MX2008012721A

MX2008012721A - Composiciones y metodos para el analisis y tratamiento de sindrome de consuncion por sida y disfuncion de celulas inmunes.

Info

Publication number: MX2008012721A
Application number: MX2008012721A
Authority: MX
Inventors: Stephen S Dominy
Original assignee: Unversity Of California
Priority date: 2006-04-05
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2009-02-20
Also published as: EP2004841A4; WO2007117596A1; AU2007235328A1; CN101415835A; US20100009340A1; CA2648459A1; EP2004841A1

Abstract

La presente invención se refiere a la señalización celular aberrante por parte de la glicoproteína de envoltura de VIH tipo I. En particular, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la identificación de inhibidores del estímulo de la senda del receptor de melanocortina por parte de VIH-I gpI20 y sus productos de degradación. Se contempla que los inhibidores así identificados son adecuados para el tratamiento de caquexia relacionada con VIH, hiperactivación de células-T, y enfermedad del sistema nervioso central.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL ANÁLISIS Y TRATAMIENTO DE SÍNDROME DE CONSUNCIÓN POR SIDA Y DISFUNCIÓN DE CÉLULAS INMUNES La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos de América Número 60/789,827, presentada el 5 de abril de 2006, incorporada en la presente mediante referencia. Campo de la Invención La presente invención se relaciona con la señalización aberrante celular por parte de la glicoproteína de envoltura del VIH tipo I. En particular, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la identificación de inhibidores de la estimulación de la senda del receptor de melanocortina por VIH-1 gp 120 y sus productos de degradación. Se considera que los inhibidores así identificados son convenientes para tratar la caquexia relacionada con el VIH, la hiperactivación de las células T y la enfermedad del sistema nervioso central. Antecedentes de la Invención Una pérdida del peso corporal involuntaria y progresiva es un síntoma de la infección por VIH (caquexia relacionada con VIH). Como lo define el Centro para el Control de Enfermedades, cuando estas pérdidas de peso llegan a ser mayores del 10 por ciento ( 10%) en el peso corporal normal y se combina ya sea con diarrea crónica o debilidad crónica y fiebre en ausencia de infección secundaria, la pérdida de peso se clasifica como síndrome de consunción relacionado con VIH (por ejemplo, síndrome del consunción por SIDA). Se sabe que el síndrome de consunción representa un papel importante en la disminución de la calidad de vida en los pacientes con SIDA y contribuye a la morbilidad y mortalidad de los pacientes infectados con VIH. El síndrome de consunción por SIDA clásico fue un lugar común antes de la introducción de la terapia anti-retroviral muy activa (HAART). Aún así, un número significativo de pacientes todavía padece de caquexia y síndrome de consunción relacionadas con VIH (Hoffmann, Rockstroh, Kamps y colaboradores, HIV Medicine 2006, website). Más aún, la pérdida de peso sigue siendo un factor independiente de riesgo de mortalidad aún en la era de HAART (Tang y colaboradores, J AIDS, 31:230-236, 2002). Los pacientes con síndrome de consunción clásico también tienen un riesgo elevado de infección oportunista, (Dworkin y Williamson, J AIDS, 33:267-273, 2003) y pueden experimentar deterioro cognitivo (Dolan y colaboradores, J AIDS, 34:155-164, 2003). Se han investigado distintos regímenes de tratamiento, incluyendo alimentación (enteral y parenteral), estimulantes del apetito, agentes anabólicos, moduladores de la citoquina y suplementos de ácidos grasos con éxito limitado. De este modo, lo que se necesita en la técnica es un tratamiento alternativo para la caquexia y el síndrome de consunción relacionados con el VIH. Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona con la señalización aberrante celular por parte de la glicoproteína de envoltura del VIH tipo I. En particular, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la identificación de inhibidores de la estimulación de la senda del receptor de melanocortina por VIH-1 gp120 y sus productos de degradación. Se contempla que los inhibidores así identificados son convenientes para tratar la caquexia relacionada con el VIH, la hiperactivación de las células T y la enfermedad del sistema nervioso central. En particular, la presente invención proporciona métodos para detectar anticuerpos en una muestra que comprenden: proporcionar i) una muestra, en donde la muestra comprende anticuerpos; y ii) un polipéptido que consiste en un epítopo de melanotropina de VIH-1; poner en contacto el polipéptido con la muestra bajo condiciones convenientes para enlazar los anticuerpos con el epítopo de melanotropina de VIH-1 del polipéptido; y detectar los anticuerpos reactivos al epítopo de la melanotropina del VIH-1 enlazados al polipéptido. En algunas modalidades, la detección comprende un ensayo inmunosorbente de enlazado con enzimas y/o un Western blot. En algunas modalidades preferidas, la muestra es de un paciente infectado por VIH-1. En otras modalidades, la muestra es de un receptor de la vacuna de SIDA (por ejemplo, alguien que puede o no ser VIH-1 positivo). En algunas modalidades, los métodos además comprenden un paso para proporcionar un pronóstico de desarrollar la enfermedad de consunción por SIDA al sujeto basado en un nivel reducido o ausente de los anticuerpos reactivos al epítopo de la melanotropina del VIH-1. En otras modalidades, los métodos además comprenden el paso de proporcionar el pronóstico de desarrollar disfunción de células T reguladoras del VIH-1 al sujeto basándose en un nivel reducido o ausente de los anticuerpos reactivos al epítopo de la melanotropina del VIH-1. En algunas modalidades preferidas, los métodos además comprenden un paso de proporcionar un pronóstico de contraer VIH-1 al receptor de la vacuna de SIDA basándose en un nivel reducido o ausente de anticuerpos reactivos al epítopo de la melanotropina del VIH-1. En otras modalidades, la muestra es del sobrenadante de un cultivo celular de hibridoma. En algunas modalidades el polipéptido comprende un fragmento de 50 kDa del VIH-1 gp120 producido por disociación con trombina. En otras modalidades, los polipéptidos comprenden un vehículo (por ejemplo, BSA, KLH, etcétera). En algunas modalidades particularmente preferidas, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 24. En otras modalidades preferidas, el polipéptido comprende una proteína de VIH-1 gp120. También se proporcionan métodos que además comprenden un paso para detectar anticuerpos que neutralizan el VIH-1 en un ensayo in vitro. Adicionalmente, la presente invención proporciona kits para detectar anticuerpos en una muestra, que comprenden: un polipéptido que comprende un epítopo de la melanotropina del VIH- 1; e instrucciones para detectar anticuerpos reactivos con el epítopo de la melanotropina del VIH-1 en una muestra. En algunas modalidades, los kits además comprenden un polipéptido de control negativo. En otras modalidades, los kits además comprenden un anticuerpo de control positivo y un anticuerpo de control negativo. En algunas modalidades preferidas, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 17 o 24. Más aún, la presente invención proporciona métodos para identificar un compuesto como un inhibidor de la estimulación del epítopo de la melanotropina del VIH-1 de un receptor de melanocortina humano (MCR), que comprende proporcionar: (i) una línea celular que expresa un MCR humano; (ii) un polipéptido que comprende un epítopo de la melanotropina del VIH-1; (iii) un compuesto; poner en contacto la línea celular con el polipéptido en la presencia y ausencia del compuesto bajo condiciones convenientes para estimular el MCR humano con el polipéptido, en donde la estimulación del MCR humano en la ausencia pero no en la presencia del compuesto indica que el compuesto es un inhibidor del epítopo de la melanotropina del VIH-1. En algunas modalidades, los métodos además comprenden identificar el compuesto como un inhibidor de la estimulación de la hormona del neuropéptido humano o del MCR humano poniendo en contacto la línea celular con una hormona de neuropéptido humano en la presencia y la ausencia del compuesto bajo condiciones convenientes para estimular el MCR con la hormona del neuropéptido humano, en donde la estimulación del MCR humano en la ausencia pero no en la presencia del compuesto indica que el compuesto es un inhibidor de la hormona del neuropéptido humano. En algunas modalidades preferidas, el MCR humano es MC4R. En otras modalidades preferidas, el MCR humano se selecciona entre el grupo que consiste en MC1R, MC2R, MC3R, y MC5R. En algunas modalidades particularmente preferidas, la línea celular es una línea celular transgénica que expresa el MC4R. En algunas modalidades preferidas, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 17 o 24. También se proporciona por la presente invención las modalidades en las cuales la hormona de neuropéptido humano se selecciona entre el grupo que consiste en la hormona que estimula el melanocito alfa (alfa-MSH), la adrenocorticotropina (ACTH), la hormona estimulante del melanocito beta (beta-MSH) y la hormona estimulante del melanocito gamma (gamma-MSH). Descripción de las Figuras La Figura 1 A muestra la secuencia de aminoácidos de la pre-proteína pro-opiomelanocortina (POMC) (SEQ ID NO: 1). La Figura 1 B muestra una alineación de los ligandos receptores de la melanocortina derivada de POMC de la hormona estimulante del melanocito alfa (alfa-MSH o alfa-melanotropina presentada como la SEQ ID NO:2), la hormona estimulante del melanocito beta (beta-MSH o beta-melanotropina presentada como SEQ ID NO:3), la hormona estimulante del melanocito gamma (gamma-MSH o gamma-melanotropina presentada como SEQ ID NO:4), la hormona adrenocorticotrópica (ACTH o adrenocorticotropina presentada como SEQ ID NO: 5) con un fragmento de VIH-1 SF2 gp120 mostrado en la orientación inversa (el péptido K13M presentado como SEQ ID NO:6). Como se muestra en esta alineación, los residuos de tirosina (Y), arginina (R), y triptófano (W) se conservan en las cinco secuencias. La Figura 2 A muestra la secuencia de ADNc del variante transcrito POMC 1 (SEQ ID NO: 7) de GENBANK Número de acceso NM_001035256. La Figura 2B muestra la secuencia de ADNc del transcrito de POMC 2 (SEQ ID NO: 8) de GENBANK Número de acceso NM_000939. El variante 1 más largo contiene la secuencia adicional en la región no traducida 5' (UTR) en comparación con el variante 2 más corto, aunque ambas secuencias de ADNc codifican la misma secuencia de proteínas POMC. La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la envoltura (Env) gp160 (SEQ ID NO: 9) del aislado SF2 del VIH-1. Los residuos 1-27 corresponden a la secuencia de péptido de señal, los residuos 28-509 corresponden a la secuencia gp120 (SEQ ID NO: 15), y los residuos 510-855 corresponden a la secuencia de gp41 (SEQ ID NO: 16). La Figura 4 muestra ia secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 10) que codifica la secuencia de envoltura Env gp160 de la Figura anterior. Esta secuencia corresponde al aislado de VIH-1 SF2 de GENBANK Número de acceso KO2007 (Sánchez-Pescador y colaboradores, Science, 227:484-492, 1985). La Figura 5 A muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de melanocortina 4 (MC4R como se presenta en SEQ ID NO: 11). La Figura 5 B muestra la secuencia de ADNc de MC4R (SEQ ID NO: 12) de GENBANK Número de acceso NM_005912. La Figura 6 A muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de melanocortina 5 (MC5R como se presenta en SEQ ID NO: 13). La Figura 5 B muestra la secuencia de ADNc de MC5R (SEQ ID NO: 14) de GENBANK Número de acceso NM_005913. La Figura 7 proporciona una alineación del péptido que enlaza al receptor de melanocortina del VIH-1 SF2 gp120 (SEQ ID NO: 17) con las glicoproteínas de superficie del VIH-2CAM2 (SEQ ID NO: 18), VIH-2D205 (SEQ ID NO: 19), VIH-2D194 (SEQ ID NO: 20) y VISmac251 (SEQ ID NO: 21). Nótese que VIH-I gp120, pero no el VIH-2 y las glicoproteínas de superficie del VIS, contienen el residuo de triptófano conservado entre las hormonas derivadas de la POMC.

La Figura 8 demuestra que el VIH-1 SF2 #79 llamado el péptido G25G (SEQ ID NO: 17) activa el MC4R humano. La Figura 9 demuestra que el VIH-1SF2 #33 llamado el K13M (SEQ ID NO: 6) sintetizado en orientación inversa también activa el MC4R humano. La Figura 10 ilustra la mala regulación del desarrollo de las células T reguladoras CD4+CD25+ mediado por la estimulación del VIH-1 gp120 de las células T MC5R + , conduciendo a la hiperactivación y la posterior vaciamiento de células T. La secuencia de alfa-MSH no ligado se proporciona como SEQ ID NO: 2, mientras que la secuencia del epítopo de melanotropina viral K13M ligado se proporciona como SEQ ID NO: 6.

La Figura 11 ilustra una estructura del VIH-1 gp 120 a la izquierda y una estructura de un fragmento de 50 kDa a la derecha. El VIH-1 gp120 es disociado por trombina dentro del ciclo V3 que libera dos fragmentos (de aproximadamente 70 kDa y 50 kDa). La localización de un epítopo de melanotropina del VIH-1, que se expone después de la disociación se indica mediante la flecha. La Tabla 1 enlista las propiedades farmacológicas y la distribución de los subtipos de receptores de la melanocortina. La Tabla 2 enlista las características de los participantes en la cohorte UCSF SCOPE. La Tabla 3 enlista las moléculas del sistema nervioso central humano del Programa de Rastreo de Fármacos Psicoactivos (PDSP) del Instituto Nacional para la Salud Mental (NIMH), que se rastrean en ensayos de enlace y/o funcionales con VIH-1 gp120, sus productos de la degradación y péptidos sintéticos que comprenden un epítopo de melanotropina del VIH-1.

G o en o en Tabla 1 Propiedades farmacológicas y distribución de subtipos de receptores de melanocortina Potencia de ligando/ Subtipo Distribución del tejido Funciones antagonistas endógenos C1 R Alfa-MSH=ACTH>beta-MSH>>gamma- Macrófagos, leucocitos Anti-inflamación MSH Agouti elanocitos, Pigmentación queratinocitos MC2R ACTH Corteza adrenal Esteroidogénesis MC3R Alfa-MSH=ACTH=beta-MSH = gamma- CNS, placenta Funciones autónomas MSH AGRP Homeostasis de energía Anti-inflamación MC4R Alfa-MSH=ACTH=beta-MSH>>gamma- CNS Homeostasis de MSH Agouti, AGRP alimentación y energía IV) o a? en -Mucenience R, y colaboradores, beta-MSH inhibits brain inflamation via MC3/4 receptors and NF-kB signaling. J. Neuroimmunology 2005; 169:13-19. -Chaki S., Okuyarna S. Involvement of melanocortin-4 receptor in anxiety and depression. Peptides 2005; 26:1952-1964.

