IDENTIFICACION DEL ESTAFILOCOCO AUREUS RESISTENTE A METICILINA ASOCIADO CON LA COMUNIDAD USA 300 ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (CA-MRSA, por sus siglas en inglés) adquirido en la comunidad son ahora una causa de preocupación clínica principal. Aunque primero se identificó en los Estados Unidos entre los usuarios de fármacos intravenosos (Saravolatz y otros, Ann Intern Med, 1982; 97:325-329), seguido por otras poblaciones de alto riesgo, tales como reclusos de prisión y atletas, los hospitales en todo el país han observado una tendencia en incremento en el número de infecciones CA-MRSA vistos en la población joven, saludable sin factores de riesgo pre-dispuestos (Centers for Disease Control and Prevention, Morb Mortal Wkly Rep, 2003; 52:793-795; Centers for Disease Control and Prevention, Morb Mortal Wkly Rep, 2003; 52:992-996; Francis y otros, Clin Infect Dis, 2005; 40:100-107; Kazakova y otros, N Engl J Med, 2005; 352:468-475; Lindenmayer y otros, Arch Intern Med, 1998; 158:895-899; Naimi y otros, JAMA 2003; 290:2976-2984; y Saravolatz y otros, Ann Intern Med 1982; 97:325-329). Un estudio de un grupo potencial publicado por Naimi y otros, encontró que la edad media de los pacientes con infecciones CA-MRSA es significativamente más joven que aquellos con MRSA adquirida nosocomial, en treinta años contra setenta años, Ref. 192130
respectivamente (Naimi y otros, JAMA 2003; 290:2976-2984). También numerosos estudios han indicado que las infecciones CA-MRSA frecuentemente se ven entre infantes y niños, otra vez sugiriendo que la probabilidad de contraer esas infecciones ya no está limitada a las poblaciones de alto riesgo tradicionales (Buckingham y otros, Pediatr Infect Dis J 2004; 23:619-624; Centers for Disease Control and Prevention, Morb Mortal Wkly Rep 1999; 48 : 707-710; Fridkin y otros, N Engl J Med 2005; 352:1436-1444; Herold y otros, JAMA 1998; 279:593-598; Mishaan y otros, Pediatr Infect Dis J 2005; 24 :201-206) . Las cepas CA-MRSA comúnmente hospedan el elemento SCCmec de tipo IV y son susceptibles a múltiples antibióticos no de ß-lactamas. Esto es en contraste a las cepas asociadas con el cuidado de la salud tales como los aislados USA100, que llevan el elemento SCCmec de tipo II y son residentes en a amplio intervalo de antibióticos debido a la presencia de múltiples elementos genéticos móviles y no móviles (McDougal y otros, J Clin Microbiol, 2003; 41:5113-5120). Sin embargo, las cepas adquiridas en la comunidad típicamente llevan los genes Leucocidín Panton-Valentine (PVL, por sus siglas en inglés) , lukS y lukF, que producen citotoxinas que causan la destrucción de leucocito y la necrosis tisular (Genestier y otros, J Clin Invest, 2005; 115:3117-3127). Las cepas que producen PVL han estado asociadas con formaciones de abscesos
en la piel, furunculosis, y casos severos de neumonía necrosante (Lina y otros, Clin Infect Dis, 1999; 29:1128- 1132). La presencia de genes PVL también puede estar asociada con una severidad de enfermedad incrementada Chambers, N Engl J Med, 2005; 352:1485-1487; y Etienne, Clin Infect Dis, 2005; 41:591-593). A pesar de su designación adquirida en la comunidad, las cepas CA- RSA frecuentemente se aislan y se transmiten entre pacientes dentro de las instalaciones del hospital (Saiman y otros, Clin Infect Dis, 2003; 37:1313-1319) . CA-MRSA también ha estado asociado con una morbidez incrementada y mortalidad en el paciente, tratamientos costosos, y procedimientos de radicación extensivos, que enfatizan el valor de la vigilancia activa para la presencia de estas cepas (Rubín y otros, Emerg. Infect Dis, 1999; 5:9-17) . Los métodos de clasificación molecular utilizados para caracterizar las cepas MRSA incluyen la electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE, por sus siglas en inglés), clasificación de secuencia multi-sitio (MLST, por sus siglas en inglés) , y amplificación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de genes objetivo (Shopsin and Rreiswirth, Emerg. Infect Dis, 2001; 7:323-326). Por PFGE, los aislados CA-MRSA en los Estados Unidos han sido, hasta ahora, clasificados como tipos de campo pulsados (PFT, por sus siglas en inglés) USA300 (ST8), USA400 (STl)
(McDougal y otros, J Clin Microbiol, 2003; 41:5113-5120), USA1000 (ST59), y USA1100 (ST30) por los Centros para Control y Prevención de Enfermedades (McDougal y otros 2005 Resumen 105B. Annu. Meeting Amer. Soc. Microbiol., resumen C-043). El S. aureus MW2, responsable de infecciones fatales en cuatro niños de Dakota del Norte y Minnesota entre 1997-1999, se considera la cepa MRSA adquirida por la comunidad prototipo perteneciente a USA400 PFT (Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Morb Mortal Wkly Rep, 1999; 48:707-710). Sin embargo, en los años recientes se ha visto una elevación alarmante en el número de aislados USA 300 identificados en una variedad de poblaciones comunitarias, incluyendo, niños, participantes deportivos, prisioneros, reclutas militares, y hombres que tienen sexo con hombres (Begier y otros, Clin Infect Dis 2004; 39:1446-1453; Buckingham y otros, Pediatr Infect Dis J, 2004; 23:619- 6243; González y otros, Pediatrics 2005; 115:642-648; Hidron y otros, Clin Infect Dis 2005; 41 : 159-166; Miller y otros, N Engl J Med, 2005; 352:1445-1453; Nguyen y otros, Emerg Infect Dis, 2005; 11:526-532; y Pan y otros, J Infect Dis 2005; 192:811-818). La detección de las cepas CA-MRSA USA 300 ha requerido tradicionalmente el uso de PFGE, MLST, y PCR (es decir, PVL) que, tomadas juntas, llevan mucho tiempo y requieren equipo que no puede estar fácilmente disponible para el laboratorio clínico de rutina. Además, el elemento
móvil catabólico de arginina recientemente descrito (ACME, por sus siglas en inglés) (Diep y otros, Lancet 2006; 367:731-739) parece que solamente está presente en cepas USA300 que llevan SCCmec del tipo IVa (McDougal y otros, Resumen 46s. 2 Intersci. Conf . Antimicrob. Agents Chemother., resumen C2-603, 2006). De esta forma, existe la necesidad de un método molecular más unificado para la rápida identificación de los aislados CA-MRSA USA300. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye un método para identificar la cepa USA300 de S. aureus resistente a meticilina, el método incluye el análisis de una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia del gen para la toxina de Leucocidín Panton-Valentine (PVL) ; y analizar el ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado; en donde la presencia de un gen para la toxina PVL y la presencia de una región de repetición AT tienen por lo menos 6 repeticiones AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado que indica que la bacteria S. aureus resistente a meticilina es la cepa USA300 del S. aureus resistente a meticilina. En algunas modalidades del método, el análisis del ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058
hipotético conservado incluye llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado si está presente; y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados que contiene una región de repetición AT. En algunas modalidades, los iniciadores de oligonucleótido solamente amplificarán la región de repetición AT cuando están presentes 6 o más repeticiones AT. En algunas modalidades, los iniciadores de oligonucleótido es un iniciador progresivo que tiene una o más bases de ácido nucleico bloqueadas en el mismo. En algunas modalidades, el iniciador de oligonucleótido progresivo tienen la secuencia TGCTCGACGTCAATATATATATAT (SEC ID NO: 7), en donde uno o más de los ácidos nucleicos es una base de ácido nucleico bloqueada. En algunas modalidades, el iniciador de oligonucleótido progresivo tiene la secuencia GLCTLCGALCGTCAALTALT ATATATAT (SEC ID NO: 5), en donde NL representa una base de ácido nucleico bloqueada. En algunas modalidades, los iniciadores de oligonucleótido incluyen un iniciador inverso que tiene la secuencia 5'-ACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO : 8 ) o 5'- CAATTAACGATGATATTCCCGATAG-S ' (SEC ID NO : 4 ) . En algunas modalidades, el método además incluye secuenciar los fragmentos de ADN amplificados. En algunas modalidades del método, el análisis de
