MX2008013351A

MX2008013351A - Sondas fluorescentes para fotografia de adn.

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Publication number: MX2008013351A
Application number: MX2008013351A
Authority: MX
Inventors: Anja Schwoegler; Thomas Carell
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2009-01-14
Also published as: WO2007128430A8; CN101448956A; TW200808975A; EP2013363A1; US20090087857A1; CA2646864A1; AU2007247498A1; WO2007128430A1; JP2009534044A; KR20090015939A; BRPI0710556A2

Abstract

La presente invención se refiere a un método de detección para analitos usando el principio de fotografía en blanco y negro y a equipos de reactivo para realizar el método, además aplicada esta nueva tecnología para detectar una secuencia biológicamente relevante en el rango nanomolar (femtomoles) en una aplicación sorteando la necesidad de una PCR. Todavía hay numerosas maneras de optimizar esta metodología que es adecuada para una variedad grande de aplicaciones en las áreas diagnósticas y proteómicas genómicas.

Description

SONDAS FLUORESCENTES PARA FOTOGRAFÍA DE ADN DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a un método de detección para analitos usando el principio de fotografía en blanco y negro y a equipos reactivos para realizar el método. Esta tecnología nueva se puede aplicar para detectar una secuencia de ácido nucleico biológicamente relevante en el rango nanomolar en una aplicación que sondea la necesidad de una PCR. La metodología es adecuada para una variedad grande de aplicaciones en las áreas diagnósticas genómicas y proteómicas.

Introducción Existe una gran necesidad en la comunidad médica, científica y no científica por pruebas diagnósticas rápidas y simples capaces de detectar biomateriales tales como oligonucleótidos, ADN, ARN y proteínas. Las metodologías disponibles hoy en día requieren equipo y tecnologías costosas y son exclusivamente adecuadas para usuarios especializados. En el caso de detección de ADN, la reacción en cadena de polimerasa [1] (PCR) o métodos de amplificación de objetivo comparable todavía son los más usados por su confiabilidad y sensibilidad (5-10 moléculas de ADN). En algunos casos, estos métodos exhiben desventajas en términos de especificidad y requieren una prueba de multicomponente costosa. Los métodos de detección directa se desarrollaron recientemente usando tecnologías complejas tales como procesos fluorescentes, quimoluminescentes, electroquímicos, radioactivos, o materiales sofisticados tales como nano-partículas [2-8]. Aunque estas pruebas nuevas pueden detectar oligonucleótidos seleccionados en el rango pico-, femto- e incluso atto-molar, su aplicación requiere un antecedente científico específico así limitando el método a laboratorios altamente especializados. Una propuesta novedosa para detectar ADN y ARN sin ningún antecedente científico específico sería un resultado histórico a fin de extender estas clases de diagnósticos a una variedad grande de aplicaciones. Este método propuesto debe cubrir los campos de diagnósticos ¡n vivo humanos tal como prueba por agentes infecciosos o de bioterrorismo o prueba genética, oncología, investigación y muchos más. El objetivo de la presente invención es desarrollar un método fácil de usar para todos estos campos sin involucrar instrumentación sofisticada y costosa. La irradiación de un fotopapel o de una emulsión conteniendo cristales de haluro de plata genera núcleos de Ag4 como imágenes latentes [9]. Estos grupos se amplifican selectivamente por el proceso de desarrollo posterior. Este paso de desarrollo se puede observar como la amplificación de la señal original - la imagen latente - por un factor de 1011. La sensibilidad de dichas emulsiones o papeles se llama "sensibilidad intrínseca" y se limita a longitudes de onda absorbidas por el haluro de plata. El proceso llamado sensibilización espectral induce sensibilidad a la longitud de onda más larga del espectro visible usando colorantes llamados sensibilizadores espectrales adsorbidos a los granos de emulsión [10]. Colorantes de cianina, merocianina y pinacianol constituyen la mayoría de sensibilizadores espectrales empleados de esta manera hasta ahora, aunque se usaron muchas otras moléculas en fotografía antes de que las cianinas fueran reconocidas como la mejor clase de colorantes para esta aplicación [11]. PCT/EP2006/004017 describe un método para detección de ADN altamente sensible que es accesible en muchos campos incluso para usuarios no especializados, sin la necesidad de un laboratorio profesional y en una manera muy simple. De acuerdo con este método, un oligonucleótido o una cadena doble de ADN se marca con un fotosensibilizador usado en fotografía. Una solución que contiene este oligonucleótido marcada (ODN) se mancha en papel fotográfico. Incluso sin ninguna sensibilización espectral, el método permite una detección del ADN marcado en una sensibilidad picomolar (300 attomoles) después de irradiación y desarrollo del fotopapel. Los presentes inventores han llevado a cabo experimentos que involucran la aplicación de moléculas reporteras, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico reporteras a un medio fotosensible, por ejemplo, papel fotográfico o cualquier otro medio sensible a la luz, en donde las moléculas reporteras portan un grupo fotosensibilizador y un grupo saciador. En ausencia de analito, el grupo fotosensibilizador se sacia. Por ejemplo, la molécula reportera puede tener una estructura de horquilla con el fotosensibilizador y el grupo saciador en o cerca de la terminal de la molécula en relación espacial cercana. Cuando la molécula reportera está presente como una estructura de horquilla, el grupo fotosensibilizador se sacia (de acuerdo con la técnica de Sonda Fluorescente conocida). De esta manera, una molécula reportera con una estructura de horquilla intacta no puede realizar una sensibilización al irradiar luz al medio fotosensible. En presencia de un analito, la estructura de horquilla se di ide. El analito puede ser una cadena de ácido nucleico complementaria o una enzima que corta la estructura de horquilla o una proteína que une a la horquilla y así divide la estructura. El grupo fotosensibilizador se separa del grupo saciador y así es capaz de fotosensibilización. En este caso, la irradiación de luz conduce a una sensibilización del medio fotográfico y así a la detección de analito. La presente invención se refiere a un método para detectar un analito en una muestra que comprende los pasos: i proveer una muestra, ii proveer una molécula reportera que comprende un grupo fotosensibilizador o un grupo de manejo para introducir un grupo fotosensibilizador y un grupo saciador en donde el grupo fotosensibilizador se sacia en ausencia del analito a detectarse, Mi contactar la muestra con la molécula reportera bajo condiciones en donde la saciedad del grupo fotosensibilizador es al menos parcialmente reducida o terminada en presencia del analito, de ser necesario, hacer reaccionar el grupo de manejo con una pareja de reacción que comprende un grupo fotosensibilizador, irradiar dicha molécula reportera en contacto con un medio fotosensible bajo condiciones en donde grupos marcadores se forman en dicho medio fotosensible en presencia de grupos fotosensibilizadores no saciados en dicha molécula reportera, y detectar dichos grupos marcadores.

