MX2008002648A

MX2008002648A - Escision de compuestos antifolato.

Info

Publication number: MX2008002648A
Application number: MX2008002648A
Authority: MX
Inventors: Roger Melton; Anthony Atkinson
Original assignee: Protherics Medicines Dev Ltd
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2008-03-14
Also published as: CA2619992A1; BRPI0520493A2; WO2007023243A2; IL189498A0; EP1917027A2; AU2005335876A1; WO2007023243A3

Abstract

Se describe un metodo para combatir toxicidad causada por un compuesto antifolato de formula 1, (ver formula I) en un individuo en quien se le ha administrado el compuesto; el metodo comprende administrar una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G al individuo; se describe un metodo para escindir un compuesto que comprende un fragmento estructural de formula IV, (ver formula IV) el metodo comprende poner en contacto el compuesto que comprende fragmento estructural de formula IV con una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G.

Description

ESCISIÓN DE COMPUESTOS ANTIFOLATO MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se relaciona con los usos de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G, y en particular con su uso en combatir la toxicidad causada por compuestos Pemetrexed y por compuestos antifolato relacionados. Los folatos naturales se utilizan por células en la vía de folato para sintetizar ADN, ARN y en la síntesis de proteínas y por lo tanto son requerimientos alimenticios esenciales (Joliver et al., 1983; Pinedo et al, 1976; Goldman 1975). Las tres enzimas en la vía folato más estudiadas como objetivos para medicamentos antifolato son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidilato sintasa (TS) y glicinamida ribonucleótido formiltransferasa (GARFT). DHFR y TS, junto con serina hidroximetiltransferasa (SHMT), comprenden las tres enzimas del ciclo timidilato. SHMT cataliza la conversión de serina a glicina con la formación de ácido metilentetrahidrofólico (MTHF). MTHF, bajo la influencia de TS, dona su grupo metileno al ácido desoxiuridílico para formar timidilato, un componente esencial del ADN. De manera importante, en la reacción de TS, el tetrahidrofolato (THF) suministra equivalentes reductores para la conversión del grupo metileno de MTHF al grupo metilo del tímidilato (dTMP). Así, por cada molécula que se forma de dTMP, se convierte una molécula de THF a dihidrofolato (DHF). El DHF debe convertirse a THF de manera que el ciclo de TS continúe produciendo dTMP. Esta reacción es catalizada por DHFR, el cual utiliza NADPH como el reductor. DHFR también cataliza la conversión de ácido fólico a DHF. GARFT cataliza la tercera en la serie de diez reacciones que se requieren para la biosíntesis de novo de purina, la conversión del ribonucleótido de glicinamida a ribonucleótido de forimilglicinamida utilizando 10-formilTHF como el donador de formilo. GARFT se produce en mamíferos como una proteína trifuncional la cual cataliza la segunda y quinta etapa de esta vía además de la tercera. La actividad de GARFT reside en la porción carboxi terminal de esta proteína trifuncional. La biosíntesis de novo de purina lleva a la formación de monofosfato de inosina, el precursor de ATP y GTP necesario para formación de ARN y de dATP y dGTP necesario para la formación del ADN. La inhibición de DHFR lleva a una deficiencia de dTMP debido a que DHF no puede reciclarse para uso en la reacción de TS. Esto a su vez genera una síntesis deficiente de ADN, ruptura del ADN y muerte celular. La inhibición directa de TS de igual manera genera una deficiencia de dTMP y muerte celular. La inhibición directa de GARFT lleva a la supresión de nucleótidos de purina, lo cual también genera muerte celular, pero el grado de citólisis generalmente es menor que el producido por una concentración igualmente inhibidora del crecimiento de un inhibidor TS (Kisliuk et al, 2003).

