MX2010014358A

MX2010014358A - Composiciones y metodos de uso del orf1358 de cepas estreptococicas beta-hemoliticas.

Info

Publication number: MX2010014358A
Application number: MX2010014358A
Authority: MX
Inventors: Ellen Murphy; Annaliesa Sybil Anderson; Ingrid Lea Dodge; Emily Mara Braunstein
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-07-04
Also published as: RU2010151562A; WO2009155484A2; EP2303318A2; WO2009155484A3; KR20110031343A; US20090318359A1; IL209862A0; AU2009259959A1; CA2728308A1; US8071112B2; US7914798B2; EP2650014A2; US20110171263A1; JP2011525113A; CN102316894A

Abstract

La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de estreptococos del grupo C y G y su uso en composiciones inmunogénicas; la invención también se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos codificados por los polinucleótidos; además, la invención se refiere a métodos de inducción de una respuesta inmune en mamíferos contra estreptococos beta-hemolíticos o infección por estreptococos beta-hemolíticos usando las composiciones inmunogénicas de los polipéptidos y polinucleótidos de estreptococos de los grupos C y G.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO DEL ORF1358 DE CEPAS ESTREPTOCÓCICAS BETA-HEMOLÍTICAS INTERREFERENCIA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional No. 61/074,251 , presentada el 20 de junio de 2008. El contenido de esta solicitud se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a polinucleótidos obtenidos de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, y los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las especies de estreptococos beta-hemolíticos son patógenos importantes responsables de muchas enfermedades humanas que van desde infecciones superficiales hasta enfermedades más severas. Incluyen especies de los grupos serológicos A, B, C y G. Las bacterias estreptocócicas del grupo A (Streptococcus pyogenes) son responsables de la mayoría de los casos de enfermedad, y pueden originar enfermedades no invasivas tales como faringitis, escarlatina, impétigo, celulitis o erisipela. Algunas cepas de estreptococos pueden producir infecciones invasivas más severas tales como síndrome de choque tóxico, fascitis necrosante y septicemia. Adicionalmente, las complicaciones de las infecciones superficiales pueden originar secuelas mediadas por inmunidad. El estreptococo del grupo B de Lancefield (Streptococcus agalactiae) es la causa predominante de la sepsis neonatal en los recién nacidos y puede ocasionar neumonía en los pacientes de edad avanzada. Inicialmente los estreptococos de los grupos C y G fueron reconocidos como patógenos de animales pero en los últimos años se ha observado que tienen un fuerte potencial de causar enfermedad humana. Generalmente la enfermedad causada por los estreptococos de los grupos C y G se presenta de forma similar a los estreptococos del grupo A, pero no se ha observado que originen secuelas mediadas por inmunidad. Los estreptococos de los grupos C y G frecuentemente se presentan en pacientes con problemas de salud subyacentes; son de importancia en los pacientes de edad avanzada, y se encuentran dispersos entre varias especies estreptocócicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de polinucleótidos novedosos de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, que corresponden al marco de lectura abierto 1358 (ORF1358) de Streptococcus pyogenes. La invención abarca los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

En una modalidad, la invención provee un polipéptido aislado que comprende por lo menos un fragmento de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31 , que es una secuencia de consenso de las diversas secuencias novedosas del ORF1358 obtenidas de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, el polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32, o un fragmento de las mismas. En algunas modalidades, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97.5%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, el polipéptido aislado tiene actividad de unión de zinc. En algunas modalidades, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95%, 97.5%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32.

En una modalidad, la invención provee un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de la misma. En algunas modalidades, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32, o un fragmento de las mismas. En algunas modalidades, el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de las mismas. En algunas modalidades, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95%, 97.5%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: ,32. En algunas modalidades, el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 90%, 95% o 99% idéntica a la secuencia de polinucleótido expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31. En algunas modalidades, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de unión de zinc. En algunas modalidades, el polinucleótido está enlazado operativamente a un elemento regulador. En algunas modalidades, el elemento regulador comprende un promotor inducible y/o un promotor constitutivo.

En una modalidad, la invención provee un anticuerpo que se une específicamente a por lo menos un fragmento de por lo menos un polipéptido aislado de ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equis/milis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

En una modalidad, la invención provee un kit que comprende un polipéptido aislado de ORF1358, o un fragmento del mismo, cuya secuencia de aminoácidos es elucidada de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, el kit comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, o un fragmento de las mismas. En algunas modalidades, el kit comprende un vector de polinucleótido que expresa un polipéptido o fragmento del mismo codificado por el ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, el kit comprende un vector de polinucleótido que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, o un fragmento de las mismas.

En una modalidad, la invención provee un vector de polinucleótido que expresa un polipéptido del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido aislado expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO. 31. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95%, 97.5%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95%, 97.5%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de unión de zinc. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia reguladora enlazada operativamente al polinucleótido aislado. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido comprende un elemento regulador que puede ser un promotor constitutivo o un promotor ¡nducible. En algunas modalidades, el vector de polinucleótido es un plásmido, un vector viral, o un vector de expresión.

En una modalidad, la invención provee una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, la composición inmunogénica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32.

En una modalidad, la invención provee una composición inmunogénica que comprende un polinucleótido aislado de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis que codifica un polipéptido del ORF1358. En algunas modalidades, la composición inmunogénica comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31 .

En una modalidad, la invención provee un método para inducir una respuesta inmune contra el estreptococo beta-hemolítico o contra la infección por estreptococo beta-hemolítico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis.

En una modalidad, la invención provee una célula hospedera ex-vivo que expresa un polipéptido aislado codificado por el ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, la célula hospedera expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95%, 97.5%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95%, 97.5%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de unión de zinc. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia reguladora enlazada operativamente al polinucleótido aislado. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que comprende un elemento regulador, que puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un vector de polinucleótido que es un plásmido, un vector viral, o un vector de expresión. En algunas modalidades la célula hospedera se selecciona de una bacteria, una célula de mamífero, una célula de insecto, o una célula de levadura.

En una modalidad, la invención provee un kit que comprende un polinucleótido o un polipéptido que comprenden un polinucleótido o polipéptido del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis.

En una modalidad, la invención provee un método de tratamiento de una infección por estreptococo beta-hemolitico en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une específicamente a por lo menos un polipéptido aislado que comprende un polipéptido codificado por el ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, en el método se utiliza un anticuerpo que se une a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. El anticuerpo usado en el método puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. En algunas modalidades, la infección por estreptococo beta-hemolítico es tratada en un humano.

En una modalidad, la invención provee el uso de un polipéptido aislado que comprende un polipéptido codificado por el ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, en la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento profiláctico de una infección por estreptococo beta-hemolítico en un mamífero. En algunas modalidades, el medicamento es útil en un tratamiento profiláctico en un humano.

En una modalidad, la invención provee un medicamento útil en el tratamiento profiláctico de una infección por estreptococo beta-hemolítico en un mamífero. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un polinucleótido aislado de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, que comprende un polipéptido del ORF1358. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un polinucleótido aislado de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, que comprende un polinucleótido del ORF1358. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un vector de polinucleótido que comprende un polinucleótido del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un anticuerpo que se une específicamente a por lo menos un polipéptido aislado, que comprende un polipéptido codificado por el ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades se utiliza en el medicamento un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32. En el medicamento se puede usar un anticuerpo monoclonal o policlonal. En algunas modalidades, el mamífero en el que se usa el medicamento es un humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de 'Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis de la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus intermedius.

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus intermedius de la SEQ ID NO: 3.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus constellatus sp. constellatus.

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus constellatus sp. constellatus de la SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del prf1358 de un Streptococcus anginosus.

La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf 358 de Streptococcus anginosus de la SEQ ID NO: 7.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis.

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis de la SEQ ID NO: 9.

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de Streptococcus constellatus sp. pharyngis.

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus constellatus sp. pharyngis de la SEQ ID NO: 1 1.

La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de consenso obtenida alineando las secuencias de polipéptido expuestas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de nucleótidos del iniciador D1358 F1.

La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de nucleótidos del iniciador D1358 F3.

La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de nucleótidos del iniciador D1358 F5.

La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de nucleótidos del iniciador D1358 R2.

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de nucleótidos del iniciador D1358 R3.

La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleótidos del iniciador D1358 R5.

La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de nucleótidos del iniciador 1358 F.

La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de nucleótidos del iniciador 1358 R.

La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos del precursor de proteína znuA del sistema de captación de zinc de alta afinidad de Streptococcus pyogenes, que tiene el NCBI gi 50902983.

La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de la lipoproteina de adherencia de la unión de zinc 2603V/R de Streptococcus agalactiae, que tiene el NCBI gi 22536713.

La SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por un ORF1358 de Streptococcus agalactiae.

La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis.

La SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis de la SEQ ID NO: 25.

La SEQ ID NO: 27 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis.

La SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis de la SEQ ID NO: 27.

La SEQ ID NO: 29 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus anginosus.

La SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf 358 de Streptococcus anginosus de la SEQ ID NO: 29.

La SEQ ID NO: 31 es la secuencia de nucleótidos del orf1358 de un Streptococcus constellatus sp. constellatus.

La SEQ ID NO: 32 es la secuencia de aminoácidos codificada por el orf1358 de Streptococcus constellatus sp. constellatus de la SEQ ID NO: 31.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención describe polinucleótidos novedosos obtenidos de cepas de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus y Streptococcus constellatus sp. pharyngis (estreptococos C+G), que corresponden al marco de lectura abierto 1358 (ORF 358) de Streptococcus pyogenes. En la solicitud publicada de patente internacional No. WO 02/083859 se proveen las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos del ORF1358. Los polinucleótidos de ORF1358 novedosos codifican polipéptidos novedosos. Estos polinucleótidos y polipéptidos se pueden usar en composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmune a los estreptococos beta-hemolíticos o a la infección por estreptococos beta-hemolíticos en un mamífero.

Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico" se usan aquí intercambiablemente. Estos términos abarcan nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster. Un "polinucleótido" puede ser un polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) de una cadena o de doble cadena, que opcionalmente contiene bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido en forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético, o mezclas de los mismos. Las bases de nucleótidos se indican en la presente descripción con el código de una letra: adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C), inosina (I) y uracilo (U).

Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuesta en un orden específico determinado por la secuencia codificadora de un polinucleótido que codifica el polipéptido.

El término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" partiendo del estado natural. Para que una composición o sustancia que ocurre en la naturaleza sea considerada "aislada", debe ser cambiada o removida de su medio original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente en forma natural en un animal vivo no se considera "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes en su estado natural se considera "aislado", como se usa el término de aquí en adelante. Los polinucleótidos aislados o los polipéptidos aislados se pueden purificar de una célula en la que ocurren naturalmente. Para obtener los polinucleótidos o polipéptidos aislados aquí descritos se pueden usar los métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos y polipéptidos.

El término "enlazado operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo polinucleótido de modo que la función de una es alterada por la otra. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente con una secuencia codificadora cuando es capaz de alterar la expresión de esa secuencia codificadora (esto es, que la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras se pueden enlazar operativamente con secuencias reguladoras en orientación de sentido o antisentido.

Los polinucleótidos ORF1358 y los polipéptidos ORF1358 descritos en la presente se pueden obtener usando las técnicas estándares de clonación y selección. Los polinucleótidos del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, y Streptococcus constellatus sp. pharyngis se pueden obtener, por ejemplo, de ADN genómico, de una colección de ADNc derivada de ARNm, de una colección de ADN genómico, o se pueden sintetizar usando técnicas muy conocidas y disponibles comercialmente, tales como por ejemplo PCR de una colección de ADNc, o RT-PCR (transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa).

El término "recombinante" significa, por ejemplo, que el polinucleótido se hace mediante una combinación artificial de dos segmentos de polinucleótido de otra manera separados, por ejemplo mediante síntesis química o mediante manipulación de polinucleótidos aislados usando las técnicas de ingeniería genética. Una "construcción de ADN recombinante" comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención enlazado operativamente con al menos un elemento regulador.

