MX2009013369A - Ingenieria de tejidos para la formacion de cemento radicular, hueso, dentina, cartilago y ligamento periodontal mediante la utilizacion de la proteina humana del cemento 1 (cemp-1). - Google Patents

Abstract

La presente invención se basa en una formulación farmacéutica para la inducción en la formación de hueso, cemento, dentina ycartílago y ligamento periodontal, compuesta de un polímero biodegradable (ácido poliláctico co-glicólico) (PLGA), con una estructura porosa tridimensional con poros entre 100-200 µm de diámetro en conjunto ya sea con proteína recombinante humana del cemento 1 (CEMP-1) o con un plásmido conteniendo la información génica de CEMP-1 y la inducción de células del ligamento periodontal cultivadas in vitro para inducirlas a formar cartílago, hueso, dentina y cemento tanto in vitro como in vivo. Palabras Clave: PLGA, Proteína del cemento 1 (CEMP-1), osteogénesis, regeneración periodontal, cartílago, cemento, terapia génica.

Description

INGENIERÍA DE TEJIDOS PARA LA FORMACIÓN DE CEMENTO RADICULAR, HUESO, DENTINA, CARTÍLAGO Y LIGAMENTO PERIODONTAL MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA HUMANA DEL CEMENTO 1 (CEMP-1) Descripción de la invención Campo Técnico La presente invención se relaciona con los procedimientos y tratamientos utilizados para favorecer la cicatrización de fracturas, regeneración ósea y de las estructuras anatómicas y funcionales que conforman el periodonto. Más específicamente se relaciona con el uso de la proteína recombinante del cemento humana (CEMP-1) o un vector de plásmido conteniendo el gen de la proteína del cemento 1 (CEMP-1) junto con un andamio tridimensional de un polímero biodegradable (ácido poliláctico co-glicólico, PLGA) en una formulación farmacéutica para favorecer la inducción de la formación de hueso, cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago tanto in vivo como in vitro, facilitando la cicatrización de fracturas, regeneración ósea y de las estructuras anatómicas y funcionales que conforman el periodonto.

Antecedentes La ingeniería de tejidos ha emergido como un medio potencial para regenerar o crecer tejidos funcionales para el reemplazo de aquellos que se han perdido debido a trauma y/o enfermedad. El tratamiento de defectos óseos asociado con la no-unión de fracturas y morbilidad de hueso como resultado de trauma o cáncer es un reto de gran importancia en la medicina ortopédica, la odontología y cirugía plástica. Más del 85% de la población mundial requiere reparación o reemplazo de una estructura craneofacial (Bishop GB, Einhorn TA. Current future clinical applications of bone morphogenetic proteins in orthopaedic trauma surgery. International orthopaedics 31 : 721-727, 2007). Estos defectos van de la simple pérdida de uno o más órganos dentarios a la resección craneofacial radical. Las lesiones traumáticas o del desarrollo y/o congénitas, así como los impedimentos de la médula espinal ocurren frecuentemente en la sociedad occidental con una prevalencia del 60% al 80% y son la causa más común de discapacidad en la población mayor de 45 años. Dichas lesiones representan la mitad de los impedimentos músculo-esqueléticos e incluyen la osteoartritis y la enfermedad degenerativa de los discos articulares (DDD), la cual es responsable del dolor crónico de la espalda y es una de las mayores causas de incapacidad de la población adulta en el mundo (Chubynscaya S, Hurtig M, Rueger DC. OP-l/BMP-7 in cartilage repair. International Orthopaedics 31 : 773-781, 2007). Por lo tanto, la regeneración de las estructuras bucales, craneofaciales y de otros tejidos mineralizados representa un reto formidable que requiere de la síntesis de la ciencia básica, clínica y tecnológica para la ingeniería de tejidos. La identificación de andamio s y/o acarreadores apropiados, tipos celulares y señales moleculares en tiempo y espacio (tríada de ingeniería de tejidos) es entonces necesaria para optimizar el desarrollo de tejidos, ¡nterfases y/o órganos híbridos como el periodonto, el cual requiere del crecimiento de hueso, cemento radicular y ligamento periodontal. Las limitaciones de las terapias actuales han llevado al desarrollo de la ingeniería de tejidos para lograr la regeneración de tejidos mineralizados.

