LT6263B - Obtaining method of dendritic cells (ld) from peripheral blood, bone marrow or apherasis product and use thereof - Google Patents
Obtaining method of dendritic cells (ld) from peripheral blood, bone marrow or apherasis product and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- LT6263B LT6263B LT2015506A LT2015506A LT6263B LT 6263 B LT6263 B LT 6263B LT 2015506 A LT2015506 A LT 2015506A LT 2015506 A LT2015506 A LT 2015506A LT 6263 B LT6263 B LT 6263B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- cells
- medium
- vials
- antigen
- cancer
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
11
LT 6263 BLT 6263 B
IŠRADIMO SRITIS Išradimas skirtas medicinos sričiai, konkrečiai - dendritinių ląstelių išgavimui iš periferinio kraujo arba kaulų čiulpų arba audinių monocitų, jų brandinimui, užkrovimui antigenu ir panaudojimui imunoterapijoje, siekiant indukuoti specifinį imuninį atsaką pagal naudojamą antigeną.FIELD OF THE INVENTION The invention relates to the field of medicine, in particular, to the extraction of dendritic cells from peripheral blood or bone marrow or tissue monocytes for their maturation, antigen loading and use in immunotherapy to induce a specific immune response according to the antigen used.
TECHNIKOS LYGISTECHNICAL LEVEL
Prieš daugiau nei du dešimtmečius, įrodžius, kad imuninė sistema gali atpažinti ir eliminuoti vėžines ląsteles, didelis dėmesys skirtas imuninių ląstelių tyrimams, mėginant išsiaiškinti kokį poveikį jos turi vėžio genezei. Dabar jau yra žinoma, kad su vėžiu kovoja tiek įgimtas, tiek įgytas imunitetas [Teng MWL, Swann JB, Koebel CM, Schreiber RD, Smyth MJ. Immune-mediated dormancy: An equilibrium with cancer. Journal of Leukocyte Biology 2008; 84: 988-93.]. Nepaisant didelės kovojančių ląstelių įvairovės, vėžys, pasitelkdamas savo gynybinius mechanizmus, išvengia sunaikinimo [Dunn GP, Old LJ, and Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annual Revievv of Immunology 2004a; 22: 329-60]. Dėl imuninės sistemos spaudimo, vėžys, norėdamas išlikti, įgyja savybių, mažinančių jo imunogeniškumą, ir/arba slopina imuninės sistemos komponentus [Chen DS and Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity 2013; 39: 1-10.]. Pastebėjus, kad geresnę prognozę turi pacientai, kuriems dėl infekcijos buvo sužadinta imuninė sistema, pradėta taikyti imunoterapija [Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr VViIliam Coley and tumour regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80.], kurios tikslas yra aktyvinti imunines ląsteles ar tikslingai jas nukreipti į vėžinių ląstelių sunaikinimą.More than two decades ago, having demonstrated that the immune system can recognize and eliminate cancer cells, great attention has been paid to research on immune cells in an attempt to identify the effects they have on the genesis of cancer. It is now known that both congenital and acquired immune systems fight cancer [Teng MWL, Swann JB, Koebel CM, Schreiber RD, Smyth MJ. Immune-mediated dormancy: An equilibrium with cancer. Journal of Leukocyte Biology 2008; 84: 988-93.]. Despite the great variety of combat cells, cancer, through its defense mechanisms, avoids destruction [Dunn GP, Old LJ, and Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annual Revievv of Immunology 2004a; 22: 329-60]. Because of the pressure of the immune system, the cancer, to survive, acquires properties that reduce its immunogenicity, and / or inhibits the components of the immune system [Chen DS and Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity 2013; 39: 1-10.]. If you notice that patients with an immune system triggered by the infection have a better prognosis, immunotherapy has been started [Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr VViIliam Coley and Tumor Regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80.], Which aims at activating or targeting immune cells to the destruction of cancer cells.
