MX2007011612A - Plantas resistentes a la sequia. - Google Patents

Abstract

La presente invencion es concerniente con el desarrollo de plantas resistentes a la sequia. La presente invencion es concerniente con la preparacion de plantas transgenicas que expresan una proteina involucrada en la sintesis de citoquinina bajo el control de un promotor inducible por senescencia.

Description

PLANTAS RESISTENTES A LA SEQUÍA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los estudios fisiológicos y genéticos indican que la senescencia es un proceso altamente regulado (Nooden, Senescente and Aging in Plants, (L.D. Nooden and A.C. Leopold, Ed.), pp. 391-439, Academic Press, San Diego, Calif., 1988; Thomas, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 31:83-111, 1980). Los estudios moleculares sugieren que los cambios en la expresión genética están asociados con el programa de senescencia. Por ejemplo, el nivel de mARN que codifica proteínas involucradas en la fotosíntesis disminuye durante la senescencia (Bate, et al., J. Exp. Bot. 42:801-811, 1991; Hensel , et al., Plant Cell 5:553-564, 1993; Jiang, et al., Plant Physiol. 101:105-112, 1993) , en tanto que se piensa que los niveles de mARN de genes que codifican proteínas están involucrados en el incremento del programa de senescencia (Graham, et al., Plant Cell 4:349-357, 1992, Hensel, et al., Plant Cell 5:553-564, 1993; Karachi , et al., Plant Physiol. 93:1323-1329, 1992; Taylor, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5118-5122, 1993). Se ha sugerido que promotores específicos de senescencia pueden ser usados para impulsar la expresión de genes seleccionados durante la senescencia. Por ejemplo, la patente estadounidense 5,689,042 utiliza un constructo genético que comprende un promotor específico de senescencia, SAG12, enlazado operativamente a una secuencia de ADN que codifica isopentil transferasa (IPT)de Agrobacterium no relacionada de manera natural a la secuencia promotora. Las plantas transgénicas que comprenden este constructo retienen hojas verdes por más tiempo al impulsar la expresión de IPT por medio del promotor de SAG12. Se sabe que el IPT incrementa el nivel de citoquinina, una clase de hormonas de planta, la concentración de las cuales declina durante la senescencia y así puede jugar una función en el control de la senescencia de hojas . Similarmente, Gan y Amasino muestran que la inhibición de senescencia de hojas puede ser obtenida mediante la producción autorregulada de citoquinina (Gao, et al., Science 270:1986-1988, 1995). Otros promotores inducibles por senescencia han sido identificados. Por ejemplo, el promotor SARK de Phaseolus vulgaris es descrito en WO 99/29159 y Hajouj et al . Plant Physiol . 124:1305-1314(2000). Un aspecto útil y deseable de regular internamente la expresión del gen de interés está en la habilidad de regular la expresión solamente en aquéllas células que sufren senescencia, dejando así a las células normales sin afectar y exentas de los efectos posiblemente negativos de la sobreproducción de citoquinina . Aunque el uso de la expresión controlada por SAG12 de IPT ha mostrado controlar la senescencia de hojas, otros fenotipos de tales plantas no están bien entendidos. La presente invención trata éstas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con el desarrollo de plantas resistentes a la sequía. Los métodos de la invención proporcionan plantas con resistencia a la sequía incrementada y otras características ventajosas, tales como rendimiento incrementado. Además, las plantas de la invención también tienen mayor eficiencia de uso de agua. La presente invención es concerniente con la preparación de plantas transgénicas que expresan una proteína involucrada en la síntesis de citoquinina bajo el control de un promotor inducible por senescencia. Los métodos de la invención comprenden (a) introducir a una población de plantas un cassete de expresión recombinante que comprende un promotor de SARK enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína involucrada en la síntesis de citoquinina; y (b) seleccionar una planta que es resistente al esfuerzo de sequía. La etapa de introducir el cassete de expresión puede ser llevada a cabo utilizando cualquier método conocido. Por ejemplo, el cassete de expresión puede ser introducido mediante un cruce sexual o utilizando Agrobacterium .