Estas alternativas generalmente se enfocan en la liberación de factores de crecimiento osteoinductivos, utilizando la liberación directa de proteína o alternativas de terapia génica, la implantación de células osteogénicas o la combinación de estas alternativas terapéuticas para promover la regeneración ósea. Sin embargo, las alternativas terapéuticas utilizando terapia génica para liberar moléculas en los defectos óseos incluyen la modificación génica ex vivo de células que son subsecuentemente transplantadas, la inyección de vectores virales conteniendo moléculas bioactivas y otra alternativas basadas en plásmidos de ADN (Huang YC, Simmons C, Kaigler D, Rice KG, Mooney DJ. Bone regeneration in rat calvarial defect with delivery of PEI-condensed plasmid DNA encoding for bone morphogenetic protein-4 (BMP-4). Gene Therapy 12:418-426, 2005). Alternativamente, la terapia génica utilizando factores de crecimiento osteogénicos promete ser una alternativa efectiva para el tratamiento de los defectos y enfermedades que afectan a los tejidos mineralizados. Se han descrito varias moléculas que poseen actividad osteoinductiva incluyendo principalmente diversas proteínas morfogenéticas tales como BMP2, BMP4 y BMP7 (proteínas morfogenéticas del hueso), (Gysin R, Wergedal JE, Sheng MH-C et al, Ex vivo gene therapy with stromal cells transduced with retroviral vector containing the BMP4 gene completely heals critical size calvarial defect in rats. Gene Therapy 9: 991-999, 2002), que han demostrado inducir la reparación/regeneración de tejidos mineralizados. La liberación directa de vectores virales conteniendo moléculas bioactivas preocupa desde el punto de vista de la reacción inmunológica del huésped, la expresión incontrolada del producto génico y la alteración del genoma. La liberación de plásmidos de ADN se ha empleado para promover la formación de tejido en diversos modelos, tales como hueso, cartílago, tejido nervioso y cicatrización (Pannier AK, Shea LD. Controlled reléase systems for DNA delivery. Mol Ther 10: 19-26, 2004).

La aplicación exitosa de alternativas de terapia génica no-viral en la regeneración ósea, de cartílago, cemento y ligamento periodontal se fundamenta en un sistema apropiado de liberación. Biomateriales naturalmente derivados como la colágena, matriz ósea desmineralizada, materiales inorgánicos como la hidroxiapatita y materiales sintéticos biodegradables tales como PLGA (ácido poliláctico co-glicólico) constituyen una alternativa como acarreadores o andamios de moléculas bioactivas, de ADN plasmídico conteniendo la información génica de moléculas bioactivas y de células genéticamente modificadas in vitro para su aplicación en la terapia génica ex vivo (Finkemeirr CG. Bone grafting and bone graft substitute. J Bone Joint Surg 84: 454-464, 2002; Kimelman N, Pelled G, Helm GA et al., Review: gene and stem cell-based therapeutics for bone regeneration and repair. Tissue Eng 13: 1135-1150, 2007). La degradación de PLGA in vivo se ve precedida por la hidrólisis y ni el PLGA ni sus productos de degradación se asocian a la inflamación, daño tisular local o toxicidad local o sistémica in vivo (Wong WH, Mooney DJ. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineenng. In: Atala A, Mooney D, (Eds). Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston, MA: Birkhauser; 1997. p 5182).

Estos procedimientos se llevan a cabo para incrementar la cicatrización de fusiones de la espina dorsal, defectos óseos, fracturas de huesos largos y aumento en la reconstrucción esquelética en el tratamiento de condiciones y lesiones maxilofaciales. Las alternativas terapéuticas incluyen injertos autólogos óseos (con la condición de incremento de dolor posoperatorio), osteogénesis de distracción, desplazamiento de segmentos óseos (Haidar ZS, Hamdy RC, Tabrizian M. delivery od recombinante bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part B: Delivery systems for BMPs in orthopaedic and craniofacial tissue engineenng. Biotechnol Lett 31: 1825-1835, 2009), y biomateriales sintéticos tales como, fosfato de calcio, sulfato de calcio, hidroxiapatita y compuestos de colágena-fosfato de calcio. Otros materiales utilizados son el hueso alogénico en combinación con médula ósea para el manejo de desplazamientos óseos y pérdida de sustancia, sin embargo, su eficacia es menor que el hueso autólogo por si mismo (Bishop GB, Einhorn TA. Current future clinical applications of bone morphogenetic proteins in orthopaedic trauma surgery. International orthopaedics 31: 721- 727, 2007). El hueso humano desmineralizado es de uso común y comercialmente disponible, sin embargo, cuando se utiliza solo, su eficacia ha fracasado para demostrar la eficacia equivalente del hueso autólogo (Bishop GB, Einhorn TA. Current future clinical applications of bone morphogenetic proteins in orthopaedic trauma surgery. International orthopaedics 31 : 721-727, 2007). Factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y los factores de crecimiento parecidos a la insulina (IGF-I, IGF-II), están bajo investigación por su papel terapéutico potencial en el incremento de la cicatrización de tejidos músculo-esqueléticos. Se ha demostrado que estas moléculas señalizadoras promueven la proliferación y diferenciación celular en sistemas in vitro e incrementan la reparación esquelética en modelos animales. Sin embargo, ninguna posee propiedades inductivas y por lo tanto no son mitogénicas para células troncales indiferenciadas.