Imunoterapija turi didelį pranašumą prieš tradicinius gydymo metodus, kadangi yra didesnio specifiškumo ir nesukelia sveikų ląstelių žūties [Eggermont LJ, Paulis LE, Tel J, Figdor CG. Tovvards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology 2014; 32 (9): 456-65]. Vienas iš imunoterapijos gydymo metodų yra vakcinacija autologinėmis vakcinomis, kurios gali būti ruošiamos iš autologinio naviko lizato ar gaminamos dendritinių ląstelių pagrindu, kurių funkcija yra pateikti antigenus naivioms T ląstelėms. Jau yra atlikta 2Immunotherapy has a great advantage over traditional methods of treatment, because it has more specificity and does not cause healthy cell death [Eggermont LJ, Paulis LE, Tel J, Figdor CG. Efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology 2014; 32 (9): 456-65]. One of the methods of immunotherapy treatment is vaccination with autologous vaccines that can be prepared from an autologous tumor lysate or produced on the basis of dendritic cells whose function is to deliver antigens to naive T cells. Already done 2
LT 6263 B daug tyrimų su įvairiomis priešvėžinėmis vakcinomis ir, nors yra pasiekiamas geresnis imuninės sistemos atsakas į naviką, tikėtino gydymo efekto dar nepasiekta [Kim J and Mooney DJ. In vivo modulation of dendritic cells by engineered materials: Towards new cancer vaccines. Nano Today 2011; 6:466-77].Many studies have been conducted with various anticancer vaccines and, although a better immune response to the tumor is achieved, the expected treatment effect has not yet been attained [Kim J and Mooney DJ. In vivo modulation of dendritic cells by engineered materials: Towards new cancer vaccines. Nano Today 2011; 6: 466-77].
Tiriama, kokį su vėžiu susijusių antigenų pateikimo metodą panaudoti, kokį adjuvantą pasirinkti, kad vakcinos būtų dar efektyvesnės: labiau sustiprintų imuninį atsaką, įveiktų imunosupresinę naviko aplinką. Tobulinami dendritinių ląstelių brandinimo metodai, kadangi nuo to priklauso, kokią funkciją atliks šios ląstelės. Yra žinoma, kad nesubrendusios dendritinės ląstelės sukelia imunotoleranciją, o subrendusios aktyvina citotoksines T ląsteles, kurios yra svarbiausios specifinio imuninio atsako komponentės, kovojančios prieš piktybines ląsteles [Palucka K and Banchereau J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity 2013; 39: 38-48].It is investigated which method of presenting cancer-related antigens to use, which adjuvant to choose for vaccines to be even more effective: to enhance the immune response, overcome the immunosuppressive tumor environment. Methods of maturation of dendritic cells are being improved, as this determines the function of these cells. It is known that immature dendritic cells induce immune tolerance while mature activate cytotoxic T cells, which are the most important components of specific immune response against malignant cells [Palucka K and Banchereau J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity 2013; 39: 38-48].
