MX2007002425A - Inmunogeno y antiveneno contra el veneno de la araña violinista - Google Patents

Abstract

La presente invención comprende el asilamiento caracterización y expresión de los fragmentos de DNA codificantes de las esfingomielinasas D de 3 especies de araña del género Loxosceles:L boneti, L. Reclusa y L. Leta y sus toxoides. También comprende la producción por medios recombinantes de las esfingomielinasas D activas y sus toxoides su uso como inmunógeno para la producción en vertebrados de anticuerpos neutralizantes del veneno correspondiente y de los fragmentes F(ab')2 respectivos. También se incluye el uso de las esfingomielinasas D recombinantes como parte de un matriz antigénicaútil en la inmunopurificación de anticuerpos y sus fragmentos o como parte de algún dispositivo diagnóstico para corroborar en clínica que el agente causal del estado de envenenamiento de un paciente sea una araña del género Loxosceles. Asímismo, la invención incluye los vectores moleculares para la expresión de los fragmentos de DNA, las cepas que los comprenden, capaces de expresar las SMD de Loxosceles y los métodos para su expresión.

Description

INMUNÓGENO Y ANTI-VENENO CONTRA EL VENENO DE LA ARAÑA VIOLINISTA DESCRIPCIÓN CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a proteínas recombinantes que comprenden la secuencia de la esfingomielinasa D, componente principal del veneno de la araña violinista (Loxosceles boneti y Loxosceles reclusa y Loxosceles laeta (variedad peruana)), las cuales al ser inoculados en mamíferos generan una respuesta inmune eficaz para neutralizar la acción tóxica del veneno total de los respectivos arácnidos. También se refiere al uso de estas proteínas como inmunogenos para la producción en vertebrados de anticuerpos contra los venenos totales de los respectivos arácnidos. También se refiere a las composiciones de dichos anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno y su uso en tratamientos del envenenamiento con la araña violinista, y a una matriz antigénica capaz de ligar específicamente anticuerpos neutralizantes del veneno del arácnido, útil para la purificación por inmunoafinidad de tales agentes seroterapéuticos y faboterapéuticos. Adicionalmente se refiere a un dispositivo diagnóstico que incorpora dicha matriz para determinar la especie a la que pertenece la araña causante de un envenenamiento, y al método para realizar dicho diagnóstico. En otro alcance de la invención también se incluyen los fragmentos de DNA que codifican para las respectivas proteínas recombinantes, y las construcciones de expresión para dichos fragmentos, así como las células bacterianas transformadas con dichas construcciones y el método para producir las proteínas por vía recombinante.

ANTECEDENTES Las arañas que pertenecen al género Loxosceles son conocidas comúnmente como violinistas por poseer una marca en forma de violín con el mástil hacia atrás en la parte antero superior del cefalotórax (Platnick, 2000).

Las arañas que están comprendidas en este género son cosmopolitas, generalmente encontrándose en regiones con clima tropical y templado (Ramos, 2000). En nuestro país se pueden encontrar alrededor de 39 especies de este género (Hoffman, 1976; Gerstch, 1983). En su hábitat natural se les puede encontrar en la corteza de árboles, debajo de piedras y en cuevas. Pueden encontrarse coexistiendo con los humanos: debajo de muebles, en los rincones de las paredes, en hendiduras, surcos de instalaciones pecuarias, madera, ladrillos y desperdicios abandonados. Una de las principales causas por las que se suscitan accidentes de mordedura por Loxosceles es, precisamente, la constante convivencia con el hombre.

El envenenamiento causado por la mordedura de una araña del género Loxosceles se llama LOXOSCELISMO. EL efecto de la mordedura de la araña violinista comúnmente da lugar a lesiones necróticas locales o dermonecrosis (Loxoscelísmo necrótico), mientras que en algunos casos llega a causar efectos sistémicos no necrosantes (Loxoscelísmo sistémico).

El grado de necrosis local se relaciona con el estadio en el que se encuentre la araña, la dosis del veneno que inyecte en la mordedura y el estado inmunitario del paciente (Moye de Alba, 1997; Maguire, 1998).

La dermonecrosis es precedida por edema, acumulación de células inflamatorias y vasodilatación, lo cual culmina con una vesícula negra llamada comúnmente "ojo de buey". Ocasionalmente el género Loxosceles puede, además, producir hemolisis intravascular asociada a esferocitosis, alteración que persiste durante varios días (Maguire, 1998; Rosse, 1998).

En México, en el Seguro Social (información personal, Dra. Ma. Del Carmen Sánchez, Hospital "La Raza", México D.F.) se presentaron 15 casos en los últimos 5 años, 1 1 en adultos y 4 en menores. En el 53.3% de los casos, además del loxoscelísmo necrótico, se presentó loxoscelísmo sistémico, de los cuales el 62% murió en consecuencia.

Bioquímica del veneno Hasta el momento pocos venenos de arañas se han estudiado con detalle. El veneno de Loxosceles está compuesto por lo menos de diez a doce componentes (Russell, 1987), entre los que figuran: esterasas, fosfatasa alcalina, hialuronidasa, fosfohidrolasas, lipasas y proteasas, entre otros. Hasta ahora se ha demostrado que el componente principal y causante de la dermonecrosis es la esfingomielinasa D (SMD). Esta enzima se une a las membranas de células (epiteliales, endoteliales del tejido vascular y eritrocitos) hidrolizando a los esfingolípidos para posteriormente liberar fosfoceramida y colina (Gatt, 1978). La hidrólisis induce la quimiotaxis de neutrófilos ocasionando trombosis vascular y una reacción de tipo Arthus (Moye de Alba, 1997; Maguire, 1998; Sanchéz, 1993).

Las hiaiuronidasas, otras enzimas involucradas en el envenenamiento, son comunes en los venenos de casi todas las arañas (Tan y Ponnundurai, 1992). Han sido detectadas en un número considerable de especies (Geren, 1984) incluyendo a Loxosceles sp., aunque en éstas se ha reportado muy baja actividad enzimática (Wright, 1973). Las hiaiuronidasas están consideradas como factores de dispersión del veneno, debido a que la hidrólisis de ácido hialurónico facilita la difusión del resto de los componentes tóxicos dentro de los tejidos de la víctima (Cevallos et al., 1992). Las hiaiuronidasas actúan como factor dispersante y las proteasas se piensa que pudieran estar implicadas directamente en la dermonecrosís a través de la digestión de las proteínas que componen la matriz extracelular (Young, 2001).

Recientes estudios han identificado dos proteasas, Loxolisina A y Loxolisina B presentes en L. Intermedia. Loxolisina A es una metaloproteasa de 20-28 kDa con actividad fibrigenolítica (degrada fibrinógeno) y fibronectinolítica (degrada fibronectina). Esta proteína pudiera estar involucrada en los efectos hemorrágicos observados localmente en el sitio de la mordedura y en algunos casos en las hemorragias a nivel sistémico, mientras que Loxolisina B es una proteasa de 32-35 kDa con actividad gelatinolítica, y aunque su función es aún desconocida, posiblemente participa en la degradación de colágena dentro de la matriz extracelular, (Feitosa et al., 1998).

En L. intermedia se han encontrado tres isoformas (P1 , P2 y P3) de la fracción necrotóxica, las cuales fueron altamente parecidas entre sí a nivel bioquímico e inmunológico. Siendo las dos primeras necrotóxicas, P2 con un mayor efecto, mientras que la P3 fue completamente inactiva. El análisis de las secuencias aminoacídicas de los primeros 35 aminoácidos del extremo amino terminal de las isoformas reveló una alta identidad entre las mismas. También se compararon con las secuencias parciales de las toxinas de otras especies de Loxosceles anteriormente reportadas, obteniendo un alto grado de similitud (Tambourgi, 1998).

En 1968 Smith y Micks demostraron que la inyección en conejos del veneno de L. reclusa, de L. laeta o de L. rufescens, producía reacciones necróticas similares. En recientes estudios se compararon las secuencias amino terminal de la esfingomielinasa del veneno de L. reclusa, L. deserta, L. gaucho, L. intermedia y L. laeta determinándose homología entre ellas (Bárbaro er a/., 1996B).

A la fecha se han reportado las secuencias completas de las esfingomielinasas D de solo 2 de las especies de Loxosceles, L laeta (Fernades Pedrosa et al. 2002) y L. intermedia (Kalapothakis et. al., 2002) estas presentan una identidad de apenas el 59% entre sí. Mientras que solamente se conocen los primeros 34 aa de la esfingomielinasa de L. reclusa, la cual resulta tener un 85.7% de identidad con la secuencia equivalente de L intermedia y 60% con la de L laeta, por lo que resulta imposible establecer una probable secuencia para los cerca de 244 aa que aún se desconocen de la enzima. Similarmente sólo se conocen 35 aa de la región amino terminal de la esfingomielinasa D de L. deserta y 39 de la de L. gaucho (para L. deserta sólo se conoce la secuencia derivada del gen).

Se han reportado trabajos de generación de anticuerpos contra especies particulares de Loxosceles y pruebas cruzadas de los mismos con venenos de arañas de otras especies del género. Por ejemplo se desarrolló un conjunto de anticuerpos monoclonales contra el componente dermonecrótico (de 35Kda) del veneno de L. gaucho que siendo efectivos para reconocer y neutralizar el veneno homólogo, su reconocimiento hacia los venenos de L. laeta y L intermedia fue mucho menor y su capacidad neutralizante fue casi nula, en comparación con anticuerpos policlonales generados contra el mismo componente de L gaucho que sí reconocieron y neutralizaron de manera suficiente el veneno de L. intermedia y de manera parcial (60%) el de L. laeta, sugiriendo la presencia de diferentes epítopes en los componentes dermonecróticos de estas especies, así como diferencias en las composiciones y toxicidades de estos venenos (Guilherme, et. al., 2001). Por otro lado, hay evidencia de una marcada reactividad cruzada entre los venenos de L. reclusa y L. deserta cuando se emplea el veneno de cualquiera de las 2 especies para generar los anticuerpos (Gómez, et. al. 2001).

En términos generales existen dos líneas para el tratamiento/prevención del envenenamiento por animales ponzoñosos como la araña violinista: la inmunización pasiva (mediante agentes seroterápicos y faboterápicos) y la inmunización activa (a través de vacunas), la primera es una medida terapéutica, mientras que la segunda es más bien una medida preventiva.

En la generación de vacunas han sido utilizados tanto venenos como toxinas aisladas. Sin embargo, la exposición a la mayoría de venenos no resulta en una inmunidad protectora. Más aún, todos los intentos por crear inmunidad protectora contra venenos como vacunas han fracasado (Russell, 1971). En contraste, ha habido éxitos creando este tipo de inmunidad contra toxinas individuales, incluyendo las vacunas contra la difteria (Audibert et. al., 1982), el tétanos (Alouf, 1985), el toxoide de la a-Latrotoxina (Alagón et. al. 1998) y la esfingomielinasa D de L laeta (Araujo, et. al. 2003).

Inmunización Pasiva El único tratamiento disponible para envenenamientos es la inmunización pasiva, además de tratamientos paliativos de algunos de los síntomas específicos.

En el caso de la inmunización pasiva, los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unirán al veneno (antígeno) son exógenos, es decir que son producidos en un primer animal. El suero o antiveneno del primer animal se administra entonces al individuo ya afectado por envenenamiento (huésped) para proveerle una fuente inmediata y activa de anticuerpos específicos y reactivos. Los anticuerpos o sus fragmentos suministrados funcionarán pues, en cierta forma como si fueran anticuerpos endógenos, ligando las toxinas del veneno y neutralizando su toxicidad.

La generación comercial de anti-venenos se puede realizar, dependiendo de su uso final, en diversos mamíferos tales como ratones, conejos, cabras, vacas y caballos, siendo el caballo el animal de elección de la mayoría de laboratorios, ya que es robusto y tolerante al proceso de inmunización y sobre todo por que produce altos rendimientos (hasta 16 L por sangrado).