En una modalidad, la invención provee un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. La secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 es la secuencia de consenso obtenida después de alinear las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, y Streptococcus constellatus sp. pharyngis, y expuestas en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32.

En una modalidad, la invención provee polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32, o fragmentos de las mismas. Quedan abarcados aquí los polinucleótidos que difieren de las secuencias de polinucleótido mostradas en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31 , debido a la degeneración del código genético. Estos polinucleótidos codifican polipéptidos que comprenden la misma función que el polipéptido codificado por el ORF1358 de Streptococcus pyogenes. Los polipéptidos pueden comprender actividad de unión de zinc.

Usando los métodos conocidos se pueden identificar ortólogos y variantes alélicas de los polinucleótidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus y Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Las variantes alélicas y los ortólogos de los polinucleótidos ORF1358 pueden comprender una secuencia de nucleótidos que típicamente es por lo menos aproximadamente 90-95% idéntica, o más, a cualesquiera una o más de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31 , o fragmentos de las mismas. Las variantes alélicas y los ortólogos de los polinucleótidos ORF1358 pueden codificar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90%, 95% o 97.5% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32. Tales polinucleótidos se pueden identificar fácilmente porque son capaces de hibridar, bajo condiciones severas, con al menos un fragmento de uno o más de cualquiera de los polinucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 25, 27, 29 o 31 , o un fragmento de las mismas.

Además, las variantes alélicas y ortólogos de los polinucleótidos ORF1358 pueden comprender solo un fragmento de la región codificadora de un polinucleótido o gen ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus y Streptococcus constellatus sp. pharyngis, tal como un fragmento de un polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31. En algunas modalidades, tales fragmentos codifican fragmentos immunogénicos.

Como es bien comprendido por los expertos en la materia, muchos grados de identidad de secuencia son útiles para identificar polinucleótidos y polipéptidos relacionados. Se hicieron alineaciones de secuencia y cálculos de porcentaje de identidad usando el programa Megalign de la suite de computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Se hizo alineación múltiple de las secuencias usando el método de alineación Clustal (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151 -153) con los parámetros por omisión (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Los parámetros por omisión para las alineaciones pareadas usando el método Clustal fueron KTUPLE 1 , GAP PENALTY=3, WINDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5. También se hicieron alineaciones de secuencia usando BLAST (Altschul S F, Madden T L, Schaffer A A, et al. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs", Nucleic Acids Research. 1 de septiembre de 1997, 25(17):3389-3402).

Los polinucleótidos ORF1358 de la invención se pueden usar, por ejemplo, para la producción de polipéptidos recombinantes para su inclusión en composiciones inmunogénicas. Para la producción de polipéptidos recombinantes, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificadora del polipéptido maduro, sola, o la secuencia codificadora del polipéptido maduro enlazado con otras secuencias codificadoras, como las que codifican una secuencia guía o secretoria, una secuencia de pre-, pro- o preproproteína, u otras porciones de fusión de péptido. Por ejemplo, se puede enlazar con la secuencia codificadora una secuencia marcadora que facilite la purificación del polipéptido fusionado (véase Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:821-824, 1989). El polinucleótido también puede contener secuencias 5' y/o 3' de la secuencia codificadora, tales como secuencias transcritas, secuencias no traducidas, señales de empalme y señales de poliadenilación.

En algunas modalidades, la información de las secuencias de polinucleótido provista en la presente permite la preparación de secuencias de oligonucleótido de ADN (o ARN) relativamente cortas que tienen la capacidad de hibridar específicamente con secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos seleccionados aquí descritos. Como se usa aquí, el término "oligonucleótido" se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, usualmente más de tres (3) típicamente más de diez (10), y hasta cien (100) o más (aunque preferiblemente entre veinte y treinta). El tamaño exacto dependerá de muchos factores que a su vez dependen de la función o uso final del oligonucleótido. De esta manera, en algunas modalidades se preparan sondas de ácido nucleico de longitud adecuada basándose en una secuencia de nucleótidos seleccionada, por ejemplo una secuencia como la mostrada en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31. La capacidad de dichas sondas de ácido nucleico para hibridar específicamente con un polinucleótido que codifica un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, las hace particularmente útiles en una variedad de modalidades. En algunas modalidades, las sondas se pueden usar en una variedad de pruebas para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Estos iniciadores se pueden generar de cualquiera manera, incluso síntesis química, duplicación de ADN, transcripción inversa, o una combinación de las mismas. La secuencia de tales iniciadores se diseña usando el polinucleótido aquí descrito para la detección, amplificación o mutación de un segmento definido de un polinucleótido que codifica un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis de células procarióticas usando tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR).

En algunas modalidades, los polinucleótidos aquí descritos se pueden usar en combinación con una marca adecuada para detectar la formación de híbridos. Se conoce una amplia variedad de marcas adecuadas, incluso marcas radioactivas, enzimáticas, u otros ligandos tales como avidina/biotina, que son capaces de producir una señal detectable.

Los polinucleótidos que son idénticos o suficientemente idénticos a una secuencia de nucleótidos contenida en una de las SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 21 , o un fragmento de las mismas, se pueden usar como sondas de hibridación para ADNc y ADN genómico, o como iniciadores para una reacción de amplificación de ácido nucleico (PCR), para aislar ADNc's de longitud completa y clones genómicos que codifican los polipéptidos aquí descritos, y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes (incluso genes que codifican homólogos y ortólogos de especies diferentes de Streptococcus dysgalactiae), que tienen una similitud de secuencia alta con las secuencias de polinucleótido expuestas en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO. 29 o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de las mismas. Típicamente, estas secuencias de nucleótidos son de por lo menos aproximadamente 90% idénticas a por lo menos aproximadamente 99% idénticas a la secuencia de polinucleótido de referencia. Generalmente las sondas o iniciadores comprenderán por lo menos 15 nucleótidos, por lo menos 30 nucleótidos, o por lo menos 50 nucleótidos.

Existen varios métodos disponibles y muy conocidos para los expertos en la materia para obtener ADNc's de longitud completa, o para extender ADNc's cortos. Por ejemplo, los métodos basados en la amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE; véase Frohman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988). Las modificaciones de esta técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathón™ (Clontech, Mountain View, CA), han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc's más grandes. En la tecnología Marathón™ se preparan ADNc's de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" se liga en cada extremo. Entonces se efectúa amplificación del ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "faltante" del ADNc usando una combinación de iniciadores de oligonucleótido específicos de gen y específicos de adaptador. Después se repite la reacción de PCR usando iniciadores "anidados", esto es, iniciadores diseñados para aparearse dentro del producto amplificado (típicamente un iniciador específico de adaptador que se aparea delante de 3' en la secuencia adaptadora, y un iniciador específico de gen que se aparea delante de 5' en la secuencia de gen conocida). Los productos de esta reacción se pueden analizar entonces por secuenciacion de ADN, y se construye un ADNc de longitud completa uniendo el producto directamente al ADNc existente para producir una secuencia completa, o efectuando una PCR separada de longitud completa usando la nueva información de secuencia para el diseño del iniciador 5'.

En una modalidad, la presente invención provee polipéptidos de ORF1358 aislados y purificados de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus ¡ntermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, para usarse en composiciones inmunogénicas. Un polipéptido de ORF1358 usado en una composición inmunogénica de la invención puede ser un polipéptido recombinante.

Un polipéptido de ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus ¡ntermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis usado en una composición inmunogénica de la presente invención abarca un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32, o un fragmento de las mismas; variantes naturales funcionales y no funcionales o equivalentes biológicos de dichos polipéptidos; variantes producidas vía recombinante o equivalentes biológicos de dichos polipéptidos; ortólogos o variantes alélicas de dichos polipéptidos.

Los equivalentes biológicos o variantes del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus ¡ntermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, incluyen polipéptidos de ORF1358 tanto funcionales como no funcionales de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Los equivalentes biológicos o variantes funcionales incluyen variantes de secuencia de aminoácidos naturales de un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, que mantienen la capacidad de provocar una respuesta inmune o antigénica en un sujeto. Las variantes funcionales típicamente contienen sustituciones conservativas de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32; o sustituciones, supresiones o inserciones de residuos no críticos en regiones no críticas del polipéptido.

En algunas modalidades se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de un polipéptido de la presente invención, y obtener todavía una molécula que tiene la misma antigenicidad del polipéptido de ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis sin cambio. Por ejemplo, en una secuencia se pueden sustituir algunos aminoácidos con otros aminoácidos sin pérdida apreciable de antigenicidad. Como la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido son lo que define la actividad biológica funcional de ese polipéptido, se pueden hacer algunas sustituciones de secuencia de aminoácidos en una secuencia de polipéptido (o su secuencia de ADN codificadora subyacente), y obtener no obstante un polipéptido con propiedades similares.

Para hacer cambios para obtener ortólogos o variantes alélicas se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva en un polipéptido es entendida generalmente (Kyte y Doolittle, J Mol Biol, 157: p. 105-132, 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tiene un índice o puntuación hidropática similar y no obstante resultar en un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basado en su hidrofobicidad y características de carga. Los índices son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); císteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9) tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).

Generalmente se acepta que el carácter hidropático relativo del residuo de aminoácido determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, que a su vez definen la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, substratos, receptores, anticuerpos, antigenos, etcétera. Se sabe que un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido que tiene un índice hidropático similar y obtener no obstante un polipéptido funcionalmente equivalente. En algunas modalidades, los polinucleótidos que codifican el polipéptido ORF1358 pueden comprender aminoácidos sustituidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +/- 2. En algunas modalidades, los índices hídrofóbicos están dentro de +/- 1 , y en algunas modalidades los índices hídrofóbicos están dentro de +/- 0.5.

También se puede hacer sustitución de aminoácidos similares basándose en la hidrofilicidad, particularmente cuando el polipéptido o péptido equivalente funcionalmente biológico así creado es para usarse en modalidades inmunológicas. La Patente de EE. UU. No. 4,554,101 , incorporada aquí como referencia, afirma que la hidrofilicidad local promedio más grande de un polipéptido, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad.

Como se usa aquí, el término "variante" es un polinucleótido o un polipéptido que difiere de un polinucleótido de referencia o un polipéptido de referencia, respectivamente, pero que retiene por lo menos una propiedad esencial. Una variante típica de un polinucleótido difiere en su secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden resultar en sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos del polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia, como se comenta más abajo. Una variante típica de un polipéptido difiere en su secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia. Generalmente las diferencias son limitadas, de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y el polipéptido variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Un polipéptido variante y su polipéptido de referencia pueden diferir en su secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones o supresiones, en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante no conocida en la naturaleza. Las variantes no naturales de los polinucleótidos y polipéptidos se pueden hacer mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

Para la producción recombinante de polipéptidos, se construyen células hospederas por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión, porciones de los mismos, o polinucleótidos de la invención. Los polinucleótidos que comprenden el ORF1358 se pueden introducir en células hospederas, por ejemplo mediante los métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al., "Basic Methods In Molecular Biology" (1986); y Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Estos métodos incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, ultrasonido, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, raspadura-carga, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de células hospederas adecuadas incluyen células bacterianas (por ejemplo, células de estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis), células de levadura (por ejemplo, Pichia, Saccharomyces), células de mamífero (por ejemplo, células Vero, células de ovario de hámster chino, fibroblastos de embrión de pollo, células BHK, células SW13 humanas), y células de insecto (por ejemplo, Sf9, Sf21).

Los polipéptidos producidos vía recombinante se pueden recuperar y purificar de los cultivos de células recombinantes mediante métodos muy conocidos, que incluyen cromatografía de líquidos de alto rendimiento, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina.