En años recientes se han desarrollado diversos materiales para la liberación controlada de de proteínas humanas recombinantes, como las proteínas morfogenéticas de hueso en fórmulas basadas en la colágena como material acarreador o andamio. Sólo las proteínas recombinantes humanas BMP-2 y BMP-7/OP1 han obtenido la aprobación para su uso clínico en humanos por la FDA (Federal and Drug Administration, USA) y ésta se limita únicamente a aplicaciones ortopédicas y de fusión de la columna vertebral. Asimismo, la administración de BMP-2 y BMP-7/OP1 mejora significativamente los estados iniciales de reparación de cartílago. Sin embargo, se requieren grandes dosis o aplicaciones múltiples para lograr el efecto osteogénico deseado. Por otra parte, estas proteínas poseen una vida media de 1 a 4 horas, lo cual significa que una dosis de aplicación exógena de BMP es equivalente a la cantidad endógena presente en 1000 seres humanos. Lo anterior representa una seria preocupación respecto a su seguridad y costo (Kwon B, Jenis LG. Carrier materials for spinal fbsion. Spine J;5(6 Suppl):224S-230S, 2005). Concentraciones suprafisiológicas como resultado de una cinética de liberación imperfecta de BMPs donde el 30% del encapsulado es perdido en la fase inicial, se han relacionado adicionalmente a complicaciones clínicas severas incluyendo hematomas generalizados en tejido blando y resorción ósea peri-implante (Gautschi OP, Frey SP, Zellweger R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. ANZ J Surg 77: 626-631, 2003; Bessa PC, Casal M, Reis RI. Boné morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from laboratory to the clinic. Part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med 2: 1.13, 2008).

Otro efecto colateral de la administración de BMP promueve crecimiento óseo excesivo lo que trae como consecuencia la presión sobre el tracto gastrointestinal y raíces nerviosas, y son inductores potentes de la calcificación arterial lo que puede predisponer a los individuos recipientes a complicaciones serias como ateromas o trombosis.

El periodonto es la unidad fisiológica y estructural que ancla el diente en el alvéolo dentario y consiste de fibras periodontales que se insertan en el hueso alveolar y en la superficie del cemento radicular. El tejido conectivo gingival y el epitelio cubren el hueso alveolar y forman la unión dentogingival en la interfase con el diente. La estructura compleja del periodonto, que consiste de tejidos conectivos blandos, como la encía y el ligamento periodontal, y de tejidos mineralizados tales como el cemento radicular y hueso, hace de la regeneración de estas estructuras un proceso único de cicatrización. La regeneración del aparato de inserción que es destruido debido a la enfermedad periodontal, es el objetivo ulterior de la terapéutica periodontal (Lynch SE. Introduction in: S E. Lynch, R.J. Genco, R E. Marx (Eds). Tissue engineering applications in maxillofacial surgery and periodontics. Quintessence Publishing Carol Stream, Illinois, 1999, pp-xi-xii). Dicha regeneración requiere de nueva inserción del tejido conectivo a la superficie radicular, un proceso que involucra regeneración de fibras periodontales y su inserción en el cemento radicular formado de novo. Desafortunadamente las alternativas terapéuticas disponibles a la fecha son clínicamente impredecibles y resultan en una regeneración parcial (Zohar R, Tenenbaum HC. How predictable are periodontal regenerative procedures?. J Can Dent Assoc 71 :675-680, 2005). Aunque las células que residen en el ligamento periodontal pueden llevar a cabo el proceso de regeneración (Ivanovski S, Haase HR, Bartold PM Expression of bone matrix protein mRNAs by primary and cloned cultures of the regenerative phenotype of human periodontal fibroblasts. J Dent Res 80: 1665-1671, 2001) es necesario identificar su localización y, de manera importante, marcadores biológicos que induzcan su proliferación y diferenciación.

El hueso es un tejido mineralizado que contiene células en su interior (osteocitos) y aporte sanguíneo directo. Posee una resistencia similar al acero a pesar de que pesa un tercio de este. Esta propiedad es atributo de los principios de ingeniería debido a su construcción tubular, su laminado y el re-enforzamiento interno de su matriz. Sus propiedades hacen de este un tejido dinámico, de constante renovación en respuesta a las influencias mecánicas, nutricionales y hormonales. El hueso provee una cubierta protectora para el cerebro, medula espinal y visceras torácicas. Asimismo, es el sitio de anclaje de los órganos dentarios en los alvéolos maxilares y mandibulares.

El cemento radicular es un tejido conectivo mineralizado único, ya que carece de aporte sanguíneo directo, inervación y drenaje linfático. A diferencia del hueso, no sufre procesos de remodelado fisiológico. El cemento radicular provee la interfase a través de la cual la superficie radicular se ancla a las fibras colágenas de Sharpey del ligamento periodontal. En base a la ausencia o presencia de células y al origen de las fibras colágenas, se reconocen dos tipos de cemento: acelular y celular (Bosshardt DD, Selvig KA, Dental d cementum: the dynamic tissue covering the root. Periodontology 2000 13: 41 75, 1997). Asimismo, la matriz del cemento consiste de colágenas tipo I y III, osteopontina, sialoproteína ósea, osteocalcina, fibronectina, vitronectina y factores de crecimiento tales como TGFp (factor de crecimiento transformante beta) y BMPs 2 y 4 (Alvarez-Pérez MA, 5 Narayanan S, Zeichner-David M, Rodríguez Carmona B, Arzate H. Molecular cloning, expression and immunolocalization of a novel human cementum-derived protein (CP-23). Bone 38: 409-419, 2006). Sin embargo, dichas moléculas no son cemento-específicas. El cemento contiene al menos una molécula específica denominada proteína del cemento 1 (CEMP-1), la cual ha mostrado que promueve la adhesión y diferenciación celular (Arzate 10 H., Chimal-Monroy J., Hernández-Lagunas L., Díaz de León L. Human cementum protein extract promotes chondrogenesis and mineralization in mesenchymal cells. J Periodont Res 31 : 144-148, 1996).