Sin embargo, hay algunas desventajas técnicas en el uso de caballos para la producción de antivenenos entre las cuales se encuentra la necesidad de cantidades grandes de veneno (inmunógeno o antígeno) para realizar la inmunización, forzando al laboratorio a contar con grandes áreas de aracnarios o contratar grandes colectas de especímenes a fin de contar con suficientes cantidades de veneno. Por ejemplo, se estima que la producción, valoración y control de calidad de un lote de antiveneno en caballos requiere del veneno proveniente de cinco mil arañas muy bien estandarizado, lo que limita su factibilidad comercial. Por lo que el contar con inmunogenos recombinantes capaces de despertar una respuesta inmunológica comparable a la que despiertan los venenos aplicados, puede ser una alternativa considerable para la producción de antivenenos, pues se tendrían inmunogenos estables y consistentes y en cantidades suficientes, con costos y riesgos mucho menores que el manteniemiento de los aracnarios o el impacto a los ecosistemas de las colectas masivas Existen particularmente dos reportes del uso de proteínas recombinantes como inmunógenos para la generación de anticuerpos en mamíferos contra venenos de arañas, que son el toxoide de la a-Latrotoxina (Alagón et. al. 1998) y una proteína de fusión que comprende la secuencia de la esfingomielinasa D de Loxosceles intermedia (Araujo, et. al 2003).

En México y Latinoamérica uno de los principales productores de antivenenos contra venenos de serpientes y arácnidos (alacrán y araña viuda negra) es el Instituto Bioclón S.A. de C.V. que produce los anticuerpos en caballos para luego purificarlos e hidrolizarlos de manera tal que sus antivenenos son en realidad fragmentos F(ab)2 de los anticuerpos, es decir, son agentes faboterápicos. Particularmente producen un antiveneno contra el veneno de la araña viuda negra, el Aracmyn®.

Debido a la variedad de efectos colaterales comunes y serios de antivenenos no purificados, el médico debe tener mucha precaución para evitar dar cantidades excesivas de productos equinos. Una teoría generalmente aceptada es que la alta incidencia de efectos colaterales con los antivenenos de caballo actuales es debida al exceso de proteína irrelevante en las mismas (irrelevante en el sentido de no tener actividad específica contra el veneno). De acuerdo con esta teoría, la remoción de tal proteína irrelevante podría reducir la carga de proteína exógena aplicada al organismo y, consecuentemente, reducir la incidencia de respuestas inmunes adversas.

Algunos investigadores en el estado de la técnica han considerado la posibilidad de la purificación por inmunoafinidad. La mayoría de esos estudios sólo han examinado anticuerpos contra una sola toxina, por ejemplo Yang (1977) probó la purificación por inmunoafinidad de anticuerpos contra una toxina de veneno de serpiente. Este investigador usó la cobratoxina, una proteína neurotóxica aislada del veneno de la cobra de Taiwan {Naja naja atra), ligada a sepharose, como matriz antigénica y usando ácido fórmico para eluir los anticuerpos toxina-específicos. Se reportó que los anticuerpos así purificados tuvieron una mayor capacidad para neutralizar la toxina que el suero sin purificar.

Otros investigadores han seguido esquemas similares de purificación como Kukongviriyapan et. al., (1982) que utilizó la toxina 3 de Naja naja siamensis ligada a diveros materiales para formar matrices antigénicas, logrando una separación de anticuerpos específicos de caballo; Ayeb y Delori (1984) quienes también siguieron el esquema de Yang para purificar anticuerpos contra toxinas específicas de alacrán y Lomonte et al. (1985), quien purificó anticuerpos contra la miotoxina de B. asper acoplada a Sepharose.

De este modo, nuevamente el contar con esfingomielinasas recombinantes capaces de ligar, preferentemente unidos a una matriz inerte, de manera específica sólo aquellos anticuerpos o sus fragmentos que tienen una alta especificidad hacia el componente necrotóxico del veneno de la araña violinista, puede ser de gran ayuda para remover toda la proteína irrelevante para el tratamiento del envenenamiento, reduciendo significativamente los riesgos de reacciones inmunes adversas.

No es poco común que tras un incidente con Loxosceles, el médico tratante o incluso el paciente afectado o sus padres en caso de menores, asuman erróneamente que se trate del piquete de algún insecto o mordedura de algún otro tipo de araña y que por tanto apliquen un tratamiento insuficiente o erróneo al paciente. Para cuando empiecen a aparecer los síntomas inequívocos del loxocelismo, la necrosis del tejido adyacente a la herida pudiera estar ya muy avanzada y sólo encontrar remedio en el injerto de piel. En este sentido sería conveniente contar con un sistema diagnóstico de fácil lectura, que permita al médico tratante determinar en las primeras horas posteriores al incidente si efectivamente se trata de una mordedura de la violinista e iniciar de manera inmediata un tratamiento efectivo que evite el desarrollo de la necrosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Cromatograma de la filtración de exclusión molecular en gel (Sephadex G-75) del extracto de glándulas de L. boneti. Los números romanos corresponden a las distintas fracciones obtenidas. La línea roja corresponde a la absorbancia a 260 nm y la azul a 280 nm.

Figura 2. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas por cromatografía en gel. 1) Marcadores de Peso Molecular. 2) Fracción I (2.24 µg). 3) Fracción II (3.84 µg). 4) Fracción III (1.44 µg). 5) Fracción IV (8 µg), 6) Usado de glándulas de L. boneti (28µg).

Figura 3. Resultado de la Cromatografía de Intercambio catiónico de la fracción II de L. boneti. Cada pico representa una isoforma. Las flechas señalan otras posibles isoformas que se encuentran en menor cantidad dentro de la fracción II. La columna fue de tipo Mono S. La columna midió 5 cm de largo por 0.5 cm de diámetro. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min. La sensibilidad fue 0.2 AU. El buffer utilizado fue acetato de amonio 20 mM pH 4.7, utilizando un gradiente de 0-2 M NaCI. La velocidad de graficación fue de 15cm/hr.

Figura 4. Se muetra el alinemiento de las secuencias de las 5 proteínas con actividad SMD que están comprendidas por las proteínas recombiantes de la presente invención, con algunas otras reportadas en la literatura.

Número de acceso en el Gene Bank: *Lb1. AY559844 L. boneti *Lr1. AY559846 L. reclus *Lr2. AY559847 L. reclusa *LI1. L. laeta *LI2. — - L. laeta La. AAP44735 L arizonica Li. AAQ16123 L. laeta LI.H17. AAM21154 L laeta LIH13. AAM21155 L. laeta * Esta Patente Figura 5. Se presentan los porcentajes de identidad de aminoácidos entre las esfingomielinasas D de diversas especies de Loxosceles. Número de acceso en el Gene Bank: especie *Lb1. AY559844 L. boneti *Lr1. AY559846 L reclus *Lr2. AY559847 L. reclusa *LI1. L. laeta *LI2. L laeta La. AAP44735 L. arizonica Li. AAQ16123 L. laeta LI.H17. AAM21154 L. laeta LIH13. AAM21155 L laeta * Esta Patente DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones El término "anticuerpo" es usado para referirse a anticuerpos polyclonales y sus fragmentos.

El término "fragmento" referido a anticuerpos, comprende una porción del anticuerpos completo, generalmente el fragmento de unión al antígeno, por ejemplo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv.

Los términos "Neutralizar" o "neutralizante" o "anticuerpo neutralizante" se refieren a la capacidad de los anticuerpos de la presente invención de unirse a la esfingomielinasa D de arañas del género Loxosceles ya sea aislada o como parte del veneno total de dichas arañas, y cancelar su efecto tóxico y el de dicho veneno. El término "Tratamiento" se refiere a un tratamiento terapéutico. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen a aquellos individuos mordidos por una o más arañas del género Loxosceles.

El término "Toxoide" se refiere a una versión mutante de las proteínas recombiantes (SMD recombinantes) de la presente invención que carecen de actividad enzimática y dermonecrótica, pero que conservan la propiedad de generar anticuerpos netrualizantes del veneno de la araña Loxosceles al ser utilizadas para inmunizar vertebrados, particularmente maíferos.

Por "acarreador farmacéuticamente aceptable" se entiende un excipiente sólido o líquido, diluyente o sustancia la que se puede utilizar con seguridad en la administración sistémica o tópica. Dependiendo de la ruta particular de administración, una variedad de acarreadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el estado del arte incluye excipientes sólidos o líquidos, diluyentes, hidrotopos, agentes activos de superficie, y sustancias encapsuladoras. La cantidad del acarreador que se emplea en conjunción con los anticuerpos o sus fragmentos F(ab')2 proporciona una cantidad práctica manejable de material por dosis unitaria de la composición.

Los acarreadores aceptables para la administración sistémica que se pueden incorporar en la composición de la presente invención incluyen azúcar, almidones, celulosa, aceites vegetales, buffers, polioles y ácido algínico. Los acarreadores específicos farmacéuticamente aceptables se describen en los siguientes documentos, todos los cuales - lo se encuentran incorporados por referencia al presente: patente estadounidense 4,401 ,663 Buckwalter et al. emitida el 30 de agosto de 1983; Solicitud de Patente Europea Núm. 089710, LaHann et al., publicada el 28 de septiembre de 1983; y Solicitud de Patente Europea Núm. 0068592, Buckwalter et al., publicada el 5 de enero de 1983. Los acarreadores preferidos para la administración parenteral incluyen propilen glicol, pirrolidol, oleato etílico, etanol acuoso y combinaciones de lo anterior.

Los acarreadores representativos incluyen la acacia, agar, alginatos, hidroxialquilcelulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, carboximetilcelulosa, carragenina, celulosa en polvo, goma guar, colesterol, gelatina, goma de agar, goma arábica, goma de karaya, goma de ghatti, goma de algarroba, octoxinot 9, alcohol olílico, pectina, ácido poliacrílico y sus homólogos, poliétilenglicol, alcohol polivinílico, poliacrilamida, lauriil sulfato de sodio, óxido de polietileno, polivinilpirrolidona, monoestearato de glicol, monoestearato de propilen glicol, goma xantana, tragacanto, ásteres de sorbitan, alcohol estearílico, almidón y sus modificaciones. Los rangos apropiados varían de alrededor del 0.5% a alrededor del 1 %.

Como se desprende de los antecedentes, a diferencia del problema de envenenamiento por la araña viuda negra (Latrodectus mactans) para la que ya existen algunos tratamientos por antivenenos (fragmentos Fab2 de anticuerpos policlonales de caballo), para el loxoscelismo, aún no existe ningún tratamiento comercial. La generación de antivenenos por inmunización con veneno de la araña pudiera ser una alternativa, sin embargo, tiene el inconveniente de que se requeriría de una gran cantidad de arañas (unas 5,000 por lote) para extraerles cantidades suficientes de veneno, además su uso implica que el suero producido por el animal contiene una gran cantidad de anticuerpos contra las muy diversas proteínas del veneno, la gran mayoría de las cuales no tienen o tienen efectos mínimos en el proceso de envenenamiento en mamíferos y, por tanto, los anticuerpos contra las mismas no tienen mayor aporte al tratamiento del envenenamiento y sí en cambio contribuyen una gran cantidad de proteína exógena al organismo en tratamiento, pudiendo ocasionar daños laterales severos. En general, algunos enfoques que se han seguido para reducir esa cantidad de proteína, han sido el separar la fracción de inmunoglobulinas del suero, eliminando otras proteínas séricas (como la albúmina) por precipitación con sulfato de amonio o sodio, con la correspondiente disminución de la actividad neutralizante, y la hidrólisis con tripsina o pepsina de tal fracción para liberar los fragmentos F(ab) o F(ab)2, que conservan la actividad neutralizante. Sin embargo, la fracción de anticuerpos o sus fragmentos siguen teniendo una alta proporción de proteína irrelevante (por ser fragmentos de anticuerpos contra todos los componentes del veneno total y contra múltiples antígenos indefinidos).

Este problema podría ser resuelto mediante una purificación por inmunoafinidad si se contara con una matriz inmunógena que permitiera separar de manera específica de la fuente de inmunoglobulinas o de los fragmentos producto de su hidrólisis, aquellos anticuerpos o fragmentos específicos, responsables de la neutralización del efecto tóxico del veneno total.

Por otro lado, como se mencionó anteriormente, existe una necesidad de contar con un sistema diagnóstico confiable que de manera rápida y sencilla permita al médico tratante determinar si se trata de una mordedura de Loxosceles y poder entonces proceder inmediatamente a aplicar un tratamiento adecuado que evite la necrosis del tejido adyacente a la zona de la mordedura.

Para resolver estos problemas, los inventores de la presente invención han abordado la estrategia de caracterizar el veneno de L. boneti, aislar y purificar su componente dermonecrótico y aislar y caracterizar el ADN codificante del mismo, así como el ADN codificante del componente dermonecrótico de L reclusa y L laeta (variedad peruana), clonar las secuencias codificantes en vectores de expresión adecuados, expresar las proteínas recombinates activas y probarlas en cuanto a su capacidad de generar una respuesta inmune eficaz en la neutralización de la propia necrotoxina y del veneno homólogo total, así como en pruebas de reacción cruzada, del veneno de estas especies de Loxosceles.

