MD4313114T2 - Tratarea combinată a leziunilor cerebrale - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la o terapie combinată pentru utilizare în tratamentul şi prevenirea leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale ischemice şi/sau hipoxice, inclusiv, dar fără a se limita la, encefalopatia hipoxico-ischemică, de preferinţă la un subiect neonatal, fie la termen, fie prematur.

Description

[0001] Domeniul invenţiei

[0002] Prezenta invenţie se referă la o terapie combinată pentru utilizare în tratarea şi prevenirea tratării şi prevenirea leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale ischemice şi/sau hipoxice, incluzând, dar fără a se limita la, encefalopatia hipoxic-ischemică, preferabil la un subiect neonatal, fie la termen, fie înainte de termen.

[0003] Stadiul tehnicii în domeniul invenţiei

[0004] Factorul de creştere a nervilor (NGF sau hNGF) este o proteină neuroactivă pentru descoperirea căreia s-a acordat Premiul Nobel pentru Medicină (1986, Rita Levi-Montalcini). De-a lungul timpului, potenţialul său terapeutic a fost studiat pe larg, în special în bolile cronice/degenerative. O formulă oculară de NGF uman recombinant (rhNGF) a fost aprobată recent de EMA şi FDA pentru tratarea cheratitei neurotrofice, o boală oculară rară. Mai puţin investigat este potenţialul neuroprotector al hNGF în leziunile acute ale sistemului nervos central (SNC). Unele publicaţii ştiinţifice au indicat că un deficit în producerea factorilor neurotrofici endogeni poate fi un factor care contribuie la determinarea gravităţii deficitelor neurologice pe termen lung observate după leziuni hipoxico-ischemice neonatale (Wang et al., Int J Neurosci 2013; 123: 191-195), sugerând astfel administrarea lor în faza acută a leziunii (Acta Cir Bras 2017; 32: 270-279, Int J Clin Exp Med 2013; 6: 951-955). În special, administrarea NGF limitează deficitul în dezvoltarea şi maturizarea comportamentelor complexe evaluate la o vârstă fragedă. Din păcate, hNGF are, de asemenea, un puternic efect hiperalgezic (Nat Med 1995; 1: 774-780). Se ştie că NGF (de tip sălbatic) afectează celulele ţintă prin legarea la doi receptori separaţi, (a) receptorul tirozin kinazei A (TrkA), care promovează supravieţuirea neuronală şi (b) receptorul neurotrofinei p75, care este implicat în reglarea decesului celular (Mesentier-Louro et al., 2017, Int. J. Mol. Sci., vol. 18(98), astfel încât elementele de secvenţă polipeptidică cu NGF de tip sălbatic, în urma distrugerii nervului optic, pot avea, de asemenea, efectul de exacerbare a degenerării retiniene prin stimularea apoptozei; a se vedea Mesentier-Louro et al., 2018, Mol. Neurobiol., vol. 56, p. 1056-1069. Este, de asemenea, cunoscut faptul că reziduul R100 de NGF uman de tip sălbatic este implicat în legarea NGF la p75 şi că mutaţia acestui reziduu afectează legarea p75; a se vedea, de exemplu, WO 2008/006893 A1. Spre deosebire de NGF de tip sălbatic, hNGF, polipeptida din prezenta invenţie are o afinitate de legare mai mică pentru p75 (a se vedea, de exemplu, Malerba et al., 2015, PlosOne, 10(9): e0136425). P61SR100E NGF uman corespunde polipeptidei cu NR. DE ID. AL SECV.: 1, denumită şi CHF6467 (NR. DE ID. AL SECV. 1).

[0005] Encefalopatia hipoxic-ischemică (HIE) sau asfixia neonatală este o cauză majoră a dizabilităţilor neurologice grave şi a mortalităţii perinatale. În Europa Occidentală şi în SUA, incidenţa acesteia este estimată la 1,5-2 cazuri din 1.000 de bebeluşi născuţi vii, cu o prevalenţă mai mare la copiii născuţi prematur (Pediatr Res 2013; 74, Suppl 1, 50-72). Decesul neuronal după HIE are loc prin apoptoză sau autofagie mediată de mecanisme programate de deces celular sau, cel mai probabil, printr-un continuum de deces celular apoptoză-necroză (Ann Neurol 2011; 69: 743-758), declanşat de o cascadă de evenimente care includ eliberarea de glutamat excitotoxic, activarea receptorilor NMDA şi AMPA, supraîncărcarea intracelulară Ca2+, deteriorarea mitocondrială, stresul oxidativ, activarea caspazei şi inflamaţia (Lancet Neurol 2011; 10: 372-382).

[0006] Fără îndoială, leziunile cerebrale în urma unui episod HI constituie un proces complex şi mai multe mecanisme şi căi contribuie la vătămări atât timpurii, cât şi întârziate (Patel, S. et al. (2014). Biochem. Soc. Trans. 42, 564-568). Astfel, noi tratamente care trebuie adăugate hipotermiei terapeutice, standardul actual de îngrijire (Davidson, J.O. et al., (2015). Front. Neurol. 6.), sunt necesare urgent pentru creşterea neuroprotecţiei. În plus, există dovezi că hipotermia terapeutică este mai eficientă împotriva encefalopatiei hipoxic-ischemice moderate decât împotriva encefalopatiei hipoxic-ischemice grave (Sabir, H., et al., (2012). Stroke 43, 3364-3370). Este din ce în ce mai recunoscut faptul că unul dintre principalii factori patogeni ai leziunilor cerebrale neonatale este inflamaţia, indusă de activarea sistemului imunitar central şi periferic (Hagberg et al., (2015). Nat. Rev. Neurol. 11, 192-208). Răspunsurile imune sunt induse în câteva minute şi pot persista săptămâni şi chiar luni după apariţia episodului (Fleiss et al., 2015 Dev. Med. Child Neurol. 57, 17-28). Hipotermia, intervenţia standard de aur după o leziune hipoxic-ischemică, nu este benefică la toţi nou-născuţii trataţi (Bainbridge et al., 2012. Brain 136, 90-105). S-a demonstrat că factorul de creştere a nervilor (NGF) protejează neuronii specifici care exprimă receptorul său de semnalizare, trkA, de mai multe episoade (Holtzman et al., 1995 J. Neurosci. 15). Există unele date, în special în creierul în curs de dezvoltare, care indică faptul că NGF are acţiuni neuroprotectoare care se extind dincolo de celulele neuronale (Fodelianaki et al., 2019 Exp. Cell Res. 377). Într-adevăr, NGF este neuroprotector în modelele animale de encefalopatie hipoxic-ischemică la nou-născuţi şi s-a sugerat mult timp ca un agent promiţător pentru protejarea creierului neonatal de episoadele hipoxic-ischemice (Holtzman et al., 1996, Ann. Neurol. 39. doi:10.1002/ana.410390117).

[0007] Hipotermia terapeutică este standardul de îngrijire pentru îmbunătăţirea supravieţuirii şi reducerea sechelelor de dezvoltare neuroproductivă la nou-născuţii cu encefalopatie hipoxic-ischemică moderată până la gravă (HIE). Răcirea selectivă a capului sau răcirea întregului corp la o temperatură ţintă principală de 33,5 °C timp de aproximativ 72 de ore, începând într-o fereastră terapeutică de 6 ore după naştere, îmbunătăţeşte supravieţuirea şi rezultatul neurologic la nou-născuţii cu HIE (J Pediatr 2015; 91: S78-S83). Deşi relativ puţine studii preclinice au comparat temperaturile multiple ale tratamentului hipotermic, s-a propus recent că, deoarece răcirea sub 33,5 °C nu pare să ofere neuroprotecţie suplimentară la modelele neonatale de HIE la şobolani, răcirea relativ uşoară ar trebui luată în considerare pentru studiile clinice viitoare (Sci Rep 2016; 6: 23430). Hipotermia, deşi nu este asociată cu complicaţii majore, pare a fi benefică doar pentru un procent relativ mic de sugari cu HIE (Int J Mol. Sci 2015; 16: 22368-22401). În mod specific, tratamentul cu hipotermie terapeutică este rezervat în prezent nou-născuţilor născuţi la termen sau aproape de termen (> 1800 g) şi este de obicei limitat la centrele de referinţă cu expertiză şi echipamente specifice.

[0008] WO 2018087656 se referă la compoziţii farmaceutice care cuprind NGF sau molecule cu activitate asemănătoare NGF pentru utilizare în tratarea leziunilor cerebrale traumatice, în special leziuni cerebrale traumatice sau leziuni hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxică-ischemică prin administrare intranazală.

[0009] Hou et al. (Chinese Journal of Primary Medicine and Pharmacy 2017; 24 (3): 338-341) raportează că hipotermia capului combinată cu terapia factorului de creştere a nervilor de şoarece pentru tratarea HIE neonatal moderat până la grav are efect protector. După cum s-a menţionat mai sus, utilizarea hipotermiei în tratarea asfixiei neonatale a fost bine documentată în stadiul tehnicii (a se vedea, de exemplu, Volpe, 2001; Gunn et al., 2000). Cu toate acestea, până în prezent nu au existat informaţii sau sugestii în domeniu că hipotermia ar putea fi utilizată în combinaţie cu administrarea de NGF mutant, CHF6467. De asemenea, nu a existat nicio sugestie că o astfel de terapie combinată ar duce la o îmbunătăţire atât de surprinzătoare şi neaşteptată a efectului neuroprotector rezultat.

[0010] Prin urmare, există încă nevoie de agenţi pentru tratarea HIE. În special, agenţii capabili să sporească efectele hipotermiei pot fi un plus extrem de valoros pentru practicile clinice curente.

[0011] Rezumatul invenţiei

[0012] CHF6467 (hNGFp, NR. DE ID. AL SECV. 1) are activitate neurotrofică similară cu factorul de creştere a nervilor umani de tip sălbatic (NGF), dar activitatea sa de sensibilizare la durere este de zece ori mai mică (Cattaneo, A. şi Capsoni, S. (2019). Pharmacol. Res. 139. doi:10.1016/j.phrs.2018.10.028.).

NR. DE ID. AL SECV.: 1

[0014] Invenţia oferă o combinaţie a unei polipeptide cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 şi hipotermie pentru utilizare în tratarea şi/sau prevenirea leziunii cerebrale traumatice sau a leziunii hipoxice ischemice cerebrale la un subiect mamifer.

[0015] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este administrată la o doză de 20 μg/kg.

[0016] Într-un exemplu de realizare preferat, leziunea cerebrală traumatică este encefalopatia hipoxico-ischemică.

[0017] Într-un exemplu de realizare preferat, subiectul mamifer este un om, preferabil subiectul este un subiect neonatal sau nou-născut sau un subiect nou-născut prematur, preferabil subiectul neonatal sau nou-născut este afectat de encefalopatie hipoxic-ischemică moderată până la gravă

[0018] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este administrată intranazal sau polipeptida este administrată în mod repetat, preferabil pentru o perioadă de la 1 la 30 de zile, preferabil de la 2 la 14 zile. Sunt de asemenea avute în vedere cicluri repetate de tratament.

[0019] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este administrată în mod repetat între 1 şi 7 ori pe zi sau polipeptida este administrată pe una sau ambele nări.

[0020] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este administrată la o doză de la 0,01 la 1,00 mg pe zi, preferabil la o doză de 0,06 până la 0,12 mg/zi de polipeptidă, preferabil la o doză de 0,06 mg/zi.

[0021] Preferabil, cantitatea de 0,06 mg/zi este pentru un nou-născut sau nou-născut cu o greutate corporală de aproximativ 3 kg.

[0022] Dozele preferate, în special pentru subiectul cu greutate corporală mai mare, sunt de la 3 la 333 μg/kg.

[0023] Dozele preferate sunt de la aproximativ 20 μg/kg la aproximativ 40 μg/kg, preferabil 20 μg/kg.

[0024] Într-un exemplu de realizare preferat, atunci când polipeptida este administrată în mod repetat, fiecare doză este de la 0,01 la 1,00 mg pe zi, preferabil fiecare doză este de la 0,06 la 0,12 mg/zi de polipeptidă, preferabil fiecare doză este de 0,06 mg/zi.

[0025] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este administrată în aproximativ de la 1 oră la 24 de ore după leziunea cerebrală.

[0026] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este cuprinsă într-o compoziţie car cuprinde o soluţie tampon de acetat şi/sau metionină.

[0027] Într-un exemplu de realizare preferat, polipeptida este administrată simultan cu hipotermia şi/sau nu mai mult de 24 de ore după hipotermie.

[0028] Într-un exemplu de realizare preferat, hipotermia trebuie iniţiată în decurs de la 1 oră la 10 ore după episodul hipoxic-ischemic (HI), preferabil hipotermia trebuie iniţiată în decurs de la 2 ore la 8 ore după episodul hipoxic-ischemic (HI), preferabil hipotermia trebuie iniţiată în decurs de la 4 ore la 6 ore după episodul hipoxic-ischemic (HI).

[0029] Într-un exemplu de realizare preferat, hipotermia trebuie menţinută pentru o perioadă de la aproximativ 1 la aproximativ 72 de ore după episodul hipoxic-ischemic (HI), preferabil de cel puţin aproximativ 4 ore, mai preferabil de cel puţin aproximativ 6 ore, mai preferabil de cel puţin aproximativ 12 ore după episodul hipoxic-ischemic (HI).

[0030] Preferabil, hipotermia este menţinută pentru o perioadă de cel puţin aproximativ 4 ore, mai preferabil cel puţin aproximativ 6 ore sau 12 ore, după naştere.

