MD4526C1

MD4526C1 - Metodă de fertilizare in vitro cu întârzierea transferului embrionar şi utilizarea celulelor mononucleare din sângele periferic

Info

Publication number: MD4526C1
Application number: MDA20140060A
Authority: MD
Inventors: Александер ФЕСКОВ; Ирина Фескова; Евгения Жилкова; Станислав Жилков
Original assignee: Mezadata Medical Ip Holding Llp
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2018-09-30
Also published as: ZA201404498B; AU2018203649A1; NZ807980A; US10271876B2; IL276077A; MX384386B; KR20140113917A; AU2012340647A1; EA038427B1; US11185348B2; EP2782993A1; MX2014006234A; BR112014012533A2; US20190110813A1; US20220039834A1; CN104126004A; CN110295143A; EP2782993A4; WO2013078312A1; MD20140060A2

Abstract

Invenţia se referă la medicină, în special la o metodă de fertilizare in vitro cu întârzierea transferului embrionar şi utilizarea celulelor mononucleare din sângele periferic.Conform invenţiei, embrionul se implantează în uterul pacientei la cel puţin două luni, preferenţial pe parcursul a 3…12 luni, după extragerea ovulelor de la pacientă, cu scopul de a reduce riscul respingerii embrionului de către sistemul autoimunitar al pacientei şi de a creşte probabilitatea şi rezultatul sarcinii, totodată, înainte de implantarea embrionului, este pregătit endometrul uterului prin introducerea în uter a celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMCs). De asemenea, metoda este combinată cu tehnici de crioprezervare, pentru păstrarea ovocitelor sau a embrionilor obţinuţi prin fertilizarea in vitro a pacientei.

Description

Prezenta invenţie nu a fost dezvoltată cu utilizarea unor Fonduri Federale, ci în mod independent, de către inventatorii enumeraţi.

Această cerere revendică prioritatea cererii de brevet depuse anterior (US 13/655.257 A1 2012.10.18), care revendică prioritatea cererii de brevet depuse anterior US 11/629,651 A1 2011.11.23, al cărei obiect este încorporat aici, prin referinţă, în întregime.

Prezenta invenţie se referă la domeniul fertilizării in vitro, în mod special la femeile care au fertilitate scăzută ca rezultat al reacţiilor autoimune. Este dezvăluită o metodă utilizată pentru a spori rata şi stabilitatea începutului sarcinii, combinând tehnicile de fertilizare in vitro, opţional cu crioprezervarea prelungită a ovocitelor lor sau a embrionilor produşi prin FIV, combinată cu pregătirea controlată a endometrului, prin intermediul celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC), înainte de transferul embrionar.

Organizaţia Mondială a Sănătăţii raportează faptul că, în fiecare an, mai mult de 15% dintre femei la nivel mondial întâmpină dificultăţi în a rămâne însărcinate şi solicită asistenţă medicală (OMS 1997), estimate a fi între 60 şi 80 de milioane de femei, pe plan mondial, în urmă cu un deceniu. Infertilitatea este definită în general de către Organizaţia Mondială a Sănătăţii ca fiind o absenţă a concepţiei, după o perioadă arbitrară de douăsprezece luni. Cu toate acestea, multe cupluri încearcă timp de ani de zile să conceapă în mod natural înainte de a solicita asistenţă medicală în efortul de a concepe o sarcină. O scădere a ratei fertilităţii este asociată cu factori medicali şi non-medicali. De exemplu, s-a demonstrat că vârsta femeilor constituie un determinant major direct al timpului mediu necesar pentru a concepe. S-a demonstrat că insuficienţa ovariană prematură apare la 1:1000 din femei înaintea vârstei de 30 de ani; 1:250 din femei până la vârsta de 35 de ani; şi 1:100 până la vârsta de 40 de ani. Prin urmare, cea mai mare rată a natalităţii se situează în grupa de vârstă de 25…30 de ani şi scade brusc după vârsta de 35 de ani. Infertilitatea este actualmente una dintre cele mai frecvente probleme de sănătate cu care se confruntă populaţia între 25 şi 45 de ani. Ca atare, există un mare interes şi necesitate în ceea ce priveşte o metodă de extindere a fertilităţii la femeile sănătoase, eventual, înlăturând barierele legate de vârstă pentru purtarea sarcinii şi pentru femeile care sunt incapabile să conceapă prin metode naturale. Deşi infertilitatea în sine nu poate ameninţa sănătatea fizică, ea are adeseori un impact serios asupra bunăstării emoţionale, mintale şi spirituale a femeilor şi cuplurilor.

Tehnologiile de reproducere asistată sunt proceduri care implică manipularea extracorporală atât de celule umane (ovocite sau ovule), cât şi de spermă (spermatozoizi) şi de embrioni, în scopul de a instala o sarcină la un subiect feminin. Aceste proceduri includ, dar nu sunt limitate la, fertilizarea in vitro ("FIV"), incluzând transfer de embrioni, transfer intrafalopian de gamet, transfer intrafalopian de zigot, transfer embrionar tubar, crioprezervare a gametului şi a embrionului, donare de ovocite sau embrion şi surogat gestaţional. Fertilizarea in vitro (“FIV”) a evoluat ca tratamentul major pentru infertilitate sau sub-fertilitate, atunci când alte metode de reproducere asistată au eşuat. În sensul său principal, procesul implică extragerea ovulului feminin de la o femeie şi fecundarea ovulului de către spermă în afara corpului ("in vitro"). Procedeul implică monitorizarea procesului ovulatoriu al femeii, extrăgând multiple ovule din ovarele femeii şi permiţând spermei să fecundeze ovulele într-un mediu lichid, în laborator. Ovulele sunt de obicei extrase de la pacientă prin extragere transvaginală a ovocitelor, care implică străpungerea peretelui vaginal cu un ac ghidat prin ultrasunete, pentru a ajunge la ovare. Prin acest ac, foliculii sunt aspiraţi, iar fluidul folicular este predat la laboratorul FIV pentru a se identifica şi diagnostica ovulele. De regulă, se extrag între zece şi treizeci de ovule de la fiecare pacientă. Ovulul fecundat (embrion), sau, de obicei, embrioni multipli, sunt apoi transferaţi în uterul pacientei, cu intenţia de a instala o sarcină de succes. A se vedea, de exemplu (US7781207 B2 2010.08.24).

Dezvoltată pentru prima dată în anii 1970, fertilizarea in vitro a oferit o formă eficientă de asistenţă pentru o mare parte din femei până în prezent. Actualmente, este raportat că FIV reprezintă 1,3% din totalul de naşteri viabile în Europa (Nygren şi colab. 2001) şi 1,7% din totalul de naşteri viabile în Australia (Hurst şi colab. 2001). În Statele Unite, ciclurile tehnologiei de reproducere asistată FIV au debutat în 2006, conducând la 41,343 de naşteri (54,656 de copii), ceea ce reprezintă ceva mai mult de 1,0% din totalul naşterilor de pe teritoriul SUA din acel an. În anul 2010, Robert Edwards a primit Premiul Nobel în Fiziologie sau Medicină, pentru dezvoltarea fertilizării in vitro. Următorul pas a fost posibilitatea de a îngheţa şi, ulterior, de a dezgheţa şi de a transfera embrionii, experimentată pentru prima dată de către Carl Wood, ceea ce a îmbunătăţit semnificativ fezabilitatea tratamentului FIV.

Ratele tipice de succes al sarcinii obţinute cu tehnici anterioare de fertilizare in vitro rămân relativ scăzute, în intervalul de la 15% la 25%, bazate pe un număr de studii raportate. Este acceptat pe scară largă de către profesioniştii în îngrijirea sănătăţii faptul că cel mai semnificativ factor de limitare pentru fertilizare este eşecul embrionilor de a se implanta în endometru, mucoasa uterină. Blake şi colab. raportează faptul că 80…85% din embrioni eşuează în a conduce la sarcină în urma transferului la pacienţii FIV, cauzând o risipă enormă de embrioni. Simon şi colab. au demonstrat că, la femeile supuse ciclului FIV, implantarea a fost detectată în 60% din cicluri, de aceea, din toţi embrionii transferaţi pe parcursul FIV, 40% au eşuat implantarea.

Un posibil motiv pentru ratele scăzute de implantare pe parcursul FIV este acela că embrionii sunt transferaţi în uter la două zile după fertilizare, în stadiul celular 4…8. Un punct de vedere este acela că ar fi preferabil să se utilizeze embrioni în stadiul de blastocist atins la 5…7 zile de cultură. Avantajele sugerate includ sincronizarea îmbunătăţită dintre embrion şi uter şi capacitatea de a selecta embrioni superiori calitativi pe parcursul perioadei mai lungi de cultură. Transferul de blastocist poate, de asemenea, să ajute la reducerea numărului de naşteri multiple rezultând din FIV, permiţând selecţionarea unui număr mai mic de embrioni foarte apţi per transfer. De obicei, în timpul procedurii FIV, doi până la cinci embrioni sunt transferaţi în uter, pentru a creşte şansa de implantare, generând riscul sarcinilor multiple. Prin urmare, mai mult de jumătate din totalul copiilor născuţi în Statele Unite după tratament FIV provin din sarcini multiple. Uneori, au loc mai multe implanturi în uter şi cum embrionii continuă să crească şi să se dezvolte în uter, pacienta este incapabilă să ducă la termen mai mult de unul sau doi fetuşi. În acel moment, este luată o decizie dificilă pentru a întrerupe acele sarcini şi a extrage fătul sau fetuşii suplimentari din uter, proces denumit reducţie embrionară sau fetală, o procedură care reduce numărul embrionilor sau fetuşilor viabili într-o sarcină multiplă. Astfel de decizii atrag atât implicaţii de ordin etic, cât şi implicaţii psihologice traumatice. Dezvoltarea tehnicilor de laborator care ar creşte probabilitatea şi certitudinea de implantare a fiecărui embrion sunt în continuare de dorit pentru o parte dintre motivele menţionate mai sus.

Într-un proces numit ciclu natural în fertilizarea in vitro, fertilizarea este efectuată prin colectarea unuia sau mai multor ovule selectate în mod natural de la pacientă în timpul ciclului menstrual normal, fără a folosi vreun medicament. În ciclul natural modificat FIV, medicaţia de fertilitate este folosită timp de două până la patru zile în timpul ciclului natural al unei femei, pentru a se evita ovulaţia spontană şi pentru spori şansele de succes ale tratamentului. “FIV cu stimulare moderată” este o metodă în care o mică doză de medicamente pentru stimulare ovariană este utilizată pe o perioadă scurtă, în timpul unui ciclu natural al unei femei, care vizează producerea de 2…7 ovule şi crearea de embrioni sănătoşi. Această metodă pare să reducă complicaţiile şi efectele adverse pentru femei şi are în vedere calitatea, nu cantitatea ovulelor şi a embrionilor. Cu toate acestea, această metodă conduce la o rată de succes foarte scăzută a sarcinii.

Tehnici suplimentare sunt, prin urmare, utilizate în mod curent, în scopul de a creşte şansele de sarcină. Cea mai comună este hiperstimularea ovariană sau superovulaţia care este utilizată pentru a stimula ovarele, în scopul de a produce ovule multiple care apoi sunt extrase de la pacientă. Protocolul lung implică, de regulă, reducerea (suprimarea sau epuizarea) axei pituitare ovariene, prin utilizarea prelungită a unui agonist al hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH). Hiperstimularea ovariană ulterioară, folosind de obicei hormonul foliculostimulant (FSH), începe odată ce procesul de reducere este complet, în general, după 10 până la 14 zile. Un ciclu FIV utilizând acest protocol este cunoscut ca fiind fertilizare convenţională in vitro. Protocolul scurt ignoră procedura de reducere şi constă într-un regim medicamentos pentru fertilitate, pentru a stimula dezvoltarea de foliculi multipli ai ovarelor. Alte proceduri folosesc agonişti ai hormonilor eliberatori de gonadotropină (GnRHa), care reduc necesitatea de monitorizare prin prevenirea ovulaţiei premature şi, mai recent, au fost utilizaţi antagonişti ai hormonilor eliberatori de gonadotropină, care au o funcţie similară. La majoritatea pacienţilor, sunt utilizate gonadotropinele injectate (de obicei analogi FSH) sub o atentă monitorizare. O astfel de monitorizare verifică frecvent nivelul de estradiol al pacientei şi, prin intermediul ecografiei ginecologice, creşterea foliculară. De obicei, sunt necesare injecţii pe parcursul a 10 zile. Stimularea ovariană comportă riscul de stimulare excesivă care conduce la sindromul de hiperstimulare ovariană (SHSO), o complicaţie ce poate pune viaţa în pericol, cu distensie abdominală, hipertrofie ovariană, şi complicaţii respiratorii, hemodinamice şi metabolice. În plus, recent s-a demonstrat, de asemenea, că medicamentele pentru fertilitate utilizate pentru stimularea ovulaţiei la pacienţii supuşi tratamentului FIV contribuie la compromiterea receptivităţii implantării embrionului în uter şi conduc la o rată scăzută a instalării sarcinii (Ertzeid şi colab. 2001).