Las proteínas recombinantes activas de L. boneti (SMDrLb), L. reclusa (SMDrLr) y L laeta (variedad peruana) (SMDrLI) pueden ser utilizadas como inmunógenos para la generación de antivenenos en vertebrados; ligadas a soportes sólidos o semisólidos para generar matrices antigénicas útiles para inmunopurificaciones de antivenenos; y en el diseño y construcción de sistemas diagnósticos para determinar si un paciente padece de loxoscelismo.

Como se detalla en el ejemplo 1 , los inventores de la presente invención separaron el veneno total de L. boneti en fracciones, encontrando que sólo la fracción II presenta actividad dermonecrótica y lograron separar 3 isoformas del componente dermonecrótico. Encontraron que sólo las isoformas I y II son activas, siendo la primera la de mayor actividad, y obtuvieron la secuencia aminoacídica del amino terminal de las tres isoformas, mismas que se usaron para diseñar los oligos específicos para obtener las clonas del componente necrotóxico a partir del RNAm extraído de glándulas venenosas de las arañas (ver ejemplo 3) siendo seleccionada la clona 30-8 para su expresión. Para ello la clona 30-8 fue subclonada en el plásmido pTrcHIS-TOPO, obteniéndose el plásmido pTrcHIS-TOPO 30-8 (ver detalles en el ejemplo 4) y expresada en E. coli XL1 Blue lográndose su expresión en forma de cuerpos de inclusión, que fueron solubilizados y refoldeados. La proteína recombinante solubilizada y refoldeada careció de actividad esfingomielinasa D (SMD) y dermonecrótica y los anticuerpos generados en conejos contra la misma, aunque capaces de reconocer la proteína mediante Western Blot, fueron incapaces de neutralizar el veneno completo de la araña L boneti.

Tras un análisis, se consideraron los siguientes factores para tratar de expresar la proteína recombinante en forma soluble y activa: i) La secuencia del fragmento utilizado carecía de los primeros 4 codones por lo que la secuencia aminoacídica de la proteína recombinante carecía de los primeros 4 aminoácidos del extremo amino terminal; ii) el vector pTrcHIS-TOPO tiene justo antes del sitio de corte de BamH I la secuencia de 36 aa, incluyendo la metionina inicial y una cola de 6 histidinas útiles para la recuperación de la proteína, que más los 2 codones ocupados por el sitio de BamH I, le agregan un total de 38 aminoácidos a la proteína recombinante, los cuales pudieran ser responsables del mal plegamiento de la misma; y iii) es sabido (véase el pET System Manual) que algunas cepas de E. coli pueden favorecer el plegamiento adecuado de algunas proteínas recombinantes que expresan. Adicionalmente, se había reportado la expresión exitosa de la proteína recombinante que comprende la secuencia aminoacídica de una de las isoformas de la esfingomielinasa D de L laeta en E coli BL21 (Fernandes Pedroza. et. al. 2002).

Por ello se decidió completar la secuencia codificante (los 4 aminoácidos faltantes) como se muestra en el ejemplo 5; cambiar al vector de expresión pQE-30 que sólo agrega 12 aminoácidos a la proteína recombinante; y expresarlo en la cepa BL21 de E. coli (ver ejemplo 6). Nuevamente se obtuvo una expresión, aunque cuantiosa, en forma de cuerpos de inclusión con una actividad enzimática despreciable.

Es sabido que si la expresión es demasiado cuantiosa, toda la proteína se acumula en forma de cuerpos de inclusión, por lo que puede ser recomendable tratar de reducir la expresión de la proteína. Para lo cual se realizó una expresión controlada de la proteína, como se detalla en el ejemplo 7, lográndose esta vez expresar la proteína tanto en forma de cuerpos de inclusión como soluble, que una vez purificada demostró tener la misma actividad específica que la isoforma I nativa, y con una LD50 de 2.55 µg por ratón.

La esfingomielinasa D recombinante soluble de L. boneti (SMDrLb) así producida fue utilizada para inmunizar conejos (ver ejemplo 8) obteniéndose títulos de hasta 29,300. Los anticuerpos resultantes fueron neutralizante tanto de la proteína recombinante activa (DE50 = 154.6^/ratón para 7^g del antígeno), como del propio veneno nativo de la araña L. boneti (DE50=149.6^/ratón con 3 DL50 del veneno nativo).

Con base en la experiencia seguida para la obtención de la esfingomielinasa D (el componente dermonecrótico) de L boneti, se procedió a obtener las esfingomielinasas D de L reclusa y L. laeta (variedad peruana). En el primer caso se conoce de la literatura la secuencia aminoacídica de los primeros 34 aminácidos del amino terminal de la esfingomielinasa D de L reclusa (Bárbaro, K.C. et. al., 1996) y al coincidir exactamente los primeros 5 aminoácidos con los correspondientes de L. boneti, se decidió utilizar los mismos oligos para obtener el cDNA del componente dermonecrótico a partir del RNAm extraído de glándulas de la araña (ver ejemplo 9). En este caso se obtuvieron los cDNA de dos isoformas activas de la SMD de L. reclusa, SMDrLrl y la SMDrLr2 (con un 90% de identidad entre sí) con actividad de 27.2 U/mg para la SMDrLrl y 11.47 U/mg para la SMDrLr2. Similarmente a lo realizado para L boneti, los inventores subclonaron las clonas en el plásmido pQE-30 y se expresaron en forma controlada en la cepa de E. coli BL21 (ver ejemplo 10). Para ejemplificar su uso como inmunógenos para la generación de anticuerpos neutralizantes del veneno de la araña L. reclusa, una de las esfingomielinasas D recombinantes solubles y activas de L. reclusa así producida, la SMDrLrl fue utilizada para inmunizar conejos (ver ejemplo 11) obteniéndose títulos de hasta 33,000. Los anticuerpos resultantes fueron neutralizantes tanto de la proteína recombinante activa (DE50 = 165 µ?/ratón con ^g de proteína recombinante), como del propio veneno nativo de la araña L reclusa (DE50=175 µ?/ratón con 12 µg de veneno).

En el segundo caso, se conoce de la literatura la secuencia aminoacídica completa de algunas de las isoformas activas de la esfingomielinasa D de L. laeta (variedad Brasileña) (Fernades Pedrosa et. al., 2002). Con base en ellas, se diseñaron los oligos LI5'Bam Hl y LI3'Sal I para obtener el cDNA del componente dermonecrótico a partir del RNAm extraído de glándulas de la araña (ver ejemplo 12). En este caso los inventores lograron aislar los cDNA de 2 isoformas distintas entre sí y activas, la primera de ellas la SMDrLU con una actividad de 58.43 U/mg y la segunda SMDrLI2 con una actividad de 252 U/mg. Similarmente a lo realizado para L. boneti y L. reclusa, los inventores subclonaron las clonas en el plásmido pQE-30 y se expresaron en forma controlada en la cepa de E. coli BL21 (ver ejemplo 13). Al ser secuenciados los fragmentos de ADN codificantes una de las proteínas codificadas, la SMDrLU resultó tener una secuencia primaria ligeramente distinta (99% de identidad) a la reportada por Fernades Pedrosa, et. al. para la isoforma H17 (que es la isoforma que reporta como activa), mientras que la SMDrLI2, que en la presente invención resulta tener cerca de 3 veces la actividad de la SMDrLU , presentó una secuencia 94% idéntica a la isoforma H13 que es reportada por Fernades Pedrosa, et. al. como inactiva. Para ejemplificar su uso como inmunógenos para la generación de anticuerpos neutralizantes del veneno de la araña L reclusa, una de las esfingomielinasas D recombinantes solubles y activas de L. laeta (variedad peruana) así producidas, la SMDrLU fue utilizada para inmunizar conejos (ver ejemplo 14) obteniéndose anticuerpos neutralizantes tanto de la proteína recombinante activa (DE50 = 200µ? por ratón para 12µ9 de proteína) como del propio veneno nativo de la araña L laeta (variedad peruana) (DE50= 225µ? por ratón para 12µg de veneno).

Las proteínas recombiantes de la presente invención SMDrLb, SMDrLrl , SMDrLr2, SMDrLU y SMDrLI2 fueron expreadas utilizando el plásmido PQE30, que adiciona a la región amino (versiones amino) de la proteína una secuencia de 12 aminoácidos MRGSHHHHHHGS (SEQ. ID. NO: 25) que incluyen una cola de 6 Histidinas. Sin embargo, pueden ser expresadas en otros sistemas de expresión que introduzcan ya sea al extremo amino o al carboxilo de las proteínas otras secuencias de aminoácidos. Un ejemplo es el plásmido PQE60 (INVITROGEN) que incluye en la región amino solo los aminoácidos Metionina, Glicina y Serina, mientras que en el extremo carboxilo incluye una secuencia de 8 aminácidos RSHHHHHH (SEQ. ID. NO: 26). En el ejemplo 16 se subclonaron las clonas Lb1 , Lr1 , Lr2 y LI2 en el plásmido PQE60 y se expresaron de manera controlada para obtener las versiones carboxilo de las proteínas (con la cola de Histidinas en dicho extremo). Las proteínas recombinantes obtenidas que al igual que las versiones amino respectiva comprenden las secuencias SEQ.ID.NO:11 , SEQ.ID.NO:13, SEQ.ID.NO:15 y SEQ.ID.NO:21 , resultaron activas.

Un primer alcance de la presente invención se refiere, pues, a las proteínas recombinantes SMDrLb, SMDrü , SMDrl_r2, SMDrLU y SMDrLI2, sin importar si se trata de sus versiones amino (con la cola de Histidinas en el extremo amino) o versiones carboxilo (con la cola de Histidinas en dicho extremo) que comprenden las secuencias de las esfingomielinasas D nativas de las arañas L. boneti, L reclusa y L. laeta respectivamente SEQ. ID. No: 11 , SEQ. ID. No: 13, SEQ. ID. No: 15, SEQ. ID. No: 19 y SEQ.ID.No:21 o mutaciones de dichas secuencias, y que presentan actividad de esfingomielinas D.

Un segundo alcance de la presente invención se refiere a los fragmentos de DNA que comprenden las secuencias codificantes de las proteínas recombinantes SMDrLb, SMDrLrl , SMDrl_r2, SMDrLU y SMDrLI2, con secuencia SEQ. ID. No: 10, SEQ. ID. No: 12, SEQ. ID. No: 14, SEQ. ID. No: 18 y SEQ.ID.No: 20, respectivamente, cuya obtención se detalla en los ejemplos 5, 9 y 12 Es conocido que el código genético es degenerado, es decir, que para un mismo aminoácido suele haber más de un codón codificante, comúnmente, la diferencia entre esos codones es la tercera de las bases. Es obvio para un experto en el estado de la técnica, que es posible llevar a cabo sustituciones de algunas bases en cualquiera de las secuencias nucleotídicas codificantes de las proteínas recombinantes de la presente invención (SMDrLb, SMDrLrl , SMDrLr2, SMDrLU y SMDrLI2), que codifiquen exactamente las mismas secuencias aminoacídicas que las presentadas en las SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 , generándose "mutaciones silenciosas" de las mismas. Esto puede ser particularmente útil cuando se desea expresar las proteínas recombinantes de la presente invención en hospederos recombinantes distintos, pues es sabido que diferentes tipos de hospederos tienen una "preferencia" de uso hacia ciertos codones para determinados aminoácidos. Tales "mutaciones silenciosas" caen dentro del alcance de la presente invención, pues el producto de su expresión es nuevamente las mismas proteínas recombinantes SMDrLb, SMDrLrl , SMDrLr2, SMDrLU y SMDrLI2 de la presente invención.