[0031] Într-un exemplu de realizare preferat, temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 36 °C, preferabil de la aproximativ 32 °C la aproximativ 35 °C.

[0032] O altă formă de realizare a invenţiei se referă la tratarea asfixiei neonatale la un mamifer care are nevoie de aceasta prin

(a)

administrarea unei cantităţi eficiente din punct de vedere terapeutic de CHF6467 mamei mamiferului înainte şi/sau în timpul travaliului; şi

(b)

supunerea mamiferului la hipotermie după naştere.

[0034] Hipotermia poate fi produsă pasiv, permiţând temperaturii să se deplaseze în jos şi să nu susţină în mod intenţionat temperatura corpului. Fiind poikilotermici, nou-născuţii preiau rapid temperatura din jur. În mod alternativ, pacientul poate deveni hipotermic în mod activ prin reducerea intenţionată a temperaturii ambientale.

[0035] O altă formă de realizare a invenţiei se referă la tratarea asfixiei neonatale la un mamifer care are nevoie de aceasta prin:

(a)

administrarea unei cantităţi eficiente din punct de vedere terapeutic de CHF6467 la mamifer; şi

(b)

supunerea mamiferului la hipotermie sau condiţii hipotermice.

[0037] Într-un exemplu de realizare preferat, mamiferul este un subiect nou-născut în primele patru săptămâni după naştere. Mai preferabil, mamiferul este în primele două săptămâni, şi mai preferabil, în prima săptămână după naştere.

[0038] Preferabil, mamiferul este un om.

[0039] Exemplele de realizare preferate pentru a doua formă de realizare a invenţiei sunt aceleaşi cu cele descrise mai sus cu privire la prima formă de realizare.

[0040] O altă formă de realizare a invenţiei se referă la tratarea asfixiei neonatale la un mamifer care are nevoie de aceasta prin administrarea unei cantităţi eficiente din punct de vedere terapeutic de xenonto la mamifer în combinaţie cu hipotermie.

[0041] O altă formă de realizare a invenţiei se referă la utilizarea CHF6467 în prepararea unui medicament pentru tratamentul asfixiei neonatale, în care tratamentul menţionat mai sus cuprinde administrarea de CHF6467 la un subiect în mod simultan, secvenţial sau separat, în combinaţie cu hipotermia.

[0042] O altă formă de realizare a invenţiei se referă la utilizarea CHF6467, în combinaţie cu hipotermia, pentru tratarea asfixiei neonatale.

[0043] Într-un exemplu de realizare preferat în combinaţie pentru utilizare în tratarea şi/sau prevenirea leziunii cerebrale traumatice sau a leziunii hipoxice ischemice cerebrale la un subiect mamifer, polipeptida este administrată la o doză de la 0,06 la 0,12 mg/zi, iar temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 35 °C.

[0044] Într-un exemplu de realizare preferat în combinaţie pentru utilizare în tratarea şi/sau prevenirea leziunii cerebrale traumatice sau a leziunii hipoxice ischemice cerebrale la un subiect mamifer, polipeptida este administrată la o doză de la aproximativ 20 μg/kg la 40 μg/kg, iar temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 35 °C.

[0045] Următoarele figuri şi exemple nelimitative ilustrează invenţia fără a limita domeniul de aplicare al acesteia.

[0046] Descrierea detaliată a ilustraţiilor

[0047] Figura 1. Efectele CHF6467 asupra transmiterii liniei de bază la sinapsele hipocampului CA1. Figura 2. CHF6467 a inversat depresia indusă de OGD (cadru preventiv). Datele cumulate normalizate arată efectele OGD asupra potenţialelor postsinaptice excitatorii de câmp (fEPSP) şi efectele protectoare ale CHF6467 perfuzate la diferite concentraţii (0,03 şi 0,1 μg/ml) în timpul OGD.

[0048] Figura 3. Depresia EPSC indusă de OGD este restabilită prin perfuzie CHF6467 (cadru terapeutic). Panoul A arată evoluţia în timp a datelor EPSC normalizate numai după OGD (cercuri închise) şi după OGD + CHF6467 (cercuri deschise). Histograma arată media datelor EPSC normalizate în ultimele 10 minute de la înregistrare după OGD şi OGD + CHF6467. Panoul B arată că CHF6467 nu induce nicio modificare a transmisiei iniţiale în absenţa OGD.

[0049] Figura 4. Efectul sinergic al CHF6467 cu hipotermie împotriva OGD. Datele cumulate normalizate care arată efectul sinergic al hipotermiei şi CHF6467 perfuzat după o perioadă de 15 minute de OGD.

[0050] Figura 5. Diagrama protocolului experimental al modelului de şobolan de encefalopatie hipoxic-ischemică neonatală. TTC = clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu

[0051] Figura 6. Efectele CHF6467 intranazale (20 şi 40 μg/kg) în mod individual şi în combinaţie cu hipotermia asupra volumului infarctului cerebral transformat în jurnal la şobolanii tineri la 72 de ore după episodul hipoxic-ischemic la vârsta de 10 zile. Numărul de animale este indicat deasupra fiecărei coloane.

[0052] Figura 7. Nivelurile de mRNA hipocampal ale unui grup de citokine şi chemokine de şobolan în encefalopatia hipoxic-ischemică (HIE) operată placebo, tratată cu vehicul, HIE tratată cu CHF6467, 20 ug/kg (HIE+CHF 20 ug/ml), HIE tratată cu hipotermie (HIE+IPO), HIE tratată cu CHF6467 şi hipotermie (HIE+IPO+CHF). Diagrame de dispersie cu medii ± medie standard de eroare (SEM). ** p <0,01 şi * p<0,05 în comparaţie cu HIE.

[0053] Figura 8. Nivelurile mRNA corticale ale unui grup de citokine şi chemokine de şobolan în encefalopatia hipoxic-ischemică (HIE) operată placebo, HIE tratată cu CHF6467, 20 ug/kg (HIE+CHF 20 ug/ml), HIE tratată cu hipotermie (HIE+IPO), HIE tratată cu CHF6467 şi hipotermie (HIE+IPO+CHF). Diagrame de dispersie cu medii ± medie standard de eroare (SEM). ** p<0,01 şi * p<0,05 în comparaţie cu HIE.

[0054] Figura 9. Analiza statistică a volumului mediu de infarct cerebral transformat după log10 pe grup de tratament.

[0055] Figura 10. CHF6467 penetrarea creierului după administrarea intranazală la şobolani tineri martor, determinată prin cuantificarea peptidei SSSHPIFHR (NR. DE ID. AL SECV. 2).

[0056] Figura 11. CHF6467 penetrarea creierului după administrarea intranazală la şobolanii tineri supuşi insultei hipoxic-ischemice. Rapoarte uşoare spre grele de peptide specifice CHF6467 SSSHPIFHR (NR. DE ID. AL SECV. 2) (A) şi QAAWEFIR (NR. DE ID. AL SECV. 3) (B) şi peptida nespecifică QYFFETK (NR. DE ID. AL SECV. 4) (C) în diferite zone ale creierului de şobolan.

[0057] Descrierea detaliată a invenţiei

[0058] Efectele neuroprotectoare ale CH6467 sau ale polipeptidei cu NR. DE ID. AL SECV. 1 au fost studiate utilizând modele experimentale de encefalopatie hipoxic-ischemică (HIE). În secţiunile acute de hipocamp supuse privării de oxigen-glucoză (OGD), un model in vitro stabilit de leziuni cerebrale hipoxic-ischemice, CHF6467 curenţi post-sinaptici excitatori anormali atenuaţi semnificativ (EPSC). În mod neaşteptat, combinaţia de CHF6467 şi hipotermie a inversat complet EPSC anormal (Fig. 4). La şobolanii neonatali supuşi unei ocluzii permanente a arterei carotide comune stângi urmată de hipoxie, un model stabilit de encefalopatie hipoxic-ischemică neonatală, administrarea intranazală de CHF6467 (20 şi 40 μg/kg) a scăzut semnificativ volumul creierului cu infarct comparativ cu animalele tratate cu vehicul. În mod surprinzător, combinaţia de CHF6467 şi hipotermie a redus dramatic volumul creierului cu infarct cu 86 % în comparaţie cu animalele tratate cu vehicule în normotermie. În mod neaşteptat, efectele neuroprotectoare ale combinaţiei de CHF6467 şi hipotermie au fost mult mai mari decât cele ale agenţilor unici (CHF6467 sau hipotermie) singuri, indicând un efect sinergic (Fig. 6). În special, efectele unei doze preferate (20 μg/kg) de CHF6467 in vivo au funcţionat în sinergie cu hipotermia în obţinerea neuroprotecţiei. Nu s-au observat mortalitate, semne clinice sau scădere în greutate la tratamentele CHF6467, ceea ce sugerează că CHF6467 pare bine tolerată.

[0059] Prezenta invenţie prevede utilizarea combinată a CHF6467 şi hipotermiei în tratarea leziunilor cerebrale, leziunilor cerebrale traumatice sau leziunilor hipoxice ischemice cerebrale, preferabil encefalopatie hipoxic-ischemică. În special, combinaţia dintre CHF6467 şi hipotermie poate scădea semnificativ mortalitatea şi dizabilităţile severe de neurodezvoltare, comparativ cu hipotermia în monoterapie la sugari şi nou-născuţi cu encefalopatie hipoxic-ischemică moderată până la gravă, în special atunci când se iau în considerare dozele adecvate, aşa cum este raportat în partea experimentală de mai jos.

[0060] În plus, au fost investigate şi efectele modulatorii ale CHF6467, singure sau în combinaţie cu hipotermia, împotriva unui grup de markeri neuroinflamatori din cortex şi hipocamp ai puilor de şobolan supuşi leziunilor cerebrale hipoxic-ischemice.

[0061] O creştere semnificativă a nivelurilor de mRNA ale mai multor citokine şi chemokine din hipocamp şi cortexul frontoparietal a fost măsurată la şobolanii care au suferit leziuni hipoxic-ischemice în comparaţie cu şobolanii operaţi placebo. CHF6467 (20 ug/kg, intranazal) a contracarat semnificativ reglarea pozitivă a mai multor markeri neuroinflamatori în regiunea hipocampală a şobolanilor care au suferit episodul hipoxic-ischemic, în timp ce hipotermia în sine nu a fost la fel de eficientă ca CHF6467. În cortex, CHF6467 (20 ug/kg) per se a fost eficient în contracararea reglării ascendente a unor markeri neuroinflamatori induşi de insulta hipoxic-ischemică şi un astfel de efect a fost în unele cazuri sporit de combinaţia cu hipotermie.

[0062] Expresia „şi/sau», de exemplu, „X şi/sau Y» va fi înţeleasă ca însemnând fie „X şi Y», fie „X sau Y» şi va fi înţeleasă ca oferind o dezvăluire explicită a termenilor „şi», a lui „sau» şi a ambelor sensuri („şi» sau „sau»).

[0063] Aşa cum sunt utilizaţi în prezentul document, cu excepţia cazului în care se specifică altfel, termenii „aproximativ», „circa» şi „în mare parte» înseamnă toţi aproximativ sau aproape şi, în contextul unei valori numerice sau al unui interval stabilit aici, desemnează preferabil +/- 10%, mai preferabil +/- 5%, în jurul valorii numerice sau intervalului menţionat sau revendicat.

[0064] Cu excepţia cazului în care se specifică altfel în mod expres, cuvântul „cuprinde» sau variaţii precum „care cuprinde» sau „cuprinzând» sunt utilizate în contextul prezentului document pentru a indica faptul că pot fi prezenţi opţional şi alţi membri în plus faţă de membrii listei introduse prin „care cuprinde». Cu toate acestea, ca un exemplu de realizare specific al prezentei invenţii, se are în vedere faptul că termenul „cuprinzând» cuprinde posibilitatea de a nu mai fi prezente alte elemente, adică, în scopul acestui exemplu de realizare, „cuprinzând» trebuie înţeles ca având semnificaţia de „constând din».

[0065] Cu excepţia cazului în care se specifică altfel în mod expres, toate indicaţiile privind cantităţile relative referitoare la prezenta invenţie se fac pe bază de greutate/greutate. Indicaţiile privind cantităţile relative ale unei componente caracterizate printr-un termen generic se referă la cantitatea totală a tuturor variantelor sau membrilor specifici acoperiţi de termenul generic menţionat. În cazul în care se specifică faptul că o anumită componentă definită printr-un termen generic este prezentă într-o anumită cantitate relativă şi dacă această componentă este caracterizată în continuare ca fiind o variantă sau un membru specific acoperit de termenul generic, se înţelege că nicio altă variantă sau membru acoperit de termenul generic nu este prezent suplimentar astfel încât cantitatea relativă totală de componente acoperite de termenul generic să depăşească cantitatea relativă specificată; preferabil, nicio altă variantă sau membru acoperit de termenul generic nu este prezent deloc.

[0066] Cu excepţia cazului în care contextul dictează altfel, termenul de factor de creştere a nervilor se referă numai la NGF de tip sălbatic şi nu include polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1.

[0067] Termenii „muteină NGF» şi „muteină a NGF» sau, cu referire la NGF „muteină a acesteia», sunt utilizaţi aici în mod interschimbabil pentru a se referi la o polipeptidă care este caracterizată prin cel puţin o mutaţie, în comparaţie cu NGF de tip sălbatic, aşa cum este descris în detaliu aici. Polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 este o muteină a NGF. Se referă la orice specie, preferabil specii de mamifere; cu toate acestea, muteina NGF umană este întotdeauna preferată. Preferabil, o muteină de NGF are o identitate de secvenţă de la 80 la 99,5 % cu NGF, în special cu NGF uman, mai preferabil o muteină are o identitate de secvenţă de la 90 la 99 % cu NGF, în special cu NGF uman.

