MX2008006702A - Neuropeptidos para el cultivo de organismos acuaticos - Google Patents

Abstract

La presente invención esta relacionada con la utilización de variantes del Péptido Activador de la Adenilato Ciclasa de Pituitaria para estimular el crecimiento y mejorar el sistema inmunológico de organismos acuáticos;las variantes del péptido fueron suministradas por inmersión, por inyección y como aditivo en la dieta alimenticia.

Description

NEUROPEPTIDOS PARA EL CULTIVO DE ORGANISMOS ACUÁTICOS CAMPO DE LA TÉCNICA La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología agropecuaria, específicamente con la utilización del Péptido Activador de la Adenilato Ciclasa de Pituitaria. Cuando se aplica el péptido por inmersión, por inyección o como aditivo en la dieta alimenticia, se obtiene un aumento en el apetito de estos organismos, una mayor tasa de crecimiento y de sobreviva, una actividad inmune superior y un aumento de la liberación de prolactina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Péptido Activador de la adenilato ciclasa de Pituitaria (en inglés Pituitary Adenylate cyclase Activating peptide, abreviado PACAP) se aisló por primera vez en el año 1989 a partir de hipotálamo bovino y se demostró que su capacidad de estimular la secreción de la hormona del crecimiento (en inglés growth hormone abreviado GH) es a través de la activación de la enzima adenilatociclasa (Miyata and col. (1989) Isolation of a novel 38 residue hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:567-574). El PACAP pertenece a la familia de péptidos que incluye a la secretina, el glucagón y el péptido intestinal vasoactivo (Arimura and Shioda (1995) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors: Neuroendocrine and endocrine interaction. Front. Neuroendocrinol. 16:53-88). Los precursores del PACAP y de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento (en inglés "growth hormone releasing hormone" abreviado GHRH), en mamíferos, están codificados por dos genes distintos (Hosoya and col. (1992) Structure of the human pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) gen. Biochim. Biophys. Acta. 1129:199-206), mientras que en todas las especies submamíferas estudiadas hasta la fecha (aves, reptiles y peces), los péptidos GHRH y PACAP son codificados por un mismo gen y están contenidos en un mismo precursor (Montero and col. (2000) Molecular evolution of the growth hormone-releasing hormone/pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide gene family. Functional ¡mplication ín the regulation of growth hormone secretion. Journal of Molec. Endocrino!. 25:157-168). El PACAP se expresa fundamentalmente en el sistema nervioso central y periférico, en las fibras nerviosas que inervan los ojos, en el tracto respiratorio, en las glándulas salivales, en el tracto gastrointestinal, en los órganos del sistema reproductivo, en el páncreas, y en el tracto urinario. También se sintetiza en las glándulas adrenales, en las gónadas y en las células inmunes (Sherwood and col. (2000) The origin and function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily. Endocrine Review 21 :619-670). Presenta diferentes funciones biológicas, lo cual, es consistente con su diversa distribución en los distintos tejidos y con su actividad hipofisiotrófica, neorotrasmisora, neuromoduladora y vasoreguladora (Chatterjee and col. (1997) Genomic organization of the rat pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor gene. Altemative splicing within the 59-untranslated región. J. Biol. Chem. 272:12122-12131 ). Está involucrado en la regulación de la división celular, de la diferenciación y de la muerte celular (Sherwood and col. (2000) The origin y function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily. Endocrine Review 21 :619-670). El PACAP estimula la liberación de la hormona de crecimiento. El efecto del péptido sobre la liberación de GH se ha demostrado, in vitro, en varias especies de mamíferos, en aves, en anfibios (Hu and col. (2000) Characterization and messenger ribonucleic acid distribution of a cloned pituitary adenylate cyclase-activatíng polypeptide type I receptor in the frog Xenopus laevis brain. Endocrino!. 141 :657-665) y en peces (Anderson L. L. and col. (2004) Growth Hormone Secretion: Molecular and Cellular Mechanisms and In Vivo Approaches. Society for Experim. Biol. and Med. 229:291-302). Los estudios realizados sobre el papel del PACAP en la secreción y liberación de la GH, in vivo, son escasos. Hasta la fecha se conoce que el péptido incrementa, in vivo, los niveles de GH en plasma de ratas (Jarr and col. (1992) Contrasting effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on in vivo and in vitro prolactin and growth hormone reléase ¡n male rats. Life Sci. 51 :823-830) y de bovinos (Radcliff and col. (2001 ) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide induces secretion of growth hormone in cattle. Domestic. Animal. Endocrino!. 21 :187-196), mientras que en ovejas (Sawangjaroen and Curlewis (1994) Effects of pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide (PACAP) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on prolactin, luteinizing hormone and growth hormone secretion in the ewe. J. Neuroendocrinol. 