El metotrexato (MTX), un análogo de folato sintético, ha estado en uso clínico desde 1984 (Bleyer 1978) y es un componente importante de diversos regímenes quimioterapéuticos utilizados para el tratamiento de pacientes con enfermedades neoplásicas. Los efectos citotóxicos tanto de MTX como sus metabolitos activos es a través de la inhibición de DHFR lo que genera inhibición de la síntesis y reparación del ADN así como inhibición de la replicación celular. El tejido que prolifera activamente, tal como las células malignas, en general son más sensibles a esta interferencia celular por MTX. Además, MTX tiene efectos inmunomoduladores y se utiliza en el tratamiento de muchas otras enfermedades, tales como artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS) y psoriasis. La aplicación de dosis elevadas de MTX, habitualmente administradas como una infusión prolongada actualmente se utiliza con frecuencia en pacientes con linfoma no de Hodgkin (NHL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) o tumores de tejido suave tal como osteosarcoma. Aunque los tejidos malignos que proliferan de manera activa son más sensibles a MTX, MTX aún puede ser tóxico para células sanas en una dosis y de una manera dependiente del tiempo a través de dos mecanismos principales. El primero es común a todos los antifolatos. Este mecanismo es a través de la inhibición de la síntesis del ADN y metabolismo celular, el cual es el mecanismo subyacente que es el responsable de la acción anticancerígena citotóxica del MTX. El riesgo de toxicidad significativa a células sanas se relaciona con las dosis cada vez mayores de MTX al momento de la exposición. La terapia con MTX se asocia con una gama de toxicidades, con mielosupresión, mucositis, hepatitis aguda y nefrotoxícídad como las complicaciones más frecuentes y graves (Bleyer, 1978). Las toxicidades adicionales que se observan en una terapia con dosis elevadas son dermatitis descamativa aguda, disfunción de linfocitos B y efectos neurológicos. Las toxicidades comunes similares también son ocasionadas por otros medicamentos antifolato, aunque generalmente se les ha administrado a dosis menores que el MTX. El segundo mecanismo es la obstrucción tubular renal inducida por MTX y la consecuente disfunción renal (nefrotoxicidad por MTX). El MTX es metabolizado por la aldehido oxidasa hepática a 7-hidroxi-MTX. La solubilidad acuosa de 7-hidroxi-MTX es 3 a 5 veces menor que la del compuesto de origen y, bajo ciertas condiciones, se sabe que precipita en los túbulos renales los cuales se piensa que son el mecanismo principal en la patogénesis de la nefrotoxicidad por MTX (Kintzel 2001 , Condit 1969). La función renal normal llevará a cabo la eliminación de una carga particular en un tiempo dado, después la acumulación y el daño se llevarán a cabo. Si un paciente que recibe MTX desarrolla nefrotoxicidad lo que genera una eliminación dañada de MTX, se inicia el ciclo autoperpetuante de eliminación reducida, una concentración plasmática elevada sostenida de MTX y exacerbación subsecuente tanto de la toxicidad no renal como avance del daño tubular renal lo que finalmente lleva a la muerte del paciente (aunque la mortalidad puede presentarse incluso en la ausencia de una insuficiencia renal total). La toxicidad renal se ha registrado con otros compuestos antifolato, pero esta puede no deberse a una 7-hidroxilación análoga del compuesto. La toxicidad por 7-OH-MTX se produce a altas dosis de MTX mientras que las dosis administradas típicas de antifolatos adicionales descritas en la presente invención únicamente se pueden considerar que como dosis "intermedias" para MTX. Como un resultado de los resultados mortales por toxicidad con MTX, habitualmente se incluyen medidas de protección en los regímenes terapéuticos con MTX: 1. Rescate con leucovorina. La leucovorina de calcio es la sal de calcio del ácido 5-formiltetrahidrofólico (también conocido como ácido folínico/folinato), el metabolito de DHFR del ácido fólico y una coenzima esencial para la síntesis del ácido nucleico y no es inhibida por MTX (Immunex Corporation 2001 ). Como un resultado, la leucovorina de calcio es capaz de rescatar células inhibidas por MTX. No obstante, a altas concentraciones de MTX, la leucovorina de calcio puede no evitar las toxicidades sistémicas (Goldman, 1975; Pinedo et al., 1976). La reversión de MTX por leucovorina de calcio es competitiva, con concentraciones relativamente más altas necesarias conforme se incrementa la concentración de MTX. Cuando las concentraciones de MTX alcanzan 100 µM, incluso concentraciones diez veces mayores de leucovorina de calcio (1 ,000 µM) son incapaces de proteger a las células de la médula ósea de la toxicidad (Pinedo et al., 1976). 2. Se requieren hidratación y alcalinización para mejorar la solubilidad de MTX y de esta manera evitar la nefrotoxicidad de MTX lo cual también puede generar un daño renal. Con estas medidas, la incidencia de la toxicidad por MTX que pone en peligro la vida puede disminuir a aproximadamente 1.5%. No obstante, pese a estas precauciones, una depuración prolongada de MTX debida a insuficiencia renal relacionada con el medicamento puede desarrollarse y llevar a toxicidades graves sistémicas y que pongan en peligro la vida, tales como mielosupresión, mucositis, hepatitis y dermatitis. En el pasado se han realizado diversos intentos por disminuir la toxicidad sistémica por MTX en dichos pacientes. En primer lugar, la hemodiálisis o diálisis peritoneal puede mejorar la depuración de MTX pero habitualmente resulta en disminuciones sólo pequeñas y transitorias de los niveles séricos tóxicos por MTX. En segundo lugar, la administración de timidina o un rescate intensificado con leucovorina puede disminuir la toxicidad sistémica por MTX pero no mejora la excreción de MTX. MTX permanece como el agente anticancerígeno antifolato más ampliamente utilizado en uso clínico hasta ahora. Debido a la seguridad y utilidad relativas de MTX, se ha invertido un esfuerzo considerable en intentar diseñar antífolatos o antifolatos terapéuticamente más selectivos con un espectro más amplío contra tumores. Inicialmente, el diseño se basa en el conocimiento creciente de las vías dependientes de folato y los determinantes del mecanismo de acción de MTX. Estos determinantes incluyen transporte, inhibición de la unión estrecha de su objetivo, DHFR y metabolismo de MTX a metabolitos de poli-K-glutamato (Glun). Estos estudios iniciales llevaron al desarrollo de otros inhibidores antifolato de dos tipos: (1 ) análogos "clásicos" que utilizan los mismos sistemas de transporte celular que MTX y que también son metabolizados a Glun; y (2) análogos "no clásicos" (es decir, lipófilos) que no requieren sistemas de transporte y que no son metabolizados a Glun. Aunque varios de estos análogos han experimentado ensayos clínicos, ninguno aún ha demostrado ser superior a MTX (McGuíre, 2003). El examen detallado de los mecanismos de citotoxicidad y selectividad de MTX muestran que la inhibición tanto de síntesis de dTMP como la síntesis de novo de purina, secundaria a la inhibición de DHFR, lleva a una inhibición de la síntesis del ADN y muerte celular subsecuente, la inhibición de otras vías dependientes de folato no parece ser necesaria para la muerte celular. Estudios adicionales demostraron que la contribución de la inhibición de dTMP o de la síntesis de purina a la muerte celular varían en diferentes tipos de células. Estos datos sugieren que la inhibición de una de estas vías individualmente puede ser terapéuticamente superior (por lo menos en algunos casos) a la inhibición doble inducida por MTX. Por lo tanto, en un diseño razonado y en estudios de diseño basados en la estructura, se elaboraron dos clases nuevas de inhibidores de enzima antifolato: inhibidores directos de TS e inhibidores directos de una o ambas de las dos enzimas dependientes de folato de la síntesis de novo de purina. Los miembros de cada clase incluyeron tipos tanto clásico como no clásico. Después de la evaluación preclínica, varios de estos se han movido a ensayos clínicos. Hasta ahora, solamente se han aprobado para uso rutinario dos compuestos antifolato nuevos; Tomudex (raltitrexed, AstraZeneca) ha sido aprobado recientemente en Europa para el tratamiento del cáncer de colon y Pemetrexed (Alimta®, Eli Lilly) ha sido aprobado en Estados Unidos para mesotelioma pleural maligno y cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC). Esto representa un gran paso hacia delante para los antifolatos dado que, por ejemplo, MTX no es eficaz contra el cáncer de colon. Continúa el desarrollo de antifolatos. Con base en la gran cantidad de conocimientos que existe ahora acerca de los antífolatos, éstos se han enfocado a aspectos específicos del mecanismo de acción. Se han descrito antífolatos más nuevos que inhiben más de una vía en el metabolismo de folato, que tienen un suministro mejorado, o que inhiben otros objetivos en el metabolismo de folato. Estos análogos nuevos están en diversas etapas del desarrollo preclínico y clínico (McGuire, 2003; Kisliuk, 2003; Purcell & Ettinger, 2003; cada uno de los cuales se incorporan como referencia en su totalidad). Edatrexato es un antifolato poliglutamado clásico que inhibe directamente la DHFR con mayor potencia en comparación con MTX. Preclínícamente, el edatrexato se pensaba que tenía un índice terapéutico mejorado en comparación con MTX. Sin embargo, en comparación con el MTX en varios ensayos fase II y fase lll en múltiples tumores sólidos, no se mostró mejoría del edatrexato en comparación con MTX, con una toxicidad similar o ligeramente peor (principalmente mucositis). Los resultados prometedores a partir de un ensayo fase I del edatrexato en combinación con vinblastina, Adriamicina, y cisplatina (EVAC), junto con filgastrima (factor estimulante de la colonia de granulocito [G-CSF]) en el cáncer de pulmón no de célula pequeña (NSCLC) lleva a un ensayo fase II de este régimen. Dieciséis de 34 pacientes evaluables (47.1 %) respondieron a la terapia. Sin embargo, se reportó toxicidad mielosupresora significativa. El cincuenta y seis por ciento de los pacientes tuvieron un grado 3 o mayor de leucopenia, y se observaron tres muertes relacionadas con el tratamiento. Las mediciones de calidad de vida disminuida llevaron a los investigadores a preguntarse la viabilidad de este régimen en su población de pacientes (revisado por Purcell & Ettinger, 2003). Lometrexol, un análogo del folato que inhibe específicamente a GARFT, ha estado en desarrollo clínico por al menos 15 años. Más que cualquier otro antifolato, este agente requiere poliglutamacíón para su efecto sobre la GARFT. Se transporta dentro de la célula vía tanto los sistemas RFC como FR. Lometrexol no tiene efecto sobre DHFR, TS, o AICARFT, y por lo tanto su efectividad se relaciona puramente con la disminución de la síntesis de purina. Los ensayos iniciales en fase I de lometrexol se confundieron por la míelosupresión acumulativa retrasada que previno la administración repetitiva. Como con Pemetrexed, los estudios preclínicos adicionales sugieren que la coadministración del ácido fólico puede modular favorablemente la toxicidad del lometrexol sin eliminar la actividad antitumoral potencial. Se han reportado los ensayos previos en fase I del lometrexol combinados con el rescate de la leucovorina. Sin embargo, las combinaciones de dosis actuales recomendadas de dosis de fase II es lometrexol, 10.4 mg/m2/semana por IV, con ácido fólico, 3 mg/m2/d oralmente. La toxicidad a partir de esta combinación se considera manejable, con un grado 3 poco frecuente de trombocítopenía y mucositis. Lometrexol actualmente está siendo evaluado en estudios de combinación en fase I con cada uno de los siguientes agentes: temozolomida, doxorubicina, carboplatina, gemcitabina, y paclitaxel así como en estudios de agente único en fase II en el sarcoma de tejido blando, melanoma, cáncer de mama, NSCLC, y cáncer de cabeza y cuello (revisado por Purcell & Ettinger, 2003). Tal vez el antifolato nuevo más excitante es Pemetrexed, un potente inhibidor clásico de la antifolato TS poliglutamable anteriormente denominado LY23154 y actualmente elaborado como Alímta® (Eli Lilly). Pemetrexed ha sido revisado por Calvert (2004) y Norman (2001 ). Los estudios en fase l/ll sobre Pemetrexed se han revisado por Hanauske et al (2004), y los ensayos clínicos seleccionados en fase II y lll de Pemetrexed se describen en el cuadro 3 de Purcell & Ettinger (2003). Los ensayos clínicos que incluyen Pemetrexed se han resumido por the US Food and Drug Administration (Hazarika et al (2004) y Cohén et al (2005)). La descripción total de cada una de estas referencias en relación con Pemetrexed se incorpora en la presente invención como referencia. Pemetrexed es poliglutamado dentro de la célula y nuestra alta afinidad para la folilpoliglutamato sintetasa (FPGS). Los derivados de poliglutamato también son inhibidores potentes de DHFR y GARFT y muestran una inhibición menos potente de la aminoimidazol carboxamida ribonucleótído formiltransferasa (AICARFT). Por lo tanto, Pemetrexed ha sido referido como un antifolato "multiblanco". Los estudios preclínicos han mostrado que la inhibición por Pemetrexed de GARFT y AICARFT, además de DHFR y TS, es importante puesto que las células necesitan tanto timidina como hipoxantina para superar el efecto antitumoral. Esto es cierto a pesar del hecho de que la inhibición por Pemetrexed TS es 30 a 200 veces mayor que la inhibición por GARFT o AICARFT y siete veces mayor que la inhibición por DHFR. Las toxicidades de Pemetrexed en varios ensayos tempranos incluyeron la mielosupresíón significativa, mucositis, y diarrea. Subsecuentemente, se estudiaron los niveles plasmáticos de la homocisteína y del ácido metilmalónico como marcadores sustitutos sensibles para el estado del ácido fólíco y de la vitamina B-?2, respectivamente. Se encontró que los bajos niveles de homocisteína y ácido metilmalónico correlacionaban fuertemente con el desarrollo de toxicidades severas relacionadas con el medicamento, sugiriendo que la toxicidad estaba relacionada con la deficiencia relativa del ácido fólico o vitamina B-?2 en ciertos pacientes con cáncer. Los pacientes del ensayo clínico que recibieron subsecuentemente suplementación de ácido fólíco y B12 tuvieron toxicidades mucho menores. Los estudios actuales producen ácido fólico oral, 5 mg la partir del día -2 al día +2 de cada ciclo de Pemetrexed. Cobalamina, 1000 µg medíante inyección intramuscular, se proporciona cada tres ciclos (revisado por Purcell & Ettinger, 2003). Aunque Pemetrexed se activa en muchos tumores sólidos, se han estudiado de manera más extensiva en mesotelioma y NSCLC. Pemetrexed también se encuentra bajo investigación para cáncer de mama, gastrointestinal, de cabeza y de cuello, urotelial, y cáncer cervical. AAG113-161 es un análogo recientemente desarrollado de Pemetrexed y es su inhibidor dual de DHFR y TS. Se consideró que el reemplazo de la porción 4-oxo de Pemetrexed con un grupo metilo para formar AAG113-161 podría mejorar la unión de DHFR al permitir una interacción hidrófoba del grupo 4-metilo con Phe31 y Leu22 de DHFR de humano. Los estudios de cristalografía de rayos X de AAG113-161 que se une a DHFR de P. carinii mostraron que se une en el monto propuesto 2,4-diamíno y que el grupo 4-metilo de AAG113-161 ocupa el ambiente hidrófobo pronosticado. De hecho, para DHFR de L. casei, AAG113-161 es 10,000 veces más inhibidor que Pemetrexed, y para DHFR de humano es 8 veces más inhibidor. Con respecto a TS, AAG113-161 es 55 veces más inhibidor que Pemetrexed para TS de E. coli y 10 veces más inhibidor que Pemetrexed para TS de humano. AAG113-161 tiene valores IC50 para CCRF-CEM de leucemia de humano y las líneas celulares de carcinoma de célula escamosa de cabeza y de cuello FaDu de 12.5 nM y 7.0 nM, respectivamente. A las concentraciones IC90, la inhibición de ambas líneas celulares se revirtió con 40 µM de timidina, consistente con la propuesta de que AAG113-161 es un inhibidor dual de DHFR y TS. En contraste con Pemetrexed, hipoxantina sola a 50 µM no ocasionó la reversión de la inhibición con AAG113-161. AAG113-161 es un sustrato excelente para FPGS de humano. Su valor Km se encuentra por debajo del límite de detección del ensayo (revisado por Kisliuk, 2003). Al igual que con MTX, un inconveniente principal respecto al uso clínico de los medicamentos antifolato más nuevos es un nivel de toxicidad inaceptable. La capacidad para degradar estos medicamentos antifolato rápidamente in vivo puede tener dos ventajas clínicas principales. En primer lugar, minimiza la toxicidad causada por los medicamentos antifolato. También permite que se administren dosis más altas de compuestos antifolato, lo que lleva potencialmente a un mayor efecto clínico. Una menor toxicidad y una eficacia mayor pueden ser suficientes para materializar el compromiso clínico de numerosos medicamentos que no han progresado a través de los ensayos clínicos. Además, dado que la toxicidad asociada con medicamentos antifolato frecuentemente se relaciona con la duración en vez de relacionarse con la dosis, la capacidad para remover rápidamente el medicamento libre en exceso en un punto de tiempo dado puede ser terapéuticamente muy útil. La carboxipeptidasa G2 (CPG2) es una enzima de Pseudomonas sp. cepa RS-16 (ahora reclasíficada como Variovorax paradoxus) y es una proteína dimérica dependiente de zinc de 83,000-84,000 Daltones (Kalghati & Bertíno, 1981 ; Chabner et al., 1972; McCullough et al, 1971 ; Minton et al., 1983; y Sherwood et al, 1985). Tiene una especificidad relativamente limitada e hidroliza el residuo ácido glutámico C terminal del ácido fólico, los derivados poliglutamilo de ácido fólico, los análogos de folato, por ejemplo metotrexato y subfragmentos de ácido fólico, por ejemplo glutamato de p-aminobenzoilo (Minton er al, 1983). Hasta ahora las enzimas carboxipeptidasas únicamente se han caracterizado en un número pequeño de Pseudomonas sp y se pueden separar con base en sus afinidades de sustrato para folato y sus análogos (Kalghatgi y Bertino, 1981 ). El International Nonproprietary Ñame (INN) de la carboxipeptidasa G2 recombinante es glucarpidasa, y está comercialmente disponible como Voraxaze™ (Protherics). Sherwood et al, (1985) previamente han reportado que CPG2 sigue la cinética de Michaelis-Menten con valores Km de 4 µM para folato, 8 µM para MTX, 34 µM para 5-metil THF y 120 µM para 5-formil THF (leucovorina). Glucarpidasa escinde metotrexato (MTX) en sus metabolitos inactivos, ácido 4-desoxi-4-amino-N10-metilpteróico (DAMPA) y glutamato y por lo tanto puede proporcionar una vía alternativa de eliminación de MTX particularmente en pacientes quienes desarrollan disfunción renal debido a nefrotoxicidad por MTX (Adamson et al, 1991 ; Mohty et al,. 2000; von Poblozki et al, 2000; Widemann et al, 2000).