[0068] Aşa cum este utilizat aici, termenul „hipotermie» se referă la supunerea unui anumit subiect (de exemplu un subiect neonatal) la condiţii hipotermice, de exemplu, prin scăderea temperaturii corpului, preferabil cu 3-5 °C, prin tehnici pasive sau active. Temperatura preferată a hipotermiei este între 32 °C şi 36 °C, preferabil de la 32 °C la 35 °C, preferabil 32 °C sau 33 °C.

[0069] Aşa cum este utilizat aici, „simultan» este folosit pentru a însemna că CHF6467 este administrat concomitent cu hipotermie, în timp ce termenul „în combinaţie» este folosit pentru a însemna că CHF6467 este administrat, dacă nu simultan, atunci „secvenţial» într-un interval de timp în care CHF6467 şi hipotermia prezintă ambele un efect terapeutic, adică ambele sunt disponibile pentru a acţiona terapeutic în acelaşi interval de timp. Astfel, administrarea „secvenţială» poate permite administrarea CHF6467 în decurs de 5 minute, 10 minute sau câteva ore înainte sau după hipotermie, cu condiţia ca timpul de înjumătăţire circulatorie sau timpul de rezidenţă a ţesutului ţintă al CHF6467 să fie astfel încât să fie prezent într-o cantitate eficientă terapeutic atunci când subiectul neonatal este expus la condiţii hipotermice.

[0070] Termenii „pacient» şi „subiect» sunt utilizaţi interschimbabil în prezentul document, în special cu referire la un pacient/subiect caracterizat de o tulburare oftalmică, aşa cum este descris aici.

[0071] În contextul prezentei invenţii, termenul „prevenire» trebuie înţeles în sens larg şi include nu numai prevenirea apariţiei leziunii cerebrale, ci şi prevenirea progresiei leziunii cerebrale. În special, în contextul unei tulburări care implică o leziune şi/sau o tulburare a creierului, termenul „prevenire» include, de asemenea, prevenirea progresiei ulterioare a leziunilor creierului.

[0072] În contextul prezentei invenţii, termenul „tratare» trebuie înţeles în sens larg şi include, fără limitare, ameliorarea simptomelor tulburării.

[0073] Conform prezentei invenţii, o „cantitate eficientă» este cantitatea sau doza care realizează o reacţie dorită sau un efect dorit, fie singură, fie împreună cu doze suplimentare.

[0074] Termenul „acceptabil din punct de vedere farmaceutic» descrie în general că o anumită substanţă poate fi administrată unui subiect, opţional şi preferabil în combinaţie cu un agent, fără ca agentul să provoace efecte adverse intolerabile, la doza utilizată. Termenii „purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic» şi „excipient acceptabil din punct de vedere farmaceutic» sunt utilizaţi pentru a se referi la unul sau mai mulţi dintre solvenţi, medii de dispersie, acoperiri, agenţi antibacterieni şi antifungici, agenţi izotonici şi de întârziere a absorbţiei şi alţii asemenea, care sunt compatibili din punct de vedere fiziologic şi sunt adecvaţi pentru administrare la un subiect aşa cum este descris în prezentul document sau nu interferează în alt mod cu o astfel de administrare. Exemple de astfel de purtători acceptabili din punct de vedere farmaceutic cuprind, fără limitare, unul sau mai multe dintre apă, soluţie salină, soluţie salină tamponată cu fosfat, dextroză, glicerol, etanol, poliorbat 80 şi altele asemenea, precum şi combinaţii ale acestora. În special în cazul compoziţiilor farmaceutice lichide, poate fi preferabil să se includă în compoziţie agenţi izotonici, de exemplu, zaharuri, polialcooli precum manitol, sorbitol sau clorură de sodiu.

[0075] Purtătorii acceptabili din punct de vedere farmaceutic pot cuprinde în plus substanţe auxiliare, cum ar fi agenţi de umectare sau de emulsionare, conservanţi sau soluţii tampon, care sporesc durata de valabilitate sau eficacitatea agentului. Un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic este de obicei cuprins într-o compoziţie conform prezentei invenţii.

[0076] Termenul „agent activ din punct de vedere farmaceutic» se referă la un agent care poate fi utilizat în administrarea la un subiect în care agentul ar fi benefic, de exemplu, în ameliorarea simptomelor unei boli sau tulburări. În plus, un „agent activ din punct de vedere farmaceutic» poate avea un efect pozitiv sau avantajos asupra stării sau stării de boală a unui subiect atunci când este administrat subiectului într-o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic. Preferabil, un agent activ din punct de vedere farmaceutic are proprietăţi curative şi poate fi administrat pentru a ameliora, îmbunătăţi, atenua, inversa, întârzia începutul sau pentru a diminua gravitatea unuia sau mai multor simptome ale unei boli sau tulburări. Un agent activ din punct de vedere farmaceutic poate avea proprietăţi profilactice şi poate fi utilizat pentru a întârzia începutul unei boli sau pentru a diminua gravitatea unei astfel de boli sau stări patologice. De exemplu, un agent al invenţiei este considerat aici ca un ingredient activ din punct de vedere farmaceutic pentru tratarea fibrozei chistice, aşa cum este revendicat. Într-un alt exemplu, o proteină activă din punct de vedere farmaceutic poate fi utilizată pentru a trata o celulă sau o persoană care nu exprimă în mod normal o proteină, sau nu este la nivelurile dorite, sau care exprimă greşit o proteină, de exemplu, o proteină activă farmaceutic poate compensa o mutaţie, sau lipsa unei expresii suficient de mari, prin furnizarea unei proteine dorite. Termenul „peptidă sau proteină activă din punct de vedere farmaceutic» include proteine sau polipeptide întregi şi se poate referi, de asemenea, la fragmente active din punct de vedere farmaceutic ale acestora. De asemenea, poate include analogi activi farmaceutic ai unei peptide sau proteine.

[0077] Termenii „subiect» şi „pacient», aşa cum sunt utilizaţi în prezenta, se referă la un mamifer. De exemplu, mamiferele în contextul prezentei invenţii sunt oamenii, primatele neumane, animalele domestice incluzând, dar fără a se limita la, câini, pisici, oi, bovine, capre, porci, cai etc., animale de laborator incluzând, dar fără a se limita la, şoareci, şobolani, iepuri etc., precum şi animale în captivitate, cum ar fi animalele din grădinile zoologice. Termenii „subiect» şi „pacient», aşa cum sunt utilizaţi aici, includ în special oamenii. Subiectul (uman sau animal) are două seturi de cromozomi; adică subiectul este diploid. Termenul „pacient» se referă la un subiect care suferă de o afecţiune, riscă să sufere de o afecţiune, a suferit de o afecţiune sau se preconizează că va suferi de o afecţiune şi care poate fi supus terapiei, de exemplu, prin administrarea unui agent. Starea pacientului poate fi cronică şi/sau acută. Astfel, un „pacient» poate fi, de asemenea, descris ca un subiect supus unei terapii şi/sau care are nevoie de o terapie.

[0078] Termenul „terapie» trebuie înţeles în sens larg şi se referă la tratarea unui subiect cu scopul de a preveni sau trata o afecţiune la subiect. În exemplele de realizare preferate, terapia include în mod specific administrarea unui agent la subiect.

[0079] Agentul conform prezentei invenţii, denumit aici şi „polipeptidă cu NR. DE ID. AL SECV.: 1» va fi acum descris mai detaliat. Termenul „polipeptidă cu NR. DE ID. AL SECV.: 1» şi termeni similari denotă aici o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi definită de NR. DE ID. AL SECV.: 1 şi/sau un agent cu activitate biologică echivalentă. Astfel, în aceşti termeni sunt incluse, de asemenea, părţi echivalente funcţional sau analogi ai unor astfel de polipeptide. Un exemplu de parte echivalentă biologic a polipeptidei ar putea fi un domeniu sau o subsecvenţă a polipeptidei cu NR. DE ID. AL SECV.: 1, care include locul de legare pentru a permite domeniului sau subsecvenţei să exercite în mare parte aceeaşi activitate biologică ca polipeptida de lungime completă cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 sau, în mod alternativ, o genă care codifică o astfel de polipeptidă. Termenul „în mare parte aceeaşi activitate biologică» se referă la o parte echivalentă sau la o polipeptidă analogică având cel puţin 50 %, preferabil cel puţin 60 %, mai preferabil cel puţin 70 %, mai preferabil cel puţin 75 %, mai preferabil cel puţin 80 %, mai preferabil cel puţin 85 %, mai preferabil cel puţin 90 %, mai preferabil cel puţin 95 % şi cel mai preferabil cel puţin 97 %, cel puţin 98 % sau cel puţin 99 % din activitatea polipeptidei cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 în testele descrise în Exemplele 1-3. Un exemplu de analog biologic echivalent al polipeptidei ar putea fi o proteină de fuziune care include cel puţin o parte din secvenţa de aminoacizi a polipeptidei cu NR. DE ID. AL SECV.: 1, dar poate fi şi un analog omolog al polipeptidei. De asemenea, moleculele complet sintetice care imită activitatea biologică specifică a polipeptidei cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 ar constitui „analogi echivalenţi din punct de vedere biologic».

[0080] Mai preferabil, termenul „polipeptidă cu NR. DE ID. AL SECV.: 1» şi termeni similari denotă aici o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi definită de NR. DE ID. AL SECV.: 1; astfel de agenţi sunt opţional proteine de fuziune care cuprind, printre altele, secvenţa de aminoacizi definită de NR. DE ID. AL SECV.: 1. Cel mai preferabil, termenul „polipeptidă cu NR. DE ID. AL SECV.: 1» şi termeni similari desemnează aici o polipeptidă care constă din secvenţa de aminoacizi definită de NR. DE ID. AL SECV.: 1; în acest exemplu de realizare, agentul constă dintr-o polipeptidă constând din cele 118 reziduuri de aminoacizi în ordine secvenţială, aşa cum sunt definite prin NR. DE ID. AL SECV.: 1. În acesta şi în alte exemple de realizare, polipeptida poartă opţional una sau două sau trei legături interne de cisteină, astfel încât reziduurile de cisteină (Cys, C) sunt legate covalent între ele pentru a forma punţi de disulfură intramoleculare. Legăturile cisteină sunt preferabil echivalente cu cele din NGF uman de tip sălbatic.

[0081] Polipeptida din prezenta invenţie poate fi, opţional, caracterizată prin modificări ulterioare post-translaţionale. Astfel de modificări post-translaţionale includ opţional glicozilarea şi/sau fosforilarea. Cu toate acestea, preferabil, polipeptida conform prezentei invenţii este lipsită de glicozilare şi/sau fosforilare. Într-adevăr, având în vedere că exemplele experimentale de aici demonstrează un efect benefic asupra vindecării leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale traumatice sau a leziunilor hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatiile hipoxic-ischemice, şi un raport beneficiu-efect advers, prin care polipeptida utilizată a fost obţinută prin expresie citosolică recombinantă în bacterii, care de obicei nu duce la glicozilare şi/sau fosforilare, este plauzibil ca efectul benefic al prezentei invenţii să nu depindă de un astfel de tip de modificare post-translaţională.

[0082] De regulă, polipeptida conform prezentei invenţii este o polipeptidă nenaturală care nu este produsă în mod natural de subiectul căruia i se administrează polipeptida.

[0083] Preferabil, polipeptida conform prezentei invenţii este o polipeptidă izolată. Mai preferabil, polipeptida conform prezentei invenţii este în mare parte lipsită de proteine de celule gazdă, produse de degradare (cum ar fi varianta des-nona, de exemplu) şi protează (cum ar fi tripsina, de exemplu). Atunci când polipeptida conform prezentei invenţii este în esenţă lipsită de proteine ale celulelor gazdă, produsele de degradare (cum ar fi varianta des-nona, de exemplu) şi proteaza (cum ar fi tripsina, de exemplu) pot fi, de asemenea, denumite „polipeptidă pură». Preferabil, polipeptida conform prezentei invenţii este administrată ca polipeptidă pură. Mai preferabil, polipeptida pură constând din NR. DE ID. AL SECV.: 1 1 are un procent în greutate de 90 % sau mai mult, preferabil 92 % sau mai mult, mai ales de 93 % sau mai mult, mai ales de 94 % sau mai mult, mai ales de 96 % sau mai mult, mai ales 97 % sau mai mult, mai ales 98 % sau mai mult, mai ales 99 % sau mai mult, mai ales 99,2 % sau mai mult, mai preferabil 99,4 % sau mai mult, mai preferabil 99,6 % sau mai mult, mai preferabil 99,8 % sau mai mult, mai preferabil 99,9 % sau mai mult, în raport cu proteina totală din compoziţie. Cel mai preferabil, polipeptida pură conform prezentei invenţii are un grad de puritate compatibil cu bunele practici de fabricaţie (GMP).

[0084] Polipeptidele care constau din NR. DE ID. AL SECV.: 1 diferă în două poziţii de secvenţa de aminoacizi a factorului de creştere a nervilor umani (NGF, denumit şi NGF uman de tip sălbatic sau NGF de tip sălbatic). Diferenţa dintre polipeptida conform prezentei invenţii şi polipeptida de tip sălbatic are un efect remarcabil asupra tratării sau prevenirii leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale traumatice sau a leziunilor hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxică-ischemică, şi absenţa efectelor secundare, aşa cum este prezentat în detaliu în prezentul document şi susţinut de exemplele experimentale din prezentul document.