Dendritinės ląstelės (DL) - tai profesionalios antigeną pateikiančios ląstelės, kurios apjungia įgimtą ir įgytą specifinį imunitetus ir atlieka svarbų vaidmenį, naikinant vėžines ląsteles [Kim SK, Yun CH, Han SH. Enhanced anti-cancer activity of human dendritic cells sensitized with gamma-irradiation-induced apoptotic colon cancer cells. Cancer Letters 2013; 335: 278-88]. Šios ląstelės yra išsidėsčiusios audiniuose ir endocitozės bei pinocitozės būdu gaudo antigenus. Toliau pagautus antigenus DL kartu su MHC I klasės ir MHC II klasės molekulėmis limfiniuose mazguose pateikia naiviems T helperiams, kurie savo ruožtu aktyvina citotoksinius T limfocitus. Aplinka, kurioje buvo “pagauti” antigenai, nulemia, ar DL sukels priešnavikinį imunitetą ar imunotoleranciją [Chen DS and Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity 2013; 39: 1-10.; Harris TJ and Drake CH. Primer on tumor immunology and cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer 2013; 1: 12]. Nesubrendusios DL, pagavusios antigeną periferiniuose audiniuose, įprastai sukelia imunotoleranciją, kadangi jų membranuose nėra kostimuliuojančių molekulių. DL brendimas susijęs su tam tikrais pokyčiais, pvz.: sumažėja antigenų “gaudymo” efektyvumas, ląstelių paviršiuje padidėja MHC II klasės ir kostimuliacinių molekulių ekspresija, įgyja receptorius, kurie nukreipia jų migraciją, įgyja citokinų sekrecijos funkciją. Vienas iš DL išskiriamų citokinų IL-12 skatina T ląstelių diferenciaciją į efektorines T ląsteles [Palucka K and Banchereau J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity 2013; 39: 38-48]. Be to, kadangi dendritinės ląstelės veikia 3Dendritic Cells (DL) are professional antigen-presenting cells that combine innate and acquired specific immunity and play an important role in killing cancer cells [Kim SK, Yun CH, Han SH. Enhanced anti-cancer activity of human dendritic cells with gamma-irradiation-induced apoptotic colon cancer cells. Cancer Letters 2013; 335: 278-88]. These cells are located in the tissues and receive antigens by endocytosis and pinocytosis. Subsequent caught antigens DL, together with MHC Class I and MHC Class II molecules, are provided by lymph nodes in naive T helper, which in turn activate cytotoxic T lymphocytes. The environment in which the "captured" antigens were found determines whether DL will cause anti-tumor immunity or immune tolerance [Chen DS and Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity 2013; 39: 1-10; Harris TJ and Drake CH. Primer is tumor immunology and cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer 2013; 1: 12]. Immature DL, which has received the antigen in peripheral tissues, usually causes immunotolerance, since there are no costimulating molecules in their membranes. DL maturation is associated with certain changes, such as reduced efficiency of antigen capture, increased expression of MHC class II and costimulatory molecules on cell surface, acquires receptors that direct their migration, acquire cytokine secretion function. One of the DL secreted cytokines IL-12 promotes T cell differentiation into effector T cells [Palucka K and Banchereau J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity 2013; 39: 38-48]. In addition, because dendritic cells work 3
LT 6263 B kaip APL, jos ir pačios gali tiesiogiai eliminuoti vėžines ląsteles per mirties signalus, tokius kaip TRAIL (su TNF susijusį apoptozę indukuojantį ligandą) ar Fas ligandą [Kim SK, Yun CH, Han SH. Enhanced anti-canceractivity of human dendritic cells sensitized with gamma-irradiation-induced apoptotic colon cancer cells. Cancer Letters 2013; 335: 278-88].LT 6263 B as APL, they can directly eliminate cancer cells through death signals such as TRAIL (a TNF-associated apoptosis-inducing ligand) or Fas ligand [Kim SK, Yun CH, Han SH. Enhanced anti-canceractivity of human dendritic cells with gamma-irradiation-induced apoptotic colon cancer cells. Cancer Letters 2013; 335: 278-88].
