral. Ejemplos de aves de corral incluyen pero no están limitados a pollos, pavos, gallinas de guinea y codorniz.

La presente invención también provee un método para detectar la presencia de reoviridae aviar único en aves de corral, que comprende las etapas de: obtener una muestra del aves de corral; poner en contacto la muestra con anticuerpos o sondas que se enlazan al reoviridae revelado en la presente; y detectar el enlace de los anticuerpos o sondas a la muestra, en donde el enlace detectado indicaría la presencia del nuevo reoviridae único aviar de la presente invención en el ave de corral. En general, la muestra es preparada de intestino, hígado o heces del ave de corral. Ejemplos de aves de corral incluyen, pero no están limitados a, pollos, pavos, gallina de guinea y codorniz.

El método para detectar y/o método para cuantificar nuevos aislados de reoviridae aviar en aves de corral puede comprender las etapas de poner en contacto una muestra del ave de corral con un anticuerpo que se enlaza a los nuevos aislados de reoviridae o la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs: 1-12 o por una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NOs : 1-12 o por una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-12, y medir la cantidad de .enlace del anticuerpo a un componente de la muestra.

A manera de ejemplo, la cantidad de nuevos aislados de reoviridae en aves de corral puede ser medida utilizando los análisis de ELISA. En la práctica, estándares y muestras a ser probados son incubados en cavidades de microtítulo pre-recubiertas con anticuerpo que captura el reovirus . Los estándares y muestras son diluidos en una solución reguladora del pH que contiene detergente por 1 hora a temperatura ambiente antes de la carga de las cavidades del microtítulo. Las partículas de reoviridae capturadas son luego detectadas por ejemplo con un segundo anticuerpo biotinilado que se enlaza al reoviridae que es luego detectado por ejemplo al utilizar un conjugado de estreptavidina-peroxidasa y sustrato coloreado. La concentración de las partículas de reoviridae es luego determinada utilizando una curva estándar preparada a partir de cantidades conocidas de las partículas de reoviridae. Las técnicas de ELISA son bien conocidas para aquellos de habilidad ordinaria en el arte.

La presente invención provee además un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos o sondas que se enlazan a los reoviridae revelados en la presente, medios para detectar anticuerpos o sondas, permitiendo mediante esto el seguimiento de la presencia de reoviridae aviar y el nivel de infección de aves de corral .

La presente invención también es concerniente con una nueva línea de célula de propagación que es derivada de líneas de células de LMH original (número de acceso ATCC CRL 2117) , que ha sido adaptada como una línea de célula no dependiente de colágeno y para crecer sobre placas de plástico. La nueva línea de célula de propagación LMH-KJ ha sido depositada con la American Type Culture Collection ("ATCC" 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209 USA) bajo el Tratado de Budapest el 26 de junio de 2008, y tiene el número de acceso PTA-9299.

La presente invención es concerniente además con un método para la propagación de nuevos serotipos de reoviridae aislados que consiste en infectar las líneas de célula no dependientes de colágeno LMH-KJ, cultivar las células bajo las mismas condiciones de cultivo como aquellas de las células LMH (número de acceso ATCC CRL 2117) con gentamicina, y cosechar los reoviridae cuando CPE es visible.

La edad de los animales que reciben una vacuna viva o desactivada de acuerdo con la invención es la misma como aquella de los animales que reciben las vacunas de reoviridae aviares vivas . o desactivadas actualmente disponibles comercialmente . Por ejemplo, los pollos escabulados de cepa pueden ser vacunados directamente desde un día de edad hacia delante con la vacuna atenuada viva de acuerdo con la invención. La vacunación de pollos padre, tales como pollos de cría, se puede hacer con una vacuna atenuada viva o desactiva de acuerdo con la invención o combinaciones de ambas. Las ventajas de este tipo de programa de inmunización incluyen la protección inmediata de la progenie de un día de edad provista por anticuerpos derivados maternalmente transmitidos verticalmente a las aves jóvenes. Un programa de vacunación de crianza típico incluye la vacunación de las crías a 6 semanas de edad con una vacuna atenuada viva, seguida por una vacunación entre 14-18 semanas de edad con una vacuna desactivada. Alternativamente, la vacunación viva puede ser seguida por dos vacunaciones con vacunas desactivadas en las semanas 10-12 y 16-18 semanas de edad.

La presente invención provee finalmente un recipiente que comprende por lo menos una dosis de la vacuna como se describe en la presente, y un kit que comprende tal recipiente con un manual de instrucciones, que incluye información en cuanto a la administración de por lo menos una dosis de la vacuna a aves de corral para disminuir la severidad del RSS y secuelas .