una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina PVL incluye llevar a cabo la reacción en cadena de polimerasa con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar un gen para la toxina PVL; y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados de un gen para la toxina PVL. En algunas modalidades, los iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar un gen para la toxina PVL incluyen 5'-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3 ' (SEC ID NO : 1 ) y 5'-GCATCAACTGTATTGGATAGCAAAAGC-3 ' ( SEQ ID NO : 2 ) . En algunas modalidades, el método además incluye secuenciar los fragmentos de ADN amplificados. En algunas modalidades del método, una bacteria S. aureus resistente a meticilina diferente de la cepa USA300 tiene al menos de 6 repeticiones AT y/o ningún gen para la toxina PVL. En algunas modalidades del método, el análisis de una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina de Leucocidín Panton-Valentine (PVL) y analizar el ADN S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT ocurre en un experimento de un solo recipiente. En algunas modalidades del método, el análisis del ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058
hipotético conservado incluye llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado si está presente; y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados que contienen una región de repetición AT; en donde el análisis de una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina PVL incluye llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar un gen para la toxina PVL; y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados de un gen para la toxina PVL. En algunas modalidades, el método además incluye analizar el ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia del gen SACOL0058 hipotético conservado, en donde el análisis del ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia del gen SACOL0058 hipotético conservado incluye llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar por lo menos una porción del gen SACOL0058 hipotético conservado y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados que contienen por lo menos una porción del gen SACOL0058 hipotético conservado. En algunas modalidades, las reacciones de cadena de polimerasa ocurren en un experimento de un solo recipiente.
La presente invención también incluye un fragmento de ADN de un genoma de la bacteria S. aureus resistente a meticilina, en donde el fragmento incluye una región de repetición AT que incluye o más repeticiones AT, y en donde el fragmento se mapea a una ubicación de aproximadamente 1.4 kb más allá de la intersección SCCmec-cromosómica . En algunas modalidades, existen 6-8 repeticiones AT en la región de repetición AT. La presente invención también incluye un fragmento de ADN aislado de un gen de la bacteria S. aureus resistente a meticilina, en donde el fragmento incluye una región de repetición AT que tiene 6 o más repeticiones AT, y en donde el fragmento incluye la región que corresponde a los nucleótidos 69954 a 70855 de la cepa COL de S. aureus (Número de Acceso de Genebank CP000046) . En algunas modalidades, existen 6-8 repeticiones AT en la región de repetición AT. La presente invención también incluye un iniciador de oligonucleótido aislado que tiene la secuencia TGLCTLCGALCGTCAALTALTATATATAT (SEC ID NO : 5 ) en donde NL representa una base de ácido nucleico bloqueada. La presente invención también incluye un iniciador de oligonucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste de 5 ' -ACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO : 3 ) y 5'-CAATTAACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO: 4). La presente invención también incluye un kit con un
par de iniciadores de oligonucleótido capaz de amplificar una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado del ADN de S. aureus y un iniciador de oligonucleótido capaz de amplificar un gen para la toxina PVL. En algunas modalidades, el kit también incluye un par de iniciadores capaces de amplificar por lo menos una porción del gen SACOL0058 hipotético conservado. A menos que se especifique otra cosa, "un", "una", "el, la", y "al menos uno" se utilizan de manera intercambiable y significan uno o más de uno. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama que muestra la ubicación de múltiples iniciadores PCR con referencia a la cepa COL de S. aureus (número de acceso CP000046) . La parte en negro representa el elemento de resistencia SCCmec. "DR" representa la región de repetición directa 3 ' que flanquea el elemento SCCmec. La parte gris representa la secuencia cromosómica de 3.3 kb 3' SCCmec, incluyendo SACOL0058 y la secuencia de repetición AT. La amplificación PCR que utiliza los iniciadores InaAT (nucleótidos 69490-69511) y ATreg-2 (nucleótidos 70831-70855) indica la presencia de >6 repeticiones AT. SACOL0058 se detectó utilizando ATreg-1 (nucleótidos 69954-69977) y Atreg-2. La amplificación de los genes PVL ocurre en una ubicación separada dentro del cromosoma. El cuadro negro inferior demuestra la hibridación
del iniciador InaAT (SEC ID NO: 5) con la secuencia de repetición AT como pudiera ocurrir en la cepa MRSA USA300 (SEC ID NO: 6) . Las Figuras 2A-2B muestran los ensayos PCR de las cepas MRSA USA300. La Figura 2A muestra la identificación del iniciador de ácido nucleico bloqueado de las cepas MRSA USA300. Carril 1, escalera de ADN de 1 kb como un estándar de tamaño molecular; carriles 2 y 3 las cepas USA300:ST8 CRG-1130 y CRG-1128, conteniendo 8 y 6 repeticiones AT, respectivamente; carril 4 las cepa CRG-930 (USA 50Ü:ST250) conteniendo 5 repeticiones AT. Carril 5, control negativo. La Figura 2B muestra ensayos PCR múltiples que diferencian las cepas USA300 de otras MRSA. Carril 1, escalera de ADN de 1 kb como un estándar en tamaño molecular; carriles 2 y 3, las cepas USA300:ST8 CRG-1130 y CRG-1128, conteniendo 8 y 6 repeticiones AT, respectivamente, así como SACOL0058 y PVL (la banda superior contiene el producto de amplificación del iniciador LNA) (1,365 bp) , la banda media contiene el producto de proteína SACOL0058 hipotético (933 bp) , y la banda inferior contiene el producto de gen PVL (433 bp) ; carril 4, la cepa CRG-1112 (mecA-negativa) conteniendo 5 repeticiones AT; carril 6, MW2 (CC1:ST1), SACOLO05"8 negativa, PVL; carril 7, control negativo. La Figura 3 presenta la secuencia de nucleótido
(SEC ID NO: 9) y la secuencia de proteína hipotética (SEC ID NO: 10) del gen SACOL0058 hipotético conservado. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos para identificar la cepa USA300 de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) . El Staphylococcus aureus, también referido en la presente como nS. aureus", "estaf" o estaf A" , es una bacteria Gram-positiva que causa una variedad de infecciones en seres humanos, en la escala de lesiones de la piel superficiales (tales como furúnculos, orzuelos, y furunculosis), a infecciones más serias (tales como neumonía, mastitis, flebitis, meningitis, e infecciones del tracto urinario) , infecciones profundamente arraigadas (tales como osteomielitis y endocarditis) . La meticilina es un antibiótico beta-lactama . Se ha utilizado previamente para tratar infecciones causadas por la bacteria Gram-positiva susceptible, incluyendo S. aureus, que por el contrario podría ser resistente a la mayor parte de las penicilinas, pero ya no se utiliza clínicamente. Su papel en la terapia ha sido grandemente reemplazado por otros antibióticos, tales como flucoxacilina y dicloxacilina . Sin embargo, el término estafilococo aureus resistente a meticilina (MRSA) continúa utilizándose para describir las cepas S. aureus resistentes a los antibióticos relacionados con la penicilina comúnmente utilizados.