El promotor de SARK es preparado convenientemente de Phaseolus vulgari s y puede tener una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO : 1. En algunas modalidades, la proteína involucrada en la síntesis de citoquinina es isopentenil transferasa (IPT) de Agrobacteri um . Una secuencia ejemplar (IPT) es una que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO : 3. La secuencia puede ser introducida a cualquier planta capaz de transformación con constructos de expresión recombinantes. La expresión en tabaco es ejemplificada en la presente. Otras plantas usadas convenientemente en la invención incluyen hierbas para céspedes .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra que plantas de tabaco WT exhibieron un marchitamiento de hojas progresivo, mientras que dos líneas transgénicas independientes no mostraron síntomas de marchitamiento durante un esfuerzo de sequía de 5 y 7 días sin agua . Las figuras 2A-2L muestran plantas de tabaco de 4 meses sometidas a esfuerzo de sequía seguido por rehidratación. Ambas plantas tanto tipo silvestre (Fig. 2A) y plantas transgénicas (Fig. 2B y 2C) exhibieron síntomas de marchitamiento de hojas después de 7 días de sequía. Los síntomas de marchitamiento de hojas se hicieron más pronunciados después de 18 días de sequía, tanto en las líneas WT (Fig. 2D) y las dos líneas transgénicas (Figs. 2E y 2F) . La rehidratación de las plantas por 7 días tuvo poco efecto sobre las plantas de WT marchitas (Fig. 2G) , pero indujo recuperación parcial de las líneas transgénicas (Figs. 2H y 21), la línea transgénica T4-24 (Fig. 21) muestra mejor recuperación que la línea transgénica T2-36 (Fig. 2H) . La rehidratación de las plantas por 14 días no recuperó las plantas de WT (Fig. 2J) , pero recuperó plenamente ambas líneas transgénicas (Figs. 2K y 2L) . La figura 3 muestra el peso fresco de plantas mostradas en la figura 2 después de re-irrigación de 14 días. Los valores son la media ± desviación estándar (n = 40) . La figura 4 muestra plantas Arabisdopsis de WT y plantas transgénicas TI (pSARK: IPT) después de esfuerzo de sequía y 5 días de rehidratación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se usa en la presente, los términos "resistencia a la sequía" o "tolerancia a la sequía" se refieren a la habilidad de una planta para recuperarse de periodos de esfuerzo de sequía (esto es, poca o nada de agua por un periodo de días) . Comúnmente, el esfuerzo de sequía será de por lo menos 5 días y puede ser tan largo como de 18 a 20 días.

El término "eficiencia de uso de agua" se refiere a la habilidad de una planta para crecer con sustancialmente ninguna penalidad de rendimiento bajo periodos extensos con cantidades de agua menores de las normales (comúnmente alrededor de la mitad) . El término "senescencia" (también denominado como muerte celular programada) se refiere a un proceso activo controlado genéticamente mediante el cual las células y tejidos de planta pierden organización y función. El término "gen asociado a senescencia" se refiere a un gen involucrado en la senescencia. La expresión de tal gen puede ser inducida (o alterada) durante el proceso de senescencia . Como se usa en la presente, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de impulsar la transcripción de una secuencia de codificación en una célula de planta. Así, los promotores usados en los constructos de la invención incluyen elementos de control de transcripción de acción cis y secuencias reguladoras que están involucradas en la regulación o modulación de la sincronización y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de transcripción de acción cis, que incluye un mejorador, un promotor, un terminador de transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosomal, regiones sin traducir 5' o 3' o una secuencia intrónica, que están involucrados en la regulación de transcripción. Estas secuencias de acción cis interactúan comúnmente con proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (encender/apagar, regular, modular, etc.) la transcripción. Un "promotor inducible por modulación" es un promotor que confiere especificidad temporal de una secuencia de codificación enlazada operativamente, de tal manera que la expresión ocurre en la consumación de la modulación y/o durante el proceso de senescencia. Un "promotor inducible por senescencia" es un promotor que confiere especificidad temporal de una secuencia de codificación enlazada operativamente, de tal manera que la expresión ocurre durante el proceso de senescencia. El término "planta" incluye plantas enteras, órganos/estructuras vegetativas de brote (por ejemplo hojas, tallos y tubérculos) , raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo brácteas, cépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (en los que se incluyen embriones, endoesperma y recubrimiento de semillas) y frutas (el ovario maduro), tejidos de plantas (por ejemplo, tejido vascular, tejido terrestre y los semejantes) y células (por ejemplo, células guardia, células de huevo, tricomas y los semejantes) y progenie de los mismos. La clase de plantas que pueden ser usadas en el método de la invención es en general tan amplio como la clase de plantas superiores e inferiores propensas a técnicas de transformación, en las que se incluyen angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas) , gimnosper as, heléchos y algas multicelulares. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidias, en las que se incluyen aneuploides, poliploides, diploides, haploides y hemícigo. Se dice que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando son alineadas para correspondencia máxima como se describe posteriormente en la presente. El término "complementario con" se usa en la presente para dar a entender que la secuencia es complementaria a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needle y Wunsch J. Mol. Biol.48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de éstos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI),o mediante inspección.