IV) IV) en o en Tabla 2 Supresores Tratados Tratados Virológicos No tratados Supresores No supresores originales y/o Totales N = 110 virológicos virológicos progresores a N= 635 N = 118 N=312 largo plazo N = 96 Edad 43 (38-47) 45 (39-50) 45 (40-51) 45 (38-50) 44 (39-50) (mediana) Sexo masculino 81 (73.6) 107 (90.7) 281 (90.1) 74 (79.6) 534 (85.5) Etnia (%) Blanco 59 (53.6) 74 (62.7) 173 (55.5) 42 (44.2) 348 (54.8) Negro 33 (30.0) 19 (16.1) 70 (22.4) 35 (36.8) 157 (24.7) Hispánico 7 (6.4) 8 (6.8) 37 (11.9) 8 (8.4) 60 (9.5) Asiático/IP 6 (5.5) 8 (6.8) 8 (2.6) 2 (2.1) 24 (3.8) Otro 5 (4.5) 9 (7.5) 24 (7.7) 8 (8.4) 46 (7.2) Orientación sexual (%) Heterosexual 40 (36.4) 20 (17.0) 57 (18.3) 29 (30.5) 146 (23.0) Homo/bisexual 70 (63.6) 98 (83.0) 254 (81.7) 66 (69.5) 488 (77.0) CD4, mediana 298 (192-413) 472 (338-665) 250 (131-437) 663 (471-781) 360 (197-560) (IQR) Plasma HIV ARN (%) <75 copias/ml 0 112 (95.7) 39 (12.9) 29 (36.3) 180 (29.6) 75-1 ,000 0 4 (3.4) 61 (20.2) 25 (31.3) 90 (14.8) 1001-10,000 27 (24.5) 1 (0.9) 76 (25.2) 24 (30.0) 126 (21.0) 10,001-100,000 52 (47.3) 0 90 (29.8) 2 (2.5) 144 (23.7) >100,000 31 (28.2) 0 36 (11.9) 0 67 (11.0) Características de los participantes en la cohorte de UCSF SCOPE Tabla 3. Institutos Nacionales de Salud Mental (NIMH) Programa de Rastreo de Fármacos Psicoactivos (PDSP) Componentes del Ensayo de Enlace COMPUESTO DE RECEPTOR RADIOLIGANDO REFERENCIA Receptores 5-HT 5-HT1 A 3H-8-OH-DPAT 5-HT 5-HT1B 3H- GR125743 ERGOTAMINA 5-HT1 Da 3H- GR125743 ERGOTAMIN A 5-HT1 Db 3H- GR125743 ERGOTAMINA 5-HT1 E 3H-SHT SHT 5-HT1 F 3H-SHT SHT 5-HT2A 3H-cetanserina Clorpromazina 5-HT2B 3H-LSD Norfenfluramina 5-HT2C 3H-mesulerg¡na Clorpromazina 5-HT3 3H-zacopr¡da LY-278,584 5-HT4 3H-SHT SDZ-205557 5-HT5A 3H-LSD Ergotamina COMPUESTO DE RECEPTOR RADIOLIGANDO REFERENCIA 5-HT6 3H-LSD Clorpromazina 5-HT7 3H-LSD Clorpromazina Receptores de dopamina D1 3H-SCH23390 SKF38393 D2 3H-N- et¡lesp¡perona HALOPERIDOL D3 3H-N-Metilespiperona Clorpromazina D4 3H-N-Metilespiperona Clorpromazina D5 SKF38393 SCH23390 Receptores muscarínicos M1 3H-QNB Pirenzepina 2 3H-QNB Metoctramina M3 3H-QNB 4-DAMP M4 3H-QNB Tropicamida M5 3H-QNB Pirenzepina Receptores adrenérgicos COMPUESTO DE RECEPTOR RADIOLIG ANDO REFERENCIA Alfa1A 3H-Prazosina Uripadil Alfa1B 3H-Prazosina Corinatina Alfa2A 3H-Colidina Oximetazolina Alfa2B 3H-Colidina Prazosina Beta! 1251-Pindolol Atenolol Beta2 251-Pindolol Atenolol Beta3 1251-Pindolol Atenolol Receptores de opiatos Mu 3H-Diprenorfina Naloxona Delta 3H-DADLE Naltrindol Kappa 3H-Bremazocina Naloxona Receptores nicotínicos Muchos 3H-Epibatidina Nicotina subtipos Receptores GABA COMPUESTO DE RECEPTOR RADIOLIG ANDO REFERENCIA GABA 3H-Muscimol GABA GABA 3H-SR 95531 GABA GABA 3H-Ro 15-4513 Benzodiazepina GABA 3H-Ro 15-1788 Benzodiazepina GABA 35S-TBPS Canal del receptor Receptores de glutamato ionotrópicos NMDA 3H-MK801 MK-801 Sitio de PCP 3H-TCP PCP Sitio de 3H-Ácido caínico Ácido glutámico Cainato Receptores peptídicos Galanina 125I-GALANINA Galanina CRFR1 1251-CRF CRF CRFR2 NPY-Y1 1251-NPY COMPUESTO DE RECEPTOR RADIOLIGANDO REFERENCIA NPY-Y2 1251-NPY NPY 3-36 Neurotensina 125l-Tyr3-NT Neurotensina Transportadores VMAT2 3H-Cetanerina Reserpina SERT 3H-Citalopram Fluoxetina NET 3H-Nisoxitina Nortriptilina DAT 3H-WIN35428 4',4"-Difluoro-3a- (difenilmetoxi)- tropano, HCL Definiciones El término "gen" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias de codificaciones necesarias para la producción de un polipéptido o precursor (por ejemplo, VIH-1 ENV). El polipéptido puede estar codificado por una secuencia de codificación de longitud entera o por cualquier porción de la secuencia de codificación en tanto que retengan la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, la actividad enzimática, el enlace de ligandos, la transducción de señales, etcétera) de la longitud entera o el fragmento. El término también abarca la región de codificación de un gen estructural y las secuencias incluyentes localizadas adyacentes a la región de codificación tanto en el extremo 5' como en el 3' por una distancia de aproximadamente 1 kb en cualquiera de los dos extremos de manera que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud entera. Las secuencias que se localizan en 5' de la región de codificación y las cuales están presentes en el ARNm se les conoce como secuencias no traducidas 5'. Las secuencias que se localizan en 3' o corriente abajo de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se conocen como secuencias no traducidas 3'. El término "gen" abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región de codificación interrumpida con secuencias no codificadas llamadas "intrones" o "regiones de intervención" o "secuencias de intervención". Los intrones son segmentos de un gen que están transcritos en ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como mejoradores. Los intrones se remueven o "se separan" de la transcripción nuclear o primaria; los intrones por lo tanto están ausentes en el transcrito ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de aminoácidos en un polipéptido naciente. En particular, el término "gen de VIH-1 ENV" se refiere a la secuencia de nucleótidos del VIH-1 ENV de longitud completa. Sin embargo, también se pretende que el término abarque fragmentos de las secuencias del VIH-1 ENV, así como otros dominios dentro de la secuencia de nucleótidos del VIH-1 ENV de longitud completa. Además, los términos "secuencia de nucleótidos HIV-1 ENV" o "secuencia de polinucleótidos VIH-1 ENV" abarca las secuencias de ADN, ADNc, y ARN (por ejemplo, ARNm). Cuando se menciona la secuencia de aminoácidos en la presente para referirse a la secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína que se presenta naturalmente, la secuencia de aminoácidos y los términos semejantes, tales como polipéptido o proteína, no significa que limitan la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos natural completa asociada con la molécula de la proteína citada. Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias localizadas tanto en el extremo 5' como en el 3' de las secuencias que están presentes en la transcripción de ARN. Estas secuencias se conocen como secuencias de "flanqueo" o regiones (estas secuencias de flanqueo se localizan en 5' o 3' para las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región de flanqueo 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores o mejoradores que controlan o influencian la transcripción del gen. La región de flanqueo 3' puede contener secuencias que dirijan la terminación de la transcripción, la disociación post transcripción y la poliadenilación. El término "tipo original" se refiere a un gen o producto de gen que tiene las características de ese gen o ese producto de gen cuando se aisla de una fuente que se presenta naturalmente. Un gen del tipo original es aquel que se observa más frecuentemente en una población y de este modo se designa arbitrariamente la forma "normal" o "tipo original" del gen. En cambio, los términos "modificado", "mutante" o "variante" se refieren a un gen o producto de gen que presenta modificaciones en secuencias o en propiedades funcionales (es decir, características alteradas) en comparación con el gen o producto del gen del tipo original. Se nota que los mutantes que se presentan naturalmente pueden ser aislados; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas en comparación con el gen o producto del gen del tipo original. Como se usa en la presente, los términos "codificación de molécula de ácido nucleico", "codificación de secuencia de ADN" y "codificación de ADN" se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena de polipéptidos (proteínas). La secuencia de ADN de este modo codifica la secuencia de aminoácidos. Las moléculas de ADN ae dice que tienen extremos "extremo 5"' y "extremo 3"' debido a que los mononucleótidos se hacen reaccionar para hacer oligonucleótidos o polinucleótidos de una manera tal que el fosfato de un anillo pentosa de un mononucleótido se une al oxígeno 3' de su vecino en una dirección vía un enlace fosfodiéster. Por lo tanto, se le llama "extremo 5"' al extremo de un oligonucleótido o polinucleótido si su fosfato 5' no está enlazado al oxígeno 3' de un anillo pentosa de mononucleótido, y se le llama "extremo 3' " si su oxígeno 3' no está enlazado a un fosfato 5' de un anillo pentosa del mononucleótido subsiguiente. Como se usa en la presente, una frecuencia de ácidos nucleicos, aún si está interna a un oligonucleótido o polinucleótido, también se puede decir que tiene extremo 5' y 3'. En ya sea una molécula lineal o circular de ADN, a los elementos discretos se les conoce como que están "corriente arriba" o 5' de los elementos o "corriente abajo" o 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción avanza de una manera de 5' a 3' a lo largo de la cadena del ADN. Los elementos promotor y mejorador que dirigen la transcripción de un gen enlazado generalmente se localizan 5' corriente arriba de la región de codificación. Sin embargo, los elementos mejoradores pueden ejercer su efecto aún cuando se localicen 3' del elemento promotor y la región de codificación. La terminación de la transcripción y las señales de la poliadenilacion se localizan 3' o corriente abajo de la región de codificación. Como se usa en la presente, los términos "un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifican un gen" y "polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen", significa una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la región de codificación de un gen o, en otras palabras, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un producto de gen. La región de codificación puede estar presente en una forma de ADNc, ADN genómico, o ARN. Cuando se presenta en forma de ADN, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de cadena simple (es decir, la cadena en sentido) o de cadena doble. Los elementos de control convenientes tales como mejoradores /promotores, las uniones de división, las señales de poliadenilación, etcétera se pueden colocar en proximidad cercana a la región de codificación del gen si es necesario permitir la iniciación apropiada de la transcripción y/o corregir el procesamiento del transcrito de ARN primario. Alternativamente, la región de codificación utilizada en los vectores de expresión de la presente invención puede contener mejoradores /promotores endógenos, uniones de división, secuencias de intervención, señales de poliadenilación, etcétera, o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos. Como se usa en la presente, el término "elemento regulador" se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita la iniciación de la transcripción de una región de codificación enlazada operablemente. Otros elementos reguladores incluyen señales de división, señales de poliadenilación, señales de terminación, etcétera. Como se usa en la presente, los términos "complementario" o "complementariedad" se usan con referencia a los polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de pares de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" es complementaria a la secuencia "T-C-A". La complementariedad puede ser "parcial", en la cual solamente algunas de las bases de los ácidos nucleicos se aparean de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. O, puede ser una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de hibridación entre las cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los métodos de detección que dependen del enlace entre los ácidos nucleicos. El término "homología" se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber homología parcial u homología completa (es decir, identificación). Una secuencia parcialmente complementaria es una que al menos parcialmente inhibe una secuencia completamente complementaria de hibridarse a un ácido nucleico objetivo y se hace referencia a ella usando el término funcional "sustancialmente homologa". El término "inhibición del enlace" cuando se usa en referencia al enlace del ácido nucleico, se refiere a la inhibición del enlace causado por la competición de secuencias homologas para enlazarse a la secuencia objetivo. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria a la secuencia objetivo se puede examinar usando un ensayo de hibridación (Southern o Northern blot, solución de hibridación y similares) bajo condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia sustancialmente homologa o sonda completará e inhibirá el enlace (es decir, la hibridación) a un objetivo de baja rigurosidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita el enlace no específico; las condiciones de baja rigurosidad requieren que el enlace de dos secuencias una con otra sea una interacción (es decir, selectiva). La ausencia de enlace no específico se puede examinar mediante el uso de un segundo objetivo que carezca ya sea de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30 por ciento de identificación); en ausencia del enlace no específico la sonda no hibridará al segundo objetivo no complementario. La técnica conoce bien que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes que comprenden condiciones de baja rigurosidad; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de base) de la sonda y la naturaleza del objetivo (ADN, ARN, composición de las bases, presentes en solución o inmovilizadas, etcétera) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y la solución de hibridación se puede variar para generar condiciones de baja rigurosidad diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones enlistadas anteriormente. Además, en la técnica se conocen condiciones que promueven la hibridación bajo condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, aumentar la temperatura de la hibridación y/o los pasos de lavado, el uso de formamida en la solución de hibridación, etcétera). Como se usa en la presente, el término "compite para enlace se usa en referencia a un primer polipéptido con una actividad que enlaza al mismo sustrato como lo hace un segundo polipéptido con una actividad, en donde el segundo polipéptido es un variante del primer polipéptido, o un polipéptido relacionado o disímil. La eficiencia (por ejemplo, cinética o termodinámica) del enlace por el primer polipéptido puede ser la misma o mayor que o menor que la eficiencia por el segundo sustrato de polipéptido. Por ejemplo, la constante de enlace de equilibrio (KD) para enlazar el sustrato puede ser diferente para los dos polipéptidos. El término "Km" como se usa en la presente, se refiere a la constante de Michaelis-Menton para una enzima y se define como la concentración del sustrato específico el cual una enzima dada produce la mitad de su velocidad máxima en una reacción catalizada por una enzima. Como se usa en la presente, el término "hibridación" se usa en referencia al apareamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) es impactado por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones involucradas, la Tm del híbrido formado, y la proporción G:C con los ácidos nucleicos. Como se usa en la presente, el término "Tm" se usa en referencia a la "temperatura de fusión". La temperatura de fusión es la temperatura en la cual una población de moléculas de ácido nucleico de cadena doble se disocia a la mitad en cadenas simples. La ecuación para calcular la Tm de los ácidos nucleicos es muy conocida en la técnica. Como se indica por las referencias estándares, una estimación simple del valor de Tm se puede calcular mediante la ecuación: Tm =81.5 + 0.41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en solución acuosa a 1 M NaCI (Véase, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hibridization, 1985). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados que toman en cuenta características estructurales así como de secuencia para el cálculo de Tm. Como se usa en la presente, el término "rigurosidad" se usa en referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica y la presencia de otros compuestos tales como solventes orgánicos, bajo los cuales se llevan a cabo las hibridaciones de ácidos nucleicos. Los expertos en la técnica reconocerán que las condiciones de "rigurosidad" se pueden alterar variando los parámetros justo como se describe individualmente o en concierto. Con condiciones de "alta rigurosidad", el apareamiento de bases de los ácidos nucleicos ocurrirá solamente entre fragmentos de ácidos nucleicos que tienen una alta frecuencia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, hibridación bajo condiciones de "alta rigurosidad" se pueden presentar entre homólogos con una identificación del 85 a 100 por ciento, preferiblemente identificación del 70 al 100 por ciento). Con condiciones de "rigurosidad media" el apareamiento de bases de ácidos nucleicos ocurrirá entre ácidos nucleicos con una frecuencia intermedia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, la hibridación bajo condiciones de "rigurosidad media" puede ocurrir entre homólogos con aproximadamente una identificación del 50 al 70 por ciento). De este modo, las condiciones de rigurosidad "débil" o "baja" frecuentemente se requieren con ácidos nucleicos que se derivan de organismos que son genéticamente diversos, ya que la secuencia de frecuencias complementarias usualmente es menor. "Condiciones de alta rigurosidad" cuando se usa en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos comprende las condiciones equivalentes al enlace o hibridación a 42° centígrados en una solución que consiste en 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2P04 H20 y 1.85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), 0.5 por ciento de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 0.1X SSPE, 1.0 por ciento de SDS a 42° centígrados cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las "Condiciones de rigurosidad media" cuando se usa en referencia a la hibridación de ácido nucleico comprenden condiciones equivalentes al enlace o hibridación a 42° centígrados en una solución que consiste en 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2P04 H20 y 1.85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), 0.5 por ciento de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 1.OX SSPE, 1.0 por ciento de SDS a 42° centígrados cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las "Condiciones de baja rigurosidad" comprenden condiciones equivalentes al enlace o hibridación a 42° centígrados en una solución que consiste en 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2P04 H20 y 1.85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), 0.1 por ciento de SDS, 5X reactivo de Denhardt [50X de Denhardt contiene por 500 mililitros: 5 gramos de Ficoll (Tipo 400, Pharmacia), 5 gramos de albúmina de suero bovino (Fracción V; Sigma)] y 100 [micro]gramos/mililitro de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado que comprende una solución de 5X SSPE, 0.1 por ciento SDS a 42° centígrados cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más nucleótidos: "secuencia de referencia", "identificación de secuencia", "porcentaje de identificación de secuencia", e "identificación sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de, una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc de longitud completa dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia de gen completa. Generalmente, una secuencia de referencia es al menos de 20 nucleotidos de longitud, frecuentemente tiene al menos 25 nucleotidos de longitud, y frecuentemente al menos 50 nucleótidos de longitud. Ya que dos polinucleótidos puede cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que sea similar entre los dos polinucleótidos, y (2) puede además comprender una secuencia que sea divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos, típicamente se realizan comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación", para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", como se usa en la presente, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en donde una secuencia de polinucleótidos se puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) de 20 por ciento menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman [Smith y Waterman, Adv Appl Math, 2: 482 (1981)] mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch [Needleman y Wunsch, J Mol Biol, 48:443 (1970)], mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman [Pearson y Lipman, Proc Nati Acad Sci, EUA, 85:2444 (1988)], mediante implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Genética de Wisconsin del 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, resultando en el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por los distintos métodos. El término "identificación de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identificación de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se presenta la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identificación de secuencias. El término "identificación sustancial" como se usa en la presente, denota una característica de una secuencia de polinucleótidos, en donde el polinucieotido comprende una secuencia que tiene al menos el 80 por ciento de identificación de secuencias, de preferencia, al menos 90, 95, o 97 por ciento de identificación de secuencias y más preferiblemente al menos 99 por ciento de identificación de secuencia en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente sobre una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de identificación de secuencias se calcula comparando la secuencia de referencia a la secuencia del polinucleótido la cual puede incluir supresiones o adiciones las cuales totalizan el 20 por ciento o menos sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de las secuencias de longitud completa de las composiciones reclamadas en la presente invención (por ejemplo, VIH-1 Env). Cuando se aplica a los polipéptidos, el término "identificación sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de peso por omisión, comparten al menos el 80 por ciento de identificación de secuencias, de preferencia al menos 90 por ciento de identificación de secuencias, más preferiblemente al menos 95, 97 o 99 por ciento de identificación de secuencias. De preferencia, las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas naturales hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. El término "fragmento" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una supresión de terminal amino y/o terminal carboxilo en comparación con la proteína original, pero donde el resto de la secuencia de aminoácidos es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácidos deducida de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen al menos 4 aminoácidos de longitud, de preferencia al menos 10 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 15 aminoácidos de longitud, y todavía es más preferible que tengan 20 aminoácidos de longitud o más largos (por ejemplo, de 25 a 50 aminoácidos de longitud), y abarca la porción del polipéptido (por ejemplo, K13M de SEQ ID NO:6 o G25G de SEQ ID NO: 17) requerida para el enlace intermolecular de la composición (reclamada en la presente invención) con sus distintos ligandos y/o sustratos. El término "que se presenta naturalmente" como se usa en la presente aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo los virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y la cual no ha sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio es algo que se presenta naturalmente. "Amplificación" es un caso especial de la réplica de ácido nucleico que involucra especificidad de plantilla. Esto es en contraste con la réplica de plantilla no específica (es decir, la réplica que depende de una plantilla, pero no depende de una plantilla específica). La especificidad de la plantilla aquí se distingue de la fidelidad de réplica (es decir, la síntesis de la secuencia de polinucleótidos adecuada) y a especificidad de nucleótidos (ribo- o desoxirribo-). La especificidad de la plantilla frecuentemente se describe en términos de la especificidad "objetivo". Las secuencias objetivos son "objetivos" en el sentido en el que se busca que se aislen separándolos de otros ácidos nucleicos. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta separación.