La invención habiendo , sido descrita en general, será entendida más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que son incluidos solamente por propósitos de ilustración de ciertos aspectos y modalidades de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.

EJEMPLOS : EJEMPLO 1: Aislamiento de reoviridae Los aislados de reoviridae revelados en la presente fueron aislados de varios pollos enfermos, de Delmarva EUA. Los aislados de reoviridae fueron cultivados en una línea de célula de carcinoma hepatocelular adaptada (CH-SAH, que es llamada alternativamente la línea de célula LMH) . La línea de célula de LMH original fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC) , número de acceso ATCC CRL 21 17.

EJEMPLO 2 ; PCR y Secuenciación El AR de doble hebra fue aislado de serotipos aislados de reoviridae AVS-A, AVS-B y AVS-A/B utilizando el kit de purificación de ARN de Quiagen. Múltiples RT-PCR se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos de reovirus publicados. Utilizando los procedimientos de Xie et al. (AVIAN DISEASES 41 : 654-660 (1997). La amplificación del ARN de reoviridae aviar único utilizando la reacción en cadena polimerasa de rranscriptasa inversa (RT-PCR) para amplificar el gen de proteína sigma C, un gen de proteína de cápsido externo sobre el segmento en SI, ningún producto de PCR fue detectado ya sea para uno u otro de los serotipos AVS-A, AVS-B, o AVS-A/B, en tanto que las cepas de reovirus aviar conocidas S1133, 2408 y SS412 amplificaron el producto de 523bp esperado.

La RT-PCR fue llevada a cabo siguiendo los procedimientos de Zhang et al. (Aren Virol (2006) 151:1525-1538) . La detección e identificación de reovirus aviares, de pato y ganso mediante RT-PCR: los reovirus de ganso y pato son parte del mismo genogrupo en el género Orthoreovirus) para amplificar el gen de proteína de núcleo interno, gen sigma A sobre el segmento S2. Los productos de PCR de aproximadamente 600bp fueron amplificados para los serotipos A y B, también como S1133, 2408, y SS412.

Estos cebadores de RT-PCR para el reoviridae sigma A, gen de proteína de núcleo interno y el gen de proteína de cápsido externo sigma C de reoviridae fueron usados para identificar los agentes virales causantes como el RSSV. Los cebadores de cápsido externo de reoviridae no amplifican genes de estos aislados de reoviridae mientras que los cebadores de núcleo interno de reoviridae lo hacen. Además, los cebadores de cápsido externo de rotavirus amplificaron el rotavirus aviar pero no el RSSV (Tabla 1) .

Tabla 1. Identificación Diferencial de Virus involucrados en RSS utilizando RT-PCR EJEMPLO 3 ; RT-PCR y Secuenciacion Utilizando los procedimientos de Zhang et al ( (Aren Virol (2006) 151:1525-1538) para amplificar el gen de proteína del núcleo interno, el gen de sigma A sobre el segmento S2, productos de RT-PCR de aproximadamente 600bp fueron amplificados para AVS-A, AVS-B, AVS-A/B, SI 133, 2408, y SS412. Estos productos de RT-PCR fueron purificados y secuenciados utilizando estos cebadores. Las secuencias de los productos de RT-PCR para AVS-A y AVS-B fueron 100% similares entre sí. Cuando se comparan con las cepas S1133 y SS412, las secuencias fueron altamente conservadas. Cuando las secuencias fueron detonadas en PudMed, los reoviridae fueron 90% similares a los accesos de reovirus aviar para ARV17 y 99G. Las cepas de reovirus aviar S1133 fueron 100% similares a 99G y SS412 fueron 93.7% similar a OS161.

EJEMPLO 4: Eficacia de Vacuna de RSSV Desactivada La eficacia de una vacuna de RSSV desactivada fue evaluada en pollos de progenie de gallinas de crianza vacunadas. La vacuna de RSSV consiste de reovirus (designados AVS-A, AVS-B) y un astrovirus (designado AVS-1) que fueron desactivadas utilizando formalina al 0.2% (concentración final) y se usa como adyuvante un adyuvante a base de aceite. Los grupos 1 y 2 consistían de pollos libres de patógenos específicos fueron vacunados a 32 semanas de edad con 0.5 mi de la vacuna subcutáneamente en la parte posterior del cuello. El Grupo 2 fue revacunado con 1.0 mi de la misma vacuna a 4 semanas después de la primera vacunación. El otro grupo de pollos (Grupo 1) no fue revacunado. Las gallinas fueron sangradas antes de la primera vacunación y a 4 y 8 semanas después de la primera vacunación. Empezando de las cuatro semanas después de la segunda vacunación, los huevos fueron recolectados de las gallinas vacunadas y puestos en una incubadora para el empollamiento . Después del empollamiento, los pollos de progenie a un día de edad fueron atacados con 0.5 mi de AVS-A. Pollos libres de patógeno específicos de un día de edad fueron usados como testigos de ataque (Grupo. 3) . Los pollos que fueron atacados fueron sometidos a necropsia en cuanto a lesiones gruesas asociadas con reovirus, tal como ceca extendida con contenido gaseoso/amarillo, intestinos pálidos y distendidos, intestinos aguados, llenos de gas.