Además, la invención se refiere a un equipo reactivo para detectar un analito en una muestra que comprende a una molécula reportera que comprende un grupo fotosensibilizador o un grupo de manejo para introducir un grupo fotosensibilizador y un grupo saciador en donde el grupo fotosensibilizador se sacia en ausencia del analito a detectarse, b opcionalmente una pareja de reacción para el grupo de manejo que comprende un grupo fotosensibilizador y c un medio fotosensible que forma grupos marcadores al momento de irradiación de grupos fotosensibilizadores no saciados. presente invención permite una detección altamente sensible de analitos, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas de unión de ácido nucleico, en muestras biológicas, por ejemplo, muestras clínicas, muestras ambientales o muestras agrícolas. Las aplicaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a, la detección de variabilidades genéticas, por ejemplo polimorfismos de nucleótido individuales (SNPs), resistencias a pesticida o medicamento, tolerancias o intolerancias, genotipo, por ejemplo, la detección de especies o cepas de organismos, la detección de organismos o cepas genéticamente modificadas, o la detección de patógenos o pestes, y la diagnosis de enfermedades o enfermedades infecciosas. Otra aplicación preferida es la detección de ácidos nucleicos en muestras para protección de marca, en donde productos tales como productos agrícolas, productos alimenticios, o productos de valor y/o empaque de estos productos se codifican con información específica del producto, por ejemplo, pero no limitado al sitio de producción, fecha de producción, distribuidor, etc., y en donde esta información se detecta con el método como se describió antes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención comprende la detección de un analito. La detección puede ser una detección cualitativa, por ejemplo, la determinación de la presencia o ausencia de un analito, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico específica en la muestra a analizarse. Sin embargo, la invención también permite detección cuantitativa de un analito, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, en la muestra a analizarse. La detección cualitativa y/o cuantitativa puede comprender la determinación de grupos de etiquetado de conformidad con métodos conocidos en la técnica. El analito a detectarse preferiblemente se selecciona a partir de ácidos nucleicos y moléculas de unión a nucleosido, nucleótido o ácido nucleico, por ejemplo, proteínas de unión a nucleosido, nucleótido o ácido nucleico. Más preferiblemente, el analito es un ácido nucleico, por ejemplo, cualquier tipo de ácido nucleico que se puede detectar de acuerdo con técnicas conocidas, en particular técnicas de hibridación. Por ejemplo, se pueden seleccionar analitos de ácido nucleico de ADN, por ejemplo, ADN, ARN o híbridos de ADN-ARN de cadena doble o cadena sencilla. Ejemplos particulares de analitos de ácido nucleico son ADN genómico, mARN o productos derivados e los mismos, por ejemplo, cADN. En una modalidad preferida, la detección involucra irradicar un medio fotosensible en presencia de una muestra que se sospeche contenga el analito y una molécula reportera, en donde la molécula reportera comprende grupos f otosensibilizadores y grupos saciadores capaces de realizar una transferencia de energía al medio fotosensible en donde grupos marcadores se pueden formar en el medio. En ausencia de analito, el grupo fotosensibilizador se sacia. En presencia de analito, la saciedad del grupo fotosensibilizador se reduce o termina. En este caso, el grupo fotosensibilizador puede inducir la formación de grupos marcadores, por ejemplo, átomos metálicos o grupos de átomos metálicos en el medio fotosensible al momento de la irradiación. En una modalidad preferida de la invención, la molécula reportera es una Sonda Fluorescente (MB) [12]. Las sondas fluorescentes son sondas de hibridación de cadena sencilla, por ejemplo, sondas de ácido nucleico o análogas de ácido nucleico que forman una estructura de tallo-y-bucle. El bucle puede contener una secuencia de sonda que es complementaria a una secuencia de objetivo, y el tallo se forma por el recocido de secuencias de brazo complementarias que se ubican en cualquier lado de la secuencia de sonda. Un fotosensibilizador, por ejemplo, un fluoroforo se enlaza covalentemente al extremo de un brazo y un saciador se enlaza covalentemente al extremo del otro brazo. Las sondas fluorescentes no dan respuesta fluorescente cuando están libres en solución. Sin embargo, cuando hibridan a una cadena de ácido nucleico que contiene una secuencia objetivo pasan por un cambio de conformación que les permite dar respuesta fluorescente brillantemente. Muchos "f luoroforos" y saciadores usados para estas sondas son los mismos colorantes usados en fotografía en blanco y negro como sensibilizadores espectrales [13], por ejemplo, colorantes de cianina, merocianina o pinacianol. El principio de trabajo de MB se puede resumir de la siguiente manera: En ausencia de objetivos, la sonda es oscura, ya que el tallo coloca los fluoroforos tan cerca al saciador no fluorescente que comparten de manera transitoria electrones, eliminando la habilidad del fluoroforo de dar respuesta fluorescente. Cuando la sonda encuentra una molécula de objetivo, forma un híbrido de objetivo de sonda que es más largo y más estable que el híbrido de tallo. La rigidez y longitud del híbrido de objetivo de sonda excluye la existencia simultánea del híbrido de tallo. Por consiguiente, la Sonda Fluorescente pasa por una reorganización de conformación espontánea que fuerza al híbrido de tallo a desasociar y el fluoroforo y el saciador a moverse lejos uno del otro, restaurando fluorescencia. La presente invención verifica la correlación entre las mediciones de fluorescencia de una MB en su forma cerrada y abierta y las señales relativas detectadas en un fotopapel. Esta técnica se llama Fotografía de ADN a base de Sonda Fluorescente (MBDP). La longitud de moléculas reporteras de Sonda Fluorescente es preferiblemente 15-100 nucleótidos y más preferiblemente 20-60 nucleótidos. Las moléculas de Sonda Fluorescente se pueden seleccionar a partir de ácidos nucleicos tales como moléculas de ADN o ARN o de análogos de ácido nucleico. Las moléculas reporteras, por ejemplo, la molécula de Sonda Fluorescente se puede fabricar de acuerdo con procedimientos estándar. La muestra puede ser cualquier muestra que pueda contener el analito a detectarse. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra biológica, tal como una muestra agrícola, por ejemplo, una muestra que comprende material de planta y/o material asociado con el sitio en donde crecen plantas, materiales de planta se almacenan o procesan. Por el otro lado, la muestra también puede ser una muestra clínica, tal como una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal tal como sangre, suero, plasma, etc., en particular de origen humano. Otros tipos de muestras incluyen, pero no se limitan a, muestras ambientales, muestras de tierra, muestras de alimentos, muestras forenses o muestras de productos de valor que son probados para protección de marca. Debido a su alta sensibilidad, el método de la presente invención es adecuado para detectar analitos directamente sin amplificación. De conformidad con la invención, incluso cantidades minutas de analitos, por ejemplo, de ácidos nucleicos, por ejemplo 0.1 ng o menos, preferiblemente 0.01 ng o menos, más preferiblemente 1 pg o menos, todavía más preferiblemente 0.1 pg o menos, incluso más preferiblemente 0.01 pg o menos y muy preferiblemente 0.001 pg o menos se pueden determinar incluso sin amplificación. La alta sensibilidad del método de la presente invención permite la detección de analitos en el rango picomolar e incluso es posible detectar analitos en el rango zeptomolar. Un análisis en el rango zeptomolar permite la detección de moléculas de ADN sencillas. En una modalidad preferida de la invención, una detección específica de secuencia del analito se lleva a cabo, en donde, por ejemplo, un ácido nucleico teniendo una secuencia específica se distingue de otras secuencias de ácido nucleico en la muestra o un polipéptido capaz de unir una secuencia de ácido nucleico especifica se distingue de otros polipéptidos en la muestra. Dicha detección específica de secuencia comprende de preferencia una reacción de hibridación específica de secuencia por la que la secuencia de ácido nucleico a detectarse se asocia con la molécula reportera. La detección involucra contactar el analito y la molécula reportera que comprende un grupo fotosensibilizador con un medio fotosensible, por ejemplo, al transferir una muestra o alícuota de muestra en donde un producto de