MX2010012430A - Conjugados de una porcion de colinesterasa y un polimero. - Google Patents

Conjugados de una porcion de colinesterasa y un polimero.

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MX2010012430A
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Seoju Lee
Mary J Bossard
Harold Zappe
Lal A R Fernando
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Nektar Therapeutics
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Abstract

Se proporcionan conjugados de una porción de colinesterasa y uno o más polímeros no peptídicos, solubles en agua; generalmente, el polímero soluble en agua, no peptidico es poli(etilenglicol) o un derivado de este; además se proporciona, entre otras cosas, composiciones que comprenden conjugados, métodos para preparar conjugados y métodos para administrar composiciones a un paciente.

Description

CONJUGADOS DE UNA PORCIÓN DE COLINESTERASA Y UN POLÍMERO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad en virtud del articulo 1 19(e) del Título 35 del Código de los Estados Unidos de la solicitud de patente provisional estadounidense No. de serie 61/127,928, presentada el 16 de mayo de 2008, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad a la presente a modo de referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN Entre otras cosas, una o más realizaciones de la presente invención se refieren en forma general a conjugados que comprenden una porción de colinesterasa (es decir, una porción que tiene al menos alguna actividad similar a la colinesterasa humana) y un polímero. Además, la invención se refiere (entre otras cosas) a composiciones que comprenden conjugados, métodos para sintetizar conjugados y métodos para administrar una composición.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema nervioso humano controla las funciones corporales mediante la transmisión de señales eléctricas a través de células nerviosas especializadas. Sin embargo, con respecto a los espacios interneurales (o entre una célula nerviosa y una célula efectora), la continuación de la señal se logra generalmente por medios químicos. La transmisión química a través del espacio entre los nervios o "sinapsis" ocurre por medio de la liberación de una sustancia conocida como "neurotransmisor" (conocido también como "neuromediador"). Al liberarse, el neurotransmisor atraviesa la sinapsis por difusión y activa (o inhibe, en función del sistema) la célula postsináptica uniéndose a un receptor ubicado en la célula postsináptica. Una vez que la señal pasó de este modo a la célula postsináptica, las enzimas en la sinapsis degradan el neurotransmisor para impedir la transferencia repetida de señales a la célula postsináptica. De este modo, se transmiten con éxito las señales en el sistema nervioso.
Las células nerviosas que liberan acetilcolina como neurotransmisor se denominan nervios colinérgicos y están ubicadas tanto en el sistema nervioso periférico como en el sistema nervioso central en los seres humanos. La acetilcolina participa en la transmisión de señales desde los nervios motores especializados al músculo esquelético así como en buena parte del sistema nervioso autónomo, que controla los músculos lisos y las glándulas asociadas (por ejemplo) a la respiración, circulación, digestión, sudoracion y metabolismo. En el cuerpo, la acetilcolina se degrada (y por lo tanto se controlan sus efectos) por medio de la acetilcolinesterasa ubicada en la hendidura sináptica. Dada la ubicuidad del sistema acetilcolina/acetilcolinesterasa en el sistema nervioso central, el equilibrio y el funcionamiento apropiados de este sistema son cruciales para la salud y el funcionamiento normal.
El equilibrio del sistema acetilcolina/acetilcolinesterasa en el sistema nervioso central se puede trastornar a través de la exposición a un inhibidor de acetilcolinesterasa, que resulta en la acumulación de acetilcolina en la hendidura sináptica. Esta acumulación, a su vez, resulta en una propagación de señal continua (generalmente mediante despolarización persistente) y en el trastorno concomitante de la transmisión neuronal efectiva. Si se permite continuar, dicho trastorno puede provocar una gran variedad de afecciones perjudiciales y - de ser graves- hasta la muerte.
El metilfosfonofluoridato de O-isopropilo (también conocido como "sarín") y otros organofosfatos de esta clase son inhibidores irreversibles de la colinesterasa. Estos organofosfatos inhiben la actividad de la colinesterasa uniéndose covalentemente a un residuo de serina en la enzima que forma el sitio donde normalmente la acetilcolina experimenta la hidrólisis. El sarín es un inhibidor tan potente y efectivo de las enzimas de colinesterasa que se lo ha desarrollado y utilizado en el contexto militar. Otros inhibidores de colinesterasa se han utilizado como insecticidas y pesticidas en el contexto agrícola.
La exposición a los inhibidores de colinesterasa se puede remediar mediante la administración de la propia colinesterasa. Al "saturar" efectivamente el sistema biológico con colinesterasa, el funcionamiento general normal de la colinesterasa permanecería esencialmente sin afectar aunque solo parte de la actividad de la colinesterasa se inhibiera mediante un inhibidor de colinesterasa, la presencia excesiva de actividad de la colinesterasa minimizaría los efectos de la exposición al inhibidor de colinesterasa. Tal abordaje sería ventajoso para la exposición accidental a los organofosfatos así como en la defensa de un ataque militar en el cual se utilice sarín o un agente químico similar. Se está desarrollando una versión recombinante de butirilcolinesterasa (BChE) humana, una proteina que existe naturalmente, bajo el nombre de PROTEXIA® como una terapia anterior y posterior a la exposición para las victimas en el campo de batalla o víctimas civiles de ataques con agentes nerviosos.
Un problema relacionado con la administración de un exceso de moléculas que tienen actividad de colinesterasa es que estas mismas enzimas basadas en proteínas se degradan relativamente rápido in vivo. Se ha descrito la PEGilación, o la unión de un derivado de poli(etilenglicol) a una proteína, como un medio para prolongar la vida media de una proteína in vivo, lo cual resulta por lo tanto en una actividad farmacológica prolongada. Por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense No. 2004/0147002 describe el uso de colinesterasas químicamente modificadas para la desintoxicación de compuestos organofosforados.
Sin embargo, no obstante estos conjugados, existe la necesidad de otros conjugados de colinesterasa. Entre otras cosas, una o más realizaciones de la presente invención están dirigidas por lo tanto a dichos conjugados así como a composiciones que comprenden los conjugados y a métodos relacionados según se describen en la presente, que se cree que son nuevos y que no se sugieren en absoluto en la técnica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, en una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, donde el residuo de la porción de colinesterasa está unido covalentemente al polímero soluble en agua a través de un residuo de cisterna en el residuo de la porción de colinesterasa.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, donde el polímero soluble en agua, antes de unirse covalentemente, es un reactivo polimérico portador de un grupo maleimida.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente, ya sea directamente o a través de una porción espaciadora que comprende uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde la porción de colinesterasa está unida al polímero soluble en agua o a una porción espaciadora mediante un enlace disulfuro.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, donde la porción de colinesterasa es una porción de colinesterasa precursora.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, donde la porción de colinesterasa es una porción de colinesterasa madura.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un método para suministrar un conjugado, método que comprende la etapa de administrar en forma subcutánea al paciente una composición que comprende un conjugado de un residuo de una colinesterasa y un polímero soluble en agua.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra un análisis SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) de soluciones conjugadas de rBChE preparadas de conformidad con los ejemplos 4, 5 y 6 y explicadas en mayor detalle en cada uno de estos ejemplos. El carril marcado con una C es el control de la proteína rBChE (no PEGilada). La rBChE se PEGiló con diferentes reactivos PEG activados según se indica sobre los carriles. Se probaron concentraciones equivalentes a tres mol (10, 25 y 50) de PEG utilizando los métodos descritos. Para cada reactivo el reactivo PEG equivalente a 10 mol resultó en niveles bajos a medios de PEGilación, el reactivo PEG equivalente a 25 mol resultó en niveles medios a altos de PEGilación y el reactivo PEG equivalente a 50 mol resultó en niveles muy altos de PEGilación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir una o más realizaciones de la presente invención en detalle, se debe entender que esta invención no se limita a los polímeros, técnicas sintéticas, porciones de colinesterasa y similares particulares, puesto que estos pueden variar.
Cabe señalar que, según se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", y "el" y "la" incluyen sus plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asi, por ejemplo, la referencia a un "polímero" incluye un único polímero pero también dos o más del mismo o diferentes polímeros, la referencia a un "excipiente opcional" se refiere a un único excipiente opcional así como a dos o más del mismo o diferentes excipientes opcionales y similares.
Al describir y reivindicar una o más de las reivindicaciones de la presente invención, se utilizará la siguiente terminología de conformidad con las definiciones descritas a continuación.
"PEG," "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)", según se utilizan en la presente, son intercambiables y abarcan cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua, no peptidico. Generalmente, los PEG para utilizar de conformidad con la invención comprenden la siguiente estructura "-(OCH2CH2)n-" donde (n) es de 2 a 4.000. Según se utiliza en la presente, PEG también incluye "-CH2CH2-0(CH2CH20)n-CH2CH2-" y "-(OCH2CH2)nO-," en función de si los oxígenos terminales han sido desplazados o no, por ejemplo, durante una transformación sintética. En toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se debe recordar que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos terminales o "de recubrimiento" y asi sucesivamente. El término "PEG" significa además un polímero que contiene una mayoría, es decir, más de un 50% de subunidades -OCH2CH2 que se repiten. Con respecto a las formas específicas, el PEG puede tener cualquier cantidad de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías, por ejemplo "ramificada", "lineal", "en forma de horquilla", "multifuncional" y similares, que se describirán con mayor detalle a continuación.
Los términos "de recubrimiento" y "extremo terminal" se utilizan de modo intercambiable en la presente para referirse a un terminal o un extremo de un polímero que tiene una porción de terminación en el extremo. Generalmente, aunque no necesariamente, la porción de terminación comprende un grupo hidroxi o alcoxiC^o, más preferentemente un grupo alcoxiC -10, y más preferentemente aún un grupo alcoxiCi.5. De esta forma, los ejemplos de porciones de terminación incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi y benciloxi), así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y similares. Se debe recordar que la porción de terminación puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero [por ejemplo, la porción de terminación "metoxi" en CH30(CH2CH20)n- y CH3(OCH2CH2)n-]. Además, se incluyen las formas saturadas, insaturadas, sustituidas y no sustituidas de cada uno de los presentes. Además, el grupo de extremo terminal también puede ser un silano. El grupo terminal también puede comprender ventajosamente una marca detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de extremo terminal que comprende una marca detectable, se puede determinar la cantidad o ubicación del polímero y/o de la porción (por ejemplo, agente activo) a la cual se acopla el polímero, utilizando un detector apropiado. Dichas marcas incluyen, aunque no taxativamente, fluorescedores, quimioluminicentes, porciones utilizadas en marcación de enzimas, colorimétricos (por ejemplo, tintes), iones metálicos, porciones radioactivas y similares. Los detectores apropiados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros, y similares. El grupo de extremo terminal también puede comprender ventajosamente un fosfolipido. Cuando el polímero tiene un grupo de extremo terminal que comprende un fosfolipido, se imparten propiedades únicas al polímero y al conjugado resultante. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen, aunque no taxativamente, aquellos seleccionados de la clase de fosfolípidos llamados fosfatídilcolinas. Los fosfolípidos específicos incluyen, aunque no taxativamente, aquellos seleccionados del grupo conformado por dilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidílcolina, disteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina y lecitina.
"Que no existe naturalmente" en referencia a un polímero descrito en la presente, significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, un polímero que no existe naturalmente puede contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros que existen naturalmente, siempre que la estructura general del polímero no se encuentre en la naturaleza.
El término polímero "soluble en agua" como en un "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Generalmente, un polímero soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente un 75%, más preferentemente al menos aproximadamente un 95%, de luz transmitida por la misma solución después del filtrado. En una base en peso, un polímero soluble en agua será preferentemente al menos aproximadamente un 35% (en peso) soluble en agua, más preferentemente al menos aproximadamente un 50% (en peso) soluble en agua, más preferentemente aún aproximadamente un 70% (en peso) soluble en agua, e incluso más preferentemente aproximadamente un 85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, lo más preferido es que el polímero soluble en agua sea aproximadamente soluble en agua en un 95% (en peso) o completamente soluble en agua.
El peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua, como el PEG, se puede expresar ya sea como un peso molecular medio en número o un peso molecular medio en peso. A menos que se indique lo contrario, todas las referencias al peso molecular en la presente se refieren al peso molecular medio en peso. Ambas determinaciones del peso molecular, promedio numérico y promedio de peso, se pueden medir utilizando cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida. Se pueden utilizar también otros métodos para medir los valores del peso molecular, como el uso del análisis del grupo terminal o la medición de propiedades coligativas (por ejemplo, depresión del punto de congelación, elevación del punto de ebullición o presión osmótica) para determinar el peso molecular medio en número o se pueden utilizar técnicas de dispersión de la luz, ultracentrifugado o viscometría para determinar el peso molecular medio en peso. Los polímeros de la invención generalmente son polidispersos (es decir, el peso molecular medio en número y el peso molecular medio en peso de los polímeros no son iguales), poseen valores de polidispersidad bajos preferentemente de menos de aproximadamente 1 .2, más preferentemente de menos de aproximadamente 1.15, más preferentemente aún de menos de aproximadamente 1.10, incluso más preferentemente de menos de aproximadamente 1.05 y más preferentemente aún de menos de aproximadamente 1.03.
Los términos "activo", "reactivo" o "activado", cuando se utilizan junto con un grupo funcional particular, se refieren a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto es en contraste con los grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción altamente imprácticas a los efectos de reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
Según se utiliza en la presente, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo abarca las formas protegidas de este, asi como también las formas no protegidas.
Los términos "porción espadadora" o "enlace" o "enlazador" se utilizan en la presente para referirse a una unión o un átomo o un conjunto de átomos utilizado opcionalmente para unir porciones interconectadas como un terminal de un segmento polímero y una porción de colinesterasa o un electrófilo o nucleófilo de una porción de colinesterasa. La porción espadadora puede ser hidrolíticamente estable o puede incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. A menos que el contexto indique claramente lo contrario, una porción espaciadora existe opcionalmente entre dos elementos cualesquiera de un compuesto (por ejemplo, los conjugados proporcionados que comprenden un residuo de una porción de colinesterasa y un polímero soluble en agua se pueden unir directa o indirectamente a través de una porción espaciadora).
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que generalmente tiene entre aproximadamente 1 y 15 átomos de largo. Dichas cadenas de hidrocarburo son preferentemente, aunque no necesariamente, saturadas y pueden ser cadenas ramificadas o lineales, aunque generalmente se prefieren las cadenas lineales. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo y similares. Como se utiliza en la presente, "alquilo" incluye cicloalquilo así como alquilo que contiene cicloalquileno.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y puede ser una cadena lineal o ramificada, como lo ejemplifican el metilo, etilo, n-butilo, /-butilo y f-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclica saturada o insaturada, que incluye los compuestos en puente, fusionados o espiro cíclicos, compuesta preferentemente de entre 3 y 12 átomos de carbono aproximadamente, y más preferentemente de entre 3 y 8 átomos de carbono aproximadamente. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que se inserta en una cadena alquilo uniéndose a la cadena en dos carbonos cualesquiera en el sistema de anillo cíclico.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -OR, donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferentemente alquiloCi-6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, etc.).