Fertilitatea femeii poate fi afectată de către disfuncţiile aparatului reproducător, ale sistemului neuroendocrin sau ale sistemului imunitar. Unele femei suferinde de cancer riscă să îşi piardă fertilitatea, deoarece anumite tipuri de tratamente prin chimioterapie, precum şi anumite tipuri de tratamente cu radiaţii, pot conduce la menopauză prematură, provocându-le sterilitate. În Europa de Vest şi America de Nord, disfuncţia endocrină este identificată la circa 10…20% dintre femeile care se prezintă cu infertilitate (Crosignani şi colab. 2000). Totuşi, în circa 10…20% din cazuri, cauza infertilităţii rămâne necunoscută. Este acceptat faptul că reacţiile autoimune ale corpului pot constitui cauza infertilităţii la multe din astfel de femei. Eşecul reproductiv autoimun şi disfuncţiile pot fi asociate cu activarea generală a sistemului imunitar sau cu reacţiile sistemului imunitar care sunt în mod specific îndreptate împotriva antigenelor ovariene.

Haller-Kikkatalo explică faptul că mecanismele de toleranţă activă sunt necesare pentru a preveni răspunsurile inflamatorii autoprotectoare ale corpului uman în faţa multor antigene externe aeropurtate şi antigene din hrană, care sunt întâlnite la suprafeţele mucoase ale organismului. Cu toate acestea, cel mai important aspect al toleranţei este autotoleranţa, care împiedică organismul să genereze un atac imun împotriva propriilor ţesuturi - aceasta este prevenţia reacţiilor autoimune. Autoimunitatea este asociată cu un dezechilibru al diferitelor componente ale răspunsului imun şi cu dezvoltarea de autoanticorpi îndreptaţi împotriva antigenelor gazdă normale. Fertilitatea femeii este reglată de o serie de interacţiuni puternic coordonate şi sincronizate pe axa hipotalamică-pituitară-ovariană. Sindromul eşecului autoimun reproductiv a fost iniţial descris de către Gleicher şi colab. în cazul femeilor cu endometrioză, infertilitate şi nivel crescut de autoanticorpi. Deşi impactul anumitor autoanticorpi în patogeneza infertilităţii nu este încă uniform înţeles, mecanismele autoimune, la fel ca şi o producţie crescută de multipli autoanticorpi sunt implicate în astfel de disfuncţii asociate infertilităţii, cum ar fi insuficienţă ovariană prematură (IOP), forme subclinice de insuficienţă ovariană, pierderi recurente ale sarcinii, endometrioză, sindromul ovarului polichistic (SOP), infertilitate inexplicabilă, încercări nereuşite repetate ale FIV şi avorturi spontane. Unele studii au sugerat importanţa mai scăzută a anticorpilor specifici şi au subliniat rolul cheie al activării totale a sistemului imunitar în fecundarea redusă. (N. Gleicher, 2001; Dmowski şi colab, 1995).

Un grup de cercetători sa-u concentrat pe elaborarea unor metode pentru a depăşi infertilitatea asociată sistemului imunitar. Prima şi cea mai obişnuită abordare este utilizarea medicaţiei care suprimă răspunsul autoimun la pacient, pentru a permite instalarea sarcinii. De exemplu, o terapie pe cale orală cu prednisolon în doză mică a fost sugerată pentru îmbunătăţirea ratei de sarcină la pacientele cu eşec recurent la FIV. Totuşi, datele contradictorii existente indică faptul că anumiţi anticorpi deteriorează embrionul, interferează cu procesul de implantare sau interferează cu formarea placentei. Aceasta face dificil de prezis succesul terapiei, folosind exact aceste medicamente imunosupresoare. S-au dezvoltat metode utilizând un pretratament mai uşor cu acid acetilsalicilic sau heparină. Cu toate acestea, deşi acest tratament a devenit general universal, rata de sarcină folosind această metodă rămâne relativ scăzută (Maghraby şi colab., 2007).

A doua abordare a fost recent introdusă. Procedura implică pregătirea atât a endometrului cât şi a mediul său înconjurător, prin intermediul celulelor mononucleare din sângele periferic. (PBMCs) (Fujiwara şi colab., Kosaka şi colab., Yoshioka şi colab). Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMCs) permit endometrului uterului să crească în mărime suficientă înainte de implantarea embrionului şi, de asemenea, acţionează ca subansambluri în raport cu organismul pentru creşterea embrionului (embrionilor), după implantarea lor în uterul femeii. Conform susţinătorilor, PBMC au fost identificate ca fiind celule multipotente. Celulele multipotente produc celule dintr-o anumită linie, foarte apropiată. Ele s-au dovedit a avea capacitatea de a fi transformate în mod natural în orice tip de ţesut uman. Celulele multipotente sunt o resursă valoroasă pentru cercetare şi tratamente terapeutice. Descoperirile recente în bioinginerie sunt destul de promiţătoare în repararea, construcţia, inginerizarea, regenerarea, generarea şi creşterea ţesutului.

Sursa EP1581637 A2 2005.10.05 dezvăluie celule stem adulte derivate din monocite, care sunt izolate din sângele periferic al mamiferelor şi metode de preparare, înmulţire şi utilizare a acestor celule stem. Sursa US 7795018 B2 2010.09.14 dezvăluie celule multipotente derivate din monocite (MOMCs) care se pot diferenţia în celule endoteliale într-un mediu de cultură, în condiţii care induc diferenţierea în endoteliu. În continuare este dezvăluită o metodă de preparare a MOMCs, care implică cultivarea de PBMCs in vitro pe fibronectină şi colectarea celulelor asemănătoare fibroblastelor. S-a demonstrat faptul că prin cultivarea într-un mediu EBM-2, un mediu de menţinere a celulelor endoteliale, timp de şapte zile, MOMCs se diferenţiază în celule endoteliale, modificând morfologia celulelor dintr-o formă de ax la o morfologie având mai multe proiecţii conform sursei US7795018 B2 2010.09.14. Cercetătorii implicaţi în prezenta invenţie au emis ipoteza că, prin urmare, utilizarea de PBMCs poate fi utilă pe parcursul procesului reproductiv şi au inclus folosirea de PBMCs într-o tehnică nouă de fertilizare in vitro.

A fost dezvoltat un grup de diferiţi agenţi de iniţiere, care, separat sau în combinaţie, pot fi aplicaţi în timpul tratamentului FIV pentru a promova acceptarea embrionului de către sistemul imunitar al unei femei. Printre aceşti agenţi, antigenul leucocitar uman solubil G (sHLA-G), pare a fi promiţător. Clasa s-HLA de molecule a fost recunoscută a fi implicată în răspunsul imun şi în modularea relaţiei imune materno-fetale în timpul sarcinii. Sher şi colab. dezvăluie în sursa US 10/829,081 izolarea sHLA-G din mediul de cultură din jurul embrionilor în cursul dezvoltării embrionilor şi blastocistelor. Ei au observat că absenţa sHLA-G din supernatantul care înconjoară grupurile de embrioni din cultură este asociată cu implantare FIV semnificativ şi rate de sarcină redusă. Ei au sugerat faptul că adaosul de sHLA-G la mediul în care embrionii sunt cultivaţi şi / sau livraţi în mediul uterin prin transfer de embrioni, ar spori implantarea şi potenţialul de sarcină al acestor embrioni. Cu toate că această tehnică este utilă, nici această metodă, nici oricare alta, în mod individual, nu a rezolvat problema infertilităţii autoimune. Se sugerează aici ca astfel de agenţi de iniţiere să fie utilizaţi împreună cu procedura din prezenta invenţie, pentru a spori probabilitatea şi succesul instalării sarcinii.

În sfârşit, construcţiile moleculare glicolipidice inginerizate asemănătoare s-au dovedit a fi capabile să modifice embrionii şi să consolideze interacţiunea dintre embrion şi ţesutul ţintă, endometrul. Construirea unei matrice macromoleculare pe suprafaţa exterioară a unui embrion şi încărcarea matricei respective cu anumiţi agenţi de stimulare a instalării sarcinii sunt tehnici care, conform susţinătorilor, vor avea aplicaţii foarte largi în tratamentul FIV în viitor. Această modificare a embrionilor prin această abordare constructivă nu numai că a fost demonstrată cu succes într-un sistem de cultură in vitro, dar animalele au dat naştere la pui sănătoşi derivaţi din astfel de embrioni modificaţi. Cu toate acestea, această abordare nu a fost încă testată în studiile clinice şi este în continuare prematur a fi luată în considerare, printre utilizările medicale curente.

Multe cercetări au fost îndreptate pentru îmbunătăţirea probabilităţii unei sarcini de succes şi naşterii unui copil. În ciuda cercetărilor considerabile, progreselor tehnice şi variaţiilor în ceea ce priveşte procedurile, rata sarcinii de succes folosind tratamentul FIV rămâne încă, în medie, la nivelul de 15…25% per ciclu. Prezenţii cercetători au încercat să abordeze provocarea implantării embrionului şi reducerii riscului de răspunsuri ale sistemului autoimunitar, prin prezentarea unei soluţii direcţionate pe stabilizarea interacţiunii dintre sistemul imunitar al unei femei şi embrion.

In sensul cel mai larg al invenţiei, este furnizată o metodă de fertilizare in vitro pentru un pacient de sex feminin, metoda cuprinzând etapele de introducere în uter a unei cantităţi eficiente de o compoziţie cuprinzând celule mononucleare din sângele periferic şi transferare în uterul pacientei, a cel puţin un embrion, după o întârziere predeterminată ulterioară iniţierii fertilizării in vitro a pacientei menţionate; şi în care rezultatele metodei conduc la o creştere a probabilităţii de implantare a embrionului în uter, cu instalare de succes a sarcinii, în comparaţie cu metodele de fertilizare in vitro care nu includ astfel de paşi. Întârzierea predeterminată de timp este o perioadă de timp suficientă pentru a scădea respingerea autoimună a embrionului sau riscul răspunsului autoimun al pacientei. Întârzierea de timp preferată înainte de transferul de embrioni este de cel puţin două cicluri menstruale sau două cicluri ovulatorii ale pacientei, cu toate că întârzierea va varia de la pacientă la pacientă şi între specii, hibrizi şi varietăţi de animale. Întârzierea de timp preferată la un pacient uman este între trei şi douăsprezece luni.

Acesta este un alt aspect al invenţiei care, spre sfârşitul perioadei de întârziere, endometrul femeilor este astfel pregătit încât să optimizeze acceptarea embrionului de către cavitatea uterină. Conform invenţiei, aceasta se realizează prin injectarea intrauterină a celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMCs), cel mai preferabil obţinute de la pacientă. S-a observat că această metodă creşte probabilitatea instalării cu succes a sarcinii şi dezvoltării timpurie a sarcinii. Combinarea întârzierii de implantare cu crioprezervarea embrionului şi pregătirea cu PBMCs a endometrului femeii este esenţa prezentei invenţii.

În mod special, este dezvăluită o metodă de fertilizare in vitro pentru o pacientă, incluzând paşii de: a) obţinere a cel puţin unui ovocit şi fecundarea ovocitului cu spermatozoizi pentru a forma un zigot; b) dezvoltare a zigotului in vitro până la stadiul embrionar; (c) crioprezervare a embrionului; (d) aşteptare pentru o perioadă predeterminată de timp, suficientă pentru a scădea riscul răspunsului autoimun al pacientei; (e) extragere a unei prime cantităţi de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) al pacientei cu 2 până la 4 zile înainte de perioada de aşteptare; (f) cultivare a respectivei prime cantităţi de PBMCs într-un mediu de cultură adecvat c (g) extragere a unei a doua cantităţi proaspete de PBMCs din sângele pacientei în ultima zi a perioadei de aşteptare; (h) combinare a primei cantităţi cultivate de PBMCs cu a doua cantitate proaspătă de PBMCs, pentru a obţine o compoziţie care conţine PBMCs proaspete şi de cultură; (i) introducerea compoziţiei de PBMCs în uterul pacientei; (j) scoatere din starea de crioprezervare a embrionului, prin decongelare; şi (k) transferarea cel puţin a unui embrion decongelat în uterul pacientei, pentru a efectua sarcina.

Un aspect suplimentar al invenţiei este o compoziţie care conţine PBMCs, o metodă pentru producerea compoziţiei şi aplicarea compoziţiei PBMC în tratamentul FIV şi pentru creşterea şi inginerizarea anumitor ţesuturi ţintă ale unui organism, cel mai preferabil endometrul uterului unei femei. O astfel de metodă implică extragerea de PBMCs din sângele unei paciente; înmulţirea unei cantităţi din PBMCs extrasă în prezenţa a 4,8…6,0% dioxid de carbon (CO2) la 36,7…37.3ºC într-un mediu de cultură care conţine (i) mediu RPMI 1640 cu L-glutamină şi bicarbonat de sodiu, (ii) albumină umană recombinată şi (iii) un agent promotor capabil să îmbunătăţească capacitatea PBMCs de consolidare a creşterii ţesutului, cum ar fi gonadotropina corionică umană (hCG); şi combinarea cantităţilor proaspete şi de cultură de PBMCs pentru a obţine compoziţia menţionată.