Después del ataque con AVS-A, 80% (16/20) de los testigos de ataque sin vacunar desarrollaron lesiones gruesas asociadas . ' con el reovirus (Tabla 2). Para los pollos de progenie de las gallinas vacunadas una vez (Grupo 1) , solamente el 21% (3/14) de los pollos fueron protegidos contra AVS-A. Para la pollos de progenie de las gallinas vacunadas dos veces (Grupo 2), el 56% (10/18) de los pollos fueron protegidos contra AVS-A. Este resultado sugiere que la vacunación de las gallinas dos veces con la vacuna de RSSV desactivada da una protección apropiada en gallinas de progenie contra reovirus.

En resumen, la vacuna de RSSV proporcionó eficacia apropiada contra AVS-A en los pollos de progenie de las gallinas vacunadas con la vacuna dos veces.

Tabla 2. Grupos de Tratamiento y Protección contra Ataque con AVS-A N/A = no aplicable EJEMPLO 5; La Constelación Genómica de la Cepa de Orthoreovirus Aviar AVS-B El ARN genómico fue extraído por el método de TRIzol. La información de secuencia preliminar fue obtenida por la amplificación de RT-PCR específica de gen de fragmentos de cada segmento de genoma. Un oligonucleótido corto fue ligado a los extremos 3 ' del ARN genómico y luego sus cebadores complementarios fueron usados en combinación con cebadores específicos de gen para determinar los extremos 5' y 3' de los segmentos genómicos . Las secuencias de nucleótidos fueron determinadas mediante el método de terminación de cadena de didesoxi .

El genoma de plena longitud (23,494 bp) de la cepa AVS-B fue determinado mediante la estrategia de secuenciación de marcha de cebador. La longitud de las regiones sin traducir fluctuaron de 12 nt a 30 nt en el extremo 5', y 30' nt a 98 nt en el extremo 3 ' . La mayoría de las secuencias del extremo 5 ' y 3 ' fueron conservadas en todos los segmentos de genoma (extremo 5', GCUUUU(U) . Extremo 3', UCAUC) . El segmento de genoma Ll de la cepa de AVS-B fue más estrechamente relacionado con la cepa 918 (91% de identidad) , mientras que el segmento de genoma L3 compartió la identidad de nucleótidos más alta con las cepas 1017.-1 y R2 (89%) . Solamente dos segmentos de genoma L2 de ortoreovirus aviar de pollo han sido publicados hasta ahora (cepas 138 y 176); la cepa AVS-B fue más estrechamente relacionada con la cepa 138 (91% de identidad de nt) . La comparación de los segmentos de genoma Mi, M2, y M3 reveló identidades de secuencia moderadas a altas a otras cepas de ortoreovirus aviar, siendo los aislados más estrechamente relacionados 138 (Mi, 90% de identidad), 601G (M2, 85% de identidad), y OS161 (M3 , 88% de identidad). Se encontró que el segmento de genoma SI es tricistrónico con cuadros de lectura abierta parcialmente traslapantes (ORF) ; la posición de los 3 ORF (plO, pl7 y oC) fue similar a aquella observada en otras cepas de ortoreovirus aviar de 'pollo. La región de codificación aC compartía baja identidad de nucleótidos a la mayoría de las cepas (30%-70%), excepto por GA 40973/2005, (93%) aislado de un caso similar de RSS en los EUA. Con respecto a los segmentos de genoma S2 , S3 y S4, la cepa AVS-B compartió la identidad de nucleótidos más alta con 138 (S2, 93%; S3, 92%), y con cepas de ortoreovirus aviar de pollo de Estados Unidos de América más recientes (hasta 93%) .