La cepa USA300 de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) es una fuente principal del Staphylococcus aureus resistente a meticilina adquirido por la comunidad (CA-MRSA) . Las infecciones CA-MRSA se han convertido en la causa de la mayor preocupación clínica. Aunque primero se identificaron en los Estados Unidos entre los usuarios de fármacos intravenosos (Saravolatz y otros, Ann Intern Med, 1982; 97:325-329), seguidos por otras poblaciones de alto riesgo, los hospitales en todo en el país han observado una tendencia en incremento en el número de infecciones CA-MRSA vistas en poblaciones jóvenes, saludables sin los factores de riesgo pre-dispuestos (Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Morb Mortal Wkly Rep, 2003; 52:793-795;; Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Morb Mortal Wkly Rep, 2003; 52:992-996; Francis y otros, Clin Infect Dis, 2005; 40:100-107; Kazakova y otros, N Eng J Med, 2005; 352:468-475; Lindenmayer y otros, Ann Intern Med, 1998; 158:895-899; Naimi y otros, JAMA, 2003; 290:2976-2984; y Saravolatz y otros, Ann Intern Med, 1982; 97:325- 329). A pesar de la designación de adquirido en la comunidad, las cepas CA-MRSA también son adquiridas de otras fuentes . Por ejemplo, las cepas CA-MRSA frecuentemente se aislan de y se transmiten entre pacientes dentro de las instalaciones del hospital. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para identificación y diagnóstico de la cepa USA300
de MRSA, incluyendo CA-MRSA. Con la presente invención, se puede identificar S. aureus a través de métodos de microbiología estándar, tales como, por ejemplo, morfología de colonia y microscópica, pruebas de coagulasa, o aglutinación. La susceptibilidad antimicrobiana también puede determinarse a través de métodos microbiológicos estándares. Ver, por ejemplo, NCCLS, "Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; fourteenth informational supplement, " NCCLS documento M100-S 14, Wayne, PA: NCCLS, 2004. La cepa de S. aureus USA300 es una cepa resistente a meticilina primero aislada en el 2000. La secuencia del genoma completo de CA-MRSA USA300 es conocida (Diep y otros, Lancet 2006; 367:731-9). Esta hospeda un cromosoma circular y tres plásmidos . Es más virulenta que S. aureus (cepa COL) y altamente invasiva de órganos principales. También es más resistente a la aniquilación a través de leucocitos polimorfonucleares humanos y causa una mayor lisis celular en el hospedero. USA300 y COL están relacionadas a través de un descendiente vertical de un ancestro común. La resistencia a las beta-lactamas y ciprofloxacina está cromosómicamente codificada. Todos los genes únicos en USA300 se agrupan en cinco alotipos novedosos de elementos genéticos móviles que codifican las determinantes de virulencia y resistencia. Los dos primeros elementos genéticos son el elemento SCCmec IV y
ACME. El tercer elemento genético es una isla de patogenicidad estafilocócica novedosa, SaPI5, que codifica dos enterotoxinas cercanamente relacionadas a SEQ y SEK en COL. El cuarto elemento genético es el fosfato phiSA2usa, que lleva los genes que codifican el leucocidín Panton-Valentine . El quinto elemento genético es el fosfato phiSa3usa, que codifica la estafilocinasa y una prote na inhibidora de quimiotaxis . Ver la red mundial en expasy. org/sprot/hamap/STAA3.html . La presente invención incluye métodos para identificar la cepa USA300 de MRSA a través del análisis de una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina leucocidín Panton-Valentine (PVL) y analizar el ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado, en donde la presencia de un gen para la toxina PVL y la presencia de una región de repetición AT tienen por lo menos 6 repeticiones AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado que indica que la bacteria S. aureus resistente a meticilina es la cepa USA300 de S. aureus resistente a meticilina. Solamente los aislados de USA300 contienen 6 o más repeticiones AT así como el gen para la toxina PVL. Mientras otros aislados MRSA, tales como USA500 (ST8) , pueden exhibir >6 repeticiones AT, esto no es en combinación con
PVL. Y, mientras otros aislados (por ejemplo, ST80) codifican PVL, esto es en combinación con por lo menos 6 repeticiones AT. De esta forma, la detección combinada de estos elementos proporciona la fácil y especifica identificación de RSA de USA300. Las cepas MRSA adquiridas en la comunidad típicamente llevan los genes de leucocidín Panton-Valentine (PVL) , lukF y lukF, que producen citotoxinas que causan la destrucción de los leucocitos y la necrosis tisular (Genestier y otros, J Clin Invest, 2005; 115:3117-3127). Las cepas que producen PVL han estado asociadas con la formación de abscesos en la piel, furunculosis, y casos severos de neumonía necrosante (Lina y otros, Clin Infect Dis, 1999; 29:1128-1132). La presencia de genes PVL también puede estar asociada con una severidad de enfermedad incrementada (Chambers, N Engl J Med, 2005; 352:1485-1487; y Etienne, Clin Infect Dis, 2005; 41:591- 593). A pesar de su designación adquirida en la comunidad, las cepas CA-MRSA frecuentemente se aislan de y se transmiten entre pacientes dentro de las instalaciones del hospital (Saiman y otros, Clin Infect Dis, 2003; 37:1313-1319). CA-MRSA también ha estado asociada con una morbidez y mortalidad incrementada en el paciente, un tratamiento costoso, y procedimientos de erradicación extensivos, que enfatizan el valor de la vigilancia activa para la presencia de estas cepas (Rubin y otros, Emerg Infect
Dis, 1999; 5:9-17) . Los métodos de la presente invención incluyen analizar una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina Leucocidín Panton-Valentine (PVL) . Cualquiera de una variedad de técnicas pueden utilizarse para analizar una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina leucocidín Panton-Valentine (PVL) . Por ejemplo, los ensayos de hibridación basados en ácido nucleico, tales como PVL EVIGENE™ (No. de catálogo Ktl04, AdvanDx, Woburn, A) , ensayos basados en reacción en cadena de polimerasa (PCR) , (ver, por ejemplo, Ejemplo 1, Jarraud y otros, Infect Immun 2002: 70:631-641; y Lina y otros, Clin Infect Dis, 1999; 29:1128-1132), o ensayos basados en secuenciación . En una modalidad preferida, el análisis de la bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina PVL se realiza llevando a cabo PCR con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar un gen para la toxina PVL y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados de un gen para la toxina PVL. En algunas modalidades, el (los) producto (s) de ADN amplificado resultante se puede secuenciar. En una modalidad, los iniciadores de oligonucleótido utilizados pueden ser luk-PV-1, 51 -ATCATTAGGTAAAATGT CTGGAC ATGATCCA-3 '
