LU84604A1

LU84604A1 - METHODS FOR MEASURING THE NUMBER OF BLISTERS PER UNIT OF VOLUME IN BLOOD

Info

Publication number: LU84604A1
Application number: LU84604A
Authority: LU
Inventors: Alois Christian Mencik; Patrick D Oultremont
Original assignee: Conseil Et Realisations Tech S
Priority date: 1983-01-26
Filing date: 1983-01-26
Publication date: 1984-10-24

Description

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MÉMOIRE DESCRIPTIFDESCRIPTIVE MEMORY

DÉPOSÉ A L'APPUI D'UNE DEMANDE DEFILED IN SUPPORT OF A REQUEST FOR

BREVET D'INVENTIONPATENT

FORMÉE PARFORMED BY

“ l ^ pour“L ^ for

Procédés pour mesurer le nombre de plaquettes par unité de volume dans le sang.Methods for measuring the number of platelets per unit volume in the blood.

La présente invention concerne l'analyse hématolo-gique et en particulier la détermination du nombre des plaquettes dans un volume unitaire de S5ang.The present invention relates to haematological analysis and in particular to the determination of the number of platelets in a unit volume of S5ang.

L'analyse hématologique comprend notamment la détermination du nombre et de l'état des éléments figurés du sang, parmi lesquels les plaquettes (thrombocytes) offrent un intérêt particulier dans les phénomènes de coagulation.The hematological analysis includes in particular the determination of the number and the state of the figured elements of the blood, among which the platelets (thrombocytes) offer a particular interest in the phenomena of coagulation.

De façon générale, 1'observation au microscope aIn general, observation under the microscope has

Id'étude des éléments figurés du sang, notamment pour leur· , t numération. L'inconvénient principal des déterminations i effectuées au microscope est qu'elles manquent de rapidité, exigent "beaucoup d'habileté de l’observateur, ont une précision médiocre pour les examens de routine dont les résultats doivent être connus rapidement et se prêtent mal à la vérification.Id study of the figured elements of blood, in particular for their number. The main disadvantage of microscopic determinations is that they lack speed, require "a great deal of skill on the part of the observer, have poor precision for routine examinations, the results of which must be known quickly, and do not lend themselves well to the cheking process.

Il est dès lors évident qu'une technique de mesure dite automatique offre les quatre avantages d'etre plus rapide, plus précise et mieux reproductible et de ne pas requérir un entraînement aussi poussé de l'opérateur.It is therefore obvious that a so-called automatic measurement technique offers the four advantages of being faster, more precise and better reproducible and of not requiring such extensive operator training.

Pour la détermination du nombre des éléments figurés du sang et en particulier des plaquettes dans un volume unitaire de sang, les techniques actuellement appliquées sont des techniques de comptage proprement dit. ^ 'For the determination of the number of the figured elements of blood and in particular of the platelets in a unit volume of blood, the techniques currently applied are counting techniques proper. ^ '

On trouvera ci-après un aperçu des techniques tant visuelles qu'automatiques de détermination du nombre des plaquettes dans le sang. Dans les deux cas, les plaquettes sont d'abord isolées par centrifugation d'un échantillon de sang dans des conditions qui éliminent les globules rouges et blancs qui sont beaucoup plus volumineux. Après centri- . . · O.-.r fugation, on dispose ainsi d'un plasma riche en plaquettes (PEP) qui est utilisé pour la numération plaquettaire.Below is an overview of both visual and automatic techniques for determining the number of platelets in the blood. In both cases, the platelets are first isolated by centrifugation of a blood sample under conditions that remove the much larger red and white blood cells. After centri-. . · O .-. R fugation, so we have a platelet rich plasma (PEP) which is used for platelet count.

Suivant la technique visuelle, dite aussi parfois mamelle, on examine au microscope à contraste de phase un dépôt de plasma riche en plaquettes dilué sur une lame de verre et on compte le nombre des-plaquettes par unité de surface. Le diamètre moyen d'une plaquette, est de 2 à 3 microns et connaissant la surface couverte par l'échantillon de ce plasma riche en plaquettes sur la lame de verre, on peut évaluer le nombre de plaquettes par unité de volume du plasma ricb^ en plaquettes et dès lors du sang complet. / I * ., / 1 Cette technique en principe simple est largement appliquée·According to the visual technique, also sometimes called udder, a plasma-rich plasma deposit diluted on a glass slide is examined under a phase contrast microscope and the number of platelets per unit area is counted. The average diameter of a wafer is 2 to 3 microns and knowing the area covered by the sample of this plasma rich in platelets on the glass slide, we can assess the number of platelets per unit volume of plasma ricb ^ in platelets and therefore whole blood. / I *., / 1 This basically simple technique is widely applied ·

Toutefois, elle présente tous les inconvénients déjà mentionnés à propos des observations au microscope·However, it has all the drawbacks already mentioned about microscopic observations ·

Les techniques automatiques se ramènent au comptage conductimétrique et comptage électro-optique·Automatic techniques are reduced to conductimetric counting and electro-optical counting ·

Le comptage conductimétrique des particules est effectué sur le plasma riche en plaquettes dilué environ 3-000 fois, qui est pompé dans une cellule présentant un étranglement percé d'un trou de quelques microns de diamètre. La conductivité électrique de la solution pompée dans la 1 cellule est mesurée au droit de l'étranglement et chaque fois qu'une particule, en l'occurrence une plaquette, traverse le trou de l'étranglement, la conductivité varie brusquement. L'impulsion traitée adéquatement actionne ,un compteur électronique qui affiche directement le nombre de plaquettes par unité de volume de la solution qu'on a fait s'écouler.The conductimetric particle counting is carried out on platelet-rich plasma diluted approximately 3-000 times, which is pumped into a cell having a throttle pierced with a hole a few microns in diameter. The electrical conductivity of the solution pumped into the 1 cell is measured at the level of the throttle and each time a particle, in this case a wafer, crosses the hole in the throttle, the conductivity varies suddenly. The properly processed pulse activates an electronic counter that directly displays the number of platelets per unit volume of the solution that has been dispensed.