Tiene tanto que la disponibilidad de información de secuencia en cuanto a ortoreovirus aviar permitió ganar discernimiento a la estructura global de capas de ortoreovirus aviar, este es el primero en reportar una secuencia de genoma de ortoreovirus aviar de plena longitud. La longitud del genoma de la cepa de AVS-B cayó en el intervalo de tamaño predicho en base a . secuencias de segmento, de genoma cognatas de plena longitud disponibles para un puñado de cepas de ortovirus aviar de referencia. La mayoría de genes de cepa de AVS-B compartieron grados significativos de conservación de secuencia con genes relacionados de cepas de ortoreovirus aviar prototipo (=85%) . Sin embargo, el segmento SI del genoma representó una excepción. Este segmento de genoma compartió =67% de identidad de nucleótidos con el segmento de genoma correspondiente de otra cepa de ortoreovirus aviares. Por otra parte, la región de codificación de proteína de aC del segmento de genoma SI fue estrechamente relacionada a otra cepa de ortoreovirus aviar de EUA aislada también de RSS. El bajo número de secuencias de gen de ortoreovirus aviar y la carencia de identidades de secuencia absolutas con cepas relacionadas no permitió identificar las cepas parentales posibles de esta nueva capa. No obstante, parece haber evidencia convincente que la acumulación de mutaciones puntuales y reclasificación de segmentos de genoma cognatos jugó un papel clave en el origen y evolución de la cepa de AVS-B.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1 . Un serotipo de reoviridae aviar aislado, caracterizado porque tiene una o más secuencias de nucleótidos que tienen por lo menos: 95% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: l o 2 , 85% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 11 o 12 , 97% de homología con una secuencia de nucleótidos resumida en SEQ ID NO: 9 o 95% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 10 .

2 . El reoviridae aviar aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque es designado como AVS-A o AVS-B o AVS-A/B, una muestra del cual ha sido depositada con la ATCC respectivamente bajo el número de acceso PTA-9301 o PTA-9302 o PTA-9297 .

3 . Pép'tidos codificados por secuencias de nucleótidos a partir del serotipo de reoviridae aviar aislado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , caracterizado porque son codificados por una o más secuencias de nucleótidos que tienen por lo menos : 95% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 1 o 2 , 85% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11 o 12, 97% de homología con una secuencia de nucleótidos resumida en' SEQ ID NO: 9 o 95% de homología con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 10.

4. Una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de reoviridae aviar, caracterizada porgue comprende el serotipo de reoviridae o un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. La vacuna de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque se usa en la protección de enfermedad de aves de corral contra enfermedades de reovirus aviar.

6. La vacuna de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque el aislado de reoviridae está en forma atenuada viva o en forma desactivada.

7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque la vacuna comprende por lo menos un epítopo antigénico codificado por una o más secuencias de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2.

8. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, caracterizada porque la vacuna comprende además un adyuvante .

9. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-8, caracterizada porque la vacuna comprende además uno o más componentes de vacuna contra un segundo patógeno infeccioso para aves de. corral .

10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el segundo patógeno es astrovirus.

11. .La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-10, caracterizada porque las aves de corral son seleccionadas del grupo que consiste de pollos, pavos, gallinas de guinea, patos, gansos y codornices.

12. Un antisuero aislado caracterizado porque es inducido en un animal por los aislados de reoviridae de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

13. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza a los aislados de reoviridae de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

15. Un método para proteger aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una . infección de reoviridae aviar, caracterizado porque comprende la etapa de administrar la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-11 a las aves de corral.

16. Un método para proteger aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de co-infección de reoviridae aviar y astrovirus, caracterizado porque comprende la etapa de administrar la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-11 a las aves de corral.

17. El método de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque las aves de corral son seleccionadas del grupo que consiste pollos, pavos, gallinas de guinea, patos, gansos y codornices.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicación 15-17, caracterizado porque la enfermedad es RSS o MAS o secuelas .

19. Un método para tratar la presencia de reoviridae en aves de corral o para cuantificar reoviridae en aves de corral, caracterizado porque comprende las etapas de: obtener una muestra del ave de corral; poner en contacto la muestra con anticuerpos o sondas que se enlazan a los aislados de reoviridae de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y detectar el enlace de los anticuerpos o sondas a la muestra, en donde el enlace detectado indicaría la presencia de reoviridae de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en las aves de corral .

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la muestra es preparada a partir de sangre, intestino, bursa de Fabricus o heces del ave de corral.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque la muestra comprende células o tejidos del ave de corral .

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque el ave de corral es seleccionado del grupo que consiste de pollos, pavos, gallinas de guinea, patos, gansos y codornices.

23. Un recipiente para vacunación de aves de corral, caracterizado porque comprende por lo menos una dosis de la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-11.

24. Un kit para vacunación de aves de corral, caracterizado porque comprende el recipiente de conformidad con la reivindicación 23 y un manual de instrucciones, que incluye información en cuanto a la administración de por lo menos una dosis de la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-11 al ave de corral para disminuir la severidad del MAS, RSS o secuelas.

25. Un kit de diagnóstico caracterizado porque comprende anticuerpos o sondas que se enlazan a los aislados de reoviridae de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

26. Una línea de célula derivada de LMH depositada con la ATCC bajo el número de acceso PTA-9299 para propagar los serotipos de reoviridae de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.