La periodontitis es una enfermedad infecciosa e inflamatoria crónica, la cual destruye las estructuras de soporte del diente. Con el incremento en las expectativas de 15 vida y la preservación de las estructuras dentales a una mayor edad, debido en parte a la fluoración del agua y a la disminución en la prevalencia de caries, la enfermedad periodontal gradualmente constituye la enfermedad más prevalerte y un problema de salud pública a nivel mundial. (Barmes DE. Public policy on oral health and oíd age: a global view.J Public Health Dent 60:335-337, 2000). El tratamiento actual para la periodontitis 20 incluye la eliminación de los factores inflamatorios causales (bacterias), seguido de diversas técnicas quirúrgicas y no quirúrgicas (raspado y alisado radicular, regeneración tisular guiada y uso de materiales cerámicos óseos y moléculas bioactivas). Las nuevas alternativas terapéuticas utilizando diversas moléculas se emplean actualmente (Zeichner- David M. Regeneration of periodontal tissues: cementogenesis revisited. Periodontol 2000. 25 41 :196-217, 2006). Estas incluyen el uso de derivados protemicos de la matriz del esmalte (EMDOGAIN). Otros estudios se han enfocado a la utilización de factores de crecimiento y a la utilización terapia génica de proteínas recombinantes en un periodo extendido de tiempo lo que constituye una estrategia terapéutica prometedora para la regeneración de las estructuras periodontales. Sin embargo, las estrategias terapéuticas utilizadas a la fecha no son predecibles, debido a que el paso crítico para lograr la regeneración de estas estructuras radica en la restauración de la inserción de fibras de tejido conectivo del ligamento periodontal a las superficies radiculares y hueso previamente expuestos a la enfermedad periodontal. La formación de novo del cemento radicular juega un papel determinante en este proceso regenerativo ya que estas fibras necesitan insertarse en el cemento radicular. Para lograr la regeneración del cemento radicular es importante el contar con moléculas que actúen en tiempo y espacio sincronizadamente para quimio-atraer e inducir la diferenciación de células responsables de secretar los constituyentes de la matriz extracelular específicos de estos tejidos (Bartold PM, Xiao Y, Lyngstaadas SP, Paine ML, Snead ML. Principies and applications of cell delivery systems for periodontal regeneration. Periodontol 2000 41:123-135, 2006).

Las evidencias experimentales indican que la proteína del cemento 1 (CEMP-1) constituyente natural del cemento radicular y ligamento periodontal y que no se ha determinado su expresión en otros tejidos adultos, posee las propiedades biológicas indicadas para llevar a cabo la regeneración ósea, de ligamento periodontal, cemento, dentina y cartílago.

Proteína del Cemento 1 (CEMP-1) La proteína del Cemento 1 (CEMP-1) (Número de acceso GenBank: NM_001048212 NM_001048216) GI: 187608423; HGNC: ID 32553, GeneID: 752014, (localizado en el cromosoma humano 16pl3.3), UniProtKB/Swiss-Prot Q6PRD7 (CEMP- 1 HUMAN), es una proteina específica de cemento y su ADNc (cadena complementaria del ácido desoxiribonucléico) es de 1395 pares de bases con un marco de lectura abierto que contiene 247 aminoácidos y que en su predicción de traducción teórica codifica para una proteína con un pH alcalino de 9.73, no presenta péptido señal y posee un peso 5 molecular teórico de 25.9 kDa. Esta proteína posee modificaciones postraduccionales (N- glicosilación y fosforilaciones) y presenta un peso molecular de 50 kDa en células eucariontes humanas. Es una proteína de localización nuclear y no presenta motivos de unión a ADN. En las bases de datos utilizando el banco NCBI BLAST no presenta homología a alguna otra proteína. Sin embargo, entre los aminoácidos 30 a 110 presenta 10 48% de similitud con colágena alfa I cadena (I), 46% con colágena XI y 40% con colágena X. La proteína del cemento I (CEMP-1) es expresada en subpoblaciones celulares del ligamento periodontal humano, cementoblastos bordeando el cemento radicular, células troncales de localización paravascular en el ligamento periodontal y pericitos en el hueso alveolar así como en cartílago de la médula espinal y en extremidades superiores e 15 inferiores en estados de desarrollo.