Prezenta invenţie va fi înţeleasă mai bine prin definirea anumitor termeni care sunt utilizaţi şi care au fost avuţi în vedere pe parcursul descrierii.

"Blastocistul" este un embrion, la cinci sau şase zile după fertilizare, cu o masă de celule interne, un strat exterior de celule numit trofectoderm şi o cavitate blastocelică plină cu lichid care conţine masa de celule interne din care derivă întreg embrionul. Trofectodermul este precursorul placentei. Blastocistul este înconjurat de zona pelucidă care este ulterior eliminată când blastocistul “cloceşte.” Zona pelucidă, compusă dintr-un strat de glicoproteine, înconjoară ovocitul din stadiul de celulă unică la stadiul de dezvoltare de blastocist. Înainte de fixarea şi implantarea embrionului, zona pelucidă este eliminată din embrion prin mai multe mecanisme, incluzând degradarea proteolitică. Zona pelucidă funcţionează iniţial pentru a preveni intrarea în ovocit a mai mult de un spermatozoid, iar mai târziu pentru a preveni fixarea prematură a embrionului înainte de ajungerea sa în uter.

“FIV cu embrion crioprezervat” se referă la un procedeu de fertilizare in vitro în care embrionul este crioprezervat şi apoi decongelat, înainte de transferul embrionar sau un proces în care ovocitul utilizat pentru fecundare a fost anterior îngheţat şi apoi dezgheţat. “FIV cu embrion proaspăt” se referă la un procedeu de fertilizare in vitro în care embrionul nu este congelat înainte de transferul în cavitatea uterină şi în care ovocitele utilizate pentru a pregăti embrionul nu au fost anterior congelate.

"Embrionul" este produsul diviziunii zigotului la sfârşitul etapei embrionare, opt săptămâni de la fecundare. Etapa de clivaj a embrionului are loc în timpul primelor trei zile de cultură.

"Transferul embrionar" este procedura prin care unul sau mai mulţi embrioni şi/sau blastocite sunt plasate în uter sau tuburi falopiene. Ca atare, termenii "blastocist" şi "embrion" sunt utilizaţi aici interschimbabil, în scopul de a defini termenul "transfer de embrion" şi în aplicarea termenului "transfer embrionar", în scopul şi domeniul de aplicare al invenţiei, astfel cum este descrisă şi revendicată.

“Endometrul” se referă la ţesutul mucoasei suprafeţei interne a uterului, care este compus dintr-un strat de celule epiteliale. Embrionul intră în contact mai întâi cu endometrul şi matricea extracelulară ("mucus") pentru implantare. Stratul epitelial şi cel de la bază de celule stromale se îngroaşă ciclic, secretă mucus şi este desprins din corp sub influenţa hormonilor ale ciclului menstrual. Prin termenul "implantare" aici se înţelege fixarea şi penetrarea ulterioară de către blastocist (după ce şi-a desprins zona pelucidă), de obicei în endometru. Fixarea pe mucoasa endometrului poate avea loc prin interacţiunea dintre moleculele de fixare şi pe una sau mai multe componente ale endometrului, incluzând membrane ale celulelor epiteliale, mucus, componente mucinoase de mucus, sau o componentă introdusă exogen a uterului.

"Fertilizarea" se referă la penetrarea ovulului de către spermatozoizi şi combinaţia dintre materialul genetic al acestora, ducând la formarea unui zigot. "Iniţierea fertilizării in vitro" aşa cum este utilizată aici, reprezintă iniţierea stimulării ovariene controlate la un pacient de sex feminin, care implică tratament farmacologic în care femeile sunt stimulate să inducă dezvoltarea de foliculi multipli ovarieni, pentru a obţine mai multe ovocite la aspiraţia foliculară.

"Uter", este principalul organ sexual reproductiv sensibil la hormoni în cazul celor mai multe mamifere, inclusiv la oameni, care conţine colul uterin la un capăt în timp ce celălalt este conectat la unul sau la ambele trompe uterine, în funcţie de specie. Funcţia de reproducere a uterului este aceea de a accepta un ovul fecundat care trece prin joncţiunea utero-tubară din tuburile falopiene. Acesta se implantează în endometru şi se hrăneşte din vasele de sânge care se dezvoltă exclusiv în acest scop. Ovulul fecundat devine un embrion, se fixează pe un perete al uterului, creează o placentă şi se transformă într-un fetus pe parcursul gestaţiei, până la naşterea copilului. Aşa cum este folosit aici, termenul "uter" încorporează tuburile falopiene în scopul transferului embrionar. Termenul “uter” este, de asemenea, utilizat interschimbabil cu termenul “cavitate uterină”, care este cavitatea corpului uterului.

În timpul tratamentului FIV, sistemul imunitar al unei femei trece printr-o producţie şi furnizare stimulată de ovocite. Dacă embrionul produs prin FIV este transferat în cavitatea uterină la scurt timp după extracţia ovocitelor, sistemul imunitar poate genera o reacţie exagerată. Astfel de reacţie exagerată a sistemului imunitar poate fi cauza incapacităţii organismului de a implanta embrionul şi conduce la infertilitate autoimună. În primul său aspect, invenţia prezintă întârzierea introducerii embrionului în uter, pentru a permite sistemului imunitar al femeii să se stabilească şi să-şi recapete echilibrul hormonal adecvat. Pe parcursul întârzierii, ovocitele sau embrionii pacientului feminin sunt opţional prezervate prin crioprezervare.

Întârzierea utilă în metoda prezentei invenţii este o perioadă predeterminată de timp, pentru fiecare pacient în parte. Pentru pacienţii umani, timpul de întârziere poate fi o perioadă de timp plasată oriunde în timpul a cel puţin două luni sau două cicluri de ovulaţie. În varianta de realizare preferată, întârzierea predeterminată este de trei cicluri de ovulaţie, ceea ce corespunde în mod tipic la trei luni. Cele mai multe femei au un ciclu de ovulaţie la fiecare 28 de zile. Este de înţeles, totuşi, că, din cauza faptului că ciclurile de ovulaţie variază de la femeie la femeie, numărul de zile efective de întârziere va varia de la pacientă la pacientă în cursul tratamentului conform procedurii FIV a invenţiei. Este posibil ca un pacient de sex feminin să aibă doar două cicluri de ovulaţie într-o perioadă de trei luni, sau, de asemenea, o femeie poate avea mai mult de trei cicluri de ovulaţie într-o perioadă de trei luni. În unele cazuri, este posibil ca o pacientă să nu aibă nici o ovulaţie suplimentară după iniţierea ovulaţiei post iniţierii tratamentului FIV. Întârzierea de timp poate fi, de asemenea, de o durată mai mare de trei luni, dar va fi, de preferinţă, în termen de trei luni până la un an. S-a demonstrat aici că perioada predeterminată de întârziere scade semnificativ riscul de infertilitate autoimună şi, prin urmare, creşte semnificativ probabilitatea de succes al sarcinii.

În limitele invenţiei se află variante de realizare în care ovocitele sau embrionii care sunt obţinuţi de la o femeie sau femei, altele decât pacienta, sunt folosite pentru instalarea sarcinii, denumite "ovule donatoare" sau, respectiv, "embrioni donatori". Acest lucru ar avea loc în situaţiile în care pacientul femeie nu este capabil să ovuleze sau să producă ovule viabile, sau în care se stabileşte că embrionii obţinuţi prin fecundarea propriilor ovule ale pacientei prezintă deficienţă sporită pentru a face posibil transferul de embrioni, sau au o probabilitate scăzută de supravieţuire, pe baza testării morfologice sau genetice.

În metoda obişnuită, femeile care sunt supuse la FIV necesită injecţii cu hormoni, pentru a stimula dezvoltarea foliculară şi producerea de ovule multiple. Acest proces de stimulare necesită, de obicei, utilizarea iniţială a unui agonist al hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH), pentru a suprima funcţia ovariană, împiedicând ovulaţia până la momentul dorit. Medicaţia care este cel mai frecvent utilizată este clomifen citrat (Clomid®), un modulator selectiv al receptorului de estrogen, care creşte producţia de gonadotropine prin inhibarea feedbackului negativ de la estrogen la hipotalamus. Această inducere a maturării finale şi eliberare a ovocitelor este adesea indusă prin administrarea de hormon luteinizant. Protocoalele pentru aceste injecţii sunt bine cunoscute şi stabilite în domeniu şi sunt utilizate în oricare dintre variantele de realizare ale metodelor invenţiei.

Conform metodei acestei invenţii, ovulele nefecundate sunt recoltate şi preluate de la pacientul de sex feminin prin tehnici cunoscute în domeniu. Astfel de tehnici implică plasarea unui ac special proiectat în foliculul ovarian şi eliminarea fluidului care conţine ovulele. Odată ce fluidul folicular este eliminat din folicul, ovulele pot fi examinate microscopic şi diagnosticate pentru a observa caracteristicile lor morfologice. O metodă de a obţine ovocite pentru FIV este dezvăluită în [1]. În metoda de faţă, şase ovocite sunt recoltate de la pacientă, cu toate că, de preferinţă, se obţin patru. Ovulele sunt apoi plasate într-un incubator. Pentru a fertiliza ovulele este folosită înseninarea convenţională sau injectarea intracitoplasmatică de spermă (ICSI). Tipul de fertilizare utilizat se bazează adesea pe parametrii materialului seminal masculin sau alţi factori cum ar fi tipul de analiză care poate fi necesară embrionului. În timpul înseninării convenţionale, sperma este amestecată cu ovulele într-un vas de cultură şi sunt incubate peste noapte, pentru a fi supuse procesului de fertilizare. În timpul injectării intracitoplasmatice a spermei, un spermatozoid este injectat direct într-un ovul. Indiferent de tehnică, ovulele sunt observate în ziua următoare pentru a fi evaluate în ceea ce priveşte diviziunea celulară. Ovulele fecundate, acum numite embrioni, sunt apoi plasate în medii de cultură specifice pentru îmbunătăţirea creşterii şi dezvoltării.

Conform invenţiei, ovocitele sau embrionii obţinuţi prin FIV sunt crescuţi pe mediu de cultură adecvat. Mediul de cultură disponibil încearcă să furnizeze substanţele nutritive necesare pentru ca celulele sa crească şi să se dezvolte şi caută să copieze cât mai mult posibil condiţiile care apar în mod normal în sistemul de reproducere feminin. Aici pot fi utilizate medii de cultură cunoscute în domeniu, care sunt potrivite pentru a fi utilizate pentru ajutorarea in vitro a dezvoltării şi creşterii celulei în experimente de laborator. Exemplele includ, dar nu sunt limitate la, fluid tubal uman, (HTF) (Irvine Scientific), mediu de N-2-hidroxietil-piperazin-N'-2-etan (HEPES) (Irvine Scientific), FIV-50 (Scandanavian FIV Science), S2 (Scandanavian IVF Science), G1 şi G2 (Scandanavian IVF Science), UniIVF, ISM-1, BlastAssist, mediu UTM (comercializat ca MEDICULT® mediu de Origio A/S), Mediu Whittens modificat, mediu Wittinghams T6, mediu Ham F-10, soluţie Earle. Sunt de obicei furnizate sisteme de tampon, cum ar fi acidul 4-morfolino propansulfonic (MOPS). Procedurile sunt bine stabilite în (Trouson şi colab., 1980 şi 1982) şi (Quinn şi colab., 1985).

Mediile de cultură de ţesut, în general, sunt sisteme complicate, care conţin o serie de aminoacizi, vitamine şi alţi compuşi. Unele medii constau din soluţii de săruri echilibrate, suplimentate cu surse de energie de carbohidraţi, cum ar fi glucoza, piruvatul şi lactatul. Mediul poate fi, de asemenea, completat cu aminoacizi non-esenţiali. Componentele din mediu sunt adesea derivate din surse non-umane şi non-animale, cum ar fi microorganisme recombinante. Este de dorit să se ia măsuri pentru a reduce posibilitatea de contaminare, cum ar fi purificarea adecvată şi tehnici de preparare practicate în domeniu. In plus, mediul poate include antibiotice, cum ar fi penicilina sau streptomicina, pentru a distruge bacteriile care pot fi introduse în mediu în timpul procesului de colectare a ovocitelor.

În timpul dezvoltării in vivo în cadrul sistemului de reproducere feminin, ovocitul este produs şi eliberat din ovar în timpul ovulaţiei şi înaintează prin oviduct spre uter. Lichidul oviductului conţine o serie de componente care oferă hrană pentru ovocit şi celulele cumulus din jurul său. După ce are loc fecundarea, zigotul rezultat se deplasează în jos prin oviduct şi intră în uter aproximativ trei zile mai târziu, fiind supus la transformare internă şi confruntându-se cu un mediu în schimbare. Schimbări semnificative în dezvoltare apar pe măsură ce zigotul/embrionul/blastocistul se dezvoltă. Compoziţia fluidului în uter care înconjoară embrionul în dezvoltare este adaptată la aceste nevoi în schimbare.