El glutamato de para-aminobenzoilo es un sustrato de glucarpidasa como lo son numerosos promedicamentos de mostaza basados en el glutamato de p-aminobenzoilo (Springer et al (1995); Dowell ef al (1996)). No obstante, no se han publicado reportes que hayan intentado determinar si cualquiera de los nuevos medicamentos antifolato son sustratos para la escisión de glucarpidasa. De hecho, hasta donde están conscientes los inventores, no existen reportes publicados con respecto a si cualesquiera compuestos de folato diferentes al ácido fólico, MTX, 5-metil THF y 5-formil THF eran sustratos para glucarpidasa. No se conocen y no se puede predecir si cualquiera de los medicamentos antifolato de la nueva generación son sustratos para escisión de glucarpidasa. Actualmente los inventores han mostrado que Pemetrexed (Alimta®) es un sustrato para glucarpidasa y tiene una Km de 25.4 µM y una kcat de 1808 s"1 como se midió por el ensayo espectrofotométrico. Todos los sustratos conocidos para la glucarpidasa tienen N (por ejemplo un grupo amíno o amíno sustituido) en la posición para con respecto al anillo de benceno marcado por R4 en la fórmula I, véase a continuación. Pemetrexed, en contraste, tiene un carbono en esta posición la cual no es un reemplazo isostérico o funcional para el nitrógeno. La escisión de dichos antifolatos por glucarpidasa es totalmente inesperada puesto que el para-aminobenzoil glutamato es un sustrato para glucarpidasa pero el benzoil glutamato no lo es. Por lo tanto Pemetrexed, junto con otros antifolatos similares tales como AAG113-161 , Edatrexato y Lometrexol podrían no haber sido pronosticados como sustratos de la glucarpidasa. Los compuestos antifolato son útiles para tratar una gama de condiciones médicas, particularmente cánceres y son adecuados para combatir toxicidad relacionada con estos compuestos lo cual incrementará significativamente su valor terapéutico. Un primer aspecto de la invención proporciona un método para combatir toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I, en donde R1 representa NH2, OH o CH3; R2 representa NH2 o alquilo de C?.4; el grupo B representa un fragmento estructural de fórmula lia, llb, lie, lid o Me, lid He grupos en los cuales las líneas discontinuas indican el punto de fusión del anillo con el anillo pirimidinilo y las líneas onduladas indican el punto de unión del heterociclo bicíclico al resto de la molécula; R7a a R7e representan independientemente H o alquilo de C?. ; A1 representa C(R8a) o N; A2 representa CH o N; A3 representa C(H)R8 , NR8c o S; A4 y A5 representan independientemente CH2, NH, O o S; el grupo B1-B2 representa CH-CH o C=C; R8a a R8c representan independientemente H o alquilo de C?. l o R8c representa C(O)R8d, R8d representa H o alquilo de C?_4; R3 representa H, alquilo de C?.6. alquenilo de C3.6 o alquinilo de R4 representa H o uno o dos sustituyentes seleccionados a partir de halo, alquilo de C?-4 y alcoxi de C?_4, o R4, junto con R5, cuando R4 se une en una posición que es ortho- a la posición a la cual está unida la porción C(O)NR5, representa n-alquileno de C?_2; R5 representa H o alquilo de C-?.4) o R5, junto con R4, cuando R4 se une en una posición que es ortho- a la posición a la cual está unida la porción C(O)NR5, representa n-alquileno de C-?_2; A6 representa -CH2C(R9a)(R9b)-D; R9a y R9b representan independientemente H o alquilo de C- O R9a y R9b juntos representan =C(H)R10; R10 representa H o alquilo de C ; D representa C(O)OH, tetrazol-5-ilo, (CH2)0-?-NHR11 o cuando R9a y R9b juntos representan =C(H)R10, entonces D también puede representar H o D representa un fragmento estructural de fórmula Illa o lllb, Illa lllb en donde las líneas onduladas indican el punto de unión de los fragmentos estructurales; R 1 representa H o C(O)R12; R12 representa H o fenilo sustituido por C(O)OH y opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes adicionales que se seleccionan de halo, alquilo de d-4 y alcoxi de CM; y grupos alquilo, alquenílo y alquinilo, así como la parte alquilo de grupos alcoxi, pueden estar sustituidos por uno o más átomos de halo; o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en un individuo en quien se ha administrado dicho compuesto, el método comprende administrar al individuo una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. El término "halo", cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a floro, cloro, bromo y yodo. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I (así como los compuestos que comprenden un fragmento estructural de fórmula VIII se describen a continuación) que se pueden mencionar incluyen tanto sales de adición de ácido como sales de metal (por ejemplo de metal alcalino tal como sodio o potasio). Los solvatos que se pueden mencionar incluyen hidratos. Los compuestos de fórmula I pueden presentar tautomerismo. En particular, los compuestos de fórmula I en los cuales R1 representa OH alternativamente se pueden presentar como sigue. la Todas las formas tautoméricas y mezclas de las mismas están incluidas dentro del alcance de la invención. Los compuestos de fórmula I que se pueden mencionar incluyen los siguientes: R1 representa NH2 o, particularmente CH3 u OH; R2 representa metilo o, particularmente NH2; el grupo B representa un fragmento estructural de fórmula lia, lie o lid; A1 y A2 representan ambos CH o, particularmente, ambos representan N; R7a, R7c y R7d independientemente representan H, o cuando A1 y A2, ambos representan CH, R7a también puede representar metilo; A3 representa S o, particularmente, CH2; A4 representa NH; A5 representa O u, particularmente NH; el grupo B1-B2 representa CH=CH; R3 representa 3-prop-1-ínilo o, particularmente, H, metilo o etilo; R4 representa metilo o, particularmente, H; R5 representa H; p9a y p9b representan ambos H o R9a y R9b juntos representan =CH2; R11 representa fenilo sustituido en posición orto por C(O)OH. Los compuestos adicionales de fórmula I que se pueden mencionar incluyen aquellos en los cuales: R2 representa NH2; el grupo B representa un fragmento estructural de fórmula lid; R5a representa NH; R7d representa H; R3 representa H; D representa C(O)OH; R9a y R9b representan ambos H. En modalidades preferidas, el compuesto de fórmula I es uno de aquellos listados en (1) a (5) a continuación, (a) R3 = H (10-deazaaminopterina); (b) R3 = CH3 (10-metil-10-deazaaminopterina); (c) R3 = CH2CH3 (10-etil-10-deazaaminopterina, Edatrexato); y (d) R3 CH2C=CH (10-propargil-10-deazaaminopterina). (2) 4'-Met¡len-5,8,10-trideazaaminopterina (Mobiltrex). (3) AAG 120-292-3. (4) ácido 5,10-dideaza-5,6J,8-tetrahídrofólico (Lometrexol). (5) (a) R1 = OH (Pemetrexed); y (b) R1 = CH3 (AAG113-161 ).

En modalidades particularmente preferidas, el compuesto de fórmula I es Edatrexato, AAG113-161 o, más preferiblemente, Pemetrexed.

Pemetrexed Se aprecia que Pemetrexed puede exhibir tautomerismo, en particular con respecto a los grupos O/OH en la posición R1, y Pemetrexed frecuentemente se ilustra en su forma tautomérica alternativa, como se muestra en la fórmula la.