Experimentos in vitro demuestran que el gen que codifica para la proteína recombinante del cemento 1 (CEMP-1) induce el cambio fenotípico en células no esqueléticas tales como los fibroblastos gingivales humanos, hacia un fenotipo mineralizante. Asimismo, participa en el proceso de mineralización promoviendo la 20 nucleación de cristales de fosfato octacálcico. Se puede concluir que la proteína del cemento 1 (CEMP-1) participa en el proceso de mineralización durante la cementogénesis.

La necesidad de moléculas que promuevan la regeneración, ósea, cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago es ampliamente reconocida. El problema a resolver 25 radica en proponer una formulación capaz de promover y/o estimular la formación de hueso, sin que este crecimiento resulte incontrolable y/o ectópico para su uso en la regeneración ósea, y que sea capaz asimismo, de replicar los procesos fisiológicos normales para la formación de cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago. La alternativa nueva no deberá inducir la calcificación arterial o incrementar el riesgo para el desarrollo de neoplasias.

Es por lo anterior que se presenta la siguiente invención con la finalidad de utilizar las propiedades de la proteína del cemento 1 para contar con una alternativa para promover la formación de hueso, cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago. La formulación aquí presentada implica la combinación de la proteína recombinante del cemento o el plásmido conteniendo la información del gen de CEMP-1 y en combinación con un polímero de estructura tridimensional (PLGA) para la liberación lenta y posee el perfil de actividades necesario para contrarrestar los problemas planteados.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 es una Microfotografía del corte histológico que muestra el defecto de tamaño crítico en calvaría de ratas Wistar. La letra (A) corresponde al grupo sin ningún tratamiento y después de 16 semanas, solo muestra el puente de tejido conectivo fibroso sin la formación de hueso, cemento o cartílago. La letra (B) corresponde a un corte, después de 16 semanas, del animal que recibió la aplicación del polímero biodegradable tridimensional. No se aprecia evidencia de formación de hueso, cemento o cartílago. La letra (C) corresponde a un corte después de 16 semanas de los individuos que recibieron la formulación del andamio tridimensional PLGA plus 10-20 g de proteína recombinante humana CEMP-1 y dejada in situ en el defecto en calvaría, se puede apreciar que el 90% del defecto se ha llenado de tejido óseo, cemento y cartílago. El recuadro (C) muestra la formación de cartílago en este mismo grupo. Las letras D, E, F. G, H, I corresponden a aumentos 40X de las zonas donde se describe la formación de hueso y cemento después de 16 semanas de aplicación de la formulación farmacéutica PLGA/CEMP-1. Se observa la formación de cemento radicular depositado en forma de láminas (D). Tejido mineralizado acelular que representa cemento radicular (E). Depósito de cemento celular (con células en su matriz y una bien definida separación de hueso (F). Aumento de la zona anterior mostrando la diferencia entre los dos tejidos (G). Tejido similar a cemento radicular (H e I). Las cabezas de flecha indican en A, B y C los límites de la lesión original de 9 mm de diámetro.

La Figura 2 es una microfotografía del corte histológico que muestra el defecto de tamaño crítico en calvaría de ratas Wistar donde la letra C se refiere al grupo sin ningún tratamiento y después de 16 semanas solo muestra el puente de tejido conectivo fibroso sin la formación de hueso, cemento o cartílago. La letra B corresponde al grupo con colocación del polímero biodegradable tridimensional, después de 16 semanas, no muestra evidencia de formación de hueso, cemento o cartílago. La letra A corresponde al grupo con la formulación del andamio tridimensional PLGA plus 400-800 µg de ADN plasmídico conteniendo el gen de CEMP-1 y dejada in situ en el defecto en calvaría, muestra que el 80% del defecto se ha llenado de tejido óseo, y cemento como se muestra en el recuadro, la formación de cementículos y la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-CEMP-1 que identifica células cementoblásticas). Las líneas en A, B y C indican los límites de la lesión original de 9 mm de diámetro.

La Figura 3 muestra los cultivos tridimensionales de células derivadas del ligamento periodontal en combinación con la formulación proteína recombinante humana a una dosis de entre 2 y 5 µ^?t? y el polímero tridimensional PLGA.. Microfotografías de los cortes histológicos de los tejidos tridimensionales formados \n vitro teñidas con la tinción Tricrómica de Masson se observa el arreglo tridimensional parecido a un tejido (A), L atención con Alizarina roja nos indican que la proteína recombinante humana CEMP-1 en combinación con el polímero tridimensional PLGA forman tejido similar a hueso y cemento radicular in vitro (B). La tinción con azul de alciano nos indica que expresan el fenotipo de cartílago (C). La expresión inmunocitoquimica en el tejido formado como resultado del uso de la formulación aquí planteada indica la presencia de Sox9, agrecano, colágena tipo 2 y colágena tipo X, indica que el tejido formado corresponde a cartílago (G, H, I y J, respectivamente. La expresión de CEMP-1 y la proteína de adhesión del cemento radicular (CAP), indican que el tejido formado corresponde a cemento radicular (K y L respectivamente). La expresión de sialoproteína ósea (BSP) y osteocalcina (OCN) indican la formación de tejido óseo (M y N respectivamente). Los cultivos tridimensionales con PLGA en conjunto con células del ligamento periodontal no expresan estos marcadores titulares (O, P, Q y R).