El "porcentaje de identidad de secuencia" es determinado al comparar dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o cancelaciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o cancelaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por cien para producir el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, por lo menos 80% de identidad de secuencia, por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% ó 97% en comparación con una secuencia de referencia utilizando los programas descritos en la presente. Preferiblemente BLAST utilizando parámetros estándar, como se describe posteriormente en la presente. Aquél de habilidad reconocerá que estos valores pueden ser ajustados apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codón, similaridad de aminoácidos, posicionamiento del cuadro de lectura y los semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos significan normalmente identidad de secuencia de por lo menos 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 97% en comparación con una secuencia de referencia utilizando los programas descritos en la presente. Los polipéptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se indica anteriormente excepto que posiciones de residuo que no son idénticas pueden diferir por cambios de aminoácidos conservadores. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y trionina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es glicina, arginina e histidina y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, licina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutámico y asparagina-glutamina . Otra indicación de que la secuencia de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridizan entre sí o un tercer ácido nucleico, bajo condiciones severas. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En general, las condiciones severas son seleccionadas para ser aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se hibridiza a una sonda perfectamente coincidente. Comúnmente, las condiciones severas serán aquéllas en las cuales la concentración de sal es aproximadamente 0.02 molar a pH 7 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 60 °C. Para los propósitos de esta revelación, las condiciones severas para hibridizaciones son aquéllas que incluyen por lo menos un lavado en 0.2X SSC a 63°C durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Las condiciones moderadamente severas incluyen por lo menos un lavado (usualmente 2) en 0.2X SSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50°C, usualmente alrededor de 55°C, por 20 minutos o condiciones equivalentes.

El término "cassete de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante por el propósito de expresar una secuencia de ácido nucleico de la invención ín vitro o ín vivo, constitutiva o mduciblemente, en cualquier célula, en las que se incluyen, además de células de plantas, células procarióticas, de levadura, fúngales, de insectos o mamíferas El término incluye sistemas de expresión lineales o circulares. El término incluye todos los vectores. Los cassetes pueden seguir siendo episomales o integrarse al genoma de célula huésped. Los cassetes de expresión pueden tener la habilidad para autoreplicarse o no, esto es, impulsar solamente la impresión transistoria en una célula. El término incluye cassetes de expresión recombinantes que contienen solamente los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombmante .

Preparación de cassetes de expresión Los cassetes de expresión de la invención comprenden promotores mducibles por senescencia. El promotor SARK de Phaseolus vulgaps es e emplificado a continuación. El promotor es descrito en WO 99/29159 y Hajouj et al . Plant Physiol . 124:1305-1314 (2000) . Otros promotores apropiados incluyen el promotor SAG12 de Arabidoposis como se describe en Gan et al . , Science, 270:1986-8 (1995). El experimentado en el arte reconocerá que el promotor particular usado en los constructos de la invención, en tanto que la expresión sea inducida por senescencia. Así, por ejemplo, promotores forman homólogos de los genes SARK o SAG12 de otra especie pueden ser usados convenientemente en los cassetes de expresión de la invención. Los promotores son usados para impulsar la expresión del gen que codifica una proteína que inhibe o hace lento el proceso de senescencia. En algunas modalidades preferidas, el gen codifica una proteína involucrada en la síntesis de citoquinina. Por ejemplo, la isopentil transferasa (IPT) cataliza la síntesis de citoquinina. Ejemplos de secuencias de IPT son presentadas en: Crespi et al . , EMBO J. 11:795-804 (1992); Goldberg et al . , Nucleic Acids . Res . 12:4665-4677 (1984); Heide Kamp et al . , Nucleic Acids Res . , 11:6211-6223 (1983); Strabala et al . , Mol . Gen . Genet . 216:388-394 (1989) GenBank Accesión Number :NC_003308 , as well as X14410 ( see SEQ ID Nos: 2 y 3) .