asociación pueda estar presente en el medio fotosensible, por ejemplo, al manchar, pipetear, etc. Al irradiar, una transferencia de energía desde el grupo fotosensibilizador al medio fotosensible se realiza de modo que los grupos marcadores tales como metal, por ejemplo, plata, núcleos se forman en el medio fotosensible en presencia, pero no en ausencia, de grupos fotosensibilizadores. De ser necesario, los grupos marcadores se pueden someter a un procedimiento de desarrollo, por ejemplo, un procedimiento de desarrollo químico o fotoquímico de acuerdo con técnicas fotográficas. El medio fotosensible puede ser cualquier soporte sólido o cualquier material soportado capaz de formar grupos marcadores, por ejemplo, núcleos metálicos. Preferiblemente, el medio fotosensible es un medio sensible a la luz, tal como papel sensible a la luz o una emulsión sensible a la luz o gel en un material de soporte. Más preferiblemente, el medio fotosensible es un medio fotográfico tal como papel fotográfico. La irradiación se lleva a cabo bajo condiciones, por ejemplo, de longitudes de onda y/o intensidad de luz de irradiación, bajo las cuales la formación de grupo marcador selectivo ocurre en presencia de grupos fotosensibilizadores. Preferiblemente, la irradiación ocurre con luz infrarroja y/o con luz visible de onda larga, dependiendo de la sensibilidad del medio. La longitud de onda de irradiación puede ser, por ejemplo, 500 nm o más, 520 nm o más, 540 nm o más, 560 o más, 580 o más para luz visible o 700 nm a 10 µ?t?, para luz infrarroja. El grupo fotosensibilizador es un grupo que es capaz de realizar una transferencia de energía, por ejemplo, una transferencia de energía de luz, a un medio fotosensible, es decir, un medio fotográfico tal como papel fotográfico. Los grupos fotosensibilizadores se pueden seleccionar a partir de grupos fluorescentes y/o de etiquetado de colorante conocidos tales como grupos de indolita a base de cianina, grupos de quinolina, por ejemplo, grupos fluorescentes comercialmente disponibles tales como Cy5 o Cy5.5. El grupo saciador es un grupo capaz de saciar la transferencia de energía del grupo fotosensibilizador al medio fotosensible. Preferiblemente, el grupo saciador es capaz de saciar la transferencia de energía de luz. Los grupos saciadores se pueden seleccionar a partir de grupos saciadores conocidos, por ejemplo, grupos saciadores conocidos en moléculas reporteras de Sonda Fluorescente, por ejemplo, como se describe en las referencias [12- 16] que se incorpora a la presente por referencia. En ciertas modalidades, la molécula reportera puede comprender un grupo de manejo, es decir, un grupo para introducir un grupo fotosensibilizador por reacción con una pareja de reacción adecuada, es decir, un compuesto que comprende uno de los grupos anteriores. En una modalidad preferida, los grupos de manejo se seleccionan a partir de grupos funcionalizados Click, es decir, grupos que pueden reaccionar con una pareja de reacción adecuada en una reacción de cicloadición en donde se forma una ligadura cíclica, por ejemplo, heterocíclica entre el grupo funcional Click y la pareja de reacción, y en donde la pareja de reacción comprende un grupo fotosensibilizador. Un ejemplo especialmente preferido de dicha reacción Click es una cicloadición (3 + 2) entre grupos de azida y alquina en la formación de anillos de 1 ,2,3-triazol. De esta manera, se pueden generar grupos fotosensibilizadores al realizar una reacción Click de un grupo de manejo de azida o alquina y una pareja de reacción correspondiente, es decir, una pareja de reacción que comprende el grupo de alquina o azida complementario y adicionalmente un grupo fotosensibilizador. Preferiblemente, la molécula reportera es una molécula de ácido nucleico, más preferiblemente una molécula nucleico de cadena sencilla. El término "ácido nucleico" de acuerdo con la presente invención en particular se refiere a ribonucleótidos, 2'-desoxiribonucleótidos o 2', 3'-didesoxiribonucleótidos. Los análogos de nucleótido se pueden seleccionar a partir de nucleótidos de azúcar o estructura modificada, en particular de análogos de nucleótido que se pueden incorporar enzimáticamente en ácidos nucleicos. En nucleótidos de azúcar modificada preferidos, el grupo 2'-OH o H del azúcar ribosa se reemplaza por un grupo seleccionado a partir de OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es alquilo de Ci-Ce, alquenilo o alquinilo y halo es F, Cl, Br o I. La ribosa en sí se puede reemplazar por otros grupos carbocíclicos o heterocíclicos de 5 ó 6 miembros tal como un grupo ciclopentano o ciclohexano. En nucleótidos de estructura modificada preferidos, el grupo de fosfo(tri)éster se puede reemplazar por un grupo modificado, por ejemplo, por un grupo fosforotioato o un grupo H-fosfonato. Otros análogos de nucleótido preferidos incluyen bloques de construcción para la síntesis de análogos de ácido nucleico tales como ácidos nucleicos de morfolíno, ácidos nucleicos de péptido o ácidos nucleicos cerrados. En una modalidad preferida, los métodos y los equipos reactivos de la presente invención se usan para aplicaciones agrícolas. Por ejemplo, la invención es adecuada para la detección de ácidos nucleicos de plantas, patógenos de planta o pestes de planta tales como virus, bacteria, hongos o insectos. Además, la invención es adecuada para detectar variabilidades genéticas, por ejemplo, SNPs en plantas o partes de planta, patógenos de planta o pestes de planta tales como insectos. Otra aplicación es una detección o monitoreo de resistencias a herbicida, fungicida o pesticida, tolerancias o intolerancias, por ejemplo, resistencias, tolerancias o intolerancias en hongos, insectos o plantas en organismos o poblaciones de organismos. La invención también es adecuada para genotipo rápido, por ejemplo, para la detección rápida y/o diferenciación de especies o cepas de hongos, insectos o plantas. Además, es posible la detección y/o diferenciación de organismos genéticamente modificados para cepas, por ejemplo, organismos o cepas de hongos, insectos o plantas. El método de la invención es en particular adecuado para la detección y caracterización de plantas o semillas. En particular, al usar el método de la invención o un equipo de prueba o tira de prueba adaptada al mismo, es posible analizar un producto, por ejemplo, una planta o una semilla con respecto al fabricante, con respecto al tipo de producto y con respecto a compuestos o contenidos estando en el producto. Es particularmente posible detectar a partir de dónde y en particular, a partir de cuál fabricante proviene un analito. Esto es posible porque incluso diferencias o desviaciones menores de un tipo silvestre, por ejemplo, de una planta de tipo silvestre, se pueden detectar por el método de conformidad con la presente invención. Además, es posible con el método de conformidad con la presente invención detectar si y a qué grado un analito se ha maquinado genéticamente. También es posible detectar si un analito contiene un cierto gen de resistencia o si un analito contiene otra característica debido a ingeniería genética. Dichas modificaciones a menudo comprenden sólo el reemplazo de una o dos bases. Pero incluso dichas modificaciones menores se pueden detectar con el método de conformidad con la presente invención. El método de conformidad con la invención hace posible definir el producto en sí, es decir, descubrir si es trigo, linaza, arroz, etc. Finalmente, es posible definir el contenido de recurso o el contenido de ciertos agentes. Por ejemplo, es posible determinar el contenido de aceite en linaza o la presencia de un gen que es resistente a tensión por sequía. El método de conformidad con la invención por tanto se puede usar para el control y monitoreo de las características de un producto, en especial de características prometidas de un producto. Dicha aplicación es especialmente útil en el campo de nutrientes pero también en farmacéuticos. Es posible con el método de conformidad con la presente invención evaluar plantas que sean producidas o distribuidas por cultivo de plantas con respecto a su origen y sus características reales. En especial se prefiere un equipo de prueba o tira de prueba, que permite el control y asignación de productos o características del producto. Debido a la alta sensible de la invención, es posible el diagnóstico temprano de patógenos, es decir, es visible el diagnóstico antes de los primeros síntomas de la presencia de patógenos. Esto es particularmente importante para el diagnóstico de roya de soya (Phakospora pachyrizi) u otros patógenos, por ejemplo, Blumeria graminis, Septoria tritici u Oomycetes u otros patógenos para los cuales solamente es posible el control, si se detecta su presencia antes de que se pueda reconocer visualmente.