6:549-555) y en humanos (Chiodera and col. (1996) Effects of intravenously infused pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on adenohypophyseal hormone secretion innormal men. Clin. Neuroendocrinol. 64:242-246), no produce este efecto. Estos hallazgos sugieren que el efecto del péptido sobre la secreción de la GH, en mamíferos, varía de especie a especie (Anderson and col. (2004) Growth Hormone Secretion: Molecular and Cellular Mechanisms and In Vivo Approaches. Society for Experim. Biol. and Med. 229:291 -302). En peces hasta el presente no existen estudios, in vivo, que muestren el papel del PACAP en la regulación de la GH, tampoco existen antecedentes del uso de este péptido como estimulador del apetito en organismos acuáticos. En crustáceos no existen evidencias, hasta el presente, de la presencia de este péptido y no se tiene conocimiento de la cascada de señales que regulan el crecimiento en estos organismos. El PACAP estimula además, la liberación de prolactina en mamíferos por las células de la glándula pituitaria (Ortmann and col. (1999) Interactions of ovarían steroids with pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and GnRH in anterior pituitary cells. Eur. J. Endocrinol. 140:207-214). Promueve la liberación de la hormona estimulante de los melanocitos (en inglés "melanotropin a-melanocyte-stimulating hormona" abreviado MSH) por las células melanotróficas de la pituitaria anterior (Vaudry and col. (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions. Pharmacol. Rev.s 52:269-364). En peces no existen estudios hasta el presente que muestren la actividad de este péptido como liberador de prolactina in vivo, ni hallazgos acerca de su efecto en el desarrollo de la coloración en peces. En mamíferos está muy bien caracterizada la función del PACAP sobre el sistema inmune y existen varias patentes que describen su uso en humanos como modulador de la respuesta inmunológica. Hasta el presente no existen antecedentes en la literatura que expliquen el papel del PACAP sobre el sistema inmune en organismos acuáticos. El gen que codifica para el PACAP ha sido clonado de varias especies de vertebrados y de un protocordado (tunicado). En peces ha sido aislado el de algunas especies de salmón y de pez gato (Sherwood and col. (2000) The Origin and Function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating olypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily Endocrine Reviews 21 (6):619-670), goldfish (Leung y col. (1999) Molecular cloning and tissue distribution of in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) the goldfish. Rec. Progr. Mol. Comp. Endocrino!. 338-388), pez cebra (Fradinger and Sherwood (2000) Characterization of the gene encoding both growth hormone-releasing hormone (GRF) and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Mol. and Cell. Endocrino!. 165:211 -219), trucha (Krueckl and Sherwood. (2001 ) Developmental expression, alternative splicing and gene copy number for the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and growth hormone-releasing hormone (GRF) gene in raibow trout. Molec. and Cell. Endocrino!. 182:99-108). En la patente US 5695954 se protege el aislamiento y la purificación de secuencias nucleotídicas de genes que codifiquen para el polipéptido GHRH-PACAP de peces, así como vectores y hospederos que expresen dichas secuencias con el objetivo de ser usados para incrementar el crecimiento en peces, vía transgénesis, introduciendo las construcciones genéticas mencionadas en huevos de peces fertilizados. Se protege además, un método para detectar peces transgénicos que contengan estas secuencias. En esta patente se reportan específicamente la secuencias de los genes que codifican para el polipéptido GHRH-PACAP de las especies Oncorhynchus Nerka, Claria macrocephalus y Acispenser transmontanus. En la presente invención se emplean variantes de la secuencia aminoacídica exacta del PACAP, obtenida en nuestro laboratorio para las especies Claria gariepinus y Oreochromis niloticus, con modificaciones en el extremo amino terminal. Estas variantes son utilizadas como estimuladores del crecimiento por vía no transgénica, mediante su administración por inmersión expresadas en el sobrenadante de cultivo de E. coli y de P. pastoris, sin previa purificación de las mismas. Inesperadamente además encontramos que estas variantes son capaces en estas condiciones de promover un aumento significativo de la actividad inmunológica en estos organismos y de la concentración de prolactina en suero. Estas propiedades del péptido no habían sido descritas hasta el presente para organismos acuáticos. Varios autores han reportado un efecto estimulador del crecimiento en peces por la administración vía inmersión de hormona de crecimiento recombinante. Sin embargo en la práctica el uso directo de la hormona de crecimiento está sujeto a muchos requisitos regulatorios, lo mismo sucede con el uso de peces transgénicos que sobreexpresan la hormona de crecimiento o un factor liberador de la misma. En la presente invención se describe una metodología no mediada por transgénesis, para aumentar el crecimiento y mejorar el sistema inmune de organismos acuáticos, incluyendo invertebrados. Los organismos acuáticos son actualmente una fuente importante de proteínas, pero su captura de forma natural se encuentra al límite máximo de su explotación, por lo que para aumentar su producción se hace necesario su cultivo (Pullin y col.; Conference Proceeding 7, 432 p. International Center for living Aquatic Resources Monagement. Manila, Philippines. 