Por "una enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G" los inventores incluyen el significado de una enzima que hidroliza el residuo de ácido L-glutámico en la parte L terminal del ácido fólico, análogos de folato y subfragmentos de ácido fólíco, por ejemplo glutamato de p-aminobenzoilo. Preferiblemente, la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G es glucarpidasa (carboxipeptidasa G2 recombinante (CPG2), número EC 3.4.22.12. La secuencia del gen que codifica glucarpidasa y la secuencia de aminoácidos de la glucarpidasa se pueden encontrar en GenBank Nos. de acceso M12599 y AAA62842 y en Minton et al. (Gene 31 (1-3), 31-38 (1984)), Minton y Clarke (J. Mol. Appl. Genet. 3 (1), 26-35 (1985)); y Chambers et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 29, 572-578 (1998)) y la secuencia de aminoácidos se lista en la figura 1. En una modalidad, la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G puede ser un derivado de glucarpidasa que tiene actividad de carboxipeptidasa G. Por "derivado" de glucarpidasa los inventores incluyen un fragmento, variante, modificación o fusión de glucarpidasa o combinaciones de los mismos, los cuales tienen actividad de carboxipeptidasa G. Los derivados se pueden elaborar utilizando técnicas de química de proteína, por ejemplo utilizando proteólisis parcial (ya sea exolítícamente o endolíticamente) o por síntesis de novo. Alternativamente, los derivados se pueden producir por tecnología de ADN recombinante. Las técnicas adecuadas para clonación, manipulación, modificación y expresión de ácidos nucleicos, y purificación de las proteínas expresadas se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001 ) "Molecular Cloning, a Laboratory Manua ', 3a edición, Sambrook eí al. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, que se incorpora en la presente como referencia. Por "fragmento" de glucarpidasa los inventores desean indicar cualquier porción de la enzima de longitud completa que tiene actividad de carboxipeptidasa G. Típicamente, el fragmento tiene por lo menos 30% de la actividad de carboxipeptidasa G de glucarpidasa. Se prefiere de manera adicional que el fragmento tenga por lo menos 50%, de manera preferible por lo menos 70% y de manera mucho más preferible por lo menos 90% de la actividad de CPG2. De manera más preferible, el fragmento tiene 100% o más de la actividad de carboxipeptidasa G de glucarpidasa. La actividad de carboxipeptidasa G de un derivado de glucarpidasa se puede determinar fácilmente por una persona experta en la técnica utilizando el ensayo de enzimas descrito en la página 448 de Sherwood et al. (1985). La descripción completa de Sherwood et al. (1985) se incorpora en la presente invención como referencia. Una "variante" de glucarpidasa se refiere a glucarpidasa que se ha alterado por una inserción, supresión y/o sustitución de aminoácidos, ya sea conservadora o no conservadora, en una o más posiciones. Por "sustituciones conservadoras" se pretende que se incluyan combinaciones tales como Gly, Ala; Val, lie, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys Arg; y Phe, Tyr. Tales modificaciones se pueden producir utilizando los métodos de ingeniería de proteínas y mutagénesis dirigida al sitio, como se describe en Sambrook et al 2001 , anteriormente mencionado. Por ejemplo, puede ser ventajoso modificar uno o más residuos de uno o ambos de los sitios activos de la enzima. Tales variantes pueden alterar benéficamente la especificidad o actividad de la enzima. La estructura cristalina de glucarpidasa fue publicada por Rowsell et al (1997) e identifica los sitios activos de la enzima. En otras modalidades, puede ser ventajoso no modificar los residuos en los sitios activos. Las variantes de secuencia, típicamente fuera de los sitios activos, pueden proteger a la enzima del metabolismo in vivo o disminuir la antigenicidad. Adicionalmente, puede ser ventajoso agregar uno o más residuos Cys para permitir que se formen enlaces disulfuro. Preferiblemente, la variante de glucarpidasa tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ. ID. NO: 1. Se prefiere adicionalmente si la variante glucarpidasa tiene por lo menos 80%, de manera preferible por lo menos 85% y de manera más preferible por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ. ID. NO: 1. De manera más preferible, la variante de glucarpidasa tiene 91 o 92 o 93 o 94 o 95 o 96 o 97 o 98 o 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ. ID. NO: 1. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos se puede determinar utilizando programas de computadora adecuados, por ejemplo el programa GAP de la University of Wisconsin Genetic Computing Group y se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula en relación a los polipéptídos cuya secuencia se ha alineado de manera óptima. La alineación alternativamente se puede llevar a cabo utilizando el programa Clustal W (Thompson ef al., (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-80). Los parámetros utilizados pueden ser los siguientes: Parámetros rápidos de alineación por pares: tamaño de K-grupo (palabra); 1 , tamaño de intervalo; 5, penalización por separación; 3, número de diagonales superiores; 5. Método de evaluación: x por ciento. Parámetros de alineación múltiples: penalización por abertura de separación; 10, castigo por extensión de separación; 0.05. Matriz de evaluación: BLOSUM. Preferiblemente, la variante de glucarpidasa o un fragmento de la variante retiene por lo menos 30% de la actividad de carboxípeptidasa G de glucarpidasa. Se prefiere de manera adicional si la variante de glucarpidasa tiene por lo menos 50%, preferiblemente por lo menos 70% y de manera más preferible por lo menos 90% de la actividad de glucarpidasa. De manera más preferible, la variante de glucarpidasa tiene 100% o más de la actividad carboxipeptidasa G de glucarpidasa. Las variantes de glucarpidasa con actividad de carboxipeptidasa G han sido descritas en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2004/0014187. En una modalidad, la variante de glucarpidasa tiene una sustitución en uno o más de los residuos Asn en las posiciones 222, 264 y 272 las cuales son sitios de N-glucosilación. Preferiblemente, Asn 222 está sustituido con Gln; Asn 264 está sustituido con Thr o Ser, de manera más preferible Ser; y Asn 272 está sustituido con Gln, independientemente o en combinación. La combinación más preferida de sustituciones tiene Gln en las posiciones 222 y 272 y Ser en el residuo 264. Este motivo QSQ resulta en una alta actividad catalítica con una Km baja para MTX (documento de US 2004/0014187). Una "modificación" de glucarpidasa se refiere a glucarpidasa en la cual uno o más de los residuos aminoácidos han sido modificados químicamente. Tales modificaciones incluyen formación de sales con ácidos o bases, especialmente ácidos y bases orgánicas e inorgánicas fisiológicamente aceptables, formando un éster o amida de un grupo carboxilo terminal, grupos protectores de aminoácido unidos tales como N-terbutoxicarbonilo y glucosilación. Tales modificaciones pueden proteger a la enzima del metabolismo in vivo o disminuir la antigenicidad. La glucarpídasa puede estar presente como copias únicas o como múltiplos, por ejemplo secuencias repetidas en tándem. La invención también incluye una fusión de glucarpidasa, o un fragmento o variante de la misma el cual tiene actividad de carboxipeptídasa G, a otro compuesto. Preferiblemente, la fusión retiene por lo menos 30% de la actividad de glucarpidasa. Se prefiere de manera adicional si la fusión tiene por lo menos 50%, de manera preferible por lo menos 70% y de manera más preferible por lo menos 90% de la actividad de glucarpidasa. De manera más preferible, la fusión tiene 100% o más de la actividad de carboxipeptidasa G de glucarpidasa. La invención puede ser utilizada para aliviar los síntomas de toxicidad causados por el compuesto antifolato de fórmula I en un individuo (es decir, como uso paliativo) o se puede utilizar para reducir la gravedad de la toxicidad en un individuo o se puede utilizar para tratar toxicidad en un individuo o se puede utilizar de manera profiláctica para evitar toxicidad en un individuo. De esta manera, por "combatir toxicidad" los inventores incluyen el significado de tratar, reducir o prevenir la toxicidad causada por el compuesto antifolato o aliviar los síntomas del mismo. La enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G típicamente actúa para combatir la toxicidad causada por el compuesto antifolato de fórmula I al disminuir rápidamente los niveles plasmáticos del medicamento y de esta manera reducir la duración de exposición de tejidos normales al medicamento y evitar la captación a largo plazo. Ya sea que un paciente particular sea uno en quien se espera el beneficio del tratamiento o no, se puede determinar por el médico. Al prevenir la toxicidad los inventores incluyen el significado de tratar a un paciente en riesgo de toxicidad, por ejemplo debido a niveles elevados y/o eliminación retrasada del compuesto antifolato de fórmula I. Cualquier paciente en quien se ha administrado el compuesto antifolato se puede considerar que se encuentra en riesgo de toxicidad causada por el mismo.

En una modalidad, el individuo en riesgo de toxicidad puede ser aquel a quien se le ha administrado el compuesto antifolato y quien no ha sido sometido a pruebas para determinar la presencia de un marcador clínico de toxicidad causada por el compuesto antifolato. En otra modalidad, el individuo en riesgo de toxicidad puede ser aquel a quien se le ha administrado el compuesto antifolato y tiene uno o más marcadores clínicos o indicaciones de toxicidad causada por el mismo. Por ejemplo, se sabe que Pemetrexed no se metaboliza en el cuerpo hasta un grado apreciable y s excreta principalmente en la orina (Eli Lilly, 2004). En pacientes con función renal normal, 70-90% del Pemetrexed se recupera sin cambio en la orina en las 24 horas después de la administración, con una vida media de eliminación de 3.5 horas. Sin embargo, el nivel de eliminación de Pemetrexed disminuye, y por lo tanto se incrementa la exposición del medicamento, en pacientes con función renal reducida. La eliminación de la creatinina se puede utilizar como un marcador para la función renal, y una eliminación de la creatinina de <45 mL/min, puede ser considerada como un marcador clínico o indicación de toxicidad por Pemetrexed. De hecho, un paciente con deterioro renal severo (eliminación de creatinina de <19 mL/min) murió por la toxicidad relacionada con el medicamento después de recibir Alimta® solo (Eli Lilly, 2004). Por lo tanto se aprecia que la capacidad de degradar Pemetrexed por la glucarpidasa puede permitir que el Pemetrexed se administre a los pacientes que necesitan del mismo los cuales tienen función renal reducida.

Así, en una modalidad, el método puede comprender la etapa anterior de determinar si el individuo a quien se le ha administrado el compuesto antifolato de fórmula I tiene un marcador clínico de toxicidad causada por el compuesto antifolato. En una modalidad, el marcador clínico de toxicidad causada por el compuesto antifolato de fórmula I puede ser un nivel del compuesto, tal como el nivel plasmático, mayor que un nivel predeterminado en un momento dado después de la administración del compuesto. El nivel plasmático predeterminado del compuesto antifolato que indica toxicidad puede ser 0.1 ó 0.2 ó 0.3 ó 0.4 ó 0.5 ó 0.6 ó 0J ó 0.8 ó 0.9 µmoles por litro o 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 µmoles o más por litro a las 24 horas después de la administración del compuesto antifolato o a las 48, o 72 ó 96 ó 120 horas, o más, después de la administración del compuesto antifolato. Así en otra modalidad, el método puede comprender la etapa previa de determinar el nivel del compuesto antifolato en el individuo en un tiempo dado después de la administración del compuesto al individuo tal como las 24 ó 48, o 72 ó 96 ó 120 horas, o más, después de la administración del compuesto antifolato. La invención incluye administrar una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G a un individuo en quien se ha administrado un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente, ya sea que el individuo haya presentado o no síntoma alguno de toxicidad causada por el compuesto.

En una modalidad, se puede preferir administrar la enzima a cada individuo en quien se ha administrado un compuesto antifolato de fórmula I, por ejemplo, en un tiempo dado después de la administración del compuesto de fórmula I. De esta manera, se puede considerar que la invención es un método in vivo de escisión de un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente. En otra modalidad, el individuo en riesgo de toxicidad puede ser aquel a quien se le ha administrado el compuesto antifolato y tiene uno o más síntomas clínicos de toxicidad causados por el mismo. De esta manera, en una modalidad, el método puede comprender la etapa previa de determinar si el individuo en quien se ha administrado el compuesto antifolato tiene un síntoma clínico de toxicidad causada por el compuesto antifolato. Son bien conocidos los síntomas de toxicidad para varios de los compuestos antifolato de fórmula I como se definieron anteriormente. Por ejemplo, las toxicidades para Pemetrexed incluyen mucositis, mielosupresión, trombocitopenía, neutropenia, sepsis neutropénica, septicemia, fatiga, neurotoxicidad, anemia, parastesia, disnea, náusea y diarrea, aunque de alguna manera se reducen por la adición con ácido fólico y vitamina B12> prurito, fatiga y estomatitis (Martin et al, 2003; Hanauske ef al, 2004); y las toxicidades para Edatrexato incluyen mucositis, mielosupresión y leucopenia Purcell & Ettinger, 2003); y las toxicidades para Lometrexol incluyen trombocítopenia y mucositís (Purcell & Ettinger, 2003). Al individuo típicamente se le administra la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G entre aproximadamente 24 y 48 horas después de que se administra el compuesto antifolato. De manera alternativa, al individuo se le puede administrar la enzima entre aproximadamente 12 y 24 horas o entre aproximadamente 48 y 72 horas, o entre aproximadamente 72 y 96 horas, o entre aproximadamente 96 y 120 horas o más después de que se le administre el compuesto antifolato. Al individuo se le puede administrar la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G durante aproximadamente 6 horas, o aproximadamente 12 horas, o aproximadamente 18 horas, o aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 30 horas, o aproximadamente 36 horas, o aproximadamente 42 horas, o aproximadamente 48 horas, o aproximadamente 54 horas, o aproximadamente 60 horas, o aproximadamente 72 horas, o aproximadamente 84 horas, o aproximadamente 96 horas, o aproximadamente 108 horas, o aproximadamente 120 horas o más después de que se administra el compuesto antifolato. Se aprecia que si el compuesto antifolato se ha administrado al individuo por error, la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G preferiblemente se administra tan pronto como se pueda una vez que se conoce el error con el fin de combatir la toxicidad causada por el mismo. De manera similar, si el individuo tiene un marcador clínico de toxicidad causada por el compuesto antifolato o un síntoma clínico de toxicidad causado por un compuesto antifolato, también se puede administrar preferiblemente la enzima tan pronto como sea posible. Una dosis de 600 mg/m2 de Pemetrexed administrada cada 3 semanas lleva a niveles altos pero manejables de toxicidad (Martin et al, 2003), y de los estudios clínicos revisados por Norman (2001 ), la mayor dosis administrada fue de^hasta 600 a 900 mg/m2. Se encontró que la dosis máxima tolerada de Edatrexato era de 3750 mg/m2, sin embargo, debido a la presencia de leucoencefalopatía en un paciente, no se recomendó un tratamiento con alta dosis de Edatrexato (Pisters et al, 1996). En cada uno de estos casos, la administración subsecuente de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G seguido por degradación del compuesto antifolato puede incrementar la dosis tolerada máxima del compuesto antifolato y de esta manera aumentar la eficacia del medicamento y minimizando cualesquiera efectos secundarios. La invención de esta manera incluye la administración a un individuo en necesidad del mismo, como se describe en la presente invención, una dosis alta de un compuesto antifolato de fórmula I, tal como 2 ó 3 ó 4 ó 5 Ó 6 ó 7 ó 8 ó 9 ó 10 o más veces las dosis anteriores y la administración subsecuente de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa en el individuo.