Además, la invención es adecuada para aplicaciones médicas, diagnósticas y forenses, por ejemplo, en medicina humana o veterinaria, por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos de patógenos, por ejemplo, patógenos humanos o patógenos de ganado o animales de mascota. En particular, es posible detectar, por ejemplo, virus o bacteria. Otras aplicaciones preferidas incluyen la detección de variabilidades genómicas, por ejemplo, SNPs en humanos o la detección de resistencias mecánicas, tolerancias o intolerancias o alergias. Además, la invención es adecuada para genotipo, en particular genotipo de humanos a fin de determinar mutaciones asociadas con predisposición o riesgo enriquecido de trastornos, alergias e intolerancias. La invención también se puede usar para la detección de organismos genéticamente modificados o cepas, organismos o cepas de bacteria o virus pero también animales de ganado genéticamente modificados, etc. La invención es particularmente adecuada para el diagnóstico rápido de enfermedades, por ejemplo, enfermedades genéticas, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes o enfermedades infecciosas. Además, la invención es adecuada para detectar la función y/o expresión de genes, por ejemplo, para propósitos de investigación. Todavía otra modalidad es el uso del método para protección de marca, por ejemplo, para detectar información específica codificada en productos tales como productos de valor como productos de protección de plantas, farmacéuticos, cosméticos y químicos finos (por ejemplo, vitaminas y aminoácidos) y bebidas, productos de combustión, por ejemplo, gasolina y diesel, aparatos electrónicos, se pueden marcar. Además, el empaque de estos y otros productos se puede marcar. La información se codifica por ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico que se han incorporado en el producto y/o en el empaque de un producto. La información se puede relacionar a la identidad del fabricante, sitios de producción, fecha de producción y/o distribuidor. Por medio de la presente invención, se puede llevar a cabo detección rápida de datos específicos del producto. Se puede preparar una muestra de una alícuota del producto que después se contacta con una o varias sondas de hibridación funcionalizadas específicas de secuencia capaces de detectar la presencia de información codificada de ácido nucleico en la muestra. La invención también es adecuada para el campo de nutrientes.