Se puede usar cualesquiera de uno o más sistemas para expresar y producir los polipéptidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis en un sistema celular heterólogo. Tales sistemas incluyen, entre otros, sistemas cromosómicos, episomales y derivados de virus. Los vectores se pueden derivar de plásmidos bacterianos, bacterias atenuadas, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, o virus. Se pueden obtener vectores de virus tales como vaccinia y otros poxvirus, sindbis, adenovirus, baculovirus, papovavirus (tales como SV40), virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia, retrovirus, alfavirus (tales como el virus de la encefalitis equina Venezolana (Patente de EE. UU. No. 5,643,576)), virus de ARN de cadena negativa no segmentados tales como el virus de la estomatitis vesicular (Patente de EE. UU. No. 6,168,943). También se pueden derivar vectores de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmido y bacteriófago, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión deben incluir regiones de control que regulan y también engendran expresión, tales como promotores y otros elementos reguladores (tales como una señal de poliadenilación). Generalmente se puede usar cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para producir un polipéptido en un hospedero. La secuencia de nucleótidos adecuada se puede insertar en un sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias muy conocidas, tales como por ejemplo las que se exponen en Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (supra).

En una modalidad, la presente invención provee vectores de expresión que expresan polipéptidos del ORF358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, para usarse en composiciones inmunogénicas. Los vectores de expresión comprenden polinucleótidos ORF1358 que codifican polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32, o un fragmento de las mismas. Alternativamente, los vectores de expresión comprenden un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de las mismas. En otras modalidades, los vectores de expresión de la invención comprenden un polinucleótido enlazado operativamente con un potenciador-promotor. En otras modalidades, los vectores de expresión comprenden un polinucleótido enlazado operativamente con un promotor procariótico. Alternativamente, los vectores de expresión comprenden un polinucleótido enlazado operativamente con un potenciador-promotor que es un promotor eucariótico. Los vectores de expresión también pueden comprender una señal de poliadenilación que está colocada en la posición 3' del aminoácido carboxi-terminal y dentro de una unidad de transcripción del polipéptido codificado.

La "secuencia codificadora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Las "secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas en dirección 5' (secuencias no codificadoras 5'), dentro, o en dirección 3' (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora, y que alteran la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias guía de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

El "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. En general, una secuencia codificadora está localizada en dirección 3' de una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste en elementos en dirección 5' proximales y más distales, estos últimos elementos llamados frecuentemente potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar la cantidad o especificidad de tejido de un promotor. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso pueden comprender segmentos de nucleótido sintéticos. Los expertos en la materia comprenderán que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. La mayoría de las veces los promotores que hacen que un fragmento de ácido nucleico sea expresado en la mayoría de los tipos de células se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Además, se reconoce que como en la mayoría de los casos no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras, fragmentos de ácido nucleico de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica.

Los promotores usados comúnmente se derivan de virus tales como polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión, adecuados para células tanto procarióticas como eucarioticas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, que se incorpora aquí como referencia. En algunos casos, el vector de expresión es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos. Ejemplos no limitativos de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al., Genes Dev, 1 : p. 268-277, 1987), promotores linfoides específicos (Caíame y Eaton, Adv Immunol, 43: p. 235-275, 1988), en particular, promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, EMBO J, 8: p. 729-733, 1989) e inmunoglobulinas (Banerji et ai, Cell, 33: p. 729-740, 1983; Queen y Baltimore, Cell, 33: p. 741-748, 1983), promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle, PNAS, 86: p. 5473-5477, 1989), promotores específicos del páncreas (Edlund et al., Science, 230: p. 912-916, 1985), y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, el promotor de suero de leche; Patente de EE. UU. No. 4,873,316 y solicitud de patente internacional EP 264,166). También se contemplan promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss, Science, 249: p. 374-379, 1990) y el promotor de la a-fetoproteína (Campes y Tilghman, Genes Dev, 3: p. 537-546, 1989).

También se proveen aquí vectores de expresión recombinantes que comprenden polinucleótidos que codifican por lo menos una porción de un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, clonados en el vector de expresión en una orientación de antisentido. Esto es, la molécula de ADN está enlazada operativamente con una secuencia reguladora de modo que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es de antisentido al ARNm del polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Se pueden elegir secuencias reguladoras enlazadas operativamente con un ácido nucleico clonado en orientación de antisentido para que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN de antisentido en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, se pueden elegir promotores y/o potenciadores virales, o secuencias reguladoras para que dirijan la expresión constitutiva específica de tejido o específica de tipo de célula del ARN de antisentido. El vector de expresión de antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fegémido o virus atenuado, en donde son producidos ácidos nucleicos de antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad puede ser determinada por el tipo de célula en la que se introduce el vector.

Los vectores de expresión recombinante aquí descritos se pueden insertar en cualquier célula hospedera adecuada. Los términos "célula hospedera" y "célula hospedera recombinante" se usan aquí intercambiablemente. Se entiende que tales términos se refieren no solo a la célula sujeto particular, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Como pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones subsiguientes debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero todavía está incluida dentro del alcance de término según se usa en la presente descripción. Una célula hospedera puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis puede ser expresado en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto (tales como Sf9, Sf21), células de levadura, o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células VERO, fibroblastos de embrión de pollo, células BHK o células COS). Otras células hospederas adecuadas serán conocidas para los expertos en la materia.

El ADN del vector se introduce en las células procarióticas o eucarióticas mediante técnicas convencionales de transformación, infección o transfección. Como se usan aquí, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una variedad de técnicas reconocidas para introducir ácido nucleico ajeno (por ejemplo, ADN) en una célula hospedera, incluso coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, ultrasonido o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio.

La célula hospedera que se describe en la presente, tal como una célula hospedera procariótica o eucariótica en cultivo, se usa para producir (esto es, expresar) un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Por consiguiente, también se describen en la presente métodos para producir un polipéptido usando dichas células hospederas. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula hospedera (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido ORF1358) en un medio adecuado, hasta que se produce el polipéptido. En otra modalidad, el método también comprende aislar el polipéptido ORF1358 del medio o la célula hospedera.

La expresión de los polipéptidos en procariotes se efectúa más frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o sin fusión. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, lambda PL, spc ribosomales y beta-lactamasa. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lac, tac y proteína de unión de maltosa. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada, usualmente en el extremo amino de la proteína recombinante. Típicamente, tales vectores de fusión sirven para tres propósitos: aumentar la expresión de la proteína recombinante; aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de corte proteolítico en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el factor Xa, trombina y enterocinasa. La invención también provee vectores (por ejemplo, vectores de expresión, vectores de secuenciación, vectores de clonación) que comprenden por lo menos un polinucleótido de la invención, células hospederas que son construidas por ingeniería genética con los vectores de la invención, y la producción de los polipéptidos de la invención por medio de técnicas recombinantes: También se pueden usar sistemas de traducción sin células para producir tales proteínas usando ARNs derivado de las construcciones de ADN de la invención.

Los vectores de expresión útiles para expresar los polipéptidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, son vectores virales tales como lentivirus, retrovirus, herpesvirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus vaccinia, baculovirus, y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. De esta manera, un gen que codifica una proteína o polipéptido funcional o muíante, o fragmento de los mismos, se puede introducir in vivo, ex vivo, o in vitro, usando un vector viral o mediante introducción directa del ADN. La expresión en tejidos objetivo se puede efectuar dirigiendo el vector transgénico a células específicas, por ejemplo con un vector viral o un ligando receptor, o usando un promotor específico de tejido, o ambos. El suministro de gen dirigido se describe en la publicación de PCT No. WO 95/28494.

Los vectores virales usados comúnmente para procedimientos de dirección y terapia in vivo o ex vivo son vectores basados en ADN y vectores retrovirales. Los métodos para construir y usar vectores virales son conocidos (por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques, 1992, 7:980-990). Preferiblemente, los vectores virales son defectuosos de replicación, esto es, son incapaces de replicarse de forma autónoma en la célula objetivo. Preferiblemente, el virus defectuoso de replicación es un virus mínimo, esto es, retiene solamente las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular el genoma para producir partículas virales.

Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como por ejemplo un virus de herpes simple (VHS), virus de papiloma, virus de Epstein Barr (VEB), adenovirus, virus adeno-asociado, etcétera. Se prefieren los virus defectuosos que carecen completamente o casi completamente de genes virales. Un virus defectuoso no es infeccioso después de su introducción en una célula. El uso de vectores virales defectuosos permite su administración a las células en una zona localizada específica, sin preocuparse de que el vector pueda infectar otras células. De esta manera puede ser alcanzado específicamente un tejido específico. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, sin limitación, un vector de virus de herpes 1 (VHS1) defectuoso (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 1991 , 2:320-330), vector de virus de herpes defectuoso que carece de un gen de glicoproteína L, otros vectores de virus de herpes defectuosos (publicaciones de PCT Nos. WO 94/21807 y WO 92/05263); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest., 1992, 90:626-630; véase también La Salle et al., Science, 1993, 259:988-990); y un vector de virus adeno-asociado defectuoso (Samuiski et al., J. Virol., 1987, 61:3096-3101 ; Samulski et al., J. Virol., 1989, 63:3822-3828; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 1988, 8:3988-3996).

Los polipéptidos de la invención, incluso los que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 13, sus fragmentos y sus análogos, o las células que los expresan, también se pueden usar como inmunogenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para los polipéptidos de la invención. La invención incluye anticuerpos inmunoespecíficos para los polipéptidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis; el uso de dichos anticuerpos para detectar la presencia o medir la cantidad o concentración de los polipéptidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis en una célula, extracto de célula o tejido, o fluido biológico, o para el tratamiento de una infección por Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis.

Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas del suero de animales inmunizados con un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son una población sustancialmente homogénea de anticuerpos para antígenos específicos. En general, los anticuerpos se pueden hacer, por ejemplo, usando las técnicas de hibridoma tradicionales (Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-499, 1975), métodos de recombinación de ADN (Patente de EE. UU. No. 4,816,567), o despliegue de fago usando colecciones de anticuerpo (Clackson et al. Nature 352: 624-628, 1991 ; Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). Para ver más técnicas de producción de anticuerpos se puede consultar "Antibodies: A Laboratory Manual", eds. Harlow and Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. La presente invención no se limita a ninguna fuente o método de producción particular ni a otra característica especial de un anticuerpo.

Los anticuerpos intactos son ¡nmunoglobulinas (Ig) y típicamente son proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras (~ 25 kDa cada una) y dos cadenas pesadas (~ 50 kDa cada una). Las cadenas ligeras se clasifican en dos isotipos (? y ?), y las cadenas pesadas se clasifican en cinco isotipos (A, D, E, G y M). Algunos isotipos de cadena pesada se dividen adicionalmente en subclases de isotipos, por ejemplo IgGi, lgG2, lgG3 e lgG4.

Se conoce el dominio y las estructuras tridimensionales de diferentes anticuerpos (Harlow y Lañe, supra). En resumen, la cadena ligera está compuesta de un dominio constante (CL) y un dominio variable N-terminal (VL). La cadena pesada está compuesta de tres o cuatro dominios constantes (CH), una región de gozne y un dominio variable N-terminal (VH). El CH adyacente al dominio VH se denomina Cm. Los dominios VH y VL contienen cuatro regiones de secuencia conservadas denominadas regiones de armazón (FR1 , FR2, FR3 y FR4), que forman un andamio para tres regiones de secuencia hipervariables denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las CDR's (CDR1 , CDR2 y CDR3) contienen la mayoría de los aminoácidos del anticuerpo que reconocen y se unen específicamente al antígeno. Las CDR's de cadena pesada se denotan como H1 , H2 y H3, mientras que las CDR's de cadena ligera se denotan como L1 , L2 y L3.

El fragmento Fab (fragmento de unión de antígeno) consiste en los dominios VH-CHi y VL-CL enlazados covalentemente por un enlace disulfuro entre las regiones constantes. El fragmento Fv es más pequeño y consiste en los dominios VH y VL unidos de forma no covalente. Para superar la tendencia de los dominios no covalentes a disociarse se puede construir un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). El scFv contiene un polipéptido flexible que une (1) el extremo C de VH al extremo N de VL, o (2) el extremo C de VL al extremo N de VH- Se puede usar como enlazador un péptido de 15 elementos (Gly4Ser)3, pero se conocen otros enlazadores.