[0085] Printre mai mulţi mutanţi ai NGF uman (mutanţi hNGF), P61SR100E NGF uman mutant este considerat cel mai promiţător pentru tratarea leziunilor cerebrale. Cu toate acestea, utilizările specifice ale tratamentului şi/sau prevenirii conform prezentei invenţii nu sunt instruite de aceste referinţe şi, de asemenea, aceste referinţe nu reuşesc să facă polipeptidele respective disponibile la o puritate suficient de mare pentru a permite utilizarea sa medicală la om. Astfel, polipeptida pentru utilizare conform prezentei invenţii, aşa cum este descrisă şi prezentată în prezentul document, oferă mai multe avantaje neaşteptate faţă de NGF uman de tip sălbatic. Administrarea agentului conform prezentei invenţii cauzează reducerea volumului infarctului cerebral (a se vedea, de exemplu, exemplul 2), iar administrarea nu este asociată cu durere.

[0086] Polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 nu se găseşte în natură şi poate fi, de asemenea, menţionată ca o polipeptidă nenaturală. Astfel, agentul conform prezentei invenţii nu este NGF de tip sălbatic şi, în special, nu este NGF uman de tip sălbatic.

[0087] Preferabil, polipeptida nenaturală conform prezentei invenţii este administrată la o puritate ridicată. Opţional, polipeptida este solubilă într-un mediu apos.

[0088] Preferabil, tratarea şi/sau prevenirea nu provoacă efecte secundare sau efecte adverse la subiectul căruia i se administrează sau i s-a administrat polipeptida. Astfel, preferabil, administrarea polipeptidei conform invenţiei nu cauzează niciun efect nedorit la subiectul mamifer.

[0089] Un efect secundar sau efect advers care este preferabil absent în acest context este hiperalgezia sau durerea. Este de preferat în mod special ca tratamentul şi/sau prevenirea conform prezentei invenţii să nu provoace hiperalgezie la subiectul mamifer. Astfel, preferabil, administrarea agentului conform prezentei invenţii nu induce nici un sindrom hiperalgezic (durere).

[0090] Este important să se sublinieze că absenţa durerii nu provoacă doar un tratament mai plăcut (sau mai puţin neplăcut) decât administrarea unui compus de referinţă asociat cu durerea (cum ar fi NGF de tip sălbatic), ci este cel puţin parţial cauzală pentru succesul tratării sau prevenirii leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale traumatice sau a leziunilor hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxică-ischemică ca atare: având în vedere că polipeptida conform prezentei invenţii este preferabil administrată nazal, absenţa durerii va permite subiectului tratat să accepte administrarea polipeptidei fără reacţii adverse, cum ar fi răzuirea sau spălarea sau îndepărtarea acesteia în alt mod pentru a evita durerea şi, ca urmare, polipeptida va exercita un efect benefic terapeutic, cum ar fi tratarea sau prevenirea leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale ischemice, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxic-ischemică. Astfel, absenţa durerii asociate cu polipeptida din prezenta invenţie va fi adecvată pentru a depăşi reticenţa îngrijitorului consumatorului şi preocupările autorităţilor de reglementare. Cu alte cuvinte, absenţa durerii este asociată cu o creştere semnificativă a raportului beneficiu-risc în comparaţie cu agenţii care sunt asociaţi cu durerea.

[0091] În special, preferabil, tratarea şi/sau prevenirea nu provoacă hiperalgezie la subiectul mamifer. Într-un exemplu de realizare, subiectul căruia i se administrează polipeptida conform invenţiei nu suferă de alodinie mecanică. Mai precis, alodinia mecanică nu este indusă la subiectul căruia i se administrează polipeptida conform invenţiei, astfel încât subiectul căruia i se administrează polipeptida să nu sufere de alodinie mecanică.

[0092] De regulă, administrarea agentului conform prezentei invenţii este bine tolerată de subiect. În special, preferabil, administrarea polipeptidei conform prezentei invenţii nu este asociată cu formarea de anticorpi antimedicament neutralizanţi la subiect. Într-adevăr, deoarece secvenţa de aminoacizi a polipeptidei conform prezentei invenţii diferă în doar două poziţii de aminoacizi de NGF umană de tip sălbatic, este plauzibil ca tolerabilitatea imunologică la om să fie deosebit de avantajoasă şi este plauzibil ca administrarea polipeptidei conform prezentei invenţii să nu fie asociată cu formarea de anticorpi antimedicament la om.

[0093] Preferabil, administrarea conform prezentei invenţii influenţează pozitiv una sau mai multe dintre următoarele: inflamaţie, inervaţie şi angiogeneză.

[0094] Patologiile conform prezentei invenţii sunt, în general, patologii caracterizate prin distrugerea mecanică şi/sau patologică (de exemplu, degenerativă) a conexiunilor interneuronale şi moartea neuronilor, a celulelor gliale şi, opţional, şi a ţesuturilor vasculare la locul afectat de o astfel de distrugere. Un exemplu nelimitativ de patologii sau afecţiuni conform prezentei descrieri este reprezentat de patologii/afecţiuni care derivă dintr-un eveniment traumatic care implică sistemul nervos central, cum ar fi leziuni cerebrale sau leziuni cerebrale traumatice (TBI) sau patologii/afecţiuni asociate acestora sau derivate direct din acestea, cum ar fi leziunile cerebrale hipoxice/ischemice (HIBI) sau, preferabil, encefalopatia hipoxică-ischemică (HIE), în special la pacienţii neonatali, paralizie cerebrală infantilă sau alte patologii/afecţiuni cauzate de traume mecanice sau de hipoxie/ischemie cerebrală.

[0095] Sunt incluse, de asemenea, leziuni precum encefalopatia hipoxică/ischemică (leziuni primare sau secundare), leziuni perinatale, paralizie cerebrală infantilă, leziuni cerebrale cauzate de ischemie cerebrală de diferite tipuri, inclusiv rupturi de anevrism cerebral, malformaţii arterio-venoase cerebrale şi tromboză sinusală cerebrală.

[0096] Conform prezentei invenţii, patologiile cauzate de modificările sistemului vascular/circulator includ, de exemplu, sindroamele hipoxic-ischemice, care includ leziuni traumatice; leziuni hemoragice; leziuni aterosclerotice; leziuni cardiogene; leziuni hipertensive.

[0097] Conform prezentei invenţii, patologiile cauzate de leziuni inflamatorii datorate unor cauze infecţioase, cum ar fi meningita/encefalita etc., de etiologie fungică, bacteriană, virală, prionică sau de altă natură.

[0098] La nivel pediatric, astfel de patologii includ, de exemplu, hipoxialasfixierea fetală şi/sau neonatală; traumatisme craniene majore; hemoragie cerebrală acută, otrăvire (monoxid de carbon, cianură); tromboza sinusurilor cerebrale; deficit de factor de coagulare; sau, de asemenea, boli genetice.

[0099] Conform prezentei invenţii, polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 poate fi administrată unui subiect care are nevoie de o astfel de administrare. Un subiect care are nevoie de o astfel de administrare poate fi un subiect care suferă de o tulburare descrisă în prezentul document, un subiect cu riscul de a suferi de o astfel de tulburare sau care este altfel afectat de o astfel de tulburare. Agentul este administrat subiectului într-o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic. Cantitatea eficientă din punct de vedere terapeutic poate fi determinată de către medic, având în vedere dezvăluirea din prezentul document.

[0100] În special, polipeptida conform invenţiei este administrată unui subiect mamifer. Subiectul poate fi denumit şi „pacient». Cel mai preferabil, subiectul mamifer este un om.

[0101] Subiectul poate fi un nou-născut, definit ca un copil din momentul naşterii până la vârsta de 12 săptămâni, în timp ce un nou-născut este definit ca un copil din momentul naşterii până la vârsta de 4 săptămâni. Tratamentul aplicat nou-născutului şi sugarului este similar în prezenta invenţie. Un copil născut prematur este unul născut înainte de sfârşitul termenului complet de gestaţie, în timp ce un copil născut îninte de termen este născut cu trei săptămâni mai mult înainte de termen.

[0102] În contextul prezentei invenţii, este de preferat şi, de asemenea, demonstrat prin exemplele experimentale din prezentul document că prevenirea leziunilor cerebrale, cum ar fi, de exemplu, reducerea (parţială) a infarctului cerebral sau altă îmbunătăţire sau ameliorare a afecţiunii sau tulburării, este o parte integrantă preferată a invenţiei, aşa cum se revendică în prezentul document. Într-adevăr, atingerea efectului terapeutic revendicat este o caracteristică tehnică funcţională a prezentei invenţii. Exemplele din prezentul document fac plauzibil ca respectiva caracteristică tehnică funcţională să fie realizabilă ca rezultat direct al administrării polipeptidei conform prezentei invenţii. Cu alte cuvinte, inventatorii prezentei invenţii au identificat că polipeptida din prezenta invenţie este cauzală pentru obţinerea ameliorării la un subiect care suferă de o leziune cerebrală, în special în combinaţie cu hipotermie. Leziunea cerebrală este, preferabil, caracterizată printr-o leziune şi/sau tulburare sau disfuncţie a creierului.

[0103] În special, administrarea la creier poate fi efectuată profitând de relaţiile şi funcţiile anatomice unice ale cavităţii nazale. Este recunoscut de mult timp că materialele terapeutice (inclusiv biologice) aplicate pe zona plăcii cribriforme din cavitatea nazală anterioară superioară pot avea acces la sistemul nervos central prin perforaţiile care admit nervii olfactivi în cavitatea nazală din craniu. În plus, pentru orice medicament care poate fi preluat de ţesuturile neuronale şi transportat de-a lungul proiecţiilor axonale, există o cale suplimentară prin intermediul nervilor olfactivi înşişi şi al ramurilor nazale relevante ale nervului trigeminal, prin care concentraţiile relevante terapeutic de medicament pot ajunge în multe zone ale creierului.

[0104] În cazul prezentei invenţii, administrarea intranazală va fi efectuată preferabil cu ajutorul unor dispozitive adecvate pentru administrare topică, care acţionează prin intermediul absorbţiei medicamentelor prin mucoasa nazală, preferabil prin formarea de particule atomizate cu un diametru între 10 şi 50 micrometri.

[0105] Un exemplu de dispozitive adecvate pentru administrarea intranazală a compoziţiei conform invenţiei îl constituie dispozitivele de tip MAD (mucosal atomizer device) sau dispozitivele care acţionează cu mecanisme similare şi sunt disponibile comercial. Aplicarea MAD cu o seringă permite atomizarea medicamentului în ansamblu, garantând astfel absorbţia optimă a acestuia la nivelul mucoasei nazale şi reducând la minimum dispersia în mediul extern şi în structurile pulmonare. Structura sa îl face un dispozitiv simplu de utilizat şi extrem de eficient.

[0106] Administrarea polipeptidei conform invenţiei intranazal cu ajutorul unui dispozitiv MAD este o modalitate validă şi accesibilă de a acorda acces acestui ingredient activ la nivelul SNC.

[0107] Dispozitivul încărcat cu compoziţia descrisă în prezentul document poate fi astfel utilizat pentru administrarea polipeptidei conform invenţiei la mucoasa nazală şi epiteliul olfactiv, cu scopul de a o transporta prin căile olfactive şi/sau terminaţiile nervoase, spre parenchimul creierului. Dispozitivul, combinat cu medicamentul, poate fi, prin urmare, utilizat în practica clinică cu scopul de a induce regenerarea neuronală în creier, de exemplu pentru tratarea rezultatelor leziunilor hipoxico-ischemice cerebrale sau a bolilor neurodegenerative, tratarea patologiilor sau afecţiunilor care în prezent nu pot fi tratate farmacologic. Compoziţiile descrise în prezentul document pot fi administrate în una sau mai multe doze zilnice, cu cantităţi totale pe zi variind de la 0,01 la 1,00 mg per pacient.

[0108] În general, polipeptida conform prezentei invenţii este administrată în mod repetat sau într-o singură administrare.

[0109] Într-un exemplu de realizare, polipeptida este administrată într-o singură administrare. În acel exemplu de realizare, polipeptida este administrată într-o singură administrare, iar administrarea este întreruptă după acea administrare unică.

[0110] Într-un exemplu de realizare alternativ, polipeptida este administrată în mod repetat într-o perioadă de la una, două sau trei la 30 de zile, preferabil de la şapte la 14 zile. De asemenea, se are în vedere repetarea tratamentelor de până la 30 de zile după o perioadă adecvată de spălare pentru a permite tratarea afecţiunilor cronic progresive sau recurente.

[0111] Într-un exemplu de realizare, polipeptida este administrată în mod repetat. Într-un exemplu de realizare, polipeptida este administrată în mod repetat, de exemplu până la vindecarea completă a leziunii cerebrale sau cel puţin până la ameliorarea simptomelor leziunii. În mod alternativ, polipeptida este administrată în mod repetat pentru o perioadă de trei până la 30 de zile, preferabil de la şapte la 14 zile. Opţional, administrarea este întreruptă după terminarea intervalului menţionat mai sus. Într-un exemplu de realizare preferat în mod special, polipeptida este administrată în mod repetat de cel puţin trei ori pe zi.

[0112] Preferabil, polipeptida este administrată în urma unei leziuni a creierului. În mod alternativ, polipeptida poate fi utilizată profilactic în circumstanţe de leziuni cerebrale anticipate sau leziuni cerebrale potenţiale (cum ar fi intervenţii neurochirurgicale sau dezvoltarea unor afecţiuni inflamatorii ale creierului).