Por ejemplo, en el área de alimentación, nutrientes animales, por ejemplo, maíz, se suplementan con una mayor cantidad de conservadores tal como ácido propiónico. Al aplicar el método de la invención, la adición de conservadores se puede reducir. Además, análisis genómico con el método de la invención permite la predicción de la capacidad de un individuo de utilizar nutrientes específicos (nutrigenómica).

FIGURAS Figura 1: Principio de trabajo de Sondas Fluorescentes, a) dos caminos diferentes para desnaturalizar la estructura de horquilla de MBs, por un objetivo recocido a la región de bucle de la horquilla (parte superior) y por temperatura, desnaturalizando reactivo o proteínas de unión de ssADN (parte inferior), b) un espectro típico de fluorescencia / temperatura de una MB en su forma abierta (línea superior) y cerrada (línea inferior). Figura 2: Representación esquemática del principio de trabajo de fotografía de ADN en MBs, MBDP. Solamente la mezcla para analizar en donde MB se recose con el objetivo T da una señal positiva como una mancha negra en el fotopapel. La forma cerrada de MB da ninguna señal en el fotopapel. Figura 3: Representación gráfica de MB1, T, T y Cy3-ODN junto con sus secuencias. A la izquierda, se listan las longitudes de onda de absorción y emisión de colorantes típicos. Figura 4: Mediciones de espectrómetro de fluorescencia (emisión a 570 nm). a) la curva menor es el espectro de MB1 0.2 µ? de 25°C a 85°C mientras que la curva roja es el espectro después de la adición de 1.2 µ? de T a la misma solución, b) adquisiciones de tiempo de emisión de fluorescencia de la adición de 1.2 µ? de T a soluciones que contienen 0.2 µ? de MB1 y reguladores de hibridación diferentes. Figura 5: Reproducción de escáner de dos foto-experimentos típicos. En a y b en la línea ref. se detecta un ODN Cy3-marcado en una serie de dilución de 10 µ? a 100 fM. En a' y b' se reportan alargaciones relativas a los experimentos de MBDP. Las manchas 1 y 5 = regulador de hibridación; mancha 2 = 10 µ? T; mancha 3 = 1 µ? B1; mancha 4 = MB1 + T (1:10). Figura 6: Reproducción de escáner del fotopapel después de revelado. Las muestras usadas se listan en la tabla 1. Ejemplo 7: Reproducción de escáner del fotopapel después de revelado. Las muestras usadas se listan en la tabla 2.