Se crea diversidad de anticuerpo usando múltiples genes de línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos de gen variables y segmentos de gen de diversidad (D) y unión (J) para hacer una región VH completa, y la recombinación de segmentos de gen variables y de unión para hacer una región VL completa. La CDR3 (H3) es la fuente más grande de diversidad molecular dentro de una secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, la H3 puede ser tan corta como de dos residuos de aminoácido, o mayor de 26. El fragmento de unión de antígeno más pequeño es el Fv, que consiste en los dominios VH y VL.

Opcionalmente los anticuerpos anti-polipéptido ORF1358 de esta invención pueden comprender regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL se puede unir en su extremo C-terminal con un dominio constante de cadena ligera como CK o CA. Similarmente, un dominio VH o porción del mismo se puede unir con una parte o toda una cadena pesada, como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y cualquier clase de isotipo. El isotipo del anticuerpo, tal como IgGi, lgG2, lgG3 o lgG4, es determinado por los dominios CH2 y CH3. Los isotipos se pueden cambiar cambiando estos dominios sin alterar la unión del antígeno. Las regiones constantes son conocidas (véase por ejemplo, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Betesda, MD, 1991 ).

Los anticuerpos quiméricos son moléculas que tienen diferentes porciones derivadas de diferentes especies de animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos y los métodos de su producción son conocidos (Cabilly et al., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 81 -.3273-3277, 1984; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1984; Boulianne et a/., Nature 312:643-646, 1984; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea No. 125023 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Taniguchi et al., Solicitud de Patente Europea No. 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison et al., Solicitud de Patente Europea No. 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger et al., Solicitud de PCT No. WO 86/01533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo et al., Solicitud de Patente Europea No. 184187 (publicada el 11 de junio de 1986); Morrison et al., Solicitud de Patente Europea No. 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074, 1986; Robinson et al., PCT/US86/02269 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443, 1987; Sun et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218, 1987; Better et al., Science 240:1041-1043, 1988).

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente con el sitio de unión de antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-ld se prepara inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, una raza de ratón) que la fuente del anticuerpo monoclonal, con el anticuerpo monoclonal para el cual se prepara el anti-ld. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para estos determinantes isotípicos (el anticuerpo anti-ld).

Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales generados contra los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para inducir anticuerpos anti-ld en animales adecuados. Las células del bazo de tales animales inmunizados se pueden usar para producir hibridomas anti-ld que secretan anticuerpos monoclonales anti-ld. Además, los anticuerpos anti-ld se pueden acoplar con un portador tal como hemocianina de lapa (KLH) y se pueden usar para inmunizar adicionalmente ratones BALB/c. El suero de estos ratones contendrá anticuerpos anti-anti-ld que tienen las propiedades de unión del mAb final específico para un epítope de R-PTPasa. Así, los anticuerpos anti-ld tienen sus epítopes idiotípicos o "idiotipos" estructuralmente similares al epítope evaluado, tal como los polipéptidos de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis codificados por el ORF1358.

El término "anticuerpo" también incluye tanto moléculas intactas como fragmentos tales como Fab, que son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión inespecífica de tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Meó. 24:316-325, 1983). Se apreciará que el Fab y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden usar para detectar y cuantificar los polipéptidos de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, de acuerdo con los métodos para moléculas de anticuerpo intactas.

El anticuerpo anti-ld también se puede usar como "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal, produciendo el denominado anticuerpo anti-anti-ld. El anti-anti-ld puede ser idéntico en sus epítopes al mAb original que indujo el anti-ld. De esta manera, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de la misma especificidad.

Los anticuerpos se pueden usar en una variedad de formas, por ejemplo, para confirmar si fue expresada una proteina, o para confirmar en donde fue expresada una proteína. El anticuerpo marcado (por ejemplo con marcación fluorescente para FACS) se puede incubar con bacterias intactas, y la presencia de la marca en la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína.

Se pueden usar otros métodos adecuados para producir o aislar anticuerpos que se unen específicamente a un epítope del polipéptido ORF1358 estreptocócico del grupo C o grupo G. En algunas modalidades, el anticuerpo recombinante se selecciona de una colección de despliegue de péptido o proteína, tal como por ejemplo colecciones de despliegue de bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN y ADNc (EP368.684; PCT7GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; W092/ 8619; WO96/07754; EP614.989; WO95/16027; WO88/06630; WO90/3809; Patente de EE. UU. No. 4,704,692; PCT/US91/02989; WO89/06283; EP371.998; EP550.400; EP229.046; y PCT/US91/07149.) En otras modalidades, el anticuerpo recombinante se selecciona de una colección de péptidos o proteínas generada estocásticamente (Patentes de EE. UU. Nos. 5,723,323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862; WO 86/05803; y EP 590,689). En otras modalidades, el anticuerpo recombinante es producido en un animal transgénico que es capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos (Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41 :901-907, 1997; Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118, 1996; y Eren et al., Immunol. 93:154-161 , 1998). Otras técnicas para producir anticuerpos recombinantes incluyen por ejemplo técnicas de producción de anticuerpo de una sola célula, tales como el método de anticuerpo de linfocito seleccionado ("SLAM") (Patente de EE. UU. No. 5,627,052), métodos de microgota de gel y citometria de flujo (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337, 1990), y selección de células B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134, 1994). Estos mismos métodos también se pueden usar para mejorar la afinidad y/o avidez de un anticuerpo anti-PPI de estreptococo del grupo C o grupo G por su blanco de unión específico.

La presente invención provee composiciones inmunogénicas que comprenden uno o más polipéptidos de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis codificados por el ORF1358. En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas comprenden uno o más polipéptidos de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, que comprenden una secuencia de residuos de aminoácido que es por lo menos 97.5%, 98%, 99% o 100% idéntica a las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 y 32, y uno o más vehículos fisiológicamente aceptables.

En otras modalidades, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden polinucleótidos que codifican los polipéptidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, y uno o más vehículos fisiológicamente aceptables. En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 90%, 95%, 99% o 100% idéntica a una o más de las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9,1 1 , 25, 27, 29 o 31.

El término "composición inmunogénica", como se usa aquí, se refiere a cualquier tipo de agente biológico en una forma administrable capaz de estimular una respuesta inmune en un animal (incluso humano) al que se le inocula la composición inmunogénica. Una respuesta inmune puede incluir inducción de anticuerpos y/o inducción de una respuesta de células T. Aquí, el término "protección", cuando se usa con respecto a una composición inmunogénica, se refiere al mejoramiento (parcial o completo) de cualquiera de los síntomas asociados con la enfermedad o padecimiento en cuestión.

Así, la protección de animales contra Streptococcus o infección por especies de Streptococcus, tales como Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis con las presentes composiciones inmunogénicas, generalmente resulta en la disminución del crecimiento bacteriano y/o uno o más de los síntomas clínicos asociados con infección por especies de Streptococcus, que incluyen artritis, endocarditis, meningitis, poliserositis, bronconeumonía, meningitis, pérdida auditiva permanente y choque séptico.

Los métodos aquí descritos pueden incluir la inducción de una respuesta inmune contra uno o más patógenos que incluyen especies de Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis). Por ejemplo, los métodos pueden incluir la inducción de anticuerpos policlonales contra uno o más patógenos que incluyen una especie de Streptococcus que puede incluir Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. En algunas modalidades, los métodos incluyen administrar a un sujeto (cualquier vertebrado, incluso pacientes humanos y otros mamíferos) una composición que incluye un polipéptido o polinucleótido ORF1358 aislado de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis.

Para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los polipéptidos de la invención se usan varias pruebas. Por ejemplo, se hace una prueba opsónica in vitro incubando juntos una mezcla de células de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, suero desactivado con calor que contiene anticuerpos específicos para el polipéptido en cuestión, y una fuente de complemento exógena. La opsonofagocitosis procede durante la incubación de células polimorfonucleares (PMN's) recién aisladas y la mezcla anticuerpo/complemento/célula de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Las células bacterianas que se cubren con anticuerpo y complemento resultan muertas por opsonofagocitosis. Las unidades formadoras de colonia (ufe) de las bacterias sobrevivientes que escapan de la opsonofagocitosis se determinan cultivando en placa la mezcla de prueba. Los títulos se reportan como el recíproco de la dilución más alta que produce > 50% de muerte bacteriana, determinada por comparación con controles de prueba. Los especímenes que muestran menos de 50% de muerte bacteriana a la dilución de suero más baja probada (1 :8) se reportan con un título OPA (anticuerpo de opsonofagocitosis) de 4. La dilución más alta probada es de 1 :2560. Las muestras con= 50% de muerte a la dilución más alta se repiten empezando con una dilución inicial más alta. El método descrito es una modificación del método de Gray (Gray, "Conjúgate Vaccines Supplement", p. 694-697, 1990). Para cada suero individual se incluye un control de suero de prueba, que contiene suero de prueba más células bacterianas y complemento desactivado con calor. Este control se usa para evaluar si la presencia de antibióticos u otros componentes del suero es capaz de matar la cepa bacteriana directamente (esto es, en ausencia de complemento o PMN's). Como control positivo de suero humano se usa un suero humano con un título opsónico conocido. El título de anticuerpo opsónico para cada suero desconocido se calcula como el recíproco de la dilución inicial del suero que da 50% de reducción de ufe en comparación con el control sin suero.

También se usa una prueba de ELISA de célula completa para evaluar la inmunogenicidad in vitro y cualquier exposición en superficie del antígeno del polipéptido, en donde la cepa bacteriana de interés se deposita sobre una placa, tal como una placa de 96 pocilios, y se hace reaccionar suero de prueba de un animal inmunizado con las células bacterianas. Si cualquier anticuerpo específico para el antígeno del polipéptido de prueba es reactivo para un epítope del antígeno del polipéptido expuesto en la superficie, el anticuerpo puede ser detectado mediante los métodos estándares conocidos del experto en la materia.

Cualquier polipéptido que muestre la actividad in vitro deseada se puede probar entonces in vivo en un modelo de animal de provocación. En algunas modalidades se usan composiciones inmunogénicas para la inmunización de un animal (por ejemplo un ratón) mediante los métodos y vías de inmunización conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, intranasal, parenteral, intramuscular, oral, rectal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, etc.). Después de la inmunización del animal con una composición inmunogénica particular de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, el animal se provoca con la misma especie estreptocócica o una diferente, y se prueba su resistencia a la misma infección u otra infección por Streptococcus spp.

Los polipéptidos y polinucleótidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis se incorporan en composiciones inmunogénicas adecuadas para su administración a un sujeto, por ejemplo un humano. Típicamente, tales composiciones comprenden la molécula de ácido nucleico o proteína, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa de aquí en adelante, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, excipientes, etcétera, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido. Se puede usar cualquier medio o agente convencional en las composiciones de la invención siempre y cuando sea compatible con el compuesto activo. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos complementarios.

Una composición inmunogénica de la invención se formula para ser compatible con la vía de administración deseada. Los ejemplos de vías de administración incluyen parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal), transmucosal (por ejemplo oral, rectal, intranasal, vaginal, respiratoria), y transdérmica (tópica). Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluente estéril tal como agua inyectable, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajusfar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La composición parenteral se puede envasar en ampolletas, jeringas desechables o frascos de multidosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina amortiguadora de fosfato (PBS). En todos los casos la composición debe ser estéril y debe ser fluida a tal grado que sea fácilmente jeringable. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar preservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, etcétera), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y usando agentes tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr por medio de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, etcétera. En muchos casos se incluyen en la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. Las composiciones inyectables se pueden hacer de absorción prolongada incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando la cantidad requerida de compuesto activo (por ejemplo un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, o anticuerpo para el mismo) en un disolvente adecuado, con un ingrediente o una combinación de ingredientes como los mencionados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización por filtración. Generalmente las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y congelación-secado, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional partiendo de una solución previamente filtrada esterilizada del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o se pueden comprimir en tabletas. Para fines de administración oral terapéutica, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y se puede usar en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para usarse como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se hacen gárgaras y se escupe o se traga. Como parte de la composición se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa; un agente desintegrador como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.