1982, ISSN 01 15-4389). Aumentar la eficiencia del cultivo de estos organismos, mediante la estimulación del crecimiento, el aumento de la sobrevida y la mejora de la calidad de las larvas se mantiene como un problema importante a resolver en la acuicultura.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve el problema antes mencionado proporcionando variantes del Péptido Activador de la Adenilato Ciclasa de Pituitaria con las secuencias de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO 12, 13 y 14, que incrementan la tasa de crecimiento de organismos acuáticos, incluyendo organismos invertebrados, en un periodo de tiempo corto, lo cual resulta de vital importancia para la acuicultura, estos péptidos aumentan además la sobrevida cuando se aplican por inmersión o como aditivo en la dieta de larvas de peces y crustáceos de interés comercial, estimulan la actividad inmune en estos organismos, así como el apetito, el desarrollo de la coloración de la piel y la liberación de prolactina. En una modalidad preferida de la presente invención, las variantes del neuropéptido PACAP se le aplican a los peces o crustáceos por inyecciones periódicas con intervalos de 3 días en una concentración de 0.1 µg/g de peso del animal, por baños de inmersión con intervalos de 1 a 4 días en agua dulce o agua de mar teniendo una concentración de péptido de entre 100 a 200 µg/por litro de agua y como alimento formulado en una concentración de 5mg/Kg de pienso. Obteniéndose en todos los casos un aumento significativo del crecimiento de estos organismos y una actividad inmune superior. El uso de las variantes del neuropéptido PACAP ofrece ventajas por ser de tallas pequeñas en el orden aproximado de los 5 KDa, por lo que se absorbe mejor a través de la piel y mucosas de los organismos al ser aplicado por inmersión, que es una via de administración con ventajas de costo y de manipulación para la acuicultura y con bajos índices de contaminación, además su mecanismo de transducción de señales se inicia por la activación de una enzima (adenilatociclasa) y no a través de la activación de una hormona y su actividad liberadora de hormona de crecimiento en mamíferos, incluyendo humanos, es débil, por lo que su utilización presenta mejor percepción pública y menos requerimientos regulatorios. Otras de las ventajas es la de estimular la actividad inmune innata y adaptativa en peces y aumentar la resistencia a infecciones por agentes patógenos. En una materialización de la invención, las variantes del PACAP se les suministran a especies de organismos acuáticos como a la tilapia Orechromis sp, al pez gato Claria sp, al salmón Salmón sp. y a camarones del género Penaus sp. En otra modalidad preferida de la presente invención, las variantes del PACAP se les suministran a los peces o crustáceos para prevenir o tratar infecciones por agentes patógenos. Como resultado de este trabajo, una materialización de la presente invención describe la preparación de una composición para tratar peces o crustáceos en cultivo para estimular su crecimiento y para incrementar su resistencia contra enfermedades, así como para tratamiento preventivo o terapéutico de una infección por agentes patógenos, todo esto con el objetivo de mejorar la productividad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras 1A y 1 B. Estrategia de clonaje del péptido de interés en los vectores de expresión en bacteria (Fig. 1A) y en levadura (Fig. 1 B). Figura 2. Experimento de estimulación del crecimiento en juveniles de Claria gariepinus mediante la inyección intraperitoneal del PACAP recombinate purificado por cromatografía de afinidad, a la dosis de 0.1 µg por gramo de peso del animal. La gráfica representa el promedio del peso corporal del grupo tratado con el PACAP comparado con el grupo tratado con placebo durante el transcurso del experimento. Figuras 3A y 3B. Experimento de estimulación del crecimiento en juveniles de Claria gariepinus mediante la inyección intraperitoneal del PACAP recombinate purificado por cromatografía de afinidad, a la dosis de 0.1 µg por gramo de peso del animal. La gráfica representa el promedio de los valores de índice hepatosomático y de peso seco del músculo del grupo tratado con el PACAP comparado con el grupo tratado con placebo. Figuras 4A y 4B. Experimento de estimulación del crecimiento en larvas de tilapia mediante la aplicación vía inmersión del PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de ruptura de E. coli, a la dosis de 100 µg por cada 1 litro de agua. Las gráficas 4A y 4B muestran el promedio de los valores de peso en gramos y de longitud en centímetros de los peces del grupo tratado con el PACAP respecto al grupo tratado con placebo, durante el transcurso del experimento.