Pour le comptage électro-optique, le plasma riche en plaquettes est dilué aussi et pompé dans une cellule éclairée par un faisceau lumineux. Lorsque le milieu ne contient pa's de particules en suspension;, le faisceau fié' subit pas de diffusion dans la solution. Par contre, au passage des particules dans la cellule, celles-ci interceptent le faisceau et en diffusent la lumière. La lumière diffusée est reçue dans un dispositif photosensible judicieusement disposé. Chaque particule% en l'occurrence »chaque plaquette, donne donc lieu à une impulsion lumineuse, qui peut être comptée électroniquement.For electro-optical counting, the plasma rich in platelets is also diluted and pumped into a cell lit by a light beam. When the medium does not contain particles in suspension, the fied beam does not undergo diffusion in the solution. On the other hand, when the particles pass through the cell, they intercept the beam and scatter the light. The scattered light is received in a judiciously arranged photosensitive device. Each particle% in this case "each plate, therefore gives rise to a light pulse, which can be counted electronically.

Ces deux techniques automatiques offrent donc les avantages déjà indiqués sur la technique visuelle, mais un de leurs inconvénients est que la nature des corpuscules ! -Λ I de globules rouges ou blancs peuvent être comptés comme I étant des plaquettes.These two automatic techniques therefore offer the advantages already indicated on the visual technique, but one of their disadvantages is that the nature of the corpuscles! -Λ I of red or white blood cells can be counted as I being platelets.

I Certains inconvénients sont aussi propres à toutes I les techniques actuelles de numération des plaquettes. En I effet, le plasma riche en plaquettes est dilué adéquatement I pour la conduite de la mesure, mais l’extrême sensibilité I' des plaquettes à l’état du milieu dans lequel elles se I trouvent en suspension fait que la simple dilution du plasma I riche en plaquettes (généralement avec de la solution phy- I siologique isotonique) provoque fréquemment une agrégation I des plaquettes qui fausse les mesures. Pour cette raison, I la précision relative (reproductibilité) excède rarement 10% I dans les différentes techniques automatiques indiquées I ci-dessus. Un autre inconvénient décisif de ces techniques I de mesure est leur caractère destructif puisque 1 ’-échantil-.I Some disadvantages are also unique to all I current platelet count techniques. In fact, the platelet-rich plasma is adequately diluted I for carrying out the measurement, but the extreme sensitivity I 'of the platelets to the state of the medium in which they are I suspended means that the simple dilution of the plasma I rich in platelets (usually with isotonic physiological I solution) frequently causes aggregation I of platelets which falsifies the measurements. For this reason, I the relative precision (reproducibility) rarely exceeds 10% I in the various automatic techniques indicated I above. Another decisive drawback of these measurement techniques I is their destructive nature since 1 ’- sample-.

I Ion de plasma riche en plaquettes, qui a servi au comptage, I ne peut plus être utilisé pour d’autres déterminations bio- I chimiques, ce qui constitue souvent un inconvénient très I grave. Enfin, il y a lieu de rappeler que les compteurs I automatiques de plaquettes actuellement disponibles dans le I commerce sont relativement onéreux (environ 200.000 francs I belges pour un appareil simple) et délicats à manipuler-.I Ion of platelet-rich plasma, which was used for counting, I can no longer be used for other biochemical determinations, which is often a very serious drawback. Finally, it should be recalled that the automatic platelet counters I currently available on the market are relatively expensive (around 200,000 Belgian francs I for a simple device) and delicate to handle.

I II serait donc de manière évidente intéressant I de disposer d’un moyen pour déterminer le nombre des pla- I quettes par unité de volume du sang qui offre le triple 1' avantage de ne pas détruire le plasma riche en plaquettes I. en ne le- diluant pas, d'assurer une précision relative I (reproductibilité) d'au moins 1% et de se prêter à une exê^ I cution automatique, simple et peu onéreuse.I It would therefore obviously be advantageous to have a means of determining the number of platelets per unit volume of blood which offers the triple advantage of not destroying the plasma rich in platelets. the diluent not, to ensure a relative precision I (reproducibility) of at least 1% and to lend itself to an automatic execution, simple and inexpensive.

I Du fait que·le plasma riche en plaquettes comprend I une phase dispersée (à savoir les. plaquettes) dont la den- I sité optique est^nettement différente "de Celle de la phase / continue, il semblerait évident d'évaluer la densité numérique des plaquettes par photométrie, puisque celle-ci se prête particulièrement au dosage de constituants qu'il est difficile ou indésirable de séparer de leur milieu. Néanmoins, les techniques photométriques, malgré leurs avantages bien connus, n’ont encore pas été appliquées à la numération des plaquettes dans les laboratoires d'analyses cliniques. En effet, ceux-ci sont équipés pour la conduite d’un certain nombre d'analyses types et leur matériel ne permet pas l'étude photométrique dans des conditions où' on peut obtenir un signal représentatif du nombre des plaquettes, à l'exclusion sensible du nombre de corps étrangers qui contribuent à la densité optique· Pour cette raison, la découverte des conditions dans lesquelles la numération des plaquettes est possible par mesure photométrique globale constitue un progrès technique important dans le domaine de l'analyse hématologique.I Because · the platelet-rich plasma includes I a dispersed phase (ie, the platelets) whose optical density is ^ markedly different "from that of the continuous / phase, it would seem obvious to assess the density numerical platelet photometry, since it is particularly suitable for the determination of constituents that it is difficult or undesirable to separate from their medium. Nevertheless, photometric techniques, despite their well known advantages, have not yet been applied to the platelet count in clinical analysis laboratories. Indeed, these are equipped for the conduct of a certain number of standard analyzes and their material does not allow photometric study under conditions where 'one can obtain a signal representative of the number of platelets, with the substantial exclusion of the number of foreign bodies that contribute to optical density · For this reason, the discovery of the conditions under which the platelet count is possible by global photometric measurement constitutes an important technical progress in the field of hematological analysis.