Niciun mediu nu este optimizat pentru sprijinirea gameţilor, fertilizarea, maturizarea zigotului şi dezvoltarea embrionului, comparativ cu mediul natural al sistemului de reproducere feminin. Astfel, un număr de medii specializate au devenit disponibile pentru a aborda etapele diferite de dezvoltare a embrionului. De exemplu, mediile G1 şi G2 au fost formulate în mod special pentru a satisface nevoile fiziologice ale etapei de clivaj embrionar şi ale embrionului, în stadiul de dezvoltare de blastocist, cu opt celule. Sursa US 6605468 B1 2003.08.12, Robertson si colab. dezvăluie un mediu pentru propagarea de embrioni în stadiu incipient către etapa de blastocist. Mediul conţine o cantitate eficientă de factor stimulator al coloniilor de granulocite-macrofage (GM-CSF), pentru a creşte procentul de embrioni pre-blastocist care se dezvoltă în blastociste gata de a fi transferate. Este dezvăluită, de asemenea, o metodă de creştere a embrionilor umani în stadiu incipient către blastociste gata de a fi transferate. Rezultatul este că o proporţie mai mare de embrioni poate fi adusă la stadiul de blastocist şi utilizată pentru implantare într-un program FIV. Un număr de studii au fost realizate folosind tehnici de cultură în care embrionii sunt co-cultivaţi cu celule de hrănire (Menezo si colab,, 1990.; Planchot si colab., 1995). Alţi factori stimulatori cum ar fi citokinele pot fi adăugate la mediu pentru a propaga creşterea embrionului, cum ar fi factorul de inhibare a leucemiei (LIF), a se vedea, de exemplu, sursa US 5418159 A 1995.05.23, Factorul inhibitor al leucemiei este un hormon puternic având utilitate generală în domeniul embriologiei in vitro, cum ar fi menţinerea liniilor de celule stem embrionare şi creşterea eficienţei transferului de embrioni.

În sursa [2] se menţionează că în loc de cufundarea celulelor de reproducere umane într-un unic mediu de cultură pe tot parcursul procesului FIV, celulele de reproducere pot fi deplasate printr-o secvenţă de medii de cultură distincte, pe măsură ce sunt efectuate diferitele proceduri FIV. Într-o formulare, mediul de cultură este special conceput pentru a oferi un mediu fizic similar celui găsit în tractul reproductiv feminin şi care să conducă la creşterea şi dezvoltarea de embrioni. Dezvăluirea sugerează că mediul specializat poate fi oferit pentru extragerea şi manipularea ovocitelor, maturarea ovocitului, fecundare obişnuită, examinarea şi biopsia ovocitului, zigotului şi embrionului, dezvoltarea embrionară la stadiul de 8 celule, dezvoltarea embrionară la stadiul de blastocist, transferul de embrioni şi crioprezervarea.

În plus faţă de utilizarea mediilor de cultură disponibile în mod obişnuit pentru prepararea embrionului, metoda invenţiei poate fi combinată cu alte tehnici, pentru a creşte probabilitatea şi succesul instalării sarcinii. Au fost dezvoltate o serie de metode în care embrionul este modificat în anumite moduri înainte de transferul în cavitatea uterină. De exemplu, sursa [3] dezvăluie modificarea enzimatică a antigenului H de pe suprafaţa celulară, prin adăugarea uneia sau mai multor unităţi de monozaharide care generează celule care sunt serologic echivalente cu celulele roşii din sânge antigen A sau B. Cercetările indică faptul că există un receptor pentru hialuronat pe embrion şi că există, de asemenea, un receptor pentru hialuronat pe endometrul uterului mamei. Hialuronatul se consideră că acţionează ca adeziv biologic care ajută embrionul în legarea la endometru şi, în consecinţă, sprijină implantarea. Sursa [4], Carter si colab. dezvăluie o metodă de localizare a acidului hialuronic la suprafaţa unei celule sau structuri multicelulare (un embrion), pentru a fi utilizată în proceduri FIV. Dezvăluirea furnizează constructe de carbohidraţi-lipide care se încorporează stabil în bi-stratul de lipide sau în membrana unei celule sau embrion, modificând activitatea sa biologică în scopul de a îmbunătăţi anumite caracteristici, cum ar fi caracteristicile de creştere, caracteristicile de depozitare şi de supravieţuire a embrionului şi probabilitatea de transpunere a embrionului în urma transferului in uter. În mod similar, sursa [5], Blake şi colab. dezvăluie un alt construct preparat exogen pentru a îmbunătăţi fixarea şi implantarea unui embrion. Embrionul este modificat de glicolipide cu cozi de lipide, care sunt inserate în membrana celulară a embrionului sau în zona pelucidă în care glicolipida a fost modificată pentru a încorpora o parte de legare, în care partea de legare este adaptată pentru a permite legarea la o moleculă de fixare. Fixarea embrionului de endometru se poate produce direct prin porţiunile de legare sau prin intermediul unei molecule de legătură. O altă metodă, colorarea proteinelor, este o metodă pentru modificarea antigenelor externe ale membranelor celulare fără transfer de gene. Descrierea pentru cererea internaţională [6] indică creşterea implementării prin punerea în contact a embrionului cu o moleculă lipidică de adeziune modificată, astfel încât să modifice dezvoltarea embrionului. Sursa US 2013067021 A1 2013.03.14 descrie o altă metodă non-transgenică pentru schimbări calitative şi/sau cantitative eficiente în antigenele de suprafaţă exprimate de o celulă. Constructele de molecule sintetice dezvăluite de către cercetători se încorporează în bistratul lipidic al celulei, şi se propune ca o astfel de inserţie sa fie favorizată termodinamic. Metodele anterioare de preparare a embrionilor, precum şi alte metode practicate în domeniu, sunt avute în vedere în scopul invenţiei de faţă.

În procesul FIV tradiţional, embrionii sunt transferaţi în cavitatea uterină la două zile după fecundare, atunci când fiecare embrion este la stadiul patru celular sau la trei zile după fecundare, când embrionul este la stadiul opt celular. Este recunoscut faptul că este de dorit să se utilizeze embrioni în stadiul de blastocist, când a ajuns la cinci - şapte zile de cultură. Metoda FIV, conform invenţiei prezente, permite transferul de embrioni în orice moment de-a lungul spectrului dezvoltare a embrionului/blastocistului. Prin observarea vizuală, cum ar fi prin cu utilizarea microscopului, blastocistele sau embrionii sunt consideraţi a fi gata de a fi transferaţi la uter atunci când cavitatea blastocelică este evidentă vizibil şi cuprinde mai mult de 50% din volumul embrionului. Într-un mediu in vivo, această etapă ar fi atinsă, în general, la patru până la cinci zile după fecundare, la scurt timp după ce embrionul a traversat tubul falopian şi ajunge în uter.

Conform celui de al doilea aspect al invenţiei, s-a descoperit de către inventatorii de faţă că introducerea unei compoziţii conţinând celule mononucleare din sânge periferic (PBMCs) în uterul unei paciente înaintea transferului de embrioni în timpul tratamentului FIV creşte în mod clar probabilitatea de succes a implantării embrionilor în endometrul uterului, conducând astfel la sarcină viabilă. Fără intenţia de a fi legat de teoria ştiinţifică, se crede că PBMCs promovează sănătatea şi viabilitatea endometrului unei femei şi a embrionului transferat.

PBMCs sunt celule progenitoare multipotente, care au potenţialul de a genera celule de multiple forme, dar un număr limitat de linii. La sfârşitul unor lungi serii de diviziuni celulare care formează embrionul sunt celule care sunt diferenţiate terminal, sau care sunt considerate a fi dedicate permanent unei anumite funcţie. Experimente cu celule stem au fost capabile de a determina celule stem din sânge să se comporte precum neuronii, sau precum celulele creierului - un proces cunoscut sub numele de transdiferenţiere. Utilizarea de celule stem pluripotente de la fetuşi, cordoane ombilicale sau ţesuturi embrionare derivate din ovule fecundate in vitro ridică probleme etice şi juridice în cazul materialelor umane, prezintă un risc de transmitere a infecţiilor şi/sau pot fi ineficiente, deoarece acestea pot fi respinse de către sistemul imunitar al unui primitor. Se poate argumenta că utilizarea de PBMCs ridică probleme mai puţin etice şi legale, deoarece PBMCs sunt celulele care sunt obţinute din sânge şi nu constituie celule stem, fiind însă capabile de a se diferenţia.

Aşa cum este utilizată aici, o celulă mononucleară din sânge periferic (PBMC) este o celulă multipotentă, care este extrasă, recoltată, derivată, izolată sau altfel obţinută din sângele unui subiect. O PBMC este o celulă de sânge şi care are un nucleu rotund. Clasa PBMC include, dar nu se limitează la, limfocite, monocite a şi macrofage. Aceste celule sanguine sunt o componentă importantă în sistemul imunitar al organismelor utilizate în combaterea infecţiilor şi în operarea altor funcţii care implică sistemul imunitar. Populaţia de limfocite este formată din celule T (CD4 şi CD8 pozitive ~ 75%), celule B şi celule NK (~ 25% combinate). Populaţia PBMC include şi celule bazofile şi dendritice.

PBMCs pot fi izolate din sânge periferic uman prin metode obişnuite cunoscute în domeniu. Celulele pot fi extrase din sânge integral utilizând FICOLL® (GE Healthcare Bio-Sciences AB LLC din Suedia), o polizaharidă hidrofilă care separă straturile de sânge, care va separa sângele într-un strat superior de plasmă, urmat de un strat de PBMCs şi o fracţiune bazală de leucocite, eritrocite şi celule polimorfonucleare (precum neutrofile, eozinofile). Celulele polimorfonucleare pot fi apoi izolate prin lizarea celulelor roşii din sânge. Ficoll® este parte a Ficoll-Paque® (GE Healthcare Bio-Sciences AB SRL din Suedia). Ficoll-Paque® este, în mod normal, plasat în partea de jos a unui tub conic şi sângele este apoi stratificat lent deasupra Ficoll-Paque®. După ce a fost centrifugat, mai multe straturi vor fi vizibile în tubul conic, de sus în jos: plasmă şi alte componente, stratul de celule mononucleare conţinând PBMCs, Ficoll-Paque® şi eritrocitele şi granulocitele care sunt prezente în formă de pelete. Această separare permite recoltarea facilă de PBMCs. Poate interveni captarea unora dintre celule roşii din sânge (prezenţa eritrocitelor şi granulocitelor) în stratul PBMC sau Ficoll-Paque®. Poate apărea uneori coagularea majoră a sângelui în stratul PBMC. Etilendiamintetraacetat (EDTA)) şi heparina sunt utilizate în mod obişnuit în combinaţie cu Ficoll-Paque® pentru a preveni coagularea. Deoarece stratificarea Ficoll-Paque® este un proces foarte lent, au fost dezvoltate dispozitive care ajuta la dispunere, care constituie etapa consumatoare de cel mai mult timp. Un astfel de produs este SepMate™ -50 (StemCell Technology Inc din Canada), un tub specializat care conţine o inserţie poroasă, care formează o barieră fizică între Ficoll-Paque® şi proba de sânge. Acest lucru permite ca proba de sânge să fie picurată rapid pe inserţie, evitând necesitatea suprapunerii direct pe Ficoll-Paque®. Inserţia SepMate™ reduce, de asemenea, durata etapei de centrifugare şi, după centrifugare, stratul superior conţinând plasmă şi PBMCs poate fi turnat într-un recipient separat. Alte dispozitive includ o coloană care conţine o barieră cu mare densitate poroasă polietilenică sau "frită." Aceste produse permit sângelui să fie întins mult mai rapid, fără amestecare de polizaharidă şi sânge. Un exemplu de un astfel de produs este "System Accuspin Histopaque-1077" comercializat de Sigma Aldrich. De asemenea, este posibil ca sistemul de separare Ficoll-Paque® sa fie inclus într-un tub vacutainer de colectare a sângelui. Astfel de vacutainere sporesc confortul şi siguranţa de colectare a produselor din sânge, dar sunt mult mai costisitoare decât vacutainerul de bază. Un alt astfel de produs, Floaties™, a fost demonstrat a dispune în mod eficient sângele sau o suspensie celulară pe Ficoll® folosind un amestec special de granule polimerice sau pelete. Acest produs este ieftin, reduce dependenţa cercetătorului de tehnică şi, de fapt, accelerează procesul de suprapunere. Oricare dintre tehnicile de mai sus, inclusiv alte tehnici, care sunt sau vor deveni practicate în domeniul colectării, izolării, extragerii, recoltării, separării, eliminării, sau în orice alt mod destinate a obţine PBMCs din sângele unui organism, uman sau animal, sunt avute în vedere în domeniul de aplicare al variantelor de realizare ale invenţiei de faţă.