El término "sustituido" como, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a una porción (por ejemplo un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes no interferentes como, aunque no taxativamente: alquilo, cicloalquiloC3-C8, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, y similares; halo, por ejemplo; fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido; y similares. "Arilo sustituido" es un arilo que tiene como sustituyente uno o más grupos no interferentes. Para las sustituciones en un anillo de fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para).
"Sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, generalmente no reaccionan con otros grupos funcionales contenidos en la molécula.
"Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono. Arilo incluye múltiples anillos arilo que pueden estar fusionados, como en naftilo o no fusionados, como en bifenilo. Los anillos arilo también se pueden fusionar o no con uno o más anillos de hidrocarburo cíclico, heteroarilo o heterociclicos. Según se utiliza en la presente, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferentemente azufre, oxigeno o nitrógeno, o una combinación de estos. Los anillos heteroarilo también se pueden fusionar con uno o más anillos de hidrocarburo cíclico, heterocíclico, arilo o heteroarilo. "Heterociclo" o "heterociclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferentemente 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y que tienen al menos un átomo en el anillo que no es un carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxigeno y nitrógeno.
"Heteroarilo sustituido" es un heteroarilo que tiene como sustituyentes uno o más grupos no interferentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes no interferentes.
Un "radical orgánico" según se utiliza en la presente incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
"Electrófilo" y "grupo electrófilo" se refieren a un ión o átomo o conjunto de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrofílico, es decir, un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo" y "grupo nucleofilico" se refieren a un ión o átomo o conjunto de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro nucleofilico, es decir, un centro que busca un centro electrofílico o con un electrófilo.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace que reacciona con agua (es decir, es hidrolizado) en condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no solo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales sino también de los sustituyentes adheridos a estos átomos centrales. Los enlaces hidrolíticamente inestables o débiles apropiados, incluyen, aunque no taxativamente, éster carboxilato, éster fosfato, anhídridos, acétales, cetales, aciloxialquil éter, ¡minas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos.
Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que está sujeto a la degradación por una o más enzimas.
Un enlace o unión "hidroliticamente estable" se refiere a una unión química, generalmente una unión covalente, que es esencialmente estable en agua, es decir que, hasta donde se puede apreciar, no atraviesa una hidrólisis en condiciones fisiológicas, durante un extenso periodo de tiempo. Los ejemplos de enlaces hidroliticamente estables incluyen, aunque no taxativamente, los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos y similares. Generalmente, un enlace hidroliticamente estable es aquel que exhibe una velocidad de hidrólisis menor a aproximadamente un 1 -2% por día, en condiciones fisiológicas. Las velocidades de hidrólisis de enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de los textos de química estándares.
"Excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. "Cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad fisiológicamente efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" se utilizan en la presente de modo intercambiable para referirse a la cantidad de un conjugado de porción de polimero-(colinesterasa) necesaria para proporcionar un nivel deseado del conjugado (o de la porción de colinesterasa no conjugada correspondiente) en el torrente sanguíneo o en el tejido al que se apunta. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, la porción particular de colinesterasa, los componentes y características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes a la que se dirige, las consideraciones individuales del paciente y similares, y los entendidos en la técnica la pueden determinar fácilmente, basándose en la información que se proporciona en la presente.
"Multifuncional" significa un polímero que tiene tres o más grupos funcionales contenidos en el mismo, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multifuncionales de la invención contendrán generalmente de aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o de 3-50 grupos funcionales, o de 3-25 grupos funcionales, o de 3- 5 grupos funcionales, o de 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales en el esqueleto del polímero.
El término "porción de colinesterasa", según se utiliza en la presente, se refiere a una porción que tiene actividad de colinesterasa humana. La porción de colinesterasa también tendrá al menos un grupo electrofílico o un grupo nucleofílico apropiado para reaccionar con un reactivo polimérico. Además, el término "porción de colinesterasa" abarca tanto la porción de colinesterasa antes de la conjugación como el residuo de porción de colinesterasa después de la conjugación. Como se explicará en mayor detalle a continuación, un entendido en la técnica podrá determinar si cualquier porción dada tiene actividad de colinesterasa. Las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácido correspondiente a cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 2 son una porción de colinesterasa, asi como cualquier proteína o polipéptído esencialmente homólogo a esta, que puede actuar como sustrato para un inhibidor de colinesterasa. Según se utiliza en la presente, el término "porción de colinesterasa" incluye dichas proteínas deliberadamente modificadas, como por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o accidentalmente a través de mutaciones. Estos términos incluyen también análogos que tienen de 1 a 6 sitios de glicosilación adicional, análogos que tienen al menos un aminoácido adicional en el extremo terminal carboxi de la proteina donde el o los aminoácidos adicionales incluyen al menos un sitio de glicosilación y análogos que tienen una secuencia de aminoácido que incluye al menos un sitio de glicosilación. El término incluye porciones producidas naturalmente y porciones producidas de modo recombinante.
El término "sustancialmente homólogos" significa que una secuencia particular determinada, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia en uno o más sustituyentes, eliminaciones o adiciones y cuyo efecto neto no resulta en una disimilitud funcional adversa entre la referencia y las secuencias determinadas. A los efectos de la presente invención, las secuencias que tienen más de un 95 por ciento de homología, propiedades biológicas equivalente y características de expresión equivalentes se consideran esencialmente homologas. A los efectos de determinar la homología, se debe descartar el truncamiento de secuencias maduras. Las secuencias que tienen grados menores de identidad, bioactividad comparable, y características de expresión equivalentes se consideran esencialmente equivalentes. Los ejemplos de porciones de colinesterasa para utilizar en la presente incluyen aquellas secuencias que son homologas esencialmente en SEQ ID NO: 1.
El término "fragmento" significa cualquier proteina o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de una porción o fragmento de una porción de colinesterasa, y que tiene la actividad biológica de la ß-colinesterasa. Los fragmentos incluyen proteínas o polipéptidos producidos mediante la degradación proteolítica de una porción de colinesterasa así como proteínas o polipéptidos producidos mediante síntesis química por métodos que son de rutina en la técnica. La actividad enzimática generalmente se mide, por ejemplo, mediante la actividad enzimática o inhibitoria utilizando lineas celulares cultivadas o métodos basados en cultivos tisulares.
El término "paciente", se refiere a un organismo vivo que sufre o es propenso a sufrir una afección que se puede prevenir o tratar mediante la administración de un agente activo (por ejemplo, conjugado) e incluye tanto seres humanos como animales.
"Opcional" o "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita seguidamente puede ocurrir o no, de modo que la descripción incluye casos en las que la circunstancia ocurre y casos en las que no.
"Sustancialmente" significa que satisface casi totalmente o completamente, por ejemplo uno o más de los siguientes: más de un 50%, un 51 % o más, un 75% o más, un 80% o más, un 90% o más, y un 95% o más del trastorno.
Los residuos de aminoácido en los péptidos se abrevian de la siguiente manera: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es He o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido aspártico es Asp o D; Ácido glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptofán es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G.
En referencia nuevamente a una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, el conjugado comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente (ya sea directamente o a través de una porción espadadora) a un polímero soluble en agua. Los conjugados de la invención tendrán una o más de las siguientes características: La porción de colinesterasa Según se estableció anteriormente, el conjugado comprende genéricamente un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente, ya sea directamente o a través de una porción espaciadora, a un polímero soluble en agua. Según se utiliza en la presente, el término "porción de colinesterasa" se referirá a la porción de colinesterasa antes de la conjugación así como a la porción de colinesterasa después de la unión a un polímero soluble en agua, no peptídíco. Se entenderá, sin embargo, que cuando la porción de colinesterasa original está unida al polímero soluble en agua, no peptídico, la porción de colinesterasa se altera ligeramente debido a la presencia de uno o más enlaces covalentes asociados con la unión al polímero. A menudo, esta forma ligeramente alterada de la porción de colinesterasa unida a otra molécula se denomina un "residuo" de la porción de colinesterasa.
La porción de colinesterasa se puede derivar de métodos no recombinantes y de métodos recombinantes y la invención no está limitada en este aspecto. Además, la porción de colinesterasa se puede derivar de fuentes humanas, fuentes animales, y fuentes vegetales.
La porción de colinesterasa se puede derivar de forma no recombinante. Por ejemplo, es posible aislar la butirilcolinesterasa de los sistemas biológicos. Según se explica en la patente estadounidense No. 5,272,080, por ejemplo, la butirilcolinesterasa se puede producir en una pureza de al menos un 90% sometiendo una fracción de plasma IV-4 sola o mezclada con una fracción IV-1 tanto a cromatografía de intercambio de aniones como a cromatografía de afinidad.
La porción de colinesterasa se puede derivar de métodos recombinantes. Por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5,248,604 y 5,595,903 describen métodos basados en recombinación para producir colinesterasa humana enzímáticamente activa. Se puede utilizar una porción de colinesterasa obtenida a través de los abordajes descritos en estas referencias como una porción de colinesterasa para preparar los conjugados descritos en la presente.
La porción de colinesterasa se puede expresar en sistemas de expresión bacterianos [por ejemplo, E. coli, ver, por ejemplo, Fischer et al.(1995) Biotechnol. Appl. Biochem. 21 (3):295-31 1], de mamíferos [ver, por ejemplo, Kronman et al. (1992) Gene 121 :295-304], de levadura [por ejemplo, Pichia pastoris, ver, por ejemplo, Morel et al. (1997) Biochem. J. 328(1):121-129], y vegetales [ver, por ejemplo, Mor et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3) .259-266]. La expresión puede ocurrir por expresión exógena (cuando la célula huésped contiene naturalmente la codificación genética deseada) o por expresión endógena. Se ha descrito la producción de butirilcolinesterasa en mamíferos transgénicos. Ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente estadounidense No. 2004/0016005.
Si bien los métodos basados en la recombinación para preparar proteínas pueden diferir, los métodos recombinantes generalmente implican construir el ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento deseado, clonar el ácido nucleico en un vector de expresión, transformar una célula huésped (por ejemplo, una célula vegetal, de bacteria, levadura, animal transgénico o mamífero como una célula de ovario de hámster chino o célula de riñon de cría de hámster), y expresar el ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseado. Los entendidos en la técnica conocen los métodos para producir y expresar polipéptidos recombinantes in vitro y en células huésped procarióticas y eucarióticas.
A los efectos de facilitar la identificación y purificación de los polipéptidos recombinantes, las secuencias de ácido nucleico que codifican una marca en el epitope u otra secuencia de unión de afinidad se pueden insertar o agregar dentro del marco con la secuencia de codificación, produciendo asi una proteína de fusión compuesta por el polipéptido deseado y un polipéptido apropiado para la unión. Las proteínas de fusión se pueden identificar y purificar haciendo correr primero una mezcla que contiene la proteina de fusión a través de una columna de afinidad que lleva porciones enlazadoras (por ejemplo, anticuerpos) dirigida contra la marca en el epitope u otra secuencia enlazadora en las proteínas de fusión, enlazando asi la proteína de fusión en la columna. A continuación, la proteína de fusión se puede recuperar lavando la columna con la solución apropiada (por ejemplo, ácido) para liberar la proteína de fusión enlazada. El polipéptido recombinante también se puede identificar y purificar lisando las células huésped, separando el polipéptido, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño, y recogiendo el polipéptido. Los entendidos en la técnica conocen estos y otros métodos para identificar y purificar los polipéptidos recombinantes. En una o más realizaciones de la invención, sin embargo, es preferible que la porción de colinesterasa no esté en forma de una proteína de fusión.
En función del sistema utilizado para expresar proteínas que tienen actividad de colinesterasa, la porción de colinesterasa puede ser no glicosilada o glicosilada y se puede utilizar cualquiera de las dos. Es decir, la porción de colinesterasa puede ser no glicosilada o la porción de colinesterasa puede ser glicosilada. En una o más realizaciones de la invención, se prefiere que la porción de colinesterasa sea glicosilada, preferentemente en cuatro sitios de glicosilación. Por ejemplo, también se prefiere tener la cadena de oligosacáridos en cada terminal del sitio de glicosilación en mañosa.
La porción de colinesterasa se puede modificar ventajosamente para incluir y/o sustituir uno o más residuos de aminoácido como, por ejemplo, lisina, cisteína, y/o arginina, a los efectos de proporcionar una unión superficial del polímero a un átomo dentro de la cadena lateral del aminoácido. En Fischer et al.(1995) Biotechnol. Appl. Biochem. 2_ (3):295-31 1 se describe un ejemplo de sustitución de una porción de colinesterasa. Además, la porción de colinesterasa se puede modificar para incluir un residuo de aminoácido que no existe naturalmente. Los entendidos en la técnica conocen las técnicas para agregar residuos de aminoácido y residuos de aminoácido que no existen naturalmente. Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-lnterscience, 1992).
Además, la porción de colinesterasa se puede modificar ventajosamente para incluir la unión de un grupo funcional (de otro modo que no sea a través de la adición de un residuo de aminoácido que contiene un grupo funcional). Por ejemplo, la porción de colinesterasa se puede modificar para incluir un grupo tiol. Además, la porción de colinesterasa se puede modificar para incluir un carbono alfa terminal N. Además, la porción de colinesterasa se puede modificar para incluir una o más porciones de carbohidrato. En algunas realizaciones de la invención, se prefiere que la porción de colinesterasa no se modifique para incluir un grupo tiol y/o un carbono alfa terminal N.