L' examen spectroscopique du plasma contenant des plaquettes révèle premièrement que l'atténuation du faisceau incident par les plaquettes est maximale quand l'observation est effectuée dans l'infrarouge, à savoir entre 7Q0 et 50.000 nm, domaine dans lequel les grosses molécules, les colloïdes du plasma et diverses entités que le plasma renferme en cas de* maladie ne brouillent guère le signal par effet Tyndall, et deuxièmement que le contraste est maximal quand l'absorbance de 1'échantillon est modérée, c'est-à-dire quand la cellule est mince (en pratique a une épaisseur de .0,1 à 3 mm) pour du plasma riche en plaquettes non dilué.Spectroscopic examination of the plasma containing platelets first reveals that the attenuation of the incident beam by the platelets is maximum when the observation is carried out in the infrared, namely between 7Q0 and 50,000 nm, the domain in which the large molecules, the colloids of the plasma and various entities that the plasma contains in the event of disease do not scramble the signal by Tyndall effect, and secondly that the contrast is maximum when the absorbance of the sample is moderate, that is to say when the cell is thin (in practice has a thickness of .0.1 to 3 mm) for undiluted platelet-rich plasma.

La numération des plaquettes du sang par photométrie peut ainsi être effectuée dans des conditions où l'atténuation due aux plaquettes elles-mêmes est maximale, c'est-à-dire où le signal est maximal, et où le bruit de / fond (dû aux*signaux parasites) est minimal, de aorte que le/ I rapport signal/fond est le plus favorable possible.The platelet count by photometry can thus be carried out under conditions where the attenuation due to the platelets themselves is maximum, that is to say where the signal is maximum, and where the background noise (due to * spurious signals) is minimal, aorta that the / I signal / background ratio is as favorable as possible.

* ' * * t* L'invention a donc pour objet des procédés pour mesurer le nombre de plaquettes par unité de volume dans le sang qui permettent la détermination de ce nombre sans comptage individuel des plaquettes, qui n'entraînent aucune altération de celles-ci et qui sont effectués dans l'infrarouge Les procédés de l'invention sont applicables dans leur principe dans toutes les circonstances où les plaquettes Tse trouvent dans un état dans lequel elles peuvent donner lieu à un signal représentatif de leur nombre à l'exclusion sensible du nombre des autres corps participant à la densité • op,tiqué, cet état étant atteint par un traitement qui consiste soit dans un fractionnement par voie mécanique, comme la centrifugation, soit dans une altération sélective par voie chimique, comme la lyse des globules rouges.* '* * t * The invention therefore relates to methods for measuring the number of platelets per unit of volume in the blood which allow the determination of this number without individual counting of the platelets, which do not cause any alteration thereof. ci and which are carried out in the infrared The methods of the invention are applicable in principle in all circumstances where the Tse platelets are in a state in which they can give rise to a signal representative of their number excluding sensitive of the number of other bodies participating in the density • op, ticked, this state being reached by a treatment which consists either in a mechanical fractionation, like centrifugation, or in a selective alteration by chemical way, like the lysis of red blood cells .

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Dans les dessins : la Fig. 1 illustre le principe de comptage des plaquettes sanguines par absorption du rayonnement infrarouge, après séparation des globules rouges et blancs par voie mécanique , en 1 ' occurrence par centrifugation,dans le premier procédé; la Fig. 2 illustre le dispositif de comptage des plaquettes sanguines par absorption du rayonnement infrarouge, dans le premier procédé; la Fig. 3 est un diagramme montrant la linéarité de la réponse en fonction de la concentration en plaquettes, dans le.premier procédé; la Fig. est une vue schématique illustrant le - -· ‘ ï principe du second procédé, et la Fig. 5 est un diagramme montrant la linéarité de corrélation avec une autre technique de mesure.In the drawings: FIG. 1 illustrates the principle of counting blood platelets by absorption of infrared radiation, after separation of the red and white blood cells by mechanical means, in 1 instance by centrifugation, in the first method; Fig. 2 illustrates the device for counting blood platelets by absorption of infrared radiation, in the first method; Fig. 3 is a diagram showing the linearity of the response as a function of the platelet concentration, in the first process; Fig. is a schematic view illustrating the - - · procédé ï principle of the second method, and FIG. 5 is a diagram showing the linearity of correlation with another measurement technique.

Le principe de mesure dans le premier procédé est / le-suivant .(Fig. 1). ; ·. χ-'* /y (i) L'échantillon de sang frais 1, par exemple de l'or-* dre de 10 ml, est additionné d'environ 1 ml d'une solution de' citrate trisodique 0,13 M comme anticoagulant, puis est soumis à la centrifugation 2 à 200 g pendant environ 10 minutes pour donner, d'une part, une fraction légère, qui est le plasma sanguin riche en plaquettes 3 (ERP) et, d'autre part, une fraction lourde ou culot *+ contenant principalement les ; globules rouges.The measurement principle in the first process is / the following (Fig. 1). ; ·. χ - '* / y (i) The fresh blood sample 1, for example of the order of 10 ml, is added with approximately 1 ml of a solution of 0.13 M trisodium citrate as anticoagulant, then is subjected to centrifugation 2 at 200 g for approximately 10 minutes to give, on the one hand, a light fraction, which is blood plasma rich in platelets 3 (ERP) and, on the other hand, a heavy fraction or pellet * + containing mainly; Red cells.