Într-unul din aspectele invenţiei prezentate aici, este un procedeu de cultivare a celulelor PBMCs. Metoda cuprinde cultivarea celulelor pe plăci acoperite cu fibronectină într-o atmosferă umedă care conţine de la 4,8% la 6,0% dioxid de carbon (CO2), la o temperatură în intervalul de la 36,7°C la 37,3°C, la o densitate de la 104 la 107/mL. Într-o variantă de realizare preferată a metodei, PBMCs sunt cultivate pentru o perioadă de timp aflată în intervalul de la 46 de ore la 72 de ore. În varianta cea mai preferată, PBMCs sunt cultivate pe plăci acoperite cu fibronectină într-o atmosferă de 5,0% CO2 la o temperatură de 37,1°C, timp de 48 de ore.

Mediul de cultură utilizat aici pentru propagarea de PBMCs extrase este un mediu Roswell Park Memorial Institute, cunoscut sub numele de mediu RPMI, disponibil din diferite surse. Mediul RPMI este adesea folosit pentru celule şi ţesuturi de cultură. Mediul RPMI 1640 a fost în mod tradiţional folosit pentru creşterea celulelor limfoide umane fără ser, celule de măduvă osoasă şi celule de tip hibridoma. Mediul RPMI 1640 utilizează un sistem de tamponare pe bază de bicarbonat şi diferă de majoritatea mediilor de cultură de celule de mamifer în formularea sa pH 8. Mediul preferat în conformitate cu metodele din invenţie utilizează un mediu de cultură RPMI 1640 conţinând L-glutamină şi bicarbonat de sodiu.

Conform unui alt aspect al invenţiei, albumina umană recombinantă (HRA) se adaugă la mediul de cultură. HRA este binecunoscută ca fiind o proteină purtătoare prezentă în concentraţii mari în plasmă, cu un timp circulator de înjumătăţire de aproximativ 19 zile. Aceasta operează în transporturile de acizi graşi la nivelul ţesuturilor, stabilizarea proteinelor, legarea ionilor metalici la suprafeţe şi are un efect antioxidant în plasmă. HRA este disponibilă pe scară largă de la un număr de furnizori, de exemplu de la Novozymes, Inc sau Sigma-Aldrich, LLC. Adăugarea HRA în timpul metodei invenţiei la mediul de cultură acţionează ca un supliment alimentar care îmbunătăţeşte creşterea PBMCs.

Într-un alt aspect al invenţiei, gonadotropina corionică umană (hCG) se adaugă la mediul de cultură RPMI 1640. Gonadotropina corionică umană (hCG) este eliberată în organism, în circulaţia maternală în timpul sarcinii prin sinciţiotrofoblaste placentare. Aceasta s-a dovedit a fi un hormon imuno-modulator şi s-a raportat că administrarea de hCG creşte succesul sarcinii şi antiserul hCG inhibă implantarea fetală. hCG interacţionează cu anumiţi receptori (receptorii LHCG) şi promovează menţinerea corpului luteinic în timpul începutului sarcinii, făcându-l să secrete hormonul progesteron. Progesteronul îmbogăţeşte uterul cu o căptuşeală groasă a vaselor de sânge şi a capilarelor, astfel încât să poată susţine dezvoltarea embrionului şi fătului. Datorită încărcăturii sale înalt negative, hCG poate respinge celulele imune ale mamei, protejând fătul în timpul primului trimestru. De asemenea, s-a emis ipoteza că hCG ar putea constitui o legătură placentară pentru dezvoltarea imunotoleranţei materne locale. De exemplu, celulele endometriale tratate cu hCG induc o creştere în apoptoza celulei T (dizolvarea de celule T). Aceste rezultate sugerează că hCG ar putea fi o verigă în dezvoltarea toleranţei imune peritrofoblastice, şi poate facilita invazia trofoblastică, care este cunoscută a accelera dezvoltarea fetală în endometru (Kayisli şi colab., 2003). S-a sugerat, de asemenea, că nivelurile de hCG sunt legate de severitatea stării de rău matinal la femeile gravide. Concentraţia minimă de hCG a mediului de cultură al invenţiei nu este mai mică de 5 UI/mL. În scopul clarităţii, s-a constatat aici că prezenţa hCG în mediul de cultură preparat conform metodei invenţiei funcţionează ca un agent promotor care îmbunătăţeşte capacitatea PBMCs de a stimula creşterea ţesutului, în mod special creşterea endometrului în timpul procesului FIV al invenţiei. PBMCs cultivate şi/sau compoziţia de cultură proaspăta şi combinată de PBMC are capacitatea de a modifica dimensiunea şi receptivitatea ţesutului endometrial al pacientei, atunci când este tratat cu compoziţia PBMC a invenţiei. Acest lucru duce la o creştere a dimensiunii, în mod special o creştere a grosimii endometrului, precum şi la o capacitate sporită a endometrului de a fixa embrionul după implantare.

Metoda de fertilizare in vitro a invenţiei furnizează utilizarea de PBMCs obţinute prin tehnica de cultivare de mai sus, în scopul de a îmbunătăţi instalarea sarcinii. După obţinerea de ovocite de la un pacient de sex feminin, o cantitate de PBMCs este extrasă din sângele pacientei. Această cantitate de PBMCs este apoi cultivată într-un mediu de cultură adecvat, în conformitate cu metoda dezvăluită mai sus, pentru a obţine o cantitate şi calitate dorită a PBMCs. După o perioadă de timp de aşteptare sau întârziere predeterminată discutată aici, o cantitate suplimentară de sânge este obţinută de la pacient şi o nouă cantitate de PBMCs este extrasă din sânge. Alternativ, lotul de sânge obţinut la început de la pacientă poate fi împărţit în diferite fracţiuni conţinând PBMCs, dintre care una sau unele sunt cultivate, şi una sau unele sunt menţinute în stare proaspătă. Cantitatea proaspătă este preferabil obţinută în ultima zi a perioadei de timp de aşteptare predeterminată. Unele PCMBs proaspete sau toate sunt apoi combinate cu o parte sau cu întreaga cantitate de cultură de PBMCs, pentru a obţine o compoziţie care conţine atât PBMCs proaspete, cât şi cultivate. Concentraţia de PBMCs într-o compoziţie preferată a PBMC conform invenţiei se află în intervalul de la 4 la 5 milioane de celule pe fiecare mililitru de compoziţie; totuşi concentraţii de până la 8 milioane de celule/mL de compoziţie sunt operabile în domeniul de aplicare al invenţiei. Compoziţia poate fi amestecată sau mixată în continuare sau prelucrată prin orice metodă dezirabilă, astfel încât să combine PBMCs fără a deteriora celulele. Această compoziţie de PBMCs este apoi introdusă, în mod obişnuit, prin injectare prin cateter în cavitatea uterină a pacientei. Conform invenţiei, între 20 şi 72 de ore mai târziu, cel mai preferabil în 24 de ore, unul sau mai mulţi embrioni sunt transferaţi în uter, pentru implantare, în scopul de a se efectua sarcina. Cercetătorii de faţă au demonstrat că această tehnică permite corpului să utilizeze PBMCs ca subansambluri, pentru a creşte grosimea stratului de endometru la nivelul uterului şi, prin aceasta, să reducă riscul de eşec al instalării sarcinii.

Este important ca PBMCs să fie extrase chiar de la pacient în cursul tratamentului FIV al invenţiei. Cu toate acestea, se prevede în sfera de aplicare a invenţiei, că cantitatea de cultură de PBMCs poate fi obţinută de la un individ, altul decât pacienta care este supusă transferului de embrioni in vitro. În acest caz, cantitatea proaspătă de PBMCs se obţine, preferabil, de la pacienta supusă transferului de embrioni, pentru a pregăti răspunsul autoimun al pacientei.

Diagnosticele de preimplantare, atât pentru embrioni, cât şi pentru sistemul reproductiv al pacientei, constituie un alt aspect al prezentei invenţii. În ceea ce priveşte diagnosticul pacientei, examinarea grosimii endometrului, care poate fi măsurată în mod tipic prin ultrasunete, este preferabil să fie situată în intervalul de la 9 mm la 11 mm, în momentul transferului de embrioni.

De asemenea, în mod obişnuit sunt efectuate diagnostice post-implantare. Testarea pentru a determina dacă unul sau mai mulţi embrioni au fost implantaţi în endometru, adică, dacă procedura a condus la instalarea unei sarcini viabile, este realizată la două săptămâni după transfer, folosind, de exemplu, teste de sânge pe b-hCG (gonadotropina corionică umană) şi alte tehnici cunoscute în domeniu. hCG este esenţial în diagnosticul de sarcină şi în condiţiile legate de sarcină, cum ar fi sarcina ectopică, avort spontan, trisomia 21, sarcină molară şi coriocarcinom. Apariţia "sarcinii biochimice", se petrece atunci când o sarcină este diagnosticată prin detectarea de hCG în ser sau urină, care nu se dezvoltă într-o sarcină clinică. Sursa US 4315908 A 1982.02.16, Zer şi colab. stabileşte o metodă pentru detectarea hCG în urină prin radioimunoanaliză. Brevetul US 8163508 B2 2012.04.24, O'Connor şi colab. furnizează o metodă şi un kit pentru estimarea sarcinii la un subiect prin metoda hCG, determinând cantitatea de izoform de hCG asociat sarcinii premature dintr-o probă. Aceste metode de diagnostic, precum şi altele, sunt utile în domeniul de aplicare al invenţiei.

Medicii depun eforturi pentru a identifica acei embrioni pentru transfer care sunt cei mai potriviţi pentru a obţine o sarcină viabilă. În anumite variante de realizare, prezenta invenţie prevede testarea morfologică, genetică şi cinetică a ovulelor, blastocistelor sau embrionilor prelevaţi de la pacientă şi preparaţi in vitro. Metodele de diagnostic includ analiza microscopică fizică a embrionului, pentru a identifica acei embrioni care par să se dezvolte normal, prin observarea caracteristicilor morfologice ale embrionului şi testarea genetică a embrionului. "Diagnosticul genetic de preimplantare" constată dacă embrionul conţine modificări sau anomalii genetice, structurale, şi/sau cromozomiale, prin analiza corpurilor polare, blastomerilor sau trofectodermului. "Screening-ul genetic de preimplantare" implică analiza corpurilor polare, blastomerilor sau trofectodermului embrionilor pentru detectarea aneuploidiei, mutaţiei şi/sau rearanjării ADN. Cel puţin trei tehnici de incubare de bază şi de biopsie asistată sunt cunoscute în domeniu pentru diagnosticarea embrionilor. Aceste tehnici includ crearea mecanică a unei incizii în zona pelucidă a embrionului cu ajutorul unui cuţit microchirurgical specializat sau a unui ac de sticlă; digerând chimic o porţiune din zona pelucidă cu acid, cum ar fi soluţie Tyrode; sau îndepărtarea zonei pelucide folosind un laser pentru a ajuta la separarea blastocistului.

Într-o variantă de realizare preferată, prin observare vizuală a embrionului cu ajutorul microscopiei (de exemplu, microscop Nikon Eclipse TE 2000-S), embrionul va prezenta anumite caracteristici fizice sau morfologice determinate simultan, înainte de a fi implantat în uter. Starea maturităţii blastocistului va fi determinată ca fiind in intervalul II AB - VI AA, conform clasificării (Gardner şi colab, 1994), încorporată aici prin referire, prin care sunt clasificate masa intracelulară şi grosimea stratului trofectoderm. Nivelul VI AB reprezintă maturizarea blastocistului la cel mai înalt nivel, corespunzând unui blastocist format care incubează din zona pelucidă.

Diagnosticul genetic al embrionului poate fi realizat prin orice tehnici cunoscute în domeniu, cum ar fi tehnica tradiţională matricială CGH pentru cromozomul artificial bacterian (BAC), şi altele asemenea. Tehnicile micromatriciale, de asemenea denumite microchip, biochip, au devenit utilizate pe scară largă pentru exprimarea genelor şi alte cercetări genomice şi oferă avantaje tehnice pentru BAC. Micromatricea este în general executată prin imprimare sau sinteză de acid nucleic, care este complementar cu secvenţele cunoscute într-un genom pe o suprafaţă. Întregul genom al unui organism sau părţi ale acestuia pot fi evaluate prin hibridizare amplificată şi marcare fluorescentă a AND-ului (acid dezoxiribonucleic) la matrice. Sursa US 2012/587406, inclus aici prin referinţă în totalitatea sa, dezvăluie metode de fertilizare in vitro, în care diagnosticul genetic de preimplantare al tuturor celor 24 de cromozomi din embrionul FIV este realizat prin amplificarea întregului genom şi prin analize micromatriceale de polimorfisme. Metoda presupune biopsierea embrionului FIV pentru a îndepărta una sau mai multe celule şi extragerea acidului nucleic din celule. Efectuarea amplificării genomului permite apoi colectarea de informaţii genetice ale embrionului în scopul de a anticipa normalitatea genetică a embrionului, pe baza informaţiilor genetice obţinute. Această tehnică face posibilă, de asemenea, determinarea cariotipului embrionului. După ce embrionii sunt analizaţi, ei sunt clasificaţi în funcţie de potenţialul de implantare în uter. În variante de realizare în care embrionii sunt analizaţi din punct de vedere genetic, unul sau mai mulţi embrioni potriviţi pentru implantare în uter sunt selectaţi pe baza predicţiilor genetice.