En la bibliografía se describen ejemplos de porciones de colinesterasa y por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense Nos. 2002/0119489, 2006/0263345 y 2008/0213281. Las porciones de colinesterasa preferidas incluyen aquellas que tienen una secuencia de aminoácido que comprende secuencias seleccionadas de los grupos conformados por las SEQ ID NOs: 1 a 2, y secuencias esencialmente homologas a estas. Una porción de colinesterasa preferida tiene la secuencia de aminoácido correspondiente a la acetilcolinesterasa humana. Otra colinesterasa preferida tiene la secuencia de aminoácido correspondiente a la butirilcolinesterasa humana, por ejemplo, la versión recombinante de butirilcolinesterasa humana que se está desarrollando con el nombre PROTEXIA® (PharmAthene Inc., Annapolis, MD). Se reconoce que tanto la acetilcolinesterasa como la butirilcolinesterasa existen en múltiples formas moleculares compuestas por diferentes números de subunidades catalíticas y no catalíticas. En seres humanos, sin embargo, ambas enzimas están compuestas por subunidades de aproximadamente 600 aminoácidos cada una, y ambas son glicosiladas. La acetilcolinesterasa se puede distinguir de la butirilcolinesterasa cercanamente relacionada por su alta especificidad para el sustrato de acetilcoiina y la sensibilidad a inhibidores selectivos. Mientras que la acetilcolinesterasa se utiliza principalmente en el cuerpo para hidrolizar la acetilcolina, la función específica de la butirilcolinesterasa no está tan clara. En todo caso, los términos "acetilcolinesterasa" y "butirilcolinesterasa" abarcan todas las formas moleculares dentro de cada enzima. En algunos ejemplos, la porción de colinesterasa estará en forma de un "monómero" donde se organiza una sola expresión del péptido correspondiente en una unidad discreta. En otros ejemplos, la porción de colinesterasa estará en la forma de un "dimero" (por ejemplo, un dimero de butirilcolinesterasa humana recombinante) donde dos formas de monómero de la proteína se asocian (por ejemplo, mediante enlace disulfuro) una a la otra. Por ejemplo, en el contexto de un dimero de butirilcolinesterasa humana recombinante, el dimero puede estar en forma de dos monómeros asociados uno a otro mediante un enlace disulfuro formado a partir de cada residuo de monómero Cys 571.
Además, se pueden utilizar formas precursoras de una proteína que tiene actividad de colinesterasa.
Las versiones truncas, las variantes híbridas y los míméticos péptidos de cualquiera de las secuencias precedentes también pueden servir como la porción de colinesterasa. Los fragmentos biológicamente activos, las variantes de eliminación, las variantes de sustitución o las variantes de adición de cualquiera de los precedentes, que mantienen al menos algún grado de actividad de colinesterasa también pueden servir como la porción de colinesterasa.
Para cualquier péptido o porción de proteína dados, es posible determinar si esa porción tiene actividad de colinesterasa. En la técnica se describen varios métodos de ensayos de actividad de colinesterasa enzimática in vitro. Ver, por ejemplo, Lockridge et al. (1978) J. Biol. Chem. 253:361-366, Lockridge et al. (1997) Biochemistry 36:786-795, Plattborze et al. (2000) Biotechnol. Appl. Biochem. 31_:226-229, y Blong et al. (1997) Biochem. J. 327:747-757. Se puede evaluar la presencia de actividad de colinesterasa enzimáticamente activa en las muestras utilizando el ensayo de actividad de Ellman [Ellman et al. (1961 ) Biochem. Pharmacol. 7:88]. Los niveles de actividad de colinesterasa se pueden estimar mediante la tinción de geles de poliacrilamida en un 30% 4- con gradientes no desnaturalizantes con 2 mM de yoduro de ecotiofato como sustrato (según se describe en Lockridge et al. supra), donde este método es una modificación de los mismos ensayos utilizando 2 mM de butiriltiocolina como sustrato [de Karnovsky et al. (1964) J. Histochem. Cytochem. 12:219]. Utilizando estos métodos, se pueden determinar las propiedades catalíticas de una porción de interés, incluidos los valores Km, Vmax y kcat, utilizando butiriltiocolina o acetiltiocolina como sustrato. Se pueden utilizar otras metodologías conocidas en la técnica para evaluar la función de la colinesterasa, incluidas electrometría, espectrofotometría, cromatografía, y metodologías radiométricas.
El Polímero Soluble en Agua Como se ha descrito anteriormente, cada conjugado comprende una porción de colinesterasa unida a un polímero soluble en agua. Con respecto al polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua es no peptidico, no tóxico, no ocurre naturalmente y es biocompatible. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos beneficiosos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo, un agente activo, como una porción de colinesterasa) en relación con tejidos vivos (por ejemplo, la administración a un paciente) pesa más que cualquier efecto nocivo según la evaluación de un facultativo, por ejemplo, un médico. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogénica si el uso deseado de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmunitaria no deseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o si se produce una respuesta inmunitaria que no se considere clínicamente significativa o importante según la evaluación de un facultativo. Se prefiere, en particular, que el polímero soluble en agua no peptidico sea biocompatible y no inmunogénico.
Asimismo, el polímero se caracteriza típicamente por tener de 2 a aproximadamente 300 extremos terminales. Los ejemplos de tales polímeros incluyen, a modo no taxativo, poli(alquilenglicoles) como el polietilenglícol ("PEG"), poli(propílenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrílato), poli(sacáridos), poli(a-hídroxiácido), poli(vinil alcohol), polifosfaceno, polioxazolinas ("POZ") (que se describen en el documento WO 2008/106186), poli(N-acriloilmorfolina) y combinaciones de cualquiera de los anteriores.
El polímero soluble en agua no está limitado a una estructura en particular y puede ser lineal (por ejemplo, un polímero con extremos recubiertos, por ejemplo, alcoxi PEG o un PEG bifuncional), ramificado o con múltiples brazos (por ejemplo, PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo de poliol), una arquitectura dendrítica (o en estrella), cada uno con o sin uno o más enlaces degradables. Además, la estructura interna del polímero soluble en agua puede organizarse en una variedad de diferentes patrones de repetición y puede seleccionarse del grupo que consiste en homopolímero, copolímero alterno, copolímero aleatorio, copolímero en bloque, tripolimero alterno, tripolimero aleatorio y tripolimero en bloque.
Generalmente, el PEG activado y otros polímeros solubles en agua activados (es decir, reactivos poliméricos), se activan con un grupo de activación adecuado para el acoplamiento a un sitio deseado de la porción de colinesterasa. Por consiguiente, un reactivo polimérico poseerá un grupo reactivo para reacción con la porción de colinesterasa. Los reactivos poliméricos representativos y los métodos para conjugar estos polímeros en una porción activa se conocen en la técnica y se describen en profundidad en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182. Los grupos de activación ejemplares adecuados para el acoplamiento a una porción de colinesterasa incluyen hidroxilo, maleimida, éster, acetal, cetal, amino, carboxilo, aldehido, hidrato de aldehido, cetona, vinilcetona, tiona, tiol, vinilsulfona, hidrazina, entre otros.
Generalmente, el peso molecular medio en peso del polímero soluble en agua en el conjugado es de aproximadamente 100 daltons a aproximadamente 150.000 daltons. Sin embargo, los intervalos ejemplares incluyen pesos moleculares medio en peso en el intervalo de mayor a 5.000 daltons a aproximadamente 100.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 6.000 daltons a aproximadamente 90.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 10.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons, en el intervalo de mayor a 10.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 53.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 25.000 daltons a aproximadamente 120.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 29.000 daltons a aproximadamente 120.000 daltons, en el intervalo de aproximadamente 35.000 daltons a aproximadamente 120.000 daltons, y en el intervalo de aproximadamente 40.000 daltons a aproximadamente 120.000 daltons. Para cualquier polímero soluble en agua se prefieren PEG con un peso molecular en uno o más de estos intervalos.
Los pesos moleculares medios en peso ejemplares para el polímero soluble en agua incluyen aproximadamente 100 daltons, aproximadamente 200 daltons, aproximadamente 300 da tons, aproximadamente 400 daltons, aproximadamente 500 da tons, aproximadamente 600 daltons, aproximadamente 700 da tons, aproximadamente 750 daltons, aproximadamente 800 da tons, aproximadamente 900 daltons, aproximadamente 1.000 da tons, aproximadamente 1.500 daltons, aproximadamente 2.000 da tons, aproximadamente 2.200 daltons, aproximadamente 2.500 da tons, aproximadamente 3.000 daltons, aproximadamente 4.000 da tons, aproximadamente 4.400 daltons, aproximadamente 4.500 da tons, aproximadamente 5.000 daltons, aproximadamente 5.500 da tons, aproximadamente 6.000 daltons, aproximadamente 7.000 da tons, aproximadamente 7.500 daltons, aproximadamente 8.000 da tons, aproximadamente 9.000 daltons, aproximadamente 10.000 da tons, aproximadamente 1 1 .000 daltons, aproximadamente 12.000 da tons, aproximadamente 13.000 daltons, aproximadamente 14.000 da tons, aproximadamente 15.000 daltons, aproximadamente 20.000 da tons, aproximadamente 22.500 daltons, aproximadamente 25.000 da tons, aproximadamente 30.000 daltons, aproximadamente 35.000 da tons, aproximadamente 40.000 daltons, aproximadamente 45.000 da tons, aproximadamente 50.000 daltons, aproximadamente 55.000 da Itons, aproximadamente 60.000 daltons, aproximadamente 65.000 da tons, aproximadamente 70.000 daltons y aproximadamente 75.000 daltons Las versiones ramificadas del polímero soluble en agua (por ejemplo, un polímero soluble en agua ramificado de 40.000 daltons comprendido por dos polímeros de 20.000 daltons) que tienen un peso molecular total de cualquiera de los anteriores, también pueden utilizarse. En una o más realizaciones, el conjugado no estará unido a ninguna porción PEG, ya sea directa o indirectamente, con un PEG de peso molecular medio en peso de menos de aproximadamente 6.000 daltons.
Cuando se utilizan como el polímero, los PEG generalmente comprenderán varios monómeros (OCH2CH2) [o monómeros (CH2CH2O), en función de cómo se defina el PEG]. Como se ha empleado en la descripción, el número de unidades de repetición se identifica mediante el subíndice "n" en "(OCH2CH2)n." Por consiguiente, el valor de (n) generalmente entra en uno o más de los siguientes intervalos: de 2 a aproximadamente 3.400, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.300, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.270, de aproximadamente 136 a aproximadamente 2.050, de aproximadamente 225 a aproximadamente 1.930, de aproximadamente 450 a aproximadamente 1.930, de aproximadamente 1 .200 a aproximadamente 1.930, de aproximadamente 568 a aproximadamente 2.727, de aproximadamente 660 a aproximadamente 2.730, de aproximadamente 795 a aproximadamente 2.730, de aproximadamente 795 a aproximadamente 2.730, de aproximadamente 909 a aproximadamente 2.730 y de aproximadamente 1.200 a aproximadamente 1.900. Para cualquier polímero dado cuyo peso molecular se conozca, es posible determinar el número de unidades de repetición (es decir, "n") mediante división del peso molecular medio en peso total del polímero por el peso molecular del monómero de repetición.
Un polímero particularmente preferido para uso en la invención es un polímero con extremos recubiertos, es decir, un polímero que tiene al menos un extremo terminal recubierto con un grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxiCi.6 inferior, aunque también puede utilizarse un grupo hidroxilo. Cuando el polímero es PEG, por ejemplo, es preferible utilizar un PEG metoxí (comúnmente denominado mPEG), que es una forma lineal de PEG donde un extremo terminal del polímero es un grupo metoxi(-OCH3), mientras que el otro extremo terminal es un hidroxilo u otro grupo funcional que, de manera opcional, puede modificarse químicamente. Útil en una forma en una o más realizaciones de la presente invención, el PEG libre o sin unir es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilos: HO-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH, donde (n) generalmente varía de cero a aproximadamente 4.000.
El polímero anterior, alfa-, omega-dihidroxilpoli(etilenglicol), puede representarse de forma breve como HO-PEG-OH donde se entiende que el símbolo -PEG- puede representar la siguiente unidad estructural: -CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-, donde (n) se define como anteriormente.
Otro tipo de PEG útil en una o más realizaciones de la presente invención es el metoxi-PEG-OH, o mPEG abreviado, en el cual un extremo terminal es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras que el otro extremo terminal es el grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se muestra a continuación.
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH donde (n) es como se describe anteriormente.
Las moléculas de PEG ramificadas o de brazos múltiples, como las descritas en la patente de los Estados Unidos No. 5,932,462 también pueden utilizarse como el polímero PEG. Por ejemplo, el PEG puede tener la estructura: polia — P R"— C I polib — Q donde: polia y polib son estructuras centrales de PEG (ya sean iguales o diferentes), como el metoxi poli(etilenglicol); R" es una porción no reactiva, como H, metilo o una estructura central de PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En una realización preferida, el polímero PEG ramificado es lisina disustituida con metoxi poli(etilenglicol).
Según la porción de colinesterasa especifica que se utilice, el grupo funcional éster reactivo de la lisina disustituida se puede modificar adicionalmente para formar un grupo funcional adecuado para reaccionar con el grupo objetivo dentro de la porción de colinesterasa.
Además, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. La estructura a continuación representa un ejemplo de PEG bifurcado: Z / PEG-X-CH \ Z donde: X es una porción espaciadora de uno o más átomos y cada Z es un grupo terminal activado unido a CH mediante una cadena de átomos de longitud definida. En la publicación de la solicitud de patente internacional WO 99/45964 se describen varias estructuras de PEG bifurcado que pueden ser utilizadas en una o más realizaciones de la presente invención. La cadena de átomos que une los grupos funcionales Z al átomo de carbono ramificante sirve como grupo de unión y puede comprender, por ejemplo, cadenas de alquilos, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de éstas.
El polímero PEG puede comprender una molécula de PEG colgante que tenga grupos reactivos, como carboxilo, unidos covalentemente a lo largo de todo el PEG en vez de al final de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden unirse al PEG directamente o por medio de una porción espaciadora, como un grupo alquileno.
Además de las formas de PEG descritas anteriormente, el polímero también puede prepararse con uno o más enlaces débiles o degradables en el polímero, incluidos cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, se puede preparar PEG con enlaces de éster en el polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis resulta en una escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular: -PEG-CO2-PEG- + H20 ? -PEG-CO2H + HO-PEG- Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como enlace degradable en una estructura central polimérica y/o como enlace degradable a una porción de colinesterasa, incluyen: enlaces de carbonato; enlaces de imina que resultan, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehido (ver, por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1 ): 582-3); enlaces de éster de fosfato formados, por ejemplo, mediante reacción de un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona, que generalmente se forman mediante reacción de una hídrazída y un aldehido; enlaces de acetal que generalmente se forman mediante reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que se forman, por ejemplo, mediante reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces de amida formados por un grupo amino, por ejemplo, en el extremo de un polímero como el PEG, y un grupo carboxilo de otra cadena de PEG; enlaces de uretano formados mediante reacción de, por ejemplo, un PEG con un grupo terminal de isocianato y un alcohol PEG; enlaces péptidos formados por un grupo amino, por ejemplo, en el extremo de un polímero como el PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótidos formados mediante, por ejemplo, un grupo fosforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.