(SEC ID N0:1) y luk-PV-2, 5 ' -GCATCAACTGT ÁTTGGATAGCAAAAGC-3 ' (SEC ID N0:2) . Otras sondas e iniciadores PVL se pueden utilizar. Por ejemplo, las sondas PVL e iniciadores se pueden designar utilizando el Iniciador Express (ver, 2.0; Applied Biosystems, Mississauga, Ontario, Canadá) y Oligo 6 (ver. 6.6.7.0; Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO) y las secuencias de gen lukF-PV y lukS-PV públicamente disponibles de S. aureus a (No. de Acceso GenBank AB006796, X72700, AB009866, y AB045978) como se describe por Ryan y McDonald., J Clin Microbiol, 2005; 43:6147-6149. Cualquiera de las sondas o iniciadores PVL descritas por Ryan y MacDonald se pueden utilizar en la presente invención. Con la presente invención, el ADN genómico para el análisis PCR se pueden preparar a través de cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, la extracción a través de un procedimiento estándar tal como el descrito en Ausubel, F. M. , R. Brent, R. E. Kingston, B. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, y K. Struhl . 1987. Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, N. Y., se pueden utilizar. Los métodos de la presente invención incluyen analizar una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado. Una región de repetición
1
AT que tiene por lo menos 6 (también referida en la presente como "menor que o igual a 5", "6 o más", y M>6") repeticiones AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado que se encuentran en la cepa USA300 de S. aureus resistente a meticilina. La secuencia del genoma completa de la cepa COL de S. aureus está disponible (Número de Acceso Genbank CP000046). Dentro de esta secuencia de genoma, localizada a aproximadamente 1.4 kb después de la intersección cromosómica JI SCCmec, está el gen SACOL0058 hipotético conservado. El gen SACOL0058 hipotético conservado está en una región cromosómica de flanqueo del elemento SCCmec. La secuencia de nucleótido completa del gen SACOL0058 hipotético conservado y su secuencia de aminoácido hipotéticos se muestran en la Figura 3 y se pueden encontrar en el No. de Acceso GenBank NC 002951 y en la red mundial en ncbi . nlm.nih.gov/entrez/viewer . fcgi?db=nucleotide&dopt=graph& _from=61796&_to=77239&val=NC_002951. El gen SACOL0058 hipotético conservado en la cepa COL de S. aureus incluye dentro del mismo sus nucleótidos 69954 a 70855 del Número de Acceso Genbank CP000046. La presente invención demuestra que solamente los aislados de la cepa USA300 contienen una secuencia de >6 repeticiones AT en combinación con la presencia del gen de la toxina PVL. Cualquiera de una variedad de técnicas se puede
utilizar para analizar una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado y una determinación del número de repeticiones AT presente. Por ejemplo, los ensayos de hibridación basados en ácido nucleico, ensayos basados en PCR y ensayos basados en secuenciación se pueden utilizar. En una modalidad preferida, el análisis de la bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado y una determinación del número de repeticiones AT presentes se llevan a cabo a través de la realización de PCR con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar la región de repetición AT y analizar la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificados de la región de repetición AT. En algunas modalidades, el (los) producto (s) de ADN amplificados resultantes se pueden secuenciar . Se pueden seleccionar una variedad de iniciadores que flanquean la región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado, con base en la secuencia genómica de esta región. En una modalidad preferida, los iniciadores de oligonucleótido se pueden seleccionar de tal forma que solamente amplificarán la región de repetición AT cuando están presentes 6 o más repeticiones AT. Dichos iniciadores
pueden tener uno o más oligonucleotidos de ácido nucleico bloqueados (LNA) incorporados en el mismo. Una o más bases LNA pueden incorporarse en el iniciador progresivo. El iniciador de oligonucleótido progresivo puede incluir la secuencia TGCTCGACGTCAATATATATATAT (SEC ID NO : 7 ) o variaciones de la misma. Las bases LNA se pueden colocar en uno o más de los nucleótidos de esta secuencia. Por ejemplo, en una modalidad, el iniciador de oligonucleótido progresivo puede tener la secuencia TGLCTLCGALCGTCAALTALTATATATAT SEC ID NO: 5), en donde NL representa una base de ácido nucleico bloqueada. El iniciador inverso puede incluir la secuencia 5 ' -ACGATGATATTCC CGATAG-3 ' (SEC ID NO : 8 ) o 5'- CAATTAACGATGATATTCCCG AT AG-31 (SEC ID NO : 4 ) . El ácido nucleico bloqueado (LNA) es un tipo novedoso de un análogo de ácido nucleico que contiene un puente de metileno 2' -O, 4'-C. Este puente restringe la flexibilidad del anillo de ribofuranosa y bloquea la estructura en la formación bic clica rígida, confiriendo un rendimiento de hibridación mejorado y una bioestabilidad excepcional. Los dúplex incluyendo oligonucleotidos LNA son considerablemente más térmicamente estables que los dúplex similares constituidos de oligonucleotidos de ADN o ARN. Los oligonucleotidos LNA forman un iniciador termodinámicamente estable con una especificidad objetivo mejorada bajo condiciones de endurecimiento severas (ver, por ejemplo,
Vester and Wengel, Biochemistry 2004; 43:13233-13241; McTigue y otros, Biochemistry, 2004; 43:5388-5404; Jensen y otros, J. Chem. Soc, Perkin Trans, 2001; 2:1224-1232; Christensen y otros, Biochem. J. , 2001; 354:481-484 (2001); y la red mundial en proligo.com). Los LNA para uso en la síntesis de oligonucleótidos están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Proligo LLC (Boulder, CO) . Las plataformas del sintetizador de ADN estándar se pueden utilizar para la síntesis de oligonucleótidos incluyendo LNA y no son requeridos los cambios en los reactivos comúnmente utilizados para la síntesis de ADN y los LNA se pueden aplicar a la mayor parte de las plataformas que utilizan oligonucleótidos sintéticos . En algunas modalidades, la presente invención además incluye analizar el ADN de S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de por lo menos una porción del gen SACOL0058 hipotético conservado, la secuencia que se muestra en la Figura 3. Cualquiera de una variedad de técnicas se puede utilizar para analizar una bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia del gen SACOL0058 hipotético conservado. Por ejemplo, los ensayos de hibridación basados en ácido nucleico, ensayos basados en PCR, mapeo de restricción, o ensayos basados en secuenciacion se pueden utilizar. En una modalidad preferida, el análisis de una bacteria S. aureus resistente a meticilina