(ii) Un volume V de cette fraction légère, par çxemple d'environ 2 à 3 ml» est prélevé hors de l'éprouvette et aspiré par la pompe 6 à travers l'appareil de comptage des plaquettes avec un déhit de l'ordre de 0,1 cm^ par seconde· (iii) Le comptage des plaquettes est réalisé par mesure de l'atténuation du faisceau infrarouge causée par la pré-(ii) A volume V of this light fraction, for example about 2 to 3 ml, is taken from the test tube and sucked by pump 6 through the platelet counting device with a dehit of the order 0.1 cm ^ per second · (iii) Platelet counting is done by measuring the attenuation of the infrared beam caused by the pre-

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sence du plasma riche en plaquettes circulant dans la cellule. Une fraction de l'atténuation résulte de la présence des plaquettes elles-mêmes et le reste de l'atténuation est la conséquence de la présence du plasma (appelé blanc). L'atténuation résultant de la présence du plasma constitue le bruit de fond. On peut déterminer le bruit de fond en faisant circuler dans la cellule soit du plasma pauvre en plaquettes ult- provenant du même sang qu' on obtient en centrifugeant un échantillon de sang pendant environ 10 minutes à 2.000 g, soit un plasma étalon. On obtient ainsi un plasma pauvre en plaquettes (PPP), qui est la fraction légère.of platelet-rich plasma circulating in the cell. A fraction of the attenuation results from the presence of the platelets themselves and the rest of the attenuation is the consequence of the presence of the plasma (called white). The attenuation resulting from the presence of the plasma constitutes the background noise. The background noise can be determined by circulating in the cell either platelet-poor plasma from the same blood as obtained by centrifuging a blood sample for about 10 minutes at 2,000 g, or a standard plasma. This results in a platelet-poor plasma (PPP), which is the light fraction.

Le signal émis par le détecteur infrarouge est proportionnel à l'intensité incidente. Par un traitement 1 · j ·' * approprie, il permet donc d'apprécier le nombre de plaquettes par unité de volume· • Le dispositif.de comptage 5 opère dans l'infrarouge / pour les raisons qui ont déjà été indiquées et comporte trois/ éléments (voir Fie. 2) j v / y I- une cellule 7 d'un volume d'environ 0,1 em^ et d'une êpais-. seur d'environ 1 mm, transparente aux rayons infrarouges, dans laquelle circule le PHP lorsqu'il est aspiré de 1'éprouvette par la pompe 6; - une source de rayonnement infrarouge ou émetteur 8, qui peut être une photodiode dont l'émission est, en l'occurrence, centrée sur une longueur d'onde de 900 à 1.000 nm, ou un émetteur LASER; - un capteur de rayonnement infrarouge 9 (élément photosensible) destiné à recevoir le rayonnement de la source infrarouge et transmis à la cellule transparente où circule le PRP. L'alignement des trois éléments est tel que l'ouverture du faisceau infrarouge ne dépasse par d'angle lorsqu'il est intercepté par le capteur.The signal emitted by the infrared detector is proportional to the incident intensity. By a suitable 1 · d · * treatment, it therefore makes it possible to assess the number of platelets per unit of volume · • The counting device 5 operates in the infrared / for the reasons which have already been indicated and comprises three / elements (see Fie. 2) jv / y I- a cell 7 with a volume of about 0.1 em ^ and a thick-. about 1 mm, transparent to infrared rays, in which the PHP circulates when it is drawn from the test tube by pump 6; a source of infrared radiation or emitter 8, which can be a photodiode, the emission of which is, in this case, centered on a wavelength of 900 to 1,000 nm, or a LASER emitter; - an infrared radiation sensor 9 (photosensitive element) intended to receive radiation from the infrared source and transmitted to the transparent cell where the PRP circulates. The alignment of the three elements is such that the opening of the infrared beam does not exceed any angle when it is intercepted by the sensor.

On trouvera ci-après un exemple d'application.du procédé de mesure.An example of an application of the measurement method is given below.

(a) On prépare un échantillon de PRP de l'ordre de 2 à 3 ml par centrifugation à environ 200 g pendant environ 10 minutes d'un échantillon d'environ 5 ml de sang frais anticoagulé; (h) on prépare un échantillon de l'ordre de 1 ml-ude PPP par centrifugation à environ 2.000 g pendant environ 10 minutes d'un échantillon d'environ 5 ml du même sang frais anticoagulé; (c) on pompe environ 2 ml de PRP à travers la cellule de comptage au déhit d'environ 0,1 cm^ par seconde et on mesure la transmission du rayonnement infrarouge au travers Λ du PRP; le résultat S est stocké en mémoire; ’ (d) facultativement, on pompe un agent de rinçage à travers la cellule pendant environ 1 minute; (e) on pompe dans la cellule de comptage environ 2 ml(a) A PRP sample of the order of 2 to 3 ml is prepared by centrifugation at approximately 200 g for approximately 10 minutes from a sample of approximately 5 ml of anticoagulated fresh blood; (h) a sample of the order of 1 ml-PPP ude is prepared by centrifugation at approximately 2,000 g for approximately 10 minutes from a sample of approximately 5 ml of the same fresh anticoagulated blood; (c) pumping approximately 2 ml of PRP through the dehit counting cell of approximately 0.1 cm ^ per second and measuring the transmission of infrared radiation through Λ of the PRP; the result S is stored in memory; ’(D) optionally, a flushing agent is pumped through the cell for about 1 minute; (e) about 2 ml are pumped into the counting cell

Iest stocké en mémoire; (f ) un calculateur établit la valeur N = (S - B) x K où K est un facteur multiplicatif caractéristique de l'appareil photosensible et Έ est le nombre dé plaquettes par unité de volume (habituellement le microlitre) de l'échantillon de sang analysé. Le facteur K s’obtient évidemment par calibrage de l'appareil.It is stored in memory; (f) a computer establishes the value N = (S - B) x K where K is a multiplicative factor characteristic of the photosensitive device and Έ is the number of platelets per unit of volume (usually the microliter) of the sample of blood analyzed. The K factor is obviously obtained by calibrating the device.