Diagnoza cinetică a embrionului este o altă procedură importantă, disponibilă în vederea selectării embrionilor cei mai potriviţi, cei mai sănătoşi, pentru transferul embrionilor. Un instrument disponibil este sistemul de monitorizare al embrionului Primo Vision cu filmare spaţială (Vitrolife AB, Göteborg, Suedia). Prima Vision este un şi sistem computerizat şi de fotografiere, care este conceput să capteze imaginile embrionilor, utilizat în ciclurile de fertilizare in vitro, pe măsură ce aceştia cresc în incubator. Imaginile embrionului care se dezvoltă într-un vas de cultura, captate de aparatul de fotografiat, sunt afişate pe un ecran de computer în laborator. Sistemul computerizat furnizează nu numai imaginile embrionilor, dar şi informaţii despre tiparul lor de creştere. Aceste informaţii permit embriologilor şi clinicienilor să observe dezvoltarea sănătoasă a embrionilor şi să detecteze orice probleme în momentul diviziunii celulare care ar putea apărea în timpul primelor etape de creştere. Avantajul suplimentar al Primo Vision este acela că permite ca aceste observaţii să fie făcute fără îndepărtarea embrionilor din incubatorul lor. Acest lucru permite embrionilor să rămână într-un mediu controlat, în care tind să crească mai repede. Conform invenţiei, embrionii cei mai dezirabili a fi selectaţi pentru transferul de embrioni ar trebui să afişeze următoarele criterii cinetice: un factor de timp de 5…12 ore pentru divizare din etapa de 2 celule în etapa de 3 celule; ar trebui să aibă 3 celule la 35…40 de ore după stadiul de zigot; 5 celule la 48…56 de ore după etapa de zigot; 8 celule la începutul celei de a treia zi de dezvoltare. Toate celulele ar trebui să aibă, preferabil, aceeaşi dimensiune, sau cât mai apropiată posibil, iar nivelul de fragmentare ar trebui să nu fie mai mare de 5…10 %.

Conform prezentei invenţii, ovocitele obţinute de la pacient sau ovocitele fecundate care s-au dezvoltat până la stadiul de embrion gata de transfer sunt păstrate pe parcursul perioadei de timp până când sistemul imunitar al pacientului este suficient de pregătit să accepte embrionul pentru gestaţie, pentru perioada de timp necesară pentru a suprima răspunsul autoimun al pacientului. Cei mai mulţi pacienţi doresc să conceapă propriii descendenţi, dacă este posibil şi, prin urmare, doresc să utilizeze propriile ovocite sau embrioni. Prin urmare, în cele mai multe situaţii, trebuie să fie prezervaţi ovocitele sau embrionii pacientului.

Într-o anumită categorie de femei care prezintă infertilitate, femeia nu este aptă să producă ovule sau să ovuleze, sau întâmpină anovulaţie sau oligoovulaţie, astfel încât ovocitul (ovocitele) donator (donatoare) sau embrionul (embrionii) donator (donatori), care sunt obţinuţi de la un alt individ de sex feminin, sunt furnizaţi pentru procedura in vitro. Prin urmare, este de aşteptat în domeniul de aplicare al anumitor variante de realizare ale invenţiei faptul că pacientul va fi înseninat cu embrionii care nu au fost obţinuţi de la pacienta însăşi, ci sunt obţinuţi de la un individ diferit, prin urmare, un ovocit donator sau un embrion donator este transferat pacientei pentru instalarea sarcinii.

De asemenea, în cadrul scopului invenţiei se află variante de realizare în care ovulele sau embrionul de la o specie sunt transferate la o specie diferită de cea de la care oul sau embrionul sunt obţinuţi. De exemplu, un embrion de la un măgar poate fi implantat în uterul unui cal.

Totuşi, cazul cel mai frecvent întâlnit rămâne în continuare acela în care se cere prezervarea ovocitelor sau embrionilor (de obicei obţinute din cele ale pacientului, dar, posibil, şi din altă sursă). Conservarea poate fi asigurată prin supunerea ovocitului sau embrionului la condiţii de temperatură scăzută, cum ar fi răcire lentă, congelare rapidă şi vitrificare. Spre deosebire de spermă, care a fost îngheţată cu succes şi utilizată pe parcursul anilor, ovulele conţin o mare cantitate de apă, ceea ce face mai dificilă congelarea. Atunci când ovulele sunt îngheţate, se pot forma cristale de gheaţă în interiorul ovulului. Aceste cristale de gheaţă pot distruge structura celulei. Pentru a ajuta la diminuarea cantităţii de cristale de gheaţă, oamenii de ştiinţă au eliminat o parte din apă pe măsură ce ovulul a fost îngheţat lent. Sursa US 2010/777149 descrie o metodă care cuprinde centrifugarea ovocitelor sau embrionilor (de exemplu de la câini, pisici, porci, efective de animale, şoareci, şobolani şi maimuţe), pentru a polariza lipidele citoplasmatice în afara ovocitului sau celulelor embrionare, supunând ovocitele sau embrionii la condiţii de temperatură scăzută în prezenţa unui crioprotector care duce la îngheţarea ovocitelor sau embrionilor înainte de depolarizarea lipidelor, urmată de depozitare la temperatură scăzută a ovocitelor sau embrionilor congelaţi. Cu toate acestea, până acum s-a dovedit a fi imposibil de îndepărtat toată apa, şi, astfel, formarea de cristale de gheaţă intra şi extracelulară nu poate fi prevenită prin congelare lentă. Astfel, fertilizarea ovocitelor, viabilitatea embrionilor şi instalarea sarcinii, în cazul acestor ovule congelate lent, odată dezgheţate, este scăzută.

Congelarea rapidă a fost încercată cu utilizarea de crioprotectori. Un crioprotector este o substanţă care este folosită pentru a proteja ţesutul biologic de deteriorarea survenită prin formarea de gheaţă. Crioprotectorii operează prin creşterea concentraţiei substanţei dizolvate în celule. Pentru a fi viabili din punct de vedere biologic, crioprotectorii trebuie să penetreze celulele cu uşurinţă şi să nu fie toxici pentru celule. Crioprotectori convenţionali sunt glicoli, cum ar fi etilen glicol, propilenglicol şi glicerol; 2-metil-2,4-pentanediol (MPD); sulfoxid de dimetil (DMSO) şi sucroză. Glicerolul şi DMSO au fost utilizate timp de decenii de către criobiologişti pentru a reduce formarea de gheaţă în sperma şi embrionii care sunt conservaţi prin răcire în azot lichid. S-a constatat că amestecurile de crioprotectori au o toxicitate mai mică şi sunt mai eficiente decât crioprotectorii utilizaţi ca agent unic. Un amestec de formamidă cu DMSO, propilenglicol şi un coloid a fost timp de mulţi ani cel mai eficient crioprotector creat în mod artificial. Mulţi crioprotectori funcţionează, de asemenea, prin formarea de legături de hidrogen cu molecule biologice pe măsura ce moleculele de apă sunt dislocate. Legarea hidrogenului în soluţiile apoase este importantă pentru funcţionarea adecvată a proteinei şi ADN-ului. Astfel, pe măsură ce crioprotectorul înlocuieşte moleculele de apă, materialul biologic îşi păstrează structura şi funcţia sa fiziologică nativă, deşi ele nu mai sunt scufundate într-un mediu lichid.

Mai recent, procesul vitrificării, un proces de îngheţare şi solidificare fără formare de cristale de gheaţă, a fost aplicat pentru a prezerva ovocitele şi embrionii, ţesuturile biologice şi organele pentru transplant şi în crionizare. Unii crioprotectori operează prin scăderea temperaturii de tranziţie vitroasă a unei soluţii sau a unui material. În acest fel, crioprotectorul previne congelarea reală, iar soluţia îşi menţine o anumită flexibilitate în fază sticloasă. Deşi congelarea lentă şi rapidă sunt operabile, vitrificarea este metoda preferată de prezervare a ovocitelor sau embrionilor, în conformitate cu metoda invenţiei. În timpul vitrificării, ovocitul sau embrionul este îngheţat suficient de rapid astfel încât cristalele de gheaţă să nu aibă timp să se formeze. Orice tehnică de vitrificare cunoscută poate fi utilizată în cadrul metodei invenţiei pentru conservare şi depozitare. De obicei, ovocitul sau embrionul este iniţial introdus într-o baie cu o concentraţie mai mică de antigel, împreună cu sucroză, pentru a elimina apa din ovocit sau embrion. Ovocitul este apoi introdus într-o baie cu concentraţie mare de antigel pentru mai puţin de un minut, timp în care îngheaţă instantaneu. Un exemplu al procesului vitrificării operabil în cadrul procesului invenţiei, implică plasarea embrionilor menţinuţi în mediu MEDICULT®, la o temperatură de 37°C, iar apoi plasarea embrionilor în mediu la 22…24°C, care este ulterior plasat într-un recipient special pentru crionizare sau purtător de tip crioleaf în azot lichid.

Conform metodei FIV a invenţiei, pacienta este gata să continue transferul de embrioni atunci când este stabilit faptul că sistemul autoimun al pacientei şi-a recăpătat echilibrul hormonal. La acel moment, crioprezervarea ovulelor sau embrionilor obţinuţi prin FIV este încheiată. Ovocitul (ovocitele) sau embrionul (embrionii) se îndepărtează din soluţia antigel şi sunt decongelaţi. Odată decongelat, un ovul nefecundat poate fi fecundat prin oricare dintre tehnicile descrise mai sus printr-o tehnologie de reproducere asistată care injectează un spermatozoid direct într-un ovul. Embrionul este decongelat prin extragerea acestuia din soluţia de azot lichid, plasarea într-o soluţie cu o temperatură de aproximativ 37°C, spălarea la temperatura camerei, plasarea din nou într-o soluţie de 37°C, plasarea într-un mediu de cultură, apoi plasarea într-un incubator menţinut la o temperatură similară cu temperatura internă a cavităţii uterine feminine, 36,8…37,2°C, pentru o perioadă de la 5 la 24 de ore, cel mai preferabil la o temperatură de 37,1°C, timp de 5 până la 7 ore.

În etapa finală a procedeului conform invenţiei este procedura prin care unul sau mai mulţi embrioni sunt introduşi în corpul pacientei într-o încercare de a produce sarcina. Această procedură este numită "transfer de embrioni" şi implică transferul embrionului în uter, cavitate uterină sau tuburi falopiene. Transferul embrionilor implică de obicei plasarea embrionilor selectaţi prin colul uterin în cavitatea uterină a pacientei cu ajutorul unui cateter mic, maleabil şi ghidat de o sondă cu ultrasunete. După cum s-a menţionat anterior, în conformitate cu metoda conform invenţiei, de preferinţă cu cel puţin 24 de ore înainte de transferul de embrioni, endometrul uterului pacientei este pregătit prin injectarea unei compoziţii de PBMCs în cavitatea uterină, folosind un cateter adecvat pentru livrare. Embrionul este de obicei menţinut într-un mediu de transfer de embrioni, de exemplu, mediu UTM Medicult®, şi poate conţine HAS, insulină umană recombinantă, gentamicină.

Este un alt aspect suplimentar al prezentei invenţii faptul că instalarea sarcinii este mai departe promovată prin introducerea de antigene de histocompatibilitate, cum ar fi antigenul leucocitar uman solubil G (sHLA-G) în sistem, care funcţionează ca "comunicatori-prieteni sau duşmani", pentru a permite recunoaşterea pozitivă şi acceptarea embrionului de către sistemul imunitar al femeii. HLA-G, precursorul formei sale solubile, sHLA-G, a fost detectat de către cercetători în preimplantarea embrionilor şi în mediile de cultură înconjurătoare obţinute în timpul studiilor FIV. Aceste constatări au sugerat că sHLA-G este implicat încă de la primele etape ale sarcinii. De asemenea, este sugerat potenţialul sHLA-G de a opera ca indicator al calităţii embrionilor (Menicucci şi colab., 1999). Un studiu sugerează că nivelurile sHLA-G la supernatanţi în preimplantarea embrionilor pot fi cuantificate şi sugerează rezultate pozitive cu probabilitatea de sarcină, acţionând ca un indicator util al calităţii embrionului, care poate fi utilizat în asociere cu testarea morfologică în cadrul criteriilor de selecţie a embrionului, pentru a creşte probabilitatea de implantare de succes. Într-o variantă de realizare, s-HLA-G este adăugat la mediul de transfer embrionar, cu o măsurare a concentraţiei preferate în mediul de transfer embrionar situată în intervalul de densitate optică (OD) de la 0,175 la 0,350, unde OD înseamnă densitatea optică măsurată la o lungime de undă în intervalul de la 400 la 450 nm, mai precis, la o lungime de undă de 405 nm. Procedura de determinare a concentraţiei de sHLA prin măsurarea densităţii optice este descrisă pe larg într-un număr de publicaţii (de exemplu, S. Martí şi colab., 2007). s-HLA-G este adăugat la mediul de transfer embrionar, iar embrionul este apoi cultivat în mediul respectiv, timp de 5 până la 20 min şi mai preferabil timp de aproximativ 10 min, imediat înainte de transferul embrionului în uter.