Producción de plantas transgénicas Constructos de ADN de la invención pueden ser introducidos al genoma del huésped de planta deseado mediante una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, el constructo de ADN puede ser introducido directamente al ADN genómico de la célula de planta utilizando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células de planta o los conductos de ADN pueden ser introducidos directamente al tejido de planta utilizando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, los constructos de ADN pueden ser combinados con regiones de flanqueo de T-ADN apropiados e introducidos a un vector huésped de Agrobacteri um tumefaci ens convencional. Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaci ens dirigirán la inserción del constructo y marcador adyacente al ADN de célula de planta cuando la célula está infectada por las bacterias . Técnicas de microinyección son conocidas en el arte y son bien descritas en la literatura científica y de patente. La introducción de constructos de ADN utilizando precipitación de polietilen glicol es descrita en Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722 (1984). Técnicas de electroporación son descritas en Fromm et al Proc . Nati . Acad . Sci . USA 82:5824 (1985). Técnicas de transformación balística son descritas en Klein et al. Nature 327:70-73 (1987). Técnicas de transformación moderadas por Agrobacterium tumefaciens, en las que se incluyen desarme y uso de vectores binarios, son bien descritos en la literatura científica. Véase, por ejemplo Horsch et al . Science 233:496-498 (1984), y Fraley et al . Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 80:4803 (1983) . Las células de planta transformadas que son derivadas mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden ser cultivadas para regenerar una planta entera que posee el genotipo transformado y así el genotipo deseado tal como sin semillas. Tales técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertos fitohormonas en un medio de cultivo de tejido, que depende comúnmente de un biocida y/o marcador de herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp . 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración puede también ser obtenida a partir de callos de plantas, explantas, órganos o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración son descritas en general en Klee et al . Ann Rev. Of Plant Phys . 38:467-486 (1987) . Aquél de habilidad en el arte reconocerá que después que el cassete de expresión es incorporado establemente en plantas transgénicas y se confirma que es operable, puede ser introducido a otras plantas mediante cruce sexual . Cualquiera de una diversidad de técnicas de cruce estándar pueden ser usadas, dependiendo de la especie a ser cruzada.

Los cassetes de expresión de la invención pueden ser usados para conferir resistencia a la sequía sobre esencialmente cualquier planta. Así, la invención tiene uso en un amplio intervalo de plantas, en las que se incluyen especies de los géneros Asparagus , Atropa , Avena , Brassi ca, Ci trus, Ci trullus, Capsi cum, Cucumi s , Cucúrbi ta , Daucus, Fragaria , Glycine, Gossypium, Helianthus , Heterocallis , Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca , Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana , Medi cago, Nicotiana , Oryza, Panieu , Pannesetum, Persea , Pi sum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella , Tri ticum, Vi ti s, Vigna, y Zea . En algunas modalidades, los métodos de la invención son usados para conferir resistencia a la sequía sobre hierbas para céspedes . Una diversidad de hierbas para céspedes son conocidas para aquéllos de habilidad en el arte. Por ejemplo, se puede usar cañuela, Festuca spp . (Por ej emplo, F. arundinacea, F. rubra, F. ovina var, duriuscula, y F. ovina) . Otros céspedes incluyen Pasto Azul de Kentucky Poa pratensi s y Agrostis trepador Agrostis palustris . Aquéllos de habilidad reconocerán que una diversidad de especies de plantas pueden ser usadas como modelos para predecir los efectos fenotípicos de expresión transgénica en otras plantas. Por ejemplo, es bien reconocido que las plantas de tabaco (Nicotiana) y Arabidopsi s son modelos útiles de expresión transgenética, particularmente en otras dicotiledóneas.

La resistencia a la sequía puede ser analizada de acuerdo con cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las plantas pueden ser cultivadas bajo condiciones en las cuales se proporciona agua menos que la óptima a la planta. La resistencia a la sequía puede ser determinada mediante cualquiera de una diversidad de medidas estándar en las que se incluyen presión de turgencia, crecimiento, rendimiento y los semejantes. En algunas modalidades, los métodos descritos en la sección de ejemplos a continuación se pueden usar convenientemente. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta especificación son incorporadas al presente por referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo por propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para aquel de habilidad ordinaria en el arte a la luz de las enseñanzas de la presente invención que ciertos cambios y modificaciones se pueden efectuar a la misma sin desviarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas .

EJEMPLOS Identificación del gen de SARK (cinasa receptora asociada a senescencia) El cADN del gen de SARK fue aislado de Phaseolus vulgaris mediante una técnica de despliegue diferencial como se describe en Hajouj et al. (2000) . La secuencia del cADN de plena longitud de SARK reveló que codifica una cinasa de proteína de serina/trionina . Se observó un dominio de transmembrana hidrofóbico sugiriendo que el gen de SARK codifica una cinasa receptora (Hajouj et al . 2000) . El análisis de Northern blot reveló la regulación ascendente del gen SARK durante etapas prematuras de senescencia de hojas. El inicio de la expresión del gen de SARK precedió cualquier signo visual (amarilleo) de la senescencia de hoja de habichuela anexa. Los discos de hojas, cuando son incubados en la oscuridad, exhibieron amarilleo acelerado. Similar a las hojas anexas intactas, los niveles de transcriptos del gen de SARK se incrementaron al inicio del proceso de senescencia antes de cualquier amarilleo visual de las hojas (Hajouj et al (2000)). Así, se puede definir el gen de SARK como un gen asociado a senescencia (SAG) . Además, la aparición de los transcriptos de SARK en las etapas muy prematuras de senescencia tanto en las hojas anexadas como separadas sugiere una función reguladora en el proceso de senescencia. Los anticuerpos criados contra la proteína de SARK fueron producidos y usados para el análisis de western blot. El patrón temporal de los niveles de la proteína de SARK se asemejaron a aquél del ARN y soportan además la idea de que la proteína de SARK está asociada con los procesos de senescencia de las hojas separadas y anexadas.

Aislamiento del promotor de SARK La región corriente arriba del extremo 5' del gen SARK fue aislada mediante el procedimiento de PCR inverso como se describe por Maniatis et al. (Molecular cloning, a laboratory manual 2nd edition. ADN genóbico de habichuela fue aislado mediante el equipo de extracción de ADN de planta (Scotlab) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN fue sometido a digestión con la enzima de restricción Xbal y recirculada mediante relegación. Los siguientes evadores fueron usados para la reacción de PCR. (1) 5' ACGTCCAACCAAAGACC 3' (2) 5' TCTGCAGCTAGTGCGATATCC 3' La reacción de PCR fue efectuada bajo las siguientes condiciones: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C, 2 minutos a 72°C por 40 ciclos y luego 10 minutos a 720°C. Un fragmento de ADN 1.4kb fue amplificado. La secuenciación de ADN de este fragmento reveló que incluía 340 bp del extremo 5' del ADN de SARK. Esta secuencia reveló la existencia de un intrón cercano al extremo 5' del gen de SARK.

Para aislar un fragmento más largo corriente arriba de la región 5' del gen de SARK, se efectuó una técnica de PCR entrelazada asimétrica térmica (TAIL) como se describe por Liu et al (Plant J. 8:457-463). Tres evadores de PCR fueron usados: 1) 5 ' TCTGCAGCTAGTGCGATATCC 3' 2 ) 5 ' TTGGTGGATGAATAATGGAG 3 ' 3 ) 5 ' ACTGTAACTCACAAATTAGA 3 ' Tres reacciones de PCR se llevaron a cabo para amplificar secuencias objetivo. Los productos de PCR fueron secuenciados. Aproximadamente 800 bp del extremo 5' del cADN fueron identificadas y son mostradas en SEQ ID NO: 1. El fragmento de PCR fue clonado en pUC57.

Creación de plantas transgénicas cjue portan el constructo pSARKtIPT. La ipt de Agrobacterium (isopentenil transferasa) , la enzima que cataliza la etapa limitante de velocidad en la biosíntesis de citoquininas fue fusionada al promotor de SARK. Gan y Amasino (Science 270; 1996 (1995) han mostrado que el promotor del gen SAG12 de Arabidopsis (gen asociado a senescencia) cuando es enlazado al gen de ipt induce la síntesis de citoquininas y retrasa el proceso de senescencia hojas. La IPT de Agrobacterium fue enlazada operativamente al promotor de 830 nucleótidos de longitud del gen de SARK e introducido como un fragmento de HinlII/Xbal a pBHOl (ClonTech) para crear el pBI p-SARK:IPT. La transformación de Agrobacterium fue efectuada mediante eletroporación.

Transformación de tabaco Las plantas fueron transformadas vía el método de transformación moderado por Agrobacterium. La expresión del gen de isopentil transferasa ( IPT) de Agrobacterium bajo la regulación del promotor de SARK provocó la senescencia retardada de las hojas de tabaco. El tabaco transgénico que contiene el p-SARK-IPT ha mostrado retardo considerable en la senescencia regular tanto de hojas individuales como de las plantas enteras. En la flor de plantas de WT usualmente de 3 a 3.5 meses después de la germinación y empieza a exhibir amarilleo de las primeras hojas (en el fondo) después de 4 meses. Sin embargo, las plantas transgénicas exhibieron una senescencia retardada significativa y no mostraron ningún amarilleo de las primeras hojas hasta 10 meses después de la germinación. Las hojas separadas del tabaco transgénico mostraron también un retardo significativo en amarilleo cuando son incubadas bajo condiciones de oscuridad. Normalmente, las hojas de tabaco desprendidas muestran amarilleo inicial después de 5-6 días de incubación en la oscuridad y completan su amarilleo después de 10-12 días. Sin embargo, las hojas desprendidas de las plantas transgénicas no mostraron ningún signo de amarilleo por 20 días y aún después de 30 días de incubación en la oscuridad todavía estaban verdes aunque se observó amarilleo inicial. Estos resultados demostraron que además de las hojas anexas, el mecanismo autorregulador de la síntesis de citoquininas en las hojas separadas de las plantas transgénicas fue también funcional .