La série des résultats de mesure ci-après illustre la technique typique de calibrage de l'instrument et la précision obtenue·The series of measurement results below illustrates the typical instrument calibration technique and the accuracy obtained ·

Pour cette série de mesures, on a utilisé un échantillon de sang contenant, comme on peut l'apprécier par voie visuelle, **97-000 plaquettes par microlitre. Cette valeur est arbitrairement retenue dans le présent exemple comme point de calage de la droite d'étalonnage (voir Pig. 3)· Cette droite établit la relation entre la concentration en plaquettes du plasma riche en plaquettes et la valeur numérique du signal de sortie de l'appareil de mesure. En l'occurrence,For this series of measurements, a blood sample was used containing, as can be appreciated visually, ** 97-000 platelets per microliter. This value is arbitrarily retained in the present example as the calibration point of the calibration line (see Pig. 3). This line establishes the relationship between the concentration of platelets in the platelet-rich plasma and the digital value of the output signal of the measuring device. As it happens,

* I* I

une concentration de 100% correspond à **97-000 plaquettes par microlitre et à une valeur numérique du signal de **.801 - 23 (dispersion pour 10 mesures). Π5a concentration of 100% corresponds to ** 97-000 platelets per microliter and to a numerical value of the signal of **. 801 - 23 (dispersion for 10 measurements). Π5

On dilue ensuite pour l'étalonnage le plasma riche eu plaquettes dans du plama pauvre en plaquettes provenant du même sang (pour éliminer autant que possible les causes d'agrégation des plaquettes ) pour établir des concentrations de 90%, 1*5% et **'0%. La numération des plaquettes par voie - ·· î ‘ » visuelle et par mesure dans l'infrarouge conduit aux résul-, tais suivants: λPlatelet-rich plasma is then diluted for calibration in platelet-poor plasma from the same blood (to eliminate as much as possible the causes of platelet aggregation) to establish concentrations of 90%, 1 * 5% and * * '0%. The platelet count by visual means and by infrared measurement leads to the following results: λ

I TABLEAU II TABLE I

Echantillon 'Numération visuelle Numération dans (plaquettes/micro-· l'infrarouge ...... litres) (niveau de signal) PEP 100% *+97-100 *+.801 ± 23 PRP 90% 398.115 *+.*+71 ± 15 PEP *+5% 2l6.9*+5 2.528 ± 20 PEP *+0% 188.9*+0 2.115 1 31 PPP (-blanc) 20.820 306 - 21Sample 'Visual counting Counting in (platelets / infrared ...... liters) (signal level) PEP 100% * + 97-100 * +. 801 ± 23 PRP 90% 398.115 * +. * +71 ± 15 PEP * + 5% 2l6.9 * + 5 2.528 ± 20 PEP * + 0% 188.9 * + 0 2.115 1 31 PPP (-white) 20.820 306 - 21

Pour simplifier l'interprétation des niveaux de signal dans la troisième colonne, on indique simplement pour chaque échantillon la valeur médiane entre le maximum et le minimum pour 10 mesures, par exemple *+.801 entre un minimum de *+.778 et un maximum de *+.82*+.To simplify the interpretation of the signal levels in the third column, we simply indicate for each sample the median value between the maximum and the minimum for 10 measurements, for example * +. 801 between a minimum of * +. 778 and a maximum from * +. 82 * +.

Il convient de remarquer que la valeur du signal pour le plasma pauvre en plaquettes n'est pas du^tout pro·^- portionnelle à la densité plaquettaire de ce plasma pauvre en plaquettes. Cela tient au fait que le signal résulte non seulement de l'absorption infrarouge dans le plasma pauvre en plaquettes, mais aussi par les parois de la Cellule de mesure. En soustrayant ce signal des résultats de la mesure sur le plasma riche en plaquettes à 100%, 90%, *+5% et *+0%, on obtient le signal met pour les mesures, qui a les Valeurs suivantes.It should be noted that the signal value for the platelet-poor plasma is not at all proportional to the platelet density of this platelet-poor plasma. This is due to the fact that the signal results not only from infrared absorption in the platelet-poor plasma, but also through the walls of the measuring cell. By subtracting this signal from the results of the measurement on the platelet rich plasma at 100%, 90%, * + 5% and * + 0%, we obtain the met signal for the measurements, which has the following values.

TABLEAU IITABLE II

' ' Echantillon Numération dans 1'infrarouge _____ (niveau de signal net) . PEP 100% *+.*+95 PRP 90% *' *+.165 PRP *+5% 3.222 ERP *+0% 1.809 PPP (blanc) 0 ♦ . *'' Infrared Scan Sample _____ (net signal level). PEP 100% * +. * + 95 PRP 90% * '* +. 165 PRP * + 5% 3.222 ERP * + 0% 1.809 PPP (white) 0 ♦. *

Ce signal net est bien une fonction linéaire de la concentra- I Néanmoins, les cellules minces exposent à quelques inconvénients propres, par exemple l'importance des forces, ; de capillarité et les difficultés de nettoyage, auxquels s'ajoutent une valeur défavorable du rapport surface-.volume* D'autre part, la grande précision atteinte avec le premier procédé ne paraît pas toujours nécessaire pour l'évaluation d'une grandeur qui présente de fortes différences entre des individus en bonne santé.This net signal is indeed a linear function of the concentra- I Nevertheless, the thin cells expose to some inherent disadvantages, for example the importance of the forces,; capillarity and cleaning difficulties, to which are added an unfavorable value of the surface-to-volume ratio. On the other hand, the high precision achieved with the first process does not always seem necessary for the evaluation of a quantity which has strong differences between healthy individuals.