[0113] Preferabil, polipeptida este administrată cât mai curând posibil după diagnosticarea leziunilor cerebrale, pentru a minimiza gradul de deces al celulelor creierului. „Cât mai curând posibil» include exemple de realizare de o zi sau mai puţin după diagnosticarea leziunilor sau leziunilor cerebrale. Cu toate acestea, polipeptida este în continuare neuroprotectoare dacă este administrată la câteva zile după apariţia leziunilor cerebrale. Preferabil, polipeptida este administrată la cel puţin trei zile după inducerea unei leziuni a creierului.

[0114] Agenţii şi compoziţiile descrise aici sunt administrate în cantităţi eficiente. În cazul tratării unei anumite tulburări, reacţia dorită se referă, preferabil, la inhibarea evoluţiei bolii. Aceasta include încetinirea progresului bolii şi, preferabil, întreruperea sau inversarea progresului bolii. Reacţia dorită la tratarea unei boli sau al unei afecţiuni poate cuprinde, de asemenea, o întârziere a debutului sau o prevenire a apariţiei bolii sau afecţiunii respective. În unele exemple de realizare, reacţia dorită cuprinde vindecarea completă a simptomelor tulburării, local şi/sau sistemic.

[0115] O cantitate eficientă dintr-un agent sau compoziţie descrisă în prezentul document va depinde de starea sau tulburarea care urmează să fie tratată, de gravitatea tulburării, de parametrii individuali ai subiectului căruia i se administrează agentul, cum ar fi vârsta, starea fiziologică, afecţiunea (afecţiunile) însoţitoare (dacă sunt prezente), dimensiunea şi greutatea, durata tratamentului, tipul unei terapii însoţitoare (dacă este prezentă), calea specifică de administrare şi alţi parametri. Prin urmare, dozele administrate agenţilor descrişi aici pot depinde de diferiţi astfel de parametri. În cazul în care o reacţie la un pacient este insuficientă cu o doză iniţială, pot fi utilizate doze mai mari (sau efectiv doze mai mari obţinute pe o cale de administrare diferită, mai localizată).

[0116] Conform prezentei invenţii, dozele adecvate şi eficiente din punct de vedere terapeutic pentru administrarea unui agent terapeutic pentru administrarea la un subiect uman pentru tratarea şi/sau prevenirea unei leziuni cerebrale, în special a unei leziuni cerebrale traumatice sau a unei leziuni hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxică-ischemică, pot fi determinate pe baza dozelor adecvate şi eficiente din punct de vedere terapeutic determinate experimental pentru administrarea unui agent terapeutic pentru administrare la un subiect rozător, în special un şoarece, pentru tratarea şi/sau prevenirea leziunilor cerebrale, în special leziuni cerebrale traumatice sau leziuni hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxică-ischemică.

[0117] Modelele animale (Exemplele 2 şi 3) sunt utile pentru stabilirea răspunsurilor farmacologice, precum şi pentru evaluarea toxicităţilor potenţiale ale produselor de tratament. În unele exemple de realizare, doza care trebuie administrată subiectului este o doză aşa cum este prezentată în Exemplul 2 sau în Exemplul 3.

[0118] Preferabil, doza de polipeptidă este determinată la sau înainte de începutul tratamentului. Într-un exemplu de realizare, dozarea este ajustată pentru administrări ulterioare, în funcţie de progresia afecţiunii tratate. Într-un exemplu de realizare alternativ, dozarea nu este ajustată pentru administrarea(ile) ulterioară(e), astfel încât dozele ulterioare să corespundă primei doze.

[0119] Polipeptida este activă atât prin administrare nazală, cât şi sistemică. În mod specific pentru administrarea nazală, doza preferată/fiecare doză pe subiect are o cantitate de la 0,10 la 1,00 mg/zi, preferabil de la 0,06 la 0,12 mg/zi de polipeptidă pe nări, şi mai preferabil aproximativ 0,06 mg/zi de polipeptidă pe nări. Aceste doze pot fi administrate într-o nară sau împărţite în ambele nări, în funcţie de circumstanţele clinice predominante, cum ar fi preferinţa destinatarului, încărcarea volemică tolerabilă şi accesul la nări. Cel mai preferabil, aceste doze indicate sunt destinate în mod specific administrării la om.

[0120] În cele ce urmează, vor fi descrise compoziţii care cuprind polipeptida conform prezentei invenţii. Astfel de compoziţii fac parte din prezenta invenţie atât ca atare, cât şi în contextul specific de utilizare în prevenirea şi/sau tratarea leziunilor cerebrale, în special a leziunilor cerebrale traumatice sau a leziunilor hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la, encefalopatia hipoxic-ischemică conform prezentei invenţii. Astfel, prezenta invenţie vizează utilizarea medicală a unor astfel de compoziţii.

[0121] În compoziţiile conform prezentei invenţii, polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 este cuprins ca ingredient activ. Pot fi incluse şi alte ingrediente.

[0122] Într-un exemplu de realizare, polipeptida este cuprinsă într-un mediu apos. Respectivul mediu apos este destinat administrării la subiectul mamifer.

[0123] O compoziţie apoasă specială pentru utilizare conform prezentei invenţii este o compoziţie lichidă adecvată pentru utilizare intranazală. Formularea are o concentraţie de 2 mg/ml, soluţie tampon de acetat 20 mM, metionină 20 mM, pH 5,5. Se dizolvă în soluţie salină 0,9 % şi poate fi administrat intranazal, preferabil la doze de 20 μg/kg sau 40 μg/kg (4 μl volum total, 2 μl/nară), nări alternative, preferabil cu un interval de 1-5 minute, preferabil 2 minute între doze. Metodele de realizare a unor astfel de compoziţii sunt cunoscute în domeniu.

[0124] În unele realizări, polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 descrisă aici este cuprinsă într-o compoziţie, cum ar fi o compoziţie lichidă, care cuprinde în plus unul sau mai mulţi purtători şi/sau unul sau mai mulţi excipienţi. Termenul „purtător», aşa cum este utilizat în prezentul document, se referă la o componentă organică sau anorganică, de natură naturală sau sintetică, care este combinată împreună cu ingredientul activ pentru a permite, spori sau facilita aplicarea ingredientului activ. Termenul „excipient», aşa cum este utilizat în prezentul document, este menit să indice toate substanţele care pot fi prezente într-o compoziţie farmaceutică a prezentei invenţii şi care nu sunt ingrediente active.

[0125] Preferabil, compoziţia conform prezentei invenţii cuprinde cel puţin apă ca excipient. În unele exemple de realizare, compoziţia conform prezentei invenţii cuprinde medii apoase şi, mai preferabil, compoziţia conform prezentei invenţii este sub formă de soluţie apoasă. Într-un exemplu de realizare, polipeptida este cuprinsă într-un mediu apos, iar mediul apos este administrat subiectului mamifer. Mediul apos poate fi, de exemplu, o soluţie apoasă.

[0126] Astfel, polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 descrisă aici poate fi prezentă într-o compoziţie, de exemplu, într-o compoziţie farmaceutică. Compoziţiile descrise în prezentul document sunt preferabil sterile şi conţin, preferabil, polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 ca peptidă sau proteină activă farmaceutic şi, opţional, a altor agenţi, menţionaţi sau nemenţionaţi în prezentul document. Compoziţiile pot fi în orice stare, de exemplu lichidă, congelată, liofilizată etc.

[0127] Compoziţiile descrise în prezentul document pot cuprinde săruri, substanţe tampon, conservanţi, purtători, diluanţi şi/sau excipienţi, toate acestea fiind preferabil acceptabile din punct de vedere farmaceutic. Termenul „acceptabil din punct de vedere farmaceutic» descrie ceva netoxic şi/sau care nu interacţionează cu acţiunea ingredientului activ al compoziţiei farmaceutice.

[0128] Substanţele tampon adecvate pentru utilizare în invenţie includ tampon acetat 20 mM.

[0129] Compoziţia (formula) conform prezentei invenţii poate fi conservată, fără limitare, conform uneia sau mai multora dintre următoarele exemple de realizare:

-

Primul exemplu de realizare: formula de mai sus poate fi păstrată congelată la -70 grade C sau la - 20 grade C (datele nu sunt prezentate) şi decongelată înainte de administrare.

-

Al doilea exemplu de realizare: formula de mai sus poate fi păstrată în frigider, preferabil în intervalul de temperatură de la +2 la + 8 grade C (datele nu sunt prezentate).

-

Al treilea exemplu de realizare: formula de mai sus poate fi supusă uscării sau liofilizării şi apoi depozitată, de exemplu, la temperatura camerei sau la 2-8 grade C (datele nu sunt prezentate). Poate fi reconstituit înainte de administrare.

[0131] Conservanţii adecvaţi pentru utilizarea în compoziţii conform prezentei invenţii includ pe cei cunoscuţi în domeniu, printre care se numără pentru ilustrare, dar fără limitare, alcool benzilic, benzalconiu şi sărurile sale, M-crezol, fenol, clorbutanol, paraben şi timerosal. Aceşti şi alţi conservanţi sunt incluşi opţional în compoziţia conform prezentei invenţii.

[0132] Astfel, prezenta invenţie prezintă polipeptida cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 pentru uz terapeutic, adică pentru utilizarea într-o metodă de tratare a corpului uman sau animal prin terapie. Terapia poate include prevenirea şi/sau tratarea unei afecţiuni. Având în vedere potenţialul de utilizare terapeutică, polipeptida menţionată poate fi, de asemenea, denumită proteină sau peptidă activă din punct de vedere farmaceutic.

[0133] Opţional, administrarea conform prezentei invenţii este însoţită de administrarea a cel puţin unui alt agent terapeutic, cum ar fi agenţi destinaţi combaterii inflamaţiei, edemului/umflăturii, presiunii intracraniene crescute, infecţiei, convulsiilor, durerii, sechelelor psihologice etc. Celălalt agent terapeutic poate face parte din compoziţia care cuprinde polipeptida conform prezentei invenţii sau, în mod alternativ, poate fi administrat subiectului separat, în acelaşi loc sau într-un loc diferit, pe aceeaşi cale de administrare sau pe o cale de administrare diferită.

[0134] Purtătorul poate fi o soluţie izotonică, opţional tamponată, cum ar fi soluţia salină sau tamponul fosfat, şi poate cuprinde în plus, dacă este necesar, conservanţi adecvaţi sau alţi excipienţi adecvaţi pentru formularea compoziţiilor pentru administrare intranazală.

[0135] Administrarea poate fi efectuată, de exemplu, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 sau mai multe ori pe zi, în funcţie de nevoile pacientului şi de fiecare dată când doza poate fi, aşa cum este descris mai sus, de la 0,01 la 1,00 mg de CHF6467 pe zi.

[0136] Într-un exemplu de realizare, de exemplu, compoziţia poate fi administrată de 2-4 ori pe zi, de exemplu de 3 ori pe zi, la o doză de la 0,02 la 0,04 mg de CHF6467 pe fiecare administrare.

[0137] De exemplu, compoziţia poate fi administrată de 3 ori pe zi într-o doză de 0,02 mg de CHF6467 şi/sau molecule cu acţiune asemănătoare NGF per administrare.

[0138] Compoziţia poate fi administrată în oricare dintre modurile şi dozele descrise mai sus pentru unul sau mai multe cicluri terapeutice.

[0139] Astfel de cicluri terapeutice, de exemplu, pot dura între o zi şi două săptămâni.

[0140] Cu titlu de exemplu, compoziţia farmaceutică poate fi furnizată sub forma unui număr (de exemplu, orice număr de la 10 la 20) de alicote prepreparate, fiecare conţinând, ca exemplu nelimitativ, 1 ml de soluţie fiziologică sau orice alt purtător adecvat, în care se diluează 0,5-2,0 mg de CHF6467. Astfel de alicote pot fi conţinute în eprubete sau, de asemenea, într-un exemplu de realizare care oferă o uşurinţă deosebită de utilizare, în seringi predozate adecvate pentru conectarea la un dispozitiv MAD. Exemplul de realizare al alicotelor este implementat astfel încât să ofere posibilitatea administrării unei doze între 0,01 şi 1,00 mg de CHF6467 pe zi. În conformitate cu un posibil exemplu de realizare, compoziţia invenţiei poate conţine, de exemplu, alicote de 1 ml care conţin 1 mg de CHF6467, acest tip de formulare fiind deosebit de potrivit pentru copiii cu o greutate corporală de aproximativ 10 kg. În mod alternativ, compoziţia poate conţine alicote de 1 ml dintr-un purtător adecvat cu 2 mg de CHF6467, de exemplu, pentru copii cu o greutate corporală de aproximativ 20 kg şi aşa mai departe. În cunoaşterea dozei recomandate în prezenta descriere, prepararea alicotelor adecvate în compoziţia farmaceutică în funcţie de intervalul de greutate corporală este o implementare simplă pentru o persoană de specialitate în domeniu.

[0141] Posibilitatea administrării medicamentelor intranazal, cu scopul de a le transporta spre creier, ocolind bariera hematoencefalică, a fost deja sugerată cu mai mult de un deceniu în urmă şi este utilizată în prezent pentru administrarea unor tipuri de medicamente sedative sau anestezice, pentru care, prin administrare intranazală, este posibilă reducerea dozei şi limitarea acestora şi, prin urmare, şi posibilele efecte secundare.