De esta manera, la invención incluye administrar a un individuo una dosis de Pemetrexed equivalente a aproximadamente 1000 mg/m2 ó 1.5 ó 2Ó2.5Ó3Ó3.5Ó4Ó5Ó6Ó7Ó8Ó9Ó10 g/m2 o más en un programa de 3 semanas, y administrar subsecuentemente una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en el individuo. Por lo tanto, la invención incluye la administración de una dosis de Edatrexato equivalente a aproximadamente 5ó6ó7ó8ó9ó10ó15ó20 ó 25 g/m2 o más, y subsecuentemente se administra una enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G al individuo. La enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G o una formulación de la misma se puede administrar por cualquier método convencional que incluye inyección parenteral (por ejemplo subcutánea o intramuscular). El tratamiento puede consistir de una dosis única o una pluralidad de dosis por un período de tiempo. De manera más preferible, la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G o una formulación de la misma se administra por vía intravenosa. En algunas circunstancias la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G o una formulación de la misma se puede administrar intratecalmente, típicamente cuando el compuesto antifolato de fórmula I se ha administrado intratecalmente. Los estudios en monos rhesus indican que la vida medía de la glucarpidasa en plasma después de la administración intravenosa está entre 52 y 58 minutos. Se ha calculado que, después de administración intratecal a los monos Rhesus, la vida media de glucarpidasa en líquido cefalorraquídeo es de 3.3 a 3.9 horas. Aunque es posible que la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G se administre sola, es preferible presentarla como una formulación farmacéutica junto con uno o más portadores aceptables. Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con el compuesto de la invención y no perjudiciales a quienes reciban el mismo. Típicamente, los portadores serán agua o solución salina la cual será estéril y estará libre de pirógenos. En una modalidad preferida, la enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G se almacena como un polvo liofilizado listo para constituirse con una solución para inyección, según se requiera. Típicamente, el contenido de un frasco de enzima liofilizada se reconstituye con solución salina normal estéril (0.9% p/v) inmediatamente antes de su uso. En una modalidad preferida, la formulación de la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G también contiene lactosa como un ingrediente inactivo, excepto para pacientes con hipersensibílidad a lactosa. Típicamente, la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G se administra a un individuo a una dosis de aproximadamente 50 unidades por kg de peso corporal (1 unidad corresponde a la actividad de enzima que escinde 1 micromol de MTX por minuto, a 37°C) por vía intravenosa durante 5 minutos.

Se apreciará que la enzima se puede administrar a dosis menores de aproximadamente 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, OJ, 0.8, 0.9, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ó 45 unidades por kg/peso corporal. También se apreciará que la enzima se puede administrar a dosis mayores de aproximadamente 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150 ó 200 o más unidades por kg/peso corporal. La frecuencia, los tiempos y las dosificaciones de administración de la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G se pueden determinar por el médico utilizando el conocimiento de las propiedades de la enzima, los niveles de la enzima antifolato en el paciente y el grado de cualquiera de los síntomas de toxicidad en el paciente. Se aprecia que las proteínas y péptidos se pueden administrar utilizando un sistema de administración de medicamento de liberación sostenida inyectable. Estos se diseñan específicamente para reducir la frecuencia de las inyecciones. Un ejemplo de dicho sistema es Nutropin Depot el cual encapsula hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH) en microesferas biodegradables que, una vez inyectadas, liberan lentamente rhGH por un período prolongado. Un método alternativo de suministro de proteínas y péptidos es el sistema inyectable ReGel que es termosensíble. Por debajo de la temperatura corporal, ReGel es un líquido inyectable mientras que a temperatura corporal forma de inmediato un depósito de gel que se erosiona lentamente y se disuelve en polímeros biodegradables, seguros y conocidos.

El medicamento activo se libera con respecto al tiempo y conforme se disuelven los bíopolímeros. Se aprecia adicionalmente que a una persona se le puede administrar un polinucléotido que codifica para la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G, lo que genera una expresión in vivo de la enzima. Los vectores y métodos adecuados son bien conocidos por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, Schepelmann et al (2005) describen terapia sistémica del promedicamento enzimático dirigido al gen utilizando un adenovirus dirigido para expresar carboxipeptidasa G2. El individuo que va a ser tratado puede ser cualquier individuo que se beneficia de dicho tratamiento. De manera típica y preferible, el individuo que va a ser tratado es un ser humano. No obstante, los métodos de la invención se pueden utilizar para tratar a mamíferos, tales como vacas, caballos, cerdos, borregos, gatos y perros. De esta manera, los métodos tienen uso en medicina tanto humana como veterinaria. En una modalidad, el método para combatir toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente comprende además administrar un agente de rescate de la vía folato al individuo. Por un "agente de rescate de la vía folato" los inventores incluyen el significado de un agente que puede rescatar la vía folato la cual está bloqueada por el compuesto antifolato. El agente de rescate de la vía folato utilizado más comúnmente es leucovorina, la sal de calcio del ácido 5- formiltetrahidrofólico. Los agentes de rescate alternativos pueden incluir las sales de ácido 5-formiltetrahidrofólico, timidina y ácido fólico. Típicamente, si el compuesto antifolato es un inhibidor de DHFR o de GARFT, el agente de rescate de la vía folato es leucovorina mientras que si el compuesto antifolato es un inhibidor de TS, el agente de rescate de la vía folato es timidina. Por ejemplo, se sabe que Edatrexato es un inhibidor de DHFR, se sabe que Lometrexol es un inhibidor de GARFT, y se sabe que Pemetrexed es un antifolato multiblanco inhibidor de DHFR, GARFT y TS (Cuadro 2, Purcell & Ettinger, 2003). De esta manera, se puede determinar fácilmente el agente de rescate de la vía folato apropiado. Se aprecia que actualmente se practica de rutina administer ácido fólico y vitamina B12 a un paciente antes de Pemetrexed. En una modalidad, al individuo se le administra la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G antes del agente de rescate de la vía folato. De manera alternativa, al individuo se le puede administrar el agente de rescate de la vía folato antes de la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. En otra modalidad adicional, al individuo se le puede administrar el agente de rescate de la vía folato y la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G de manera sustancialmente simultánea. Los compuestos antifolato pueden ser útiles para tratar una gama de cánceres y son capaces de combatir la toxicidad asociada con estos compuestos lo que incrementa su valor terapéutico.

La invención incluye un método para tratar el cáncer que comprende administrar un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente al individuo y posteriormente administrar al individuo una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. La administración subsecuente de la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G es para combatir la toxicidad causada por el compuesto antifolato como se describió anteriormente. De esta manera, la invención incluye un método para tratar el cáncer que comprende administrar un compuesto antífolato de fórmula I como se definió anteriormente al individuo y combatir la toxicidad causada por el compuesto antifolato al administrar una enzima que tiene actividad carboxipeptidasa G. Los cánceres los cuales pueden ser tratados por los compuestos antifolato de fórmula I son bien conocidos por una persona experta en la técnica, algunos de los cuales se discuten por McGuire (2003); Kisliuk (2003); y Purcell y Ettinger (2003), así como en las referencias específicas mencionadas en la presente invención. La invención incluye un método para tratar cáncer, el método comprende administrar Pemetrexed al individuo y combatir la toxicidad causada por Pemetrexed al administrar una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. El cáncer que va a ser tratado por la administración de Pemetrexed puede ser leucemia, mesotelioma, NSCLC, cáncer de pulmón, de mama, de colon, de páncreas, de riñon, de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y de cuello, cáncer urotelial o carcinoma cervical (Martin ef al (2003); Thodtmann ef al (2003); Ettinger ef al (2002); Calvert (2004)). La invención incluye un método para tratar el cáncer, el método comprende administrar AAG113-161 al individuo y combatir la toxicidad causada por AAG113-161 al administrar una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. El cáncer que va a ser tratado por administración de AAG113-161 puede ser leucemia, mesotelioma, NSCLC, cáncer de mama, de colon, de páncreas, de riñon, de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y de cuello, cáncer urotelial o carcinoma cervical. La invención incluye un método para tratar el cáncer, el método comprende administrar Edatrexato al individuo y combatir la toxicidad causada por Edatrexato al administrar una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. El cáncer que va a ser tratado por administración de Edatrexato puede ser cáncer de mama, de pulmón, de cabeza y de cuello, carcinoma de célula escamosa, NSCLC, linfoma no de Hodgkin, tumor de célula germinal, mesotelioma pleural o histiocitoma fibroso maligno (Kuriakose et al (2002); Dreicer et al (1997); Pisters et al (1996), y Meyers et al (1998-9). La invención incluye un método para tratar el cáncer, el método comprende administrar Lometrexol al individuo y combatir la toxicidad causada por Lometrexol al administrar una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. El cáncer que va a ser tratado por administración de Lometrexol puede ser un sarcoma de tejido blando, NSCLC, cáncer de mama, de cabeza y de cuello o melanoma.

El método de tratamiento del cáncer también puede comprender la administración de un agente anticáncer adicional al individuo. Los agentes quimíoterapéuticos adecuados para el cáncer pueden incluir: agentes alquilantes incluyendo nitrógeno mostazas tales como mecloretamína (HN2), cíclofosfamida, ifosfamida, melphalan (L-sarcolisina) y clorambucil; etíleniminas y metilmelaminas tales como hexametilmelamina, tiotepa; alquilo sulfonatos tal como busulfan; nitrosoureas tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU) y estreptozocina (estreptozotocina); y tríazenos tal como decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoímidazol-carboxamida); Antimetabolitos incluyendo análogos de pírimidina tales como fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), floxuridina (fluorodeoxiuridina; FUdR) y citarabina (citosína arabinósido); y análogos de purina e inhibidores relacionados tales como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2'-deoxicoformicina). Los productos naturales incluyen alcaloides vinca tales como vínblastina (VLB) y vincristina; epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como dactinomícina (actinomicína D), daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C); enzimas tal como L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica tal como interferón alfenomas. Agentes misceláneos incluyendo complejos de coordinación de platino tal como cisplatina (c/s-DDP) y carboplatina; antracenediona tal como mitoxantrona y antraciclina; urea sustituida tal como hidroxiurea; derivado de metil hidrazina tal como procarbazina (N-metilhidrazina, MIH); y supresor adrenocortical tal como mitotano (o,p'-DDD) y aminoglutetimida; taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas de hormona tales como flutamida y tamoxifen. Sin embargo, los agentes anticáncer preferidos incluyen cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, vinorelbina, doxorubicina, epirubicina, ciclofosfamida, paclítaxel, irinotecan, gemcitabina y docetaxel. Un segundo aspecto de la invención proporciona el uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento para combatir la toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente en un primer aspecto de la invención. Las preferencias respecto al compuesto antifolato de fórmula I en este aspecto y en aspectos subsecuentes de la invención son como se describieron anteriormente con respecto al primer aspecto de la invención. Los compuestos de fórmula I que se pueden mencionar incluyen Pemetrexed, AAG113-161 , Edatrexato y Lometrexol. Pemetrexed es más preferible. La invención incluye el uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G para combatir la toxicidad en un individuo quien tiene uno o más signos clínicos, síntomas o marcadores de toxicidad causados por dicho compuesto, como se describió anteriormente. En una modalidad, la invención incluye el uso de la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento para combatir toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente en un individuo a quien se ha administrado un agente de rescate de la vía folato. Al individuo se le puede administrar el agente de rescate de la vía folato antes del medicamento o al individuo se le puede administrar el agente de rescate de la vía folato después del medicamento, o al individuo se le puede administrar el agente de rescate de la vía folato y el medicamento de manera sustancialmente simultánea. Las preferencias con respecto al agente de rescate de la vía folato en este y en aspectos subsecuentes de la invención son como se describieron anteriormente con respecto al primer aspecto de la invención. Un tercer aspecto de la invención proporciona el uso de un agente de rescate de la vía folato en la preparación de un medicamento para combatir la toxicidad ocasionada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente en un individuo al que se le administra una enzima que tiene actividad carboxipeptidasa G. Al individuo se le puede administrar la enzima antes del medicamento, o al individuo se le puede administrar la enzima después del medicamento, o al individuo se le puede administrar la enzima y el medicamento sustancialmente de manera simultánea. Un cuarto aspecto de la invención proporciona el uso de una enzima que tiene actividad carboxipeptidasa y un agente de rescate de la vía folato en la preparación de un medicamento para combatir la toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente.