Pour ces différentes raisons, la Demanderesse a mis au point un second procédé, suivant lequel la mesure est effectuée directement dans un tube de centrifugeuse en verre siliconé d'un diamètre de l'ordre de 6 mm.For these various reasons, the Applicant has developed a second method, according to which the measurement is carried out directly in a centrifuge tube made of silicone glass with a diameter of the order of 6 mm.

Le procédé met en jeu trois opérations "interdépendantes exécutées dans des conditions précises.The method involves three "interdependent operations executed under specific conditions.

1. Centrifugation.1. Centrifugation.

2. Mesure turbidimétrique- 3· Mesure du rapport des volumes de la fraction lourde et de la fraction légère après centrifugation.2. Turbidimetric measurement - 3 · Measurement of the ratio of the volumes of the heavy fraction and the light fraction after centrifugation.

En particulier, pour la centrifugation, l'échantillon de sang frais anticoagulé, dont le volume est en général de 0,5 à 1,0 ml, mais qui peut tomber à 0,2 ml, est.fractionné par centrifugation en une fraction légère, qui uest le plasma riche en plaquettes (ERP), et une fraction lourde contenant principalement les globules rouges et blancs. Bien qu'en principe la centrifugation puisse être exécutée à petite vitesse, mais longtemps (par exemple avec une accélération de 30 à 200 g pendant 30 à. ^û, minutes) ou à grande vitésse et rapidement (par exemple avec une accélération de 1.000 à 2.000 g pendant *H) à 180 secondes), la vitesse de rotation n'est pas indifférente parce qu'elle détermine pour beaucoup la durée totale du cycle de mesure. En pratique, le choix, est fondé principalement sur des critères économiques duIn particular, for centrifugation, the anticoagulated fresh blood sample, the volume of which is generally 0.5 to 1.0 ml, but which can drop to 0.2 ml, is activated by centrifugation in a light fraction. , which is platelet-rich plasma (ERP), and a heavy fraction containing mainly red and white blood cells. Although in principle centrifugation can be performed at low speed, but for a long time (for example with an acceleration of 30 to 200 g for 30 to. ^ Û, minutes) or at high speed and quickly (for example with an acceleration of 1,000 at 2,000 g for * H) at 180 seconds), the speed of rotation is not indifferent because it largely determines the total duration of the measurement cycle. In practice, the choice is based mainly on economic criteria of

Idu fait que le prix des centrifugeuses augmente pour les i i 1 · ' ^ ! • ‘ grandes -vitesses de rotation. Un autre paramètre dont il y: a lieu de tenir compte est qu'il existe une relation particulière entre la densité optique du plasma et le nombre des plaquettes par unité de volume du sang pour chaque couple d'accélération et de durée de centrifugation. Par exemple, une centrifugation de 30 minutes à 200 g dans des tubes en verre siliconé d'un diamètre intérieur de 6 mm permet d'établir une relation linéaire entre la turbidité du plasma, mesurée comme précité ci-après, et le nombre des plaquettes par unité de volume du sang total, compte tenu du rapport entre le volume du plasma et le volume du sang total.Idu fact that the price of centrifuges increases for i i 1 · '^! • ‘high rotation speeds. Another parameter to be taken into account is that there is a particular relationship between the optical density of the plasma and the number of platelets per unit volume of blood for each couple of acceleration and duration of centrifugation. For example, a centrifugation of 30 minutes at 200 g in silicone glass tubes with an internal diameter of 6 mm makes it possible to establish a linear relationship between the turbidity of the plasma, measured as mentioned above, and the number of platelets per unit volume of whole blood, taking into account the ratio of the volume of plasma to the volume of whole blood.

Pour la mesure de la densité optique, l’a cuvette contenant le sang centrifugé est amenée dans le système de mesure turbidimétrique de façon que la couche légère du sang intercepte le faisceau de mesure, le signal analogique de l’appareil est converti par un système de conversion analo-gique-numérique en une indication numérique DX représentative de la densité optique du plasma.For the measurement of optical density, the cuvette containing the centrifuged blood is brought into the turbidimetric measurement system so that the light layer of blood intercepts the measurement beam, the analog signal of the device is converted by a system of analog-digital conversion into a digital indication DX representative of the optical density of the plasma.

lu fait que la densité optique du plasma est connue et qu'il en est donc de même du nombre de plaquettes par unité de volume du plasma, il faut déterminer encore le nombre de plaquettes par unité de volume du sang total, soit DY. A cette fin, il suffit de mesurer le rapport R entre le volume du plasma et le volume du sang total. Cette mesure peut être effectuée automatiquement à l'aide d’un système de balayage classique qui détermine la hauteur de l'interface entre la fraction lourde (rouge et opaque) et la fraction légère (jaunâtre et translucide), soit simplement par apposition d'une réglette graduée. ‘In view of the fact that the optical density of plasma is known and that the same is true of the number of platelets per unit volume of plasma, the number of platelets per unit volume of whole blood must also be determined, ie DY. To this end, it suffices to measure the ratio R between the volume of the plasma and the volume of the whole blood. This measurement can be performed automatically using a conventional scanning system which determines the height of the interface between the heavy fraction (red and opaque) and the light fraction (yellowish and translucent), either simply by affixing a graduated scale. ‘

Enfin, le nombre N de plaquettes par unité de volume^ du sang est donné par la relation ; , a JFinally, the number N of platelets per unit volume of blood ^ is given by the relation; , to J

IN = a + b. DY = a + b.R.DXIN = a + b. DY = a + b.R.DX

-•Lj où a et "b sont les constantes propres de l'appareil qui 1 permettent de convertir DY en un nombre de plaquettes par unité de volume du sang, habituellement le microlitre. Les constantes a et b s'obtiennent par étalonnage de l'appareil, par exemple avec du plasma dont la teneur en plaquettes est connue·- • Lj where a and "b are the device's own constants which 1 convert DY into a number of platelets per unit volume of blood, usually the microliter. The constants a and b are obtained by calibrating l device, for example with plasma of known platelet content ·