Para administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de un aerosol desde un recipiente o despachador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medio transmucosal o transdérmico. Para administración transmucosal o transdérmica se usan en la composición agentes de penetración adecuados para la barrera que se desea penetrar. Estos agentes de penetración son generalmente conocidos e incluyen, por ejemplo para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal se puede realizar usando aerosoles nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas como se conocen generalmente.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos), o enemas de retención para suministro rectal.

En una modalidad, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegen al compuesto contra eliminación rápida del cuerpo, tal como una composición de liberación controlada que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados.

Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de tales composiciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation (Mountain View, CA) y Nova Pharmaceuticals, Inc. (Baltimore, MD). También se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas, con anticuerpos monoclonales para antígenos virales). Estos se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo como se describe en la Patente de EE. UU. No. 4,522,811.

Es conveniente presentar las composiciones orales o parenterales en formas farmacéuticas dosificadas para facilitar su administración y uniformidad de dosificación. Como se usa aquí, la forma farmacéutica dosificada se refiere a unidades físicamente distintas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas farmacéuticas dosificadas de la invención es dictada por las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se quiere lograr y depende directamente de ellas, y de las limitaciones inherentes de la técnica de formulación de dicho compuesto activo para el tratamiento de las personas.

Se proveen composiciones inmunogénicas combinadas donde se combinan uno o más de los polipéptidos de la invención con uno o más polisacáridos o conjugados polisacárido-proteína estreptocócicos conocidos.

El componente de proteína de los conjugados de carbohidrato-proteína es conocido como "proteina portadora". El término "proteínas portadoras" incluye las proteínas que son inocuas, no reactivas y obtenibles con cantidad y pureza suficientes. Las proteínas portadoras son susceptibles de procedimientos de conjugación estándar. Por ejemplo, se puede usar CRM197 como la proteína portadora. La CRMig7 (Wyeth, Sanford, N.C.) es una variante inocua (toxoide) de la toxina de difteria aislada de cultivos de Corynebacteríum diphthería cepa C7 (ß197), desarrollada en casaminoácidos y medio basado en extracto de levadura. La CRM197 se purifica por ultrafiltración, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico. También son adecuados otros toxoides de difteria para usarse como proteínas portadoras.

Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas desactivadas tales como el toxoide tetánico, toxoide pertusis, toxoide del cólera (como se describe por ejemplo en la publicación de PCT No. WO/2004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli, y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. También se puede usar proteínas de la membrana externa bacteriana tales como el complejo c de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de unión de transferrina, proteína A de superficie neumocócica de neumolisis (PspA), proteína adhesina neumocócica (PsaA), o proteína D de Haemophilus influenzae. También se pueden usar como proteínas portadoras otras proteínas como ovoalbúmina, hemocianina de lapa (KLH), albúmina de suero bovina (BSA) o proteína purificada derivada de tuberculína (PPD).

Las composiciones inmunogénicas que comprenden los polinucleótidos ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, son suministradas al receptor mediante una variedad de vectores y sistemas de expresión. Tales sistemas incluyen, entre otros, sistemas cromosómicos, episomales y derivados de virus, como se mencionó arriba.

Una composición ¡nmunogénica de la presente invención típicamente se administra por vía parenteral en formas farmacéuticas dosificadas que contienen, según se requiera, vehículos, adyuvantes y excipientes inocuos fisiológicamente aceptables que son muy conocidos.

Se entiende que un vehículo farmacéuticamente aceptable designa un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica o inmunogénica, que no causan efectos secundarios y que, por ejemplo, facilitan la administración del compuesto activo, aumentan su duración y/o eficacia en el cuerpo, aumentan su solubilidad en solución, o alternativamente mejoran su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son muy conocidos y serán adaptados por los expertos en la materia de acuerdo con la naturaleza y modo de administración del compuesto activo elegido.

Las composiciones inyectables, por ejemplo suspensiones acuosas u oleosas inyectables estériles, se preparan de acuerdo con la técnica convencional usando agentes de dispersión o mojado y agentes de suspensión adecuados. La composición inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluente o disolvente inocuo aceptable para uso parenteral, por ejemplo como una solución en 1 ,3-butanodiol.

Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se utilizan aceites no volátiles estériles como disolventes o medios de suspensión. Para esta finalidad se puede usar cualquier aceite no volátil suave, incluso mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico son de utilidad en la preparación de las composiciones inyectables.

Los vehículos incluyen soluciones salinas neutras amortiguadas con fosfato, lactato, Tris, etcétera. Cuando se van a administrar vectores virales, el vector se purifica suficientemente para hacerlo esencialmente libre de contaminantes no deseados, tales como partículas de adenovirus defectuosas importunas o endotoxinas y otros pirógenos, de tal manera que no ocasione ninguna reacción indeseable en la persona que recibe la construcción del vector. En algunas modalidades, los medios para purificar el vector incluyen el uso de gradientes de densidad boyante, tal como centrifugación por gradiente de cloruro de cesio.

Un liposoma también puede ser un vehículo. Los medios para usar liposomas como vehículos de suministro son muy conocidos (véase por ejemplo la revisión de Schwendener R A, Adv. Exp. Med. Biol. 620:117-128, 2007).

Las composiciones inmunogénicas de esta invención también comprenden una secuencia de polinucleótido de esta invención enlazado operativamente con una secuencia reguladora que controla la expresión del gen. La secuencia de polinucleótido de interés se construye por ingeniería en un vector de expresión, tal como un plásmido, bajo el control de elementos reguladores que promueven la expresión del ADN, esto es, elementos promotores y/o potenciadores. En algunas modalidades se usa el promotor/potenciador inmediato temprano de citomegalovirus humano (Patente de EE. UU. No. 5,168,062). El promotor puede ser específico de célula y permitir la transcripción sustancial del polinucleótido solo en células predeterminadas.

Los polinucleótidos de la invención se introducen directamente en el hospedero como ADN "desnudo" (Patente de EE. UU. No. 5,580,859), o se formulan en composiciones con agentes facilitadores, tales como bupivacaína y otros anestésicos locales (Patente de EE. UU. No. 5,593,972) y poliaminas catiónicas (Patente de EE. UU. No. 6,127,170). En este procedimiento de inmunización con polinucleótido, los polipéptidos de la invención son expresados in vivo sobre una base transitoria; el material genético no se inserta ni se integra en los cromosomas del hospedero. Este procedimiento se distingue de la terapia génica en donde la meta es insertar o integrar el material genético de interés en el cromosoma. Se usa una prueba para confirmar que los polinucleótidos administrados por inmunización no produzcan un fenotipo transformado en el hospedero (por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 6,168,918).

Las composiciones inmunogénicas aquí descritas también comprenden, en algunas modalidades, uno o más adyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que realza la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno. Se ha mostrado que varias citocinas o linfocinas tienen actividad moduladora inmune y por lo tanto son útiles como adyuvantes; incluyen sin limitación las interleucinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase por ejemplo, la Patente de EE. UU. No. 5,723, 127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones a, ß y ?; el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (véase por ejemplo la Patente de EE. UU. No. 5,078,996 y No. de registro ATCC 39900); el factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF); el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF); y los factores de necrosis de tumor a y ß. Otros adyuvantes que son útiles en las composiciones inmunogénicas aquí descritas incluyen quimocinas, que incluyen sin limitación MCP-1 , MIP-1a, ???-1 ß y RANTES; moléculas de adhesión como selectina, por ejemplo L-selectina, P-selectina y E-select¡na; moléculas de tipo mucina, por ejemplo CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1 ; un miembro de la familia de integrinas como LFA-1 , VLA-1 , Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas tal como PECAM, ICAMs, por ejemplo ICAM-1 , ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras como CD40 y CD40L; factores de crecimiento que incluyen el factor de crecimiento vascular, el factor de crecimiento de nervio, el factor de crecimiento de fibroblasto, el factor de crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1 y el factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas receptoras que incluyen Fas, receptor del TNF, Flt, Apo-1 , p55, WSL-1 , DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6; y Caspasa (ICE).

Los adyuvantes adecuados para realzar una respuesta inmune también incluyen, sin limitación, MPL™ (monofosforil-lípido A 3-O-desacilado, Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la Patente de EE. UU. No. 4,912,094. También son adecuados para usarse como adyuvantes los análogos sintéticos del lípido A o compuestos de aminoalquil-glucosamina fosfato (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa (Hamilton, MT), y que se describen en la Patente de EE. UU. No. 6,113,918. Uno de tales AGP's es el 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil-2-desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, conocido también como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (FA) o como una emulsión estable (EE).

Otros adyuvantes incluyen muramil péptidos, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones aceite en agua tales como MF59 (Patente de EE. UU. No. 6,299,884) (que contiene 5% de escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span 85 (que contiene opcionalmente varias cantidades de MTP-PE), formulado en partículas de submicrones usando un microfluidizador como el Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA)), y SAF (que contiene 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado con pluronic, y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión de submicrones o agitado en vórtice para generar una emulsión con tamaño de partícula más grande); adyuvante incompleto de Freund (IFA); sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amphigen; Avridine; L121/escualeno; D-láctido-poliláctido/glicósido; polioles pluronic; bórdetela muerta; saponinas como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA), descrito en la Patente de EE. UU. No. 5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descrito en la Patente de EE. UU. No. 5,254,339, y complejos inmunoestimuladores (ISCOMS); Mycobacterium tuberculosis; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos tales como los oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (por ejemplo, véase la Patente de EE. UU. No. 6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), descrito en las Patentes Europeas Nos. 1 ,296,713 y 1 ,326,634; toxina pertusis (PT) o mutantes de la misma, toxina del cólera o mutantes de la misma (por ejemplo, véanse las Patentes de EE. UU. Nos. 7,285,281 , 7,332,174, 7,361 ,355 y 7,384,640); o la toxina termolábil de E. coli (LT) o mutantes de la misma, particularmente LT-K63, LT-R72 (por ejemplo, véanse las Patentes de EE. UU. Nos. 6,149,919, 7,1 15,730 y 7,291 ,588).

La presente invención está dirigida, entre otras cosas, al tratamiento de una infección estreptocócica mediante la administración de reactivos inmunológicos terapéuticos, tales como anticuerpos monoclonales humanizados, que reconocen epítopes específicos en un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis a un sujeto, bajo condiciones que generan una respuesta terapéutica benéfica en el sujeto. Los "reactivos inmunológicos" incluyen por ejemplo anticuerpos, anticuerpos humanizados, fragmentos de anticuerpo, péptidos que comprenden elementos de unión de antigeno o CDR's, etcétera. Las "respuestas terapéuticas benéficas" incluyen por ejemplo inducción de fagocitosis u opsonización de estreptococos beta-hemolíticos. La invención también está dirigida al uso de los reactivos inmunológicos descritos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección estreptocócica beta-hemolítica.

En un aspecto, la invención provee métodos de prevención o tratamiento de enfermedades asociadas con una infección estreptocócica beta-hemolítica en un paciente. Algunos métodos de la invención abarcan administrar a un paciente una dosis efectiva de un anticuerpo que se une específicamente a un epítope del ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Tales métodos son particularmente útiles para prevenir o tratar una enfermedad estreptocócica beta-hemolítica en los sujetos. Los "sujetos" incluyen cualquier animal vertebrado, tal como los animales domésticos, animales de granja, mamíferos y pacientes humanos. Los métodos ejemplares incluyen administrar una dosis efectiva de un anticuerpo o péptido de unión de antígeno, que se une a un polipéptido ORF 358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis. Algunas modalidades incluyen administrar una dosis efectiva de un anticuerpo u otro péptido que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno o CDR, que se une específicamente a un epítope en un polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis, tal como por ejemplo un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualesquiera una o más de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10,12, 13, 26, 28, 30 o 32.