La invención incluye el uso como se definió anteriormente en el segundo, tercero y cuarto aspectos de la invención para combatir la toxicidad ocasionada por un compuesto antifolato de fórmula I en un individuo que se trata para un cáncer por la administración del compuesto antifolato, como se detalló anteriormente. Un quinto aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente en la preparación de un medicamento para combatir el cáncer en un individuo al que se le administra subsecuentemente una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. El tipo de cáncer que se puede combatir por cualquier compuesto antifolato específico de fórmula I se conoce por la persona experta en la técnica y se puede determinar por el médico. En una modalidad, al individuo también se le administra un agente de rescate de la vía folato. La enzima que tiene actividad carboxipeptidasa G se puede administrar antes, después, o subsecuentemente de manera simultanea con el agente de rescate de la vía de folato. En una modalidad, la invención incluye el uso de Pemetrexed en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un individuo en quien se administra una enzima que tiene actividad de carboxipeptidas G. La invención también incluye el uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento para combatir la toxicidad causada por Pemetrexed en un individuo al que se le ha administrado Pemetrexed para tratar el cáncer. Los cánceres que se pueden tratar por la administración de Pemetrexed se conocen en la técnica e incluyen aquellos anteriormente listados. De manera similar, los cánceres que pueden ser tratados por la administración de un medicamento que contiene AA113-161 , Edatrexato, Lometrexol y otros compuestos antífolato de formula I se conocen en la técnica, e incluyen aquellos anteriormente listados. La invención de esta manera incluye el uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento para complementar la terapia de un cáncer que va ser tratado por la administración de un compuesto antifolato de fórmula I. Un sexto aspecto de la invención proporciona un método in vitro de escisión de la porción L-glutamato terminal de un compuesto de fórmula I como se definió anteriormente, el método comprende poner en contacto al compuesto con una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. Un séptimo aspecto de la invención proporciona un método para determinar la tasa y/o grado de escisión de un compuesto de fórmula I como se definió anteriormente por una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G, el método comprende: proporcionar un compuesto de fórmula I, poner en contacto el compuesto de fórmula I con una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G bajo condiciones tales que pueda llevarse a cabo la escisión del compuesto, y monitorear la tasa y/o el grado de escisión del compuesto de fórmula I con el tiempo. En una modalidad, la etapa de suministro comprende proporcionar una cantidad conocida o concentración del compuesto de fórmula I. En una modalidad, la etapa de monitoreo comprende monitorear la cantidad y/o la concentración del compuesto de fórmula I con respecto al tiempo. De manera adicional o alternativa, la etapa de monitoreo comprende monitorear la cantidad y/o concentración de uno o más productos de descomposición del compuesto de fórmula I con el tiempo. Se aprecia que el método para determinar la tasa y/o el grado de escisión se puede realizar in vitro o se puede realizar in vivo. El método se puede utilizar ya sea in vivo o in vitro para monitorear el nivel del compuesto de fórmula I que permanece sin escisión después del tratamiento con la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. De esta manera, se puede utilizar el método para monitorear la eficacia de la enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G para combatir la toxicidad relacionada con el compuesto de fórmula I. El método puede comprender además determinar si se requiere una dosis adicional de la enzima que tenga actividad de carboxipeptidasa G con el fin de reducir la cantidad del compuesto de fórmula I a un nivel predeterminado, típicamente un nivel el cual no provoca toxicidad. También se puede determinar la cantidad de enzima que se va a administrar en la dosis adicional. Por lo tanto, el método también puede comprender poner en contacto el compuesto de fórmula I con una dosis adicional de la enzima que tiene actividad de carboxípeptidasa G bajo condiciones tales que pueda llevarse a cabo la escisión del compuesto de fórmula I. Un octavo aspecto de la invención proporciona un sistema terapéutico (o se puede denominar como un "equipo de partes") que consiste o que comprende un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente y una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. Opcionalmente, el sistema terapéutico también puede contener un agente de rescate de la vía folato. Preferiblemente, el sistema terapéutico contiene un compuesto preferido de fórmula I como se definió anteriormente en el primer aspecto de la invención, de manera más preferible Pemetrexed. De manera aún más preferible, el sistema terapéutico contiene glucarpidasa o un derivado del mismo que tiene actividad de carboxipeptidasa G, como se definió anteriormente en el primer aspecto de la invención. Los agentes de rescate de la vía de folato preferidos también son como se definen en el primer aspecto de la invención. El sistema terapéutico o el equipo de partes de manera adecuada puede contener tanto el compuesto de fórmula I como la enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G y opcionalmente el agente de rescate de la vía folato, empacado y presentado en una formulación adecuada ya sea para almacenamiento o para uso. Así, por ejemplo, la glucarpidasa puede ser un polvo liofilizado listo para ser reconstituido como una solución para inyección o puede estar reconstituido de antemano como una solución para inyección. De manera similar, Pemetrexed puede ser un polvo liofilizado listo para ser reconstituido como una solución para inyección o puede estar reconstituido de antemano como una solución para inyección. Típicamente, el compuesto de fórmula I y la enzima son para administración separada en un régimen de tratamiento particular y de esta manera se empacan o formulan por separado. La enzima y el agente de rescate de la vía folato se pueden administrar juntos y por lo tanto se pueden formular para coadministración. Un sistema terapéutico preferido o equipo, como se definió anteriormente, comprende Pemetrexed y Glucarpidase, y opcionalmente pero preferiblemente, ácido fólico y/o vitamina B-?2. Un noveno aspecto de la invención proporciona un método para escisión de un compuesto que comprende un fragmento estructural de fórmula IV, en la que la línea ondulada indica el punto de unión del fragmento estructural; y R3 a R6 son como se definieron en la presente invención anteriormente; o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, el método comprendiendo poner en contacto el compuesto que comprende el fragmento estructural de fórmula IV con una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. Las preferencias para los grupos R3 a R6 son las mismas con respecto al fragmento estructural de fórmula IV puesto que se encuentran con respecto a los compuestos de fórmula I. A este respecto, los fragmentos estructurales particulares de fórmula IV que se pueden mencionar incluyen aquellos en los cuales R4 y R5 representa H y R6 representa CH2CH2C(O)OH o CH2C(=CH2)C(O)OH. Las preferencias para la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G son las mismas que para el primer aspecto de la invención como se describió anteriormente. En una modalidad, el método se puede llevar a cabo in vitro. En una modalidad alternativa, el método se puede llevar a cabo in vivo. Típicamente, el compuesto que comprende el fragmento estructural de fórmula IV es un compuesto antifolato.

En una modalidad cuando el compuesto antifolato que comprende un fragmento estructural de fórmula IV se administra a un individuo en el curso del tratamiento médico o de alguna otra manera, la invención proporciona un método para combatir la toxicidad causada por el compuesto antifolato que comprende el fragmento estructural de fórmula IV, el método comprendiendo administrar al individuo una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. De esta manera, la invención incluye el uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento para combatir la toxicidad causada por un compuesto antifolato que comprende un fragmento estructural de fórmula IV. En el contexto de usos médicos de este noveno aspecto de la invención, cuando el compuesto que comprende el fragmento estructural de fórmula IV es un compuesto antifolato, las preferencias para el uso de los agentes de rescate de la vía folato, las formulaciones farmacéuticas, los tiempos y niveles de administración, los pacientes y enfermedades que van a ser tratados, etc., son los mismos que para el primer aspecto de la invención como se describió anteriormente. Todos los documentos a los que se hace referencia en la presente invención se incorporan en este documento en su totalidad como referencia. La lista o discusión de un documento publicado anteriormente en esta especificación no necesariamente debe tomarse como un reconocimiento de que dicho documento es parte del estado de la técnica o es de conocimiento general común. La invención ahora se describirá con mayor detalle con referencia a las siguientes estructuras químicas, figuras y ejemplos. Las siguientes estructuras muestran la estructura química de cinco sustratos de CPG2. Pemetrexed, AAG113-161 , Edatrexato, Lometrexol y metotrexato (técnica anterior).

Pemetrexed AAG113-161 Lometrexol Edatrexato Metotrexato (técnica anterior) La figura 1 es una secuencia de aminoácidos de glucarpidasa (SEQ. ID. NO: 1 ). La figura 2 es una gráfica que muestra diferencias espectrales en la absorbancía de Pemetrexed pre- y post- la adición de glucarpidasa.

La figura 3 es una gráfica de una gráfica de Michaelis-Menten para MTX (sustrato de la técnica anterior). La figura 4 es una gráfica de una gráfica de Michaelis-Menten para Pemetrexed (experimento 1 ). La figura 5 es una gráfica de una gráfica de Michaelis-Menten para Pemetrexed (experimento 2).

EJEMPLO 1 Determinación de la propiedad cinética de la escisión de Pemetrexed (Alimta®) por glucarpidasa (Voraxaze™) Resumen La escisión de Pemetrexed por glucarpidasa (Voraxaze™) se evaluó in vitro por la medición del cambio en el espectro de absorción a 250 nm. Se encontró que Pemetrexed se escindía por glucarpidasa con las cinéticas de reacción similares a aquellas de la escisión de metotrexato por la misma enzima. Esto indica que la glucarpidasa puede tener utilidad clínica como terapia de intervención para la toxicidad por Pemetrexed y puede tener un papel a largo plazo en el uso planeado con Pemetrexed en varias condiciones malignas.

Objetivo del estudio Determinación de las propiedades cinéticas de Pemetrexed y medición de la afinidad (Km) y constante de velocidad catalítica (kcat) de Pemetrexed suministrado por Eli Lilly utilizando glucarpidasa (Voraxaze™).

Preparación de qlucarpídasa Un vial con 1000 unidades de glucarpidasa liofilizada (Protherics, lote CAMR 004/1991 ) se resuspendió en 1 ml de 50 mM de Tris-HCl pH 7.4 que contiene 0.2 mM de Zn2+, luego se diluyó 1/20 seguido por 1/50 para producir una solución de trabajo 1/1000 de la concentración original, es decir 1 U/ml. 10 µl de la solución de trabajo, 0.01 unidades, se utilizaron por ensayo.

Método de ensavo El siguiente ensayo cinético previamente validado de parámetros catalíticos para glucarpidasa, utilizando metotrexato (MTX) como sustrato se utilizó para determinar las propiedades cinéticas de la escisión de Pemetrexed por glucarpidasa.

Generalidades del ensavo Este procedimiento describe el ensayo de la actividad de carboxipeptidasa G2 por espectrofotometría a 320 nm, utilizando MTX como sustrato (Sherwood et al, 1985).