La mesure de la densité optique est effectuée au moyen d'un dispositif tel que schématisé à la Fig. qui montre comment le plasma riche en plaquettes 10 surmontant le culot 11, constitué principalement par des globules rouges, est inséré dans le trajet optique délimité par deux collimateurs 12 qui délimitent le faisceau de lumière infrarouge 13 émis par la source infrarouge l*f et atteignant le récepteur infrarouge 15· Pour un tube de centrifugeuse d'un-, diamètre, intérieur de l'ordre de 6 mm, un faisceau étroitement colli-maté, dont le diamètre est inférieur à 2 mm, convient. Le rayonnement infrarouge, d'une longueur d'onde de 700 à 50.000 nanomètres, est émis par une diode semi-conductrice ou par un générateur de rayonnement laser. Le détecteur au moyen duquel l'intensité du faisceau transmis est mesurée est un dispositif photosensible semi-conducteur (photodiode) ou un tube photomultiplicateur, mais peut être remplacé par tout autre élément sensible équivalent.The measurement of the optical density is carried out by means of a device as shown diagrammatically in FIG. which shows how the platelet-rich plasma 10 surmounting the pellet 11, consisting mainly of red blood cells, is inserted into the optical path delimited by two collimators 12 which delimit the beam of infrared light 13 emitted by the infrared source l * f and reaching the infrared receiver 15 · For a centrifuge tube of one-, diameter, interior on the order of 6 mm, a closely collimated beam, the diameter of which is less than 2 mm, is suitable. Infrared radiation, with a wavelength of 700 to 50,000 nanometers, is emitted by a semiconductor diode or by a laser radiation generator. The detector by means of which the intensity of the transmitted beam is measured is a semiconductor photosensitive device (photodiode) or a photomultiplier tube, but can be replaced by any other equivalent sensitive element.

Le procédé décrit ci-dessus a fait l'objet d'expériences dans une grande gamme de conditions de centrifugation. Seules certaines de ces conditions, conduisent à une relation linéaire entre la densité optique DX du plasma et le nombre N de plaquettes par microlitre de sang, obéissant à la relation „ indiquée ci-dessus.The process described above has been tested in a wide range of centrifugation conditions. Only some of these conditions lead to a linear relationship between the optical density DX of the plasma and the number N of platelets per microliter of blood, obeying the relationship „indicated above.

•A titre de comparaison, les mesures ont été effec- , tuées non seulement par le prpc£dé de l1 inventiont maie, égBlet , • ment à l'aide de l'appareil HET1AL0G-D de la Société Technicon (Etats-Unis d'Amérique) qui est -à ce jour considéré comme: l'un des meilleurs disponibles dans ce domaine.• By way of comparison, the measurements were carried out not only by the method of the invention, but also with the aid of the HET1AL0G-D apparatus of the Technicon company (United States of America). 'America) which to date is considered to be one of the best available in this field.

Les résultats relatifs à 23 sangs humains différents sont présentés àu Tableau III et reportés en diagramme à la Eig. Les conditions opératoires sont les suivantes : a. prélèvement de 10 cm-3 de sang à la veine cubitale au moyen d'une seringue sous vide de type ‘'VENOJECT" contenant l'agent anticoagulant (éthylènediaminetétraacétate de sodium); 3 b. utilisation de 1 cmJ du sang pour compter les plaquettes par le procédé de l'invention et du volume restant aux mêmes fins au moyen de l'appareil HEMALOG-L.The results relating to 23 different human bloods are presented in Table III and plotted in diagram at Eig. The operating conditions are as follows: a. 10 cm-3 blood sample taken from the ulnar vein using a "VENOJECT" type vacuum syringe containing the anticoagulant agent (sodium ethylenediaminetetraacetate); 3 b. using 1 cmJ blood to count platelets by the process of the invention and the volume remaining for the same purpose by means of the HEMALOG-L apparatus.

Le tableau rassemble les résultats numériques. de£ mesures obtenues dans les deux cas. . ’ ‘ // ' \ - ar? i Λ » , > · X . ' * · I * ‘ ' TABLEAU III ï > Résultats de numération des plaquettes dans 23 sangs humains différents et comparaison entre les résultats . obtenus par le procédé de l'invention et ceux obtenus avec l'appareil HEMALOG—D. les résultats des deux dernières colonnes sont exprimés en milliers de plaquettes par microlitre de sang.The table collects the numerical results. of £ measurements obtained in both cases. . ’‘ // '\ - ar? i Λ ”,> · X. '* · I * ‘' TABLE III ï> Results of platelet count in 23 different human blood and comparison between the results. obtained by the process of the invention and those obtained with the HEMALOG-D apparatus. the results of the last two columns are expressed in thousands of platelets per microliter of blood.

Echantillon Rapport R DX DY = R.DX Mesures ïï = a + b .KSample Report R DX DY = R.DX Measures ïï = a + b .K