Figura 5. Experimento de estimulación del crecimiento en larvas de tilapia mediante la aplicación vía inmersión del PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de ruptura de E. coli, a la dosis de 100 µg por cada 1 litro de agua. La gráfica representa el peso en gramos de los peces tratados con el PACAP y de los peces tratados con placebo a los 22 días de iniciado los tratamientos. Figura 6. Experimento de estimulación del crecimiento en larvas de tilapia mediante la aplicación vía inmersión del PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de ruptura de E coli, a la dosis de 100 µg por cada 1 litro de agua. La fotografía muestra la diferencia en longitud a los 30 días, después del último baño de inmersión, de los peces tratados con el PACAP (A y C) respecto al grupo tratado con placebo (B). Figuras 7A-7C. Experimento de estimulación del crecimiento en larvas de tilapia mediante la aplicación vía inmersión del PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de ruptura de E coli, a la dosis de 100 µg por cada 1 litro de agua. La fotografía muestra mayor precocidad en el desarrollo de la coloración de los peces tratados con el PACAP (A y B) respecto al grupo placebo (C). Figura 8. Experimento para evaluar el efecto del PACAP recombinante purificado por cromatografía de afinidad, sobre el apetito, en tilapias juveniles de la especie Orechromis niloticus, cuando es aplicado a la dosis de 0.5 µg por gramo de peso del animal. La gráfica muestra la cantidad de alimento promedio ingerido por los peces de ambos grupos a las 6 horas y a las 22 horas de iniciado los tratamientos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de vectores para la expresión del PACAP de forma intracelular en E.coli y de forma extracelular en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris El gen que codifica para PACAP de Claria gariepinus fue aislado mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (en inglés, Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR) a partir de la secuencia previamente obtenida por RT-PCR (en inglés, Reverse Transcription -Polymerase Chain Reaction) para el gen que codifica para el neuropéptido GHRH-PACAP de esta especie. Se utilizaron los oligonucleótidos específicos SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 para obtener la secuencia completa del gen que codifica para el polipéptido GHRH-PACAP incluyendo la secuencia señal, y los oligonucleótidos específicos SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4 para amplificar el gen exacto del PACAP con los sitios de restricción enzimático necesarios para su clonaje en un vector de expresión en E. coli. EL PACAP de tilapia se aisló de igual forma utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4. La presente invención constituye el primer reporte del aislamiento de este gen en tilapia. El gen que codifica para el PACAP fue clonado en el vector de expresión en E coli pAR 3040 utilizando los sitios de restricción Ndel / BamHI (Figura 1A). Se seleccionó uno de los clones recombinantes para transformar la cepa de E. coli BL21 D3 e inducir la expresión del gen bajo la regulación del promotor T7, utilizando como inductor IPTG 0.5 mM. La expresión del gen se llevó a cabo a 28°C durante 5 horas. La expresión del PACAP recombinante y su integridad se chequearon mediante Espectometría de Masas. Para la construcción de los vectores de expresión del PACAP en P. pastoris, se utilizaron los vectores de expresión pPS9 y pPS10. Se utilizaron los oligonucleótidos SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 6 para el clonaje en pPS9 y los oligonucleótidos SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6 para el clonaje en pPS10. Para el clonaje en el vector pPS7 se utilizaron los sitios de restricción Ncol / Spel, esta estrategia de clonaje adiciona a la proteína de interés en el extremo amino terminal una meteonina y una glicina. Para el clonaje en el vector pPS10 se utilizaron los sitios Nael y Spel, esta estrategia de clonaje no adiciona aminoácidos a la proteína de interés (Figura 1 B). Los plásmidos fueron linealizados antes de transformar la cepa de MP36 de P. pastoris. La transformación se llevó acabo por electroporación. La cepa MP36 es un muíante auxotrófico his3 la cual adquiere un fenotipo His+ después de la transformación.