para la presencia o ausencia de por lo menos una porción del gen SACOL0058 hipotético conservado se llevó a cabo realizando PCR con iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar por lo menos una porción del gen SACOL0058 hipotético conservado. En algunas modalidades, el (los) producto (s) de ADN amplificados resultantes se pueden secuenciar. Una variedad de iniciadores se pueden utilizar, incluyen, pero no limitándose a, ATreg-1, 5'-GAAAATGGAATAGAGTTGGCAGAC-3 ' (SEC ID NO : 3 ) y ATreg-2, 5'-CAATTAACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO: 4). La presente invención incluye iniciadores de oligonucleótido aislados para utilizarse en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye, pero no se limita a, cualquiera de los iniciadores de oligonucleótido descritos en presente, incluyendo los iniciadores de oligonucleótido que tienen la secuencia 5 ' -ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3 ' (SEC ID NO:l); 5'-GCATCAACTGTATTGGATAGCAAAAGC-3 ' ( SEC ID NO : 2 ) ; 5 ' - ACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO : 3 ) ; 5'-CAATTAACGATGATATTCCCGATAG-3' (SEC ID NO: 4); 5'- TGCTCGACGTCAATATATATATAT (SEC ID NO : 7 ) y 5'- ACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO : 8 ) . La presente invención incluye un iniciador de oligonucleótido con la secuencia 5 ' -TGCTCGACGTCAATATATATATAT (SEC ID NO: 7), en donde una o más de las bases son una base
de ácido nucleico bloqueada. En una modalidad preferida, el iniciador de oligonucleótido es TGLCTLCGALCGTCAALTALTATATATAT (SEC ID NO: 5), en donde NL representa una base de ácido nucleico bloqueada. La presente invención también incluye kits que incluyen un par de iniciadores de oligonucleótido capaces de amplificar una región de repetición AT del gen SACOL0058 hipotético conservado del ADN de S. aureus y un iniciador de oligonucleótido capaz de amplificar un gen para la toxina PVL. En algunas modalidades, el kit también puede incluir un par de iniciadores capaces de amplificar por lo menos una porción de gen SACOL0058 hipotético conservado. Con la presente invención, el análisis de la bacteria S. aureus resistente a meticilina para la presencia o ausencia de un gen para la toxina de Leucocidín Panton-Valentine (PVL) , la presencia o ausencia de una región de repetición AT en el gen SACOL0058 hipotético conservado; y la presencia o ausencia del gen SACOL0058 hipotético conservado se puede llevar a cabo en cualquiera de una variedad de formatos. Por ejemplo, uno o más de estos análisis se pueden llevar a cabo de manera separada, se pueden llevar a cabo como una reacción múltiple, en un solo recipiente de reacción, o se pueden realizar como un microensayo. En algunas modalidades, la bacteria S. aureus resistente a meticilina se puede analizar para la presencia o ausencia de
marcadores adicionales . Las muestras que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención se pueden obtener de cualquier fuente incluyendo, pero no limitándose a, sangre, productos sanguíneos, tejido, ascitos, medios de cultivo, fluidos corporales, sangre, pus, especímenes urogenitales, heces, productos comestibles, bebidas, productos cosméticos, productos farmacéuticos, productos para el cuidado de la salud, superficies tales como pisos y mesas, y partículas aerotransportadas tales como polen y polvo. Una muestra se puede obtener de aislados clínicos, por ejemplo, una aislado obtenido de la piel o infecciones de tejido suave. Una muestra se puede obtener de un hisopo de un sitio del cuerpo, por ejemplo, de la nariz, incluyendo, pero no se limitándose a, orificios nasales anteriores, la garganta, el perineo, la axila o la piel. Una muestra puede ser una que se sospecha que tiene microorganismos, en particular S. aureus . La muestra puede haber sido probada para la presencia de microorganismos y haber sido probada positiva para microorganismos. La presente invención incluye un fragmento de ADN aislado de un gen de la bacteria de S. aureus USA300 resistente a meticilina, en donde el fragmento incluye una repetición AT del gen SACOL0058 hipotético conservado que tiene 6 o más repeticiones AT. Dicho fragmento de ADN aislado
puede tener 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones AT. Dicho fragmento de ADN aislado puede tener de 6 a 8 repeticiones AT. Como se utiliza en la presente, el término "aislado" significa que un polinucleótido es ya sea removido de su entorno natural o sintéticamente derivado, por ejemplo a través de técnicas recombinantes , o química o enzimáticamente sintetizada. Un polinucleótido aislado denota un polinucleótido que ha sido removido de su ambiente genético natural y de esta forma libre de otras secuencias de codificación foráneas o indeseadas, y está en una forma adecuada para utilizarse dentro de los sistemas de producción de proteínas genéticamente modificadas. Los polinucleótidos aislados de la presente invención están libres de otras secuencias de codificación con las cuales están ordinariamente asociados, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de existencia natural tales como promotores o terminadores . Preferiblemente, el polinucleótido se purifica, es decir, esencialmente libre de cualqui-er otro polinucleótidos o polipéptidos y productos celulares asociados u otras incoherencias. La presente invención se ilustra a través de los siguientes ejemplos. Se entiende que los ejemplos particulares, materiales, cantidades y procedimientos se interpretarán ampliamente de acuerdo con el alcance y espíritu de la invención como se establece en la presente.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Ensayo PCR múltiple rápido para la identificación de los aislados de Staphylococcus aureus resistente a meticilina adquiridos en la comunidad (CA-MRSA) . Los informes recientes han observado un incremento discernible en el número de infecciones con Staphylococcus aureus resistente a meticilina adquirido en la comunidad (CA-MRSA) en pacientes sin factores de riesgo tradicionales . En los Estados Unidos, la cepa CA-MRSA más prominente codifica los genes de citotoxina de leucocid n Panton-Valentine (PVL) , que pertenecen a USA300 de tipo electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) , el tipo 8 de la secuencia multi-sitio (ST8), y lleva el cromosoma del cásete estafilocócico (SCC) mee de tipo IV. Actualmente, la caracterización molecular de MRSA, tal como USA300 puede ser consumidora de tiempo y por lo general está más allá de la capacidad técnica de muchos laboratorios clínicos, haciendo difícil la identificación de rutina. Con el ejemplo presente, se analizaron las regiones cromosómicas que flanquean el elemento SCCmec en 44 aislados MRSA USA300. Una secuencia "de repetición AT" representativa se identificó dentro del gen SACOL0058 hipotético conservado localizado a 1.4 kilobases (kb) en corriente descendente del extremo 3' de la intersección cromosómica Jl SCCmec. Solamente los aislados USA300 contuvieron una secuencia de >6