Transformación de Arabidopsis La amplificación de PCR del p-SARK-IPT utilizando los siguientes evadores fue efectuada mediante la polimerasa de ADN Pfu Turbo (Stratagene) .

SARKIPF 5'T T C C T T A G A T G C T G T C A C A A T C A 3' SARKIPTR 5'G A A C A T C T T A T CC A G A T G A A G A C A G 3' La plantilla para la amplificación de PCR fue el ADN de tabaco transgénico que contiene el p-SARK-IPT. El producto de PCR (pSARK:IPT) fue clonado con el equipo de clonación TOPO a células competentes topo (DH5a-Tl) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . Se efectuaron minipreparaciones de plásmido de ADN con el equipo de Qiaprep (Qiagen) . El plásmido fue sometido a digestión con BglII y EcoRI y fue ligado con el vector Cambia 1380 (CAMBIA, Canberra Australia) .

La electroporación del vector Cambia que porta el pSARK:IPT fue efectuada a células competentes (DH5a) . La minipreparación de plásmido de ADN de las colonias de DH5a transfectadas fue llevada a cabo con el equipo de Qiaprep (Qiagen) . El vector de Cambia que contiene el pSARK:IPT fue introducido electroforéticamente a Agrobacterium para la transformación de planta. Plantas Arabidopsis thaliana fueron transformadas mediante la técnica de filtración al vacío con Agrobacteri um tumefaci ens que contiene el pSARK:IPT y el gen de resistencia a higromicina (hptllgene) para la selección en plantas .

Expresión de isopentil transferasa (IPT) bajo la regulación del promotor de gen de SARK en plantas de tabaco confiere resistencia a la sequía. Plantas de tabaco transgénicas que portan el pSARK:IPT han sido cultivadas en invernadero durante 2-3 meses.

No se pudieron visualizar ninguna diferencia morfológica entre las plantas transgénicas y las plantas de WT durante los primeros 3-4 meses. Enseguida del inicio de florecimiento, las plantas de tabaco de 3 meses de edad fueron sometidas a esfuerzo de sequía (no se agregó agua a las macetas) durante 5-16 días. Las plantas de WT mostraron un marchitamiento de hojas progresivo (Fig.l). Sin embargo, las plantas transgénicas (dos líneas independientes) no mostraron síntomas de marchitamiento (Fig. 1) . Durante un esfuerzo de sequía de 5 y 7 días sin agua. Los periodos de deshidratación largos de 16 días provocaron marchitamiento irreversible severo de las plantas de WT y marchitamiento menos severo y reversible en plantas que portan el pSARK:IPT. La rehidratación (re-irrigación de las plantas deshidratadas) provocó recuperación de las plantas pSARK:IPT transgénicas mientras que las plantas de WT no pudieron ser recuperadas (Fig. 1) del esfuerzo de sequía. Las plantas tipo silvestre (WT) y dos líneas transgénicas de plantas de tabaco que portan el pSARK:IPT (T2-36 y T4-24) fueron cultivadas en invernadero durante 5 meses. No se pudieron observar diferencias morfológicas entre las plantas transgénicas y las plantas tipo silvestre durante los primeros 3-4 meses de cultivo bajo condiciones óptimas. En seguida del inicio del florecimiento, plantas de tabaco de 4 meses fueron sometidas a un esfuerzo de sequía (no se agregó agua a las macetas) por un periodo de 18 días consecutivos (Fig. 2, A-F) . Tanto las plantas tipo silvestre (Fig. 2A) como las plantas transgénicas (Fig. 2B y 2C) mostraron síntomas de marchitamiento de hojas después de 7 días de sequía. Los síntomas de marchitamiento de hojas se hicieron más pronunciados después de 18 días de sequía, tanto en las plantas de WT (Fig. 2D) y las dos líneas transgénicas (Figs. 2E y 2F) .