Tales características opcionales del conjugado, es decir, la introducción de uno o más enlaces degradables a la cadena de polímeros o a la porción de colinesterasa, pueden proporcionar un control adicional sobre las propiedades farmacológicas finales deseadas del conjugado bajo administración. Por ejemplo, se puede administrar un conjugado grande y relativamente inerte (esto es, que tiene unidas una o más cadenas de PEG con alto peso molecular, por ejemplo, una o más cadenas de PEG con un peso molecular mayor a aproximadamente 10.000, donde el conjugado esencialmente no posee bioactividad) que se hidroliza para generar un conjugado bioactivo que posee una porción de la cadena de PEG original. De este modo, las propiedades del conjugado se pueden ajustar con mayor eficacia para equilibrar la bioactividad del conjugado con el tiempo.
El polímero soluble en agua asociado con el conjugado también puede ser "escindible". Esto es, el polímero soluble en agua se escinde (mediante hidrólisis, procesos enzimáticos o de otro modo), con lo que produce la porción de colinesterasa no conjugada. En algunos casos, los polímeros escindibles se separan de la porción de colinesterasa in vivo sin dejar ningún0fragmento del polímero soluble en agua. En otros casos, los polímeros escindibles se separan de la porción de colinesterasa in vivo dejando un fragmento relativamente pequeño (por ejemplo, una marca de succinato) del polímero soluble en agua. Un polímero escindible ejemplar incluye uno que se una a la porción de colinesterasa por medio de un enlace de carbonato.
Los entendidos en la técnica reconocerán que la discusión anterior respecto al polímero no peptídico soluble en agua de ninguna manera es exhaustiva sino meramente ilustrativa, y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas anteriormente. Según su uso en la presente, el término "reactivo polimérico" se refiere por lo general a una molécula entera, la cual puede comprender un segmento de un polímero soluble en agua y un grupo funcional.
Como se describe anteriormente, un conjugado de la invención comprende un polímero soluble en agua unido covalentemente a una porción de colinesterasa. Generalmente, para cualquier conjugado, habrá de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a una o más porciones con actividad de colinesterasa. Sin embargo, en algunos casos, el conjugado puede tener 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más polímeros solubles en agua unidos individualmente a una porción de colinesterasa. Cualquier polímero soluble en agua puede unirse covalentemente a un aminoácido de la porción de colinesterasa o, cuando la porción de colinesterasa es (por ejemplo) una glicoproteina, a un carbohidrato de la porción de colinesterasa. La unión a un carbohidrato puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante funcionalización metabólica que emplee química de azida de ácido siálico [Luchansky et al. (2004) Biochemistry 43(38): 12358-12366] u otros abordajes adecuados como el uso de glicidol para facilitar la introducción de grupos aldehidos [Heldt et al. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32.5429-5433].
El enlace particular dentro de la porción con actividad de colinesterasa y el polímero depende de varios factores. Tales factores incluyen, por ejemplo, la química de enlaces particular empleada, la porción de colinesterasa particular, los grupos funcionales disponibles en la porción de colinesterasa (para unión con un polímero o conversión en un sitio de unión adecuado), la presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro de la porción de colinesterasa, y similares.
Los conjugados de esta invención pueden ser, aunque no necesariamente, profármacos, lo que significa que el enlace entre el polímero y la porción de colinesterasa es hidrolíticamente degradable para permitir la liberación de la porción base. Los enlaces degradables ejemplares incluyen éster de carboxilato, éster de fosfato, tioléster, anhídridos, acétales, cetales, éter de aciloxialquilo, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Tales enlaces pueden prepararse fácilmente modificando apropiadamente la porción de colinesterasa (por ejemplo, el extremo terminal C del grupo carboxilo de la proteína o un grupo lateral de cadena de hidroxilo de un aminoácido como una serina o treonina contenida dentro de la proteína o una funcionalidad similar dentro del carbohidrato) y/o el reactivo polimérico utilizando métodos de acoplamiento comúnmente empleados en la técnica. Sin embargo, son más preferidos los enlaces hidrolizables que se forman fácilmente mediante reacción de un polímero adecuadamente activado con un grupo funcional no modificado contenido dentro de la porción que presenta actividad de colinesterasa.
De forma alternativa, puede emplearse también un enlace hidroliticamente estable, como un enlace de amida, uretano (conocido también como carbamato), amina, tioéter (conocido también como sulfuro) o urea (conocida también como carbamida) como el enlace para acoplar la porción de colinesterasa. Nuevamente, se prefiere como enlace hidroliticamente estable una amida. En un abordaje, un polímero soluble en agua que posee un éster activado puede hacerse reaccionar con un grupo amino en la porción de colinesterasa, lo que resulta en un enlace de amida.
Los conjugados (en oposición a una porción de colinesterasa no conjugada) pueden o no poseer un grado mensurable de actividad de colinesterasa. Es decir, un conjugado de polímero de porción de colinesterasa de conformidad con la invención poseerá cualquier valor de aproximadamente el 0.1 % a aproximadamente el 100% de la bioactividad de la porción de colinesterasa base no modificada. En algunos casos, los conjugados de porción de polímero de colinesterasa pueden presentar una bioactividad de la porción de colinesterasa base no modificada mayor al 100%. Preferentemente, los conjugados que poseen poca o ninguna actividad de colinesterasa contienen un enlace hidrolizable que conecta el polímero con la porción, de modo que sin importar la falta (o falta relativa) de actividad en el conjugado, la molécula base activa (o un derivado de la misma) se libera por escisión acuosa-inducida del enlace hidrolizable. Dicha actividad puede determinarse utilizando un modelo adecuado in vivo o in vitro, según la actividad conocida de la porción particular que emplea actividad de colinesterasa.
Para los conjugados que poseen un enlace hidroliticamente estable que acopla la porción que presenta actividad de colinesterasa al polímero, el conjugado generalmente poseerá un grado mensurable de bioactividad. Por ejemplo, tales conjugados se caracterizan generalmente por poseer una bioactividad que satisface uno o más de los siguientes porcentajes relativos al de la porción de colinesterasa no conjugada: al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 1 5%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 100% y más del 105% (cuando se mide en un modelo adecuado, como los más conocidos en la técnica). Preferentemente, los, conjugados que presentan un enlace hidroliticamente estable (por ejemplo, un enlace amida) poseerán al menos un grado de la bioactividad de la porción base no modificada que presenta actividad de colinesterasa.
Los conjugados ejemplares de conformidad con la invención serán ahora descritos donde la porción de colinesterasa es una proteína. Generalmente, se espera que dicha proteína comparta (al menos en parte) una secuencia de aminoácido similar, como la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO 2. Por consiguiente, mientras se hará referencia a ubicaciones específicas o átomos en SEQ ID NOS: 1 ó 2, dicha referencia es sólo por conveniencia y los entendidos en la técnica podrán determinar fácilmente la ubicación o el átomo correspondiente en otras porciones que presenten actividad de colinesterasa. En particular, la descripción provista en la presente para la colinesterasa innata en seres humanos se aplica a menudo a fragmentos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de los anteriores.
Los grupos amino en las porciones de colinesterasa proporcionan un punto de unión entre la porción de colinesterasa y el polímero soluble en agua. Utilizando la secuencia de aminoácido proporcionada en SEQ ID NOS: 1 a 2, es evidente que hay varios residuos de lisina, cada uno de los que presenta un aminoácido-e que puede estar disponible para la conjugación. Asimismo, el amino N-terminal de cualquier proteína también puede servir como punto de unión.
Hay varios ejemplos de reactivos poliméricos adecuados útiles para formar enlaces covalentes con aminas disponibles de una porción de colinesterasa. En el Cuadro 1 a continuación se proporcionan ejemplos específicos, junto con el conjugado correspondiente. En el cuadro, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "-NH-(ChE)" representa el residuo de la porción de colinesterasa después de la conjugación con el reactivo polimérico. Mientras que cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (??2??20)?] que figura en el Cuadro 1 termina en un grupo "Chb", otros grupos (como H y bencilo) se pueden sustituir por esta.
CUADRO 1 Reactivos políméricos selectivos de amina y el conjugado de porción de colinesterasa formado por estos (bajo ciertas condiciones de reacción tal como pH > 8) Se puede lograr la conjugación de un reactivo polimérico con un grupo amino de una porción de colinesterasa mediante varias técnicas. En un abordaje, una porción de colinesterasa puede conjugarse con un reactivo polimérico funcionalizado con un derivado de succinimidilo (u otro grupo de éster activado, donde pueden utilizarse abordajes similares a los que se describen para estos reactivos poliméricos que contienen un grupo éster activado alternativos). En este abordaje, el polímero que incluye un derivado de succinimidilo puede unirse a la porción de colinesterasa en un medio acuoso a un pH de 7 a 9.0, aunque el empleo de diferentes condiciones de reacción (por ejemplo, un pH menor tal como 6 a 7, o diferentes temperaturas y/o menores a 15°C) puede resultar en la unión del polímero a una ubicación diferente en la porción de colinesterasa. Además, puede formarse un enlace amida mediante reacción de un polímero soluble en agua no peptidico terminado en amina con una porción de colinesterasa portadora de un grupo de ácido carboxílico activante.
Un conjugado ejemplar comprende la siguiente estructura O II H3CO-(CH2CH20)n-X-CH-C-NH-(ChE) R1 donde: (n) es un número entero con un valor de 2 a 4000; X es una porción espaciadora; R1 es un radical orgánico; y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa.
Otro conjugado ejemplar de la presente invención comprende la siguiente estructura: O II H3CO-(CH2CH20)n-CH2-CH-C-NH-iChE) CH3 donde (n) es un número entero con un valor de 2 a 4.000 y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa.
Generalmente, en otro abordaje útil para la conjugación de la porción de colinesterasa en un reactivo polimérico es el empleo de la aminación reductora para conjugar una amina primaria de una porción de colinesterasa con un reactivo polimérico funcionalizado con una cetona, un aldehido o una forma hidratada de estos (por ejemplo, hidrato de cetona, hidrato de aldehido). En este abordaje, la amina primaria de la porción de colinesterasa reacciona con el grupo carbonilo del aldehido o la cetona (o el correspondiente grupo de un aldehido o cetona hidratados que contenga hidroxilo), formando asi una base de Schiff. La base de Schiff, a su vez, puede convertirse reductiblemente en un conjugado estable mediante el empleo de un agente reductor como borohidruro de sodio. Las reacciones selectivas son posibles (por ejemplo, en el extremo terminal-N), en particular con un polímero funcionalizado con una cetona o con un aldehido alfa-metilo ramificado y/o en condiciones de reacción específicas (por ejemplo, pH reducido).
Los conjugados ejemplares de la invención donde el polímero soluble en agua es una forma ramificada incluyen aquellos donde el polímero soluble en agua comprende la siguiente estructura: donde cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4.000.
Los conjugados ejemplares de la invención comprenden la siguiente estructura: O H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0-i R2 I ]-0-X-(CH2CH20)b C-|-NH-(ChE) O HaCO-íCHzCHzOJn-CHzCHz-NH-C-O-1 H donde: cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4.000; X es una porción espaciadora; (b) es un número entero con un valor de 2 a 6; (c) es un número entero con un valor de 2 a 6; R2, en cada caso, es independientemente H o alquilo inferior; y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa.
Un conjugado ejemplar de la invención comprende la siguiente estructura: H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0- O II O HOCH2CH2CH2-C-NH-(CH2CH20)4-CH2CH2CH2CH2-(ChE) H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0-1 donde: cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4000; y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa.
Otro conjugado ejemplar de la invención comprende la siguiente estructura: O H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0-| R2 o I -0-(X)a-(CH2CH20)b -|-C-|-C-NH-(ChE) O H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0-1 R: donde: cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4.000; (a) es cero o uno; X, cuando está presente, es una porción espaciadora que consta de uno o más átomos; (b') es cero o un número entero con un valor de uno a diez; (c) es un número entero con un valor de uno a diez; R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico; R , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa.
Un conjugado ejemplar de la invención comprende la siguiente estructura: o H3C0-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0 O -CH2CH2CH2C-NH-(C E) H3C0-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-O- donde: cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4.000; y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa.
Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como punto de unión en la porción de colinesterasa. El compuesto comprenderá la siguiente estructura: O II (ChE)-C-X-POLI donde (ChE) y el grupo carbonilo adyacente corresponden a la porción de colinesterasa que contiene carboxilo, X es un enlace, preferentemente un heteroátomo que se selecciona de O, N(H) y S, y POLI es un polímero soluble en agua, como PEG, que opcionalmente termina en una porción terminal.
El enlace C(0)-X resulta de la reacción entre un derivado polimérico con un grupo funcional terminal y una porción de colinesterasa que contiene carboxilo. Como se describe anteriormente, el enlace especifico dependerá del tipo de grupo funcional que se utilice. Si el polímero se funcionaliza en los extremos o "se activa" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico y X será O. Si la estructura central polimérica se funcionaliza con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S. Cuando se emplean ciertos polímeros, con múltiples brazos, ramificados o bifurcados, la porción C(0)X, y en particular la porción X, pueden ser relativamente más complejas y pueden incluir una estructura de enlace más larga.
Los derivados solubles en agua que contienen una porción de hidrazida también son útiles para la conjugación en un carbonilo y ácido carboxílico. En la medida en que la porción de colinesterasa no contenga una porción de carbonilo o un ácido carboxílico, puede agregarse uno utilizando técnicas conocidas para los entendidos en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir una porción de carbonilo reduciendo un ácido carboxílico (por ejemplo, el ácido carboxílico C-terminal) y/o proporcionando versiones glicosiladas o glicadas (donde los azúcares agregados tienen una porción de carbonilo) de la porción de colinesterasa. En lo que respecta a las porciones de colinesterasa que contienen un ácido carboxílico, un reactivo PEG-hidrazina puede, en presencia de un agente acoplador (por ejemplo, DCC), unirse covalentemente a la porción de colinesterasa [por ejemplo, mPEG-OCH2C(O)NHNH2 + HOC(0)-(ChE) da como resultado mPEG-OCH2C(0)NHNHC(0)-ChE]. En el Cuadro 2, a continuación, se proporcionan ejemplos específicos de derivados solubles en agua que contienen una porción de hidrazida, junto con los conjugados correspondientes. Además, cualquier derivado soluble en agua que contenga un éster activado (por ejemplo, un grupo succinimidilo) puede convertirse para contener una porción de hidrazida mediante reacción del derivado del polímero soluble en agua que contiene el éster activado con hidrazina (NH2-NH2) o terc-butil carbazato [NH2NHC02C(CH3)3]. En el cuadro, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "=C-(ChE)" representa el residuo de la porción de colinesterasa que sigue a la conjugación con el reactivo polimérico. Opcionalmente, el enlace de hidrazona puede reducirse utilizando un agente reductor adecuado. Mientras que cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20)n] que figura en el Cuadro 2 termina en un grupo "CH3", otros grupos (como H y bencilo) pueden sustituirse por estos.