La especificidad de plantilla se logra en la mayoría de las técnicas de amplificación escogiendo la enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, bajo las condiciones de uso, procesarán solamente secuencias específicas de ácido nucleico en una mezcla heterogénea de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las polimerasas Taq y Pfu, en virtud de su habilidad para funcionar a alta temperatura, se encuentra que despliegan alta especificidad para las secuencias enlazadas y de este modo definidas por los cebadores; la alta temperatura da como resultado condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación del cebador con las secuencias objetivo y no la hibridación en secuencias que no son objetivos. Como se usa en la presente, el término "objetivo", cuando se usa en referencia a la reacción en cadena de polimerasa, se refiere a la región de ácido nucleico enlazada por los cebadores usados para la reacción en cadena de polimerasa. Como se usa en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea que se presenta naturalmente como una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico, (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como una polimerasa de ADN y a una temperatura conveniente y pH conveniente). El cebador de preferencia es de cadena simple para la eficiencia máxima en la amplificación, pero alternativamente puede ser de cadena doble. Si es de cadena doble, el cebador primero se trata para separar sus cadenas antes de ser usado para preparar productos de extensión.

De preferencia, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente de inducción. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método. Como se usa en la presente, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos) , ya sea que se presenten naturalmente como una digestión de restricción purificada o producidos sintéticamente, recombinantemente o mediante amplificación por reacción en cadena de polimerasa que sea capaz de hibridar a otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de una sola cadena o de doble cadena. Las sondas son útiles para la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención será etiquetada con cualquier "molécula reportera", de manera que sea detectable en cualquier sistema de detección, incluyendo, pero sin limitarse a enzima (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), sistemas fluorescentes, radioactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a algún sistema o etiqueta particular de detección. Como se usa en la presente, el término "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al método de Mullís (Patente de los Estados Unidos de América Números 4,683,195, 4,683,202, y 4,965,188, incorporadas en la presente mediante referencia) para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. Este proceso para amplificar la secuencia objetivo consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores de oligonucleótidos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia objetivo deseada, seguida por una secuencia precisa de ciclado térmico en presencia de una polimerasa de ADN. Los dos cebadores son complementarios a sus cadenas respectivas de la secuencia objetivo de doble cadena. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se templan con sus secuencias complementarias dentro de la molécula objetivo. Después del temple, los cebadores se extienden con una polimerasa para así formar un nuevo par de cadenas complementarias. Los pasos de desnaturalización, temple de cebador, y extensión de la polimerasa se pueden repetir muchas veces, (es decir, la desnaturalización, el temple y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores uno con respecto al otro, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el método se conoce como "reacción en cadena de la polimerasa" (de aquí en adelante "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia objetivo se conviertan las secuencias predominantes (en términos de la concentración) en la mezcla, se dice que son "amplificados por PCR". Con PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia objetivo específica en ADN genómico a un nivel detectable mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda etiquetada; incorporación de cebadores biotinilados seguido por la detección del conjugado avidina-enzima; la incorporación de trifosfato desoxinucleótido etiquetado con 32P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Además del ADN genómico, cualquier secuencia de oligonucleótidos o polinucleótidos se puede amplificar con el conjunto apropiado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el proceso de PCR mismo, son, en sí mismos, plantillas eficientes para las amplificaciones subsecuentes de PCR. Como se usa en la presente, los términos "producto de PCR", "fragmento de PCR", y "producto de la amplificación" se refieren a la mezcla resultante de los compuestos después que se completan dos o más ciclos de los pasos de desnaturalización, endurecimiento y extensión de PCR. Estos términos abarcan el caso en donde ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias objetivo. Como se usa en la presente, el término "reactivos de amplificación" se refiere a los reactivos (trifosfato desoxirribonucleótido, regulador, etcétera), necesarios para la amplificación excepto los cebadores, la plantilla de ácido nucleico, y la enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de la reacción se colocan y se contienen en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micro pozos, etcétera). Como se usa en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica. Como se usa en la presente, el término "molécula de ADN recombinante" se refiere a una molécula de ADN que está compuesta por segmentos de ADN unidos entre sí por medio de técnicas de biología molecular. Como se usa en la presente, el término "anti-sentido" se usa en referencia a las secuencias de ARN que son complementarias a una secuencia de ARN específica (por ejemplo, ARNm). Incluidas dentro de esta definición están las moléculas de ARN anti-sentido ("ARNsas") involucradas en la regulación de genes por bacterias. El ARN anti-sentido se puede producir por cualquier método, incluyendo síntesis dividiendo el gen o los genes de interés en una orientación inversa a un promotor viral que permite la síntesis de una cadena de codificación. Una vez introducida en un embrión, esta cadena transcrita se combina con el ARNm natural producido por el embrión para formar duplicados. Estos duplicados bloquean entonces ya sea la transcripción adicional de ARNm o su traducción. De esta manera, se pueden generar genotipos mutantes. El término "cadena antisentido" se usa en referencia a la cadena de ácido nucleico que es complementaria a la cadena en "sentido". La designación (-) (es decir, "negativo") a veces se usa en referencia a la cadena anti-sentido, con la designación (+) a veces se usa en referencia a la cadena sentido (es decir, "positivo"). Las regiones de las secuencias de ácido nucleico que son accesibles a las moléculas anti-sentido se pueden determinar utilizando métodos de análisis de computación disponibles. El término "aislado" cuando se usa en relación con un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido aislado" o "polinucleótido aislado" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se identifica y separa de al menos un ácido nucleico contaminante con el cual ordinariamente se asocia en su fuente natural. El ácido nucleico aislado está presente en una forma o configuración que es diferente de la que se encuentra en la naturaleza. En cambio, los ácidos nucleicos no aislados, son ácidos nucleicos tales como el ADN y el ARN encontrados en el estado en que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la célula huésped en proximidad a los genes vecinos; las secuencias de ARN, tales como la secuencia de ARNm que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con otros ARNm numerosos que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica MC4R incluye, a manera de ejemplo, este ácido nucleico en células que ordinariamente expresan MC4R donde el ácido nucleico está en un lugar cromosómico diferente del de las células naturales, o de otro modo está flanqueado por una secuencia de ácidos nucleicos diferente que la encontrada en la naturaleza. El ácido nucleico aislado, oligonucleótido o polinucleótido puede estar presente en forma de cadena simple o cadena doble. Cuando un ácido nucleico aislado, oligonucleótido o polinucleótido se va a utilizar para expresar una proteína, el oligonucleótido o polinucleótido contendrá al mínimo la cadena en sentido o de codificación (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de cadena simple), pero puede contener ambas, cadena en sentido y cadena anti-sentido (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de cadena doble). Como se usa en la presente, el término "porción" en referencia a una secuencia de nucleótidos (como en "una porción de una secuencia de nucleótidos dada") se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro nucleótidos hasta la secuencia de nucleótidos entera menos un nucleótido (10 nucleótidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etcétera). Como se usa en la presente, el término "región de codificación" cuando se usa en referencia al gen estructural se refiere a las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos encontrados en el polipéptido naciente como resultado de la traducción de una molécula de ARNm. La región de codificación está enlazada, en eucariotes, sobre el lado 5' por el triplete de nucleótidos "ATG" que codifica el iniciador metionina y sobre el lado 3' por uno de los tres tripletes que especifica los codones de detención (es decir, TAA, TAG, TGA). Como se usa en la presente, el término "purificado" o "purificar" se refiere a la remoción de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos de VIH-1 Env se purifican mediante la remoción de las proteínas contaminantes que no son inmunoglobulinas; también se purifican mediante la remoción de inmunoglobulina que no se enlaza al VIH-1 Env. La remoción de las proteínas que no son inmunoglobulina y/o la remoción de las inmunoglobulinas que no se enlazan con VIH-1 Env da como resultado el aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas reactivas con VIH-1 Env en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos de VIH-1 Env recombinantes se expresan en células huéspedes bacterianas y los polipéptidos se purifican por la remoción de las células huéspedes; esto aumenta el porcentaje de polipéptidos recombinantes de VIH-1 Env en la muestra. El término "ADN recombinante" se refiere a una molécula de ADN que está compuesta de segmentos de ADN unidos entre sí por medio de técnicas de biología molecular. De manera similar, el término "proteína recombinante" se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de ADN recombinante. El término "proteína de fusión" como se usa en la presente se refiere a una proteína formada mediante la expresión de un gen híbrido hecho combinando dos secuencias de genes. Típicamente esto se lleva a cabo clonando un ADNc en un vector de expresión en un cuadro con un gen existente. El compañero de fusión puede actuar como un reportero (por ejemplo ß gal) puede proporcionar una herramienta para propósitos de aislamiento (por ejemplo, IgG Fe). Los sistemas convenientes para la producción de proteínas recombinantes incluyen pero no se limitan a procarióticas (por ejemplo, Escherichia coli), levadura (por ejemplo, Saccaromyces cerevisiae, insectos (por ejemplo, baculovirus) , mamíferos (por ejemplo, ovario de hámster chino), vegetales (por ejemplo, azafrán), y sistemas sin células (reticulocito de conejo). El término "proteína original" se usa en la presente para indicar que una proteína no contiene residuos de aminoácidos codificados por secuencias de vectores; esto es la proteína original que sólo contiene los aminoácidos encontrados en la proteína como se presenta en la naturaleza. Una proteína original se puede producir por medios recombinantes o puede aislarse de una fuente donde se presenta naturalmente. Como se usa en la presente, el término "porción" en referencia a una proteína (como en "una porción de una proteína dada") se refiere a los fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro residuos de aminoácidos consecutivos hasta la secuencia de aminoácidos entera menos un aminoácido. El término "Southern blot", se refiere al análisis de ADN sobre gel de agarosa o de acrilamida para fraccionar el ADN de acuerdo al tamaño seguido por la transferencia del ADN del gel a un soporte sólido, tal como una membrana de nylon o nitrocelulosa. El ADN inmovilizado se sondea con una sonda etiquetada para detectar la especie de ADN complementaria a la sonda usada. El ADN se puede disociar con enzimas de restricción antes de la electroforesis. Después de la electroforesis el ADN se puede depurar parcialmente y desnaturalizar antes de o durante la transferencia al soporte sólido. Los Southern blot son una herramienta estándar de la biología molecular (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, páginas 9.31-9.58, 1989). El término "Northern blot" como se usa en la presente se refiere al análisis de ARN por electroforesis de ARN en geles de agarosa para fraccionar el ARN de acuerdo al tamaño seguido por la transferencia de ARN del gel a un soporte sólido, tal como a una membrana de nylon o nitrocelulosa. El ARN inmovilizado se sondea con una sonda etiquetada para detectar la especie del ARN complementaria a la sonda usada. Los Northern blot son una herramienta estándar de biología molecular (Sambrook, y colaboradores, supra, páginas 7.39-7.52, 1989). Los términos "Western blot", "Western immunoblot", "inmunomanchado" y "Western" se refieren al análisis inmunológico de la o las proteínas, polipéptidos o péptidos que han sido inmovilizados sobre un soporte de membrana. Las proteínas primero se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (es decir, SDS-PAGE) para separar las proteínas seguido por la transferencia de la proteína del gel a un soporte sólido tal como nitrocelulosa o una membrana de nylon. Las proteínas inmovilizadas se exponen a un anticuerpo que tiene reactividad hacia un antígeno de interés. El enlace del anticuerpo (es decir, el anticuerpo primario) se detecta mediante el uso de un anticuerpo secundario que específicamente enlaza al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario típicamente se conjuga a una enzima que permite la visualización del complejo antígeno-anticuerpo mediante la producción de un producto de reacción coloreado o cataliza una reacción enzimática luminiscente (por ejemplo, el reactivo ECL, Amersham). En otras modalidades, el enlace de los anticuerpos primarios se puede detectar mediante el uso de anticuerpos secundarios etiquetados. El término "determinante antigénico" como se usa en la presente se refiere a una porción de un antígeno que hace contacto con un anticuerpo particular (es decir, un epítopo). Cuando una proteína o un fragmento de proteína se usa para inmunizar a un animal huésped, numerosas regiones de la proteína pueden inducir la producción de anticuerpos que enlazan específicamente a una región dada o estructura tridimensional sobre la proteína; estas regiones o estructuras se conocen como determinantes antigénicos. Un determinante antigénico puede competir con el antígeno intacto (es decir, el "¡nmunógeno" usado para provocar la respuesta inmune) para enlazar a un anticuerpo. El término "anticuerpo" se refiere a los anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos policlonales, que se forman en el animal como resultado de una reacción inmunológica contra la proteína de interés o un fragmento de la misma, fácilmente se pueden aislar de la sangre usando métodos muy conocidos y se pueden purificar mediante cromatografía en columna, por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales también se pueden preparar utilizando métodos conocidos (Véase, por ejemplo, Winter y Milstein, Nature, 349, 293-299, 1991). Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" abarca los anticuerpos preparados recombinantemente y modificados y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, tales como los anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos biespecíficos u oligo específicos, anticuerpos de cadena simple y los fragmentos F(ab) o F(ab)2. El término "reactivo" usado en referencia a un anticuerpo indica que el anticuerpo es capaz de enlazar un antígeno de interés. Por ejemplo, un anticuerpo reactivo con el epítopo de melanotropina del VIH-1, es un anticuerpo que enlaza al VIH-1 gp120 o a un fragmento de VIH-1 gp120 (por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17). Como se usa en la presente, el término "inmunoensayo" se refiere a cualquier ensayo que usa al menos un anticuerpo específico para la detección o la cuantificación de un antígeno. Los inmunoensayos incluyen, pero no se limitan a Western blots, ELISAs, radioinmunoensayos, y ensayos de inmunofluorescencia. Se conocen en la técnica muchos formatos diferentes de ELISA, cualquiera de los cuales encontrará uso en la presente invención. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a estos ensayos. Como se usa en la presente, el término "ELISA" se refiere al ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas (o EIA). Numerosos métodos y aplicaciones de ELISA se conocen en la técnica y se describen en muchas referencias (Véase, Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)," en Molecular Biomethods Handbook, Rapley y colaboradores [Editores], páginas 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 1998; Harlow y Lañe (Editores), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Ausubel y colaboradores (Editores), Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 11, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994). Además, hay numerosos sistemas de pruebas ELISA disponibles comercialmente. Como se usa en la presente, un "anticuerpo de detección" es un anticuerpo que lleva un medio para la visualización o cuantificación, el cual típicamente es una fracción de enzima conjugada que típicamente produce un producto de reacción fluorescente o coloreado después de la adición de un sustrato conveniente. Las enzimas conjugadas comúnmente usadas con anticuerpos de detección en el ELISA incluyen la peroxidasa de rábano picante, ureasa, fosfatasa alcalina, glucoamilasa y ß- galactosidasa. En algunas modalidades, el anticuerpo de detección se dirige al antígeno de interés, mientras que en otras modalidades el anticuerpo de detección es un anticuerpo antiespecie.