Por otro lado, también es obvio para un experto en el estado de la técnica que es posible sustituir algunos aminoácidos por otros de características semejantes de las secuencias aminoacídicas, por ejemplo, un aminoácido polar por otro polar, uno aromático por otro aromático, uno cargado por otro, etc. No se espera que tales mutaciones produzcan cambios sustantivos en la actividad de las proteínas recombinantes, por ello aquellas mutaciones puntuales o sitio-específicas a los fragmentos de DNA codificantes de las proteínas recombinantes de la presente invención, que produzcan proteínas funcionalmente equivalentes (es decir que tengan actividad de esfingomielinasa D y causes dermonecrosis a un mamífero inoculado con ellas) quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Otro alcance de la presente invención se refiere a los métodos recombinantes para producir las proteínas SMDrLb, SMDrLrl , SMDrLr2, SMDrLU y SMDrLI2 mediante el uso de los fragmentos de DNA con secuencia SEQ. ID. No: 10, SEQ. ID. No: 12, SEQ. ID. No: 14, SEQ. ID. No: 18 y SEQ.ID.No: 20, respectivamente. Esto se ilustra en los ejemplos 7, 10 y 13.

De este modo un método general para la producción de las proteínas recombiantes de la presente invención comprende los pasos de: a) incubar en un medio adecuado y en condiciones adecuadas de cultivo, una cepa bacteriana recombinante transformada con un vector de expresión que comprende un fragmanto de DNA seleccionado del grupo que consiste de los fragmentos de DNA con secuencia SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 27 y SEQ. ID. NO: 29. b) opcionalmente, separar del medio la masa celular y c) romper las células para liberar la proteína y d) opcionalmente separar y purificar la proteína recombinante.

La selección del sistema de expresión vector-huésped puede ser variada, en la presente invención a modo ilustrativo más no limitativo, se eligió la cepa BL21 de E. coli para ser utilizada en los métodos de producción de las proteínas recombinantes de la presente invención y se realizó una expresión controlada de las mismas, mediante una inducción con IPTG 0.1 mM, por lo que preferentemente, en el método para la producción de las proteínas recombiantes de la presente invención, al alcanzarse una masa celular adecuada, se induce la expresión con una concentración de IPTG de 0.1 mM, a una temperatura entre 20 y 25°C y por un período de al menos 12 a 20 hr.

Otro alcance de la presente invención se refiere al uso de las proteínas recombinantes SMDrLb, SMDrLrl , SMDrLr2, SMDrLU y SMDrLI2 como inmunógenos para la generación en mamíferos de anticuerpos neutralizantes del efecto tóxico y dermonecrótico del veneno total de arañas del género Loxosceles con vistas a la producción industrial de antivenenos contra los venenos de tales arañas. Esto se ilustra claramente en los ejemplos 8, 1 1 y 14 en conejos.

Otro alcance de la presente invención se refiere a una matriz antigénica que comprende las proteínas recombinantes de la presente invención. Las proteínas recombinantes de la presente invención (SMDrLb, SMDrLrl , SMDrl_r2, SMDrL.11 y SMDrLI2), pueden también ser utilizados para generar una matriz antigénica al ser ligados ya sea covalentemente o por interacciones hidrofóbicas o hidrofílicas, a algún sustrato como la poliacrilamida, el polivinilo, la agarosa aldehido activada (patentes estadounidenses No. 5,904,922 y 5,443,976), la sepharose, la carboximetil celulosa o algún otro, de tal forma que esa matriz sea capaz de ligar específicamente ya sea anticuerpos (generados contra veneno total de las arañas Loxosceles o contra los mismo venenos enriquecidos con algunas de las proteínas recombinantes de la presente invención, o contra mezclas de tales proteínas recombinantes de la presente invención) o los fragmentos F(ab) o F(ab')2 obtenidos de la hidrólisis de tales anticuerpos, siendo útil en la purificación por inmunoafinidad de dichos anticuerpos o fragmentos F(ab) o F(ab')2, por lo que el uso de las proteínas recombinantes de la presente invención en la matriz antigénica y dicha matriz antigénica quedan incluidos en el alcance de la presente invención. Esta inmunopurificación de los anticuerpos o sus fragmentos durante el proceso de manufactura de antivenenos, ayudará a disminuir la proporción de proteína exógena irrelevante que se administra a un paciente mordido por una araña Loxosceles.

Otro alcance más de la presente invención se refiere al uso de las proteínas recombinantes de la presente invención (SMDrLb, SMDrLrl , SMDrLr2, SMDrLU y SMDrLI2) en diagnóstico. Es posible mediante el uso de cualquiera de las proteínas recombinantes de la presente invención generar anticuerpos monoclonales específicos contra algún epítope presente solamente en dicha proteína recombinante o la correspondiente toxina nativa del veneno de la especie homologa de araña Loxosceles, pero ausente en la toxina del veneno de las otras especies de Loxosceles. Estas proteínas recombinantes pueden ser usadas como parte de una matriz antigénica en la que estén ligadas covalentemente o por interacciones hidrofóbicas o hidrofílicas a un sustrato, y dicha matriz puede ser utilizada como parte de un dispositivo diagnóstico. Dicho dispositivo podrá ser utilizado para detectar la presencia en una muestra (de un individuo presuntamente mordido por una araña Loxosceles), de anticuerpos generados (por el organismo del individuo) específicamente contra la toxina nativa homologa del venenó de una araña Loxosceles específica, determinando si la araña que mordió al individuo pertenecía a esa especie de Loxosceles. Esto se puede realizar con cada una de las proteínas recombinentes de la presente invención, con lo que se lograría determinar a cual de las especies homologas (L. boneti, L. reclusa o L laeta variedad peruana) pertenece la araña causante de la mordida, dando al médico tratante una herramienta para dirigir el tratamiento en forma específica. Un método para diagnosticar si el animal que picó un individuo pertenece a una especie particular de la araña Loxosceles comprenderá el poner en contacto el dispositivo arriba mencionado con una muestra del individuo picado por el alacrán. Si están presentes, los anticuerpos generados particularmente contra la toxina natural del veneno de la araña que mordió al individuo reconocerán y se ligarán a alguna de las proteínas recombinantes del dispositivo. Un sistema de detección opcional puede ser utilizado para revelar la presencia de los anticuerpos de la muestra ligados a la proteína recombinante del dispositivo. Este sistema de detección puede estar basado en métodos inmuno-enzimáticos, de inmuno-fluorescencia o inmuno-cromatográfia.

MATERIAL Y METODOLOGÍA 1. ARAÑAS Los ejemplares de L boneti fueron colectados por gente capacitada para el reconocimiento del género Loxosceles, en las Comunidades de La Capilla y Corral de Toros, Municipio de Iguala, que se encuentran en la parte centro del Estado de Guerrero, según la distribución determinada por Hoffman, 1976 y Gerstch, 1983. Para confirmar esto se mandaron 10 hembras y 10 machos al Museo de Historia Natural de New York con el Dr. Norman Platnick, que las identificó como tales. Los ejemplares de L. reclusa fueron colectados en Stillwater, Oklahoma por los inventores de la presente invención, mientras que los ejemplares de L. laeta (variedad peruana) fueron colectados en la ciudad de Lima, Perú. 2. OBTENCIÓN DEL VENENO Las glándulas de las arañas fueron extraídas mecánicamente, jalando los quelíceros para desprenderlas. Estas se colocaron en buffer acetato de amonio 20 mM pH 4.7 y se maceraron con un homogenizador de teflón (50 aparatos venenosos por mi); se centrifugaron dos minutos a 14,000 rpm con el fin de quitar residuos sólidos y restos celulares no deseados; se almacenaron a -70 °C hasta su uso.

También se obtuvieron cantidades limitadas de veneno puro (diferente al extracto de glándulas descrito). Para ello se aprovechó el hecho de que algunas arañas expulsan, como resultado de la manipulación, pequeñas cantidades de veneno, las cuales fueron colectadas con tubos microcapilares. 3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS a) Cromatografía de exclusión molecular en gel Se empleó una columna de 170 cm de largo por 1.4 cm de diámetro. La resina seleccionada para empacar la columna fue Sephadex G-75 (SIGMA CHEMICAL CO.) debido a que su límite de exclusión es de 70 kDa. El buffer de corrida fue acetato de amonio 20 mM, pH 4.7. La velocidad de flujo en el experimento fue de 48 mi h"1 cm"2. Se aplicaron 72.56 mg de veneno (3.5 mi), medidos por absorbancia a 280 nm. Se colectaron muestras cada seis minutos de un volumen de 4.5 mi aproximadamente, leyéndose en el espectrofotómetro (Beckman DU650Í) bajo dos longitudes de onda: 260 nm y 280 nm. b) Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). La separación de las proteínas de los venenos se realizó en geles de poliacrilamida al 12.5%, en condiciones reductoras, a corriente constante. El equipo utilizado para este método fue el Mini Protean III (BIO-RAD). Para cada muestra sometida a electroforesis se utilizaron distintas concentraciones.

Para las condiciones reductoras se utilizó 2-mercaptoetanol a una concentración final de 2.5 %. Los marcadores de peso molecular preteñidos (BioLabs, Inc.) se usaron como estándares de peso molecular. Todas las muestras se desnaturalizaron previamente en baño María durante cinco minutos, incluyendo al marcador de peso molecular. Estas se corrieron a una corriente constante de 15 mA, hasta que el colorante penetró en el gel separador; posteriormente se incrementó a 25 mA. Una vez terminada la corrida del gel se procedió a llevar a cabo la tinción con azul Brillante de Coomassie durante una hora y se destiñió con una solución de ácido acético 10% y metanol 25% durante toda la noche con agitación constante. c) Cromatografía de intercambio iónico ( FPLC) La columna que se utilizó fue del tipo Mono S HR 5/5 (Pharmacia LKB Biotech) que es un intercambiador catiónico fuerte, basado en resinas hidrofilicas. El flujo utilizado para las corridas fue de 1 ml/min. Los buffers utilizados fueron los siguientes. Buffer inicial: Buffer A-Acetato de amonio 20 mM pH 4.7. Buffer límite: Buffer B-Acetato de amonio 20 mM pH 4.7 + 2 M cloruro de sodio.

Ambos buffers (filtrados con membrana de 0.22 mieras) se corrieron para calibrar la columna según las especificaciones del distribuidor: Una vez que la columna estaba equilibrada se procedió a inyectar la muestra. Ésta previamente fue centrifugada durante dos minutos a 14,000 rpm, con el fin de clarificar (quitar residuos y/o precipitados).

La sensibilidad del detector fue de 0.2 AU, la velocidad de flujo fue de 1 ml/min y el gradiente fue de 0 a 2 M cloruro de sodio. 4. ACTIVIDAD DE ESFINGOMIELINASA D.

La medición de esta actividad enzimática se llevó a cabo con el Amplex Red Sphingomielinase Assay Kit (Molecular Probes) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante, empleando diluciones seriadas (1 :1) a partir de *\ µ ?p\\.

. MEDICIÓN DE TÍTULOS POR ELISA DE LOS SUEROS Y DETERMINACIÓN DE REACCIONES CRUZADAS IN VITRO La titulación de los anticuerpos a partir de sueros se llevó a cabo por Inmunoensayos enzimáticos (ELISA de sus siglas inglés Enzyme Linked Immuno Assay). Éste ensayo también fue utilizado para observar posibles reacciones cruzadas.

La prueba de ELISA consistió en: 1. Sensibilizar placas de 96 pozos para ELISA (Maxi sorp, NUNC™ Brand products) con una solución de antígeno a una concentración de 5 µg/ml, reconstituida en 100 mM carbonato/bicarbonato pH 9.5.

Por cada pozo se colocaron 100 µ? hasta la columna 11 , ya que el carril 12 fungió como control negativo. La placa se incubó toda la noche a 4 °C. 2. Una vez concluida la incubación, se lavó tres veces con 200 µ? de solución de lavado. Se tuvo que repetir este proceso cada vez que se pasaba al siguiente paso a lo largo de toda la técnica. 3. Posteriormente se bloquearon los sitios inespecíficos de pegado para proteínas con 200 µ? de solución de bloqueo, durante 2 horas a 37 °C. 4. Repetición del paso 2. 5. Se hicieron diluciones seriadas de los sueros con una dilución inicial de 1 :30 en buffer de reacción para ELISA (señalada en el apéndice correspondiente). En cada pozo se adicionaron 100 µ? de la solución de reacción para ELISA y se mezclaron 50 µ?/???? de la dilución del suero anti-loxosceles en la columna 1 , para proceder a las diluciones seriadas 3x hasta la columna 10 dejando la 11 y 12 como controles. Se incubó por una hora a temperatura ambiente. 6. Se repite el paso 2. 7. Después se incubó el segundo anticuerpo anticonejo conjugado a la enzima peroxidasa diluido 1 :1000 en solución de reacción para ELISA, poniendo 100 µ?/????. El tiempo de incubación fue de 1 hora a temperatura ambiente. 8. La reacción se reveló con 100 µ?/???? de sustrato ABTS (Boehringer), incubándose por 5 minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos la reacción se detuvo con 25 µ? de ácido fluorhídrico (Aldrich) y se procedió a leer la placa en un lector de ELISA (modelo BIO-RAD 550) a 405 nm.