CUADRO 2 Reactivos poliméricos específicos para carboxilo v el conjugado de la porción de colinesterasa formado por estos Los grupos tiol contenidos dentro de la porción de colinesterasa pueden servir como sitios efectivos de unión para el polímero soluble en agua. En particular, los residuos de cisteína proporcionan grupos tiol cuando la porción de colinesterasa es una proteina. Los grupos tiol en dichos residuos de cisteina pueden después hacerse reaccionar con un PEG activado específico para la reacción con grupos tiol, por ejemplo, un polímero N-maleimidilo u otro derivado como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,739,208 y en el documento WO 01/62827. Además, un tiol protegido puede ser incorporado a una cadena lateral de oligosacáridos de uña glícoproteina activada, seguida de desprotección con un polímero reactivo de tiol soluble en agua.
En el Cuadro 3, que figura a continuación, se proporcionan ejemplos específicos de reactivos junto con el conjugado correspondiente. En el cuadro, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "-S-(ChE)" representa el residuo de la porción de colinesterasa después de la conjugación con el polímero soluble en agua. Mientras que cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20)n] que figura en el Cuadro 3 termina en un grupo "CH3", otros grupos (como H y bencilo) pueden estar sustituidos por estos.
Con respecto a SEQ ID NOS: de 1 a 2 correspondientes a porciones de colinesterasa ejemplares, puede verse que hay muchos residuos de cisteina que contienen tiol. Por consiguiente, los sitios de unión a tiol preferidos están asociados con unos de estos siete residuos de cisteina. Aunque es preferible no romper ningún enlace de disulfuro, cabe la posibilidad de unir un polímero dentro de la cadena lateral de uno o más de estos residuos de cisteina y retener un grado de actividad. Una ubicación preferida para unir un polímero soluble en agua es en el residuo de cisteína que contiene tiol, correspondiente a Cys66 de SEQ ID NO: 2. Además, es posible agregar un residuo de cisteína a la porción de colinesterasa utilizando técnicas sintéticas convencionales. Ver, por ejemplo, el procedimiento descrito en el documento WO 90/12874 para agregar residuos de cisteína, donde dicho procedimiento puede adaptarse para una porción de colinesterasa. Asimismo, también pueden emplearse procedimientos convencionales de ingeniería genética para introducir un residuo de cisteína en la porción de colinesterasa. Sin embargo, en algunas realizaciones es preferible no introducir un residuo adicional de cisteína y/o grupo tiol.
CUADRO 3 Reactivos poliméricos selectivos de tiol v el conjugado de la porción de colinesterasa formada con estos Con respecto a conjugados formados a partir de polímeros solubles en agua que presentan uno o más grupos funcionales de maleimida (sin importar si la maleimida reacciona con un grupo amino o tiol en la porción de colinesterasa), la(s) forma(s) del ácido maleámico correspondientes al polímero soluble en agua también pueden reaccionar con la porción de colinesterasa. En ciertas condiciones (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7-9 y en presencia de agua) el anillo de maleimida se "abrirá" para formar el ácido maleámico correspondiente. El ácido maleámico, a su vez, puede reaccionar con un grupo amino o tiol de una porción de colinesterasa. Las reacciones ejemplares maleámicas basadas en ácidos se muestran esquemáticamente a continuación. POLI representa el polímero soluble en agua, y (ChE) representa la porción de colinesterasa.
Un conjugado representativo de conformidad con la invención puede presentar la siguiente estructura: POLI- C(0)Z-Y-S-S-(ChE) donde POLI es un polímero soluble en agua, L es un enlazante opcional, Z es un heteroátomo que se selecciona del grupo que consiste en O, NH y S, e Y se selecciona del grupo que consiste en alquiloC2-io, alquilo C2-10 sustituido, arilo y arilo sustituido y (ChE) es una porción de colinesterasa. Los reactivos poliméricos que pueden hacerse reaccionar con una porción de colinesterasa y resultan en este tipo de conjugado se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0014903.
Como se indicó anteriormente, los conjugados ejemplares de la invención donde el polímero soluble en agua es una forma ramificada, tendrán una forma ramificada del polímero soluble en agua que comprende la siguiente estructura: donde cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4.000.
Los ejemplares conjugados que presentan un polímero soluble en agua en forma ramificada se preparan utilizando el siguiente reactivo: formando así un conjugado con la siguiente estructura: donde: (para cada estructura) cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4000; y ChE es un residuo de porción de colinesterasa.
Un conjugado adicional ejemplar puede formarse utilizando un reactivo: formando asi un conjugado con la siguiente estructura: donde: (para cada estructura) cada (n) es independientemente un número entero con un valor de 2 a 4.000; y ChE es un residuo de porción de colinesterasa.
Los conjugados pueden formarse utilizando reactivos poliméricos selectivos de tiol de diversas maneras y la invención no está limitada en este sentido. Por ejemplo, la porción de colinesterasa -opcionalmente en una solución amortiguadora adecuada (que incluye soluciones amortiguadoras que contienen amina, si se desea) - se ubica en un medio acuoso a un pH de aproximadamente 7-9 y el reactivo polimérico selectivo de tiol se agrega en un exceso molar. Se deja que la solución proceda durante aproximadamente 0.5 a 2 horas, aunque los tiempos de reacción mayores a 2 horas (por ejemplo, 5 horas, 10 horas, 12 horas y 24 horas) pueden ser útiles si se determina que los rendimientos de PEGilación son relativamente bajos. Los reactivos poliméricos ejemplares que pueden utilizarse en este abordaje son reactivos poliméricos que presentan un grupo reactivo que se selecciona del grupo formado por maleimida, sulfona (por ejemplo, vinilsulfona) y tiol (por ejemplo, tioles funcionalizados tales como un orto piridinilo o "OPSS").
Como se ha indicado anteriormente, un reactivo polimérico selectivo de tiol (por ejemplo, un reactivo polimérico portador de un grupo funcional de maleimida) puede utilizarse para formar un conjugado con una porción de colinesterasa. Por ejemplo, es posible hacer reaccionar, en condiciones de conjugación, el reactivo polimérico selectivo de tiol con una forma dimera de la porción de colinesterasa (por ejemplo, una forma dimera de BChE humana recombinante). Suponiendo que la posición en la porción de colinesterasa correspondiente a Cys66 se conjuga selectivamente, se forma una mezcla que comprende un dímero monoconjugado con unión en Cys66 de una subunidad de monómero que compone el dímero y un dímero diconjugado con unión en Cys66 de cada una de las dos subunidades de monómero que constituyen el dímero (por ejemplo, una mezcla que comprende dímeros monoPEGilados con unión en Cys66 de una subunidad que constituye el dímero y dímeros díPEGilados con unión en Cys66 para cada una de las dos subunidades que componen el dímero).
En otro abordaje ejemplar, puede llevarse a cabo una etapa de reducción en un método para preparar conjugados. Puede llevarse a cabo una etapa de reducción empleando técnicas conocidas para los entendidos en la técnica. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una etapa de reducción sometiendo una proteína a condiciones de reducción, por ejemplo, mediante adición de un agente reductor, como 2-mercaptoetanol, ditiotreitol o tris(2-carboxietil)fosfina.
En los casos en que se lleve a cabo una etapa de reducción, puede llevarse a cabo la etapa de reducción antes de una reacción de conjugación inicial o después de una reacción de conjugación inicial (por ejemplo, con purificación posterior y/o conjugación posterior).
Por ejemplo, en un abordaje donde se lleva a cabo una etapa de reducción posterior a una reacción de conjugación inicial, puede llevarse a cabo una etapa de reducción con la mezcla descrita anteriormente, es decir, una mezcla que comprende un dímero monoconjugado con unión en Cys66 de una subunidad de monómero que compone el dímero y un dímero diconjugado con unión en Cys66 de cada una de las dos subunidades de monómero que componen el dímero (por ejemplo, una mezcla que comprende dímeros monoPEGilados con unión en Cys66 de una subunidad que compone el dímero y dímeros diPEGilados con unión en Cys66 para cada una de las dos subunidades que componen el dímero). El resultado de reducir la mezcla antes mencionada es una mezcla reducida que comprende monómero no conjugado y monómero monoconjugado. Posteriormente, la mezcla reducida puede purificarse utilizando técnicas conocidas (como cromatografía de intercambio iónico) para separar el monómero sustancialmente no conjugado y el monómero monoconjugado para formar una composición que comprenda el monómero sustancialmente no conjugado y una composición que comprenda el monómero monoconjugado. Después de esto, pueden suprimirse las condiciones de reducción (por ejemplo, suprimir o separar el agente reductor, mediante, por ejemplo, la utilización de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, diafiltración, entre otros) de la composición que comprende monómero sustancialmente monoconjugado con el resultado de que los enlaces de disulfuro se regeneran para formar, por ejemplo, una composición que comprende dimero diconjugado (por ejemplo, dimero diPEGilado). Opcionalmente, . puede implementarse una etapa de filtración de flujo tangencial ("TFF") posterior a la supresión de las condiciones de reducción para concentrar la composición que comprende monómero monoconjugado, con el beneficio de aumentar la tasa de formación de dimero diconjugado. El abordaje mencionado anteriormente tiene los beneficios de rendimientos relativamente elevados, por ejemplo, superiores al 50% de dimero diconjugado (por ejemplo, dimero diPEGilado), caracterización del producto simplificada y una necesidad relativamente reducida de utilizar reactivos poliméricos.
Con respecto a los reactivos poliméricos, los descritos aquí y en cualquier otro lado están disponibles comercialmente o pueden prepararse a partir de materiales de partida comercialmente disponibles. Además, los métodos para preparar los reactivos poliméricos se describen en la bibliografía.
La unión entre la porción de colinesterasa y el polímero soluble en agua no peptídíco puede ser directa, donde no hay átomos que intervengan que estén ubicados entre la porción de colinesterasa y el polímero, o indirecta, donde uno o más átomos están ubicados entre la porción de colinesterasa y el polímero. Con respecto a la unión indirecta, una "porción espadadora" sirve como enlazante entre el residuo de la porción de colinesterasa y el polímero soluble en agua. El átomo o átomos que componen la "porción espadadora" puede incluir uno o más átomos de carbono, átomos de nitrógeno, átomos de azufre, átomos de oxígeno y combinaciones de estos. La porción espaciadora puede comprender un grupo amida, amina secundaria, carbamato, tioéter y/o disulfuro. Los ejemplos no taxativos de porciones espadadoras específicas incluyen las seleccionadas del grupo que consiste en -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(0)-NH-, -NH-C(0)-NH-, -0-C(0)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-0-CH2-, -CH2-C(0)-0-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-0-CH2-, -C(0)-0-CH2-CH2-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)r, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R6)-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, en las que R6 es H o un radical orgánico que se selecciona del grupo formado por alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis y (j) es de cero a 20. Otras porciones espaciadoras especificas presentan la siguiente estructura: -C(O)-NH-(CH2)i-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1. 6-NH-C(O)-, y -O-C(O)-NH-(CH2)1.6-NH-C(O)-, donde los valores de subíndice que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)1-6 significa que la estructura puede contener 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos. Además, cualquiera de las porciones espaciadoras anteriormente mencionadas puede también incluir una cadena de oligómeros de óxido de etileno que comprende de 1 a 20 unidades de monómero de óxido de etileno [es decir, -(CH2CH2O)i-2o]. Es decir, la cadena de oligómeros de óxido de etileno puede ocurrir antes o después de la porción espaciadora y, opcionalmente, entre cualesquiera dos átomos de una porción espadadora formada por dos o más átomos. A su vez, la cadena de oligómeros no seria considerada parte de la porción espadadora si el oligómero es adyacente a un segmento de polímero y representa únicamente una extensión del segmento de polímero.
Composiciones Los conjugados son generalmente parte de una composición. En general, la composición comprende una pluralidad de conjugados, preferente pero no necesariamente, cada conjugado está compuesto por la misma porción de colinesterasa (es decir, dentro de toda la composición, sólo se encuentra un tipo de porción de colinesterasa). Además, la composición puede comprender una pluralidad de conjugados donde cualquier conjugado está compuesto por una porción que se selecciona del grupo que consiste en dos o más porciones de colinesterasa diferentes (es decir, dentro de toda la composición, se encuentran dos o más porciones de colinesterasa diferentes). Sin embargo, de forma óptima, básicamente todos los conjugados de la composición (por ejemplo, el 85% o más de la pluralidad de conjugados en la composición) están cada uno compuestos por la misma porción de colinesterasa.
La composición puede comprender una especie de conjugado único (por ejemplo, un conjugado monoPEGilado donde el polímero individual está unido en la misma ubicación para sustancialmente todos los conjugados de la composición) o una mezcla de especies de conjugados (por ejemplo, una mezcla de conjugados monoPEGilados donde la unión del polímero ocurre en sitios diferentes y/o una mezcla de conjugados monoPEGilados, diPEGilados y triPEGilados). Las composiciones también pueden comprender otros conjugados que tengan cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros unidos a cualquier porción con actividad de colinesterasa. Además, la invención incluye casos en los que la composición comprende una pluralidad de conjugados, donde cada conjugado comprende un polímero soluble en agua unido covalentemente a una porción de colinesterasa, así como composiciones que comprenden dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros solubles en agua unidos covalentemente a una porción de colinesterasa.
Con respecto a los conjugados en la composición, la composición presentará una o más de las características mencionadas a continuación, al menos aproximadamente el 85% de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 85% de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 85% de los conjugados en la composición tendrán de uno a dos polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 85% de los conjugados en la composición tendrán un polímero unido a la porción de colinesterasa, al menos aproximadamente el 95% de los conjugados en la composición tendrán de uno a cinco polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 95% de los conjugados en la composición tendrán de uno a cuatro polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 95% de los conjugados en la composición tendrán de uno a tres polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 95% de los conjugados en la composición tendrán de uno a dos polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 95% de los conjugados en la composición tendrán un polímero unido a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 99% de los conjugados en la composición tendrán de uno a cinco polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 99% de los conjugados en la composición tendrán de uno a cuatro polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 99% de los conjugados en la composición tendrán de uno a tres polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 99% de los conjugados en la composición tendrán de uno a dos polímeros unidos a la porción de colinesterasa; al menos aproximadamente el 99% de los conjugados en la composición tendrán un polímero unido a la porción de colinesterasa. Se entiende que una referencia a un intervalo de polímeros, por ejemplo, "de x polímeros a y polímeros", contempla un número de polímeros de x a y inclusive (es decir, por ejemplo, "de uno a tres polímeros", contempla un polímero, dos polímeros y tres polímeros, "de uno a dos polímeros", contempla un polímero y dos polímeros, y asi sucesivamente).