Alternativamente, el anticuerpo de detección se prepara con una etiqueta tal como biotina, un marcador fluorescente, o un radioisótopo, y se detecta y/o cuantifica usando esta etiqueta.

Como se usa en la presente, los términos "reactivo reportero", "molécula reportera", "sustrato de detección" y "reactivo de detección" se usan en referencia a reactivos que permitan la detección y/o la cuantificación de un anticuerpo ligado a un antígeno.

Por ejemplo, en algunas modalidades, el reactivo reportero es un sustrato colorimétrico para una enzima que ha sido conjugada a un anticuerpo. La adición de un sustrato conveniente al conjugado de anticuerpo-enzima da como resultado la producción de una señal colorimétrica o fluorimétrica (por ejemplo, después del enlace del anticuerpo conjugado al antígeno de interés). Otros reactivos reporteros se incluyen pero no se limitan a, compuestos radioactivos. Esta definición también abarca el uso de biotina y de compuestos basados en avidina (por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a neutravidina y estreptavidina) como parte del sistema de detección. El término "transgén" como se usa en la presente se refiere a un gen extraño que se coloca en un organismo introduciendo el gen extraño en huevos recientemente fertilizados o en embriones tempranos. El término "gen extraño" se refiere a cualquier ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de gen) que se introduce en el genoma de un animal mediante manipulaciones experimentales y puede incluir las secuencias de genes encontradas en ese animal en tanto el gen introducido no resida en el mismo lugar donde lo hace el gen que se presenta naturalmente. Como se usa en la presente, el término "vector" se usa en referencia a moléculas de ácidos nucleicos que transfieren segmentos de ADN de una célula a otra. El término "vehículo" frecuentemente se usa intercambiablemente con "vector". El término "vector de expresión" como se usa en la presente se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión en procariotes usualmente incluyen un promotor, un operador (opcional), y un sitio de enlace de ribosoma, frecuentemente junto con otras secuencias. Las células eucarióticas se sabe que utilizan promotores, mejoradores, y señales de terminación y de poliadenilación. Como se usa en la presente, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula eucariótica o procariótica (por ejemplo, células bacterianas tales como E. Coli, células de levadura, células de mamífero, células aviarias, células anfibias, células vegetales, células de peces, células de insectos), ya sea que se localicen in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células huéspedes se pueden localizar en un animal transgénico. El término "transfección" como se usa en la presente se refiere a la introducción de ADN extraño en células eucarióticas. La transfección se puede llevar a cabo por una variedad de medios conocidos en la técnica incluyendo la co-precipitación de ADN-fosfato de calcio, la transfección mediada por dextrano-DEAE, la transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposoma, lipofección, fusión de protoplasto, infección retroviral y biolística. El término "transfección estable" o "transfectado establemente" se refiere a la introducción y la integración del ADN extraño en el genoma de una célula transfectada. El término "transfectante estable" se refiere a una célula que se le ha integrado establemente ADN extraño en el ADN genómico. El término "transfección transitoria" o "transfectado transitoriamente" se refiere a la introducción de ADN extraño en una célula en donde el ADN extraño falla al integrarse al genoma de la célula transfectada. El ADN extraño persiste en el núcleo de la célula transfectada por varios días. Durante este tiempo el ADN extraño se somete a controles reguladores que gobiernan la expresión de los genes endógenos en los cromosomas. El término "transfectante transitorio" se refiere a las células que han recogido ADN extraño pero han fallado en integrar este ADN. El término "co-precipitación de fosfato de calcio" se refiere a una técnica para la introducción de ácidos nucleicos en una célula. La recogida de ácidos nucleicos por una célula es aumentada cuando el ácido nucleico se presenta como un coprecipitado de ácido nucleico-fosfato de calcio. La técnica original de Graham y van der Eb (Graham y van der Eb, Virol, 52:456, 1973), ha sido modificada por varios grupos para optimizar las condiciones de tipos particulares de células. La técnica está bien conciente de estas numerosas modificaciones. El término "compuesto de prueba" se refiere a cualquier entidad química, farmacéutica, fármaco y similar que se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad, padecimiento, malestar, o trastorno de la función corporal, o de otro modo alterar el estatus fisiológico o celular de una muestra. Los compuestos de prueba comprenden tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales. Un compuesto de prueba se puede determinar que es terapéutico rastreando mediante métodos de rastreo de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" se refiere a un compuesto terapéutico que se ha demostrado (por ejemplo, a través de ensayos con animales o experiencia anterior con la administración a humanos) que es efectivo en este tratamiento o prevención. Los términos "paciente" y "sujeto" se refieren a un mamífero (humano o animal) que es un candidato para recibir el tratamiento médico. El término "control" se refiere a los sujetos o muestras que proporcionan una base de comparación para los sujetos o muestras experimentales. Por ejemplo, el uso de sujetos de control o muestras de control permite la determinación con respecto a la eficacia de los procedimientos experimentales. En algunas modalidades, el término "sujeto de control" se refiere a animales que reciben un tratamiento falso (por ejemplo, PBS solo o IgG de conejo normal en solución salina). Los términos "muestras" y "espécimen" se usan en su sentido más amplio. Por un lado, significa que incluyen un espécimen o cultivo. Por otro lado, significa que incluyen tanto muestras biológicas como ambientales. Estos términos abarcan todo tipo de muestras obtenidas de humanos y otros animales, incluyendo, pero sin limitarse a, fluidos corporales tales como orina, sangre (por ejemplo, incluyendo suero o plasma), materia fecal, líquido cefalorraquídeo, semen, saliva, exudado de heridas, así como tejido sólido. Sin embargo, estos ejemplos no se considerarán limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención. El término "leucocito" como se usa en la presente, se refiere a células llamadas glóbulos blancos que ayudan a que el cuerpo luche contra las infecciones y otras enfermedades, e incluyen por ejemplo los granulocitos (por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos, basófilos), fagocitos mononucleares, y linfocitos (por ejemplo, células B, células T, células aniquiladoras naturales). Como se usa en la presente, el término "purificado" se refiere a moléculas (por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos) que se remueven de su ambiente natural, se aislan o separan. Una "secuencia de ácidos nucleicos aislada" es por lo tanto una secuencia de ácidos nucleicos purificada. Las moléculas "sustancialmente purificadas" son al menos 60 por ciento libres, preferiblemente al menos 75 por ciento libres, y más preferiblemente al menos 90 por ciento libres de otros compuestos con los cuales se asocian naturalmente. Como se usa en la presente, el término "agonista" se refiere a moléculas o compuestos que imitan la acción de un compuesto "original" o "natural". Los agonistas pueden ser homólogos a estos compuestos naturales con respecto a la conformación, a la carga u otras características. De este modo, los agonistas pueden ser reconocidos por los receptores expresados sobre las superficies celulares. Este reconocimiento puede dar como resultado cambios fisiológicos y/o bioquímicos dentro de la célula, de manera que la célula reacciona a la presencia del agonista de la misma manera que si el compuesto natural estuviera presente. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula que enlaza o interactua con un receptor de melanocortina.