Nepaisant didelės pažangos moksle, naujų vaistų sukūrimo ir naviko biologijos pažinimo, vėžys vis dar išlieka viena iš pagrindinių mirties priežasčių ne tik tarp besivystančių, bet ir išsivysčiusiose šalyse. Šiuo metu svarbiausi vėžio gydymo metodai yra trys: chirurgija (naviko pašalinimas), chemoterapija (vaistų vartojimas) ir radioterapija (spindulinis gydymas). Kiekvienas būdas turi apribojimų ar pašalinių poveikių, pvz.: chirurginis gydymas gali būti taikomas tik šalinant kietą, apčiuopiamą naviką, o problemų kyla dėl nepašalintų pradinio naviko liekanų ar metastazių. Chemoterapija yra grįsta sparčiai besidalijančių ląstelių naikinimu įvairiais citostatikais, tačiau organizme greitai proliferuoja ne tik vėžinės ląstelės, bet ir plaukų folikulų, žarnyno epitelio, kaulų čiulpų ląstelės ir kt. [Aly HAA. Cancer therapy and vaccination. Journal of Immunological Methods 2012; 382:1-23]. Imuninės sistemos ląstelės, pvz.: makrofagai, gali slopinti chemoterapijos efektyvumą priklausomai nuo naviko rūšies. Vienas pirmųjų tyrimų, siekiant išsiaiškinti makrofagų įtaką chemoterapijai parodė, kad vėžio gydymui skiriamas preparatas doksorubicinas, pelėse susargdintose leukemija ar limfoma, sustiprina priešvėžinį makrofagų poveikį. Kitas pavyzdys yra B ląstelės, kurios netiesiogiai skatina ortotopinės epitelinio audinio karcinomos progresavimą. Chemoterapija, neinhibuojant B ląstelių yra neveiksminga. Tik kartu su anti-CD20 antikūnais, vaistas paklitakselis yra veiksmingas prieš šios rūšies vėžį [Coffelt SB and de Visser KE. Immune-mediated mechanisms influencing the efficacy of anticancer therapies. Trends in Immunology 2015; 36 (4): 198-216].Despite significant advances in science, the development of new drugs and the knowledge of tumor biology, cancer remains one of the main causes of death not only among developing countries but also in developed countries. Currently, the most important cancer treatment methods are three: surgery (tumor removal), chemotherapy (drug use) and radiotherapy (radiotherapy). Each method has limitations or side effects, for example, surgical treatment can only be used to remove a solid, tangible tumor, and problems arise due to untreated primary tumor residues or metastases. Chemotherapy is based on the destruction of rapidly dividing cells by various cytostatics, but not only the cancer cells, but also the hair follicles, intestinal epithelium, bone marrow cells, etc., rapidly proliferate. [Aly HAA. Cancer therapy and vaccination. Journal of Immunological Methods 2012; 382: 1-23]. Immune system cells, such as macrophages, can inhibit the effectiveness of chemotherapy depending on the type of tumor. One of the first studies to investigate the effect of macrophages on chemotherapy has shown that doxorubicin, a medicine used to treat cancer in mice, enhances the anti-cancer effect of macrophages. Another example is B cells that indirectly promote the progression of orthotopic epithelial tissue carcinoma. Chemotherapy without inhibiting B cells is ineffective. Only in combination with anti-CD20 antibodies, paclitaxel is effective against this type of cancer [Coffelt SB and de Visser KE. Immune-mediated mechanisms influencing the efficacy of anticancer therapies. Trends in Immunology 2015; 36 (4): 198-216].
Norint pasiekti geresnių rezultatų, yra taikomas kombinuotas kelių metodų gydymas. Gydymas tradiciniais chemoterapijos metodais yra kenksmingas, kadangi yra pažeidžiamos ir sveikos ląstelės, todėl tikimasi didelių pasiekimų, pradėjus plačiai taikyti imunoterapiją, specifiškai nukreiptą prieš vėžines ląsteles. Imunoterapija - vėžio gydymo metodas, kuomet imuninės sistemos komponentai yra aktyviai arba pasyviai suaktyvinami ir nukreipiami piktybinių ląstelių sunaikinimui. Dėl didesnio specifiškumo yra išvengiama pašalinių poveikių, kuriuos sukelia įprasti gydymo metodai [Eggermont LJ, Paulis LE, Tel J, Figdor CG. Tovvards efficient cancer immunotherapy: Advances 4Combined multi-method treatment is used to achieve better results. Treatment with conventional chemotherapy methods is harmful because of the damage to healthy cells, and hence, great achievements are expected after extensive application of immunotherapy specifically directed against cancer cells. Immunotherapy is a method of treating cancer, when the components of the immune system are actively or passively activated and directed to the destruction of malignant cells. Increased specificity prevents side effects caused by conventional methods of treatment [Eggermont LJ, Paulis LE, Tel J, Figdor CG. Tovvards efficient cancer immunotherapy: Advances 4
LT 6263 B in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology 2014; 32 (9): 456-65].LT 6263 B in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology 2014; 32 (9): 456-65].