[0142] În conformitate cu un alt exemplu de realizare, una sau mai multe părţi alicote menţionate pot fi precalibrate pentru administrare pediatrică sau pentru administrare la adulţi şi pot fi subdivizate în doze unice pe interval de greutate corporală cuprinzând o cantitate adecvată de CHF6467.

[0143] Într-un exemplu de realizare alternativ, una sau mai multe alicote pot fi alicote cu doze multiple, de exemplu alicote „zilnice» sau „săptămânale», care pot fi subdivizate într-o doză adecvată în funcţie de greutatea pacientului.

[0144] După cum s-a menţionat deja mai sus, în conformitate cu un exemplu de realizare, unul sau mai multe dispozitive pentru administrarea compoziţiei pot fi dispozitive de tip MAD (dispozitiv atomizor mucozal).

[0145] De exemplu, CHF6467 poate fi sub forma unui kit. Kitul invenţiei poate cuprinde un număr (de exemplu, orice număr de la 10 la 20) de alicote prepreparate, fiecare conţinând, ca exemplu nelimitativ, 1 ml de soluţie fiziologică, în care sunt diluate 0,01-1,00 mg de CHF6467, ceea ce, pentru cele 10 seringi predozate, oferă posibilitatea de a administra de la 0,01 la 1,00 mg/subiect sau de la 3 la 333 μg/kg de CHF6467. Astfel de alicote pot fi deja conţinute în seringi sterile, opţional deja echipate cu dispozitivul MAD pentru administrarea intranazală a polipeptidei. În conformitate cu un posibil exemplu de realizare, kitul invenţiei, de exemplu, poate cuprinde 10 seringi cu de la 0,01 la 1 mg de CHF6467 pentru nou-născutul cu greutatea corporală de aproximativ 3 kg. În cunoaşterea dozei recomandate în prezenta descriere, pregătirea unui kit farmaceutic adecvat pentru intervalele de greutate corporală este o implementare simplă pentru o persoană calificată în domeniu. În acest fel, ar fi posibil să se protejeze administrarea intranazală a unei cantităţi adecvate de CHF6467 capabile să stimuleze receptorii intracerebrali pentru NGF (TrkA şi p75) prezenţi în majoritatea zonelor serotoninergice şi colinergice ale creierului. În plus, kiturile de acest fel, ar permite administrarea intranazală a CHF6467 acasă şi de către părinţii nou-născuţilor (având în vedere simplitatea şi siguranţa metodologiei), îmbunătăţind semnificativ calitatea vieţii acestor nou-născuţi.

[0146] În plus, compoziţia, kiturile şi metoda invenţiei pot fi utilizate nu numai pentru pacienţii (inclusiv pacienţii de vârstă pediatrică sau neonatală) care suferă de deficienţe neurologice cauzate de traumatisme craniene majore, ci şi pentru toţi copiii afectaţi de leziuni cerebrale cauzate de encefalopatia hipoxico-ischemică cauzată de leziuni perinatale şi pentru pacienţii afectaţi în general de paralizie cerebrală infantilă şi leziuni cerebrale secundare şi ischemie cerebrală de diferite naturi (de exemplu, ruptură de anevrism cerebral, malformaţii arterio-venoase cerebrale şi tromboză sinusală cerebrală).

[0147] Într-un alt exemplu de realizare preferat al invenţiei, nou-născutul este supus hipotermiei înainte de tratamentul cu CHF6467.

[0148] Într-un exemplu de realizare preferat, CHF6467 este administrat secvenţial cu hipotermia.

[0149] Într-un exemplu de realizare preferat, CHF6467 este administrat secvenţial după sau înainte de hipotermie.

[0150] Într-un exemplu de realizare preferat, CHF6467 este administrat simultan cu hipotermia, într-un exemplu de realizare preferat al invenţiei, CHF6467 este administrat într-o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic.

[0151] Într-un alt exemplu de realizare preferat, CHF6467 este administrat într-o cantitate eficientă din punct de vedere sub-terapeutic.

[0152] Cu alte cuvinte, CHF6467 este administrat într-o cantitate care ar fi insuficientă pentru a produce efectul terapeutic dorit dacă ar fi administrat în absenţa condiţiilor hipotermice.

[0153] Şi mai preferabil, combinaţia dintre CHF6467 şi hipotermie are un efect sinergic, respectiv combinaţia este sinergică.

[0154] Într-un exemplu de realizare deosebit de preferat, CHF6467 este administrat înainte de episodul hipoxică/ischemic în sine sau înainte de confirmarea diagnostică a unei leziuni hipoxice/ischemice care se suspectează că a avut loc. Astfel, într-un exemplu de realizare preferat, CHF6467 este administrat nou-născutului prin intermediul mamei înainte de naştere, de exemplu, prin administrarea la mamă înainte sau în timpul travaliului.

[0155] Preferabil, CHF6467 este administrat mamei cu până la aproximativ 48 sau 24 de ore înainte de naştere, mai preferabil cu până la aproximativ 12 ore, mai preferabil până la aproximativ 6 ore sau 3 ore sau 1 oră înainte de naştere. După naştere, nou-născutul este apoi supus unor condiţii hipotermice.

[0156] Într-un alt exemplu de realizare preferat, CHF6467 este administrat nou-născutului sau sugarului imediat după naştere, unde există motive clinice pentru a suspecta că ar fi putut apărea un episod hipoxic/ischemic cu impact clinic, dar înainte de confirmarea diagnosticului. Această circumstanţă este facilitată de rapiditatea şi uşurinţa cu care CHF6467 poate fi administrat fără a interfera cu alte activităţi sau intervenţii clinice importante.

[0157] EXEMPLE

[0158] Exemplul 1: Secţiuni acute de hipocamp supuse privării de oxigen-glucoză (OGD)

[0159] Metode

[0160] Şoarecii C57Bl6/J (30-50 de zile) au fost ucişi prin decapitare, iar creierul a fost îndepărtat rapid şi plasat în CSF artificial rece ca gheaţa (aCSF) (0 °C), oxigenat (95 % O2 la 5 % CO2). Secţiuni de hipocamp parasagital (250-350 μM) au fost tăiate folosind vibratom şi recuperate timp de 1 oră în aCSF la temperatura camerei. O singură secţiune a fost plasată pe o plasă de nailon, complet scufundată într-o cameră de înregistrare şi superfuzată cu aCSF (3 ml/min, ~30 °C) oxigenat în mod continuu. Înregistrările extracelulare de teren au fost efectuate folosind un electrod bipolar plasat în fibrele colaterale Schaffer pentru a obţine potenţialul postsinaptic excitator de câmp (fEPSP) care a fost înregistrat cu microelectrozi de sticlă, umplut cu aCSF plasat în regiunea CA1 a stratum radiatum. Folosind o clemă de plasture celular întreg, inventatorii au evaluat efectul neuroprotector al CHF6467 asupra parametrilor neuronilor unici modificaţi de OGD. Mai exact, inventatorii au măsurat curenţii postsinaptici excitatori spontani (sEPSC) şi potenţialul membranar (Vm). Inventatorii au evaluat, de asemenea, fereastra de timp a neuroprotecţiei CHF6467 în timpul şi după înregistrarea OGD a curenţilor postsinaptici excitatori (EPSC). Privarea de oxigen/glucoză in vitro (OGD) a fost realizată prin perfuzarea secţiunilor cu aCSF fără glucoză şi gazate cu 95 % N2 la 5% CO2. După OGD, secţiunile au fost reperfuzate cu aCSF conţinând glucoză şi O2. Hipotermia a fost obţinută prin perfuzarea secţiunilor cu aCSF (+4 °C) conţinând glucoză şi oxigenat (95% O2 la 5 % CO2).

[0161] Rezultate

[0162] Inventatorii au studiat efectele neuroprotectoare ale CHF6467 şi hipotermiei, în mod individual sau în combinaţie, pe secţiuni acute de hipocamp de şoarece expuse la OGD.

[0163] În primul rând, au investigat efectul CHF6467 asupra neurotransmisiei bazale în hipocamp. Inventatorii au efectuat experimente înregistrând fEPSC în condiţii de control timp de 20 de minute, apoi au adăugat CHF6467 la soluţia de baie la diferite concentraţii (0,001-0,1 μg/ml) timp de 15 minute. CHF6467 a reuşit să crească amplitudinea fEPSC la concentraţia de 0,1 μg/ml (Figura 1).

[0164] Capacitatea secţiunilor de hipocamp de a recupera funcţia sinaptică la revenirea oxigenării normale depinde de durata OGD. În condiţiile experimentale ale inventatorilor, OGD aplicat timp de 10 minute a indus o depresiune fEPSP ireversibilă (datele nu sunt prezentate). Aplicarea în baie a CHF6467 în timpul OGD a inversat depresia fEPSP, observată în condiţiile de control. Secţiunile tratate cu CHF6467 în timpul OGD au arătat o recuperare completă a amplitudinii fEPSP (Figura 2).

[0165] Pentru a studia ferestrele terapeutice din modelul in vitro al inventatorilor, au fost efectuate experimente în configuraţia clemei de plasture celular întreg, evaluând efectul neuroprotector al CHF6467 asupra neuronilor unici. Inventatorii au înregistrat curenţi postsinaptici excitatori evocaţi (EPSC) care au fost reduşi în mod ireversibil după 15 minute de OGD. Inventatorii au observat un efect neuroprotector al CHF6467 atunci când a fost aplicat după OGD (Figura 3A), dar nu a fost observată nicio modificare a neurotransmisiei bazale atunci când CHF6467 a fost aplicat în condiţii normale (Figura 3B).

[0166] Pentru a investiga posibilitatea unui efect sinergic între CHF6467 şi hipotermie, care până în prezent reprezintă singura abordare terapeutică aprobată pentru HIE, inventatorii au efectuat experimente aplicând CHF6467 cu hipotermie după OGD. În condiţiile experimentale ale inventatorilor, hipotermia a putut anula parţial reducerea EPSC indusă de OGD (Figura 4). Aplicarea concomitentă a CHF6467 în timpul hipotermiei a reuşit să salveze complet reducerea OGD a EPSC (Figura 4).

[0167] Dozele in vitro şi in vivo de CHF6467 şi protocoalele de administrare au fost selectate în studii doză-răspuns pentru a susţine o potenţială aplicaţie clinică. Atenuarea maximă a leziunilor neuronale in vitro a fost observată la 0,03 μM CHF6467. În mod surprinzător, efectele neuroprotectoare ale CHF6467 in vitro au fost îmbunătăţite în mod semnificativ de hipotermie la 4 °C până la o inversare aproape completă a leziunilor electrofiziologice neuronale.

[0168] În general, prezentele date electrofiziologice susţin potenţialul neuroprotector al CHF6467 împotriva mai multor modificări funcţionale induse de ischemie.

[0169] În baza acestor rezultate in vitro care arată că CHF6467 este capabil să protejeze de excitotoxicitatea mediată de ischemie (datele nu sunt prezentate) şi fără a fi legat de nicio teorie, CHF6467 poate servi ca terapie neuroprotectoare potenţială, în combinaţie cu hipotermie, pentru tratarea leziunilor cerebrale sau a leziunilor cerebrale traumatice sau a leziunilor hipoxice ischemice cerebrale, incluzând, dar fără a se limita la encefalopatia hipoxic-ischemică.

[0170] Exemplul 2: Model de şobolan de encefalopatie hipoxic-ischemică neonatală

[0171] Metode

[0172] Animale. Experimentele şi procedurile de utilizare a animalelor au fost în conformitate cu Ghidul Institutului Naţional de Sănătate pentru îngrijirea şi utilizarea animalelor de laborator (Publicaţiile NIH nr. 80-23, revizuite în 1996). Protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor din cadrul Departamentului de Ştiinţe ale Sănătăţii, Universitatea din Florenţa, în conformitate cu Convenţia europeană pentru protecţia animalelor vertebrate utilizate în scopuri experimentale şi în alte scopuri ştiinţifice (ETS nr. 123) şi Directiva Consiliului Comunităţilor Europene din 24 noiembrie 1986 (86/609/CEE). S-au depus toate eforturile pentru a minimiza numărul de animale folosite şi suferinţa lor.

[0173] Proceduri. Procedurile chirurgicale au fost efectuate în ziua postnatală 7 pe şobolani Wistar (Harlan, MI, Italia), după modelul Rice-Vannucci (Ann Neurol 1981; 9: 131-141). Pe scurt, puii de şobolan au fost anesteziaţi cu gaz izofluran (inducţie, 4 %; întreţinere, 1 %) în oxigen:oxid de azot (1:1). Artera carotidă comună stângă a fost ligată folosind mătase 4-0 după o incizie mediană. După operaţie, toţi puii au fost returnaţi la femele pentru recuperare şi lactaţie timp de 1,5 ore. Apoi puii au fost plasaţi în camere de plexiglas închise, ventilate (W20, D20, H17), parţial scufundate într-o baie de apă şi expuse prin flux continuu la gaz încălzit şi umidificat, 8 % oxigen, 92 % azot timp de 120 de minute. După apariţia episodului, puii au fost readuşi la femele timp de 1 oră şi apoi plasaţi într-o cameră la temperaturi normotermice (37 °C) sau hipotermice (32 °C) timp de 4 ore. CHF6467 fost administrat intranazal imediat şi la 24 de ore după hipoxie la doza de 20 μg/kg, care s-a dovedit a fi bine tolerată în experimentele anterioare. Toţi puii au fost apoi ţinuţi cu mamele lor şi sacrificaţi prin decapitare sub anestezie cu izofluran 72 de ore mai târziu. Pentru măsurarea zonelor şi volumelor infarctului, secţiunile coronale de 1 mm grosime au fost tăiate cu o lamă, incubate în 2 % clorură de 2,3,5- trifenil-tetrazoliu (TTC) timp de 20 de minute la 37 °C şi apoi fixate în 4 % paraformaldehidă timp de 24 de ore. Zonele infarctului au fost măsurate cu ajutorul unui sistem computerizat de analiză a imaginilor (Image-Pro Plus 3.0, Silver Spring, MD, SUA). Volumul infarctului a fost calculat aşa cum a fost descris anterior (Ann Neurol 1981; 9: 131-141).