En otro aspecto, la invención presenta la administración de anticuerpos u otros péptidos de unión de antígeno que se unen al polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus o Streptococcus constellatus sp. pharyngis en el sujeto, e inducen una respuesta de eliminación de estreptococos beta-hemolíticos. Por ejemplo, tal respuesta de eliminación puede ser efectuada por fagocitosis mediada por el receptor Fe.

Normalmente los reactivos inmunológicos terapéuticos de la invención son sustancialmente puros de contaminantes indeseables. Esto significa que normalmente un reactivo inmunológico tiene una pureza de por lo menos aproximadamente 50% p/p (peso/peso), y también que está sustancialmente libre de proteínas y contaminantes importunos. En algunas modalidades, los reactivos inmunológicos tienen una pureza de por lo menos aproximadamente 80% p/p. En otras modalidades, los reactivos inmunológicos tienen una pureza de por lo menos aproximadamente 90% o 95% p/p. Sin embargo, usando las técnicas convencionales de purificación de proteína, se pueden obtener péptídos homogéneos de por lo menos 99% p/p de pureza.

Los métodos se pueden usar tanto en sujetos asintomáticos como en los que muestran en el momento síntomas de la enfermedad. Los anticuerpos usados en tales métodos pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o no humanos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión de antígeno, péptidos que comprenden regiones de unión de epítope o CDR's), y pueden ser monoclonales o policlonales como se describe en la presente.

En otro aspecto, la invención presenta la administración de un anticuerpo con un vehículo farmacéutico como una composición farmacéutica. Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar a un sujeto administrándole un polinucleótido que codifica por lo menos una cadena de anticuerpo. El polinucleótido es expresado para producir la cadena de anticuerpo en el paciente. Opcionalmente, el polinucleótido codifica cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. El polinucleótido es expresado para producir las cadenas pesadas y ligeras en el paciente. En modalidades ejemplares, se monitorea en la sangre del paciente la concentración del anticuerpo administrado.

Los sujetos susceptibles de tratamiento incluyen personas en riesgo de la enfermedad pero que no muestran síntomas, y también pacientes que muestran síntomas en el momento. Por lo tanto, las presentes composiciones inmunogénicas y anticuerpos terapéuticos se pueden administrar de forma profiláctica a la población general. En sujetos asintomáticos el tratamiento puede empezar a cualquier edad. El tratamiento puede ser monitoreado determinando los títulos de anticuerpo en el transcurso del tiempo. Si la respuesta inmune o el título de anticuerpo descienden, está indicada una dosis de refuerzo.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones inmunogénicas o medicamentos se administran a un sujeto susceptible o en riesgo de infección estreptocócica beta-hemolítica en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la severidad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluso los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de conducta de la enfermedad asociados con la infección, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente en sospecha de padecer dicha enfermedad, o que ya la padece, en una cantidad suficiente para curar o detener por lo menos parcialmente los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o de conducta), incluso sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad.

Una cantidad adecuada para el tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéuticamente o profilácticamente efectiva. En regímenes tanto profilácticos como terapéuticos, los reactivos inmunológicos usualmente se administran en varias dosis hasta alcanzar una respuesta inmune suficiente. El término "respuesta inmune" o "respuesta inmunológica" incluye el desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpo) y/o celular (mediada por células T específicas de antígeno o sus productos de secreción), dirigida contra un antígeno en un sujeto receptor. Tal respuesta puede ser una respuesta activa, esto es, inducida por la administración de un inmunógeno (supra) o una respuesta pasiva, esto es, inducida por la administración de inmunoglobulina o anticuerpo o células T cebadas. Normalmente la respuesta inmune se monitorea y si la respuesta inmune empieza a declinar se administran dosis repetidas.

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de una infección estreptocócica beta-hemolítica varían dependiendo de muchos factores, que incluyen el medio de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano u otro animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Usualmente el sujeto es un humano pero también se pueden tratar mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos. Puede ser necesario titular las dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia.

Para inmunización pasiva con un anticuerpo, las dosis varían de aproximadamente 0.0001 mg/kg a 100 mg/kg, más usualmente de 0.01 mg/kg a 5 mg/kg (por ejemplo, 0.02 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o dentro de la escala de 1 mg/kg a 10 mg/kg. También están consideradas dentro del alcance de la invención dosis intermedias de las escalas anteriores. Tales dosis se pueden administrar a los sujetos diariamente, en días alternos, semanalmente, mensualmente, cada dos meses, cada tres meses, o de acuerdo con cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar abarca la administración en múltiples dosis durante un periodo prolongado, por ejemplo de por lo menos seis meses. Regímenes de tratamiento ejemplares adicionales abarcan la administración una vez cada dos semanas, o una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses. Programas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado entra dentro de las escalas indicadas.

El anticuerpo se administra usualmente en múltiples ocasiones.

Los intervalos entre las dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares según indique la medición de los niveles sanguíneos del anticuerpo para el polipéptido ORF1358 de Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus sp. constellatus, Streptococcus anginosus, o Streptococcus constellatus sp. pharyngis en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para obtener una concentración plasmática de anticuerpo de 1-1000 pg/ml, y en algunos métodos 25-300 g/ml. Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar como una forma farmacéutica de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una vida media más larga, seguidos por los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos.

La dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un coctel de los mismos se administran a un paciente que todavía no presenta la enfermedad para reforzar la resistencia del paciente. Tal cantidad se define como una "dosis profiláctica efectiva". En este uso, las cantidades precisas nuevamente dependen del estado de salud e inmunidad general del paciente, pero varían en general de 0.1 mg a 25 mg por dosis, en especial de 0.5 mg a 2.5 mg por dosis. Una dosis relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo prolongado.

En aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosis relativamente alta (por ejemplo, aproximadamente de 1 mg a 200 mg de anticuerpo por dosis, siendo más comunes las dosis de 5 mg a 25 mg), a intervalos relativamente cortos y hasta reducir o terminar el avance de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestre alivio parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente se le puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Las dosis de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos varían de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, o 30 pg a 300 pg de ADN por paciente. Las dosis de vectores virales infecciosos varían de 10 a 100 viriones o más por dosis.

Los reactivos inmunológicos terapéuticos se pueden administrar por vía parenteral, tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las vías de administración más típicas de un agente inmunogénico son la infusión intravenosa o la administración subcutánea, aunque otras vías pueden ser igualmente eficaces. La siguiente vía más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza más típicamente en los músculos del brazo o pierna. En algunos métodos los reactivos inmunológicos se inyectan directamente en un tejido particular en donde se acumulan depósitos, por ejemplo inyección intracraneal. Para la administración del anticuerpo se prefiere la inyección intramuscular o la infusión intravenosa. En algunos métodos los anticuerpos se administran como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo microinfusor (por ejemplo, el dispositivo Medipad™; véase Meehan er a/., Journal of Controlled Reléase, 46:107-1 19, 1997).

Como se menciona arriba, las respuestas inmunes contra la infección estreptocócica beta-hemolítica se pueden formar in vivo (o ex vivo) mediante la administración de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y sus cadenas componentes usadas para inmunización pasiva. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de ácido nucleico que codifica un reactivo inmunológico típicamente se enlaza con elementos reguladores, tales como un promotor y un potenciador, que permiten la expresión del segmento de ADN en las células objetivo de un paciente. Para su expresión en células sanguíneas, como es deseable para inducir una respuesta inmune, los elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada o el promotor y potenciador temprano intermedio mayor de CMV son adecuados para dirigir la expresión. Los elementos reguladores enlazados y las secuencias codificadoras frecuentemente se clonan en un vector. Para la administración de anticuerpos de doble cadena, las dos cadenas se pueden clonar en los mismos vectores o en vectores separados.

Se tienen disponibles varios sistemas de vector viral que incluyen sistemas retrovirales (véase, por ejemplo, Lawrie y Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102 109 (1993)); vectores adenovirales (véase, por ejemplo, Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993)); vectores de virus adeno-asociados (véase, por ejemplo, Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994)), vectores virales de la familia del virus de la viruela, incluso el virus vaccinia y los virus de la viruela aviar, vectores virales del género de virus alfa tales como los derivados de los virus Sindbis y Semliki Forest (véase, por ejemplo, Dubensky et al., J. Virol. 70:508, 1996), virus de la encefalitis equina Venezolana (véase Johnston et al., patente de EE. UU. No. 5,643,576), y rabdovirus, tales como el virus de la estomatitis vesicular (véase Rose, Patente de EE. UU. No. 6,168,943) y papilomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325, 1995; Woo et al., publicación PCT No. WO 94/12629, y Xiao y Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24: 2630-2622, 1996).

El ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR, o un vector que contiene el mismo, se puede empacar en liposomas. Los lípidos adecuados y análogos relacionados se describen en Eppstein et al., Patente de EE. UU. No. 5,208,036, Felgner et al., Patente de EE. UU. No. 5,264,618, Rose, Patente de EE. UU. No. 5,279,833, y Epand et al., Patente de EE. UU. No. 5,283,185. Los vectores y el ADN que codifica un inmunógeno también pueden ser adsorbidos o asociados con vehículos de partículas, ejemplos de los cuales incluyen polímeros de polimetacrilato de metilo y poliláctidos y poli(lactido-co-glicólidos), véase, por ejemplo, McGee et al., J. Microencapsul. 14(2):197-210, 1997.

Los vectores de polinucleótido o polinucleótidos desnudos (por ejemplo, ADN) pueden ser suministrados in vivo mediante la administración a un paciente individual, típicamente por administración sistémica (por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica o infusión intracraneal), o aplicación tópica (véase, por ejemplo, Anderson et al., Patente de EE. UU. No. 5,399,346). El término "polinucleótido desnudo" se refiere a un polinucleótido que no se administra junto con un agente facilitador de transfección. Los polinucleótidos desnudos algunas veces se clonan en un vector plasmídico. Los vectores plasmídicos pueden incluir también agentes facilitadores de transfección tales como bupivacaína (Weiner et al., Patente de EE. UU. No. 5,593,972). El ADN también se puede administrar usando una pistola de genes; véase Xiao y Brandsma, supra. El ADN que codifica un anticuerpo (o fragmento que comprende una CDR) se precipita sobre la superficie de cuentas metálicas microscópicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o gas helio en expansión y penetran los tejidos a una profundidad de varias capas de células. Por ejemplo, el dispositivo de suministro de genes ACCEL™, esto es, una pistola de ADN fabricada por Agricetus, Inc. Middleton Wl, es adecuado para la práctica de esta invención. Alternativamente, el ADN desnudo puede pasar a través de la piel hacia la corriente sanguínea simplemente aplicando el ADN sobre la piel con irritación química o mecánica (véase Howell et al., publicación PCT No. WO 95/05853).

En otra modalidad, vectores que codifican reactivos inmunológicos pueden ser suministrados ex vivo a las células, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, bíopsia de tejido), o células madre hematopoyéticas de donador universal, seguido por reimplantación de las células en el paciente, usualmente después seleccionar las células que tienen incorporado el vector.

Opcionalmente, los reactivos inmunológicos de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes que son por lo menos parcialmente efectivos en el tratamiento de la enfermedad estreptocócíca beta-hemolítica. Los reactivos inmunológicos de la invención también se pueden administrar en combinación con otros agentes que mejoran el acceso del reactivo inmunológico terapéutico a una célula o tejido objetivo, por ejemplo llposomas y similares. La coadministración de dichos agentes puede disminuir la dosis de un reactivo Inmunológico terapéutico (por ejemplo, anticuerpo o cadena de anticuerpo terapéutico) necesaria para lograr un efecto deseado.