EJEMPLOS 1. Materiales y métodos Para probar el concepto y su validez, se eligió una secuencia de oligodesoxinucleótido (ODN) asociada con la bacteria Yersinia pestis (5'-AGCCACGCCTCAAGGG-3'), aquí simplemente llamada Objetivo (T). Esta secuencia es importante para bioterrorismo y aplicaciones de guerra biológica y ya se ha estudiado en la literatura [14]. Específicamente se diseñó una sonda fluorescente que se unió a amplímeros generados de los genes 16S rARN de Y. pestis. Se eligió usar MB1 comercialmente disponible diseñado para buscar objetivo T de y. pestis. El oligonucleótido T no modificado se diseñó para ser complementario con T y atraparlo cuando se necesite. Las secuencias se reportan en la figura 3 junto con los colorantes usados y sus longitudes de onda de absorción y emisión. El colorante Cy3 en efecto es uno de los colorantes en fotografía en blanco y negro y el saciador de hoyo negro BHQ2 tiene una buena eficiencia saciadora de 97% hacia Cy3 [13]. Se han usado diferentes reguladores en este trabajo y una lista de ellos se reporta aquí: H = 1 M Tris-HCI pH 8, 100 mM MgCI2 H5 = 1M a-Acetato H1 = 1M Tris-HCI pH 8, 400 mM MgCI2, H6 = 1M tri-Na-Citrato 150 mM KCI H2 = 900 mM NaCI, 90 mM Na-Citrato H7 = 1M Na-tetraborato H3 = 1M KH2P04 H8 = 1M K2C03 H4 = 1M a-Formato Primero se probó la habilidad de MB1 para identificar su objetivo usando un espectrómetro de fluorescencia (Jasco Fluorescence Spectrometer F-750). MB1 híbrida con un exceso de T en presencia de una concentración de sal arriba de 5 mM. Se probó los reguladores de hibridación diferentes y sales como se mencionó antes usando diferentes concentraciones para obtener el mejor resultado con la mínima concentración de sal en solución, la concentración de sal en efecto influye en el proceso de sensibilización del fotopapel. El comportamiento de fluorescencia de MB1 por lo general fue consistente con los datos reportados en la literatura [15]. Aquí se reporta varios ejemplos de análisis de fluorescencia de MB en diferentes condiciones operativas. En un experimento de MBDP típico 1 µ?_ de la solución de analito se coloca en el fotopapel. La evaporación del solvente y la penetración de la muestra en la resina del papel se pueden lograr lentamente a temperatura ambiente (30-60 minutos) o rápidamente (1-5 minutos) colocando el fotopapel en una superficie caliente debajo de 40°C. El último método parece mejorar la adsorción de la muestra en el fotopapel como destacado por la sensibilidad mejorada. Cabe señalar que solamente el colorante adsorbido a la superficie de haluro de plata es efectivo como sensibilizador [11]. Se usó llfospeed RC Deluxe (llford) como papel fotográfico. Una vez adsorbidas las gotas de 1 µ!_ en el fotopapel, se irradió con luz blanca a través de 55 nm de filtro cortado y un filtro de densidad 0.5 OD. El revelado del fotopapel se logró usando soluciones estándar y comercialmente disponibles. El procedimiento completo se realizó en un cuarto obscuro. La única instrumentación no incluida en un cuarto obscuro estándar usado en estos experimentos consiste de una micro-pipeta para la deposición de muestra y un espectrómetro de fluorescencia. 2. Resultados y discusiones 2.1 Experimentos preliminares Se preparó una solución de 1 µ? B1 en agua conteniendo Tris-HCI (pH 8, 10 mm) y MgCI2 (1 mM). A una carga de esta solución se agregó un exceso grande de T (10 µ?). Ambas cargas y un frasco en donde solamente una solución de T (10 µ?) estaba presente (10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM gCI2) se calentaron a 80°C durante 5 minutos y después se enfrió lentamente. Todas las muestras se analizaron por espectrometría de fluorescencia y en paralelo al manchar 1 µ? de cada una de las tres soluciones - más una solución de referencia que contiene los reguladores de hibridación - en el fotopapel comercialmente disponible. Los resultados de este primer experimento se muestran en la figura 5. Bajo estas condiciones, ya es posible distinguir entre la forma cerrada de MB1 (1 µ?_ de 1 µ? sol. = 1 pmol) en la mancha 3 y la forma abierta en donde MB1 se recose con T (1:10) en la mancha 4. Aunque la mancha 3 da una señal positiva débil también, esto se debe a la alta concentración usada en este primer experimento y a la saciedad no cuantitativa del colorante. En efecto hay una señal de fluorescencia residual de MB1 en esta forma cerrada (detectable por espectrómetro de fluorescencia) incluso a temperaturas bajas (a en la figura 4). Las manchas 1 y 5 son las referencias y su color blanco (negativo falso) es en contraste con el aspecto de la mancha 2 relativo al objetivo T (1 µ? de 10 µ? sol. = 10 pmol) en donde cualquier sensibilizador (colorante) está faltando. El aspecto blanco de las manchas de referencia se puede deber a la interacción de aniones de cloruro presentes en la solución de referencia (10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM MgCI2) con los cationes de plata del fotopapel. En efecto usando estas condiciones (alta concentración de Cl) cuando la concentración de cualquier ODN Cy3-marcado está debajo de 0.05 µ? se puede detectar una señal blanca negativa. Sobre esta concentración, la sensibilización espectral del papel debido al colorante del ODN marcado realiza el efecto negativo de las sales. ODNs no marcados dan resultados positivos falsos débiles para altas concentraciones. En vista de esta evidencia del experimento, es posible explicar la mancha 2 relativa a la solución del objetivo T. Con un experimento tan fácil se verificó que el principio de sonda fluorescente es aplicable para la técnica de fotografía de ADN detectando 10 picomoles de T. Después se investigó diferentes condiciones para mejorar la relación de señal / antecedentes y muchos otros parámetros a fin de extender la aplicabilidad de este método a la detección de sub-picomoles (< 10"12 moles) de objetivo. 2.2 Detección de 600 femtomoles de objetivo T Las manchas negras del experimento mostrado en la figura 6 (tabla 1) no son tan intensas como en el experimento previo. Sin embargo, la interpretación de este experimento se logró por el uso paralelo del espectrómetro de fluorescencia. Esta falta de resolución se debe a la baja concentración de la muestra y al efecto de sal antes mencionado. En la línea A de este experimento se estableció la reversibilidad del proceso con base en los roles de hibridación. Una vez recosida la B1 con este objetivo T (A4 en la tabla 1 y en la figura 6), es posible "apagar" la señal así generada al agregar la cadena contadora de T (en A5). Esta cadena híbrida con T en competencia con MB1. La hibridación de T / T será favorecida en la hibridación de T / MB1 por el exceso grande de T' usado y por factores termodinámicos (MB1 puede formar una horquilla estable). En A6, la fluorescencia de la mezcla en el espectrómetro de fluorescencia y la mancha en el fotopapel se restauran por la adición de T. El ADN no marcado formado por hibridación de T / T da una mancha negativa en el fotopapel (A7) incluso para las altas concentraciones de 1.2 µ? usadas aquí.