En una o más realizaciones, es preferible que la composición que contiene el conjugado no posea albúmina, al menos sustancialmente. También es preferible que la composición no posea, al menos sustancialmente, proteínas que no presenten actividad de colinesterasa. Por consiguiente, es preferible que la composición esté en un 85%, o más preferiblemente un 95%, o más preferiblemente aún un 99% libre de albúmina. Asimismo, es preferible que la composición esté en un 85%, más preferiblemente un 95%, o más preferiblemente aún un 99% libre de cualquier proteina que no presente actividad de colinesterasa. En la medida en que la albúmina esté presente en la composición, las composiciones ejemplares de la invención están sustancialmente libres de conjugados que comprendan un polímero de poli(etilenglicol) que enlace un residuo de una porción de colinesterasa con la albúmina.
El control del número deseado de polímeros para cualquier porción puede lograrse mediante la selección del reactivo polimérico adecuado, la proporción entre los reactivos poliméricos y la porción de colinesterasa, la temperatura, las condiciones de pH y otros aspectos de la reacción de conjugación. Además, la reducción o eliminación de los conjugados no deseados (por ejemplo, los conjugados que tienen cuatro o más polímeros unidos) puede lograrse a través de medios de purificación.
Por ejemplo, pueden purificarse los conjugados de la porción de colinesterasa del polímero para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. Específicamente, la mezcla del producto puede purificarse para obtener un promedio de cualquiera de entre uno, dos, tres, cuatro, cinco o más PEG por porción de colinesterasa, por lo general uno, dos o tres PEG por porción de colinesterasa. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción del conjugado final dependerá de varios factores, incluidos, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, la porción de · colinesterasa particular, el régimen de dosificación deseado y la actividad residual y las propiedades in vivo del(los) conjugado(s) individual(es).
Si se desea, pueden aislarse conjugados con pesos moleculares diferentes mediante cromatografía de filtración en gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se utiliza para fraccionar relaciones de polímero con porción de colinesterasa numeradas de forma distinta (por ejemplo, 1-mer, 2-mer, 3-mer, y así sucesivamente, donde "1 -mer" indica un polímero por porción de colinesterasa, "2-mer" indica dos polímeros por porción de colinesterasa, y así sucesivamente) en función de sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde fundamentalmente al peso molecular medio de la porción de polímero soluble en agua). Por ejemplo, en una reacción ejemplar donde una proteína de 35.000 daltons se conjuga al azar con un reactivo polimérico con un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (con un peso molecular de aproximadamente 35.000 daltons), proteína monoPEGilada (con un peso molecular de aproximadamente 55.000 daltons), proteína diPEGilada (con un peso molecular de aproximadamente 75.000 daltons) y así sucesivamente.
Aunque este abordaje puede emplearse para separar PEG y otros conjugados de porción polímero- colinesterasa con diferentes pesos moleculares, este abordaje por lo general no es eficaz para la separación de isoformas posicionales que presentan diferentes sitios de unión al polímero dentro de la porción de colinesterasa. Por ejemplo, puede utilizarse la cromatografía de filtración en gel para separar recíprocamente mezclas de PEG 1 -meros, 2-meros, 3-meros, y así sucesivamente, aunque cada una de las composiciones de conjugados recuperados puede contener PEG unido(s) a diferentes grupos reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) en la porción de colinesterasa.
Las columnas de filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ comercializadas por Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La selección de una columna en particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución generalmente se lleva a cabo utilizando una solución amortiguadora adecuada, como fosfato, acetato o similares. Las fracciones recolectadas pueden analizarse mediante diversos métodos, por ejemplo, absorbancia (i) a 280 nm para contenido proteico, (ii) análisis proteico basado en pigmentos utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar, (iii) prueba de yodo para contenido PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (¡v) electrofóresis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE), y después una tinción con yoduro de bario, y (v) cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
La separación de isoformas posicionales se realiza mediante cromatografía de fase inversa utilizando una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) utilizando una columna adecuada (por ejemplo, una columna C18 o una columna C3, comercializadas por empresas como Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose ™ comercializada por Amersham Biosciences. Cualquiera de estos abordajes puede utilizarse para separar isómeros de agente activo-polímero que tengan el mismo peso molecular (es decir, isoformas posicionales).
Preferentemente, las composiciones carecen sustancialmente de proteínas que no presentan actividad de colinesterasa. Además, las composiciones preferentemente están sustancialmente libres de todos los polímeros solubles en agua unidos no covalentemente. Sin embargo, en algunas circunstancias, la composición puede contener una mezcla de conjugados de porción de colinesterasa-polímero y porción de colinesterasa no conjugada.
Opcionalmente, la composición de la invención comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Si se desea, puede agregarse el excipiente farmacéuticamente aceptable a un conjugado para formar una composición.
Los excipientes ejemplares incluyen, a modo no taxativo, los que se seleccionan del grupo formado por carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, sürfactantes, soluciones amortiguadoras, ácidos, bases y las combinaciones de estos.
Un carbohidrato, como por ejemplo un azúcar, un azúcar derivatizado como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar puede estar presente como excipiente. Los excipientes específicos de carbohidratos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, como la fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, como la lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, como la rafinosa, melecitosa, maltodextrínas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares.
El excipiente puede también incluir una sal inorgánica o solución amortiguadora, como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico y combinaciones de estos.
La composición también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o impedir el crecimiento microbiano. Los ejemplos no taxativos de agentes antimícrobianos adecuados para una o más realizaciones de la presente invención incluyen el cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol de bencilo, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feníletilico, nitrato de fenilmercurio, timerosal y las combinaciones de estos.
También puede haber un antioxidante presente en la composición. Los antioxidantes se utilizan para evitar la oxidación, previniendo asi el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para el uso en una o más realizaciones de ía presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, metabisulfito de sodio y las combinaciones de estos.
Un suríactante puede estar presente como excipiente. Los surfactantes ejemplares incluyen: polisorbatos, como "Tween 20" y "Tween 80," y plurónicos como F68 y F88 (ambos comercializados por BASF, Monte Olivo, Nueva Jersey), ésteres de sorbitán; lípidos, como fosfolipidos, como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposomal), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como el colesterol; y agentes quelantes, como EDTA, zinc y otros cationes adecuados. Ácidos o bases pueden estar presentes como excipientes en la composición. Los ejemplos no taxativos de ácidos que pueden utilizarse incluyen los ácidos que se seleccionan del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y las combinaciones de estos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, a modo no taxativo, las bases que se seleccionan del grupo formado por hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumarato de potasio y las combinaciones de estos.
La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el reactivo polimérico) en la composición variará en función de una serie de factores, pero, de manera óptima, será una dosis terapéuticamente efectiva cuando se almacene la composición en un envase de dosis de unidad (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica se puede contener en una jeringa. Una dosis terapéuticamente efectiva puede determinarse experimentalmente mediante la administración repetida de cantidades de conjugado cada vez mayores con el fin de determinar qué cantidad produce un resultado clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará en función de la actividad de excipiente y las necesidades particulares de la composición. En general, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a través de experimentos de rutina, es decir, mediante la preparación de composiciones que contengan diferentes cantidades del excipiente (que van de menor a mayor), el examen de la estabilidad y otros parámetros, y luego mediante la determinación del intervalo en el que un rendimiento óptimo se logra sin efectos adversos significativos.
Sin embargo, en general, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99% en peso, preferentemente de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 98% en peso, y más preferiblemente de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 95% en peso del excipiente, con concentraciones de menos del 30% en peso, en el mejor de los casos.
Los excipientes farmacéuticos anteriormente mencionados, junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), el "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipiente, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las composiciones abarcan todo tipo de formulaciones y, en particular, las adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilatos que pueden reconstituirse, así como líquidos. Los ejemplos de diluyentes adecuados para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección incluyen agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, solución salina tampopada con fosfato, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de estos. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se proporcionan soluciones y suspensiones.
En general, las composiciones de una o más realizaciones de la presente invención se administran, aunque no necesariamente, mediante inyección y por lo tanto son generalmente soluciones o suspensiones liquidas inmediatamente anteriores a la administración. El preparado farmacéutico también puede adoptar otras formas, como jarabes, cremas, ungüentos, comprimidos, polvos y similares. También se incluyen otros modos de administración, como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucósica, oral, por vía intratecal, subcutánea, intraarterial, y demás.
La invención también proporciona un método para administrar un conjugado como el proporcionado en la presente a un paciente que sufre una afección sensible al tratamiento con el conjugado. El método comprende administrar a un paciente, generalmente mediante inyección, una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado (preferentemente como parte de una composición farmacéutica). Como se ha descrito anteriormente, los conjugados pueden inyectarse (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea y parenteral). Los tipos adecuados de formulación para administración parenteral incluyen soluciones listas para la inyección, polvos secos para la combinación con un solvente antes de su uso, suspensiones listas para la inyección, composiciones secas insolubles para la combinación con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para disolución previa a la administración, entre otros.
El método de administración puede utilizarse para el tratamiento de cualquier afección que pueda corregirse y prevenirse mediante la administración del conjugado. Los entendidos en la técnica saben qué afecciones pueden tratarse con eficacia con un conjugado específico. Por ejemplo, los conjugados pueden utilizarse solos o en combinación con otra farmacoterapia para tratar pacientes con exposición a organofosfatos. De manera ventajosa, el conjugado puede administrarse al paciente antes, al mismo tiempo, o después de la administración de otro agente activo.
La dosis real que se administra varía según la edad, peso y estado general del individuo, asi como la gravedad de la enfermedad que padece, el juicio del profesional de la salud, y el conjugado administrando. Las cantidades terapéuticamente eficaces son conocidas por los entendidos en la técnica y/o se describen en los textos de referencia pertinentes y en la bibliografía. Por lo general, una cantidad terapéuticamente eficaz oscila entre aproximadamente 0.001 mg y 100 mg, preferentemente en dosis de 0.01 mg/dia a 75 mg/día y más preferentemente en dosis de 0.10 mg/día a 50 mg/dia. Se puede administrar periódicamente una dosis diaria hasta que, por ejemplo, los síntomas de intoxicación por organofosfato disminuyan y/o se eliminen por completo.
La unidad de dosificación de cualquier conjugado (nuevamente, preferentemente proporcionados como parte de un preparado farmacéutico) puede administrarse en una variedad de esquemas de dosificación en función de las recomendaciones de un facultativo, las necesidades del paciente, etc. El esquema de dosificación específico será conocido por los entendidos en la técnica o puede determinarse experimentalmente empleando métodos de rutina. Los esquemas de dosificación ejemplares incluyen, a modo no taxativo, la administración una vez al día, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana, dos veces por mes, una vez por mes y cualquier combinación de estos. Una vez que se logra el objetivo clínico, se detiene la dosificación de la composición.
Una de las ventajas de la administración de ciertos conjugados descritos en la presente es que las porciones individuales de polímero soluble en agua pueden escindirse cuando un enlace hidrópicamente degradable está incluido entre el residuo de la porción de colinesterasa y el polímero soluble en agua. Tal resultado es ventajoso cuando la eliminación del cuerpo es potencialmente un problema debido al tamaño del polímero. De manera óptima, se facilita la escisión de cada porción de polímero soluble en agua mediante el uso de enlaces fisiológicamente escindibles y/o enzimáticamente degradables como amida, carbonato o enlaces que contienen éster. De esta manera, la eliminación del conjugado (a través de escisión de porciones individuales del polímero soluble en agua) puede modularse mediante la selección del tamaño molecular del polímero y el grupo funcional tipo que proporcionaría las propiedades de eliminación deseadas. Un entendido en la técnica puede determinar el tamaño molecular adecuado del polímero, así como el grupo funcional escindible. Por ejemplo, un entendido en la técnica, mediante la experimentación de rutina, puede determinar un tamaño molecular adecuado y un grupo funcional escindible preparando, en primer lugar, una variedad de derivados de polímeros con pesos y grupos funcionales escindibles diferentes, obteniendo asi el perfil de eliminación (por ejemplo, a través de muestras de sangre u orina) mediante la administración del derivado de polímero a un paciente y la toma periódica de muestras de sangre y/o orina. Una vez obtenida una serie de perfiles de eliminación para cada conjugado probado, puede identificarse un conjugado adecuado.
Deberá entenderse que, si bien la invención se describió juntó con sus realizaciones especificas preferidas, la descripción anterior, así como los ejemplos posteriores pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes a los entendidos en la técnica a la que pertenece la invención.
Todos los artículos, libros, patentes y otras publicaciones citados en la presente se incorporan a esta en su totalidad a modo de referencia.
Parte experimental La práctica de la invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de síntesis orgánica, bioquímica, purificación de proteínas y similares, que entran en los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican en detalle en la bibliografía. Ver, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-lnterscience, 1992), supra.
En los siguientes ejemplos predictivos, se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se deben tener en cuenta ciertos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, la temperatura es en grados C y la presión es o está cercana a la presión atmosférica a nivel del mar. Se considera que cada uno de los siguientes ejemplos instruye a los entendidos en la técnica para realizar una o más de las realizaciones que se describen en la presente.
Se obtuvo una solución acuosa ( "solución madre") que contiene la porción de colinesterasa correspondiente a la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2, la secuencia de proteína madura, para utilizar en los ejemplos. La concentración de la solución madre varió entre 1 y 100 mg/mL.
Análisis SDS-PAGE Se analizaron muestras mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) utilizando el sistema Invitrogen NuPAGE y geles tris-acetato premoldeados Novex 3-8% (Invitrogen, Carisbad, CA). Se prepararon las muestras, se cargaron en el gel y se realizó la electroforesis según describe el fabricante.
Cromatografía de intercambio de aniones Se preparó una columna de intercambio de aniones Q-FF Sepharose (GE Healthcare) con un volumen de lecho de aproximadamente 100 mi, utilizando métodos estándar. Se conectó la columna a un sistema GE Healthcare (Chalfont St Giles, UK) AKTA básico o de nivel más alto para purificar los conjugados PEG-rChE preparados. Los detalles para el proceso de purificación se describen más adelante.
Análisis RP-HPLC Se realizó el análisis de cromatografía en fase inversa (RP-HPLC) en un sistema de HPLC Agilent (Santa Clara, CA) 1 100. Se analizaron las muestras utilizando una columna Agilent Zorbax 300SB-C8 (P/N 863973-906, 4.6 X 150 mm, 3.5 pm de tamaño de partícula, tamaño del poro 300 A). La velocidad de flujo de la columna fue de 0.5 ml/min. Las fases móviles fueron un 0.1 % de TFA en agua (solvente A) y un 0.1 % de TFA en acetonitrilo (solvente B).