[0174] Formularea şi administrarea intranazală a CHF6467. După terminarea hipoxiei, şobolanii au fost plasaţi într-o poziţie în decubit dorsal. CHF6467 (lotul nr. NGF183704-TR1, concentraţie 2 mg/ml, 20 mM tampon acetat, 20 mM metionină, pH 5,5) a fost dizolvată în soluţie salină 0,9 % şi administrată intranazal la doza de 20 μg/kg (4 μl volum total, 2 μl/nară), nări alternative cu un interval de 2 minute între doze.

[0175] Analiza statistică. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM de n experimente. Semnificaţia statistică a diferenţelor dintre intensităţile de fluorescenţă ale iodurii de propidiu sau coloraţia TTC a fost analizată utilizând ANOVA bidirecţional, urmată de testul Holm-Sidak pentru comparaţii multiple. Toate calculele statistice au fost efectuate utilizând SigmaPlot (versiunea 11.0). O valoare de probabilitate (P) de < 0,05 a fost considerată semnificativă.

[0176] Rezultate

[0177] Inventatorii au studiat efectele neuroprotectoare ale CHF6467, în mod individual sau în combinaţie cu hipotermia, în modelul de şobolan nou-născut de encefalopatie hipoxic-ischemică neonatală (HIE) (modelul Rice-Vannucci; Ann Neurol 1981; 9: 131-141). Protocolul experimental este prezentat în diagramă (Figura 5). În acest model, ocluzia arterei carotide stângi urmată de expunerea la hipoxie (8 % O2 şi 92 % azot timp de 2 ore) are ca rezultat o apariţie de ~80 % a infarctului cerebral ipsilateral la puii de şobolan trataţi cu vehicul, aşa cum s-a descris anterior (Landucci et al., Neurosci Lett. 2018; 668:103-107).

[0178] Constatările observaţionale privind emisfera proaspătă ipsilaterală la ocluzia arterei carotide au inclus paloare, atrofie şi pierdere de ţesut în striatum, hipocamp, cortex şi talamus (datele nu sunt prezentate). Când secţiunile de creier au fost colorate cu clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (TTC), inventatorii au observat că HIE a produs un infarct cerebral semnificativ (Figura 6) care a avut un volum de 70,4 ± 7,8 mm3.

[0179] După terminarea hipoxiei, şobolanii au fost plasaţi într-o poziţie în decubit dorsal. CHF6467 a fost dizolvat în soluţie salină 0,9 % şi administrat intranazal în doză de 20 μg/kg sau 40 μg/kg (4 μl volum total, 2 μl/nară), nări alternative cu un interval de 2 minute între doze. Administrarea a 20 şi 40 μg/kg (echivalent cu aproximativ de la 60 la 120 μg pentru un nou-născut uman cu greutate corporală de 3 kg) CHF6467 intranazal imediat şi la 24 de ore după hipoxie a redus semnificativ amploarea infarctului comparativ cu vehiculul.

[0180] Hipotermia (32 °C timp de 4 ore începând cu 1 oră după sfârşitul hipoxiei) a redus semnificativ extinderea la animalele tratate cu vehicul în normotermie (Figura 6). Combinaţia de CHF6467 20 μg/kg cu hipotermie a determinat o reducere dramatică a volumului infarctului, care a fost semnificativ mai mare decât cel produs doar de hipotermie (Figura 6). În mod interesant şi surprinzător, combinaţia dintre hipotermie şi CHF6467 neuroprotecţie a înlocuit suma efectelor neuroprotectoare ale agenţilor unici.

[0181] Reducerile procentuale medii ale volumului mediu de infarct cerebral transformat în funcţie de valoarea Log a grupului vehicul + normotermie după diferitele tratamente au fost:

-

Normotermie + CHF6467 20 μg/kg: -13,6 %

-

Normotermie + CHF6467 40 μg/kg: -24,3 %

-

Hipotermie + Vehicul: -13,4 %

-

Hipotermie + CHF6467 20 μg/kg: -47,9%

[0183] Animalele au fost monitorizate o dată pe zi pentru examinarea semnelor clinice şi de două ori pe zi pentru mortalitate şi morbiditate.

[0184] Analiza efectului de interacţiune

[0185] Ulterior, au fost efectuate analize statistice utilizând SAS versiunea 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA). Analiza statistică a efectului de interacţiune dintre CHF6467 şi hipotermie s-a bazat pe date transformate log10, utilizând un model ANOVA presupunând o varianţă separată pentru fiecare grup de tratament. Efectele fixe ale hipotermiei (da/nu), CHF6467 (da/nu) şi interacţiunea lor au fost incluse în model. Datele din grupul tratat cu normotermie + CHF6467 40 μg/kg au fost excluse din analiză deoarece nu au contribuit la evaluarea efectului de interacţiune (deoarece acest studiu nu a inclus un grup hipotermie + CHF6467 40 μg/kg).

[0186] Interacţiunea dintre CHF6467 20 μg/kg şi hipotermie a fost semnificativă statistic (p = 0,006). Această interacţiune este evidentă în Figura 9, unde volumul mediu de infarct cerebral transformat în log10 este prezentat în funcţie de grupul de tratament. În cazul unor efecte aditive (fără interacţiune) de CHF6467 20 μg/kg şi hipotermie, ar fi de aşteptat linii paralele. Absenţa paralelismului a sugerat o interacţiune între efectele CHF6467 20 μg/kg şi hipotermie. Efectul neuroprotector al combinaţiei de CHF6467 20 μg/kg şi hipotermie a fost mai mare decât suma efectelor individuale ale CHF6467 şi hipotermiei.

[0187] Tabelul 1 raportează efectul CHF6467 în mod individual sau combinat cu hipotermie asupra greutăţii corporale. Nu s-au observat diferenţe semnificative statistic în creşterea în greutate corporală şi nici semne clinice adverse.

[0188] Tabelul 1: Efectul CHF6467 singur sau combinat cu hipotermie asupra greutăţii corporale

0 ore

24 de ore

48 de ore

72 de ore

FALS

17,17 ± 1,20

19,44 ± 1,27

21,44 ± 1,28

23,02 ± 1,69

HIE

16,84 ± 0,38

17,44 ± 0,46

19,72 ± 0,58

21,87 ± 0,88

HIE+ CHF6467 20 μg/kg i.n.

15,33 ± 0,66

16,28 ± 0,58

18,48 ± 0,62

21,35 ± 1,15

HIE+ CHF6467 40 μg/kg i.n.

17,22 ±0,38

18,14 ± 0,53

20,67 ± 0,53

23,00 ± 0,45

HIE+ IPO

15,68 ± 0,46

17,12 ± 0,62

19,03 ± 0,77

21,49 ± 1,12

HIE+ IPO+ CHF6467 20 μg/Kg

15,31 ± 0,44

16,90 ± 0,56

19,17 ± 0,73

21,49 ± 1,00

[0190] Apoi, CHF6467 poate fi utilizat ca agent neuroprotector la nou-născuţii cu HIE în combinaţie cu hipotermia.

[0191] Exemplul 3: Efectul CHF6467 asupra expresiei markerilor neuroinflamatori într-un model de şobolan juvenil cu leziuni cerebrale hipoxic-ischemice

[0192] Metode

[0193] Proceduri experimentale pe animale. Toate procedurile şi condiţiile care implică animale experimentale au fost revizuite şi aprobate de comitetul local de etică şi autorizate de Ministerul Sănătăţii din Italia (autorizaţia numărul 671/2019-PR).

[0194] Procedura experimentală a fost efectuată aşa cum s-a descris anterior (Landucci et al., 2018 Neurosci. Lett. 668). Pe scurt, în ziua 7 postnatală, puii de şobolan Wistar au fost anesteziaţi cu gaz izofluran (inducţie, 4-5 %; întreţinere, 1-2 %). Artera carotidă comună stângă a fost ligată folosind mătase 4-0 după o incizie mediană. După operaţie, toţi puii au fost returnaţi la femele pentru recuperare şi lactaţie timp de 1 oră. Apoi puii au fost plasaţi în camere de plexiglas închise, ventilate (W20, D20, H17), parţial scufundate într-o baie de apă şi expuse prin flux continuu la gaz încălzit şi umidificat, 8 % oxigen, 92 % azot timp de 120 de minute. După apariţia episodului, puii au fost readuşi la femele timp de 1 oră şi apoi plasaţi într-o cameră la temperaturi normotermice (37 °C) sau hipotermice (32 °C) timp de 4 ore. CHF6467 fost administrat intranazal imediat după terminarea hipoxiei la o doză de 20 μg/kg. Toţi puii au fost apoi ţinuţi cu mamele lor şi sacrificaţi prin decapitare 24 de ore mai târziu.

[0195] Formularea şi administrarea intranazală a CHF6467. După terminarea hipoxiei, şobolanii au fost plasaţi într-o poziţie în decubit dorsal. CHF6467 (lotul nr. NGF183704-TR1, concentraţie 2 mg/ml, 20 mM tampon acetat, 20 mM metionină, pH 5,5) a fost dizolvată în soluţie salină 0,9 % şi administrată intranazal la doza de 20 μg/kg sau 40 μg/kg (4 μl volum total, 2 μl/nară), nări alternative cu un interval de 2 minute între doze.

[0196] Extracţia ARN din zonele creierului hipocampal şi cortical. Liza probelor pe bază de fenol/guanidină: S-au utilizat 800 ul reactiv de liză QIAzol/30 mg de ţesut atât pentru hipocamp, cât şi pentru cortex. Probele de ţesut au fost omogenizate combinând bile şi dispozitivul Tissue Lyser (Qiagen). După adăugarea de cloroform, omogenatul a fost separat în faze apoase şi organice prin centrifugare. Faza apoasă superioară a fost extrasă prin sistemul automat QiaCube Connect (Qiagen). S-a ales etapa de protocol care include DNază pentru a elimina gDNA. Probele de ARN au fost eluate în apă fără RNază şi depozitate la -80 °C până la etapa de transcriere inversă.

[0197] Concentraţia probelor de ARN a fost determinată la analizorul Nanodrop (ThermoFisher) şi ajustată pentru a retrotranscrie 1000 ng de ARN într-o reacţie RT pentru fiecare probă. O etapă suplimentară a enzimei ezDNază™ a fost efectuată înainte de reacţia RT pentru a elimina gDNA. S-au urmat condiţiile de ciclu termic sugerate de producător pentru a permite reacţia RT.

[0198] Panou de markeri neuroinflamatori. Probele de cDNA au fost testate pe plăci matrice personalizate (matricea de gene Taqman, Thermofisher), inclusiv amorse şi sonde pentru genele ţintă şi de întreţinere.

[0199] Următoarele gene (numărul de catalog Thermofisher în paranteze) au fost vizate în timpul studiului: Genele de întreţinere: 18s rRNA (Hs99999901_s1), B2m (Rn00560865_m1), Tbp (Rn01455648_m1); Genele ţintă: Ccl2 (Rn00580555_m1), Ccl22 (Rn01536591_m1), Ccl12 (Rn01464638_m1), Tnf (Rn00562055_m1), Cxcl2 (Rn00586403_m1), Ccl7 (Rn01467286_m1), Ccr5 (Rn02132969_s1), Ccl20 (Rn00570287_m1), Il6 (Rn01410330_m1), Cxcl10 (Rn01413889_g1), Ccl6 (Rn01456400_m1).

[0200] TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) şi cDNA diluat au fost adăugate pe plăci; condiţiile de cicluri termice sugerate de producător au fost urmate pentru a efectua reacţia PCR. Rezultatele au fost calculate folosind metoda 2-ΔΔCt bazată pe amplificarea genei de întreţinere.

[0201] Analiza statistică a fost efectuată de software-ul Graph Prism; A fost aplicat un test ANOVA obişnuit într-o singură direcţie, urmat de comparaţii ad-hoc Dunnett sau Tuckey.

[0202] Rezultate

[0203] O creştere semnificativă a nivelurilor de mRNA ale unui grup de citokine şi chemokine în hipocamp şi cortexul frontoparietal a fost măsurată la şobolanii care au suferit leziuni hipoxic-ischemice în comparaţie cu şobolanii operaţi placebo (Fig. 7 şi 8). CHF6467 (20 ug/kg, intranazal) a contracarat semnificativ reglarea ascendentă a mai multor markeri neuroinflamatori (ccl2, cxcl2, TNF-alfa, IL-6, ccl20) în regiunea hipocampală a şobolanilor cu un episod hipoxic-ischemic indus, iar hipotermia în sine nu a fost la fel de eficientă ca CHF6467, deşi a contracarat semnificativ reglarea ascendentă a ccl2 (Fig. 7).

[0204] În cortex, CHF6467 (20 ug/kg) per se a contracarat unii markeri neuroinflamatori reglării ascendente (dar numai cxcl2 a ajuns la o semnificaţie statistică) indusă de ischemiza hipoxică-ischemică şi acest efect a fost, pentru unii markeri neuroinflamatori (ccl7, ccl2, IL-6, TNF-alfa, cxcl2), augmentat de combinaţia cu hipotermie (Fig. 8).