repeticiones AT en combinación con PVL. Las cepas USA500 o Ibéricas relacionadas tuvieron >6 repeticiones AT pero fueron PVL negativas. Utilizando un iniciador de ácido nucleico bloqueado (LNA) específico para >6 repeticiones AT en combinación con iniciadores para detectar PVL, se desarrolló un ensayo PCR múltiple específico para la identificación de las cepas USA300. Los resultados múltiples fueron 100% concordantes con la secuenciación de ADN, indicando la utilidad que el método ha prometido como medio para identificar rápidamente estos aislados problema. MATERIALES Y METODOS Cepas bacterianas. Un total de 106 cepas S. aureus (105 MRSA, 1 MSSA) se examinaron en este estudio (Tabla 1) . Las cepas se seleccionaron de acuerdo con el tipo MLST y PFGE, con 44 perteneciendo a USA300. De éstos, 30 aislados pertenecieron al complejo clónico USA300-0114 8 (CC8:ST8) (Enright y otros, Proc.Natl Acad. Sci. U.S. A 2002; 99:7687-7692); todos fueron aislados independientes conocidos como estando epidemiológicamente no relacionados. Se incluyeron otros aislados en las bases de su relatividad genética con cepas USA300 según determinado por el análisis MLST BURST (disponible en la red mundial en at//mlst .net) . Electroforesis de gel de campo pulsado. Todas las cepas se analizaron a través de PFGE. El ADN bacteriano se preparó de acuerdo con el protocolo rápido de Goering
(Goering, 1993. Pulsed Field Gel Electrophoresis , p. 185-196. In D . H. Persing, T. F. Smith, F. C. Tenover, y T. J. White (eds.), Molecular Microbiology : Diagnostic Principies and Practice. ASM Press, Washington, DC) . Los patrones de campo pulsado se analizaron utilizando el software BioNumerics (v. 4.6, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) de acuerdo con el criterio publicado (McDougal y otros, " Pulsed-field gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing a national datábase," J. Clin Microbiol . 2003; 41:5113-5120). PCR. El ADN cromosómico se aisló para PCR utilizando el método descrito por Enright, en el sitio web MLST (disponible a la red mundial en at/ /saureus .mlst .net/misc/info . asp; ver también Enright y otros, J Clin Microbiol, 2003; 38:1008-1015). La detección de los genes PVL se llevó a cabo utilizando los iniciadores luk-PV-1, 5'- ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3 ' (SEC ID NO: 1) y luk-PV-2 , 5 ' -GCATCAACTGTATTGGATAGCAAAAGC-3 ' (SEC ID NO : 2 ) , generando un producto de par base 433 (bp) como se describe por Lina y otros (Lina y otros, Clin Infect Dis, 19199; 29:1128-1132). Las secuencias de iniciador utilizadas para detector el gen SACOL0058 hipotético conservado (cepa COL de S. aureus, número de acceso Genbank CP00OO46) fueron ATreg-1, 51 -GAAAATGGAATAGAGTTGGCAGAC-3 ' (SEC ID NO : 3 ) y ATreg-2, 5'-
CAATTAACGATGATATTCCCGATAG-3 ' (SEC ID NO:4A), resultando un producto de amplificación de 902 bp. Las mezclas de reacción (100 µ? de volumen total) contuvieron 1.5 mM de MgCl2, mezcla de 200 uM de d TP, iniciadores a una concentración final de 0.5 mM, 2.5 U de polimerasa de ADN (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) , y 1 µ? (aproximadamente 1 µg) de ADN de plantilla. La amplificación se llevó a cabo durante 34 ciclos con desnaturalización a 94 aC durante 30 segundos, endurecimiento a 66SC durante 30 segundos, extensión a 72 aC durante 1 minutos 30 segundos, y extensión final a 72 aC durante 5 minutos . El iniciador designado para discriminar el número de repeticiones AT presente dentro de SACOL0058 fue lnaAT-5'-TGLCTLGCALCGTCAALTALTATATATAT-3 ' (SEC ID NO : 5 ) (nucleótidos 69490-69511, designados con un AT adicional en el extremo 3' del iniciador) . Los oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueados (LNA; Sigma-Proligo, Boulder, CO.) dentro del iniciador se indicaron por (L) (Vester y Wengel , Biochemistry 2004; 43:13233-13241). Este iniciador se acopló con el iniciador ATreg-2 con condiciones PCR como se describió anteriormente para la detección de SACOL0058, pero con una temperatura de endurecimiento de 67 SC durante 30 segundos y 5 U de polimerasa Taq produciendo un producto de 1,366 bp en tamaño . La PCR múltiple, para detectar simultáneamente PVL,
SACOL0058, y el número de repeticiones AT, se llevó a cabo para SACOL0058, pero con iniciadores a las siguientes concentraciones: luk-PV-l, luk-PV-2, y ATreg-1 a 0.5 uM, ATreg-2 a 0.75 uM, InaAT a 0.5 uM, y 5 U de polimerasa de ADN Taq por reacción. Las reacciones de amplificación se visualizaron a través de electroforesis de gel de agarosa (1.5% SeaKem LE [FMC BioProducts, Rockland, Maine] ) en regulador de H 1 X Tris-borato-EDTA (TBE) . Los productos PCTG se secuenciaron en las instalaciones del Centro de Biología Molecular de la Universidad de Creighton utilizando un analizador Avant Genetic ABI Prism® 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . RESULTADOS Identificación de la secuencia de repetición AT USA300 representativa. La región cromosómica SCCmec en aislados MRSA se conoce como siendo recombinogénica, dando como resultado una variedad de tipos SCCmec (Hanssen y Ericson Sollid, FEMS Immunol Med Microbiol, 2006; 46:8-20). Este ejemplo se enfoca en las secuencias específicas USA300 en regiones genómicas directamente flanqueadas SCCmec, razonando que estas áreas también podrían someterse a grados más altos de recombinación. Utilizando una variedad de iniciadores, el análisis
de aproximadamente 3 kb de secuencia genómica en corriente ascendente del lado orfx de SCCmec reveló 100% de homología a través de las 30 cepas USA300-0114 (CC8:ST8) estudiadas. Además, la secuencia fue similar a siete genomas de Staphylococcus aureus no de USA300 (MW2, COL, Mu50, N315, NCTC8325, MRSA252, y MSSA476) (ver red mundial en ncbi.nlm.gov). Sin embargo el análisis de 3.3 Kb se secuencia genómica se extendió más allá de la intersección cromosómica Jl-SCCmec (Ito y otros, Drug Resist. Updat, 2003; 6:41-52) y reveló una región conteniendo ya sea 6 u 8 repeticiones de un par base de adenina-timina en todos los aislados USA300 examinados . La comparación de la secuencia con la cepa COL de S. aureus (CC8:ST250) localizó la región de repetición AT de aproximadamente 1.4 kb en corriente descendente de la intersección cromosómica Jl-SCCmec, dentro del gen SACOL0058 hipotético conservado. Sin embargo, SACOL0058 contuvo solamente 5 repeticiones AT en COL. Además, el análisis POR reveló la presencia de SACOL0058 en los aislados USA100, USA500, y USA800 negativos PVL. SACOL0058 estuvo ausente del cromosoma de la cepa MW2 MRSA USA 00 asociada con la comunidad prototípica (CC1:ST1). PCR de ácido nucleico bloqueado para detectar la presencia y extensión de la secuencia de repetición AT. Los iniciadores de oligonucleótido tradicionales no fueron adecuados para la detección de repetición AT debido al