Los clones transformantes se identificaron mediante Dot Blot. Utilizando la técnica de Southern Blot se determinó en cuales la integración había ocurrido por reemplazamiento del gen AOX1 de P. pastoris por el cásete de expresión del plásmido recombinante, lo cual se corresponde con un fenotipo Muts (baja utilización de metanol) e His+. La P. pastoris secreta bajos niveles de proteínas propias y su medio de cultivo no necesita suplementos proteicos, por lo que se puede esperar que una proteína heteróloga que se secreta al medio extracelular, constituya la mayoría del total de proteínas en el medio (más de un 80%) (Tschopp and col. (1987) Bio/Technology, 5:1305-1308). La expresión del PACAP en P. pastoris se llevó acabo en fermentadores de 5 litros mediante la adición de metanol al medio de cultivo.

EJEMPLO 2 Experimento de estimulación del crecimiento en juveniles de Claria gariepinus, determinación del índice hepatosomático y del peso seco del músculo de los peces Se utilizaron 18 ejemplares de la especie Claria gariepinus sin distinción de sexo, de aproximadamente la misma edad y con un peso de 30 a 40 gramos. Se conformaron dos grupos experimentales, de nueve individuos cada uno. Los grupos fueron aclimatados en tanques separados, con recirculación constante de agua, a una temperatura de 28°C y con un fotoperíodo constante de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Los animales se alimentaron dos veces al día, con raciones equivalentes al 5% del peso corporal total en cada tanque. Cada ejemplar fue identificado antes de comenzar el experimento. Uno de los grupos experimentales fue tratado con el péptido PACAP previamente semipurificado (70 % de pureza) SEQ ID NO. 13, mientras que el otro grupo, utilizado como placebo, fue tratado con proteínas de E.coli contenidas en PBS 1X (proteínas de E.coli obtenidas mediante el mismo procedimiento de purificación del péptido de interés, equivalentes a la cantidad de contaminantes presentes en la muestra purificada del PACAP). Los peces tratados con el PACAP fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis de 0.1 µg del péptido por gramo de peso corporal del animal, 2 veces por semana. El grupo placebo fue inyectado de igual forma con la muestra placebo. A los 22 días de iniciado el experimento, los animales inyectados con el PACAP en la cavidad peritoneal, mostraron un incremento en gramos del peso corporal significativamente mayor (p<0.05) respecto a los animales inyectados con placebo (Figura 2). Se midieron los valores de índice hepatosomático y peso seco del músculo para demostrar que el incremento en peso corporal observado no se debió ni al aumento del tamaño de los órganos, ni al aumento del contenido de agua en músculo. No se observaron diferencias significativas entre los valores de índice hepatosomático y entre los valores de peso seco del músculo de los grupos experimentales (Figuras 3A y 3B).

Resultados similares se obtuvieron cuando se aplicó el PACAP recombinante de secuencia SEQ ID NO. 12.

EJEMPLO 3 Experimento de estimulación del crecimiento, de la resistencia a agentes patógenos y de la liberación de prolactina, en larvas de tilapia mediante la aplicación vía inmersión del PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de ruptura de E. coli Se realizó un experimento para el evaluar el papel del PACAP de Claria gariepinus recombinante contenido en el sobrenadante de ruptura de E. coli sobre el crecimiento en larvas de tilapia. Se conformaron dos grupos experimentales de 60 larvas cada grupo, un grupo tratado con el PACAP de secuencia SEQ ID NO. 13 y un grupo placebo. Las larvas pertenecientes a cada grupo fueron aclimatadas en canaletas independientes de 80L, a una temperatura de 28°C y con un fotoperíodo constante de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad y se alimentaron con una cantidad de pienso de acuerdo a la fórmula: Cantidad de alimento = # de anímales X peso promedio (g) X 40% /100. Los tratamientos se realizaron por inmersión en un volumen de 2L, tres veces por semana durante 20 días, se aplicaron aproximadamente 200 µg del PACAP por cada baño de inmersión, de una hora de duración. Se obtuvieron como resultados que a los 10 días de iniciado el experimento el grupo tratado con el PACAP mostró un incremento en peso corporal y en la longitud estadísticamente superior respecto al grupo placebo (p<0.01 ), a los 15 días de iniciado el experimento la diferencia entre los tratamientos eran altamente significativa (p<0.001 ) (Cuadro 1 y Figura 4A y 4B). A los 20 días de aplicados los baños de inmersión las diferencias entre el grupo tratado con el PACAP y el grupo placebo continuaban siendo altamente significativas (p<0.001 ) (Figura 5).

CUADRO 1 Peso y longitud de las larvas de tilapias a los 10 días y a los 15 días de iniciado los tratamientos.

El peso y la longitud están dados como el promedio ± la desviación estándar Se observó que el efecto sobre el crecimiento se mantenía en el tiempo, pues 30 días después del ultimo baño de inmersión (realizado a los 20 días de iniciado el experimento) las diferencias en el peso corporal y en la longitud entre los animales de los grupos experimentales eran muy significativas (p<0.01 ) (Figura 6). Se observó además que los peces tratados con el péptido desarrollaban la pigmentación de la piel con mayor precocidad (Figuras 7A-7C).