Un aspect înrudit al invenţiei furnizează o metodă de creştere, reparare, inginerizare, restaurare, sau altă modalitate de tratare a unui ţesut ţintă al unui pacient prin creşterea ţesutului ţintă în prezenţa compoziţiei PBMC, conform procedeului stabilit în această dezvăluire. ţesutul este crescut prin introducerea ţesutului în prezenţa PBMCs cultivate, sau prin cultivare utilizând compoziţie PBMC combinată din PBMCs cultivate şi proaspete. Ambele procese, atât procesul in vivo, cât şi cel in vitro sunt avute în vedere. O variantă de realizare a unei asemenea metode este aceea că ţesutul ţintă este endometrul uterului unei paciente. Cu toate acestea, aşa cum este dezvăluit în sursele US 7795018 B2 2010.09.14 şi US 8216838 B2 2012.07.10, Kuwana şi colab., PBMCs sunt recunoscute ca fiind celule multipotente care sunt foarte potrivite pentru transplant de celule în vederea regenerării organelor, inclusiv oase, cartilagii, muşchi scheletic, ţesut adipos, muşchi cardiac, vascular, endotelial şi neuronal. Prin urmare, procedeul, mediul de cultură şi compoziţia conform invenţiei cuprinzând o combinaţie de PBMCs, atât de cultură, cât şi proaspete din prezenta invenţie pot fi extinse mult dincolo de limitele tratamentului FIV şi tratarea endometrului, la aplicaţiile care implică creşterea, repararea şi inginerizarea altor ţesuturi, care sunt apte de a fi tratate prin PBMCs.

Este de remarcat aici că conceptul şi aplicarea acestei invenţii are relevanţa cea mai mare pentru om, dar este aplicabilă implantării embrionului la o mare varietate de animale. Această invenţie nu este limitată la fertilizarea in vitro umană sau implantarea embrionului folosind sistemul de întârziere autoimună cu utilizarea compoziţiilor PBMC. De exemplu, tehnica poate fi utilizată pe animale, cum ar fi animalele murine, inclusiv şobolanul cenuşiu şi şoarecele de casă; cu animalele de companie, inclusiv câini şi pisici; şi cu efectivul de animale domestice, cum ar fi porci, cai, măgari, capre, oi, lame şi alpaca, printre altele, în scopul de a creşte rata natalităţii la astfel de animale. Aceste creşteri vor avea implicaţii financiare semnificative în industria efectivelor de animale şi implicaţii sociale în domeniile cercetării şi dezvoltării ştiinţifice şi medicale.

Deşi invenţia este în general definită ca mai sus, specialiştii în domeniu vor aprecia că aceasta nu se limitează la aceasta şi include variante de realizare din care exemplele următoare furnizează o descriere suplimentară. Este de înţeles că alte modificări funcţionale specifice pot fi efectuate în scopul de aplicare în domeniu, fără a ne îndepărta de scopul prezentei invenţii. Avantajele invenţiei sunt demonstrate de către exemplele de mai jos, care sunt expuse pentru a ilustra metodele şi compoziţia invenţiei şi sunt menite a fi pur exemplificative în ceea ce priveşte principiile şi aplicările invenţiei şi nu trebuie văzute ca o limitare în ceea ce priveşte domeniul acesteia.

Exemplele de mai jos ilustrează prezenta invenţie. A fost efectuat un studiu pentru a examina şi compara cele două proceduri FIV. Prima procedură a fost denumită metoda "FIV cu embrion proaspăt" şi a doua procedură a fost denumită metoda "FIV cu embrion crioprezervat". Comparaţia statistică a rezultatelor clinice a fost realizată pentru a examina efectul în ratele de sarcină la femeile care prezintă infertilitate sau întârziere în implantarea embrionului sau a blastocistului în cavitatea uterină a femeii după extragerea ovocitului. Termenii "rata sarcinii", "rata clinică a sarcinii " şi "rata de implantare" sunt utilizaţi aici interschimbabil şi se referă la numărul de sarcini clinice exprimate per 100 de cicluri de transfer de embrion. În continuare a fost investigat efectul administrării celulelor mononucleare din sângele periferic intrauterin (PBMC) asupra ratelor de sarcină, pentru ambele proceduri, atât pentru "FIV cu embrion proaspăt", cât şi pentru "FIV cu embrion crioprezervat".

Subiecţi: au fost examinate în total o sută optzeci (180) de femei prezentând infertilitate. Anterior prezentului studiu, fiecare pacientă fusese supusă în prealabil la două sau mai multe tratamente “FIV cu embrion proaspăt” eşuate şi cel puţin un “FIV cu embrion crioprezervat” eşuat, înainte de participarea la prezentul studiu. Femeile au fost împărţite in 2 grupe a câte 90 de femei per grup. Vârsta medie a femeilor din grupul 1 a fost de 35,5 ± 3,4 ani. Vârsta medie a pacientelor din grupul 2 a fost de 36,5 ± 5,5 ani. Subiecţii au fost pregătiţi după cum urmează.

Procedura FIV: s-a aplicat protocolul standard FIV folosind un a-GnRH (hormonul de eliberare a gonadotropinei) pentru stimularea ovariană controlată a pacientelor din ambele grupuri. Perioada de stimulare a ovarului pentru fiecare pacientă a fost între 10 şi 12 zile. Mărimea medie a foliculilor a fost măsurată ca fiind de aproximativ 18 mm la momentul puncţiei transvaginale. Au fost aplicate pacientelor din ambele grupuri Gonal, Menopur, Choragon, pentru menţinerea fazei luteale. În general, 10 până la 12 ovule au fost extrase de la fiecare pacientă. Nu mai puţin de 80% din ovocitele obţinute au fost suficient de mature pentru a fi fecundate (etapă de maturizare MII, conform determinării prin clasificarea Gardner).

După extragerea ovocitelor, ele au fost cultivate în mediu FIV Universal (MEDICULT® disponibil de la Origio A/S Corporation, Danemarca) având concentraţia de CO2 în intervalul 5,5…5,7%, la o temperatură de 36,8…37,1°C. Ovocitele au fost apoi fecundate atât prin ICSI, cât şi prin procedura standard FIV. Tehnica a fost aleasă luând în considerare indicatori referitori la spermă, vârsta pacientei, experienţa încercărilor FIV anterioare cu rezultat negativ. În cazul procedurii FIV standard, spermatozoizii au fost adăugaţi ovocitelor în mediu UniFIV. Zigoţii dezvoltaţi în ziua următoare au fost plasaţi într-un mediu ISM-1. În cazurile în care ovocitele au fost obţinute prin puncţie transvaginală, acestea au fost plasate în mediu UniFIV. După fertilizarea prin procedura ICSI, ovulele au fost imediat plasate în ISM-1. Embrionii au fost cultivaţi în mediu FIV MEDICULT® Universal pe parcursul primelor trei zile pentru dezvoltarea embrionului de clivare şi în mediu MEDICULT® BlastAssist pe parcursul zilei a patra şi a cincea de cultură, până la formarea blastocistului. Transferul de embrion a fost efectuat utilizând mediu UTM MEDICULT®.

Vitrificare: vitrificarea a fost aplicată blastocistelor sau embrionilor în ziua a 5-a de dezvoltare, utilizând metoda standard MEDICULT®. Embrionii au fost plasaţi în soluţiile specificate, pentru a îndepărta cât mai posibil din apă. Embrionii au fost plasaţi pe purtători de crionizare în azot lichid. Nu au fost plasaţi mai mult de doi embrioni pe un purtător. Embrionii congelaţi au fost depozitaţi pe durata aşteptării o perioadă de trei luni până la un an.

Preparare PBMC: celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost extrase de la fiecare pacientă. Prima cantitate de PBMCs a fost preluată de la pacientă în ziua primirii ovocitelor în protocoalele "FIV cu embrion proaspăt", sau cu trei zile înainte ca embrionii să fie transferaţi în uter în protocoalele "FIV cu embrion crioprezervat". Iniţial, 10 mL de sânge periferic au fost recoltaţi de la fiecare pacientă. Întreaga cantitate (10 mL) din sângele periferic a fost amestecată cu 10 mL de mediu RPMI 1640 MEDICULT® cu L-glutamină şi bicarbonat de sodiu, formând un volum combinat de 20 mL de sânge diluat. Un mediu de separare a limfocitelor (mediu gradient de densitate) a fost apoi folosit pentru a separa PBMCs de sânge. Un volum de 7 mL de sânge diluat a fost dispus pe 3 mL din mediul de gradient de densitate. După stratificare, centrifugarea sângelui stratificat a fost realizată la o viteză de 1500 de rotaţii pe minut, timp de 30…35 min pentru a genera PBMCs. PBMCs astfel obţinute au fost spălate de două ori în RPMI prin centrifugare, timp de 10 min, la o viteză de 1600 rotaţii pe minut, la 4°C. PBMCs spălate au fost transferate în mediul de cultură. Mediul de cultură l-a constituit un amestec de mediu RPMI 1640 cu L-glutamină şi bicarbonat de sodiu, cu adăugare de gonadotropină corionică umană (hCG) şi albumină umană recombinantă (de la Sigma-Aldrich Co, LLC). Condiţiile culturii au fost menţinute la 5,0% CO2 şi 37°C. Perioada de cultură a PBMCs a fost de 48…52 de ore. După 48…52 de ore, a fost recoltată o cantitate suplimentară din cantitatea totală de sânge de la aceeaşi pacientă. PBMCs suplimentare au fost extrase prin aceeaşi metodă. Al doilea lot din PBMCs au fost combinate cu PBMCs de cultură şi amestecul a fost transferat în cavitatea uterină a pacientei printr-un cateter. Procedura se realizează rapid, într-un total de 10…15 min. Volumul amestecului total de PCMBs pentru aplicarea intrauterină pentru fiecare pacientă în parte a fost în intervalul 0,2…0,3 mL.

Dezgheţarea şi transferul embrionului: pentru fiecare pacientă, au fost selectate câte două blastociste pentru transferul de embrioni. Decongelarea a fost realizată folosind protocolul standard MEDICULT®. Embrionii au fost îndepărtaţi din azotul lichid şi plasaţi într-o soluţie de 37°C, apoi spălaţi cu mai multe soluţii la temperatura camerei, plasaţi din nou într-o soluţie la 37°C, apoi plasaţi într-un mediu de cultură într-un incubator, la o temperatură de temperatură de 37,1°C, timp de 6 ore. Embrionii au fost cultivaţi în mediu BlastAssist MEDICULT® sau 3…4 ore după decongelare. Embrionii au fost apoi plasaţi într-un mediu UTM MEDICULT® timp de aproximativ 15 min. Transferul de embrioni a fost realizat cu utilizarea mediului UTM MEDICULT®, prin catetere cu control prin ultrasunete Cook® Medical.

Procedura FIV: ambele grupuri de femei au fost supuse tratamentului FIV. Procedura FIV efectuată pe grupul 1 nu a implicat utilizarea de PCMBs; în timp ce procedura FIV pentru grupul 2 a fost efectuată cu utilizarea de PBMCs. Durata tratamentului pentru fiecare grup de femei a inclus două etape - un ciclu "FIV cu embrion proaspăt" şi un ciclu "FIV cu embrion crioprezervat", aşa cum este descris aici. În ziua transferului embrionar, dimensiunea endometrului a fost măsurată la 9…11 mm, în ambele grupuri de paciente. După transferul embrionar, tuturor pacientelor li s-a administrat progesteron, astfel cum se obişnuieşte pe parcursul tratamentului FIV, pentru a pregăti endometrul pentru implantarea embrionului. Implantarea embrionului a fost confirmată prin teste de sânge pe b-hCG, efectuate la două săptămâni după transferul de embrioni. Sarcina clinic a fost confirmată prin examinarea cu ultrasunet la trei săptămâni după transferul de embrioni.

Ambele grupuri de femei au fost supuse unui ciclu "FIV cu embrion proaspăt", cu transferul a două blastociste. Fiecare pacientă a fost testată în ce priveşte apariţia sarcinii. Eşecul a reieşit atunci când testarea a arătat o absenţă a sarcinii clinice sau biochimice. În acele cazuri în care ciclul "FIV cu embrion proaspăt" a eşuat în a avea ca rezultat o implantare cu succes a embrionului, a fost realizat un ciclu "FIV cu embrion crioprezervat", prin care în cavitatea uterină a pacientei au fost introduşi embrioni congelaţi, după o perioadă de timp de întârziere situată între 2 si 3 cicluri menstruale după ciclul "FIV cu embrion proaspăt" negativ, care a fost măsurat la aproximativ trei luni după ziua în care au fost extrase ovocitele din ovarele pacientei.