Descripción detallada de la invención.

Breve resumen La presente invención describe una formulación farmacéutica que consiste de la combinación de la proteína recombinante humana CEMP-1 y/o homodímeros y heterodímeros a partir de su secuencia proteínica para inducir la formación de cemento, hueso, dentina, ligamento periodontal y cartílago, y en combinación con un polímero tridimensional biodegradable; ácido poliláctico co-glicólico (PLGA) con poros de entre 100 y 200 µ?? de diámetro para inducir la formación de hueso, cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago.

Otra modalidad preferida de la presente invención, es una formulación farmacéutica que consiste del plásmido de ADN conteniendo el gen de CEMP-1 en combinación con un andamio de polímero biodegradable (PLGA) de estructura tridimensional con poros de entre 100 y 200 µp? de diámetro para inducir la formación de hueso, cemento, ligamento periodontal y cartílago.

Otra de las modalidades preferidas de la presente invención es proveer un procedimiento para el cultivo tridimesional de células humanas derivadas del ligamento periodontal en combinación con la proteína recombinante del cemento 1 (CEMP-1) y polímero de estructura tridimensional biodegradable (PLGA) con poros de entre 100 y 200 µt? de diámetro para la inducción de diferenciación de células del ligamento periodontal para formar cemento, hueso, dentina y cartílago in vitro.

Descripción detallada Con base en los experimentos desarrollados que se describen enseguida, demostramos que la proteína recombinante humana del cemento 1 (CEMP-1) así como el plásmido conteniendo la información codificante para ésta proteína, incluida en una formulación de liberación lenta, puede ser utilizada en la ingeniería de tejidos y terapia génica para la regeneración de hueso, cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago.

La formulación divulgada en la presente invención, puede regenerar hueso, estructuras del periodonto (cemento y ligamento periodontal), dentina, así como cartílago como resultado de la pérdida de estas estructuras debido a trauma, infección, defectos craneofaciales y cáncer. Asimismo se describe un procedimiento tridimensional de cultivo in vitro, para la inducción de células del ligamento periodontal para la producción de hueso, cemento, dentina y cartílago.

Preparación y propiedades fisicoquímicas de la proteína recombinante humana CEMP-1. La clonación y expresión de la proteína del cemento 1 en Escherichia coli y la preparación de anticuerpos policlonales específicos han sido publicados (Alvarez-Pérez MA, Narayanan S, Zeichner-David M, Rodríguez Carmona B, Arzate H. Molecular cloning, expression and immunolocalization of a novel human cementum-derived protein (CP-23). Bone 38: 409-419, 2006). La Capacidad de inducción de la proteína recombinante CEMP-1 en la nucleación de cristales de fosfato octacálcico in vitro ha sido publicada (Villarreal-Ramírez E, Moreno A, Mas-Oliva J, Chávez-Pacheco JL, Narayanan AS, Gil-Chavarría I, Zeichner-David M, Arzate H. Characterization of recombinant human cementum protein 1 (TwCEMP-l): primary role in biomineralization. Biochem Biophys Res Commun 19;384:49-54, 2009).

Fórmula de liberación lenta.

Para poder obtener los beneficios del uso de la proteína recombinante CEMP-1, se preparó una formulación farmacéutica que consiste de Ácido poliláctico co-glicólico (PLGA) el cual es un copolímero que se utiliza en diversas formulaciones de productos terapéuticos aprobados por la FDA cuyo objeto en esta formulación es facilitar la liberación de CEMP-1. Las composición preferida del polímero PLGA utilizado en esta invención fue de 50% ácido poliláctico y 50% ácido co-glicólico (PLGA 50:50) con un peso molecular que se encuentra en el rango de los 90 kDa. La hidrólisis de este polímero en el organismo produce los monómeros originales, el ácido láctico y ácido glicólico. El radio de ácido láctico y ácido glicólico influencia el grado de degradación y liberación de CEMP-1 en el organismo. También es factible utilizar homodímeros y heterodímeros a partir de CEMP-1 ya que es posible que estos pudieran iniciar los procesos de señalización para llevar a cabo la diferenciación ya sea de células derivadas del ligamento periodontal y/o células troncales para su utilidad terapéutica o como reguladores y modificadores de la respuesta terapéutica en la inducción para la formación de hueso, cemento, dentina, ligamento periodontal y cartílago.

En otra modalidad de la presente invención, se utilizó un vector plasmídico (que contiene la información codificante de CEMP-1) adicionando al polímero tridimensional entre 400 a 800 µg de plásmido humana en combinación con PLGA, se secaron al vacío. Posteriormente el ADN fue fijado al polímero tridimensional por medio de luz ultravioleta.

Formación de cemento, hueso y cartílago por medio de la inducción de la proteína recombinante humana CEMP-1 en células derivadas del ligamento periodontal humano en una formulación farmacéutica con polímero PLGA tridimensional in vitro.

