LU100916B1 - RNA-guided endonuclease DNA labeling - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Claims (14)
1. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Probe, wobei die Probe mit einem Ribonukleoprotein-Komplex kontaktiert wird, umfassend ein unmarkiertes Cas-Protein, eine unmarkierte crRNA, die mit der Ziel-DNA-Sequenz hybridisiert, und eine markierte tracrRNA, die mit der crRNA unter Bedingungen hybridisiert, bei denen die Ziel-DNA in der Probe in der Lage ist, mit der crRNA zu hybridisieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die crRNA und die tracrRNA getrennte RNA- Moleküle sind.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Cas-Protein ein rekombinantes Cas-Protein, vorzugsweise ein rekombinantes Cas-Protein vom Typ II, weiter bevorzugt ein Cas-Protein ohne Nukleaseaktivität, besonders bevorzugt ein nCas9-Protein oder dCas9-Protein ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die crRNA und die tracrRNA synthetische RNAs sind und wobei die crRNA und die tracrRNA vorzugsweise jeweils kürzer sind als natürlich vorkommende crRNAs und tracrRNAs.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die tracrRNA eine Lange von 67 nt und eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 aufweist und die crRNA eine Länge von 36 nt und eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die tracrRNA mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einer Goldnanopartikel-Markierung, vorzugsweise am 5'- Terminus, markiert ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe mit mindestens zwei verschiedenen Ribonukleoprotein-Komplexen in Kontakt gebracht wird, wobei sich die Ribonukleoprotein-Komplexe zumindest in ihrer crRNA und in der Markierung ihrer tracrRNA
’ PAT 1680 LU Deutsche Ubersetzung der Anspriiche -2- LU100916 unterscheiden, und wobei die unterschiedlichen Markierungen vorzugsweise unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen sind.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe ein Gewebeschnitt, eine Präparation von gequetschten oder aufgetropften Chromosomen oder Nuklei, oder eine Nuklei-, Chromosomen- oder Zellsuspension ist, vorzugsweise ein Gewebeschnitt ist, der mit einer gepufferten Paraformaldehyd-haltigen oder Glyoxal-haltigen Lôsung, vorzugsweise einer gepufferten 4% Paraformaldehydlôsung, fixiert wurde.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Paraformaldehyd-fixierte Gewebeschnitt mit einer gepufferten 4% Paraformaldehydlôsung in Kontakt gebracht wird, nachdem er mit dem Ribonukleoproteinkomplex in Kontakt gebracht wurde.
10. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend die Schritte des: a) Inkubierens einer mit gepufferter 4% Paraformaldehydlôsung fixierten Gewebeprobe mit dem Ribonukleoproteinkomplex bei einer Temperatur von 4-37 ° C, vorzugsweise 15-30 ° C, weiter bevorzugt 20-28 ° C, besonders bevorzugt 25-26 ° C, wobei die tracrRNA mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert ist, b) Inkubierens der Gewebeprobe aus Schritt a) mit gepufferter 4% Paraformaldehydlôsung auf Eis, und c) Messens der Fluoreszenz in der Probe.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend den weiteren Schritt des Kontaktierens der Probe mit einem markierten Antikôrper, vorzugsweise einem fluoreszenzmarkierten Antikôrper, wobei der Antikôrper vorzugsweise gegen ein DNA- bindendes Protein gerichtet ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Antikörper vorzugsweise gegen ein DNA- bindendes Protein gerichtet ist.
’ PAT 1680 LU Deutsche Ubersetzung der Anspriiche -3- LU100916
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei eine fluoreszenzmarkierte tracrRNA und ein fluoreszenzmarkierter Antikôrper verwendet werden, und wobei die Fluoreszenzmarkierungen der tracrRNA und des Antikôrpers unterschiedliche Emissionswellenlängen aufweisen.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspriiche, wobei das Verfahren ein In-situ- Verfahren ist.
| ' PAT 1680 LU Anhang zur Zusammenfassung _1- LU100916 a gRNA complex 3' formation + J crRNA tracrRNA b ® RNP complex . © formation Cas9 protein + 2 J protospacer element vu gRNA C : RNP complex labells à À target sequence Cd)
NGG Fig. 1
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LU100916A LU100916B1 (en) | 2018-08-29 | 2018-08-29 | RNA-guided endonuclease DNA labeling |
| EP19194184.8A EP3617325B1 (de) | 2018-08-29 | 2019-08-28 | Rna-gesteuerte endonuklease-dna-markierung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| LU100916A LU100916B1 (en) | 2018-08-29 | 2018-08-29 | RNA-guided endonuclease DNA labeling |
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| LU100916B1 true LU100916B1 (en) | 2020-03-03 |
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ID=63722722
Family Applications (1)
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| LU100916A LU100916B1 (en) | 2018-08-29 | 2018-08-29 | RNA-guided endonuclease DNA labeling |
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|---|---|
| LU (1) | LU100916B1 (de) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016061523A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Howard Hughes Medical Institute | Genomic probes |
| WO2017053762A1 (en) * | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Methods and reagents for molecular proximity detection using rna-guided nucleic acid binding proteins |
| WO2018111946A1 (en) * | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Genome editing detection |
-
2018
- 2018-08-29 LU LU100916A patent/LU100916B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016061523A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Howard Hughes Medical Institute | Genomic probes |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DENGHONG ZHANG ET AL: "CRISPR-bind: a simple, custom CRISPR/dCas9-mediated labeling of genomic DNA for mapping in nanochannel arrays", BIORXIV, 19 July 2018 (2018-07-19), XP055586613, Retrieved from the Internet <URL:https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/07/19/371518.full-text.pdf> DOI: 10.1101/371518 * |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20200303 |