Pirmosios imunoterapijos užuomazgos siekia XIX a. pabaigą, kai W. Coley pastebėjo, kad pacientas, pasiekęs visišką naviko remisiją, prieš tai persirgo ūmia streptokokų sukelta infekcija. Vėliau, sukūręs vakciną iš negyvų Streptococcus pyogenes ir Serratia marcescens bakterijų, pradėjo gydyti neoperuotinu vėžiu (dažniausiai sarkoma) sergančius žmones. Vakcinos paskirtis buvo sužadinti imuninę sistemą [Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr VViIliam Coley and tumour regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80; Parish CR. Cancer immunotherapy: the past, the present and the future. Immunology and Cell Biology 2003; 81: 106-13]. Maždaug tuo pat metu, R. Pearl pranešė, kad tuberkuliozė turi priešvėžinį poveikį, todėl sugalvota vėžio gydymui panaudoti vakciną, taikomą tuberkuliozės gydymui - BCG (baccile Calmette-Guėrin). BCG vakcina šiuo metu yra vienintelė bakterinės kilmės vakcina, taikoma imunoterapijoje neinvazinio šlapimo pūslės vėžio gydyme [Mayer G. Immunology -chapter one: innate (non-specific) immunity. Microbiology and Immunology On-Line Textbook. University of South Carolina School of Medicine. http://pathmicro.med.sc.edu/qhaffar/innate.htm [cituota 2015 05 01].; Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr VViIliam Coley and tumour regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80], Plaučių vėžio imunoterapijoje BCG yra taikoma tik kaip adjuvantas imuninės sistemos stimuliavimui [Raez LE, Fein S, Podack ER. Lung Cancer Immunotherapy. Clinical Medicine & Research 2005; 3 (4): 221-8].The beginnings of first immunotherapy date back to the 19th century. when Coley noticed that a patient with complete tumor remission had previously had an acute streptococcal infection. Later, after developing a vaccine against dead Streptococcus pyogenes and Serratia marcescens, people with non-operative cancer (usually sarcoma) were treated. The purpose of the vaccine was to induce the immune system [Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr VViIliam Coley and Tumor Regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80; Parish CR. Cancer immunotherapy: the past, the present and the future. Immunology and Cell Biology 2003; 81: 106-13]. Approximately at the same time, Pearl reported that tuberculosis had anti-cancer effects, and therefore invented a vaccine for the treatment of cancer, used for the treatment of tuberculosis - BCG (baccile Calmette-Guérin). The BCG vaccine is currently the only bacterial vaccine used in immunotherapy for the treatment of non-invasive bladder cancer [Mayer G. Immunology -chapter one: innate (non-specific) immunity. Microbiology and Immunology On-Line Textbook. University of South Carolina School of Medicine. http://pathmicro.med.sc.edu/qhaffar/innate.htm [citing 01/05/2015]. Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr VViIliam Coley and Tumor Regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80], BCG for lung cancer immunotherapy is only used as an adjuvant for stimulation of the immune system [Raez LE, Fein S, Podack ER. Lung Cancer Immunotherapy. Clinical Medicine & Research 2005; 3 (4): 221-8].