Para determinar los títulos de las lecturas obtenidas, las curvas sigmoideas fueron generadas con el programa GraphPad Prism (Versión 2; GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). El punto de inflexión se calculó ajustando los datos experimentales para cada veneno y cada antiveneno por regresión no-lineal de las curvas sigmoides. 6. PRUEBAS DE WESTERN-BLOT. Esta es una técnica que se utiliza para identificar de una mezcla a proteínas o fragmentos de éstas, cuáles reaccionan con un determinado anticuerpo o antisuero. Los Western-Blot se hicieron según el protocolo de Mathews y Holde (1998).

Se prepararon geles de poliacrilamida al 12.5% que se corrieron de manera acostumbrada para separar los componentes proteicos de los venenos de L. boneti y L reclusa. La cantidad de veneno utilizada para cada ensayo fue de 30 µg por carril. Una vez terminada la corrida de los geles se realizó la transferencia durante una hora a corriente constante (400 mA) a una membrana de nitrocelulosa (soporte sólido). Para ésto se utilizó una cámara de transferencia bajo condición semihúmeda (OWL). Una vez terminada la transferencia la membrana se bloqueó durante toda la noche con agitación constante a temperatura ambiente en una solución al 5 % de leche descremada/TBST, para impedir el pegado inespecífico de los anticuerpos. Pasado este tiempo se procedió a lavar las membranas tres veces con TBST 1X (diez minutos cada lavado). Posteriormente se incubó con el primer anticuerpo en 0.1% de leche descremada en polvo (Carnation o Svelty/TBST) con agitación constante a temperatura ambiente por una hora (se diluyó de acuerdo al título del anticuerpo). Las diluciones utilizadas en este ensayo fueron 1 :1000, 1 :2500 y 1 :5000.

Concluida la incubación se continuó con tres lavados de diez minutos con TBST 1X cada uno. Se procedió a incubar una hora a temperatura ambiente y con agitación constante con el segundo anticuerpo en 0.1 % de leche descremada/TBST. Como segundo anticuerpo se utilizó anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina (ZYMED).

Pasada la hora de incubación, se lavó tres veces por diez minutos con TBST, se eliminó el TBST del último lavado y se agregó el buffer de reacción NTB-BClP el cual se dejó reaccionar durante cinco minutos, parándose la reacción con 5mM EDTA. 7. DETERMINACIÓN DE LAS DL50 Para determinar la DL50 de la SMDrLb y la SMDrLr los venenos nativos de L reclusa y L. boneti, se usaron grupos de 5 ratones Balb/c de 18-20 g, aplicándoseles intraperitonealmente cantidades variables de toxina, desde 0.6 hasta 17.57 µg de toxina por animal, encontrándose una DL50 de 2.55 µg de SMDrLb y de 6µg de SMDrLr por ratón. La SMDrLb empleada tenía una concentración de 331 µg/ml (por técnica BCA) y una actividad de esfingomielinasa D de 104.77 U/ml, la SMDLr tenía una concentración de 53^g/ml y una actividad de esfingomielinasa D de 103.38 U/ml. Los cálculos fueron realizados por el programa GraphPad Prism (Versión 2; GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). Los venenos empleados presentaron una concentración de 3,300µg/ml de proteína (BCA) y una actividad esfingomielinasa D de 7.5U/mg, para el de L. boneti, y 5,800>g/ml (BCA) y 9.05U/mg para el veneno de L. reclusa. 8. DERMONECROSIS EN CONEJOS La actividad dermonecrótica fue evaluada en conejos y fue determinada como la describió Furlanetto et al. (1962a, b).

Se utilizaron distintas concentraciones del veneno que se diluyeron en 0.2 mi de buffer PBS pH 7.4 o en 0.2 mi de acetato de amonio 20 mM pH 4.7. Éstas se inyectaron intradérmicamente en el lomo de dos conejos A fin de ilustrar mejor la presente invención y su modo de uso, se proporcionan los siguiente ejemplos específicos para ayudar al lector a comprender mejor los diversos aspectos de la práctica de la presente invención. Dado que estos ejemplos específicos son simplemente ilustrativos, en ningún caso deberá considerarse las siguientes descripciones como limitantes al alcance de la presente invención: EJEMPLO 1. Caracterización bioquímica del veneno de Loxosceles boneti. Para caracterizar el veneno de la araña Loxosceles boneti, que se distribuye en México, particularmente en los estados de Guerrero, Puebla y Morelos, se obtuvo extracto de glándulas de la araña. El extracto fue liofilizado y reconstituido en acetato de amonio 20 mM pH 4.7, observándose la formación de un precipitado. Un análisis en SDS-PAGE (condiciones reductoras) mostró que la proteína de interés se conservó principalmente en el sobrenadante, con el que se continuó trabajando. Este se separó por cromatografía de exclusión molecular en gel, observándose 4 picos principales (Figura 1). Correspondientemente, las muestras se separaron en 4 fracciones, conteniendo la fracción II la proteína de aproximadamente 32KDa que presumiblemente sería la esfingomielinasa (Figura 2). Esta fracción II se caracterizó por Cromatografía de Intercambio Iónico por FPLC para buscar posibles isoformas como en los casos reportados de L. reclusa y L. intermedia, obteniéndose tres picos mayoritarios correspondientes a las Isoformas I, II y III (Figura 3). De éstas sólo las isoformas I y II resultaron tener actividad dermonecrótica probada en piel de conejos, como lo describió Furlanetto et al. (1962a, b). La actividad de esfingomielinasa de la fracción II (que comprende las 3 isoformas) fue de 25 U/mg. Cada una de las 3 isoformas separadas, se secó por centrifugación en SAVANT y luego se secuenció en un equipo automatizado Beckman LF3000, utilizando la química de Edman (Walsh et al. 1981).

De la isoforma I se lograron secuenciar los primeros 35 aminoácidos (SEQ. ID. NO: 1), de la isoforma II, los primeros 33 (SEQ. ID. NO:2) y de la isoforma III, los primeros 22 (SEQ. ID. NO:3). La actividad enzimática para la isoforma I resultó ser de 30.5 U/mg para la isoforma II de 9.5 U/mg y para la Isoforma III fue de 0 U/mg.

EJEMPLO 2. Generación de anticuerpos policlonales en mamífero contra el veneno de L. boneti y reacción cruzada con el veneno de L. reclusa.

Para generar anticuerpos anti veneno de L boneti, se inocularon 2 conejos mediante un esquema de 13 inmunizaciones. En las 9 primeras se administró extracto de glándulas de L. boneti, en cantidades crecientes desde los 20 hasta los 250µg, mientras que en las inoculaciones restantes se administraron 60, 80 y 100 µg la fracción II (mezcla de las 3 isoformas), obtenida de la cromatografía de exclusión molecular en gel. Las inmunizaciones se llevaron a cabo cada 10 días. En todos los casos se inyectó un volumen de 1 ml (en PBS) intradérmico con adyuvante incompleto de Freund, salvo la primera que fue con adyuvante completo de Freund.

Los sueros obtenidos fueron titulados, obteniéndose títulos de hasta 30,000. En reacciones cruzadas con veneno de L. reclusa, los títulos fueron de hasta 23,000. En la Figura 4 se muestra un Western Blot del veneno de L. reclusa y L. boneti (separados por SDS-PAGE) revelados con el suero anti L boneti, donde se muestra claramente la afinidad hacia el componente de 32.5 KDa de ambos venenos.

EJEMPLO 3. Aislamiento de las clonas parciales de las necrotoxinas de L. boneti.

Para el aislamiento de las clonas de las necrotoxinas, se aisló el RNAm de las glándulas venenosas de arañas de cada especie por el método de TRIZOL (Gibco) siguiendo el protocolo del fabricante. Para la síntesis de primera cadena se utilizó el kit 3' RACE (Gibco). 2µ? del RNAm total (aproximadamente 500ng) extraído de glándulas, 4µ? de agua y 1 µ? (10 pmoles) del oligonucleótido Adapter Primer (AP), que comprende una cola de poli Ts (SEQ.ID. NO:4), fueron incubados para desnaturalizar, a 7°C por 10 min e inmediatamente enfriados en hielo. Se añadió 2µ? de Buffer PCR 10X, 1 µ? de dNTPs (10mM), 2µ? de MgCI2 (25mM) y 2 µ? DTT (0.1 M), preincubándose por 2 a 4 min a 42°C. Se agregó inmediatamente 1 µ? de Reverse Transcriptase Superscript (Invitrogen), se mezcló e incubó por 50 min a 42°C. Se inactivo la enzima incubando 15 min a 70°C e inmediatamente se enfrió la mezcla en hielo por un min. Se añadió 1 µ? de RNAsa H y se incubó por 20 min a 37°C y se almacenó a -80°C.

Para la reacción de polimerasa en cadena (PCR), se tomó una muestra de la reacción de primera cadena (2µ?) y se adicionaron a buffer PCR 10X Mg2+ (100mM TRIS-HCI pH8.3, 500 mM KCI 15mM MgCI2 ,), 200µ? dNTPs, 20 pmoles del oligonucleótido directo (en el sentido 5'-3'), 20 pmoles del oligonucleótido reverso (en el sentido 3'-5') AUAP (Gibco) (SEQ.ID. No: 5) y dos unidades de Taq DNA Polymerasa (ROCHE) en un volumen final de 50 µ?. La reacción se llevó a cabo usando un termociclador Perking Elmer 9600 con el siguiente protocolo: Incubación de la mezcla durante 3 min a 94°C, seguidos 25 ciclos de tres pasos de incubación: 1 min a 94°C, 90 seg a 48°C y 2 min a 72°C. La Taq DNA polymerasa pega en los extremos 3' una A útil para hibrídar con la T de los extremos 5' del vector de clonación linealizado pCR 2.1 -TOPO (3.9Kb).

Para el caso de L. boneti, se diseñaron 2 oligonucleótidos con base en la secuencia aminoacídica común determinada común a las isoformas I y II, el oligo Lb1 (SEQ. ID. NO:6) correspondiente a la secuencia de los aminoácidos 5 a 10 del amino terminal de las isoformas I y II y el oligo Lb-nested (SEQ.ID.NO:7) que comprende la última base del aa 7 y |as del 8 a 12 y las dos primeras bases del aa 13. El primero se empleó para la reacción PCR mientras que el segundo se empleó para un PCR confirmatorio. En ambos caso se utilizó el oligo comercial AUAP (GIBCO) (SEQ ID NO:5) que reconoce específicamente la secuencia del oligo AP de la misma compañía.

Los productos de PCR fueron purificados en un kit para extracción en gel (ROCHE) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente fueron hibridados (y ligados) con el vector de clonación pCR 2.1 -TOPO (3.9Kb) (Invitrogen) linearizado por la TOPO isomerasa, que presenta una T saliente en ambas cadenas, obteniéndose el plásmido con el inserto (producto del PCR 30). Estas construcciones fueron utilizadas para transformar células de E. coli cepa XLI blue. La selección de clonas que comprendían algún inserto, se realizó plaqueando las células transformantes en cajas Petri con LB/agar con ampicilina en presencia de X-Gal, eligiéndose las colonias blancas para la amplificación de plásmidos. Se obtuvieron 3 colonias positivas.

De las 13 colonias positivas, solo 7 contenían un inserto del tamaño adecuado. Los DNA plasmídicos fueron secuenciados en ambas cadenas usando nucleótidos fluorescentes en un aparato de Perkin Elmer Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) como lo describe el fabricante. De las 7 clonas positivas se eligió una por tener la secuencia más claramente identificada de manera inequívoca, la clona 30-8, con una tamaño aproximado de 900pb.

EJEMPLO 4. Expresión de la clona parcial de L. boneti.