Como se usa en la presente, los términos "antagonista" e "inhibidor" se refieren a moléculas o compuestos que inhiben la acción de un compuesto "original" o "natural". Los antagonistas pueden o no ser homólogos a estos compuestos naturales respecto a la conformación, la carga u otras características. De este modo, los antagonistas pueden ser reconocidos por el mismo o diferentes receptores que son reconocidos por los agonistas. Los antagonistas pueden tener efectos aloestéricos, los cuales previenen la acción de un agonista (por ejemplo, previenen que el epítopo de melanotropina VIH-1 o que el VIH-1 gp120 se enlace a un receptor de melanocortina). En contraste con los agonistas, los compuestos antagonistas no dan como resultado cambios fisiológicos y/o bioquímicos dentro de la célula de manera que la célula reaccione a la presencia del antagonista de la misma manera que si estuviera presente el compuesto natural. Los antagonistas y los inhibidores pueden contener proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula que se enlace o interactue con receptores de melanocortina o un polipéptido que comprende un epítopo de melanotropina del VIH-1 o el cual prevenga la estimulación de un receptor de melanocortina por un polipéptido que comprende un epítopo de melanotropina del VIH-1. Como se usa en la presente, el término "proporcionar un pronóstico" se refiere a proporcionar información con respecto al impacto de la presencia de la infección del VIH-1 en la salud futura de un sujeto (por ejemplo, incluye una determinación de la probabilidad o el riesgo relativo de desarrollar una o más de caquexia relacionada con VIH-1, enfermedad de consunción, disfunción de células T reguladoras y enfermedad del sistema nervioso central, en comparación con otros individuos infectados con el VIH-1). Como se usa en la presente, el término "instrucciones para usar el kit" incluye instrucciones para usar los reactivos contenidos en el kit para la detección de anticuerpos con el epítopo de melanotropina patógenos (por ejemplo, VIH-1) en una muestra de un sujeto. En algunas modalidades, las instrucciones además comprenden la declaración del uso pretendido requerido por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA) para etiquetar productos de diagnóstico in vitro. La FDA clasifica a los diagnósticos in vitro como dispositivos médicos y requiere que estén aprobados a través del procedimiento 510(k) o de reactivo específico analito (ASR). La información requerida en una solicitud bajo el 510(k) incluye: (1) el nombre del producto in vitro incluyendo la marca o el nombre del propietario, el nombre común o usual, y el nombre de clasificación del dispositivo; (2) el uso pretendido del producto; (3) el número de registro del establecimiento, si es aplicable, del propietario o el operador que somete la presentación 510 (k); la clase en la cual el producto de diagnóstico in vitro se colocó bajo la sección 513 de la ley de FD&C si se conoce, su panel apropiado, o, si el propietario o el operador determina que el dispositivo no ha sido clasificado bajo esta sección, una declaración para esa determinación y la base para la determinación de que el producto del diagnóstico in vitro no está clasificado; (4) etiquetas propuestas, etiquetamiento y anuncios suficientes para describir el producto de diagnóstico in vitro, su uso pretendido, e instrucciones para su uso. Cuando es aplicable deberán suministrarse fotografías o dibujos técnicos; (5) una declaración indicando que el dispositivo es similar a y/o diferente de otros productos de diagnóstico in vitro del tipo comparable en la distribución comercial en los Estados Unidos, acompañados por datos para apoyar la declaración; (6) un resumen del 510(k) de la seguridad y los datos de efectividad sobre los cuales se basa la determinación de equivalencia sustancial; o una declaración 510(k) de que la información de seguridad y de efectividad apoyada por la FDA encontrando equivalencia sustancial estará disponible para cualquier persona dentro de 30 días después de una solicitud por escrito; (7) una declaración de que el presentador cree a su leal saber y entender que todos los datos y la información presentada en la notificación de mercado es verdadera y precisa y que ningún hecho material se ha omitido; (8) cualquier información adicional con respecto al producto de diagnóstico in vitro solicitado que sea necesaria para que la FDA haga una determinación de equivalencia sustancial. La información adicional está disponible en la página web en Internet de la FDA de los Estados Unidos. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona con la señalización aberrante celular por la glicoproteína de envoltura del VIH del tipo I. En particular, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la identificación de inhibidores de la estimulación de la senda del receptor de melanocortina por el VIH-1 gp120 y sus productos de degradación. Los inhibidores identificados se contempla que sean convenientes para tratar la caquexia relacionada con el VIH, la hiperactivación de las células T y la enfermedad del sistema nervioso central. I. El Sistema de Melanocortina Las melanocortinas son un grupo de péptidos derivados de pro-opiomelanocortina (POMC) que están compuestos de adrenocorticotropina (ACTH) y alfa, beta, y gamma- hormonas estimulantes de melanocito (MSH) entre otras hormonas de péptidos (Véase, Raffin-Sanson y colaboradores, Eur J Endocrinol, 149:79-90, 2003). Estos péptidos bioactivos actúan como agonistas endógenos para los receptores de melanocortina de la superficie celular y representan una variedad de papeles fisiológicos en esteroidogénesis, pigmentación, anti-inflamación, control de ingreso de alimentos, gasto de energía, y comportamiento sexual. Los estudios de clonaciones moleculares han revelado la existencia de cinco subtipos de receptores de melanocortina nombrados MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, y MC5R, los cuales forman una familia distinta de los receptores acoplados a la proteína G. Los cinco receptores de melanocortina activan las ciclasas de adenililo vía las proteínas G estimuladoras, mediante lo cual se eleva el cAMP intracelular (Cone, Nature Neuroscience, 8:571-578, 2005). Los cinco subtipos de receptores son distinguibles por su distribución de tejido, función fisiológica y su capacidad para reconocer varios péptidos de melanocortina. (Tabla 1). El receptor 4 de melanocortina (MC4R) se expresa en múltiples sitios del sistema nervioso central (CNS) y se ha demostrado que es crítico para mantener la homeostasis del peso corporal (O'Rahilly y colaboradores, Nature Medicine, 10:351-352, 2004; y Huszar y colaboradores, Cell, 88:131-141, 1997). La activación de los receptores 4 de melanocortina reduce los almacenes de grasa corporal disminuyendo el ingreso de alimentos y aumentando el gasto de energía (Balthasar y colaboradores, Cell, 123 :493- 505, 2005). Estudios recientes han revelado la evidencia de una modulación central directa del flujo exterior simpático al tejido adiposo a través de los receptores 4 de melanocortina dando como resultado una movilización de líquidos y adiposidad disminuida (Berthound y colaboradores, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 289:1236-1237, 2005). La importancia del receptor 4 de melanocortina en la homeostasis de energía en humanos se demuestra por el hecho de que las mutaciones en el receptor 4 de melanocortina ahora son reconocidas como la forma más común de obesidad monogénica en humanos (Srinivasan y colaboradores, J Clin Invest, 114:1158-1164; O'Rahilly y colaboradores, Nature Medicine, 10:351-352, 2004; y Farooqi y colaboradores, N Engl J Med, 348:1085-1095, 2003). II. Glicoproteínas de la Envoltura de VIH-1 Las glicoproteínas de envoltura (Env) del VIH median la unión viral y la posterior fusión de las membranas con las células huéspedes (Wyatt y Sodroski, Science, 280:1884-1888, 1998). Las glicoproteínas gp160 Env se ensamblan como trímeros durante la síntesis y se disocian durante el transporte a la superficie celular infectada dentro del ectodominio (gp120) y fragmentos de la transmembrana (gp41). La disociación permite a la Env sufrir cambios conformacionales después de enlazarse al receptor CD4 (Dalgleish y colaboradores, Nature, 312, 763-767, 1984; y Klatzmann y colaboradores, Nature, 312:767-768, 1984) y al co-receptor CXCR4 o CCR5 (Feng y colaboradores, Science, 272:872-877, 1996; Trkola y colaboradores, Nature, 384:184-187, 1996; y Wu y colaboradores, Nature, 384:179-183, 1996). La comparación de las secuencias de aminoácidos gp120 de múltiples aislados virales conducen a la identificación de cinco regiones variables flanqueadas por cinco regiones conservadas (Starcich y colaboradores, Cell, 45:637-648, 1986). Las regiones conservadas del ectodominio gp120 forman estructuras importantes para la interacción con el dominio de transmembrana gp41 y para la interacción de los receptores virales de las células huéspedes. Las estructuras de cristal de VIH gp120 han sido determinadas (Véase, por ejemplo, Berger, Nature Structure Biology, 5:671-674; Kwong y colaboradores, Nature, 393:648-659, 1998; Moore y Binley, Nature, 393:630-631, 1998; Rizzuto y colaboradores, Science, 280:1949-1953; Wyatt y Sodroski, Science, 280:1884-1888, 1998; y Wyatt y colaboradores, Nature, 393:705-711, 1998) dando luz sobre la relación entre la estructura y la función de la envoltura. La glicoproteína gp120 se despide del complejo de envoltura y se puede encontrar en el suero de los pacientes con SIDA a concentraciones de aproximadamente de 12-92 nanogramos/mililitro (Schneider y colaboradores, J Gen Virol, 67:2533-2538, 1986; y Oh y colaboradores, J AIDS, 5:251-256, 1992). Durante la infección natural, el gp120 provoca tanto anticuerpos neutralizantes como no neutralizantes al virus. Los anticuerpos no neutralizantes frecuentemente se dirigen contra las regiones de gp120 que se exponen en la gp120 soluble pero no pueden acceder al complejo de envoltura trimérica. En cambio, los anticuerpos neutralizantes reconocen los epítopos en el complejo de envoltura trimérica, típicamente en las regiones de la gp120 adyacentes a los sitios de enlace del receptor (Sattentau y Moore, J Exp Med, 182:185-196, 1995; y Moore y Sodroski, J Virol, 70:1863-1872, 1996). La VIH-I gp120 ha mostrado ser susceptible a la disociación del ciclo V3 produciendo dos fragmentos de 70 kDa y de 50 kDa (Werner y Levy, J Virol, 67:2566-2574, 1993). En particular, se encontró que la trombina y la triptasa disocian la gp120 en un sitio tríptico (GPGR/ AFVT presentado como SEQ ID NO:32), mientras que se encontró que la catepsina E disocia la gp120 en el sitio parecido a la quimiotripsina (GPGRAF/VT presentada como SEQ ID NO: 32) en estudios usando la VIH-1 gp120 correspondiente al aislado IIIB (Clements y colaboradores, AIDS Res Hum Retroviruses, 7:3-16, 1991). También se ha sugerido que una proteasa parecida a trombina disocia la gp120 en (GP/GRAFVT presentada como SEQ ID NO:32) después de un enlace CD4 indujo un cambio conformacional (Johnson y colaboradores, FEBS Lett, 337:4-8, 1994). Ya que una membrana de célula T asocia proteasa de serina, se encontró que la triptasa TL2 disocia la gp120 dentro del ciclo V3 (Niwa y colaboradores, Eur J Biochem, 237:64-70, 1996). La presente invención contempla que uno o ambos fragmentos de degradación de la gp120 (por ejemplo, el fragmento terminal amino de 70 kDa y/o el fragmento terminal carboxilo de 50 kDa) representan un papel en la patología relacionada con el VIH-1. III. VIH-1 gp120 Media la Patogénesis del SIDA Se ha postulado que el mimetismo conformacional de los péptidos huéspedes por el VIH-1 gp120 representa un papel en varios aspectos de la patogénesis del SIDA. De hecho, antes del desarrollo de la presente invención, el inventor ha propuesto que el péptido T, un fragmento de la segunda región variable de la gp120 (ASTTTNYT, correspondiente a los residuos del 185 al 192 de la secuencia del VIH-1SF2, presentada como SEQ ID NO:22), imita a la hormona gamma-MSH (Dominy, Med Hypothesis, 27:1-4, 1988). Aunque esta hipótesis no fue sustanciada, otro análisis de las secuencias de aminoácidos de la VIH-1 gp120 ha revelado la existencia de un epítopo de melanotropina cerca del término carboxilo de la VIH-1 gp120, como se describe en la presente en el Ejemplo 1. Específicamente, durante el desarrollo de la presente invención, un péptido denominado G25G (SEQ ID NO: 17) del quinto dominio conservado de la VIH-1 gp120 que incluye residuos dentro de la quinta alfa hélice y la vigésima quinta hoja beta, se encontró que es un agonista débil del MC4R (Figuras 7 y 8). Además, como se describe en la presente por primera vez, se encontró que un péptido denominado K13M (SEQ ID NO:6) sintetizado en orientación inversa de secuencia dentro del péptido G25G comparte residuos críticos de triptófano, arginina y tirosina con alfa-MSH, beta-MSH, y gamma- MSH y ACTH (Figura 1). De manera importante, también se encontró que el péptido K13M es un agonista débil de MC4R (Figura 9). A. Síndrome de Consunción por SIDA La presente invención contempla que el epítopo de la melanotropina en la VIH-1 gp120 o sus productos de degradación enlaza y activa el MC4R u otras moléculas de la superficie celular del sistema nervioso central in vivo, mediante lo cual representa papeles en el desarrollo de la caquexia relacionada con el VIH y el síndrome de consunción por SIDA. En particular se contempla que la estimulación crónica del MC4R por la VIH-1 gp120 contribuye a la anorexia y al gasto de energía aumentado. Recientes estudios, cuando se ven en el contexto de la presente invención, proporcionan apoyo para la presente invención. Específicamente, se encontró que la VIH-1 gp120 está presente en el sistema nervioso central durante todas las etapas de la enfermedad, incluyendo en pacientes con demencia asociada con el VIH-1 (Ritola y colaboradores, J Virol, 79:10830-10834, 2005). Más aún, la administración del intracerebro-ventricular de la glicoproteína VIH-1 IIIB gp120 diario durante cinco días, disminuyó significativamente ingesta de alimento y agua por las ratas (Guzman y colaboradores, Neurosci Lett, 396:50-53, 2006), dando como resultado una ganancia de peso disminuida en comparación con las ratas de control que recibieron vehículo solamente. Aunque, no se requiere el conocimiento del o los mecanismos para hacer y usar la presente invención y la presente invención no se limita a ningún mecanismo particular de acción, el desprendimiento espontáneo de la gp120 por las células infectadas por VIH-1 se contempla que se parece a una glándula exócrina secretando una hormona de péptido. En una extensión de esta analogía, el ligando endógeno primario para MC4R, alfa-MSH, es fisiológicamente activo a una concentración de 30 pg/ml, mientras que la concentración circulante de la VIH-1 gp 120 en un paciente con SIDA está en el orden de 12-92 nanogramos/mililitro (por ejemplo, 3 órdenes de magnitud mayor). De este modo, se contempla que la concentración suprafisiológica de gp120 compite con las hormonas de neuropéptidos para enlazarse con el MC4R. B. Disfunción de Células T Reguladoras Además de representar un papel crítico en la homeostasis del peso corporal, el sistema de melanocortina es crucial para regular el nivel de la activación de las células T. A través del receptor de melanocortina 5 (MC5-R) expresado sobre la superficie de las células T cebadas con antígeno, lal alfa-MSH estimula el desarrollo de las células T reguladoras CD4+ CD25+ (Treg). Las células T reguladoras CD4+ CD25+ a su vez suprimen la activación de otros subconjuntos de células T en parte a través de la liberación del factor de crecimiento transformante (TGF)-beta (Taylor y Namba, Immunol Cell Biol, 79:358-367, 2001). Más recientemente se han encontrado altos niveles de ARNm de MC1R, MC2R y MC3R, así como ARNm de MC5R en células T CD4+, mientras que se encontraron niveles moderados de estos ARNm en células NK, monocitos y granulocitos (Anderson y colaboradores, Scand J Immunol, 61:279-284, 2005). La presente invención contempla que la VIH-1 gp120 enlaza y activa a uno o más de MC1R, MC2R, MC3R y MC5R in vivo vía el epítopo de melanotropina viral de SEQ ID NO:17. La identificación del péptido o péptidos estimuladores del receptor de melanocortina de la VIH-1 gp120 se determina como se describe en el Ejemplo 2 para MC5R. Específicamente, la presente invención contempla que el epítopo de melanotropina de envoltura VIH-1 enlazado al MC5R o a otras moléculas de la superficie celular sobre las células T cebadas con antígeno, interfiere con el desarrollo de las células T reguladoras CD4+ CD25+. La reducción en los números de las células T reguladoras se manifiesta como una sobre-estimulación inmunológica. Sin duda, se está acumulando evidencia de que el avance del SIDA se asocia con una reducción de las células T reguladoras CD4+ CD25+, y un aumento en la hiperactivación de las células T (Nixon y colaboradores, Microbes Infect, 7:1063-1065, 2005). Por otro lado, los niveles de plasma elevados de alfa-MSH (un ligando endógeno de MC5R así como de MC4R) se asocian con una supervivencia aumentada en los pacientes infectados con VIH. Específicamente, la concentración de la alfa-MSH circulante fue mayor en los que no progresan que en los que progresan, mientras que no se observó esta correlación con las concentraciones circulantes del antagonista del receptor de interleucina 1 y del receptor soluble del factor de necrosis de tumor (Airaghi y colaboradores, J Lab Clin Med, 133:309-315, 1999).