Antigenų, susijusių su naviku (TAA), atradimas paskatino specifinės imunoterapijos vystymą [Parish CR. Cancer immunotherapy: the past, the present and the future. Immunology and Cell Biology 2003; 81: 106-13; VVayteck L, Breckpot K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K. A personalized view on cancer immunotherapy. Cancer Letters 2014; 352: 113-25], kurios tikslas yra sužadinti imuninės sistemos atsaką į naviką [Bluestone JA, Small EJ. The future of cancer treatment: VVill it include immunotherapy? Cancer Cell 2012; 22: 7-8], žinant, kad efektyvus imuninis atsakas neišsivysto dėl sumažėjusio imuninių ląstelių atpažinimo, silpno naviko imunogeniškumo ir imunosupresinės naviko aplinkos [Kumar S and Mason M. Principles of cancer treatment by immunotherapy. Surgery 2012; 30 (4): 5The discovery of antigens associated with tumor (TAA) has led to the development of specific immunotherapy [Parish CR. Cancer immunotherapy: the past, the present and the future. Immunology and Cell Biology 2003; 81: 106-13; Vayteck L, Breckpot K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K. Personalized view on cancer immunotherapy. Cancer Letters 2014; 352: 113-25], which aims to induce an immune response to the tumor [Bluestone JA, Small EJ. VVill it include immunotherapy? Cancer Cell 2012; 22: 7-8], knowing that an effective immune response is not due to reduced recognition of immune cells, weak tumor immunogenicity, and immunosuppressive tumor environment [Kumar S and Mason M. Principles of cancer treatment by immunotherapy. Surgery 2012; 30 (4): 5
LT 6263 B 198-202],LT 6263 B 198-202]
Pagal veikimą naviko imunoterapija yra skirstoma į pasyviąją ir aktyviąją. Pasyvioji imunoterapija apima visas imunologiškai aktyvias medžiagas, imunomoduliuojančias ląsteles ir nepriklauso nuo paties paciento imuninės sistemos funkcionavimo, kadangi jam yra pateikiamos ląstelės, pasižyminčios priešvėžiniu poveikiu [Aly HAA. Cancertherapy and vaccination. Journal of Immunological Methods 2012; 382:1-23], Toliau pasyviąją imunoterapiją galima smulkiau suskirstyti j terapiją monokloniniais antikūnais, stimuliuojančiais citokinais ir adoptyviomis T ląstelėmis [Wayteck L, Breckpot K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K. A personalized view on cancer immunotherapy. Cancer Letters 2014; 352:113-25], Pagal kito šaltinio skirstymą prie pasyviosios imunoterapijos dar yra priskiriama kaulų čiulpų transplantacija [Zavala VA and Kalergis AM. New clinical advances in immunotherapy for the treatment of solid tumours. Immunology 2015],By function, tumor immunotherapy is divided into passive and active. Passive immunotherapy involves all immunologically active substances, immunomodulating cells and independent of the patient's own immune system, as it is provided with cells with anti-cancer effects [Aly HAA. Cancertherapy and vaccination. Journal of Immunological Methods 2012; 382: 1-23] Further passive immunotherapy may be further subdivided into monoclonal antibody stimulating cytokines and adoptive T cells [Wayteck L, Breckpot K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K. Personalized view on cancer immunotherapy. Cancer Letters 2014; 352: 113-25], Bone marrow transplantation is still attributed to another source for passive immunotherapy [Zavala VA and Kalergis AM. New clinical advances in the treatment of solid tumors. Immunology 2015]
Aktyviajai imunoterapijai yra būtina tinkamai funkcionuojanti paciento imuninė sistema, kadangi gydymo metu kovai su vėžinėmis ląstelėmis yra sužadinami recipiento imuniniai mechanizmai. Aktyviajai imunoterapijai yra priskiriamos įvairios vakcinos: BCG, peptidinės, DNR, dendritinių ląstelių ir kt., kurios turėtų būti kiek galima mažiau toksiškos organizmui, galėtų sukelti priešvėžinį imuninį atsaką ne tik prieš pirminį naviką, bet ir prieš metastazes, kurių poveikyje susidarytų imuninė atmintis, apsauganti nuo ligos atsinaujinimo [Moingeon P. Cancer vaccines. Vaccine 2001; 19: 1305-26.; Yannelli JR and Wroblewski JM. On the road to a tumor cell vaccine: 20 years of cellular immunotherapy. Vaccine 2004; 23: 97-113].Active immunotherapy requires the proper functioning of the patient's immune system, as the recipient's immune mechanisms are triggered during the treatment of cancer cells. Various vaccines are included in active immunotherapy: BCG, peptide, DNA, dendritic cells, etc., which should be as toxic to the body as possible, could lead to an antitumor immune response not only against the primary tumor, but also against metastases that produce immune memory. Preventing Disease Recovery [Moingeon P. Cancer Vaccines. Vaccine 2001; 19: 1305-26; Yannelli JR and Wroblewski JM. 20 years of cellular immunotherapy. Vaccine 2004; 23: 97-113].