potencial de múltiples repeticiones 3' para facilitar la formación de hairpina, dímeros de iniciador, etc. Por consiguiente, los oligonucleótidos LNA se utilizaron para asegurar la correcta hibridación y discriminación entre las repeticiones AT de 5 y >6. Esta especificidad dio como resultado el hecho de que los oligonucleótidos LNA están modificados con un puente de metileno 2'-0, 4 ' -C formando un iniciador termodinámicamente estable con una especificidad objetivo mejorada bajo condiciones de endurecimiento severas (Vester y Wengel. 2004. Bioche istry 43 : 13233-13241 ) . El iniciador LNA-PCR se diseñó con 6 repeticiones AT en el extremo 3' y bases modificadas con LNA cerca del extremo 5' para corregir fuertemente la conducción de la hibridación y la amplificación PCR cuando se utilizó con un iniciador inverso apropiado en aislados con >6 repeticiones AT (Figura 1) . Como se muestra en la Figura 2A, la amplificación se observó solamente en las cepas conteniendo >6 (es decir, 6 y 8) repeticiones AT. Estos resultados fueron 100% concordantes con el análisis de secuencia ADN. Se utilizó LNA-PCR para examinar una variedad de cepas pertenecientes a los complejos CC5 y CC8 clónicos MLST, incluyendo variantes de sitio individual de ambos grupos, y variantes de sitios dobles o triples de CC8. Además para los aislados USA300:ST8, SACOL0058 se encontró en CC8:ST247 (clon Ibérico), CC8:ST250 (USA500), CC5 : ST5 (USA100 y USA800) y
aislados CC5:ST228, pero estuvo ausente de aislados CC8:ST239 y CC8:ST240 del clon brasileño. Sin embargo, como se observó previamente, solamente los aislados USA300, que llevan genes PVL, poseyeron ya sea 6 u 8 repeticiones AT. Los resultados para todos los aislados examinados se muestran en la Tabla 1. PCR múltiple para rápida identificación de los aislados PFT USA300. Utilizando una modificación menor de la reacción de PCR, los iniciadores se combinaron para crear un ensayo PCR múltiple con el potencial de diferenciar los aislados USA300 de otras cepas MRSA. Como se muestra en la Figura 2B, los carriles 2 y 3, las cepas USA300 se identificaron a través de tres productos PCR: (i) SACOL0O58,
(ii) amplificación basada en LNA de >6 repeticiones AT, y
(iii) genes PVL. Un aislado USA500:ST8 conteniendo 6 repeticiones AT, se distinguió de los aislados USA300-0114 a través de la ausencia de la banda PVL (Figuras 2A-2B, carril 4). El aislado mecA negativo, CRG-1112 (NCTC8325) , fue un control positivo para SACOL0058 (Figura 2B, carril 4) mientras que la cepa CRG-956 (USA400, W2 ) sirvió como un control positivo para PVL (Figura 2B, carril 6) . Los productos de amplificación discrepantes, cuando se observaron, no fueron problemáticos debido a su menor intensidad y variación de tamaño.
TABLA 1 Características del Aislado S. aureus
Aislado MLSTa PFTb/Designación PVL Repetición0 AT Fuente de Cepa
956 CCLST1 USA400 (MW2) ND CDCa
CH17 CCl:STle USA400 D Este estudio
CH18 CC1 :STle USA400 ND Este estudio CH33 CCl:STle USA400 ND Este estudio CH62 CCl:STle USA400 ND Este estudio CH48 CC1 : STle USA400 ND Este estudio 947 CC5 : ST5 USA100 (N315) 5 CDC 948 CC5:ST5 USA100 (Mu50) 5 CDC 1244 CC5:ST5 USA800 <5 CDC 1245 CC5 : ST5 ÜSA8O0 <5 CDC 1226 CC5:ST228 Dinamarca 3727-03 <5 SSIf
1116 CC8:ST8 USA300-0114h 6 CDC 1112 CC8 :ST8 NCTC83259 5 CDC 1117 CC8:ST8 USA300-0114 6 CDC 1126 CC8 : ST8 USA300-0114 6 CDC 1127 CC8 :ST8 USA300-0114 6 CDC 1128 CC8 : ST8 USA300-0114 6 CDC 1129 CC8 : ST8 USA300-0114 8 CDC
1130 CC8:ST8 USA300-0114
1131 CC8:ST8 USA30O-0114
1132 CC8:ST8 USA300-0114
1133 CC8:ST8 USA300-0114
1134 CC8:ST8 USA300-0114
1135 CC8:ST8 USA300-0114
1136 CC8:ST8 USA300-0114
1137 CC8:ST8 USA300-0114
1138 CC8:ST8 USA300-0114
1139 CC8:ST8 USA3O0-0114
1140 CC8.-ST8 USA300-0114
1141 CC8:ST8 USA300-0114
1142 CC8:ST8 USA300-0114
1143 CC8:ST8 USA300-0114
1144 CC8:ST8 USA300-0114
1145 CC8:ST8 USA300-0114
1146 CC8:ST8 USA300-0114
1147 CC8:ST8 USA300-0114
1148 CC8:ST8 USA300-0114
1149 CC8:ST8 USA300-0114
1150 CC8:ST8 USA300-0114
1151 CC8:ST8 USA300-0114
1152 CC8:ST8 USA300-0114 1233 CC8:ST8 USA300-0114 1235 CC8:ST8 USA300-00451
1335 CC8 :ST8e USA300-00451
1330 CC8 : ST8e USA300-0068j
1118 CC8 :ST8 USA300-0120k
1119 CC8 :ST8 USA300-0120
1234 CC8 : ST8 USA300-0120
1236 CC8 :ST8 USA300-0120
1336 CC8 : ST8e USA300-0120
1333 CC8 :ST8e USA300-0120
1334 CC8 : ST8e USA300-0120
1337 CC8 : ST8e USA300-01201
1237 CC8 :ST8 USA300-0247h
1238 CC8 :ST8 USA300-0251h
1331 CC8 : :ST8e USA300-02721
1228 CC8 : : ST8 USA500 1230 CC8 : :ST8 USA500 1231 CC8 : : ST8 USA500 511 CC8 : :ST239 Brasileño
513 CC8 : : ST239 Brasileño
515 CC8 : :ST239 Brasileño
517 CC8 : ST239 Brasileño
519 CC8 : ST239 Brasileño
521 CC8 : ST239 Brasileño
523 CC8 : ST239 Brasileño
525 CC8 : ST239 Brasileño
1186 CC8 : ST239 Brasileño
1187 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC
1188 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC
1189 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC 1191 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC 1192 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC
1184 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC
1190 CC8:ST239 Brasileño - ND CDC 1225 CC8:ST239 Dinamarca 2731-03 - ND SSI 1185 CC8:ST240 Brasileño - ND CDC
510 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC
512 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC
514 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC
516 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC 518 CC8.-ST247 Ibérico - <5 CDC
520 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC
522 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC
524 CC8.-ST247 Ibérico - <5 CDC
1227 CC8:ST247 Ibérico - 5 CDC 1229 CC8ST247 Ibérico - 5 CDC
1241 CC8:ST247 Ibérico - <5 CDC
930 CC8:ST250 USA500 (COL) - 5 CDC
1246 CC15:ST15 USA900 - ND CDC
1220 CC22:ST22 Dinamarca 40135 - ND SSI
1221 CC22:ST22 Dinamarca 22744-99 SSI