Femeile din grupul 1 nu au primit niciun tratament cu PCMBs; femeile din grupul 2 au primit un tratament cu PBMCs, imediat după încheierea perioadei de aşteptare. În timpul ciclurilor "FIV cu embrion proaspăt", PBMCs au fost administrate în uterul fiecărui subiect, în a doua zi de cultură embrionară, la 48…52 de ore de la extragerea ovulului. În timpul ciclurilor "FIV cu embrion crioprezervat", au fost administrate PBMCs in uter, cu aproximativ 24 de ore înainte de transferul de embrioni.

Rezultate: grupul pacientelor supuse tratamentului FIV cu embrion proaspăt fără PBMCs, a avut ca rezultat o rată a implantării de 22,2% (20 de sarcini clinice după 90 TE). Utilizarea de PMBCs în timpul metodei ”FIV cu embrion proaspăt” a determinat o creştere a ratei implantării de până la 31,1% (28 de sarcini clinice după 90 TE). În grupul femeilor supuse încercărilor prin tratament "FIV cu embrion crioprezervat" (timpul de întârziere având o durată de cel puţin 3 luni, atât pentru grupul 1, cât şi pentru grupul 2), rata de implantare fără aplicarea intrauterină de PBMCs a fost de 21,4% (15 sarcini clinice, după 70 TE), în timp ce după aplicarea de PBMCs, rata de implantare a fost de aproape două ori mai mare 41,9% (26 de sarcini clinice, după 62 TE). Rata totală de succes pentru grupul 1 (90 de paciente fără aplicare de PBMCs) a fost de 38,9% (35 de sarcini clinice). Rata totală de success pentru grupul 2 (90 de paciente cu aplicare de PBMCs) a fost de 60,0% (54 de sarcini clinice). Rezultatele clinice ale studiului sunt prezentate în tab. 1 de mai jos. Abrevierea “TE” indică “transfer de embrioni”.

Rata de implantare în ciclurile “FIV cu embrion proaspăt” şi “FIV cu embrion crioprezervat”, cu şi fără administrare de PBMCs la pacientă.

Tabelul 1

Rata de sarcină clinică Grupul 1 (fără PBMC) Grupul 2 (cu PBMC) FIV cu embrion proaspăt 22,2% (20 de sarcini după 90 TE) 31,1% (28 de sarcini după 90 TE) FIV cu embrion crioprezervat 21,4% (15 sarcini după 70 TE) 41,9% (26 de sarcini după 62 TE) Total 38,9% (35 de sarcini pentru 90 de paciente) 60,0% (54 de sarcini pentru 90 de paciente)

Tab. 1 demonstrează rata crescută a sarcinii obţinută, comparativ cu FIV tradiţional, prin utilizarea propriilor PBMCs ale femeii, prin pregătirea uterului înainte de transferul de embrioni. Se demonstrează mai departe faptul că, combinând întârzierea sau tehnica "FIV cu embrion crioprezervat" cu pregătirea pentru concepţie a uterului unei paciente prin administrarea de PBMCs proprii ale femeii în timpul procesului de fertilizare in vitro, produce o creştere semnificativă a ratei de sarcină la femeile infertile, în comparaţie cu procedurile FIV cunoscute anterior, posibil ca un rezultat sinergic atât al faptului că se permite sistemului autoimun al pacientului feminin să îşi recapete echilibrul hormonal, cât şi al faptului că se permite procesului de instalare să fie realizat într-o cavitate uterină având o abilitate sporită pentru implantarea embrionului.

Orice referire din această descriere la "o anume variantă de realizare," "o variantă de realizare," "exemplu de variantă de realizare," etc, înseamnă că o anumită trăsătură, structură, sau caracteristică descrisă în legătură cu varianta de realizare este inclusă în cel puţin o variantă de realizare a invenţiei. Apariţiile unor astfel de expresii în diferite locuri din descriere nu se referă în mod neapărat, în totalitate, la aceeaşi variantă de realizare. Mai mult, atunci când o anumită trăsătură, structură sau caracteristică este descrisă în legătură cu orice variantă de realizare, este presupus că este de competenţa unui specialist în domeniu efectuare acestei trăsături, structuri sau caracteristici în legătură cu alte variante de realizare.

Deşi variantele de realizare au fost descrise cu referire la un număr de variante de realizare ilustrative ale acestora, trebuie să se înţeleagă faptul că pot fi concepute numeroase alte modificări şi variante de realizare de către specialiştii în domeniu care se vor afla în spiritul şi domeniul de aplicare al principiilor acestei dezvăluiri. Mai specific, sunt posibile diverse variaţii şi modificări în părţile componente şi/sau aranjamente combinate ale subiectului în domeniul de aplicare al dezvăluirii, desenelor şi revendicărilor anexate. În plus faţă de variaţiile şi modificările în părţile componente şi/sau aranjamente, utilizări alternative vor fi de asemenea evidente pentru specialiştii în domeniu.

Descrierea se publică în redacţia solicitantului.

1. US 4725579 A 1988.02.16

2. US 6838235 B2 2005.01.04

3. WO 2005121322 A1 2005.12.22

4. US 8183214 B2 2012.05.22

5. US 7819796 B2 2010.10.26

6. WO 99/05255 A1 1999.02.04

Claims

1. Compoziţie de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) pentru fertilizarea in vitro a unei paciente, care conţine: a) o primă cantitate de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) al pacientei, pentru cultivarea ulterioară într-un mediu de cultură; b) o a doua cantitate proaspătă de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs).

2. Compoziţie, conform revendicării 1, unde prima cantitate de celule mononucleare (PBMCs) este extrasă cu 2...4 zile înainte de sfârşitul perioada de aşteptare, care constitue cel puţin 2 luni sau două cicluri de ovulaţie, pentru scăderea riscului răspunsului autoimun sau influenţei sistemului endocrin, sau funcţiei reproductive a pacientei.

3. Compoziţie, conform revendicării 1, unde a doua cantitate de celule mononucleare (PBMCs) este extrasă în ultima zi a perioadei de aşteptare, care costituie cel puţin 2 luni sau două cicluri de ovulaţie, pentru scăderea riscului răspunsului autoimun sau influenţei sistemului endocrin, sau funcţiei reproductive a pacientei.

4. Compoziţie, conform revendicărilor 1-3, unde concentraţia de celule mononucleare (PBMCs) este în intervalul de la 4 la 8 milioane de celule într-un mililitru de compoziţie menţionată.

5. Compoziţie, conform revendicărilor 1-4, unde prima şi/sau a doua cantitate de celule mononucleare (PBMCs) conţine extract de celule mononucleare (PBMCs) din sângele periferic al unei paciente.

6. Compoziţie, conform revendicărilor 1-4, unde prima şi/sau a doua cantitate de celule mononucleare (PBMCs) conţine extract de celule mononucleare (PBMCs) din sângele periferic al unei alte paciente.

7. Metodă de preparare a compoziţiei de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) pentru fertilizarea in vitro a unei paciente, care include: a) obţinerea unei prime cantităţi de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) al pacientei; b) cultivarea primei cantităţi de celule mononucleare menţionate într-un mediu de cultură adecvat; c) obţinerea unei a doua cantităţi de celule mononucleare (PBMCs) din sângele pacientei; d) amestecarea primei cantităţi cultivate cu a doua cantitate proaspătă de celule mononucleare (PBMCs).

8. Metodă, conform revendicării 7, unde ulterior se aşteaptă cel puţin 2 luni sau două cicluri de ovulaţie pentru scăderea riscului răspunsului autoimun sau influenţei sistemului endocrin, sau funcţiei reproductive a pacientei.

9. Metodă, conform revendicării 7 sau 8, unde prima cantitate de celule mononucleare din sângele pacientei se obţine cu 2...4 zile înainte de sfârşitul perioada de aşteptare.

10. Metodă, conform revendicării 7 sau 8, unde a doua cantitate proaspătă de celule mononucleare din sângele pacientei se obţine în ultima zi a perioadei de aşteptare.

11. Metodă, conform revendicărilor 7-10, unde prima şi/sau a doua cantitate de celule mononucleare (PBMCs) conţine extract de celule mononucleare (PBMCs) din sângele periferic al unei paciente.

12. Metodă, conform revendicărilor 7-10, unde prima şi/sau a doua cantitate de celule mononucleare (PBMCs) conţine extract de celule mononucleare (PBMCs) din sângele periferic al unei alte paciente.

13. Metodă, conform revendicărilor 7-12, unde cantitatea de celule mononucleare (PBMCs) menţionată se cultivă pe plăci acoperite cu fibronectină într-o atmosferă umedă, care conţine 4,8...6,0% de dioxid de carbon (CO2) la o temperatură de 36,7... 37,3°C şi o densitate a celulelor de 104…107/ml.

14. Metodă, conform revendicărilor 7-13, unde cultivarea celulelor mononucleare menţionate se efectuează într-un mediu de cultură adecvat care include: mediul RPMI 1640, L-glutamină, bicarbonat de sodiu, albumină umană recombinată şi opţional gonadotropină corionică umană (hCG); la care concentraţia minimă de hCG în mediul de cultură este de cel puţin 5 UI/ml.

15. Metodă, conform revendicărilor 7-14, unde cultivarea celulelor mononucleare (PBMCs) se efectuează timp de 46...72 ore.

16. Metodă de fertilizare in vitro pentru o pacientă, care include următoarele etape: a) obţinerea cel puţin a unui ovocit de la o pacientă; b) fecundarea ovocitului de către spermatozoid, pentru formarea unui zigot şi dezvoltarea zigotului in vitro până la stadiul embrionar; c) crioprezervarea embrionului; d) obţinerea unei prime cantităţi de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) al pacientei; e) cultivarea primei cantităţi de celule mononucleare menţionate într-un mediu de cultură adecvat; f) aşteptarea pentru o perioadă de timp predeterminată, suficientă pentru a reduce riscul răspunsului autoimun al pacientei; g) extragerea unei a doua cantităţi proaspete de celule mononucleare din sângele periferic (PBMCs) al pacientei în ultima zi a perioadei de aşteptare; (h) combinarea primei cantităţi cultivate de celule mononucleare (PBMCs) cu a doua cantitate proaspătă de celule mononucleare (PBMCs), pentru a obţine o compoziţie care conţine celule mononucleare (PBMCs) proaspete şi cultivate; (i) introducerea compoziţiei de celule mononucleare (PBMCs) în uterul pacientei; (j) decongelarea embrionului; (k) transferarea cel puţin a unui embrion decongelat în uterul pacientei pentru a iniţia sarcina.

17. Metodă, conform revendicării 16, unde embrionul este crioprezervat prin vitrificare.

18. Metodă, conform revendicării 16, unde prima cantitate de celule mononucleare (PBMCs) este extrasă cu 2...4 zile înainte de sfârşitul perioada de aşteptare, care este de cel puţin 2 luni sau două cicluri de ovulaţie pentru scăderea riscului răspunsului autoimun sau influenţei sistemului endocrin, sau funcţiei reproductive a pacientei.

19. Metodă, conform revendicării 16, unde a doua cantitate de celule mononucleare (PBMCs) este extrasă în ultima zi a perioadei de aşteptare, care este de cel puţin 2 luni sau două cicluri de ovulaţie pentru scăderea riscului răspunsului autoimun sau influenţei sistemului endocrin, sau funcţiei reproductive a pacientei.

20. Metodă, conform revendicării 16, unde volumul de compoziţie introdusă în uter în etapa (i) se află în intervalul de 0,1…0,3 ml.

21. Metodă, conform revendicării 16, unde transferul de embrioni se efectuează când embrionul are o maturitate a stării de blastocist în intervalul II AB - V AA, determinată în conformitate cu clasificarea lui Gardner.

22. Metodă, conform revendicării 16, unde embrionul este transferat în uter cu un mediu de transfer de embrioni, care conţine o substanţă care stimulează concepţia.

23. Metodă, conform revendicării 22, unde substanţa care stimulează concepţia reprezintă antigenul leucocitar uman solubil din clasa G (sHLA-G), concentraţia de sHLA-G în mediul de transfer al embrionilor se află în intervalul 0,175…0,350 DO, unde DO semnifică densitatea optică măsurată la o lungime de undă în intervalul de la 400…450 nm.

24. Metodă, conform revendicării 16, unde adiţional se efectuează cultivarea embrionului în mediul de transfer al embrionilor menţionat pentru o perioadă cuprinsă în intervalul de la 5…20 min înainte de transferul embrionului în uter.

25. Metodă, conform revendicării 16, unde pacienta este o fiinţă umană şi introducerea embrionului în uterul pacientei se efectuează peste 20…72 de ore după introducerea compoziţiei de celule mononucleare (PBMCs).

26. Compoziţie conform revendicărilor 1-6 sau compoziţie obţinută prin metoda conform revendicărilor 7-15 utilizate pentru creşterea, repararea, regenerarea sau tratarea ţesutului unei paciente.