A fin de poder expresar la proteína recombinante obtenida en el ejemplo anterior, el cDNA se subclonó en el vector de expresión pTrcHIS-TOPO (INVITROGEN). Con el fin de meter en fase el gen en el plásmido, se diseñaron 2 oligonuclótidos, el directo, Lb5' incompleto (SEQ. ID. NO: 22), partiendo de las secuencias codificantes de los aminoácidos 5 a 9 del amino terminal de las isoformas I y II (los primeros 5 del inserto clonado en el paso anterior) más el sitio de reconocimiento para la enzima BamHI y 3 bases más para que la enzima se pegue y el oligo reverso, Lb3'Sal I (SEQ. ID. NO:9), partiendo de la secuencia codificante de los aa 275 a 279 (los últimos 5 del extremo carboxilo de la esfingomielinasa D de L. boneti), más el codón de término, más el sitio de reconocimiento de la enzima Sal I y 4 bases más para el pegado de la enzima. Con el plásmido de la clona 30-8 como templado y usando como primers los oligos directo y reverso diseñados, se llevó a cabo una reacción PCR obteniéndose un fragmento de DNA que comprende la secuencia codificante de la proteína recombinante con los aminoácidos 5 a 279 de la esfingomielinasa de L. boneti, con un sitio de corte de BamH I en el extremo 5' y uno de Sal I en el 3'.

Tanto el vector de expresión pTrcHIS-TOPO, como el producto de PCR arriba mencionado fueron digeridos con las enzimas BamH I y Sal I y ligados para obtener el plásmido pTrcHIS-TOPO 30-8, siendo transformado en células electrocompetentes de E. coli XLI blue. Se obtuvieron 3 colonias positivas que efectivamente portaban el plásmido pTrcHIS-TOPO 30-8, con el inserto del tamaño adecuado (según se observó en un gel, tras liberar el inserto digiriendo el plásmido con BamH I y Sal I), confirmándose por secuenciación.

Para expresar la proteína recombinante, cada una de las 3 colonias obtenidas, fueron cultivadas en 3ml de medio LB en presencia de ampicilina 100µg/ml a 37°C durante todo la noche con agitación, luego fueron transferidas a un matraz de 500ml de LB con ampicilina. Una vez que el cultivo alcanzó una densidad óptica de 0.6 OD6oo se indujo la expresión con 1 mM IPTG durante 3 hrs a 37°C con agitación. Las células cosechadas por centrifugación (8,000 rpm, 15 min) y resuspendidas en 5 mi de buffer A (NaH2P04 100mM, TRIS-HCI 10mM pH8 y Cloruro de Guanidinio 6M) y posteriormente sonicadas, por 6 ciclos de 30 seg c/u con intervalos de 1 min en hielo. Posteriormente, se centrigugó por 25 min a 10,000 rpm. El sobrenadante fue pasado por una columna de Níquel (Ni-NTA agarose) (Qiagen) para purificar la proteína. Ua vez terminada la purificación se dializó contra PBS para eliminar el cloruro de guanidinio, pero la proteína precipitó. La proteína precipitada se cuantifico por BCA (PIERCE) pero al ser probada como ¡nmunógeno en conejos no se obtuvieron buenos resultados. Con base en ello se decidió plegar in vitro la proteína.

Para plegar la proteína in vitro se solubilizó colocándola en presencia de 5M de cloruro de guanidinio más 30M de DTT por 2 hr a temperatura ambiente. Al cabo de este tiempo, la proteína fue dializada contra una solución con 2M de cloruro de guanidinio, 4mM de glutatión reducido (GSH), 2mM de glutatión oxidado (GSSG) en PBS 1X pH47.4, durante 1hr. Estas diálisis se repitieron con concentraciones decreciente de cloruro de guanidinio, manteniendo las de GSH y GSSG constantes, excepto en el último paso de diálisis en fueron eliminados de la solución, quedando la proteína en PBS 1X ph 7.4, recuperándose un 80% de la proteína en forma soluble. La proteína solubilizada resultó carecer de actividad esfingomielinasa y dermonecrótica, y los anticuerpos generados en conejos con esta proteína recombinante fueron capaces de reconocer la propia proteína recombinante y al componente dermonecrótico del veneno completo detectados por Western Blot, pero fueron incapaces de neutralizar la toxicidad dicho veneno.

EJEMPLO 5. Aislamiento de la clona completa de la esfingomielinasa D completa de L boneti A fin de contar con una secuencia codificante de la esfingomielinasa D completa de L. boneti (es decir desde el primer aminoácido de la región amino terminal hasta el último en la región carboxilo terminal), se diseñó el oligonucleotido Lb5'BAM Hl (SEQ ID NO: 8) que incluye además de la secuencia necesaria para el sitio Bam H1 , los codones codificantes de los primeros 4 aa del amino terminal de la esfingomielinasa D de L. boneti, más los siguientes 5 aminoácidos ya presente en el producto original del PCR obtenido de la clona 30-8. Se realizó una reacción PCR utilizando el plásmido pTrcHIS-TOPO 30-8 como templado y el oligo LB5'BamH1 como primer directo y el mismo oligo Lb3'Sal I (SEQ ID NO: 9), como primer reverso, obteniéndose un fragmento de DNA que comprende la secuencia codificante completa de la esfingomielinasa de L. boneti, flanqueada por los sitios de corte de BamH I y Sal I. Este fragmento fue clonado en el plásmido TOPO 2.1 (3.9Kb) transformándose células competentes de E. coli XL1 blue; se obtuvieron 4 colonias positivas de las que se comprobó la secuencia nucleotídica del inserto por secuenciación. Se produjo una mayor cantidad del plásmido y el inserto, que comprende el gen completo (SEQ. ID. No: 10) codificante de la proteína recombinante activa SMDrLb (SEQ. ID. No: 11), fue liberado por digestión con las enzimas Bam Hl y Sal I. El Inserto fue purificado mediante un kit de purificación (ROCHE) y ligado al vector PQE30, previamente digerido con la mismas enzimas de restricción, obteniéndose el vector PQE30 8c.

EJEMPLO 6. Expresión de la clona completa SMDrLb.

El producto de la ligación con el plásmido PQE30 se utilizó para transformar células competentes de E. coli BL21 , que al ser plaquedas dieron lugar a 3 clonas positivas, confirmándose la presencia del fragmento de DNA que comprende la secuencia codificante completa de la esfingomielinasa D de L. boneti, según se pudo corroborar por análisis de restricción con las enzimas Bam Hl y Sal I.

La clona que se utilizó para la expresión fue denominada Lb 30-8c3.1. Para ello se cultivó a 37°C en LB más Ampicilina hasta una OD de 0.6, posteriormente fue inducido con 1 mM de IPTG por 3 hr. Nuevamente la proteína se expresó cuantiosamente pero en cuerpos de inclusión, cuya actividad esfingomielinasa D, fue despreciable.

EJEMPLO 7. Expresión controlada de la clona completa de esfingomielinasa D de L. boneti.

A fin de controlar el nivel de expresión de la proteína recombinante SMDrLBI , la clona 8c se incubó en 50ml de LB con Ampicilina a 37°C toda la noche, las células fueron transferidas a un matraz con 11 del mismo medio. Al alcanzar un OD600 de 0.6 se indujo el cultivo con IPTG (0.1 mM) y se incubó 16 hr a una menor temperatura (20-22°C) con agitación. Las células fueron recuperadas por centrifugación (10 min a 8,000 rpm). El paquete celular fue resuspendido en 20 mi de PBS, sonicado en 6 ciclos de 30 seg con intervalos de 1 min en hielo y centrifugado nuevamente 25 min a 10,000 rpm. Tanto en el sobrenadante como en el pellet se encontró una proteína del peso molecular esperado (32 Kda).

La proteína recombinante soluble se purificó haciendo pasar el sobrenadante por una columna de NiTA (Níquel Trinitriloacético, Qiagen), donde la proteína recombinante se queda pegada por la alta afinidad de la cola de 6 histidinas hacia el metal. Posteriormente fue lavada con 15 volúmenes de PBS y con 10 volúmenes de PBS más ¡midazol 25mM, para finalmente eluir la proteína recombinante con PBS más 250 mM de Imidazol. La elusión fue colectada y dializada contra PBS para eliminar el imidazol presente. Se midió la actividad esfingomielinasa y resultó ser de 31.5 U/mg, es decir, prácticamente la misma que la encontrada para la isoforma I nativa.

Ejemplo 8. Producción de anticuerpos neutralizantes a partir de la proteína recombinante activa SMDrLb.

Con la proteína recombinante soluble activa SMDrLb producida conforme al ejemplo 7, se inocularon 2 conejos neozelandeses de 3.5 Kg, con un esquema de 8 inoculaciones, separadas 10 días entre sí, con cantidades increméntales de la proteína recombinante, desde 30 hasta 100 µg/conejo de proteína recombinante soluble (activa) en PBS. Las inoculaciones fueron intradérmicas en un volumen final de 1 ml, con 0.5 mi de adyuvante de Freund, completo para la primera inoculación e incompleto para las subsecuentes.

A los 10 días de la octava inoculación, se midió el título de anticuerpos y fue de 22,800 para un conejo y 29,300 para el otro. Los conejos se sangraron a blanco y se separó el suero de ambos conejos y se mezcló (50/50% en volumen).

Para determinar la dosis efectiva media (ED50) de la mezcla de sueros, se realizaron 3 retos con distintas cantidades de la propia proteína recombinante SMDrLb, 7.8, 15.45 y 18.1 µg/ratón. Para ello, se usaron grupos de 4 ratones Balb-C de 18-20 g, inyectándoseles una mezcla preincubada (30 min a 37°C) de la proteína SMDrLb con cantidades crecientes (de 100-200 µ?) de la mezcla del suero de los 2 conejos inmunizados, en SS (NaCI 0.15 M), obteniéndose las siguientes DE50: 18.1µ? 276.5µ? Los cálculos fueron realizados con el programa GraphPad Prism (Versión 2; GraphPad Software, Inc, San Diego, CA) .

Mientras que en un ensayo similar se aplicaron 92 µg del veneno nativo de L. boneti preincubado con cantidades crecientes del suero homólogo (anti SMDrLb) obteniéndose una DE50 de 149.6µ? por ratón, para los 92µg que equivalen a 3DL50.

EJEMPLO 9. Aislamiento de las clonas completas de la esfingomielinasa D de L. reclusa Para el aislamiento de las clonas de las necrotoxinas, se aisló el RNA total de las glándulas venenosas de las arañas por el método de TRIZOL reagent (Gibco) siguiendo el protocolo del fabricante. Para la síntesis de primera cadena se utilizó el kit 3' RACE (Gibco). 2µ? del RNA total (aproximadamente 500ng) extraído de glándulas, 4µ? de agua y 1 µ? (10 pmoles) del oligonucleotido Adapter Primer (AP), que comprende una cola de poli-Ts (SEQ. ID. NO:4), fueron incubados para desnaturalizar, a 70°C por 10 min e inmediatamente enfriados en hielo. Se añadió 2µ? de Buffer PCR 10X, 1 µ? de dNTPs (10mM), 2µ? de MgCI2 (25mM) y 2 µ? DTT (0.1 M), preincubándose por 2 a 4 min a 42°C. Se agregó inmediatamente 1 µ? de Reverse Transcriptase (Invitrogen), se mezcló e incubó por 50 min a 42°C. Se inactivo la enzima incubando 15 min a 70°C e inmediatamente se enfrió la mezcla en hielo por un min. Se añadió 1 µ? de RNAsa H y se incubó por 20 min a 37°C y se almacenó a -80°C.

Para la reacción de polimerasa en cadena (PCR), se tomó una muestra de la reacción de primera cadena (2 µ?) y se adicionaron a buffer PCR 10X Mg2+ (100mM TRIS-HCL pH 8.3, 500 mM KCI 15 mM MgCI2 ,), 200 µ? dNTPs, 20 µ????ße del oligonucleotido directo (en el sentido 5'-3'), que en este caso se utilizó el mismo oligonucleotido LB5'Bam H1 (SEQ. ID. NO: 8) que incluye además de la secuencia necesaria para el sitio BamH1 , los codones codificantes de los primeros 9 aa del amino terminal de la esfingomielinasa D de L. reclusa. 20 µ????ßß del oligonucleotido reverso (en el sentido 3'-5') el oligo reverso Lb3'Sal I (SEQ ID NO: 9) y dos unidades de Taq DNA Polymerasa (New England Biolabs, Beverly MA, USA) en un volumen final de 50 µ?. La reacción se llevó a cabo usando un termo ciclador Perking Elmer 9600 con el siguiente protocolo: Incubación de la mezcla durante 3 min a 94°C, seguidos 25 ciclos de tres pasos de incubación: 1 min a 94°C, 90 seg a 48°C y 2 min a 72°C . Al final un paso de 10 min a 72°C. La Taq DNA polymerasa pega en los extremos 3' una A útil para hibridar con la T de los extremos 5' del vector de clonación pCR 2.1 -TOPO (3.9Kb).