1224 CC22 : ST22 Dinamarca 848-03 SSI 1232 CC22:ST22 EMRSA15 CDC 1172 CC30:ST30 USA200/EMRSAl6 SMRSALm 1248 CC30:ST30 USAI 100 CDC 958 CC30:ST30 USA200 SMRSAL 1223 CC30 : ST36 Dinamarca 2551-03 SSI
1222 CC30:ST579 Dinamarca 1391-03 SSI
1242 CC45:ST45 USA600 CDC
1247 CC59:ST59 USA1000 CDC 1243 CC72:ST72 USA700 CDC 1197 CC80:ST80 Dinamarca 188851-95 SSI
1198 CC80:ST80 Dinamarca 11819-97 SSI
1212 CC80:ST80 Francia HT0401 SSI
1214 CC80:ST80 Grecia 14 SSI
a Complejo clónico: tipo de secuencia b Tipo de campo pulsado como se describe por
McDouglas y otros (23). c ND = No Detectado; 5, 6 u 8 número de repeticiones AT confirmadas con secuenciación : <5 ó >6 = número de repeticiones AT detectadas a través del ensayo PCR. d Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, Georgia, USA. e Tipo MLST de acuerdo con el patrón PFGE. f Robert Skov - Statens Serum Institute, Copenhagen, Dinamarca. 9 Staphylococcus aureus susceptible a meticilina. h SCCmec de tipo IVa, USA300-0114 fueron aislados independientes de ubicaciones geográficas conocidas que se sabe que no están epidemiológicamente relacionadas. 1 SCCmec tipo IVb. j SCCmec tipo no clasificable, no IVa, b o c. k aislados USA300-0120 (excepto 1337) fueron SCCmec de tipo IVb. 1 SCCmec de tipo IVc . m McDonald Morrison - Scottish MRSA Reference Laboratory, Glasgow, UK. EXPLICACION El CA-MRSA USA300 es una preocupación clínica clara y emergente. Sin embargo, la identificación definitiva de estas cepas ha involucrado tradicionalmente una combinación de pruebas y protocolos (es decir, PFGE, MLST, SCCmec, PVL)
que requieren la experiencia especializada y varios días para completarse. Además, el elemento móvil catabólico de arginina recientemente descrito (ACME) por Diep y otros (Diep y otros, Lancet 2006; 367:731-739) parece que no solamente está presente en las cepas USA300 que llevan SCCmec del tipo IVa (McDougal y otros, Resumen 46a. Intersci . Conf. Antimicrob. Agents Chemother., resumen C2-603, 2006). El ensayo múltiple descrito en la presente diferencia las cepas CA-MRSA USA300 como una variedad de SCCmec del subtipo IV (ver Tabla 1) de otros MRSA. En este ejemplo, solamente los aislados USA300 contuvieron ya sea 6 u 8 repeticiones AT así como genes PVL. En algunas instancias, los aislados con tipos de secuencia relacionados tales como USA500 (ST8) exhibieron >6 repeticiones AT, pero nunca en combinación con PVL. Otros aislados (por ejemplo, ST80) codificaron PDL, pero siempre contuvieron <6 repeticiones AT. De esta forma, la detección combinada de estos elementos a través de PCR múltiple permitió que los aislados USA300 fueran rápida y específicamente identificados sin secuenciación. Como con cualquier ensayo, las cepas variantes pueden existir siendo difíciles detectar con éste método. Sin embargo, los resultados de este ejemplo demuestran el potencial del ensayo LNA como un método efectivo en cuanto a costo, rápido para identificar CA-MRSA USA300, un patógeno significativo como una prevalencia en incremento en muchas instalaciones de
hospital y de la comunicad. En los aislados CC8 examinados, SACOL0058 estuvo presente en ST8 , ST247, I 247, y ST250, pero no en ST239 y ST240, consistente con el análisis MLST como se discutió por Enright y otros (Enright y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A 2002; 99:7687-7692). Interesantemente, SACOL0058 también se encontró en CC5. El análisis de secuencia de proteína del gen SACOL0058 hipotético conservado a través del programa de traducción Accelrys GCG® (San Diego, CA) mostró que las cepas MRSA que contienen 5 repeticiones AT pueden poseer una proteína completamente funcional. Sin embargo, una repetición AT adicional (es decir, 6 repeticiones AT) dieron como resultado un intercambio de marco de lectura produciendo un codón de detención en el aminoácido 286. Con 8 repeticiones AT, los primeros 285 aminoácidos de la proteína permanecieron homólogos al original con una divergencia posterior. Mientras los datos presentados en este ejemplo no tratan cuestiones con respecto al papel funcional de SACOL0058 en aislados de estafilococo, la región parece que permanece conservada contra cepas especialmente incluyendo el genotipo USA300. En la PCR de la petición AT, en combinación con PCR para la presencia de los genes PVL y el SACOL0058, tiene el potencial de identificar cepas CA-MRSA USA300 en una forma eficiente en cuanto a costo, rápida. Los resultados exactos
se pueden obtener siguiendo cuidadosamente las condiciones PCR optimizadas, permitiendo un diagnóstico valioso y datos de vigilancia a ser recolectados rápidamente sin la necesidad de secuenciación . Las palabras "preferido" y "preferible" se refieren a modalidades de la invención que pueden permitirse ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, otras modalidades también pueden ser preferidas, bajo las mismas o diferentes circunstancias. Además, la descripción de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no pretende escribir otras modalidades del alcance de la invención. También en la presente, la descripción de intervalos numéricos a través de puntos finales incluyen todas las sub-zonas de números dentro del intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.8, 4, 5, etc . ) . La descripción anterior de la invención no pretende describir cada modalidad descrita de cada implementación de la presente invención; más bien, solamente se describen modalidades ilustrativas. La descripción completa de todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones, y material electrónicamente disponible (incluyendo, por ejemplo, sometimientos de secuencia de nucleótido en, por ejemplo,
GenBank y RefSeq, y sometimientos de secuencias de aminoácidos en, por ejemplo, SwissProt, PIR, PRF, PDB, y traducciones de regiones de modificación anotadas en GenBank y RefSeq) citadas en la presente se incorporan por referencia. La descripción anteriormente detallada y los ejemplos han sido dados para claridad de entendimiento solamente. No se entenderán limitaciones innecesarias a la misma. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos, para variaciones obvias para un experto en la técnica que se incluirán dentro de la invención definida por las reivindicaciones. Todos los encabezados son para conveniencia del lector y no deberá utilizarse para limitar el significado del texto que sigue después de los encabezados, a menos que se especifique así. Para cualquier método descrito en la presente que incluye pasos discretos, los pasos se pueden conducir en un orden factible. Y, cuando es apropiado, cualquier combinación de dos o más pasos se puede conducir simultáneamente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.