En este mismo experimento se estudió la presencia del protozoo cutáneo del tipo Trichodina sp., para ellos se tomaron de forma aleatoria 10 animales de cada grupo de experimentación, a los 30 días de iniciado los tratamientos y se determinó la intensidad de la invasión por este agente patógeno. Los valores de intensidad de la invasión se determinaron según la fórmula: (I: # total de parásitos por pez) I = ? N/ n-F0 y E = n-F0 x 100/ n donde: I: (intensidad media de la invasión) E: (# de peces del total parasitados) ? N: (total de parásitos hallados) F0 (número de peces no parasitados) n: (número de peces muestreados) Se obtuvo como resultado que los animales tratados con el PACAP presentaron una intensidad de la invasión por el protozoo Trichodinas sp. significativamente menor (un valor promedio de 1= 2.20) respecto al grupo tratado con placebo que presentó un valor promedio de 1= 5.56 (p< 0.01 ). A los 45 días de iniciados los tratamientos se trataron los peces mediante baños de inmersión en las condiocines anteriormente descritas y se les extrajo sangre a las 24 horas de realizados los tratamientos. Se le midió la concentración de prolactina en suero a cada pez (muestra de 10 animales por cada grupo tratado) mediante Western blot y mediante ELISA (en inglés Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Se utilizó para estos experimentos un anticuerpo pohclonal anti prolactina de tilapia Se obtuvo como resultado que los peces del grupo tratado con el péptido presentaron concentraciones de prolactma en suero estadísticamente superior respecto al grupo placebo p<0 01 (Cuadro 2) Este resultado es muy atractivo para aquellos organismos acuáticos de interés comercial, como es el caso de los salmones, que realizan su ciclo de vida en agua dulce y agua de mar y en los que la prolactina desempeña una función importante en la osmoregulación CUADRO 2 Concentración de prolactina (ng/mL) en el suero de los peces a los 45 días de iniciado el experimento La concentración está dada como el promedio ± la desviación estándar EJEMPLO 4 Experimento para evaluar el efecto del PACAP recombinante sobre el apetito en tilapias juveniles de la especie Orechromis niloticus Los efectos biológicos del PACAP sobre el apetito, en peces, no han sido estudiados hasta el presente. De manera general en los organismos vertebrados submamíferos la actividad de estos péptidos sobre el apetito ha sido poco caracterizada. (Jensen, 2001 , Regulatory peptides and control of food intake in non-mammalian vertebrates. Comp. Biochem. And Phisiol. Part A 128:471-479). Para evaluar el efecto del PACAP sobre el apetito en peces, se utilizaron tilapias juveniles de la especie Oreochromis niloticus, seleccionadas al azar sin distinción de sexo y edad y de aproximadamente el mismo peso corporal. Se conformaron tres grupos experimentales, con tres réplicas cada uno (3 tilapias por réplica). Las tilapias se colocaron en canaletas de 80 litros y se mantuvieron a 28°C, con un fotoperíodo de luz oscuridad (14 horas luz-10 horas oscuridad) y recirculación constante del agua. El primer grupo fue tratado con el PACAP (previamente obtenido en nuestro laboratorio, con un 87% de pureza) de secuencia SEQ ID NO.13, mediante inyección intraperitoneal (0.5 µg/gramo de peso del animal). El segundo grupo fue tratado con el GHRP-6 (Lipotec, S.A Barcelona. España), utilizando el mismo método de administración a la dosis de 0.1 µg/gramo de peso del animal. El grupo placebo fue tratado con proteínas de E.coli contenidas en PBS 1X (proteínas de E.coli obtenidas mediante el mismo procedimiento de purificación del PACAP, equivalentes a la cantidad de contaminantes presentes en la muestra purificada del PACAP). Luego de aplicar por inyección los tratamientos, se añadió la misma cantidad de comida a los tres grupos experimentales, recolectándose a las 6 horas la comida no ingerida y añadiendo nuevamente alimento.

Volviéndose a monitorear el apetito a las 22 horas de comenzado el experimento. El alimento colectado del fondo de cada canaleta en cada monitoreo, fue secado al horno a 100°C durante 20 horas y fue pesado en una balanza analítica. Se calculó la comida ingerida determinando la diferencia entre la comida añadida a los estanques (10 gramos, con un 20% de humedad) y la comida no ingerida por los peces. Las tilapias inyectadas con el PACAP por vía intraperitoneal, a la dosis de 0.5 µg/gramo de peso del animal y las inyectadas con el péptido GHRP-6, por esta misma vía de administración, pero a la dosis 0.1 µg/gramo de peso del animal, mostraron un aumento significativo (p<0.05) del apetito respecto a las tilapias del grupo placebo (Figura 8).