C. Enfermedad del Sistema Nervioso Central (CNS) Los trastornos neuropsiquiátricos relacionados con el VIH están aumentando en importancia en la era de Terapia Anti-Retroviral muy Activa (HAART). Se ha estimado que el 30 por ciento de los adultos infectados con VIH-1 están afectados por un trastorno motor cognitivo menor. Además, a pesar de HAART, el 10 por ciento de los pacientes infectados desarrollará demencia asociada con VIH-1. De hecho en los Estados Unidos la infección de VIH-1 es la causa más común de demencia en adultos jóvenes. La investigación básica ha implicado a la glicoproteína de envoltura del VIH-1, conocida como gp120, en la enfermedad del sistema nervioso central (CNS) relacionada con el VIH. Dos líneas de ratones transgénicos que expresan VIH-1 gp120 y gp160 respectivamente en el sistema nervioso central exhiben neuropatología (Toggas, Nature, 367:188-193, 1994; y Berrada y colaboradores, J Virol, 69:6770-6778, 1995). La presente invención contempla que el epítopo de la melanotropina en VIH-1 gp120 o sus productos de degradación se enlaza y activa a una o más moléculas de la superficie celular del sistema nervioso central in vivo, mediante esto representando papeles en el desarrollo de la enfermedad del sistema nervioso central por VIH. En particular, se contempla que la estimulación crónica de los receptores del sistema nervioso central por el epítopo de melanotropina que contiene fragmentos de envoltura del VIH-1 contribuye a los trastornos neuropsiquiátricos relacionados con el VIH.

IV. Generación de anticuerpos reactivos al epítopo de la melanotropina viral En algunas modalidades, se proporcionan anticuerpos para permitir la detección de proteínas que contienen el epítopo de la melanotropina viral. Los anticuerpos se pueden preparar usando varios ¡nmunógenos. En una modalidad, el inmunógeno es un péptido sintético que corresponde al epítopo de la melanotropina del VIH-1SF2 (SEQ ID NO: 17) usado para generar anticuerpos que reconocen la VIH-1 SF2 gp120. Estos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena simple, fragmentos Fab, y bibliotecas de expresión de Fab. En otras modalidades preferidas, el epítopo de melanotropina del VIH-1 se define por la secuencia de octapéptidos genérica WRXXXXXY (SEQ ID NO:31), en donde W en la posición 1, R en la posición 2 e Y en la posición 8 son invariantes, y X puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos naturales humanos. De este modo, los epítopos de melanotropina del VIH-1 de la presente invención comprenden al menos 8 aminoácidos. Sin embargo, en las modalidades preferidas la composición y métodos de la presente invención comprenden polipéptidos que consisten en el epítopo de melanotropina del HIV-ISF2 (SEQ ID NO: 17), los polipéptidos que comprenden el epítopo de melanotropina del VIH-1SF2 (SEQ ID NO: 17), y los polipéptidos que consisten en o comprenden variantes de los mismos. En modalidades particularmente preferidas, las variantes incluyen epítopos de melanotropina de VIH-1 que tienen desde uno a 22 (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 cambios conservadores de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en relación con la SEQ ID NO: 17, de manera que se mantiene o se mantiene sustancialmente el enlace a uno o ambos de MC4R o MC5R. En otras modalidades preferidas, las variantes incluyen epítopos de melanotropina del VIH-1 que tienen desde uno a 22 cambios de aminoácidos conservadores o no conservadores (por ejemplo, sustituciones) en relación con la SEQ ID NO:17, de manera que el enlace a uno o ambos de MC4R o MC5R se mantiene o se mantiene sustancialmente. En todavía otras modalidades, las variantes incluyen epítopos de melanotropina de VIH-1 que tienen desde uno a ocho (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho) menos aminoácidos en la terminal N y/o desde uno a nueve (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) menos aminoácidos en la terminal C en relación con la SEQ ID NO: 17, de manera que el enlace a uno o ambos de MC4R o MC5R se mantiene o se mantiene sustancialmente. En modalidades particularmente preferidas, los variantes de los epítopos de melanotropina de VIH-1 incluyen variantes de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:17, en donde W en la posición 9, R en la posición 10 e Y en la posición 10 son invariantes, de manera que el enlace a uno o ambos de MC4R o MC5R se mantiene o sustancialmente se mantiene. Varios procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para la producción de anticuerpos policlonales dirigidos contra el epítopo de la melanotropina viral. Para la producción del anticuerpo, varios animales huéspedes que se pueden inmunizar por inyección con el péptido correspondiente al epítopo de la melanotropina viral incluyen, pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras etcétera. En una modalidad preferida, el péptido se conjuga a un vehículo inmunogénico (por ejemplo, toxoide de difteria, albúmina de suero bovino, hemocianina de limpete de orificio (KLH), etcétera). Varios adyuvantes se pueden usar para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de huésped, incluyendo pero sin limitarse al adyuvante de Freund (completo o incompleto), geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio) sustancias activas en la superficie (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como el BCG (Bacilo Calmette-Guerin). Para la preparación de los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el epítopo de melanotropina viral, se contempla que cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivos encontrará uso con la presente invención (Véase por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estos incluyen pero no se limitan a la técnica del hibridoma (Kóhler y Milstein, Nature, 256:495-497, 1975; y Cote y colaboradores, Proc Nati Acad Sci, EUA 80:2026-2030, 1983), así como la técnica del trioma, y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985). En una modalidad adicional de la invención, se producen anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología como la descrita en la PCT/US90/02545). Adicionalmente, se contempla que las técnicas descritas para la producción de una cadena simple de anticuerpos (Patente de los Estados Unidos de América Número 4,946,778; incorporada en la presente mediante referencia) encontrará uso en producir anticuerpos de cadena simple específicos para el epítopo de la melanotropina viral. Una modalidad adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse y colaboradores, Science 246:1275-1281, 1989) para permitir la identificación rápida y simple de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para el VIH-1 gp120. Se contempla que cualquier técnica adecuada para producir fragmentos de anticuerpos encontrará uso para generar fragmentos de anticuerpos que contengan el idiotipo (región de enlace de antígeno) de la molécula de anticuerpo. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen pero no se limitan a: fragmento F(ab')2 que se pueda producir por digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')2, y fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. En la producción de anticuerpos, se contempla que el rastreo del anticuerpo deseado se llevará a cabo por técnicas conocidas en el campo (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas), inmunoensayo de "emparedado", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación en difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos ¡n situ (por ejemplo, usando oro coloidal, etiquetas de enzimas o radioisótopos, por ejemplo), Western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación, etcétera), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis. En una modalidad, se detecta el enlace de anticuerpos detectando una etiqueta sobre el anticuerpo primario. En otra modalidad, se detecta el anticuerpo primario detectando el enlace de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo secundario está etiquetado. Muchos medios se conocen en la técnica para detectar el enlace en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. En particular como bien se sabe en la técnica, el péptido inmunogénico deberá proporcionarse libre de la molécula portadora usada en cualquier protocolo de inmunización. Por ejemplo, si el péptido se conjugó con KLH5, puede ser conjugado con BSA, o usado directamente, en un ensayo de rastreo. Los anticuerpos anteriores se pueden usar en métodos conocidos en la técnica en relación con la localización y la estructura de un epítopo de melanotropina viral (por ejemplo, para Western blot), medir los niveles del mismo en muestras biológicas apropiadas, etcétera. Los anticuerpos se pueden usar para detectar un epítopo de melanotropina viral en una muestra biológica de un individuo. La muestra biológica puede ser un fluido biológico, tal como, pero sin limitarse a, sangre, suero, plasma, fluido intersticial, orina, fluido cefalorraquídeo, y similar, que contiene células. Las muestras biológicas se pueden probar directamente para determinar la presencia de un epítopo de melanotropina viral usando una estrategia (por ejemplo, ELISA o radioinmunoensayo) y un formato (por ejemplo, micropozos, varilla graduada, etcétera) apropiados. Alternativamente, las proteínas en la muestra pueden separarse por tamaño por ejemplo, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en la presencia o ausencia de dodecil-sulfato de sodio (SDS), y la presencia del epítopo de melanotropina viral detectada por inmunomanchado (Western blot). Las técnicas de inmunomanchado generalmente son más efectivas con anticuerpos generados contra un péptido correspondiente a un epítopo de la proteína, y por lo tanto, son particularmente adecuados para la presente invención. V. Rastreo de Fármacos usando un Epítopo de Melanotropina Viral La presente invención proporciona métodos y composiciones para usar un epítopo de melanotropina viral, VIH-1 gp120, o sus productos de degradación como un objetivo para rastrear fármacos (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, miméticos de péptidos, anticuerpos, etcétera) que pueden inhibir la estimulación aberrante de las moléculas de la superficie de las células del sistema nervioso central tales como MC4R y/o MC5R por fragmentos de la envoltura de VIH-1. Como se describe más adelante y en todas partes se pueden diseñar y usar varios sistemas de ensayos diferentes (Patente de los Estados Unidos de América Número 5,908,609 para Lee y colaboradores, 1999; Patente de los Estados Unidos de América Número 6,100,048 para Cone y colaboradores, 2000; y Patente de los Estados Unidos de América Número 6,278,038 para Cone y colaboradores, 2001, todas incorporadas en la presente mediante referencia por entero), para identificar compuestos o composiciones que modulan la actividad de MC4R y/o MC5R. Los sistemas descritos más adelante se pueden formular como kits. Con este fin, los polipéptidos que comprenden el epítopo de melanotropina viral se pueden empacar en una variedad de recipientes (por ejemplo, frascos, tubos, placas de pozos de microtitulación, botellas y similares). Otros reactivos se pueden incluir en recipientes separados y se pueden proporcionar con el kit (por ejemplo, muestras de control positivo, muestras de control negativo, péptidos de melanocortina que incluyen, pero no se limitan a alfa-MSH y derivados de ACTH), reguladores, medios, etcétera.