Ejemplo de uso 1 Uso de la proteína recombinante humana en combinación con PLGA para la reparación de defectos óseos de tamaño crítico.

Se utilizaron grupos de 6 ratas Wistar machos de aproximadamente 250 gramos de peso. El defecto de tamaño crítico fue de 9 mm y se realizó utilizando una trefina. Se eligió este tamaño de defecto porque en la ausencia de proteína solo se forma tejido conectivo fibroso sin evidencia de formación ósea en el espacio de la calvaría. La formulación utilizada en un grupo de animales consistió en un disco poroso tridimensional de acido poliláctico co-glicólico (PLGA) con la proteína recombinante CEMP-1. El polímero fue incubado con concentraciones de proteína recombinante humana del cemento 1 a un rango de dosis delO-20 µg y secado al vacío. Los animales controles no fueron tratados con el polímero tridimensional (PLGA) y otro grupo se mantuvo sin tratamiento. Se asegura el aporte sanguíneo al sitio quirúrgico. El sitio de la operación se selló con Satin S-100, cuyo contenido es principalmente gelatina. Después de 16 semanas, los animales se examinaron, se tomaron radiografías y se realizaron cortes histológicos de 5 µp? de grosor y teñidas con hematoxilina y eosina y tricrómica de Masson para su examen en el microscopio de luz. Se realizaron análisis histomorfométricos para determinar la cantidad de tejido mineralizado formado en el defecto de tamaño crítico en la calvaría de las ratas Wistar. Los hallazgos principales se presentan en la figura 1 donde se puede apreciar que en el grupo que recibió PLGA tridimensional no se llevó a cabo el proceso de regeneración ósea, como puede ser observado en A; así como en el grupo sin tratamiento, como puede ser observado en B. Mientras que en el grupo que recibió la fórmula de la proteína recombinante CEMP-1 con el polímero tridimensional, se llevó a cabo una reparación del 90% en el llenado del defecto (con hueso y/o cemento) como es claramente observado en C y/o la formación de cartílago como se observa en el recuadro C.

Conclusiones. a) Sí nada se adiciona al defecto óseo de tamaño crítico en calvaría de rata, no existe formación de hueso, cartílago o cemento. Es evidente solamente el crecimiento de tejido conectivo fibroso. b) La presencia única del polímero tridimensional PLGA no induce la formación de hueso, solamente la presencia de una cicatriz de tejido conectivo fibroso. c) La formulación de la proteína recombinante CEMP-1 en combinación con el polímero tridimensional PLGA induce la formación de alrededor del 90% de tejido óseo y/o cemento y cartílago. El tejido presenta uniformidad, características morfológicas normales y esta confinado al defecto creado experimentalmente.

Ejemplo de uso 2 Uso del vector plasmidico y CEMP-1 humana en combinación con PLGA para la reparación de defectos óseos de tamaño crítico en calvaría de ratas.

Este procedimiento es similar al anterior excepto que en lugar de la proteína recombinante CEMP-1, se adicionaron entre 400-800 pg de plásmido (que contiene la información codificante paraCEMP-1) al polímero tridimensional se secaron al vacío. Posteriormente el ADN fue fijado al polímero tridimensional por medio de luz ultravioleta.

El procedimiento quirúrgico y procesamiento de las muestras es igual al anteriormente descrito.

Los hallazgos principales se resumen en la figura 2, donde se puede apreciar que en el grupo que recibió PLGA tridimensional no se promovió la regeneración ósea como puede ser observado en C;, así como en el grupo sin tratamiento, como puede ser observado en B. En el grupo que recibió la formulación del vector plasmidico conteniendo la información codificantre de CEMP-1 con el polímero tridimensional, presentó una reparación del 80% en el llenado del defecto con hueso e islas de cemento radicular, como se observa en A.

Conclusiones a) Sí nada se adiciona al defecto óseo de tamaño crítico en calvaría de rata, no existe formación de hueso, cartílago o cemento. Es evidente solamente el crecimiento de tejido conectivo fibroso. b) La presencia única del polímero tridimensional PLGA no presenta formación de hueso, solamente la presencia de una cicatriz de tejido conectivo fibroso. c) La formulación conteniendo el plásmido con la información codificante de CEMP-1 en combinación con el polímero tridimensional PLGA induce la formación de alrededor del 80% de tejido óseo e islas de cemento radicular. El tejido presenta uniformidad, características morfológicas normales y esta confinado al defecto creado experimentalmente.

Ejemplo de uso 3 Formación de cemento, hueso y cartílago por medio de la inducción de la proteína recombinante humana CEMP-1 en células derivadas del ligamento periodontal humano en una formulación farmacéutica con polímero PLGA tridimensional in vitro.