EJEMPLOS 1A - 1D Conjugación mediante la cadena lateral de cisteína Según se estableció anteriormente, la conjugación de una porción de colinesterasa mediante una cadena lateral de cisteína que contiene tiol preserva de forma ideal los enlaces disulfuro existentes. Con respecto a la forma madura de butirilcolinesterasa, existe un único residuo de cisteína (Cys66) que es una cisteína no afectada por enlace disulfuro. Lockridge et al. (1987) J. Biol. Chem. 262(27): 12945-12952. Lockridge et al. también informa que esta cisteína no era modificable mediante alquilación, presumiblemente debido a que esta cisteína se encuentra "enterrada" en la estructura secundaria y terciaría de la proteína. Por lo tanto, la capacidad de conjugar en esta ubicación sería inesperada.
Los ejemplos 1A al 1 D se realizaron utilizando el abordaje general descrito a continuación.
Proteína I La forma recombinante de la proteína existe como un homodimero con las dos subunidades idénticas enlazadas mediante un único enlace disulfuro en Cys571 en cada subunidad. El método describe las condiciones para lograr un nivel relativamente alto de PEGilación mediante la adición de un reactivo por unidad de proteína monómera en condiciones bajo las cuales la proteína se mantiene como un dímero. De este modo, cada subunidad idéntica es esencialmente PEGilada en la posición Cys66 y no en la posición Cys571.
EJEMPLO 1A PEGilación de rBChE con un PEG 20kDa lineal portador de un grupo maleimida PEG 20kDa portador de un grupo maleimida (n definida para proporcionar un PEG ~20kDa) EJEMPLO 1A CONJUGADO (cada n definida para proporcionar un PEG ~20kDa) La concentración inicial de la solución madre de proteína butilcolinesterasa fue ±90 mg/mL y se disolvió la proteina en un tampón que contenía 10 mM de NaP04 (pH 7.4), 1 mM de EDTA y 35 mM de NaCI. Se diluyó un gramo de proteína (1 1 mL de la solución madre anterior) con 8.1 mL de tampón de dilución (2 mM de NaP04, 1 mM de EDTA (pH 7.4)) de modo que la concentración de proteína final fuera de 52-53 mg/mL.
Mientras se agitaba esta solución de proteína, se agregaron 0.74 mL de tampón Tris (1 M Tris, pH 8.2). A esto le siguió la adición de 0.238 mL de base Tris (1 M base Tris). El pH resultante de la solución fue un pH de 8.30.
En un recipiente separado se disolvió una cantidad de reactivo PEG, equivalente a 6 mol de la cantidad de proteina, en tampón de dilución PEG (2 mM de NaP04, 1 mM de EDTA, pH 6.1 ) a una solución de un 16.7% (p/v). Mientras se agitaba la solución de proteina se agregó la solución reactiva de PEG a la solución de proteína diluida. Esta mezcla se denomina de aquí en adelante como la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante seis horas a temperatura ambiente (22°C).
Después de este tiempo se hizo una segunda solución reactiva de PEG disolviendo una cantidad de reactivo PEG equivalente a 4 mol de la cantidad de proteina en el tampón de dilución PEG. Mientras se continuó agitando la reacción de PEGilación se agregó esta solución reactiva de PEG adicional a la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante otras 6- 8 horas a temperatura ambiente (22°C). Después se almacenó la reacción de PEGilación a 4°C hasta que los productos de la PEGilación se purificaron, pero generalmente dentro de las 48 horas.
EJEMPLO 1B PEGilación de rBChE con un PEG 30kDa lineal portador de un grupo maleimida PEG 30kDa portador de un grupo maleimida (n definida para proporcionar un PEG ~30kDa) EJEMPLO 1 B CONJUGADO (n definida para proporcionar un PEG ~30kDa) La concentración inicial de la solución madre de proteina butilcolinesterasa fue ±90 mg/mL y se disolvió la proteína en un tampón que contenia 10 mM de NaP04 (pH 7.4), 1 mM de EDTA y 35 mM de NaCI. Se diluyó un gramo de proteina (1 1 mL de la solución madre anterior) con 8.1 mL de tampón de dilución (2 mM de NaPO4, 1 mM de EDTA (pH 7.4)) de modo que la concentración de proteína final fuera de 52-53 mg/mL.
Mientras se agitaba esta solución de proteína, se agregaron 0.74 mL de tampón Tris (1 M Tris, pH 8.2). A esto le siguió la adición de 0.238 mL de base Tris (1 M base Tris). El pH resultante de la solución fue un pH de 8.30.
En un recipiente separado se disolvió una cantidad de reactivo PEG, equivalente a 6 mol de la cantidad de proteína, en tampón de dilución PEG (2 mM de NaP04l 1 mM de EDTA, pH 6.1 ) a una solución de un 16.7% (p/v). Mientras se agitaba la solución de proteina se agregó la solución reactiva de PEG a la solución de proteína diluida. Esta mezcla se denomina de aquí en adelante como la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante seis horas a temperatura ambiente (22°C).
Después de este tiempo se hizo una segunda solución reactiva de PEG disolviendo una cantidad de reactivo PEG equivalente a 4 mol de la cantidad de proteína en el tampón de dilución PEG. Mientras se continuó agitando la reacción de PEGilación se agregó esta solución reactiva de PEG adicional a la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante otras 6-18 horas a temperatura ambiente (22°C). Después se almacenó la reacción de PEGilación a 4°C hasta que los productos de la PEGilación se purificaron, pero generalmente dentro de las 48 horas.
EJEMPLO 1C PEGilación de rBChE con un PEG 40kDa ramificado portador de un grupo maleimida PEG 40kDa ramificado portador de un grupo maleimida (cada n definida para proporcionar un PEG ~20kDa) EJEMPLO 1C CONJUGADO (cada n definida para proporcionar un PEG ~20kDa) La concentración inicial de la solución madre de proteina butilcolinesterasa fue ±90 mg/mL y se disolvió la proteina en un tampón que contenía 10 mM de NaPO4 (pH 7.4), 1 mM de EDTA y 35 mM de NaCI. Se diluyó un gramo de proteína (11 mL de la solución mencionada anteriormente) con 8.1 mL de tampón de dilución (2 mM de NaPO4, 1 mM de EDTA (pH 7.4)) de modo que la concentración de proteína final fuera de 52-53 mg/mL.
Mientras se agitaba esta solución de proteina, se agregaron 0.74 mL de tampón Tris (1M Tris, pH 8.2). A esto le siguió la adición de 0.238 mL de base Tris (1 M base Tris). El pH resultante de la solución fue un pH de 8.30.
En un recipiente separado se disolvió una cantidad de reactivo PEG, equivalente a 6 mol de la cantidad de proteina, en tampón de dilución PEG (2 mM de NaP04, 1 mM de EDTA, pH 6.1) a una solución de un 16.7% (p/v). Mientras se agitaba la solución de proteina se agregó la solución reactiva de PEG a la solución de proteína diluida. Esta mezcla se denomina de aquí en adelante como la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante 6 horas a temperatura ambiente (22°C).
Después de este tiempo se preparó una segunda solución reactiva de PEG disolviendo una cantidad de reactivo PEG equivalente a 4 mol de la cantidad de proteína en el tampón de dilución PEG. Mientras se continuó agitando la reacción de PEGilación se agregó esta solución reactiva de PEG adicional a la reacción de PEGilación. Se dejó la reacción de PEGilación en agitación durante otras 6-18 horas a temperatura ambiente (22°C). Después se almacenó la reacción de PEGilación a 4°C hasta que los productos de la PEGilación se purificaron, pero generalmente dentro de las 48 horas.
EJEMPLO 1D PEGilación de rBChE con un PEG 60kDa ramificado portador de un grupo maleimída PEG 60kDa ramificado portador de un grupo maleimida (cada n definida para proporcionar un PEG ~30kDa) o H3C-(OCH2CH2)N-NH-C-0-CH2 O.
O O HC-OCH2 :H2-CH2-C-NH-CH2CH2-NH-C CH2-CH2-N H3C-(0CH2CH2)N-NH-C-0-CH2 EJEMPLO 1 D CONJUGADO (cada n definida para proporcionar un PEG ~30kDa) La concentración inicial de la solución madre de proteina butilcolinesterasa fue ±90 mg/mL y se disolvió la proteína en un tampón que contenia 10 mM de NaP04 (pH 7.4), 1 mM de EDTA y 35 mM de NaCI. Se diluyó un gramo de proteína (1 1 mL de la solución madre anterior) con 8.1 mL de tampón de dilución (2 mM de NaP04, 1 mM de EDTA (pH 7.4)) de modo que la concentración de proteína final fuera de 52-53 mg/mL.
Mientras se agitaba esta solución de proteína, se agregaron 0.74 mL de tampón Tris (1 M Tris, pH 8.2). A esto le siguió la adición de 0.238 mL de base Tris (1 M base Tris). El pH resultante de la solución fue un pH de 8.30.
En un recipiente separado se disolvió una cantidad de reactivo PEG, equivalente a 6 mol de la cantidad de proteina, en tampón de dilución PEG (2 mM de NaP04, 1 mM de EDTA, pH 6.1 ) a una solución de un 16.7% (p/v). Mientras se agitaba la solución de proteina se agregó la solución reactiva de PEG a la solución de proteína diluida. Esta mezcla se denomina de aquí en adelante como la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante seis horas a temperatura ambiente (22°C).
Después de este tiempo se preparó una segunda solución reactiva de PEG disolviendo una cantidad de reactivo PEG equivalente a 4 mol de la cantidad de proteína en el tampón de dilución PEG. Mientras se continuó agitando la reacción de PEGilación se agregó esta solución reactiva de PEG adicional a la reacción de PEGilación. Se dejó agitar la reacción de PEGilación durante otras 6- 18 horas a temperatura ambiente (22°C). Después se almacenó la reacción de PEGilación a 4°C hasta que los productos de la PEGilación se purificaron, pero generalmente dentro de las 48 horas.
EJEMPLO 2 Condiciones de PEGilación alternativas que logran un rendimiento de PEGilación de un 65-70% utilizando mPEG-40k-maleimida El tiempo de reacción para esta reacción de PEGilación fue de seis días a 0°C agitando con una barra de agitación magnética y una placa.
Se agregó reactivo PEG a una solución madre en modo de lote, agitando y agregando el equivalente a 1 mol de reactivo PEG seco cada día según se muestra en el Cuadro 4, a continuación.
A los efectos de lograr un nivel alto de PEGilación (es decir; > a un 65% de PEGilación con respecto al monómero), se mantuvo la concentración de la proteína en el nivel más alto posible. Bajo estas, condiciones, la mezcla de reacción era "lechosa/nubosa" debido a la formación de agregados de proteína reversibles. Sin embargo, si se agregaba más del equivalente a un mol de PEG sin una dilución mínima de la reacción de PEGilación, la agregación era demasiado grande (determinado empíricamente) y la eficacia de la PEGilación se reducía. Por lo tanto, antes de la adición de PEG seco, la reacción de PEGilación se diluyó con tampón según se muestra en el Cuadro 4, a continuación.
Para las adiciones de reactivo PEG donde también se agregó tampón de dilución de reacción, el reactivo PEG también se podía disolver en el tampón antes de agregar la mezcla de la reacción de PEGilación.
La proteina se disolvió en tampón que contenia 10 mM de NaP04 (pH 7.3), 1 mM de EDTA y 35 mM de NaCI (tampón de dilución de reacción) en una concentración inicial de 83 mg/mL y las cantidades de reacción a continuación describen la PEGilación de 20 gramos de proteína rhBChE en un volumen inicial de 241 ml_.
La adición de tampón y reactivo PEG se realizaron a temperatura ambiente según las especificaciones establecidas en el Cuadro 4.
CUADRO 4 Descripción de las adiciones Después de esta reacción se purificó la proteina PEGilada según se describe en el ejemplo 3.
EJEMPLO 3 Purificación de dímero di-PEGilado El método de PEGilación descrito en los ejemplos 1 A-1 D y 2 genera una solución de proteína donde un 65 a un 70% de la proteína es PEGilada con respecto a la forma de monómero de la proteína. Se analizó la reacción de PEGilación mediante RP-HPLC después de que la proteína se redujo a monómero. Sin embargo, la forma biológica deseada de esta reacción fue el dímero di-PEGilado y la reacción de PEGilación no produjo un dímero completamente PEGilado. El nivel de PEGilación podría aumentarse marginalmente mediante otras adiciones de reactivo PEG, pero en última instancia el aumento moderado en la PEGilación sería iniciado por el costo aumentado del reactivo PEG. El análisis de mezclas de reacción mostró que aproximadamente un 50% de la mezcla de reacción era en la forma de un dímero mono-PEGilado y un 45% en la forma de un dímero di-PEGilado. Además, después de la purificación, solo se pudo recuperar entre un 30 y un 35% del dímero di-PEGilado. El nivel de recuperación era demasiado bajo para un proceso económicamente viable.
Por lo tanto se describe un método en el cual esencialmente toda la forma de monómero mono-PEGilado de la proteína que estaba presente en la fracción dímero mono-PEGilado se podría recuperar y convertir en un dímero di-PEGilado. Este método posibilitó un rendimiento total del proceso comprendido entre al menos un 55 y un 60%.
Para la purificación de 1 gramo de reacción de PEGilación, se cargó una columna de intercambio aniónico de 22mm de diámetro (Q-sefarosa de flujo rápido) (utilizando métodos conocidos por los entendidos en la técnica) de modo que el volumen del lecho resultara en 5 mg/mL de carga proteica. Se equilibró la columna en el tampón de cromatografía A (10 mM de NaP04 (pH 7.8), 1 mM de EDTA, 5 mM de cisteína).
La proteina en la reacción de PEGilación se redujo a la forma de monómero mediante la adición de un volumen de reacción de PEGilación de tampón reductor (10 mM de NaP04 (pH 7.8), 1 mM de EDTA, 20 mM de cisteína) e incubando a temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, se agregaron siete volúmenes de reacción de PEGilación de tampón de cromatografía A y un volumen de reacción de PEGilación de agua, obteniendo una reacción de PEGilación 10 veces más diluida que la original.
Se programó un instrumento apropiado de cromatografía de modo que toda la reacción de PEGilación diluida se cargara en la columna y se lavó cualquier proteina no unida con dos volúmenes de lecho de columnas de tampón de cromatografía A. A continuación, se utilizaron varios gradientes escalonados para eluir el monómero PEGilado de BChE.
La etapa de gradiente 1 fue un gradiente continuo de un 0 a un 25% de tampón de cromatografía B (equivalente al tampón A pero que contiene también NaCI 0.5 M), sobre 2.5 volúmenes de lecho. Se recogieron las fracciones.