Tabla 1 [MB] = 0.1 µ? ; [T] = 0.6 µ? (exceso de 6 veces). T" = (5'-CCCTTGAGGCGTGGCT-3 ) cadena contadora de T En la linea B de la figura 6, la concentración de MB1 se 10 veces menor que en los primeros experimentos. T se usó en un exceso de 6 veces y la concentración reguladora disminuyó a 5 mM de Tris-HCI pH 8 y 0.5 mM de MgCI2. En dichas condiciones experimentales todavía es posible detectar el objetivo T presente en la mancha B4 en una concentración de 0.6 µ?. Estos 600 femtomoles de T se han detectado con esta prueba. Las manchas B7 y B8 aquí se usan como referencias. Consisten de una solución reguladora (5 mM Tris-HCI pH 8 y 0.5 mM MgCI2) de un ODN Cy3-marcado comercialmente disponible (Cy3-ODN) en las concentraciones de 1 µ? y 0.1 JL/M, respectivamente. Cabe señalar que la intensidad de la mancha B8 es comparable - e incluso más débil - con aquella de la mancha B4. Esto condujo a dos conclusiones. En B8, el fotopapel muestra la presencia de un ODN marcado en una manera dependiente de concentración que es confiable para diferentes ODNs. Cy3-ODN en efecto da una señal más fuerte para la misma concentración usando las mismas condiciones de irradiación y desarrollo en ausencia de cualquier sal (ver, es decir, B8 en la figura 6 vs B3 en la figura 7). 2.3 Selección de diferentes reguladores de hibridación Se probaron diferentes reguladores y sales a fin de lograr la hibridación de MB1 con T con un efecto de sal mínimo en el fotopapel. Una lista de reguladores seleccionados usados para este propósito se puede encontrar en la sección de Materiales y Métodos. Ninguno de estos reguladores mejoró los desempeños ya logrados usando el regulador H para la aplicación de MBDP aunque muchos de ellos muestran buenas propiedades de hibridación monitoreadas por fluorescencia (figura 4). Algunos ejemplos se reportan en la línea A (figura 7, tabla 2).