A. Ensayos basados en células De acuerdo con la invención, se puede usar un sistema de ensayo basado en células para rastrear compuestos que modulan la estimulación del epítopo de melanotropina viral de las moléculas de la superficie de las células del sistema nervioso central tales como MC4R y/o MC5R. En algunas modalidades, los compuestos así identificados son convenientes para tratar el síndrome de consunción por SIDA, y la disfunción de las células T reguladoras mediada por el VIH. Con este fin, se pueden usar las células que expresan endógenamente MC4R o MC5R para rastrear los compuestos. De manera alternativa, se pueden usar líneas celulares, tales como las células 293, las células COS, las células CHO, los fibroblastos, y similares, genéticamente diseñados para expresar el MC4R o el MC5R con propósitos de rastreo. De preferencia, se pueden usar células huéspedes genéticamente diseñadas para expresar un receptor funcional que responde a la activación por péptidos de melanocortina como el punto final en el ensayo (por ejemplo, medido por un cambio químico, fisiológico, biológico o fenotípico, inducción de un gen de célula huésped o un gen reportero, cambio en los niveles de cAMP, actividad de ciclasa adenililo, actividad de proteína G en la célula huésped, tasa de acidificación extracelular, actividad de cinasa de la célula huésped, proliferación, diferenciación, etcétera). Para ser útiles en los ensayos de rastreo, las células huéspedes que expresan MC4R o MC5R funcionales deberán dar una respuesta significativa a un ligando de MC4R o MC5R, preferiblemente mayor de 5 veces la inducción sobre el fondo. Las células huéspedes deberán preferiblemente poseer varias características, dependiendo de la lectura, para maximizar la respuesta inductiva por los péptidos de melanocortina, por ejemplo, para detectar una inducción fuerte de un gen reportero CRE, sería ventajoso: (a) un nivel natural bajo de cAMP, (b) proteínas G capaces de interactuar con el MC4R o MC5R, (c) un alto nivel de ciclasa de adenililo, (d) un alto nivel de cinasa de proteína A, (e) un bajo nivel de fosfodiesterasas, y (f) un alto nivel de proteína de enlace del elemento de respuesta de cAMP. Para aumentar la respuesta al péptido de melanocortina, las células huéspedes podrían diseñarse para expresar una cantidad mayor de factores favorables o una cantidad menor de factores no favorables. Además, podrían eliminarse sendas alternativas para la inducción del reportero CRE para reducir los niveles básales. Para utilizar este sistema de células, las células que expresan el receptor de melanocortina se exponen a un compuesto de prueba o a los controles de vehículos (por ejemplo, placebos). Después de la exposición, las células se pueden examinar para medir la expresión y/o la actividad de los componentes de la senda de la transducción de señales del receptor de melanocortina, o se puede examinar la actividad de la senda de traducción misma. Por ejemplo, después de la exposición, se pueden examinar los lisados de células para determinar la inducción de cAMP. La capacidad de un compuesto de prueba para aumentar los niveles de cAMP, sobre los niveles vistos con las células tratadas con el control vehículo, indica que el compuesto de prueba induce la transducción de señales mediada por el receptor de melanocortina expresado por la célula huésped. Al rastrear compuestos que pueden actuar como antagonistas selectivos de la estimulación del receptor de melanocortina mediante un epítopo de melanotropina viral, es importante incluir ligandos que activan el MCR (por ejemplo, alfa-MSH, beta-MSH o ACTH) para examinar la inhibición de la transducción de señales por el compuesto de prueba en comparación con los controles vehículos. En una modalidad específica de la invención, las construcciones que contienen el elemento responsivo cAMP enlazado a cualquiera de una variedad de diferentes genes reporteros se pueden introducir entre las células que expresan el receptor de melanocortina. Estos genes reporteros pueden incluir pero no se limitan a acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT), luciferasa, GUS, hormona de crecimiento, o fosfatasa alcalina de placenta (SEAP). Después de la exposición de las células del compuesto de prueba, se puede cuantificar el nivel de la expresión del gen reportero para determinar la capacidad del compuesto de prueba para regular la actividad del receptor. Los ensayos de fosfatasa alcalina son particularmente útiles en la práctica de la invención ya que esta enzima es secretada de la célula. Por lo tanto, el sobrenadante del cultivo de tejido se puede examinar para determinar la fosfatasa alcalina secretada. Además, se puede medir la actividad de la fosfatasa alcalina mediante ensayos calorimétricos, bioluminiscentes o quimioluminiscentes (Bronstein y colaboradores, Biotechniques, 17:172-177, 1994). Estos ensayos proporcionan un sistema de detección simple, automático, fácilmente sensible para el rastreo farmacéutico. Cuando se desea discriminar entre los receptores de melanocortina e identificar los compuestos que selectivamente agonizan o antagonizan a MC4R o MC5R, los ensayos escritos anteriormente deberán llevarse a cabo usando un panel de células huéspedes, cada una diseñada genéticamente para expresar uno de los receptores de melanocortina (MC1R hasta MC5R). La expresión de los receptores de melanocortina humana se prefiere para propósitos de descubrimiento de fármacos. La clonación y la caracterización de cada receptor ha sido descrita: MC1R y MC2R (Mountjoy y colaboradores, Science, 257:1248-1251, 1992; y Chhajlani y Wikberg, FEBS Lett, 309:417-420, 1992); MC3R (Roselli-Rehfiiss y colaboradores, Proc Nati Acad Sci, EUA, 90:8856-8860, 1993; y Gantz y colaboradores, J Biol Chem, 268:8246-8250, 1993); MC4R (Gantz y colaboradores, J Biol Chem, 268:15174-15179, 1993; y Mountjoy y colaboradores, Mol Endo, 8:1298-1308, 1994); y MC5R (Chhajlani y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun, 195:866-873, 1993; y Gantz y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun, 200:1214-1220, 1994), cada una de las cuales se incorpora mediante referencia en la presente por entero. De este modo, cada una de las secuencias anteriores se puede utilizar para diseñar una célula o línea celular que expresa uno de los receptores de melanocortina para usarlos en ensayos de rastreo descritos en la presente. Para identificar compuestos que específicamente o selectivamente regulan la estimulación del epítopo de melanotropina viral de la actividad del MC4R, o la inhibición de MC4R con el efecto del compuesto de prueba sobre los otros receptores de melanocortina. De manera alternativa, si la células huéspedes expresan más de un receptor de péptido de melanocortina, la señal de fondo producida por estos receptores como respuesta a los péptidos de melanocortina se debe "restar" de la señal (Gantz y colaboradores, supra). La respuesta de fondo producida por estos receptores de melanocortina que no son MC4R se puede determinar por varios métodos incluyendo la eliminación de la actividad de MC4R por anti-sentido, anticuerpo o antagonista. Con respecto a esto deberá notarse que células de CHO del tipo natural demuestran una respuesta endógena pequeña a los péptidos de melanocortina, los cuales se deben sustraer del fondo. De manera alternativa, la actividad contribuida de otros receptores de melanocortina podría eliminarse activando las células huéspedes con un ligando específico para MC4R, o incluyendo inhibidores específicos de otros receptores de melanocortina. B. Ensayos no basados en células Además de los ensayos basados en células, se pueden usar sistemas de pruebas no basados en células para identificar compuestos que inhiben que el epítopo de melanotropina viral se enlace a las moléculas de la superficie celular del sistema nervioso central tales como MC4R y/o MC5R. Por ejemplo, se pueden usar membranas aisladas para identificar compuestos que previenen la interacción del VIH-1 gp120 con el MC4R. En un experimento típico utilizando membranas aisladas, se pueden diseñar genéticamente las células HEK293 para expresar el MC4R. Las membranas se pueden cosechar mediante técnicas estándares y usar en un ensayo de enlace in vitro con un ligando etiquetado con 125l (por ejemplo, alfa-MSH, beta-MSH o ACTH yodados). El enlace específico se determina comparándolo con ensayos de láser realizados en presencia del ligando no etiquetado en exceso. Para identificar compuestos que inhiben el epítopo de la melanotropina viral enlazada al MC4R, se incuban las membranas con ligando etiquetado en la presencia o ausencia de un compuesto de prueba. Los compuestos que se enlazan al receptor y compiten con ligandos etiquetados para enlazar las membranas reducen la señal en comparación con las muestras del control vehículo. Alternativamente, los MC4R solubles pueden ser expresados recombinantemente y utilizados en ensayos no basados en células para identificar compuestos que inhiben los epítopos de la melanotropina viral que enlaza al MC4R. Se preparan los polipéptidos de MC4R expresados recombinantemente o las proteínas de fusión de MC4R. En ensayos no basados en células el MC4R expresado recombinantemente se une a un sustrato sólido tal como un tubo de ensayo, o sobre pozos de microtitulación o una columna, por medios muy conocidos para los expertos. Los compuestos de prueba se examinan para determinar su capacidad para evitar que el epítopo de melanotropina viral se enlace al MC4R. C. Compuestos candidatos para propósitos de rastreo Los ensayos descritos anteriormente y en todas partes (Publicación de Patente de los Estados Unidos de América Número 2003010524 de Cone y colaboradores, 2003, incorporada en la presente mediante referencia por entero) pueden identificar compuestos que afectan la actividad del MC4R del epítopo de melanotropina viral. Por ejemplo, los compuestos que afectan la actividad del MC4R mediado por el epítopo de melanotropina viral incluyen pero no se limitan a los compuestos que se enlazan al MC4R y miden el enlace del ligando patógeno, y ya sea que activen la transducción de señales (agonistas) o bloqueen la activación (antagonistas), y los compuestos que se enlazan al ligando patógeno del MC4R y neutralizan el ligando patógeno (por ejemplo, la actividad del epítopo de melatropina viral de VIH-1 gp120). Algunas modalidades de la presente invención proporcionan agonistas del receptor de melanocortina de mamíferos que tienen la fórmula general: A-B-C-D-E-F-G-amida, en donde A es un residuo de aminoácido alifático, incluyendo por ejemplo Leu, He, Nle y Met, así como derivados análogos y sustituidos de los mismos; B es un residuo de aminoácido ácido, que incluye por ejemplo Asp y Glu; C es un residuo de aminoácido básico, tal como His; D es un residuo de aminoácido aromático que tiene una conformación d, incluyendo d-Phe, d-Tyr y derivados sustituidos de los mismos; E es un residuo de aminoácido básico, por ejemplo, Arg, Lys, homoArg, homoLys, y análogos o derivados sustituidos de los mismos; F es Trp o derivados sustituidos del mismo; y G es Lys, homoLys o derivados sustituidos de los mismos. En las modalidades de péptido, los agonistas del receptor de melanocortina de la invención, el péptido se cicla mediante la formación de un enlace amida entre el grupo carboxilo de cadena lateral del residuo Asp o Glu en la posición B en el péptido, y el grupo amino de cadena lateral del residuo Lys u homoLys en la posición G. Otras modalidades de la presente invención proporcionan antagonistas del receptor de melanocortina de mamíferos que tienen la fórmula general: A-B-C-D-E-F-G-amida, en donde A es un residuo de aminoácido alifático, incluyendo por ejemplo Leu, He, Nle y Met, así como análogos y derivados sustituidos de los mismos; B es un aminoácido ácido que incluye por ejemplo Asp y Glu; C es un residuo de aminoácido, tal como His; D es un residuo de aminoácido aromático que tiene una conformación d, incluyendo d-Nal y derivados sustituidos del mismo; E es un residuo de aminoácido básico, por ejemplo Arg, Lys, homoArg, homoLys y análogos o derivados sustituidos de los mismos; F es Trp o derivados sustituidos del mismo; y G es Lys, homoLys o derivados sustituidos de los mismos. En las modalidades de péptidos de antagonistas del receptor de melanocortina de la invención, el péptido se cicla mediante la formación de un enlace amida entre el grupo carboxilo de cadena lateral del residuo Asp o Glu en la posición B en el péptido, y el grupo amino de cadena lateral del residuo Lys o homoLys en la posición G. En las modalidades preferidas, los antagonistas del receptor de melanocortina de la invención son agonistas del receptor MC4 y/o del receptor MC5. Sin embargo, deberá notarse que los ensayos convenientes para la presente invención también identifican compuestos que modulan la transducción de señales de MC4R o MC5R (por ejemplo, los compuestos que afectan los eventos de señalización corriente abajo, tales como inhibidores o mejoradores de las actividades de la proteína G que participan en transducir la señal activada por el enlace del ligando con el MC4R). Se contempla la identificación y el uso de estos compuestos que afectan los eventos de señalización corriente abajo de MC4R o MC5R para modular los efectos de MC4R sobre el desarrollo del síndrome de consunción por SIDA y los efectos del MC5R sobre la disfunción de las células T reguladoras mediadas por VIH-1. Los compuestos que se pueden rastrear de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, y otros compuestos orgánicos (por ejemplo, peptidomiméticos) que preferiblemente se enlazan al VIH-1 gp120 para inhibir la estimulación de MC4R o MC5R por el epítopo de melanotropina viral contenido en el mismo. Los compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, péptidos tales como, por ejemplo, péptidos solubles, incluyendo pero sin limitarse a miembros de las bibliotecas aleatorias de péptidos (Lam y colaboradores, Nature 354: 82-84, 1991; y Houghten y colaboradores, 1991, Nature, 354: 84-86, 1991), la biblioteca molecular derivada de química combinatoria hecha de aminoácidos con configuración D y/o L, fosfopéptidos, incluyendo, pero sin limitarse a, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos, aleatorios o parcialmente degenerados (Songyang, Cell, 72: 767-778, 1993), anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o de cadena simple, y fragmentos de biblioteca de expresión FAb, F(ab')2, Fab, y fragmentos de enlace de epítopo de los mismos, y moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas. Otros compuestos que se pueden rastrear de acuerdo con la invención incluyen pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas que son capaces de, por ejemplo, cruzar la barrera sangre cerebro. D. Moléculas de Superficie de Células del Sistema Nervioso Central Adicionales Enlazadas por gp120 o sus Productos de Degradación. El Programa de Rastreo de Fármacos Psicoactivos (PDSP) del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH) se utiliza para identificar moléculas de superficie celular del sistema nervioso central adicionales enlazadas por VIH-1 gp120 y sus productos de disociación de trombina 50 kDa y 70 kDa, así como los péptidos sintéticos que comprenden un epítopo de melanocortina viral. En particular la presente invención contempla una estrategia de rastreo de receptor (Roth y colaboradores, Proc Nati Acad Sci EUA, 99:11934-11939, 2002; y Armbruster y Roth, J Biol Chem, 280:5129-5132, 2005) para identificar objetivos moleculares para la envoltura del VIH-1. Tanto los rastreos de enlace de ligandos como los rastreos funcionales se emplean para definir molecularmente la psicoactividad mediada por la envoltura del VIH-1. Específicamente, varios polipéptidos que contiene epítopo de melanocortina viral se ponen en contacto con preparaciones de membrana de células que expresan receptores clonados para la determinación de los valores Ki en un formato de alta producción. Los receptores clonados incluyen pero no se limitan a receptores de acetilcolina, receptores adrenérgicos, receptores de dopamina, receptores GABA, receptores de histamina, receptores de glutamato, receptores de opiato, receptores de péptido, receptores de serotonina, transportadores, receptores de adenosina, receptores de prostaglandina, y receptores de imidazolina (Véase, Tabla 3). La presente invención contempla que gp120 y uno o ambos de sus productos de degradación enlazan y activan los receptores del sistema nervioso central que participan en la homeostasis del peso corporal, la inflamación y la cognición. VI. Composición Farmacéutica La presente invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores o antagonistas de un epítopo de la melanotropina viral, incluyendo anticuerpos, solos o en combinación con al menos algún otro agente, tal como un compuesto estabilizante, y se pueden administrar en cualquier vehículo estéril, farmacéuticamente biocompatible, incluyendo, pero sin limitarse a solución salina, solución salina regulada, dextrosa, y agua. Los métodos de la presente invención encuentran uso para tratar enfermedades o alterar estados fisiológicos. Los péptidos se pueden administrar al paciente intravenosamente en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica. Se pueden usar los métodos estándares para la administración intracelular de péptidos (por ejemplo, administración vía liposoma). Estos métodos son muy conocidos para las personas con experiencia ordinaria en la técnica. Las formulaciones de esta invención son útiles para la administración parenteral, tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular, e intraperitoneal. La administración terapéutica de un polipéptido intracelularmente también se puede llevar a cabo usando terapia de genes como se describió anteriormente. A. Determinación de Dosis La toxicidad y la eficacia terapéutica de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en los cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo para determinar LD50 (la dosis letal para el 50 por ciento de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en ei 50 por ciento de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción LD5o/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos grandes. Aunque también se pueden usar compuestos que exhiben efectos colaterales tóxicos, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija estos compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, mediante esto, reducir los efectos secundarios. Las cantidades de dosificación normales pueden variar de 0.1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la vía de administración. La guía respecto a las dosis particulares y métodos de administración se proporcionan en la literatura (Véase, las Patentes de los Estados Unidos de América Números 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212, todas las cuales se incorporan en la presente mediante referencia). Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para los anticuerpos que para los inhibidores de moléculas pequeñas. La administración intracerebral puede necesitar administración de una manera diferente que las inyecciones intravenosas. Los datos obtenidos de las pruebas de cultivo celulares y estudios sobre animales se pueden usar para formular un intervalo de variación de dosis para su uso en humanos. Las dosis de estos compuestos se basan preferiblemente dentro de un intervalo de variación de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o sin toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo de variación dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de variación de concentración en el plasma circulante que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza la mitad de la inhibición máxima de síntomas) como se determina en el cultivo celular. Esta información se puede usar para determinar con más precisión dosis útiles en humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. B. Formulaciones y Uso Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. De este modo, el compuesto y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables se pueden formular para la administración por inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o de la nariz) o administración oral, bucal, parenteral o rectal. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas, o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxi-propil-metil-celulosa); rellenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco u óxido de sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas se pueden recubrir mediante métodos muy conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo conveniente antes del uso. Estas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras, saborizantes, colorantes, y agentes edulcorantes según sea lo apropiado. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse convenientemente para dar una liberación controlada del compuesto. Para la administración bucal las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o trociscos formulados de manera convencional. Para la administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de rocío por aerosol, a partir de empaques presurizados o un nebulizador, con el uso de un impulsor conveniente (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gras conveniente). En el caso de aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador se pueden formular para que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo conveniente tal como lactosa o almidón. Los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitarias (por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples) con un conservador añadido. Las composiciones pueden tomar forma como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o de dispersión. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo conveniente (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes del uso. Los compuestos también se pueden formular en composición rectal tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implante (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos convenientes (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones, o como derivados solubles esparcidos, por ejemplo, como una sal soluble esparcida. Las composiciones, si se desea, se pueden presentar en un empaque o dispositivo dosificador que puede contener una o más formas de dosis unitarias que contienen el ingrediente activo. El empaque, por ejemplo, puede comprender una hoja de metal o plástica, tal como un empaque de ampolla. El empaque o dispositivo dosificador puede estar acompañado por instrucciones para su administración. Experimental Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar y adicionalmente ilustrar ciertas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención y no se considerarán limitantes del alcance de la misma. En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguiente abreviaturas : eq (equivalentes); M (Molar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles) ; nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); ng (nanogramos); I o L (litros); mi (mililitros); µ? (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); pm (micrómetros o mieras); nm (nanómetros) ; °C (grados Centígrados); U (unidades), mU (miliunidades); min. (minutos); seg. (segundos); % (por ciento); kb (kilobase); bp (par de bases); y PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Ejemplo 1 Identificación de un péptido de VIH-1SF2 gp120 que activa al receptor 4 de melanocortina humano (hMC4R) Una serie de péptidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos del quinto dominio conservado del VIH-1SF2 gp120 fueron sintetizados por Península Labs (Behnont, CA). Líneas celulares. La secuencia que codifica el ADN del receptor 4 de melanocortina humano (hMC4R) se subclonaron en un vector pcDNAIneo (Invitrogen) y se transfectaron establemente en células de riñon embrionario humano 293 (HEK293) utilizando un procedimiento de fosfato de calcio modificado (Chen y Okayama, Mol Cell Biol, 7:2745-2752, 1987). Las células transfectadas establemente se seleccionaron en DMEM que contenía 10 por ciento de suero de becerro neonato (NCS) y 1 miligramo/mililitro de G418, y se cultivaron en medio suplementado con 500 microgramos /mililitro de G418. Ensayos de ciclasa de adenililo. La actividad de la ciclasa de adenililo se determinó directamente midiendo la capacidad de las células de convertir [3H]adenina en [3H]cAMP después de la exposición de las células a dosis crecientes de los péptidos de gp120. Pozos duplicados que contenían aproximadamente 1 x 106 células se incubaron durante 2 horas con 2.5 pCi de [3H]adenina en DMEM que contenía 10 por ciento de NCS. Después de que este medio fue aspirado y las células se solubilizaron con un 1 mililitro de 2.5 por ciento de ácido perclórico, 0.1 mM de cAMP. Se removieron los lisados (0.8 mililitros) , se neutralizaron con 80 microlitros de 4.2 N de KOH, y 0.42 mililitros de H20. Las muestras se mezclaron y el sedimento se dejó asentarse. Se contó un total de 0.1 mililitro de cada lisado en un contador beta para determinar la cantidad total de [3H]adenina incorporada en la células. Se separó del lisado el cAMP después de la cromatografía secuencial sobre Dowex y columnas de óxido de aluminio. Se eluyó el cAMP con columnas de óxido de aluminio en 4 mililitros de Tris (pH 7.4) y se contó en un contador beta. Se calculó la actividad de ciclasa relativa determinando el porcentaje de [3H]adenina convertida en [3H]cAMP. Se usó el paquete de software Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA) para ajustar las curvas a los datos y calcular la EC50 y los valores de respuestas máximos. Resultados. Como se muestra en la Figura 8, el péptido G25G (#79) estimuló la actividad ciclasa de adenililo en las células HEK-293 transgénicas que expresan el hMC4R. Específicamente el péptido VIH-1SF2 gpl20 G25G (GGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLG, SEQ ID NO:17) estimuló la producción de cAMP a una concentración de 10"6M, mientras que varios péptidos de control (por ejemplo, #77 R12Q = RNSSSSGSSGAGQ, SEQ ID NO:23) no estimularon la actividad de la ciclasa de adenililo inducida por hMC4R a las concentraciones probadas. En adición, como se muestra en la Figura 9, el péptido #33 K13M correspondiente a una porción del péptido G25G sintetizado en la orientación inversa también estimuló la ciclasa de adenililo en las células HEK-293 transgénicas que expresan el hMC4R. Específicamente el péptido K13M (KYKYLESRWNDRM, SEQ ID NO: 6) estimuló la producción de cAMP a una concentración de 10"6M, mientras que los otros péptidos gp120 de similares longitudes sintetizados ya sea en la dirección hacia adelante (f) o inversa (r) no estimularon la actividad de la ciclasa de adenililo inducida por hMC4R a las concentraciones probadas. Péptidos de gp120 adicionales probados: #27fM13K = MRDNWRSELYKYK, SEQ ID NO:24; #29fR12K = RDNWRSELYKYK, SEQ ID NO:25; #31rK14D = KYKYLESRWNDRMD, SEQ ID NO:26; #35rK17G = KYKYLESRWNDRMDGGG, SEQ ID NO:27; #37fG17K = GGGDM RDNWRSELYKYK, SEQ ID NO:28; #39rK12R = KYKYLESRWNDR, SEQ ID NO:29; y #41fD14K = D MRD WRSELY YK, SEQ ID NO.30. Ejemplo 2 Identificación de un péptido de VIH-1SF2 gp120 que activa al receptor 5 de melanocortina humano (hMC5R) Líneas celulares. La secuencia que codifica el ADN del receptor 5 de melanocortina humano (hMC5R) se subclonó en un vector de expresión eucariótico conveniente tal como el vector pcDNAIneo (Invitrogen) y se transfecto establemente en células de riñon embrionario humano 293 (HEK293) utilizando un procedimiento de fosfato de calcio modificado (Chen y Okayama, Mol Cell Biol, 7:2745-2752, 1987). Las células transfectadas establemente se seleccionaron en DMEM que contenía 10 por ciento de suero de becerro neonato (NCS) y 1 miligramo/mililitro de G418, y se cultivaron en medio suplementado con 500 microgramos/mililitro de G418. Ensayos de ciclasa de adenililo. La actividad de la ciclasa de adenililo se determinó directamente midiendo la capacidad de las células de convertir [3H]adenina en [3H]cAMP después de la exposición de las células a dosis crecientes de los péptidos de gp120. Pozos duplicados que contenían aproximadamente 1 x 106 células se incubaron durante 2 horas con 2.5 pCi de [3H]adenina en DMEM que contenía 10 por ciento de NCS. Después de esto el fue aspirado y las células se solubilizaron con un 1 mililitro de 2.5 por ciento de ácido perclórico, 0.1 mM de cAMP. Se removieron los lisados (0.8 mililitros), se neutralizaron con 80 microlitros de 4.2 N de KOH, y 0.42 mililitros de H20. Las muestras se mezclaron y el sedimento se dejó asentarse. Se contó un total de 0.1 mililitro de cada lisado en un contador beta para determinar la cantidad total de [3H]adenina incorporada en la células. Se separó del lisado el cAMP después de la cromatografía secuencial sobre Dowex y columnas de óxido de aluminio. Se eluyó el cAMP con columnas de óxido de aluminio en 4 mililitros de Tris (pH 7.4) y se contó en un contador beta. Se calculó la actividad de ciclasa relativa determinando el porcentaje de [3H]aden¡na convertida en [3H]cAMP. Se usó el paquete de software Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA) para ajustar las curvas a los datos y calcular la EC50 y los valores de respuestas máximos. Ejemplo 3 Producción y Detección de los Anticuerpos Reactivos al Epítopo de Melanotropina Viral Síntesis de péptido. Un péptido correspondiente al M13K (MRDNWRSELYKYK presentado como SEQ ID NO:24) se sintetizó con residuos de glicina y cisteína de terminal carboxilo para acoplarse a un vehículo. Similarmente, los péptidos correspondientes a G25G (SEQ ID NO: 17) y K13M (SEQ ID NO: 6) se sintetizaron después de la adición de un residuo de cisteína al término amino o carboxilo para facilitar el acoplamiento a un vehículo tal como una hemocianina de limpete de orificio (KLH). Generación de anticuerpos policlonales. Ratones BALB/c se inmunizaron intraperitonealmente en los días 0, 15, y 30 con aproximadamente 50 microgramos de péptido acoplado con KLH resuspendido en 100 microlitros de solución salina regulada con fosfato (PBS) y se emulsionaron con un volumen igual de adyuvante RIBI (RIBI Immunochem Research Inc., Hamilton, MT). Se recolectó sangre de la vena de la cola antes de la inmunización inicial y después de cada refuerzo, y la fracción del suero se examinó para determinar el contenido de anticuerpo específico. El anticuerpo reactivo para VIH-I Env se midió mediante un Western blot usando tiras derivadas de electroforesis en gel de docecilsulfato de sodio con poliacrilamida (SDS-PAGE) de péptidos reducidos conjugados a un segundo vehículo tal como albúmina de suero bovino (BSA), VIH-1 gp120 soluble recombinante, y/o Usados de una célula que expresa el VIH-1 Env (por ejemplo, una célula infectada). En una modalidad ejemplar, los ratones BALB/c se inmunizaron con M13K-KLH en adyuvante de Freund Completo. Después de un periodo de descanso de ocho semanas los ratones fueron reforzados con M13K-KLH en Adyuvante de Freund Incompleto, luego se reforzaron de nuevo en intervalos de dos semanas con M13K-KLH en PBS. El suero se recolectó de los ratones una semana después de cada refuerzo y se probó contra M13K-BSA en un ELISA. Las titulaciones de anticuerpos de 1:50 a 1:400 se obtuvieron después del primer refuerzo, lo que aumentó a la titulación de 1:25,600 a 1:51,200 después de refuerzos posteriores. Producción de anticuerpos monoclonales (mAb). Se cosecharon esplenocitos de un ratón BALB/c adulto 3 días después del refuerzo con el péptido gp120 conjugado a KLH. Los esplenocitos se fusionaron a células de mieloma P3x63Ag8.653 a una proporción de 5:1, y los hibridomas se seleccionaron en DMEM que contenía hipoxantina-aminopterina-timidina. Se rastrearon los sobrenadantes del cultivo celular para determinar la reactividad del VIH-1 como se describe para la generación de anticuerpos policlonales. Ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas (ELISA). También se pueden analizar los anticuerpos específicos para la envoltura del VIH-1 inducidos por la inmunización mediante ELISA con el VIH-1 gp120 soluble recombinante o el conjugado del péptido de gp120-BSA como el antígeno. Placas lmmunlon-2 se recubrieron con rgp120 (1 miligramos/mililitro) en regulador de carbonato (15 mM Na2C03, 35 mM NaHC03 [pH 9.8]) durante la noche a 48°C. Las soluciones se aspiraron, y los pozos se rellenaron con 100 mililitros de regulador de boqueo (Diluyente de papel filtro; DuPont, Wilmington, Del.) que contenía 2.5% de suero bovino fetal y se incubaron a 37° centígrados durante 4 horas. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS que contenía 0.05% Tween 20. Las muestras de plasma se valoraron por duplicado a una dilución de 1:50 en pozos que contenían regulador borato (0.1 M ácido bórico, 47 mM borato de sodio, 75 mM de NaCI, 0.05% [volumen/volumen] Tween 20) más 2.5 por ciento de suero bovino fetal. Se observó el desarrollo de color usando un conjugado de fosfatasa alcalina-inmunoglobulina G de cabra anti-mono (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) seguido por incubación con hexahidrato de p-nitrofenilfosfato de disodio (Sigma 104 sustrato de fosfatasa) en regulador de dietanolamina (0.9 M dietanolamina-7 mM de MgCI2 [pH 9.8] con HCI concentrado). Se midió la absorbencia a 405 nanómetros. Detección de anticuerpo neutralizante. Los anticuerpos que neutralizan el VIH-1 se miden en células MT-2 usando un ensayo de aniquilación de células como se describe previamente (Montefiori y colaboradores, J Clin Microbiol, 26:231-235, 1988). Se preparan caldos de virus en células H9 y se titulan mediante una concentración de p24 y 50 por ciento de dosis infectiva de cultivo de tejido se ensaya en células MT-2. Se pueden usar ensayos similares para medir los anticuerpos neutralizantes contra los aislados virales i en los cuales se determina la titulación del caldo y se realizan los ensayos en células CEMx174. Las muestras de suero se inactivaron por calor durante una hora a 56°C antes del ensayo. Ejemplo 4 Disociación de VIH-1 gp120 con trombina y análisis Western Blot de los Anticuerpos Se obtuvo VIH-1 gp120 del aislado SF162 del Programa de Reactivos para el SIDA de los Institutos Nacionales de Salud (catálogo número 7363). Se obtuvo trombina de plasma humano de Sigma (catálogo número T9010). Veinte microlitros de VIH-1 gp120 (1.2 microgramos/microlitro) y diez microlitros de trombina (30 Unidades/mililitro) se mezclaron e incubaron a 37°C durante 2 horas. Se añadieron el regulador de la muestra SDS y el agente reductor a la mezcla de gp 120-trombina, se calentó a 85°C durante 2 minutos y luego se analizó mediante SDS-PAGE (2 microgramos de gp120/ franja). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF para análisis por Western blot. El gel de post transferencia se tiñó con azul Coomassie y el blot post-transferido se tiñó con Ponceau S. La membrana se cortó en tiras, se bloqueó durante la noche a 4°C en una solución de Tween leche. Cada tira se hizo reaccionar con un control o con un anticuerpo de prueba. El control positivo fue un anticuerpo monoclonal de VIH-1 gp120, el control negativo fue medio de cultivo celular y los anticuerpos de prueba fueron sobrenadantes de cultivo celular de clones de hibridoma obtenidos de ratón inmunizado M13K-KLH. Bandas de 120 kDa, 70 kDa y en una extensión menor de 50 kDa se visualizaron en el gel teñido con azul Coomassie. La banda de 50 kDa se oscureció algo por la banda grande correspondiente al estabilizante de BSA. Las bandas de 120 kDa y 70 kDa se detectaron por el anticuerpo de control positivo, mientras que no se detectaron bandas en el anticuerpo de prueba y bandas de control negativo a las diluciones probadas. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente mediante referencia. Varias modificaciones y variaciones del método descrito y sistema de la invención serán aparentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y el espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con unas modalidades preferidas específicas, deberá entenderse que la invención como se reclama no deberá limitarse indebidamente a estas modalidades específicas. Sin duda, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvios para los expertos en los campos relevantes, pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar anticuerpos en una muestra, el cual comprende: a) proporcionar (i) una muestra, en donde la muestra comprende anticuerpos; y (ii) un polipéptido que comprende un epítopo de melanotropina del VIH-1; b) poner en contacto el polipéptido con la muestra bajo condiciones convenientes para enlazar los anticuerpos con el epítopo de melanotropina del VIH-1 enlazado al polipéptido.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la detección comprende un ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la detección comprende un Western blot.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es de un paciente infectado con el VIH-1.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es de un receptor de vacuna de SIDA.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es del sobrenadante de un cultivo de células de hibridoma.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende un fragmento de 50 kDA de la VIH-1 gp120 producido mediante disociación con trombina.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende un vehículo.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:24.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende una proteína VIH-1 gp120.