HEMALOG-DHEMALOG-D

1 0,578 370 2ib 6o 59 2 0,619 ^80 297 8 0 85 3 0,625 7¾ ^66 128 139 b 0,5^5 1636 892 292 2?b 5 0,6^5 1080 697 225 212 6 0,523 1030 539 171 162 7 0,515 I870 963 278 .296 8 0,600 1990 119^ 3^5 ‘ ’ 369 9 0,651 1580 1029 305 317 10 0,557 l*+00 " 78Ο 220 238 11 0,697 690 bQl 1 b7 1¾ 12 0,536 166 0 89 0 2*f2 273 13 0,785 ^9½ 388 1¾ llb lb 0,6l5 9^0 578 171 17^' 15 0,706 21^0 1511 ^67 ^70 16 ' .0,573 1396 800 2b8 2^5 17 0,576 2326 13^0 b$b bi$ 18 0,662 1036 686 20b 209 . 19. 0,377 736 277 , 79 79 -.20 0,657 *+96 '326 9^ 95 21 0,701 630 bb2 126 131 22 : 0,55^ 1^86 823 268 252 23 0,5¾ 1360 736 ' 2b$ 22b I Λ. / fi « L'analyse par les moindres carrés donne, pour les paramètres a et b, les valeurs de 27,002 et de 3,160, res-· pectivement. i1 0.578 370 2ib 6o 59 2 0.619 ^ 80 297 8 0 85 3 0.625 7¾ ^ 66 128 139 b 0.5 ^ 5 1,636 892 292 2? B 5 0.6 ^ 5 1080 697 225 212 6 0.523 1030 539 171 162 7 0.515 I870 963 278 .296 8 0.600 1990 119 ^ 3 ^ 5 '' 369 9 0.651 1580 1029 305 317 10 0.557 l * + 00 "78Ο 220 238 11 0.697 690 bQl 1 b7 1¾ 12 0.536 166 0 89 0 2 * f2 273 13 0.785 ^ 9½ 388 1¾ llb lb 0.6l5 9 ^ 0 578 171 17 ^ '15 0.706 21 ^ 0 1511 ^ 67 ^ 70 16' .0.573 1396 800 2b8 2 ^ 5 17 0.576 2326 13 ^ 0 b $ b bi $ 18 0.662 1036 686 20b 209. 19. 0.377 736 277, 79 79 -.20 0.657 * + 96 '326 9 ^ 95 21 0.701 630 bb2 126 131 22: 0.55 ^ 1 ^ 86 823 268 252 23 0.5¾ 1360 736 '2b $ 22b I Λ. / Fi “The least squares analysis gives, for parameters a and b, the values of 27.002 and 3.160, respectively. I

Le taux de corrélation entre les deux séries de mesures est de 98,99%.The correlation rate between the two series of measures is 98.99%.

La reproductibilité des mesures est de - k% (1<T) pour l'appareil HEMALOG-D, de - 1% (1 όΟ pour la mesure du rapport E et de - 1% (ld") pour la mesure de DX.The reproducibility of the measurements is - k% (1 <T) for the HEMALOG-D device, - 1% (1 όΟ for the measurement of the E ratio and - 1% (ld ") for the measurement of DX.

Il ne faut pas perdre de vue qu'il est pratiquement impossible de disposer d'étalons, absolus, mais laIt should not be forgotten that it is practically impossible to have absolute standards, but the

Eig. 2 montre comment, dans les conditions expérimentales choisies, les points de mesure N se groupent le. long d'une droite dont l'origine est a = -8,002 et la pente ß = 1,00012. Le procédé de l'invention subit donc très favorablement la - comparaison avec un procédé connu.Eig. 2 shows how, under the chosen experimental conditions, the measurement points N group together. along a straight line whose origin is a = -8.002 and the slope ß = 1.00012. The process of the invention therefore very favorably undergoes comparison with a known process.

//

Bien que divers modes et détails de réalisation auent été décrits pour illustrer l'invention, il va de soi que celle-ci est susceptible" de nombreuses variantes et / modifications sans sortir de son cadre. · /f*Although various embodiments and details have been described to illustrate the invention, it goes without saying that it is susceptible of "many variations and / modifications without going beyond its scope. · / F *

Claims

1, - Method of counting blood platelets making it possible to determine the number of platelets per unit of volume - without individual counting of platelets and without alteration thereof, according to which (a) a blood sample is prepared in which the density optical due to platelets has been made preponderant. rante by removal of other figurative elements from the blood either mechanically or chemically; (b). a blood sample is used in which the optical density of all the figured elements of the blood has been made sufficiently lower than the optical density of the sample prepared in (a) respectively by techniques of the same nature; characterized in that the first sample and the second are successively pumped through a photometer cell and the optical density of each sample is determined in the infrared range, then the number of platelets per unit volume is deduced from the difference of the two measurement results.

2.- .suendent method claim 1, characterized in that photometric measurements are carried out under conditions where the absorbance of the sample is moderate ·. 3 · ”Method according to claim 2, characterized in that the absorbance is made moderate by using a thin cell. 4 - * - Method according to claim 3) characterized in that the cell has a maximum thickness of 0.1 to 3 mm · 5 * - Method according to claim 1, characterized in that the first sample is pumped and * *: ί;

6.- Method of counting blood platelets; to determine the number of platelets per unit volume without individual counting of platelets and without alteration thereof, characterized in that: a. a blood sample is subjected to centrifugation under appropriate conditions of duration and acceleration in order to fractionate it into a heavy pellet and into a supernatant phase rich in platelets; b. the optical density of the centrifuged plasma is measured in the infrared, which is a function of the population density of the platelets in the plasma; vs. measuring the ratio between the volume of plasma and the volume of whole blood; d. the number of platelets per unit volume in the blood after calibration is determined using this optical density and this ratio. ~ 7 · ”Method according to claim 6, characterized in that the sample is centrifuged of blood under conditions allowing a linear relationship to be established between the optical density of the plasma and the number of platelets per unit volume of blood.

8. Method according to claim 7j characterized in that the centrifugation is carried out at 200 g for 3. minutes * in silicone glass cuvettes with an internal diameter of 6 mm.

9. A method according to any one of. Claims 6 to 8, characterized in that the optical density is measured in the centrifuge tube.

10. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that photometric measurements are carried out at a wavelength falling in the interval · = A * BHI ll. ~ Method according to claim 10, character- laughed at the fact that the wavelength falls in the range of 900 to 1,000 nm. ιλ> ·

12. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that an H photodiode is used as the source of the infrared radiation. H 13 · “Method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that an H LASER transmitter is used as the source of the infrared radiation. · I Drawings: --4 - plates A * S ..... pages of which - cover page _Ah ...... pages of description H ....... 3 ... pages of claims B ____ short description fl Luxembourg, JAN 26. 1383 H The mayor; Ύ / M Charles München H H ï H