Tabla 2 [MB] = 0.2 µ?; [T] = 0.6 µ (exceso de 3 veces). * + 5µ?_ H; ** + 5µ?_ H6; *** + 3µ?_ H3 + 10 µ?_ H6. # + 30 µ? ?3 En este caso particular, se usó MB1 en una concentración de 0.2 µ? y solamente un exceso de 3 veces de T. Este pequeño exceso de T es suficiente para una hibridación eficiente como se muestra en A3 y A4 (figura 7) y se ha confirmado por monitoreo de fluorescencia. Las manchas A6 y A7 dan ninguna señal debido a la presencia de una sal diferente en la mezcla de muestra. En la línea C (figura 7) las soluciones de referencia que contienen solamente agua y los reguladores se detectan en la misma concentración usada para los experimentos de hibridación. Algunos de los reguladores ¡nteractúan con el fotopapel incluso en ausencia de iones de cloruro. En algunos casos, incluso es posible detectar un resultado positivo como para H8 y para H6 en C9 de la figura 7. La línea B en la tabla 2 y en la figura 7 es el Cy3-ODN de referencia ya mencionado. Aquí este ODN simplemente se disuelve en agua y se detecta en una serie de dilución de 10 µ a 100 fM. Se concluyó que la naturaleza de las sales empleadas en los experimentos y su concentración pueden influir fuertemente en la sensibilidad del método. 3. Conclusiones La presente invención describe un método novedoso para detectar biomoléculas usando el principio de fotografía en blanco y negro. Se pueden lograr niveles de sensibilidad picomolar sin optimización extensiva. La técnica se basa en las propiedades de hibridación altamente específicas de ADN. Experimentos preliminares muestran que esta técnica es fácil de usar y poco costosa aunque resultados sorprendentes ya se podrían lograr con ella. Hasta ahora, el límite de detección usando el fotopapel comercial antes mencionado y las condiciones reportadas aquí es 600 femtomoles de objetivo T por 1 µ? de solución analizada. Este límite es dependiente de la naturaleza de las sales y el fotopapel usado, y se puede modular al usar colorantes diferentes y fuentes de luz diferentes. La detección de una secuencia de ADN seleccionada en el rango nanomolar (femtomoles de objetivo) es un resultado sorprendente para dicho método fácil y rápido. Se pueden detectar agentes diferentes usando diferentes MBs al mismo tiempo ya que la especificidad de estas sondas es bien establecida en la literatura [16]. MBs en efecto se aplican en estudios de polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) y en detección multiplex de objetivos diferentes también [17]. La modificación reportada de la estructura de MBs como en las MBs a base de ácido nucleico cerrado (LNA-MBs) [18] o de las parejas de colorante / saciador como para MBs con supersaciadores [19] o con saciadores de oro [17] hacen de estas MBs los candidatos perfectos para muchas aplicaciones. Adicionalmente, incluso seria posible diseñar tiras de fotopapel específicas en donde muchas MBs ya se absorben. Al usar diferentes fuentes de luz (o diferentes filtros) para cada MB sería posible detectar diferentes objetivos específicos simultáneamente. Además, MBs multiplicadas-modificadas se podría diseñar y sintetizar usando la f uncionalización de click-química de ADN desarrollado en los laboratorios [20], así aumentando drásticamente la disponibilidad de MBs especificas en un modo modular y práctico. El contenido de los documentos citados en la presente solicitud se incorpora a la presente por referencia.

REFERENCIAS R. K. Saiki, S. S., F. Faloona, K. B. Mullís, G. T. Horn, H. A.

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Claims

REIVINDICACIONES 1.- Un método para detectar un analito en una muestra que comprende los pasos: i proveer una muestra, ii proveer una molécula reportera que comprende un grupo fotosensibilizador o un grupo de manejo para introducir un grupo fotosensibilizador y un grupo saciador en donde el grupo fotosensibilizador se sacia en ausencia del analito a detectarse, iii contactar la muestra con la molécula reportera bajo condiciones en donde la saciedad del grupo fotosensibilizador es al menos parcialmente reducida o terminada en presencia del analito, iv de ser necesario, hacer reaccionar el grupo de manejo con una pareja de reacción que comprende un grupo fotosensibilizador, v irradiar dicha molécula reportera en contacto con un medio fotosensible bajo condiciones en donde grupos marcadores se forman en dicho medio fotosensible en presencia de grupos fotosensibilizadores no saciados en dicha molécula reportera, y vi detectar dichos grupos marcadores. 2 - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el analito se selecciona a partir de ácidos nucleicos y moléculas de unión a nucleósido, nucleótido o ácido nucleico. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el analito a detectarse es un ácido nucleico seleccionado a partir de ADN y ARN. 4 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra es una muestra biológica. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde la muestra es una muestra agrícola, muestra nutricional o una muestra clínica. 6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la detección se lleva a cabo directamente sin amplificación. 7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la detección se lleva a cabo en combinación con un paso de amplificación. 8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la molécula reportera es una molécula de ácido nucleico. 9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el grupo de manejo se selecciona a partir de grupos de azida y alquino. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dichos grupos de azida se hacen reaccionar al realizar una reacción Click con un grupo alquino de una pareja de reacción que comprende un grupo fotosensibilizador. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dichos grupos alquino se hacen reaccionar al realizar una reacción Click con un grupo azida de una pareja de reacción que comprende un grupo fotosensibilizador. 12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde los grupos fotosensibilizadores se seleccionan a partir de grupos de colorante fluorescente. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde los grupos fotosensibilizadores se seleccionan a partir de grupos indolita a base de cianina y grupos quinolina. 14. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el medio fotosensible comprende átomos o iones metálicos capaces de formar núcleos metálicos. 15 - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el metal es Ag. 16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el medio fotosensible es un papel sensible a la luz tal como papel fotográfico o una emulsión sensible a la luz o gen en un material de soporte. 17. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el paso de irradiación (v) se lleva a cabo con luz visible de onda larga y/o con luz infrarroja. 18. - Un equipo reactivo para detectar un analito en una muestra que comprende: a una molécula reportera que comprende un grupo fotosensibilizador o un grupo de manejo para introducir un grupo fotosensibilizador y un grupo saciador en donde el grupo fotosensibilizador se sacia en ausencia del analito a detectarse, b opcionalmente una pareja de reacción para el grupo de manejo que comprende un grupo fotosensibilizador y c un medio fotosensible que forma grupos marcadores al momento de irradiación de grupos fotosensibilizadores no saciados. 19. - El equipo de conformidad con la reivindicación 18, en donde la molécula reportera está presente como reactivo impregnado en el medio fotosensible. 20. - Uso de un equipo de reactivo de conformidad con la reivindicación 18 ó 19 en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17. 21. - Uso del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o el equipo de reactivo de conformidad con la reivindicación 18 ó 19 para aplicaciones agrícolas, aplicaciones médicas, diagnósticas y forenses, detectar función y/o expresión de genes, para protección de marca o para aplicaciones nutricionales, en particular en el área de alimentación. 22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para detectar un analito que se ha modificado por ingeniería genética. 23.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para detectar un analito que es un producto de un organismo genéticamente modificado.