11. El método de la reivindicación 1, que además comprende un paso de detectar anticuerpos que neutralizan al VIH-1 en un ensayo in vitro.

12. Un kit para detectar anticuerpos en una muestra, el cual comprende: a) un polipéptido que comprende un epítopo de melanotropina de VIH-1; y b) instrucciones para detectar anticuerpos reactivos contra el epítopo de melanotropina de VIH-1 en una muestra.

13. El kit de la reivindicación 12, el cual además comprende un polipéptido de control negativo.

14. El kit de la reivindicación 13, el cual además comprende un anticuerpo de control positivo y un anticuerpo de control negativo.

15. El kit de la reivindicación 13, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID

NO:17 o la SEQ ID NO:24. 16. Un método para identificar un compuesto como un inhibidor de la estimulación del epítopo de la melanotropina del VIH-1 de un receptor de melanocortina humano (MCR), el cual comprende: a) proporcionar: (i) una línea celular que expresa un MCR humano; (ii) un polipéptido que comprende un epítopo de melanotropina de VIH- ; y (iii) un compuesto; b) poner en contacto la línea celular con el polipéptido en la presencia y ausencia del compuesto bajo condiciones convenientes para estimular el MCR humano con el polipéptido

17. El método de la reivindicación 16, el cual además identifica el compuesto como un inhibidor de la estimulación de la hormona del neuropéptido humano del MCR humano mediante el paso (c) poner en contacto la línea celular con una hormona de neuropéptido humano en la presencia y ausencia del compuesto bajo condiciones convenientes para estimular el MCR con la hormona de neuropéptido humano, en donde la estimulación del MCR humano en ausencia pero no en presencia del compuesto indica que el compuesto es un inhibidor de la hormona de neuropéptido humano.

18. El método de la reivindicación 16, en donde el MCR humano es el MC4R.

19. El método de la reivindicación 16, en donde el MCR humano se selecciona del grupo que consiste en MC1R, MC2R, MC3R y MC5R.

20. El método de la reivindicación 18, en donde la línea celular es una línea celular transgénica que expresa el MC4R.

21. El método de la reivindicación 16, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:24.

22. El método de la reivindicación 17, en donde la hormona de neuropéptido humano se selecciona entre el grupo que consiste en la hormona estimulante de melanocitos alfa (alfa-MSH), adrenocorticotropina (ACTH), la hormona estimulante de melanocitos beta (beta-MSH), y la hormona estimulante de melanocitos gamma (gamma-MSH).