Los reactivos inmunológicos de la invención frecuentemente se administran como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, esto es, y una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables; véase "Remington's Pharmaceutical Science" (15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica que se desean. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluentes inocuos farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración en animales o humanos. El diluente se selecciona a fin de no alterar la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluentes son agua destilada, solución salina fisiológica amortiguadora de fosfatos, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes, estabilizadores inocuos no terapéuticos, no inmunogénicos, etcétera.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes que son metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos como quitosán, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como látex funcionalizado Sepharose™, agarosa, celulosa, etcétera), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y agregados lipidíeos (tales como gotítas de aceite o liposomas). Adicíonalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (esto es, adyuvantes).

Para administración parenteral, los reactivos inmunológicos de la invención se pueden administrar como dosis inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluente fisiológicamente aceptable, con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol, o etanol. Adicíonalmente pueden estar presentes en las composiciones sustancias auxiliares tales como agentes de mojado o emulsionantes, agentes tensoactivos, sustancias amortiguadoras del pH, etcétera. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son de origen de petróleo, animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son los vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o un preparado de implante, que se pueden formular de tal manera que permitan la liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición ejemplar comprende un anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml, formulado en un amortiguador acuoso que consiste en 50 mM de L-histidina, 150 mM de NaCI, ajustado a pH 6.0 con HCI.

Típicamente, las composiciones se preparan como composiciones inyectables en forma de soluciones liquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de inyectarse. El preparado también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o microparticulas tales como poliláctido, poliglicólido o copolímero para realzar el efecto adyuvante, como se menciona arriba (véase Langer, Science 249: 1527 (1990), y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Los reactivos inmunológicos de esta invención se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o preparado de implante, que se pueden formar de modo que permitan la liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.

Composiciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen composiciones intranasales y pulmonares, supositorios y composiciones transdérmicas. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar de mezclas que contienen el ingrediente activo en una escala de 0.5% a 10%, de preferencia de 1 % a 2%. Las composiciones orales incluyen excipientes tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones se presentan en forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formas farmacéuticas de liberación sostenida o polvos, que contienen de 10% a 95% del ingrediente activo, preferiblemente de 25% a 70%.

Alternativamente se puede usar suministro transdérmico por medio de un parche para la piel o mediante transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521 , 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201 -215, 1998).

La invención también provee métodos de monitoreo del tratamiento en un paciente que padece o es susceptible de padecer una infección estreptocócica beta-hemolítica, esto es, para monitorear el tratamiento administrado a un paciente. Los métodos se pueden usar para monitorear tanto el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos como el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos. En particular, los métodos son útiles para monitorear la inmunización pasiva (por ejemplo, midiendo el nivel del anticuerpo administrado).

Algunos métodos abarcan determinar un valor de referencia, por ejemplo un nivel o perfil de anticuerpo en un paciente, antes de administrar una dosis del reactivo inmunológico, y comparar este valor con el valor del perfil o nivel después del tratamiento. Un aumento significativo del valor del nivel o perfil (esto es, mayor que el margen típico del error experimental en mediciones repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación estándar de la media de dichas mediciones), indica un resultado positivo del tratamiento (esto es, que la administración del reactivo inmunológico ha logrado una respuesta deseada). Si el valor de la respuesta inmune no cambia significativamente, o disminuye, esto indica un resultado negativo del tratamiento. Si el tratamiento es inmunoterapia pasiva, es de esperar que el nivel de anticuerpo disminuya con el tiempo con una vida media característica.

Normalmente la muestra de tejido para el análisis es sangre, plasma, suero, fluido mucoso o fluido cerebroespinal del paciente. La muestra se analiza, por ejemplo, para determinar los niveles o títulos de anticuerpos para la PPI estreptococia. Los métodos de ELISA para detectar anticuerpos específicos para la PPI estreptocócica se describen en la sección de ejemplos. En algunos métodos, el nivel o título de un anticuerpo administrado se determina usando una prueba de eliminación, por ejemplo en una prueba de fagocitosis in vitro (véase por ejemplo Jansen et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 8(2): 245-250, 2001).

El perfil de anticuerpo después de una inmunización pasiva normalmente muestra un pico inmediato de la concentración de anticuerpo, seguido por un descenso exponencial. Sin más dosis, el descenso se aproxima a los niveles previos al tratamiento en un periodo de días a meses, dependiendo de la vida media del anticuerpo administrado.

En algunos métodos se hace una medición de línea basal del anticuerpo para la PPI estreptocócica en el paciente antes de la administración; se hace una segunda medición brevemente después para determinar el nivel pico del anticuerpo, y se hacen una o más mediciones adicionales a intervalos para monitorear el descenso de los niveles de anticuerpo. Cuando el nivel del anticuerpo ha disminuido hasta la línea basal o a un porcentaje predeterminado del pico menos la línea basal (por ejemplo, 50%, 25% o 10%), se administra una dosis más de anticuerpo. En algunos métodos, el nivel pico o los niveles subsiguientes medidos menos el valor de fondo se comparan con valores de referencia determinados previamente para constituir un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico beneficioso en otros pacientes. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que un valor de referencia (por ejemplo, menor que la media menos una desviación estándar del valor de referencia en una población de pacientes que se benefician del tratamiento), está indicada la administración de una dosis adicional de anticuerpo.

Métodos adicionales incluyen monitorear durante el tratamiento cualquier síntoma fisiológico reconocido usado rutinariamente por los investigadores o médicos para diagnosticar o monitorear infecciones estreptocócicas o enfermedades asociadas. Por ejemplo, se pueden monitorear los síntomas de celulitis, erisipelas, impétigo," fascitis necrosante, dolor de garganta, enrojecimiento de la garganta, escalofríos, fiebre, cefalea, náusea, vómito, taquicardia, malestar, amigdalitis, agrandamiento de los ganglios linfáticos y/o salpullido.

La especificación se entenderá más completamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la especificación, todas las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Las modalidades dentro de la especificación ilustran las modalidades de la invención y no se deben considerar limitativas del alcance de la invención. Los expertos en la materia reconocerán que la invención reclamada abarca muchas otras modalidades, y que la especificación y los ejemplos son únicamente ejemplares, ya que el verdadero alcance y espíritu de la invención son indicados por las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación del ORF13S8 en cepas estreptocócicas Se han identificado las secuencias de ADN y proteína de antígenos estreptocócicos candidatos en muchos genomas estreptocócicos. Sin embargo, existe información de secuencia limitada sobre los genomas estreptocócicos de los grupos C y G. Actualmente el Sanger Centre determina la secuencia de dos genomas estreptocócicos de origen animal (grupo C), Streptococcus equi y Streptococcus zooepidemicus. La minería de datos de los genomas parcialmente terminados usando iniciadores degenerados produjo las secuencias de ADN del ORF1358.

Se diseñaron sondas de oligonucleótidos degenerados para identificar el ORF1358 en Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis, cepa ATCC12394 y cepa ATCC35666; Streptococcus intermedius, cepa ATCC27335; Streptococcus constellatus sp. constellatus cepa ATCC27823; Streptococcus anginosus, cepa ATCC33397; y Streptococcus constellatus sp. pharyngis, cepa NTCT13122.

Todas las secuencias conocidas que contienen el ORF1358 se alinearon usando AlignX (Vector NTI), se usaron y las regiones de homología para la construcción del iniciador degenerado. Los iniciadores se diseñaron con mínima degeneración pero manteniendo una temperatura de fusión alta y un potencial de autodímerización bajo. Las secuencias de nucleótidos de los iniciadores se exponen en las SEQ ID NOs: 14 a 21.

Los iniciadores se analizaron usando el sitio web de Integrated DNA Technologies (Coraville, IA). Se hicieron estudios de amplificación iniciales usando preparados de ADN genómico hechos para un aislado del estreptococo C ATCC12394 (Streptococcus dysgalactiae sp. equisimilis). Se obtuvieron secuencias de gen parciales para el extremo 5' y 3' del ORF1358. Entonces se diseñaron iniciadores directos e inversos basándose en estas secuencias, y subsiguientemente se usaron para amplificar aproximadamente 700-900 p.b. de secuencia del ORF1358 de diferentes cepas G y C. Los iniciadores basados en ATCC12394 se exponen en las SEQ ID NOs: 20 y 21.

Usando métodos conocidos para los expertos en la materia, se preparó ADN genómico de cada cepa arriba mencionada, y los fragmentos de polinucleótido que corresponden al ORF1358 se amplificaron usando los iniciadores expuestos en las SEQ ID NOs: 14-21. Las secuencias de nucleótidos obtenidas del ORF1358 se exponen en las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 25, 27, 29 y 31.

La traducción de estos polinucleótidos resultó en las secuencias de aminoácidos del ORF1358 de estas cepas de estreptococos. Las secuencias de polinucleótido se exponen en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 y 32.

Las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 se alinearon usando Clustal W, y se generó una secuencia de consenso que se expone en la SEQ ID NO: 13.

El cuadro 1A representa las distancias de pares obtenidas usando ClustalW (lento/exacto, Gonnet) o porcentajes de identidad obtenidos después de alinear las secuencias de aminoácidos de ORF1358 expuestas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, con las secuencias de aminoácidos de ORF1358 expuestas en las SEQ ID NOs: 22, 23 y 24: CUADRO 1A Porcentajes de identidad estreptocócicos El cuadro 1 B representa las distancias de pares o el porcentaje de identidad obtenidos usando BLAST después de alinear las secuencias de aminoácidos de ORF1358 expuestas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 y 32, con las secuencias de aminoácidos de ORF1358 expuestas en las SEQ ID NOs: 22 y 23: CUADRO 1B Porcentajes de identidad estreptocócicos EJEMPLO 2 Anticuerpos para los epítopes del ORF1358 de estreptococos del grupo C/G La unión de los anticuerpos a las bacterias, un proceso conocido como opsonización, puede llevar a la captación y muerte de las bacterias por células fagocíticas. Tales anticuerpos, derivados de fuentes en masa de humano o animal, o de fuentes monoclonales humanas o murinas o quiméricas, usados solos o combinados, se pueden usar en situaciones profilácticas o terapéuticas en donde pudiera estar presente BHS en la corriente sanguínea, tal como en la sepsis neonatal o la sepsis posterior a cirugía o fuga de un absceso.

Los anticuerpos se desarrollaron en ratones contra polipéptidos recombinantes de unión de zinc de estafilococos del grupo C/G, codificados por el ORF1358. Durante el proceso del examen, el antisuero antiestreptococo beta-hemolítico y anticuerpos monoclonales contra varias cepas de estreptococos beta-hemolíticos (BHS), se notó que algo de antisuero y anticuerpos fueron cruzadamente reactivos contra muchas cepas de BHS, incluso miembros de Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) y estreptococos del grupo C y grupo G (que incluyen las especies Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, Streptococcus dysgalactiae sp. Equisimilis y Streptococcus dysgalactiae sp. Dysgalactiae) (véase el cuadro 1). El examen de los anticuerpos se hizo usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Brevemente, estreptococos muertos con calor se incubaron con un anticuerpo anti-ORF1358 de estreptococo del grupo C y grupo G de ratón sobre hielo durante 45 minutos, seguido por dos lavados con FBS 10% /PBS. Luego, los estreptococos se incubaron con un anticuerpo anti-Alexa-488 de ratón de cabra (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 30 minutos sobre hielo, seguido por dos lavados con FBS 10% /PBS. Después, las células se resuspendieron en FBS 10% /PBS y se corrieron en una máquina de FACS (por ejemplo, véase DeMaster ef al., Infecí Immun., 70(1): 350-359, 2002). Esta reactividad cruzada también significa que el ORF1358 del grupo C o grupo G o el polipéptido codificado por el mismo se puede usar en una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune efectiva para proteger contra la infección por estreptococos del grupo A o grupo B, y también por estreptococos del grupo C o el grupo G.