Células de ligamento periodontal cultivadas in vitro y en combinación con PLGA en un sistema de cultivo tridimensional fueron mantenidas en cultivo durante 4-6 semanas con la adición de 2-5 µg/mL de proteína recombinante humana CEMP-1. Al término, las células fueron fijadas y procesadas para corte histológico estándar. Se obtuvieron secciones de 5 µp? de grosor que se tiñeron con la técnica de tricrómica de Masson para observar el arreglo tridimensional similar al de un tejido, como se aprecia en A, tinción con alizarina roja, para detección de sales de calcio, indicativo del proceso de mineralización, como puede ser apreciado en (B) y azul de alciano para determinar la formación de cartílago como se aprecia en (C). Asimismo, se determinó la expresión de marcadores tisulares de cartílago en el tejido formado in vitro como lo son: agrecano, Sox 9, colágena tipo ?, y colágena X y que se observan en (G, H, I y J, respectivamente). Se expresan marcadores biológicos que identifican la formación de cemento radicular in vitro como lo son: CEMP-1 que se observa en la letra K) y la proteína de adhesión del cemento radicular (CAP) que se observa en la letra (L). La expresión de marcadores biológicos que indican la formación de hueso in vitro, como la sialoproteína ósea y osteocalcina que se observan en las letras (M y N respectivamente). En los cultivos controles se omitió la adición de la proteína recombinante CEMP-1, por lo que no formó tejido in vitro similar a hueso, cemento y/o cartílago, como se observa en las letras (E y F).

Los hallazgos principales se pueden apreciar en la figura 3, donde se observa que las células del ligamento periodontal son inducidas a mineralizar in vitro formando hueso, cemento y cartílago en el sistema tridimensional con la formulación de PLGA y CEMP-1. Esto se corroboró con la expresión de proteínas específicas para estos tejidos.

Conclusiones. a) Sí no se adiciona la proteína recombinante humana a los cultivos tridimensionales en la formulación PLGA/CEMP-1 las células humanas derivadas del ligamento periodontal no se diferencian hacia osteoblastos, cementoblastos y/o condroblastos, por lo que no forman hueso, cemento o cartílago. b) La adición de la fórmula polímero tridimensional PLGA proteína recombinante CEMP-1 induce a las células del ligamento periodontal humano a formar tejidos: óseo, cemento y cartílago y a la expresión de moléculas utilizadas como marcadores biológicos de estos tejidos en un sistema de cultivo tridimensional in vitro.

Claims (11)

REIVINDICACIONES .

1. Uso de la proteína recombinante humana del Cemento 1 (CEMP-1) o sus homodímeros, hetrodímeros o el vector plasmídico conteniendo el gen que codifica para la proteína CEMP-1 en combinación con Acido Poliláctico Co-Glicólico (PLGA) en una estructura porosa tridimensional para la preparación de un medicamento útil para inducir en un mamífero la formación o regeneración de hueso, cemento radicular, dentina, ligamento periodontal y/o cartílago.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína recombinante humana del Cemento 1 o sus homodímeros y heterodímeros se encuentran preferentemente entre los 10-20 µ&

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el plásmido conteniendo el gen que codifica para la proteína del cemento 1 (CEMP-1) se encuentra preferentemente entre los 400 - 800 µ&

4. El uso de conformidad con la reivindicación 1. caracterizado porque el PLGA se encuentra a una concentración preferentemente de 50% de poliláctico y 50% de ácido co-glicólico (PLGA 50:50).

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura porosa tridimensional cumple la función de retención de la proteína recombinante y/o el vector plasmídico para llevar a cabo la función de liberación lenta y sostenida.

6. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para ser utilizado en un mamífero en la formación o regeneración de hueso, cemento radicular, dentina, ligamento periodontal y/o cartílago.

7. El medicamento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el mamífero es preferentemente el humano.

8. Una formulación farmacéutica que consiste de uno o más de los siguientes componentes: a. La proteína recombinante humana del cemento 1 (CEMP-1) b. Homodímeros y heterodimeros, de CEMP-1 c. Vectores plasmídicos conteniendo secuencias de ácidos nucleicos totales o parciales del gen que codifica para CEMP-1 en combinación con un vehículo de liberación lenta a base de ácido poli láctico co- glicólico (PLGA) con una estructura tridimensional para inducir en un mamífero la formación o regeneración de hueso, cemento radicular, dentina, ligamento periodontal y/o cartílago.

9. La formulación farmacéutica de la reivindicación 8, para ser utilizada en un mamífero en condiciones que requieran la formación o regeneración de hueso, cemento radicular, dentina, ligamento periodontal y/o cartílago.

10. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 8 y 9 caracterizada porque el mamífero es preferentemente el ser humano.

11. Una formulación farmacéutica que consiste de 2 a 5 µg de la proteína recombinante humana del cemento 1 (CEMP-1) en combinación con un vehículo de liberación lenta a base de ácido poliláctico co-glicólico (PLGA) con una estructura tridimensional para inducir in vitro en cultivos celulares de fibroblastos derivados del ligamento periodontal, y/o células troncales humanas, la formación de cemento radicular, hueso, dentina, cartílago y/o ligamento periodontal, para su uso ulterior en la reparación de condiciones que requieran la formación de hueso, cemento, dentina, ligamento periodontal y/o cartílago.