Los productos de PCR fueron purificados en un kit para extracción (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente fueron hibridados (ligados) con el vector de clonación pCR 2.1 -TOPO (3.9Kb) (Invitrogen) linealizado por la TOPO isomerasa, que presenta una T saliente en ambas cadenas, obteniéndose los plásmidos pCR 2.1 -TOPO Lr1 y pCR 2.1 -TOPO Lr2 que comprenden los insertos productos del PCR, Lr1 y Lr2, respectivamente. Estas construcciones fueron utilizadas para transformar células de E. coli cepa XLI blue. La selección de clonas que comprendían algún inserto, se realizó plaqueando las células transformantes en cajas Petri con LB/agar con ampicilina en presencia de X-Gal, eligiéndose las colonias blancas para la amplificación de plásmidos. Se obtuvieron 5 colonias positivas.

De las 5 colonias positivas, solo 2 (la Lr1 y la Lr2) contenían un inserto del tamaño adecuado. Los DNA plasmídicos fueron secuenciados en ambas cadenas usando nucleótidos fluorescentes en un aparato de Perkin Elmer Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) como lo describe el fabricante. Las 2 clonas positivas se eligieron por tener la secuencia más claramente identificada como esfingomielínasas D y con variaciones entre sí (90% de identidad), Ambas clonas, con un tamaño aproximado de 900pb, comprendían respectivamente las secuencias codificantes completas de dos isoformas de la esfingomielinasa D de L. reclusa (SEQ. ID. No: 12 y SEQ. ID. No: 14) mientras que las proteínas codificadas (SMDrLrl y SMDrLr2) tuvieron la secuencias aminoacídicas SEQ. ID. No: 13 y SEQ. ID. No: 15. Para cada una, el inserto, que comprende el gen de la SMDrLr correspondiente, fue liberado por digestión con las enzimas Bam Hl y Sal I. Cada inserto fue purificado mediante un kit de purificación (ROCHE) y ligado al vector PQE30, previamente digerido con la mismas enzimas de restricción, obteniéndose los vectores PQE30 Lr1 y PQE30Lr2.

EJEMPLO 10. Expresión controlada de las clonas completas de la SMDrLr.

A fin de controlar el nivel de expresión de la proteína recombinante (tanto de SMDLrl como de SMDrLr2), las células de E. coli BL21 transformadas con el vector PQE30 Lr1 o PQE30 Lr2 se incubaron en 3 mi de LB con Ampicilina a 37°C toda la noche, fueron transferidas a un matraz con 100 mi del mismo medio conteniendo 1 mM de IPTG y se incubaron 16 hr a una temperatura de 20-22°C. Las células fueron recuperadas por centrifugación (10 min a 10,000 rpm). El paquete celular fue resuspendido en 5 mi de PBS, sonicado en 6 ciclos de 30 seg con intervalos de 1 min en hielo y centrifugado nuevamente 25 min a 10,000 rpm. Tanto en el sobrenadante como en el pellet se encontró una proteína del peso molecular esperado (32 Kda).

Las proteínas recombinantes SMDrLrl y SMDrLr2 solubles se purificaron haciendo pasar el sobrenadante por una columna de NiTA (Níquel Trinitriloacético, Qiagen), donde la proteína recombinante se queda pegada por la alta afinidad de la cola de 6 histidinas hacia el metal. Posteriormente fueron lavadas con 10 volúmenes de PBS y con 10 volúmenes dé PBS más imidazol 25 mM, para finalmente eluir la proteína recombinante con PBS más 250 mM de Imidazol. La elusión fue colectada y dializada contra PBS para eliminar el imidazol presente. Se midió la actividad esfingomielinasa y resultó ser de 27.2 U/mg para la SMDrLrl es decir prácticamente la misma que la encontrada para la isoforma I nativa y de 11.47 U/mg para la SMDrLr2. EJEMPLO 11. Producción de anticuerpos neutralizantes a partir de la proteína recombinante activa SMDrLrl .

Se eligió una de las proteínas recombinantes, la SMDrLrl . Con la proteína producida conforme al ejemplo 10, se inocularon 2 conejos neozelandeses de 3.5 Kg, con un esquema de 8 inoculaciones, separadas 10 días entre sí, con cantidades increméntales de la proteína recombinante, desde 30 hasta 100 µg/conejo de proteína recombinante soluble (activa) en PBS. Las inoculaciones fueron intradérmicas en un volumen final de 1ml, con 0.5 mi de adyuvante de Freund, completo para la primera inoculación e incompleto para las subsecuentes.

Se midió el título de anticuerpos y fue de 26,000 para un conejo y 33,000 para el otro. Los conejos se sangraron hasta blanco y se separó el suero de ambos conejos y se mezcló (50/50% en volumen).

Para determinar la dosis efectiva media, ED50 de la mezcla de sueros, se usaron grupos de 4 ratones Balb-C de 18-20 g, inyectándoseles una mezcla preincubada (30 min a 37°C) de 12µg de toxina SMDrLrl con cantidades crecientes de la mezcla del suero de los 2 conejos inmunizados, en SS (NaCI 0.15 M), La dosis efectiva media del antiveneno anti-SMDrLi contra la propia proteína recombinante activa resultó ser de 165 µ? por ratón, con 12µg de proteína. Los cálculos fueron realizados con el programa GraphPad Prism (Versión 2; GraphPad Software, Inc, San Diego, CA).

Mientras que en un ensayo similar se aplicaron 12 µg del veneno nativo de L. reclusa por ratón preincubados con cantidades crecientes del suero homólogo (anti SMDrLrl), se encontró una DE50 de 175µ? por ratón con ^g de veneno homólogo.

EJEMPLO 12. Aislamiento de las clonas completas de la esfingomielinasa D completa de L. laeta.

Se procedió como en el ejemplo 9 pero utilizando glándulas de L. laeta como fuente de transcritos y se utilizaron los oligos directo LI5'BamH1 (SEQ.ID.NO: 16 y reverso LI3'Sal I (SEQ.ID.NO: 17) para la PCR, diseñados con base en las secuencia reportadas para la variedad brasileña (Fernades Pedrosa, et. al., 2002), cuyos productos se purificaron y seleccionaron de igual forma, obteniéndose 2 clonas con una secuencia claramente identificada y con variaciones entre sí (88% de identidad) comprendiendo respectivamente las secuencias codificantes completas de dos isoformas de la esfingomielinasa D de L. laeta (SEQ. ID. No: 18 y SEQ. ID. No: 20) mientras que las proteínas codificadas (SMDrLU y SMDrLI2) tuvieron la secuencias aminoacídicas SEQ. ID. No: 19 y SEQ. ID. No: 21. Finalmente se subclonaron en el plásmido PQE30, obteniéndose los vectores pQE30 LI1 y PQE30 LI2, listos para su expresión.

EJEMPLO 13. Expresión controlada de la clona completa SMDrLU .

Se seleccionaron las dos clonas SMDrLU y SMDrLI2 para su expresión. Para lograr su expresión controlada, a modo de evitar que toda la proteína recombinante fuera expresada en forma de cuerpos de inclusión, se procedió de la misma manera que en el ejemplo 10, pero transformando la células con los vectores pQE30 LI1 y pQ30 Lr2. Las proteínas recombinantes así producidas tuvieron una actividad de 58.43 U/mg para la SMDrLU y de 252 U/mg.

EJEMPLO 14. Producción de anticuerpos neutralizantes a partir de la proteína recombinante activa SMDrLU .

Se procedió de manera semejante al ejemplo 11 pero utilizando la proteína SMDrLU del ejemplo 13 para inmunizar los animales. Los títulos alcanzaron valores de hasta 34,300 y se encontró una DE50 de 200 µ? por ratón con 12 µ9 de la propia SMDrLU y de 225 µ? por ratón con 12 µ9 del veneno homólogo.

EJEMPLO 15. Ensayos de Protección Cruzada.

Se realizaron exitosamente ensayos de protección cruzada retando ratones con 12µg de veneno de L. boneti o de la proteína SMDrLb y se encontró un DE50 de 1 12µ? de suero de conejo anti SMDrLr por ratón y que 200µ? del mismo por ratón fueron suficientes para neutralizar el 100% del efecto tóxico del veneno. De igual manera se retaron ratones con 12 µg de veneno nativo de L. reclusa o de la proteína SMDrLrl y se encontró que entre 160 y 200µ? de suero de conejo anti SMDrLb fueron suficientes para neutralizar su efecto tóxico.

EJEMPLO 16. Subclonación de las clonas Lb1 , Lr1 , Lr2 y LI2 con Histidinas en posición Amino.

Para demostrar que la inclusión de la cola de histidinas en el extremo amino de las proteínas recombiantes SMD de la presente invención (versiones amino), no tiene un efecto significativo en la efectividad de la proteína, algunas de las clonas: Lb1 , Lr1 , Lr2 y LI2 se subclonaron en el plásmido PQE60 que agrega la cola de Histidonas en el extremo carboxilo, en lugar del amino. Para ello se utilizaron los mismos oligos Lb5'Bam Hl (para Lb1 , Lr1 y Lr2) y LI5'Bam Hl (para LI2) como oligos directos y los oligos Lb3' Bgl II (SEQ.ID.NO: 23) y LI3' Bgl II (SEQ.ID.NO: 24), respectivamente como oligos reversos. Las construcciones se expresaron de manera controlada en cepas de E. coli BL21 de la misma forma que en los ejemplos 7, 10 y 13. Las proteínas recombinantes así producidas (versión carboxilo), presentaron esencialmente las mismas actividades SDM que las versiones amino.

EJEMPLO 17. Producción de anticuerpos en caballos, contra una mezcla de varias de las proteínas recombinantes de las 3 especies de Loxosceles.

A fin de ilustrar más aun la capacidad de las proteínas recombinantes de la presente invención para generar anticuerpos neutralizantes en vertebrados, particularmente en mamíferos, esta vez se eligió al caballo para generar en él los anticuerpos. Al mismo tiempo para ilustrar la posibilidad de utilizar una composición inmunogénica que comprenda más de una de las proteínas recombiantes de la presente invención, se eligieron 4 de ellas, que se consideraron suficientemente representativas para neutralizar los venenos de al menos las 3 especies de la araña Loxosceles, algunas en su versión amino y otras en su versión carboxilo. De este modo la composición inmunogénica quedó compuesta por 2 partes de SMDrLrl (versión amino o SMDrLrl -NH2), 2 partes de SMDrLb (versión carboxilo o SMDrLb-COOH), 1 parte de la SMDrLU (versión amino o SMDrLI1-NH2) y 1 parte de SMDrLI2 (versión carboxilo o SMDrLI2-COOH).

Se seleccionaron 5 caballos que nunca habían sido inmunizados o tenido algún contacto con algún antígeno relacionado con la araña Loxosceles y se inmunizaron con la composición inmunogénica mencionada en el párrafo anterior. La inmunización se realizó a lo largo de 9 meses iniciando con una dosis de 2.5 µg de la mezcla de toxinas recombinantes hasta llegar a 250 µg. Las inmunizaciones se realizaron con intervalos de dos semanas y se utilizaron, de manera alternada, adyuvante de Freund y alúmina como adyuvantes. La inmunización se realizó por vía subcutánea. A los caballos se les tomaron muestras de sangre con intervalos de un mes a fin de medir los títulos de anticuerpos por un ensayo inmunoenzimático.

Se sangraron los caballos al término de los nueve meses y el plasma fue mezclado y procesado para producir fragmentos F(ab')2 por digestión con la enzima pepsina y su posterior purificación. Se determinó la dosis efectiva media de los fragmentos F(ab')2 de manera similar a la descrita en el ejemplo 8. Se utilizaron 14 grupos de 5 ratones Balb-C de 18-20 g, se inmunizaron dos grupos (uno control y uno con tratamiento con fragmentos F(ab')2) para cada una de las siguientes proteínas recombinantes (toxinas recombiantes) o venenos: SMDrLrl -NH2, SMDrLb-COOH, SMDrLU -NH2, SMDrLI2-COOH, veneno de L. boneti, veneno de L. reclusa y veneno de L. laeta. Para ello se les inyectó una mezcla preincubada (30 min a 37°C) de 5DL50 de la proteína recombinante o el veneno, ya sea con cantidades crecientes (de 100-200 µ?) de los fragmentos F(ab')2 obtenidos, en SS (NaCI 0.15 M) para los grupos con tratamiento, y con solamente SS para los grupos control. A partir de las DE50 determinadas con el ya citado programa GraphPad Prism, se calcularon las cantidades de toxina o veneno neutralizados por 1 mg de fragmentos F(ab')2 (capacidad neutralizante) que se presentan a continuación: EJEMPLO 18. Obtención de toxoides de la SMDrLb.