[0205] În plus, combinaţia dintre CHF6467 şi hipotermie a sporit efectul tratamentelor unice împotriva ccl2, ccl7, TNF-alfa şi IL-6. Apoi, CHF6467 poate exercita efecte modulatoare majore faţă de răspunsul imunoinflamator evocat de hipoxie-ischemie în creierul imatur al rozătoarelor, iar un astfel de efect nu este redundant atunci când este combinat cu hipotermie.

[0206] Exemplul 4: Cuantificarea CHF6467 în creierul şobolanului

[0207] Metode

[0208] Selecţia peptidelor şi sinteza standardelor cu etichete grele

[0209] Au fost selectate patru peptide care prezintă specificităţi diferite pentru NGF de şobolan CHF6467 şi/sau matur (Tabelul 2) şi omologii lor AQUA (Absolute QUAntification) corespunzători au fost sintetizaţi cu Thermo Scientific.

[0210] Tabelul 2. Peptide NGF selectate pentru detectarea spectrometriei de masă.

Specificitate

Secvenţă

Început

Sfârşit

MWmono

CHF6467, uman

SSSHPIFHR

1

9

1066.531

NR. DE ID. AL SECV. 2

*SSSHPIFHR

(L-Arginină-13C6,15N4 , +10Da)

1076.539

CHF6467

QAAWEFIR

96

103

1019.519

NR. DE ID. AL SECV. 3

*QAAWEFIR

(L-Arginină-13C6,15N4 , +10Da)

1029.527

Nespecific

QYFFETK

51

57

961.455

NR. DE ID. AL SECV. 4

*QYFFETK

(L-lizină-13C6,15N2, +8Da)

969.469

Şobolan

ALTTDDK

89

95

762.376

NR. DE ID. AL SECV. 5

*ALTTDDK

(L-lizină-13C6,15N2, +8Da)

770.390

* Secvenţe îmbogăţite izotopic pentru testul AQUA: izotopi grei (13C6,15N4) pentru arginină şi (13C6,15N2) pentru lizină au fost adăugaţi la ultimul aminoacid, aşa cum este indicat cu font aldin.

[0212] Proceduri experimentale pe animale

[0213] Toate procedurile şi condiţiile care implică animale experimentale au fost revizuite şi aprobate de comitetul local de etică şi autorizate de Ministerul Sănătăţii din Italia (autorizaţia numărul 671/2019-PR). Aşa cum s-a descris anterior (Landucci et al., 2018, Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023.), postnatal ziua 7, puii de şobolan Wistar au fost anesteziaţi cu gaz izofluran (inducţie, 4-5 %; întreţinere, 1-2 %). Artera carotidă comună stângă a fost ligată folosind mătase 4-0 după o incizie mediană. După operaţie, toţi puii au fost returnaţi la femele pentru recuperare şi lactaţie timp de 1 oră. Apoi puii au fost plasaţi în camere de plexiglas închise, ventilate (W20, D20, H17), parţial scufundate într-o baie de apă şi expuse prin flux continuu la gaz încălzit şi umidificat, 8 % oxigen, 92 % azot timp de 120 de minute. După apariţia episodului, puii au fost readuşi la femele timp de 1 oră şi apoi plasaţi într-o cameră la temperaturi normotermice (37 °C) sau hipotermice (32 °C) timp de 4 ore. CHF6467 fost administrat intranazal imediat după terminarea hipoxiei la doze de 40 μg/kg. În plus, unui grup de animale naive care nu au suferit episodul hipoxic-ischemic, li s-a administrat intranazal 40 μg/kg. Toţi puii au fost apoi ţinuţi cu mamele lor şi sacrificaţi prin decapitare 2 ore mai târziu.

[0214] Formularea şi administrarea intranazală CHF6467

[0215] După terminarea hipoxiei, şobolanii au fost plasaţi într-o poziţie în decubit dorsal. CHF6467 (concentraţie 2 mg/ml, soluţie tampon acetat 20 mM, metionină 20 mM, pH 5,5) a fost dizolvată în soluţie salină 0,9 % şi administrată intranazal la doza de 40 μg/kg (4 μl volum total, 2 μl/nară), nări alternante cu un interval de 2 minute între doze.

[0216] Extragerea proteinelor din zonele creierului hipocampal şi cortical

[0217] Probele de creier decongelate sunt păstrate la gheaţă şi se adaugă soluţie tampon de extracţie în raport de 10:1 (v/g) (50 mM ABC + 2 % SDS + cocktail inhibitor de protează dil.500X). Omogenizarea ţesuturilor se realizează prin mărunţire cu bile TissueLyser II, 2 minute la 30/s. Apoi probele sunt păstrate timp de 5 minute la 70 °C şi lăsate să se răcească la temperatura camerei înainte de tratamentul de 15 minute cu 25 U/ml benzonază. Conţinutul de proteine este cuantificat prin testul BCA.

[0218] Digestia proteinelor

[0219] Omogenatele creierului sunt reduse (5 mM DTT, 5 minute la 95 °C) şi alchilate (15 mM IAA, 45 minute la 24 °C pe întuneric). Detergentul este îndepărtat din soluţia tampon de probă prin coloanele de centrifugare Pierce. Apoi se adaugă 20 % ACN la soluţia tampon de digestie înainte de a adăuga tripsină în raport de 1:20 (g/g), 5 ore la 37 °C, urmată de o a doua adăugare de tripsină în raport de 1:20 (g/g) şi incubare peste noapte la 37 °C. Înainte de stingerea reacţiei cu 0,1 % TFA, toate probele sunt dopate cu 1,5 ng/g peptide AQUA.

[0220] Fracţionarea probelor

[0221] Probele digerate sunt fracţionate prin cromatografie de excludere după dimensiune prin sistemul ÄKTA Pure 25M echipat cu o coloană Superdex 30 Increase 3.2/300 şi un colector F9-R, care rulează un gradient liniar de 30 % ACN, 0,1 % TFA.

[0222] Detectare şi cuantificare CHF6467

[0223] Fracţiile SEC selectate sunt colectate, SpeedVac uscat şi resolubilizat în 3 % ACN, 0,1 % TFA înainte de analiza nanoLC-MS printr-un sistem UltiMate™ 3000 RSLCnano cuplat la un spectrometru de masă Orbitrap Fusion™ Lumos™ Trifrid™. NanoLC funcţionează în modul de preconcentrare şi separarea se realizează printr-o coloană EASY-Spray PepMap RSLC C18, 50 cm x 75 µm. Gradientul de fază mobilă este de 5-40 % B în 100 de minute, unde B este de 80 % ACN şi 0,1 % FA. Analiza spectrometriei de masă constă în scanare completă şi obţinere de date PRM temporizată pentru a detecta peptidele CHF6467 de interes şi peptidele lor grele corespunzătoare marcate. Curbele de calibrare provizorii au fost construite pentru a cuantifica nivelurile semnalului CHF6467 în matricea creierului. Un interval de concentraţie de 8 puncte cuprins între 0,09 şi 12 ng/g a fost testat iniţial pentru analiza ţesuturilor de la animale martor, apoi a fost testat un interval de concentraţie de 6 puncte cuprins între 0,06 şi 13,5 ng/g înainte de analiza animalelor HIE.

[0224] Rezultate

[0225] Analiza secvenţei izoformelor NGF naturale, mature, umane şi de şobolan, precum şi varianta CHF6467 i-au determinat pe inventatori să identifice regiuni lungi de omologie, dar şi unele peptide triptice unice (Tabelul 2). Inventatorii au selectat două peptide care, luând în considerare modelul animal din acest studiu, sunt proteotipice ale variantei CHF6467: SSSHPIFHR (m/z 534.265) şi QAAWEFIR (m/z 510.759). Cercetătorii au monitorizat, de asemenea, contribuţia unei peptide care ar putea raporta atât izoformele exogene, cât şi cele endogene: QYFFETK (m/z 481,727, NR. DE ID. AL SECV. 4). În cele din urmă, au identificat o peptidă selectivă pentru şobolan, ALTTDDK (m/z 382.188, NR. DE ID. AL SECV. 5), pentru a raporta în mod specific un potenţial răspuns endogen.

[0226] Inventatorii au testat preliminar distribuţia CHF6467 după administrarea intranazală la şobolanii tineri martor. Această dovadă a principiului a fost efectuată pe un număr mic de probe: trei bulbi olfactivi, doi hipocampi şi două cortexuri cerebrale. CHF6467 a fost detectat în toate probele, oferind dovezi ale capacităţii sale de a pătrunde în zonele de interes ale creierului. Estimările de cuantificare, efectuate pe baza semnalelor peptidice SSSHPIFHR (NR. DE ID. AL SECV. 2) (Figura 10), au arătat că, în medie, câteva sute de picograme pot fi găsite în zonele corticale şi în hipocamp.

[0227] Inventatorii continuă acest studiu cu investigarea gradului de penetrare a creierului CHF6467 administrat intranazal şobolanilor tineri supuşi unei leziuni hipoxic-ischemice (Landucci et al., 2018 Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023.). Ei au analizat cortexul cerebral şi hipocampul de la şase animale, comparând ţesuturile ipsi-laterale şi contra-laterale. Cu excepţia a trei hipocampi laterali ipsi, care au fost pierduţi în timpul pregătirii probei din cauza unei fisuri în tub, CHF6467 a fost detectat în toate probele analizate cu o reproductibilitate echitabilă între replicile probei din aceeaşi zonă (Figura 11). Pe baza tuturor celor trei peptide selectate pentru cuantificare, cantităţile de CHF6467 detectate păreau a fi în afara intervalului de cuantificare testat (0,06 şi 13,5 ng/g), sugerând niveluri mai mici de 60 pg/g în cadrul acestui grup de animale supuse leziuni hipoxic-ischemice.

[0228] Acest studiu demonstrează că CHF6467 poate intra într-adevăr în creier după administrarea intranazală ajungând în hipocamp şi cortexul cerebral, unde îşi poate exercita efectul neuroprotector şi antineuroinflamator împotriva episodului hipoxic-ischemic din creierul imatur al rozătoarelor.

[0229] Spectrometria de masă este un instrument valoros pentru detectarea şi cuantificarea specifică a proteinelor în matricele complexe. În general, datele arată că administrarea intranazală a CHF6467 are ca rezultat niveluri detectabile ale proteinei în zonele relevante ale creierului, în special hipocampul şi cortexul.

Claims (22)

1. O combinaţie a unei polipeptide cu NR. DE ID. AL SECV.: 1 şi hipotermie pentru utilizare în tratarea şi/sau prevenirea leziunii cerebrale traumatice sau a leziunii hipoxice ischemice cerebrale la un subiect mamifer.

2. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 1, în care polipeptida este administrată la o doză de 20 μg/kg.

3. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 1 sau 2, în care leziunea cerebrală traumatică este encefalopatia hipoxică-ischemică.

4. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care subiectul mamifer este un om, preferabil subiectul este un subiect neonatal sau nou-născut sau un subiect nou-născut prematur, preferabil subiectul neonatal sau nou-născut este afectat de encefalopatie hipoxic-ischemică moderată până la gravă.

5. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată intranazal sau în care polipeptida este administrată în mod repetat, preferabil într-o perioadă de la 1 la 30 de zile, preferabil de la 2 la 14 zile.

6. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată în mod repetat între 1 şi 7 ori pe zi sau polipeptida este administrată pe una sau ambele nări.

7. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată la o doză de la 0,01 la 1,00 mg pe zi.

8. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 7, în care polipeptida este administrată la o doză de la 0,06 la 0,12 mg/zi de polipeptidă.

9. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 7, în care polipeptida este administrată la o doză de 0,06 mg/zi.

10. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care, atunci când polipeptida este administrată în mod repetat, fiecare doză este de la 0,01 la 1,00 mg pe zi.

11. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 10, în care fiecare doză este de la 0,06 la 0,12 mg/zi de polipeptidă.

12. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 10, în care fiecare doză este de 0,06 mg/zi.

13. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată în aproximativ de la 1 oră la 24 de ore după leziunea cerebrală.

14. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida menţionată mai sus este cuprinsă într-o compoziţie care cuprinde o soluţie tampon de acetat şi/sau metionină.

15. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată simultan cu hipotermie şi/sau nu mai mult de 24 de ore după hipotermie.

16. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare în care hipotermia trebuie iniţiată în decurs de la 1 oră la 10 ore după problema hipoxic-ischemică (HI), preferabil hipotermia trebuie iniţiată în decurs de la 2 ore la 8 ore după problema hipoxic-ischemică (HI), preferabil hipotermia trebuie iniţiată în decurs de la 4 ore la 6 ore după problema hipoxic-ischemică (HI).

17. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care hipotermia trebuie menţinută într-o perioadă de la aproximativ 1 la aproximativ 72 de ore după episodul hipoxic-ischemic (HI).

18. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 36 °C.

19. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 18, în care temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 35 °C.

20. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată la o doză de la 0,06 la 0,12 mg/zi, iar temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 35 °C.

21. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată la o doză de 20 μg/kg, iar temperatura mamiferului trebuie menţinută la o temperatură de la aproximativ 32 °C la aproximativ 35 °C.

22. Combinaţia pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările anterioare, în care polipeptida este administrată intranazal, iar polipeptida este sub formă de alicote prepreparate, fiecare alicotă fiind conţinută în flacoane sau în seringi predozate adecvate pentru conectarea la sau echipate cu un dispozitiv atomizor mucozal.