La actividad de carboxipeptidasa se determina al medir velocidad de la hidrólisis del MTX a 37°C. La mezcla reactiva (1000 µl) contiene Tris/HCl (pH 7.4), MTX y ZnAc2.2H2O. La reacción se inicia mediante la adición de la solución que contiene la enzima a ser ensayada y la absorbancia a 320 nm se monitorea en el espectrofotómetro Hitachi U-2010. La velocidad de hidrólisis se calcula de conformidad con la pendiente de la sección lineal de la curva A320 = f(tiempo).

En este ensayo, una unidad de actividad de carboxipeptidasa (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la hidrólisis de un micromol del MTX en 1 minuto, en 1 ml de la mezcla reactiva a 37°C. La actividad de carboxipeptidasa (CA) que se expresa en U.ml"1 o en µmoles. min'1. mi"1 se calcula como sigue: Ecuación 1 en la que, CA = actividad de carboxipeptidasa; ?A = la variación de la absorbancia medida en el período de tiempo seleccionado para medición de la actividad; Dil = la dilución de la muestra a ser ensayada; ?tiempo = la duración del período seleccionado para medir la actividad (min); Vreact = el volumen de la mezcla reactiva; Vsam = el volumen de la mezcla utilizada para la medición; y ??M320 = la variación del coeficiente de extinción molar (en M" 1 c -,-m. "1).

La variación del coeficiente de extinción molar (?SM320) del metotrexato es -8200 M'1.cm'1, lo cual significa que, para una ruta óptica de 1cm, la hidrólisis total de una solución 1 M de metotrexato se acompaña por una disminución en 8200 de la absorbancia a 320 nm. Vréac,= 1000 µl Vsam = 50 µl ?A/?tiempo = pendiente de la línea obtenida Si estos valores se reemplazan en la ecuación 1 , se obtiene lo siguiente: Pendiente x Di? x 20 _ , ,- , -. -.-^ n , CA = = -Pendiente x Dil x 24_>9 = - Pendiente x Dii x K 8 2 Ecuación 2 Con K = 2.439 La actividad específica de SA (que se expresa en U.mg"1) se calcula como sigue: PC Ecuación 3 SA = la actividad específica; CA = actividad de carboxipeptidasa (en U.ml"1); PC = concentración de la proteína (mg/ml) determinada por espectrofotometría de UV.

Procedimiento del ensayo Las muestras se diluyen en el regulador de pH para dilución a 40°C justo antes del ensayo. La actividad (U/ml) de una muestra a una dilución dada se mediante el promedio de las dos réplicas. Estas dos pruebas se llevan a cabo utilizando dos diluciones independientes. La segunda dilución de la muestra también se prepara justo antes del ensayo.

La prueba de actividad del producto secado por congelamiento se lleva a cabo en 10 grupos de 2 viales secados por congelamiento de CPG2 cada uno suspendido en 1 ml de agua para obtener una actividad de carboxipeptidasa G2 cercana a 1000 U/ml. Las diluciones adicionales en el regulador de pH para dilución (+ lactosa) de 2000x, 2500x y 3000x se pueden utilizar para las mediciones. Se evaluó un control negativo (sin enzima). La A320 se midió y se encuentra entre 0.80 y 1.00 y no varía en más de 0.01 unidades en 1 minuto.

La actividad de carboxipeptidasa se midió mediante la adición de 50 µl de la muestra diluida a ser ensayada con la muestra de célula, mezclar, y medir la A320 una vez cada segundo por 40 segundos.

- Pendiente x 2 439 (S = pendiente) se calcula para los primeros 40 segundos lineales de la gráfica A320 = f(tiempo), y es entre 0.15 y 0.575 U/ml. Si el valor obtenido no se encuentra dentro de este intervalo, el ensayo se repitió con una dilución más apropiada de la muestra. La actividad de carboxipeptidasa se definió como: CA = - Pendiente x Dii x K Con K = 2.439: La actividad específica de SA (expresada en U.mg"1): Medición de la escisión de Pemetrexed En este ejemplo, la velocidad del recambio para una cantidad conocida, fija de glucarpidasa se midió durante un intervalo de nueve concentraciones diferentes del sustrato: 60 µM, 40 µM, 20 µM, 16 µM, 12 µM, 10 µM, 8 µM, 6 µM y 4 µM. La velocidad de escisión en cada concentración diferente del sustrato se midió por triplicado. Las concentraciones del sustrato se eligieron para abarcar un intervalo que provee datos tanto de los niveles de saturación como de los niveles limitantes del sustrato con el objeto de permitir el ajuste preciso de la curva. Las mediciones de velocidad se realizaron mediante la evaluación del cambio en la absorbancia por Pemetrexed a 250 nm utilizando un espectrómetro con termostato de Hitachi U2010 s/n 121-01222 con el software v1.2 para soluciones UV. Un ejemplo de los cambios observados se muestran en la figura 2. La sustracción del pre-espectro a partir del post-espectro muestra un cambio máximo a 250 nm. Para una solución 100 µM, la ?A250 máxima es de 0.487. Por lo tanto el cambio en el coeficiente de extinción molar para una solución 1 M podría ser de 4870. Pemetrexed no fue soluble en regulador de pH acuoso y por lo tanto se disolvió en DMSO a 5.97 mg/ml para producir una solución de almacenamiento de 10 mM, 1-10 µl la cual se utilizó para preparar recipientes que contiene 10-60 µM de Pemetrexed; para la preparación de las células que contienen <10 µM, se llevó a cabo una dilución adicional 1/10 en DMSO para producir una solución de almacenamiento 1 mM. En todos los casos, el volumen de DMSO en el recipiente se mantuvo constante a 10 µl mediante la adición de DMSO rojo como se requiera. Los estudios previos han demostrado que la presencia de 1% v/v de DMSO no es inhibidora a la glucarpidasa. La afinidad (Km) y constante de velocidad de la muestra (Vma?) de cada serie de datos se calculó de manera directa lineal utilizando el software "Enzfitter" (Biosoft, Cambridge, RU) con el molde Michaelis-Menten.

La constante de velocidad catalítica específica, kcat, se calculó mediante la división del valor Vma? calculado por la concentración molar conocida de la enzima de la muestra medida de glucarpídasa.

Resultados La figura 3 muestra la acción de metotrexato con glucarpidasa sobre un intervalo de concentración y ajustado para demostrar las cinéticas de Míchaelis Menten. Utilizando el programa ?nzfitter' se puede calcular una Km (constante de afinidad) para el metotrexato, y al dividir el Vmax calculado por la concentración conocida de la enzima (la concentración inicial de glucarpidasa fue de 2.15 mg/vial) se calculó la kcat. Las figuras 4 y 5 muestran datos equivalentes para dos estudios sobre Pemetrexed. Los resultados a partir de cada experimento se muestran a continuación, y se resumen en el cuadro I.

Cinética enzimática para el metotrexato Parámetros ajustados Vmax (limitando la velocidad máxima): 0.067 ± 0.004 (valor del error estándar) Ks (constante de disociación para el complejo ES): 10.26 ± 1.81 (valor del error estándar) Cálculo de kcat ?Emax = 8300 a 320 nm para MTX. Por lo tanto la Vmax es de 0.067/8300 = 8.07 x 10~6 mol/minuto para la cantidad de enzima utilizada. La enzima utilizada fue 10 µl de 1.08 µg/ml en 1 ml de la mezcla de reacción, =1.08 x 10"8g = 1.295 x 10 10 M. Por lo tanto kcat es 1 x 8.07 x 10'6 = 62316/min = 1038.6/seg 1.295 x 10"10 Cinéticas enzimáticas para Pemetrexed (Experimento I) Parámetros ajustados Vmax: 0.099/min ± 0.008 Ks: 14.44 µM ± 2.925 Cálculo de kcat La conversión de 1 ml que contiene 10 µl de Pemetrexed 10 mM produce un cambio en la DO de 0.487AU. Por lo tanto, el cambio en el coeficiente de extinción molar es de 4870 Por lo tanto la Vmax es de 2.05 x 10"5L/min para la cantidad de enzima utilizada. La enzima utilizada fue 10 µl de 2.15 µg/ml, =2.15 x 10"8g = 2.29 x 10"10 M.

Por lo tanto la kcat es de 1 x 2.05 x 10'5 = 79150/min = 1319/seg 2.59 x 10"10 Cinéticas enzimáticas para Pemetrexed (Experimento II) Parámetros ajustados Vmax: 0.174/min ± 0.028 Ks: 36.286µM ± 9.522 Cálculo de kcat La conversión de 1 ml que contiene 10 µl de Pemetrexed 10 mM produce un cambio en la DO de 0.487AU. Por lo tanto, el cambio en el coeficiente de extinción molar es de 4870 Por lo tanto la Vmax es de 0.174/4870 = 3.57 x 10"5L/min para la cantidad de enzima utilizada. La enzima utilizada fue 10 µl de 2.15 µg/ml en 1 ml de la mezcla de reacción, =2.15 x 10"8g = 2.59 x 10"10 M. Por lo tanto la kcat es de 1 x 3.57 x 105= 137840/mín =2297/seg 2.59 x 10 10 CUADRO I Resumen de los resultados cinéticos Discusión Las medias de los valores obtenidos para Km y kcat son 25.4 µM y 1808s"1 respectivamente. Ambas demostraron que Pemetrexed es un sustrato muy bueno para la glucarpidasa y sugieren que la glucarpidasa (Voraxaze™) podría ser utilizada clínicamente para el control de los niveles de Pemetrexed en la circulación. Bajo las mismas condiciones y utilizando el mismo lote de enzima, se determinaron los valores de 10.3 µM para Km y 1038 s"1 para kcat del metotrexato. Aunque la Km determinada para Pemetrexed fue mayor que aquélla para MTX es comparable con la de 5-metil tetrahidrofolato, el cual se ha demostrado que es eliminado por la glucarpidasa, incluso en la presencia de niveles muy elevados de MTX, y la alta kcat medida no sugiere que la glucarpidasa deba ser de valor clínico para controlar los niveles en suero de Pemetrexed.

EJEMPLO 2 Identificación de nuevos sustratos para lucarpidasa A: AAG113-161) AAG113-161 es su inhibidor dual de DHFR y TS. AAG113-161 se pone en contacto con glucarpidasa in vitro y se encontró que es un sustrato de la glucarpidasa.

La deglutamilación de AAG113-161 por glucarpidasa se midió espectrofotométricamente. Se preparó una solución de almacenamiento de 10 mM AAG113-161 es decir 100 mM Tris-HCl pH 7.3 y se utilizó para preparar una serie de diluciones de 0-100 µM en 100 mM Tris-HCl pH 7.3. 990 µl de cada dilución se colocaron en un recipiente de cuarzo y se pre-calentaron a 37°C. 10 µl de solución enzimática se añadieron para iniciar la reacción y el progreso de la reacción se siguió mediante la medición de la velocidad de cambio en la absorbancia a una longitud de onda adecuada. El cambio en el coeficiente de extinción de AAG113-161 después de la conversión completa de una solución 100 µM por un exceso de glucarpidasa se midió con el objeto de calcular el cambio en el coeficiente de extinción debido a la conversión completa de 100 nmoles de AAG 113-161. Con estos datos, las velocidades medidas se convirtieron a valores de µmol/min. La medición de la velocidad de reacción en un intervalo de concentraciones de sustrato, a partir de 1-100 µM permitió determinar las Km y kcat para la enzima utilizando el software de cómputo Enzfitter.