Con base en la identificación del centro catalítico de una de las ¡soformas de esfingomielinasas D de L. laeta recientemente reportada (Murakami et.al. 2005), se decidió hacer mutagénesis sobre el DNA codificante de la SMDrLb (SEQ.ID.NO: 10), una mutante en el codón codificante del residuo de histidina de la posición 11 , y la otra en el codón codificante del residuo de ácido glutámico de la posición 31, ambas contadas en la proteína madura. La primera mutante obtenida, denominada SMDrLb(H11 K) consistió en la sustitución de la Histidina de la posición 11 por una Lisina y tiene una SEQ.ID.NO: 27 para su secuencia codificante y SEQ.ID.NO: 28 para la proteína madura expresada y la segunda mutante denominada SMDrLb(E31 K) consistió en la sustitución del ácido glutámico de la posición 31 por Lisina y tiene una SEQ.ID.NO: 29 para su secuencia codificante y SEQ.ID.NO: 30 para la proteína madura expresada.

Para obtener las mutantes se utilizó la clona PQE30Lb-8c3.1 y el kit QuickChange de mutagénesis dirigida (QuickChange Site-Directed Mutagénesis Kit) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) siguiendo el protocolo recomendado por la compañía (Papworth, C, et. al., 1996).

Las dos mutantes SMDrLb(H11 K) y SMDrLb(E31 K) incorporadas en el vector pQE30 fueron aisladas y expresadas en forma controlada en la cepa E. coli BL21 , de manera semejante a la descrita para la SMDrLb en el ejemplo 7.

Ambas proteínas fueron expresadas exitosamente en forma soluble (y parte como cuerpos de inclusión). Se les analizó su actividad enzimática de esfingomielinasa D por el método previamente descrito, resultando nula. Adicionalmente se hicieron pruebas de dermonecrosis en conejos con lo que se demostró que carecen de este efecto.

Para determinar si estas versiones enzimáticamente inactivas y no dermonecróticas pero expresadas en forma soluble, eran capaces de generar anticuerpos neutralizantes de la propia SMDrLb activa o del veneno de L. boneti, para cada una de las mutantes, se inocularon 2 conejos neozelandeses de 3.5 Kg, con un esquema de 8 inoculaciones, separadas 10 días entre sí, con cantidades increméntales de la proteína recombinante, desde 30 hasta 100 µg/conejo de proteína recombinante soluble (inactiva) en PBS. Las inoculaciones fueron intradérmicas en un volumen final de 1 ml, con 0.5 mi de adyuvante de Freund, completo para la primera inoculación e incompleto para las subsecuentes.

En ambos casos se obtuvieron títulos que variaron de entre 25,200 y 31 ,500. Para cada caso los 2 conejos se sangraron hasta blanco y se separó el suero de ambos conejos y se mezcló (50/50% en volumen).

Para determinar la dosis efectiva media, DE50 de la mezcla de sueros de cada caso, se usaron grupos de 4 ratones Balb-C de 18-20 g, inyectándoseles una mezcla preincubada (30 min a 37°C) de ^g de toxina SMDrLb con cantidades crecientes de la mezcla del suero de los 2 conejos inmunizados, en SS (NaCI 0.15 M), A partir de las DE50 detrminadas con el ya citado programa GraphPad Prísm, se calcularon las cantidades de toxina o veneno neutralizados por 1 mi de cada uno de los sueros (capacidad neutralizante) que se presentan a continuación: REFERENCIAS Alouf, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 136B:309 (1985).

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Se citan las siguientes patentes o solicitudes: Solicitud de patente mexicana No: 991 1 191. Alagón, A., L. D. Possani, G. Gurrola, E. Grishin, A. Lipkin, y E. Volynski. "Inmunógeno, anti-veneno y vacuna contra el veneno de la araña viuda negra".

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Patente norteamericana No. 5,443,976. Carroll, S. B. Immobilization of Crotalus atrox and Crotalus durissus terrificus whole venoms on aldehyde-activated agarose.

Claims (56)

Reivindicaciones. Habiéndose descrito la presente invención se reivindica lo siguiente:

1. Una proteína aislada del veneno de la araña Loxosceles boneti, que presenta una actividad de esfingomielinasa y produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que tiene la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 11.

2. Una proteína recombinante que presenta una actividad de esfingomielinasa D y produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 11 , o una mutación funcionalmente equivalente de la misma.

3. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 2, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 10, o una mutación silenciosa de la misma.

4. Una proteína recombinante que carece de actividad de esfingomielinasa D y que no produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 11 con una sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 , Asp33, Asp91 , His11 y His47.

5. La proteína recombinante de la reivindicación 4, caracterizada por que la sustitución es en un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 y His11.

6. La proteína recombinante de la reivindicación 5, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ.ID.No: 28.

7. La proteína recombinante de la reivindicación 5, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ.ID.No: 30.

8. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 4, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 10 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 , Asp33, Asp91 , His11 y His47.

9. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 5, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 10 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 y His11.

10. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 6, caracterizado por que tiene una secuencia nucleotídica SEQ. ID. No: 27.

11. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 7, caracterizado por que tiene una secuencia nucleotídica SEQ. ID. No: 29.

12. Una proteína recombinante que presenta una actividad de esfingomielinasa D y produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 13, o una mutación funcionalmente equivalente de la misma.

13. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 12, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 12, o una mutación silenciosa de la misma.

14. Una proteína recombinante que carece de actividad de esfingomielinasa D y que no produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 13 con una sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 , Asp33, Asp91 , His11 y His47.

15. La proteína recombinante de la reivindicación 14, caracterizada por que la sustitución es en un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 y His11.

16. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 14, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 12 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 , Asp33, Asp91 , His11 y His47.

17. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 15, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 12 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 y His11.

18. Una proteína recombinante que presenta una actividad de esfingomielinasa D y produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 15, o una mutación funcionalmente equivalente de la misma.

19. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 18, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 14, o una mutación silenciosa de la misma.

20. Una proteína recombinante que carece de actividad de esfingomielinasa D y que no produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 15 con una sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 , Asp33, Asp91 , His11 y His47.

21. La proteína recombinante de la reivindicación 20, caracterizada por que la sustitución es en un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 y His11.

22. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 20, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 14 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 , Asp33, Asp91 , His11 y His47.

23. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 21 , caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 14 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu31 y His11.

24. Una proteína recombinante que presenta una actividad de esfingomielinasa D y produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 19, o una mutación funcionalmente equivalente de la

25. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 24, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 18, o una mutación silenciosa de la misma.

26. Una proteína recombinante que carece de actividad de esfingomielinasa D y que no produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 19 con una sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32, Asp34, Asp91 , His12 y His47.

27. La proteína recombinante de la reivindicación 26, caracterizada por que la sustitución es en un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32 y His12.

28. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 26, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 18 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32, Asp34, Asp91 , His12 y His47.

29. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 27, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 18 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32 y His12.

30. Una proteína recombinante que presenta una actividad de esfingomielinasa D y produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 21 , o una mutación funcionalmente equivalente de la misma.

31. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 30, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 20, o una mutación silenciosa de la misma.

32. Una proteína recombinante que carece de actividad de esfingomielinasa D y que no produce dermonecrósis en un mamífero inoculado con ella, caracterizada por que comprende la secuencia aminoácida SEQ. ID. NO: 21 con una sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32, Asp34, Asp91 , His12 y His47.

33. La proteína recombinante de la reivindicación 32, caracterizada por que la sustitución es en un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32 y His12.

34. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 32, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 20 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32, Asp34, Asp91 , His12 o His47.

35. Un fragmento de DNA que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 33, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 20 con una mutación consistente de una sustitución del codón codificante de un aminácido seleccionado del grupo que consiste de Glu32 y His12.

36. Un vector de expresión caracterizado por que comprende cualquiera de los fragmentos de DNA de las reivindicaciones 3, 8, 9, 10, 11 , 13, 16, 17, 19, 22, 23, 25, 28, 31 , 34 y 35.

37. Una Cepa bacteriana recombinante caracterizada por que ha sido transformada con el vector de la reivindicación 36.

38. La cepa bacteriana recombinante de la reivindicación 37 caracterizada por que es de Escherichia coli.

39. Le cepa bacteriana recombinante de la reivindicación 38 caracterizada por que es Escherichia coli BL21.

40. Un método para la producción de las proteínas recombinantes de cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 15, 18, 20, 21 , 24, 26, 27, 30, 32 o 33, caracterizado por que comprende los pasos de: a) incubar en un medio adecuado y en condiciones adecuadas de cultivo, una cepa bacteriana recombinante transformada con un vector de expresión que comprende un fragmanto de DNA seleccionado del grupo que consiste de los fragmentos de DNA con secuencia SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 27 y SEQ. ID. NO: 29, b) opcionalmente, separar del medio la masa celular y c) romper las células para liberar la proteína y d) opcionalmente separar y purificar la proteína recombinante.

41. El método de la reivindicación 40, caracterizado por que, adicionalmente después del paso de incubación, al alcanzarse una masa celular adecuada, se induce la expresión con una concentración de IPTG de 0.1mM, a una temperatura entre 20 y 25°C y por un período de al menos 12 a 20 hr.

42. El método de la reivindicación 40, caracterizado por que la cepa bacteriana es de Escherichia coli.

43. El método de la reivindicación 42, caracterizado por que la cepa de Escherichia coli es BL21.

44. Una composición inmunogénica o antigénica que comprende al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 15, 18, 20, 21 , 24, 26, 27, 30, 32 o 33.

45. Un método para producir anticuerpos contra el veneno de arañas del género Loxosceles, caracterizado por que comprende el inyectar en un vertebrado, una cantidad efectiva suficiente para generar anticuerpos, de una composición inmunogénica o antigénica que comprende al menos una proteína recombinante de cualquiera de las revindicaciones 2, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 15, 18, 20, 21 , 24, 26, 27, 30, 32 o 33.

46. El método de la reivindicaión 45, caracterizado por que el vertebrado es un mamífero.

47. El método de la reivindicación 46. caracterizado por que el mamífero es un caballo.

48. El método de la reivindicación 45 caracterizado por que los anticuerpos son neutralizantes del veneno de la araña Loxosceles.

49. El método de la reivindicación 45, caracterizado por que adicionalmente incluye la recuperación de dichos anticuerpos de dicho mamífero y opcionalmente su purificación.

50. El método de la reivindicación 48 caracterizado por que dicha araña Loxosceles es de una especie seleccionada del grupo que consiste de L. boneti, L. reclusa y L. laeta.

51. Una composición farmacéutica de los anticuerpos producidos mediante el método de la reivindicación 48, o sus fragmentos de unión al antígeno y acarreadores farmacéuticos aceptables, caracterizada por que dicha composición neutraliza el efecto in vivo del veneno de arañas del género Loxosceles.

52. La composición de la reivindicación 51 caracterizada por que dicha araña Loxosceles es de una especie seleccionada del grupo que consiste de L. boneti, L. reclusa o L. laeta.

53. Una composición que comprende al menos una proteína recombinante cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 15, 18, 20, 21 , 24, 26, 27, 30, 32 o 33 ligadas a un sustrato caracterizado por que dicha composición liga específicamente anticuerpos generados contra el veneno de arañas del género Loxosceles o contra el veneno de arañas Loxosceles enriquecidos con al menos una de las proteína recombinante de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 15, 18, 20, 21 , 24, 26, 27, 30, 32 o 33. ?

54. Un dispositivo de diagnóstico caracterizado por que comprende la composición de la reivindicación 53.

55. Un método para diagnosticar si la araña que mordió a un individuo pertenece a una especie particular de Loxosceles caracterizado porque se hace contactar el dispositivo diagnóstico de la reivindicaión 54 con una muestra del individuo picado y se detecta la presencia de anticuerpos específicos en el dispositivo.

56. Un método para tratar el envenenamiento por mordedura de arañas Loxosceles caracterizado por que comprende el administrar a un individuo que requiera dicho tratamiento la composición farmacéutica de la reivindicación 51.