El cuadro 2 representa la reactividad cruzada del antisuero y los anticuerpos para el polipéptido estreptocócico del grupo C/G codificado por el ORF1358. De acuerdo con el cuadro 2, el símbolo "+" significa que la señal obtenida del anticuerpo específico para el antígeno es por lo menos tres veces más alta que el valor de fondo; el símbolo "+/-" significa que la señal obtenida del anticuerpo específico para el antigeno es entre dos veces y tres veces más alta que el valor de fondo; y el símbolo "-" significa que la señal obtenida del anticuerpo específico para el antígeno es menor o igual que el valor de fondo.

CUADRO 2 Reactividad cruzada del anticuerpo Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 1165 Streptococcus pyogenes + GAR 1 199 Streptococcus pyogenes + GAR 1251 Streptococcus pyogenes + GAR 1278 Streptococcus pyogenes + GAR 1362 Streptococcus pyogenes + GAR 1439 Streptococcus pyogenes + GAR 1530 Streptococcus pyogenes + GAR 1566 Streptococcus pyogenes + GAR 1672 Streptococcus pyogenes + GAR 1839 Streptococcus pyogenes + GAR 1923 Streptococcus pyogenes + GAR 2107 Streptococcus pyogenes + GAR 2330 Streptococcus pyogenes + GAR 2646 Streptococcus pyogenes + GAR 2650 Streptococcus pyogenes + GAR 2869 Streptococcus pyogenes + GAR 3104 Streptococcus pyogenes + GAR 3549 Streptococcus pyogenes + GAR 3784 Streptococcus pyogenes + GAR 4029 Streptococcus pyogenes + GAR 4030 Streptococcus pyogenes + GAR 4230 Streptococcus pyogenes + GAR 4773 Streptococcus pyogenes + GAR 4983 Streptococcus pyogenes + GAR 4987 Streptococcus pyogenes + GAR 5861 Streptococcus pyogenes + CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 5991 Streptococcus pyogenes + GAR 6084 Streptococcus pyogenes + GAR 7055 Streptococcus pyogenes + GS 20 Streptococcus pyogenes + GS 21 Streptococcus pyogenes + GS 22 Streptococcus pyogenes + GS 23 Streptococcus pyogenes + GS 24 Streptococcus pyogenes + GS 25 Streptococcus pyogenes + GS 26 Streptococcus pyogenes + GS 27 Streptococcus pyogenes + GS 28 Streptococcus pyogenes + GS 29 Streptococcus pyogenes + GS 30 Streptococcus pyogenes + GS 31 Streptococcus pyogenes +/- GS 32 Streptococcus pyogenes + GS 33 Streptococcus pyogenes + GS 34 Streptococcus pyogenes + GS 35 Streptococcus pyogenes + GS 36 Streptococcus pyogenes +/- GS 37 Streptococcus pyogenes + GS 38 Streptococcus pyogenes + GS 39 Streptococcus pyogenes + GS 40 Streptococcus pyogenes + GS 41 Streptococcus pyogenes + GS 42 Streptococcus pyogenes +/- GS 43 Streptococcus pyogenes + CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GS 44 Streptococcus pyogenes + GS 45 Streptococcus pyogenes + GS 46 Streptococcus pyogenes + GS 47 Streptococcus pyogenes +/- GS 48 Streptococcus pyogenes +/- GS 49 Streptococcus pyogenes + GS 50 Streptococcus pyogenes + GS 51 Streptococcus pyogenes + GS 52 Streptococcus pyogenes + GS 53 Streptococcus pyogenes + GS 54 Streptococcus pyogenes +/- GS 55 Streptococcus pyogenes + GS 56 Streptococcus pyogenes + GS 57 Streptococcus pyogenes + GS 58 Streptococcus pyogenes + GS 59 Streptococcus pyogenes + GS 60 Streptococcus pyogenes + GS 61 Streptococcus pyogenes + GS 62 Streptococcus pyogenes + GS 63 Streptococcus pyogenes + GS 64 Streptococcus pyogenes + GS 65 Streptococcus pyogenes + GS 66 Streptococcus pyogenes + GAR 1 Streptococcus agalactiae + GAR 1012 Streptococcus agalactiae - GAR 1023 Streptococcus agalactiae - GAR 1049 Streptococcus agalactiae - CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 10895 Streptococcus agalactiae - GAR 1 192 Streptococcus agalactiae +/- GAR 127 Streptococcus agalactiae - GAR 12790 Streptococcus agalactiae - GAR 1305 Streptococcus agalactiae - GAR 131 Streptococcus agalactiae - GAR 1355 Streptococcus agalactiae - GAR 1446 Streptococcus agalactiae - GAR 1494 Streptococcus agalactiae - GAR 154 Streptococcus agalactiae + GAR 176 Streptococcus agalactiae - GAR 18 Streptococcus agalactiae + GAR 1844 Streptococcus agalactiae - GAR 1931 Streptococcus agalactiae - GAR 2369 Streptococcus agalactiae +/- GAR 252 Streptococcus agalactiae - GAR 2533 Streptococcus agalactiae - GAR 2682 Streptococcus agalactiae - GAR 2717 Streptococcus agalactiae - GAR 2723 Streptococcus agalactiae - GAR 2724 Streptococcus agalactiae - GAR 2842 Streptococcus agalactiae - GAR 287 Streptococcus agalactiae - GAR 3003 Streptococcus agalactiae - GAR 3751 Streptococcus agalactiae - GAR 381 Streptococcus agalactiae - GAR 3830 Streptococcus agalactiae - CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 4131 Streptococcus agalactiae - GAR 4293 Streptococcus agalactiae +/- GAR 4398 Streptococcus agalactiae - GAR 462 Streptococcus agalactiae - GAR 4837 Streptococcus agalactiae - GAR 54 Streptococcus agalactiae - GAR 562 Streptococcus agalactiae + GAR 6016 Streptococcus agalactiae + GAR 614 Streptococcus agalactiae +/- GAR 63 Streptococcus agalactiae + GAR 6332 Streptococcus agalactiae + GAR 6387 Streptococcus agalactiae +/- GAR 6505 Streptococcus agalactiae +/- GAR 67 Streptococcus agalactiae - GAR 864 Streptococcus agalactiae +/- GAR 967 Streptococcus agalactiae - GS19 GGS +/- GS27 GGS +/- ATCC 33397 Streptococcus anginosus +/- ATCC 33397 Streptococcus anginosus - GAR 10823 Streptococcus anginosus +/- GAR 1272 Streptococcus anginosus - GAR 1370 Streptococcus anginosus - GAR 1425 Streptococcus anginosus +/- GAR 592 Streptococcus anginosus - GAR 1595 Streptococcus anginosus - GAR 2044 Streptococcus anginosus - CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 2523 Streptococcus anginosus - GAR 2565 Streptococcus anginosus - GAR 2697 Streptococcus anginosus +/- GAR 2822 Streptococcus anginosus - GAR 3091 Streptococcus anginosus - GAR 3560 Streptococcus anginosus + GAR 3576 Streptococcus anginosus +1- GAR 3858 Streptococcus anginosus +/- GAR 3938 Streptococcus anginosus - GAR 4133 Streptococcus anginosus +/- GAR 4158 Streptococcus anginosus + GAR 4234 Streptococcus anginosus + GAR 4426 Streptococcus anginosus + GAR 4680 Streptococcus anginosus + GAR 4834 Streptococcus anginosus +/- GAR 4896 Streptococcus anginosus + GAR 5093 Streptococcus anginosus + GAR 5094 Streptococcus anginosus + GAR 5675 Streptococcus anginosus - GAR 5776 Streptococcus anginosus + GAR 5831 Streptococcus anginosus +/- GAR 6187 Streptococcus anginosus +/- GAR 6590 Streptococcus anginosus +/- GAR 7000 Streptococcus anginosus +/- GAR 7023 Streptococcus anginosus - GAR 7190 Streptococcus anginosus - GAR 7214 Streptococcus anginosus +/- CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 7468 Streptococcus anginosus - GAR 7818 Streptococcus anginosus + GAR 8620 Streptococcus anginosus + GAR 8693 Streptococcus anginosus - GAR 8722 Streptococcus anginosus +/- .

GAR 8736 Streptococcus anginosus - GAR 8954 Streptococcus anginosus +1- ATCC 27823 Streptococcus constellatus - GAR 1235 Streptococcus constellatus - GAR 1384 Streptococcus constellatus +/- GAR 181 1 Streptococcus constellatus + GAR 2421 Streptococcus constellatus +/- GAR 3145 Streptococcus constellatus - GAR 3355 Streptococcus constellatus - GAR 4048 Streptococcus constellatus +/- GAR 4083 Streptococcus constellatus + GAR 4861 Streptococcus constellatus + GAR 4870 Streptococcus constellatus 4 GAR 5757 Streptococcus constellatus +/- GAR 6129 Streptococcus constellatus +/- GAR 61 7 Streptococcus constellatus - GAR 6258 Streptococcus constellatus + GAR 7224 Streptococcus constellatus + GAR 7369 Streptococcus constellatus + ATCC 12394 Streptococcus dysgalactiae +/- ATCC 12394 Streptococcus dysgalactiae + ATCC 40378 Streptococcus dysgalactiae - CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GAR 3868 Streptococcus dysgalactiae +/- GAR 4272 Streptococcus dysgalactiae + ATCC 35666 Streptococcus dysgalactiae + BAA-338 Streptococcus dysgalactiae sp. +/- Equisimilis GAR 3015 Streptococcus equisimilis + ATCC 27335 Streptococcus intermedius + ATCC 27335 Streptococcus intermedius + GAR 2407 Streptococcus intermedius - GS28 unk + GS67 GGS/GCS + GS68 GGS/GCS +/- GS69 GGS/GCS - GS70 GGS/GCS +/- GS71 GGS/GCS + GS72 GGS/GCS + GS73 GGS/GCS - GS74 GGS/GCS - GS75 GGS/GCS +/- GS77 GGS/GCS + GS78 GGS/GCS + GS79 GGS/GCS +/- GS80 GGS/GCS - GS81 GGS/GCS +/- GS82 GGS/GCS +/- GS83 GGS/GCS + GS84 GGS/GCS - CUADRO 2 (Continuación) Cepa Especie Reactividad a anti- ORF1358 GS85 GGS/GCS - GS86 GGS/GCS +/- GS88 GGS/GCS + GS89 GGS/GCS +/- GS90 GGS/GCS +/- GS91 GGS/GCS +/- GS92 GGS/GCS + GS93 GGS/GCS + GS94 GGS/GCS +

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una o más de: la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32.

2. - El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97% idéntica a una o más de: la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 32.

3. - Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 95% idéntica a una o más de: la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31.

5. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizado además porque comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 97% idéntica a una o más de: la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, o SEQ ID NO: 31.

6. - El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado además porque está enlazado operativamente con un elemento regulador.

7. - Un vector de polinucleótido que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

8. - El vector de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque es uno o más de: un plásmido, un vector viral, o un vector de expresión.

9. - Una célula que comprende un polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o un vector de polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde la célula está ex vivo.

10.- La célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, una célula de mamífero, una célula de insecto y una célula de levadura.

1 1. - Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

12. - Una composición inmunogénica que comprende un polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o un vector de polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8.

13.- El uso de la composición inmunogénica de la reivindicación 11 o 12, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune a una bacteria de estreptococo beta-hemolítico o a una infección estreptocócica beta-hemolítica en un paciente.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde la bacteria de estreptococo beta-hemolítico o la infección estreptocócica beta-hemolítica es del grupo A, grupo B, grupo C o grupo G.

15. - El uso de un polipéptido aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico de una infección estreptocócica beta-hemolítica en un paciente.

16. - El uso de un polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o un vector de polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico de una infección estreptocócica beta-hemolítica en un paciente.

17. - Un kit que comprende un polipéptido aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

18. - Un kit que comprende un polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o un vector de polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8.

19. - Un método para producir un polipéptido aislado, que comprende transformar, transfectar o infectar una célula con un plásmido que contiene un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, cultivar la célula bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido en la célula, y purificar dicho polipéptido de la célula.