B: Edatrexato Edatrexato es un inhibidor de DHFR (Ciba Geigy). Edatrexato se pone en contacto con glucarpidasa in vitro y se encontró que es un sustrato de la glucarpidasa. La deglutamílación de Edatrexato por la glucarpidasa se midió espectrofotométricamente. Se preparó una solución de almacenamiento de 10 mM de Edatrexato en 100 mM Tris-HCl pH7.3 y se utilizó para preparar una serie de diluciones de 0-100 µM en 100 mM Tris-HCl pH 7.3. 990 µl de cada dilución se colocaron en un recipiente de cuarzo y se pre-calentaron a 37°C. 10 µl de la solución enzimática se añadieron para iniciar la reacción y el progreso de la reacción se siguió mediante la medición de la velocidad de cambio en la absorbancia a una longitud de onda adecuada. El cambio en el coeficiente de extinción de Edatrexato después de la conversión completa de una solución 100 µM por un exceso de glucarpidasa se midió con el objeto de calcular el cambio en el coeficiente de extinción debido a la conversión completa de 100 nmoles de Edatrexato. Con estos datos, las velocidades medidas se convirtieron a valores de µmol/min. La medición de la velocidad de reacción en un intervalo de concentraciones de sustrato, a partir de 1-100 µM permitió determinar las Km y kcat para la enzima utilizando el software de cómputo Enzfitter.

E: Lometrexol Lometrexol es un inhibidor de GARFT (Tularik, inventado por Lilly). Lometrexol se pone en contacto con glucarpidasa in vitro y se encontró que es un sustrato de glucarpidasa. La deglutamílación de Lometrexol por glucarpidasa se midió espectrofotométricamente. Se preparó una solución de almacenamiento de 10 mM Lometrexol en 100 mM Tris-HCl pH 7.3 y se utilizó para preparar una serie de diluciones de 0-100 µM en 100 mM Tris-HCl pH 7.3. 990 µl de cada dilución se colocaron en un recipiente de cuarzo y se pre-calentaron a 37°C. 10 µl de solución enzimática se añadieron para iniciar la reacción y el progreso de la reacción se siguió mediante la medición de la velocidad de cambio en la absorbancía a una longitud de onda adecuada. El cambio en el coeficiente de extinción de Lometrexol después de la conversión completa de una solución 100 µM por un exceso de glucarpidasa se midió con el objeto de calcular el cambio en el coeficiente de extinción debido a la conversión completa de 100 nmoles de Lometrexol. Con estos datos, las velocidades medidas se convirtieron a valores de µmol/min. La medición de la velocidad de reacción en un intervalo de concentraciones de sustrato, a partir de 1-100 µM permitió determinar las Km y kcat para la enzima utilizando el software de cómputo Enzfitter.

EJEMPLO 3 Rescate de la toxicidad de Pemetrexed por administración de qlucarpidasa A un paciente a quien se le ha administrado Pemetrexed y que tiene niveles plasmáticos tóxicos de Pemetrexed se le administra una dosis de 50 unidades por kg de peso corporal de glucarpídasa por inyección intravenosa en un período de aproximadamente 5 minutos. La concentración plasmática de Pemetrexed en el paciente se reduce a niveles no tóxicos.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento útil para combatir la toxicidad en un individuo ocasionada por un compuesto antifolato de fórmula I, en donde R1 representa NH2, OH o CH3; R2 representa NH2 o alquilo de C-|.4; el grupo B representa un fragmento estructural de fórmula lia, llb, lie, lid o Me, lid ¡le en dichos grupos las líneas punteadas indican el punto de fusión del anillo con el anillo pirimidinilo y las líneas onduladas indican el punto de unión del heterociclo bícíclíco con el resto de la molécula; R7a a R7e independientemente representan H o alquilo de C?- ; A1 representa C(R8a) o N; A2 representa CH o N; A3 representa C(H)R8b, NR8c o S; A4 y A5 independientemente representan CH2, NH, O ó S; el grupo B1-B2 representa CH-CH o C=C; R8a a R8c independientemente representan H o alquilo de C-?- , o R8c representa C(0)R8d; R8d representa H o alquilo de d-4; R3 representa H, alquilo de C?-6, alquenilo de C3.6 o alquínilo de C3.6; R4 representa H o uno o dos sustituyentes seleccionados a partir de halo, alquilo de C- y alcoxi de C?-4, o R4, junto con R5, cuando R4 se une en una posición que es orto- a la posición a la cual está unida la porción C(O)NR5, representa n-alquileno de C?_2; R5 representa H o alquilo de C-?.4, o R5, junto con R4, cuando R4 se une en una posición que es orto- a la posición a la cual está unida la porción C(O)NR5, representa n-alquíleno de d-2; R6 representa -CH2C(R9a)(R9b)-D; R9a y R9b independientemente representan H o alquilo de C-|.4l o R9a y R9b juntos representan =C(H)R10; R10 representa H o alquilo de C?- ; D representa C(0)OH, tetrazol-5-ilo, (CH2)0-rNHR11, o, cuando R9a y R9b juntos representan =C(H)R10, entonces D también puede representar H, o D representa un fragmento estructural de fórmula Illa o lllb, Illa lllb ; en donde las líneas onduladas indican el punto de unión de los fragmentos estructurales; R1 representa H o C(O)R12; R12 representa H o fenilo sustituido por C(Q)OH y opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados a partir de grupos halo, alquilo de C?_4 y alcoxi de C^; y alquilo, alquenilo y alquinilo, así como la parte alquilo de los grupos alcoxi, puede estar sustituida por uno o más átomos halo; o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. 2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto antifolato de fórmula I se selecciona a partir de Pemetrexed, AAG113-161 , Edatrexato y Lometrexol. 3.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde el individuo tiene uno o más marcadores clínicos de toxicidad ocasionada por el compuesto antifolato. 4.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde el marcador clínico de toxicidad es un nivel plasmático del compuesto antifolato mayor que un nivel predeterminado indicando toxicidad en un tiempo dado después de la administración del compuesto. 5.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde el nivel plasmático sanguíneo predeterminado del compuesto antifolato que indica toxicidad es de 1µM a las 24 horas después de la administración del compuesto. 6.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el individuo tiene uno o más síntomas clínicos de toxicidad ocasionada por el compuesto antifolato. 1.- El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde el síntoma clínico de toxicidad ocasionada por el compuesto antifolato se selecciona a partir de anemia, anorexia, astenia, deshidratación, diarrea, fatiga, fiebre, hepatotoxicidad, hiperbílirubinemia, leucopenia, mucositis, mielosupresión, náusea, neurotoxicidad, neutropenia, sepsis neutropénica, parastesia, salpullido, transaminitís reversible, septicemia, estomatitis, trombocitopenia y vómito. 8.- El uso de un compuesto antifolato de fórmula I como se reclama en la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en la preparación de un medicamento útil para combatir el cáncer en un individuo, en donde el medicamento es adaptado para ser admínistrable previo a una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. 9.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde un agente de rescate de la vía del folato es adicionalmente administrable al individuo. 10.- El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el folato es administrable antes de la enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G. 11.- El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el agente de rescate de la vía del folato es administrable después de la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. 12.- El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el agente de rescate de la vía del folato y la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G son administrables sustancialmente de manera simultánea. 13.- El uso de un agente de rescate de la vía del folato en la preparación de un medicamento útil para combatir la toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió en la reivindicación 1 ó 2 en un individuo, en donde una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G es adicionalmente adminístrable. 14.- El uso de una enzima que tiene actividad de carboxípeptidasa G y un agente de rescate de la vía del folato en la preparación de un medicamento útil para combatir la toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula I como se definió en la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 15.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en donde el agente de rescate de la vía del folato se selecciona a partir de leucovorina, timidina y ácido fólico. 16.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G se encuentra a una dosis de aproximadamente 50 unidades por kg de peso corporal. 17.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el individuo es uno el cual ha sido tratado para el cáncer mediante el compuesto antifolato. 18.- El uso como se reclama en la reivindicación 8 ó 17, en donde el compuesto antifolato de fórmula I es Pemetrexed y el cáncer a ser tratado se selecciona a partir de leucemia, mesotelioma, NSCLC, cáncer de pulmón, de mama, de colon, de páncreas, de riñon, de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial y carcinoma cervical. 19.- El uso como se reclama en la reivindicación 8 ó 17, en donde el compuesto antifolato de fórmula I es AAG113-161 y el cáncer a ser tratado se selecciona a partir de leucemia, mesotelioma, NSCLC, cáncer de mama, de colon, de páncreas, de riñon, de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial y carcinoma cervical. 20.- El uso como se reclama en la reivindicación 8 ó 17, en donde el compuesto antifolato de fórmula I es Edatrexato y el cáncer a ser tratado se selecciona a partir de carcinoma de mama, de pulmón, carcinoma de célula escamosa de cabeza y de cuello, NSCLC, linfoma no de Hodgkin, tumor de célula germinal, mesotelioma pleural y histíocitoma fibroso maligno. 21.- El uso como se reclama en la reivindicación 8 ó 17, en donde el compuesto antifolato de fórmula I es Lometrexol y el cáncer a ser tratado se selecciona a partir de sarcoma de tejido blando, NSCLC, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello y melanoma. 22.- Un sistema terapéutico que comprende un compuesto antifolato de fórmula I como se definió anteriormente en la reivindicación 1 ó 2, y una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. 23.- El sistema terapéutico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque también comprende un agente de rescate de la vía del folato. 24.- El sistema terapéutico de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizado además porque también comprende un agente anticáncer adicional. 25.- Un método ex vivo para escindir una porción L-glutamato terminal a partir de un compuesto de fórmula I como se definió en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, el método comprendiendo poner en contacto el compuesto con una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. 26.- Un método ex vivo para determinar la velocidad y/o grado de escisión de un compuesto de fórmula I como se definió en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 por una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G, el método comprendiendo: proveer el compuesto de fórmula I, poner en contacto el compuesto de fórmula I con una enzima que tiene actividad de carboxipeptídasa G bajo condiciones de tal manera que se puede presentar la escisión del compuesto, y monitorear la velocidad y/o grado de escisión del compuesto de fórmula I durante el tiempo. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el paso de monitoreo comprende monitorear la cantidad y/o concentración del compuesto de fórmula I. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, caracterizado además porque el paso de monitoreo comprende monitorear la cantidad y/o concentración de uno o más productos del procesamiento del compuesto de fórmula I. 29.- Un método ex vivo para la escisión de un compuesto que comprende un fragmento estructural de fórmula IV, en donde la línea ondulada índica el punto de unión del fragmento estructural; y R3 a R6 son como se definieron en la reivindicación 1 , o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, el método comprendiendo poner en contacto el compuesto que comprende el fragmento estructural de fórmula IV con una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el compuesto que comprende el fragmento estructural de fórmula IV es un compuesto antifolato. 31.- El uso de una enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G en la preparación de un medicamento útil para combatir la toxicidad causada por un compuesto antifolato de fórmula IV como se definió en la reivindicación 29. 32.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 21 ó 31 , o un sistema terapéutico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 25 a 30, en donde la enzima que tiene actividad de carboxipeptidasa G es glucarpidasa, o un derivado de la misma el cual tiene actividad de carboxipeptidasa G.