La rehidratación de las plantas por 7 días tuvo poco efecto sobre las plantas de WT marchitas (Fig. 2G) , pero indujo recuperación parcial de las líneas transgénicas (Figs. 2H y 21), la línea transgénica T4-24 (Fig. 21) muestra mejor recuperación que la línea transgénica T2-36 (Fig. 2H) . La rehidratación de las plantas por 14 días no recuperó las plantas de WT (Fig. 2J) , pero recuperó plenamente ambas líneas transgénicas (Figs. 2K y 2L) . Las mediciones del peso fresco de las plantas tipo silvestre y plantas transgénicas al final del período de rehidratación mostró que las líneas transgénicas obtuvieron un peso fresco de 250 - gramos/planta, en tanto que el tipo silvestre permaneció seco con un peso que no excedió del 20% de aquél de las líneas transgénicas (Fig. 2) . La figura 3 muestra el peso fresco de plantas mostradas en la figura 2 después de re-irrigación de 14 días. Los valores son las media ± de dirección estándar (n = 40) .

Expresión del gen de IPT bajo la regulación del promotor del gen de SARK confiere resistencia a la sequía a plantas de Arabidopsis transgénicas. Plantas de Arabidopsis thaliana fueron cultivadas bajo el régimen de día largo (16/8 horas) a 23 °C. No se pudieron distinguir ninguna diferencia morfológica ni de desarrollo entre las plantas de WT y las plantas transgénicas (pSARK: IPT) bajo condiciones normales. Sin embargo, cuando plantas de dos meses (en la etapa de florecimiento avanzado) fueron sometidas a esfuerzo de sequía (no se agregó agua a las macetas) exhibieron resistencia al esfuerzo diferencial. Las plantas de WT sufrieron marchitamiento irreversible severo y amarilleo de hojas después de 12 días de deshidratación, mientras que 10 líneas independientes diferentes de las plantas transgénicas TI (pSARK:IPT) mostraron marchitamiento moderado y se recuperaron del esfuerzo de sequía después de 5 días de rehidratación (Fig. 4) .