La etapa de gradiente 2 fue una etapa de mantenimiento a un 25% de tampón B para 2.5 volúmenes de lecho. Se recogieron las fracciones.
La etapa de gradiente 3 fue una etapa directa a un 100% B seguida por una etapa de mantenimiento a 100% B (etapa de gradiente 4) para 2 volúmenes de lecho. Se recogieron las fracciones.
El monómero mono-PEGilado se eluyó sobre un pico ancho durante las etapadas de gradiente 1 y 2. El monómero no PEGilado se eluyó durante la etapa de gradiente 4.
La columna se regeneró utilizando métodos estándar.
Se reunieron las fracciones apropiadas y se intercambiaron/concentraron en un tampón utilizando filtración del flujo tangencial (TFF) y métodos estándar como describe el fabricante de las unidades de filtración.
La solución de monómero mono-PEGilada se concentró mediante TFF en una concentración de proteina de 25 mg/mL y se aplicaron siete cambios de volumen de tampón TFF (10 mM de NaP04 (pH 7.5), 1 mM de EDTA, 35 mM de NaCI). Mediante filtración se esterilizó la solución utilizando una unidad de filtración de 0.22 pm.
En este punto, se había retirado la cisteína utilizada para reducir la proteína a monómero (mediante el proceso TFF) de la solución de proteina y la incubación a temperatura ambiente durante 48 horas seguida del almacenamiento a 4°C permitió que se regenerara la forma dímera de la proteina. El producto final por lo tanto fue la forma dímera di-PEGilada de la proteína.
EJEMPLO 4 PEGilación de rChE con derivado de mPEG-N-hidroxisuccinimida ramificada, 40kDa Las reacciones de PEGilación están diseñadas de tal modo que después de la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rChE sea 2.5 mg/ml. Se calienta a temperatura ambiente el PEG2-NHS, 40kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. Se pesa una cantidad del reactivo PEG equivalente a 10-50 mol del rChE que se quiere PEGilar y se disuelve en 20mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7.5) y 1 mM de EDTA para formar una solución reactiva de un 12%. La solución reactiva de PEG al 12% se agrega rápidamente a la alícuota de solución rChE madre y se agita durante 3 - 18 horas a temperatura ambiente para permitir el acoplamiento del mPEG2-NHS con el rChE mediante un enlace amida, lo que resulta en una solución conjugada. Se inactiva la solución conjugada con una solución de lisina (pH 7.5) de modo que la concentración molar final de lisina es 10 - 100 veces la concentración molar del reactivo PEG.
Se encontró que el mPEG2-NHS proporciona un volumen molecular relativamente grande de éster N-hidroxisuccinimida activo ("NHS"), que reacciona selectivamente con la lisina y la aminas terminales.
Utilizando este mismo abordaje, se preparan otros conjugados utilizando mPEG2-NHS que tienen otros pesos moleculares medios en peso.
Los conjugados que utilizan PEG2-NHS, 40kDa, se prepararon esencialmente de conformidad con el procedimiento establecido en este ejemplo, donde se utilizó PEG2-NHS, 40kDa, equivalente a 10, 25 y 50 mol en tres intentos por separado. En la FIG. 1 se proporciona el análisis SDS -PAGE de las soluciones conjugadas resultantes.
EJEMPLO 5 PEGilación de rChE con derivado de mPEG-butiraldehído lineal, 30kDa o CH30- CH2CH2o— C- H- cH2CH20:)-CH2CH2CH2CHO Derivado de mPEG-butiraldehido lineal, 30kDa ("mPEG-butirALD") Las reacciones de PEGilación están diseñadas de tal modo que después de la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rChE sea de 2.5 mg/ml. Se calienta a temperatura ambiente el mPEG-ButirALD, 30kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. Se pesa una cantidad del reactivo PEG equivalente a 10-50 mol del rChE que se quiere PEGilar y se disuelve en 20mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7.5) y 1 rtiM de EDTA para formar una solución reactiva al 12%. La solución reactiva de PEG al 12% se agrega a la alícuota de solución rChE madre y se agita durante 15-30 minutos. Luego se agrega un agente reductor, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3), a 10-100 de exceso molar en relación con el reactivo PEG y se agita la reacción durante 5- 18 horas a temperatura ambiente para asegurar el acoplamiento mediante un enlace amina secundario para formar de ese modo una solución conjugada.
Se encontró que el grupo aldehido de mPEG-ButirALD reacciona con las aminas primarias asociadas con el rChE y se une covalentemente a estas mediante aminas secundarias al reducirlas mediante un reactivo reductor como cianoborohidruro de sodio.
Utilizando este mismo abordaje, se preparan otros conjugados utilizando mPEG-ButirALD que tiene otros pesos moleculares medios en peso.
Los conjugados que utilizan mPEG2-ButirALD, 30kDa, se prepararon esencialmente de conformidad con el procedimiento establecido en este ejemplo donde se utilizó mPEG-ButirALD, 30kDa, equivalente a 0, 25 y 50 mol en tres intentos por separado. En la FIG. 1 se proporciona el análisis SDS -PAGE de las soluciones conjugadas resultantes.
EJEMPLO 6 PEGilación de rChE con derivado de mPEG-butiraldehído ramificado, 40kDa Derivado de mPEG-butiraldehído ramificado, 40kDa ("mPEG2-butirALD") Las reacciones de PEGilación están diseñadas de tal modo que después de la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rChE sea de 2.5 mg/ml. Se calienta a temperatura ambiente el mPEG2-ButirALD, 40kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. Se pesa una cantidad del reactivo PEG equivalente a 10-50 mol del rChE que se quiere PEGilar y se disuelve en 20mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7.5) y 1 mM de EDTA para formar una solución reactiva al 12%. La solución reactiva de PEG al 12% se agrega a la alícuota de solución rChE madre y se agita durante 15-30 minutos. Luego se agrega un agente reductor, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3), a 10-100 de exceso molar en relación con el reactivo PEG y se agita la reacción durante 5- 18 horas a temperatura ambiente para asegurar el acoplamiento mediante un enlace amina secundario para formar de ese modo una solución conjugada. encontró que el grupo aldehido de mPEG2-ButirALD reacciona con las aminas primarias asociadas al rChE y se une • covalentemente a estas mediante aminas secundarias al reducirlas mediante un reactivo reductor como cianoborohidruro de sodio.
Utilizando este mismo abordaje, se preparan otros conjugados utilizando mPEG2-ButirALD que tienen otros pesos moleculares medios en peso.
Los conjugados que utilizan mPEG2-ButirALD, 40kDa, se prepararon sustancialmente de conformidad con el procedimiento establecido en este ejemplo donde se utilizó mPEG2-ButirALD, 40kDa, equivalente a 10, 25 y 50 mol en tres intentos por separado. En la FIG. 1 se proporciona el análisis SDS -PAGE de las soluciones conjugadas resultantes.
EJEMPLO 7 PEGilación de rChE con derivado de mPEG-succinimidil a- metilbutanoato lineal, 30kDa Derivado de mPEG-succinimidil a-metilbutanoato lineal, 30kDa ("mPEG-SMB") Las reacciones de PEGilación están diseñadas de tal modo que después de la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rChE sea de 2.5 mg/ml. Se calienta a temperatura ambiente el mPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. Se pesa una cantidad del reactivo PEG equivalente a 10-50 mol del rChE que se quiere PEGilar y se disuelve en 20mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7.5) y 1 mM de EDTA para formar una solución reactiva al 12%. La solución reactiva de PEG al 12% se agrega a la alícuota de solución rChE madre y se agita durante 5-18 horas a temperatura ambiente resultando así en una solución conjugada. Se inactiva la solución conjugada con una solución de lisina (pH 7.5) de modo que la concentración molar final de lisina es 10 - 100 veces la concentración molar del reactivo PEG.
Se encontró que el derivado de mPEG-SMB proporciona un éster NHS esténicamente impedido, activo, que reacciona selectivamente con la lisina y las aminas terminales.
Utilizando este mismo abordaje, se preparan otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tienen otros pesos moleculares medios en peso.
EJEMPLO 8 PEGilación de rChE con mPEG-PIP, 20kDa A continuación se proporciona la estructura básica del reactivo polimérico: CH30-(CH2CH20)nCH2CH2- CH30-(CH2CH20)nCH2CH2 (forma hidratada) Las reacciones de PEGilación están diseñadas de tal modo que después de la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rChE sea de 2.5 mg/ml. Se calienta a temperatura ambiente el mPEG-PIP, 20kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. Se pesa una cantidad del reactivo PEG equivalente a 10-50 mol del rChE que se quiere PEGilar y se disuelve en 20mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7.5) y 1 mM de EDTA para formar una solución reactiva al 12%. La solución reactiva de PEG al 12% se agrega a la alícuota de solución rChE madre y se agita durante 15-30 minutos. Luego se agrega un agente reductor, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3), a 10-100 de exceso molar en relación con el reactivo PEG y se agita la reacción durante 5-18 horas a temperatura ambiente para asegurar el acoplamiento mediante un enlace amina secundario (a un carbono secundario) para formar de ese modo una solución conjugada. Se inactiva la solución conjugada con una solución de lisina (pH 7.5) de modo que la concentración molar final de lisina es 10 - 100 veces la concentración molar del reactivo PEG.
Se encontró que el grupo cetona de mPEG-PIP reacciona con las aminas primarias asociadas al rChe y se une covalentemente a estas mediante una amina secundaria al reducirlo mediante un reactivo reductor como cianoborohidruro de sodio.
Utilizando este mismo abordaje, se preparan otros conjugados utilizando mPEG-PIP que tienen otros pesos moleculares medios en peso.
EJEMPLO 9 Actividad de conjugados de (rChE)-PEG ejemplares Se determinan las actividades de los conjugados de (rChE)-PEG descritos en los ejemplos anteriores. Se cree que todos los conjugados rChE son farmacológicamente activos.

Claims (32)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, en donde el residuo de la porción de colinesterasa está unido covalentemente al polímero soluble en agua a través de un residuo de cisteína en el residuo de la porción de colinesterasa.
2.- Un conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, en donde el polímero soluble en agua, antes de unirse covalentemente, es un reactivo polimérico portador de un grupo maleimida.
3.- Un conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, en donde el polímero soluble en agua es un polímero soluble en agua ramificado.
4 - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 y 3, caracterizado además porque la porción de colinesterasa es acetilcolinesterasa.
5.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 y 3, caracterizado además porque la porción de colinesterasa es butirilcolinesterasa.
6.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 y 3, caracterizado además porque la porción de colinesterasa se prepara de forma recombinante.
7. - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizado además porque el polímero soluble en agua es un polímero seleccionado del grupo conformado por poli(óxido de alquileno), poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina y poli(acriloilmorfolina).
8. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el polímero soluble en agua es un poli(óxido de alquileno).
9. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el poli(óxido de alquileno) es un poli(etilenglicol).
10 - El conjugado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) tiene extremos terminados con una porción de extremo terminal seleccionada del grupo conformado por hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.
1 1 - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado además porque el polímero soluble en agua del poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio en peso en el intervalo de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 100.000 daltons.
12.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el residuo de cisteína en el residuo de la porción de colinesterasa corresponde a Cys66 de butirilcolinesterasa.
13 - El conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el reactivo polimérico portador de un grupo maleimida tiene la siguiente estructura: H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH- H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH- donde: X es una porción espaciadora compuesta de uno o más átomos, y cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de aproximadamente 2 a aproximadamente 4.000.
14 - El conjugado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el reactivo polimérico portador de un grupo maleimida tiene la siguiente estructura: o H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-0-CH2 0 O I I! II HC-OCH2-CH2 CH2-C-NH-CH2CH2-NH-C CH2-CH2 n I H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-0-CH2 donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de aproximadamente 225 a aproximadamente 1.930.
15.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque cada (n) se define a modo de proporcionar -(OCH2CH2)- que tenga un peso molecular de aproximadamente 20kDa.
16 - El conjugado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el polímero soluble en agua ramificado incluye la siguiente estructura: H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C-0 - O H3CO-(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-C -0-1 donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 4.000.
17 - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque tiene la siguiente estructura: donde: cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 4.000; X es una porción espaciadora compuesta de uno o más átomos, y ChE es un residuo de una porción de colinesterasa. El conjugado de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque tiene la siguiente estructura: H3C -(0CH2CH2)n-NH- H3C -(0CH2CH2)n-NH- donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a
4.000.
19. - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado además porque el conjugado tiene de uno a dos polímeros solubles en agua unidos al residuo de la porción de colinesterasa.
20. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el conjugado tiene dos polímeros solubles en agua unidos al residuo de la porción de colinesterasa.
21. - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado además porque el residuo de la porción de colinesterasa está en forma de un dímero derivado de dos porciones de colinesterasa separadas.
22. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el conjugado tiene dos polímeros solubles en agua unidos al residuo de la porción de colinesterasa, un polímero soluble en agua unido a cada una de las colinesterasas que forman el dímero.
23. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el reactivo polimérico portador de un grupo maleimida tiene un único grupo maleimida.
24. - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado además porque la porción de colinesterasa está glicosilada.
25. - Un conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, en donde el conjugado está en una forma aislada y monoPEGilada.
26 - Un conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, en donde el polímero soluble en agua, antes de unirse covalentemente, es un reactivo polimérico portador de un grupo maleimida.
27.- Un conjugado que comprende un residuo de una porción de colinesterasa unida covalentemente a un polímero soluble en agua, en donde la porción de colinesterasa es una porción de colinesterasa precursora.
28 - Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
29 - Un método para hacer un conjugado que comprende poner en contacto, bajo condiciones de conjugación, una porción de colinesterasa con un reactivo polimérico portador de un grupo funcional reactivo tiol.
30 - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la etapa de contacto se realiza a un pH mayor a 8.0.
31 - Un método para hacer un conjugado que comprende, (a) combinar, bajo condiciones de conjugación, una composición reactiva que comprende varias moléculas reactivas poliméricas selectivas de tiol con una composición de porción de colinesterasa que comprende varias moléculas de porción de colinesterasa, estando cada molécula en forma de un dimero para formar una mezcla de conjugado que comprende dimeros monoconjugados y dimeros diconjugados; (b) someter la mezcla de conjugado a condiciones de reducción para formar una mezcla reducida que comprende monomeros no conjugados reducidos y monomeros monoconjugados reducidos; (c) separar los monomeros monoconjugados reducidos de la mezcla reducida para formar una composición que comprende monomeros monoconjugados reducidos; y (d) retirar las condiciones reductoras de la composición que comprende monomeros monoconjugados reducidos para formar asi una composición de dimeros diconjugados.
32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la composición que comprende monomeros monoconjugados reducidos está sustancialmente libre de monomeros no conjugados reducidos.
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