EJEMPLO 5 Experimento de evaluación del efecto del PACAP recombinante sobre el sistema inmune en peces Se utilizaron juveniles de Claria gariepinus. Se conformaron dos grupos de 10 animales cada grupo. Los grupos fueron aclimatados en tanques separados, con recirculación constante de agua, a una temperatura de 28°C y con un fotoperíodo constante de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Los animales se alimentaron dos veces al día, con raciones equivalentes al 5% del peso corporal total en cada tanque. El péptido de secuencia SEQ ID NO.13, se aplicó por inyección intraperitoneal 2 veces por semana a la dosis de 0.1 µg/gramo de peso del animal. A los animales se les extrajo sangre a los 20 días de iniciado el experimento para medir los niveles de lisozima y de lectinas en suero sanguíneo. La actividad de lisozima en el suero se determinó mediante un método turbidimétrico, basado en la lisis de Micrococcus lysodeikticus liofilizado. Se utilizó lisozima de clara de huevo de gallina como patrón de referencia. Se prepararon los patrones de lisozima a concentraciones de 0, 1 , 2, 4 y 8 µg/mL en tampón fosfato (0.05 M NaHP04 12H20, pH 6.2). El microorganismo se preparó a una concentración de 3 mg/mL en tampón fosfato. Se añadieron 100 µL de las soluciones patrón en placas de 96 pocilios de fondo llano y se realizó por duplicado, y se añadieron 100 µL de suero por sextuplicado. A cada uno de estos pocilios se le añadió 100 µL de la suspensión del microorganismo para un volumen final de 200 µL en cada pocilio. Se leyó densidad óptica (DO) inmediatamente después de adicionar el microorganismo, a una ?= 450 nm en un lector de placas de 96 pocilios a los 0, 2, 3, 5, 10, 15, 25, 35 y 45 min. Las reacciones trascurrieron a 22°C aproximadamente. Se consideró como una Unidad (U) de lisozima: la variación de 0,001 unidades de DO en un minuto. Las unidades de lisozima de los patrones y de las muestras fueron calculadas de la siguiente forma: dividiendo la pendiente de la curva ?D045o nm vs t (min) (en su intervalo lineal) entre 0,001. Se hizo la curva patrón de U?¡SOz¡ma vs µg/mL de lisozima en donde se interpolaron las unidades de actividad enzimática de las muestras para hallar su concentración. Como resultado del experimento se obtuvo que los peces tratados con el PACAP mostraron un incremento en los niveles de lizosima en suero estadísticamente muy significativo (p<0.01 ) respecto al grupo placebo (Cuadro 3).

CUADRO 3 Concentración de lisozima (µg/mL) en el suero de los peces a los 20 días de iniciado el experimento La concentración está dada como el promedio ± la desviación estándar * test Student. Denota diferencias significativas (p<0.01 ) Para determinar la presencia de lectinas en suero sanguíneo, se realizó un ensayo de hemoaglutinación. Se realizaron diluciones seriadas en PBS 1X pH 7.2 partiendo de 100 µl del suero en una placa de 96 pocilios con fondo en U. Se añadió igual cantidad de una solución de eritrocitos de conejo al 2%. Las placas fueron incubadas 1 hora a temperatura ambiente y se leyó el título de hemoaglutinación visualmente. La actividad de lectinas fue expresada como el recíproco de la dilución más alta que mostró hemoaglutinación completa. Los peces tratados con el péptido mostraron un incremento en los niveles de lectinas, estadísticamente significativo, respecto al grupo placebo (p<0.05) (Cuadro 4).

CUADRO 4 Título de hemoaglutinación (el recíproco de la dilución más alta gue mostró hemoaglutinación completa) en el suero de los peces a los 45 días de iniciado el experimento * test de student. Denota diferencias significativas (p<0.05) EJEMPLO 6 Experimento de estimulación del crecimiento en larvas de tilapia mediante la aplicación del PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris Se realizó un experimento para el evaluar el efecto del PACAP de Claria gariepinus recombinante contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris de secuencia SEQ ID NO 14, sobre el crecimiento en larvas de tilapia. Se conformaron tres grupos experimentales de 50 larvas cada grupo, un grupo tratado con el PACAP, un grupo tratado con la hormona de crecimiento de tilapia y un grupo placebo. Las larvas pertenecientes a cada grupo fueron aclimatadas en canaletas independientes de 80L, a una temperatura de 28°C y con un fotoperíodo constante de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad y se alimentaron con una cantidad pienso de acuerdo a la fórmula: Cantidad de alimento = # de animales X peso promedio (g) X 40% /100. Los tratamientos se realizaron por inmersión en una hora y media en un volumen de 20 litros de agua, tres veces por semana durante 30 días, se aplicaron aproximadamente 100 µg del péptido / litro de agua. Se obtuvo como resultado que a las 5 semanas de iniciado el experimento (35 días) el grupo tratado con el PACAP mostró un aumento significativo del peso corporal promedio respecto al grupo placebo (p<0.01 ). El grupo tratado con la hormona de crecimiento de tilapia expresada en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris mostró también un incremento del peso corporal promedio estadísticamente significativo respecto al grupo placebo (p<0.05) (Cuadro 5).

CUADRO 5 Peso de las larvas de tilapia en gramos Los datos se presentan como el promedio del peso ± la desviación estándar.