SEQ ID NO: .1 TTCTTCCT AGATGCTGTCACAATCATTTTCATTATTTTTATATTTGGTTTTACTGC ACAAGTGACATAATGAGTGCTGAATTGTGGTATTGTGGGAACCTTAAGCAATAGT TTCATTAGACCACTTGTGCAGGTtTTtGGGGTGGTAGAAGGAATGCTCGTTGTCT CTGAATGAGTTCTATTTTCATCTTTAGAAACTAGTAATTTAGTTAGTTTTGGGTCT CGTGGTTCTACAGAGGGTTGAGATACTTTTGAAGTATCTCTCTTTTATTATATTAT ACTpTTGCTGATAAAAAAAGGTAGGTAGTTTTTrTTGGAATATTTTGTAGGATTT TGTGGAGGTGTTTGGTATAAGGATTGAAATATpCAAAAATATTTCCATTTAATTT ACTTTTTCTTATAAAAAAAATCCTCCATGAAACAAGATCATCTTCTAGAAACAAC AAGTAATATATTAGAATCTCTTTCTGAATTTTCTCATTTGTGAGTTATAGTACTT TTTTCCAATAATAATTATAAGTGGTAAGATGTGTGGTTGTGGAAGTTGGAAGGAA AGAAGGAAAGAAAGGTTAGTTTTTGTTTTGTATTTGAAAGTAAGTCAAGGTCATt GGCTTAGGGTTCTACCACTGCAACTATTCCACATTGGCTTCTACCACTGCAATTAT TCCACATTGGCTTGTACTGTAAGGACAAACCTTGGCATGTCAAATACTTTTCATC ACATATAACCATATTATAAACTACTTTCCATCTCCATTATTCATCCACCAAAATCT AGAGTCACTGAGAGTGCAGATAACACAATTCTCTAATATAAAAATCAGTTTGTAT TCAATATACTGCAAAAAACTTATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCA CAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTL^CCAGTCC TTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACC AACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCT GGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGT GTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTG CTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTA TTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAG TTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTA TCTTGGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGA TATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGC TTGACGCAAATATGGAAGG?AAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCAT CCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGA CGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGT ACGCCAGCCCTGCGTCGC ACCTGTCTTCATCTGGATAAGATGTTCAGATC SEQ ID NO: 2 1 ggatcccgtt acaagtattg cacgttttgt aaattgcata ttaatgcaat ctggatgttt 61 aataacgaat gtaatggcgt agaaatatgt attttattgt atttatcttt cactatgttg 121 aagtttgcaa taatatgcta atgtaaaatt aaaaaattat gtactgccgc atttgttcaa 181 atggcgccgt tatttcaaaa atatctttga ttttgttacg aggacaacga ctgcaggaag 241 taaataaaag acgctgttgt taagaaattg ctatcatatg tgcccagcta tagggccatt 301 taagttcaat tgtgaaatag ccgcccttat tttgacgtct catcaaatca aatattaaaa 361 aatatctcac tctgtcgcca gcaatgatgt aataaccgca gaaaagtgag agtaaatcgc 421 ggaaaaacgt cgccgagtgg catgaatagc ggcctccgta ttgctgattt agtcagcttt 481 atttgactta agggtgccct cgttagtgac aaattgcttt caaggagaca gccatgcccc 541 acactttgtt gaaaaacaag ttgccttttg ggaagaacct aaagccactt gctcttcaag 601 gaggaatatc gaggaagaga atataacagc ctctggtaca gacttctctt gtgcaaaaat 661 caatttgtat tcaacatatc gcaagaccga tggatctacg tctaattttc ggtccaactt 721 gcacaggaaa gacatcgact gcgatagctc ttgcccagca gactggcctc ccagtcctct 781 cgctcgatcg cgtccaatgc tgtcctcaac tatcaaccgg aagcgggcga ccaacagtgg 841 aagaactgaa aggaacgact cgtctgtacc ttgatgatcg ccctttggta aagggtatca 901 ttacagccaa gcaagctcat gaacggctca ttgcggaggt gcacaatcac gaggccaaag 961 gcgggcttat tcttgaggga ggatctatct cgttgctcag gtgcatggcg caaagtcgtt 1021 attggaacgc ggattttcgt tggcatatta ttcgcaacga gttagcagac gaggagagct 1081 tcatgagcgt ggccaagacc agagttaagc agatgttacg cccctctgca ggtctttcta 1141 ttatccaaga gttggttcaa ctttggaggg agcctcggct gaggcccata ctggaaggga 1201 tcgatggata tcgatatgcc ctgctatttg ctacccagaa ccagatcacg cccgatatgc 1261 tattgcagct cgacgcagat atggagaata aattgattca cggtatcgct caggagtttc 1321 taatscatgs gcgtcgacag gaacagaaat tccctttggt gggcgcgaca gctgtcgaag 1381 cgtttgaagg accaccattt cgaatgtgat agattgcacc agttttgttt cagacttgtc 1441 gctatttgaa taagatgttc gttctttgtt gtgttggtgt gttgtgatag aggcaagtgg 1501 tttgaaactt gtttttactg gtttattttc agtctcttgg acgatgtttt acaaatataa 1561 tattgtgaaa attgtggttt tatattcgta gaacgaaata aatggtaagt atagccgtta 1621 tcaaaattta gcaaaaattg ttaaaggttc ttttatgcgg tgaggttgtc gacttttcat 1681 cattgtcgcg taaggagtta cggatatcca taactgtaaa aacgccgcag aatttacggg 1741 tggtgcattt agtttgccgt tcaacatgat tttggcaata gttggtaacc aagcactagc 1801 caaccgttcg ataatcactt aatcgatgga accgttcagc tttccttcgt gaggctgctc 1861 ttgatgatga gctgccgtct agtttttata acgccgggtt acgcattata gacaagctt SEQ ID NO: 3 DLRLIFGPTCTGKTSTAIALAQQTGLPVLSLDRVQCCPQLSTGSGRPTVEELKGTTR YLDDRPLVKGIITAKQ AHERLIAEVHNHEAKGGLILEGGSISLLRCÍVIAQSRY NADFRWHIIRNEIADEESFMSVA TRVKQM RPSAGLS IIQE VQ REPRLRPILEGIDGYRYALLFATQNQITPDMLLQLDADMENKLIHGIAQEFLIHARRQEQKFPLVG ATAVEAFEGPPFRM

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para la preparación de una planta resistente al esfuerzo de sequía. El método está caracterizado porque comprende : (a) introducir a una población de plantas un cassete de expresión recombinante que comprende un promotor de SARK enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína involucrada en la síntesis de citoquinina y (b) seleccionar una planta que es resistente al esfuerzo de sequía.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de introducción se lleva a cabo mediante cruce sexual .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de introducción se lleva a cabo utilizando Agrobacteriu .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor de SARK es de Phaseolus vulgaris .
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el promotor de SARK es por lo menos 95% idéntico a SEQ ID NO : 1.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína involucrada en la síntesis de citoquinina es isopentenil transferasa.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la isopentenil transferasa es de Agrobacteri u .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la isopentenil transferasa es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 3.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta es una dicotiledónea.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la planta es de tabaco.