EJEMPLO 7 Experimento de estimulación del crecimiento y de la calidad de las larvas de camarones de la especie Litopenaeus schmitti tratados con el PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris Se utilizaron larvas de camarones de la especie L. schmitti. Se utilizaron dos grupos experimentales, un grupo tratado con el péptido recombinante contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris de secuencia SEQ ID NO. 14 y un grupo tratado con placebo (P. pastoris sin transformar). Las larvas se cultivaron en tanques de fibra de vidrio con capacidad de 100 L. La alimentación se basó en diatomeas (Chaetoceros gracilis), el alga flagelada (Tetraselmis suecica), y nauplius de Artemia frescos (Aquatic Eco-Systems Inc.) Los factores abióticos de crecimiento fueron los siguientes: Iluminación (24:00 L/O) Aireación constante. Salinidad de 34 ppm. Oxígeno disuelto 5.2 ± 0 5 en el ciclo larval. Recambio después de PZm 80% Se les aplicaron a los dos grupos experimentales cuatro baños de inmersión, uno cada tres días de una hora de duración Se obtuvo como resultado que el grupo tratado con el péptido mostró un incremento en el peso corporal promedio estadísticamente significativo respecto al grupo placebo (p<0.001 ) (Cuadro 6) CUADRO 6 Peso de las larvas de camarón en miligramos Los datos se presentan como el promedio del peso ± la desviación estándar Se observó mayor homogeneidad en la longitud de los camarones lo cual es de vital importancia en la camaronicultura y mejor calidad de las larvas (mayor número de pares de ramificaciones branquiales y de modificaciones rostrales). La diferencia en sobrevida en el estadio de PL9 fue de un 40% mayor en el caso del grupo tratado con PACAP.

EJEMPLO 8 Estimulación del crecimiento en juveniles de Claria gariepinus mediante la formulación del PACAP recombinante en la dieta de los peces El PACAP recombinante contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris de secuencia SEQ ID NO. 14, fue concentrado y formulado en la dieta alimenticia de los peces a una concentración de aproximadamente 5 mg/Kg de pienso. El control negativo fue la dieta formulada con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris sin transformar. Se utilizaron 2 grupos experimentales de 100 larvas, con un peso promedio de 0.1 g. Un grupo se alimentó con pienso formulado con el sobrenadante de P. pastoris conteniendo al PACAP y el otro grupo con pienso formulado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris sin transformar. El experimento transcurrió durante 30 días. El PACAP recombinante incluido en la dieta produjo un incremento en el peso corporal de los peces de aproximadamente un 30% respecto al grupo placebo, lo cual denota diferencias significativas entre los grupos (p<0.01 ).

Claims (3)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Método para aumentar la productividad de un cultivo de peces o crustáceos que comprende la alimentación o la administración del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, a los peces o crustáceos en cultivo en una cantidad efectiva para estimular su crecimiento o incrementar su resistencia contra enfermedades o ambas.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se emplea para aumentar la liberación de prolactina y mejorar la osmorregulación en peces. 3 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se emplea para regular el apetito en organismos acuáticos. 4 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se emplea para favorecer el desarrollo de la coloración en peces ornamentales y en crustáceos. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se obtiene por síntesis química. 6 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se obtiene por vía recombinante. 7 - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se emplea sin purificar, contenido en el sobrenadante de ruptura de E.coli. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se emplea sin purificar, contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se emplea purificado a partir de sistemas de producción recombinantes. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se le aplica a los peces o crustáceos por inyecciones periódicas con intervalos de 3 días en una concentración de 0.1 µg/g de peso del animal. 11 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se le suministra a los peces o crustáceos por baños de inmersión con intervalos de 1 a 4 días en agua dulce o agua de mar teniendo una concentración de péptido de entre 100 a 200 µg/por litro de agua. 12 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropeptido PACAP se le suministra a los peces o crustáceos en el alimento formulado en una concentración de 5mg/Kg de pienso. 13 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1-12, caracterizado además porque dicho neuropeptido PACAP se le suministra a la tilapia Orechromis sp. 14 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1-12, caracterizado además porque dicho neuropeptido PACAP se le suministra al pez gato Claria sp. 15 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1-12, caracterizado además porque dicho neuropeptido PACAP se le suministra al salmón Salmón sp. 16.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 -12, caracterizado además porque dicho neuropeptido PACAP se le suministra a los camarones Penaus sp. 17 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho neuropéptido PACAP se le suministra a los peces o crustáceos para prevenir o tratar infección por agentes patógenos. 18.- Uso del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, en la preparación de una composición para tratar peces o crustáceos en cultivo para estimular su crecimiento. 19.- Uso del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, en la preparación de una composición para tratar peces o crustáceos en cultivo para incrementar su resistencia contra enfermedades. 20.- Uso del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, en la preparación de una composición para tratamiento preventivo o terapéutico de una infección por agentes patógenos en peces o crustáceos en cultivo. 21.- Uso del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, para estimular el crecimiento de peces y crustáceos en cultivo para mejorar la productividad. 22.- Uso del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, para incrementar la resistencia a enfermedades de peces y crustáceos en cultivo para mejorar la productividad. 2

3.- Uso del neuropéptido PACAP, según las secuencias SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14, para la prevención o tratamiento de infecciones por agentes patógenos de peces y crustáceos en cultivo para mejorar la productividad.