Dendritinių ląstelių vakcinos 1973 metais R. M. Steinman kartu su Z. Cohn pristatė darbą apie naujai atrastas ląsteles, kurioms dėl citoplazminių ataugų suteikė dendritinių ląstelių (DL) pavadinimą [Rovvley DA and Fitch FW. The road to the discovery of dendritic cells, a tribute to Ralph Steinman. Cellular Immunology 2012; 273: 95-8]. Dėl DL gebėjimo pagauti ir pristatyti antigenus T ląstelėms, jas aktyvuoti, jos tapo svarbiu ginklu, kuriant priešvėžines vakcinas [Vasaturo A, Verdoes M, de Vries J, Torensma R, Figdor CG. Restoring immunosurveillance by dendritic cell vaccines and manipulation of the tumor microenvironment. Immunobiology 2015; 220: 243-8]. Taip pat, vėžys, ypatingai pažengusioje stadijoje, yra sietinas su sumažėjusiu DL skaičiumi ir atlieka ne imunostimuliacinę, tačiau imunosupresinę funkciją, todėl pacientams, sergantiems 6Dendritic Cell Vaccines In 1973, Steinman, together with Z. Cohn, presented a work on newly discovered cells that have been named dendritic cells (DL) by cytoplasmic growths [Rovvley DA and Fitch FW. The road to the discovery of dendritic cells, a tribute to Ralph Steinman. Cellular Immunology 2012; 273: 95-8]. Due to the ability of DL to capture and deliver antigens to T cells, they become an important weapon for the development of anti-cancer vaccines [Vasaturo A, Verdoes M, de Vries J, Torensma R, Figdor CG. Restoring immunosurveillance by dendritic cell vaccines and manipulation of the tumor microenvironment. Immunobiology 2015; 220: 243-8]. Also, cancer, especially in the advanced stage, is associated with a decrease in the number of DL and does not have an immunostimulatory but immunosuppressive function, so patients with 6
LT 6263 B vėžiu, yra svarbu atstatyti DL kiekį ir funkciją. Yra du DL vakcinų tipai, paruoštos ex vivo ir in vivo [Strioga MM, Darinskas A, Pasukoniene V, Mlynska A, Ostapenko V, Schijns V. Xenogeneic therapeutic cancer vaccines as breakers of immune tolerance for clinical application: To ūse or not to ūse? Vaccine 2014; 32: 4015-24.].For LT 6263 B cancer, it is important to restore the amount and function of DL. There are two types of DL vaccines prepared ex vivo and in vivo [Strioga MM, Darinsk A, Pasukoniene V, Mlynska A, Ostapenko V, Schijns V. Xenogeneic therapeutic cancer vaccines as breakers of immune tolerance for clinical application: ? Vaccine 2014; 32: 4015-24.].
Autologinės ex vivo DL vakcinos dažniausiai yra ruošiamos iš funkciškai nepaliestų monocitų, kurie yra įkraunami naviko antigenais, brandinami ex vivo ir suleidžiami atgal pacientui [Strioga MM, Darinskas A, Pasukoniene V, Mlynska A, Ostapenko V, Schijns V. Xenogeneic therapeutic cancer vaccines as breakers of immune tolerance for clinical application: To ūse or not to ūse? Vaccine 2014; 32: 4015-24.]. DL brandinimas yra svarbus etapas, kadangi nesubrendusios ląstelės sukelia imunotoleranciją, pasireiškiančią citotoksinių T ląstelių pašalinimu ir reguliacinių T ląstelių ekspansija [Palucka K and Banchereau J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity 2013; 39: 38-48.; Radford KJ, Tullett KM, Lahoud MH. Dendritic cells and cancer immunotherapy. Current Opinion in Immunology 2014; 27: 26-32], Subrendusios, įkrautos DL keliauja į limfinius mazgus, kur aktyvina CTL, galinčius eliminuoti vėžines ląsteles.Autologous ex vivo DL vaccines are usually prepared from functionally intact monocytes that are loaded with tumor antigens, matured ex vivo and injected back into the patient [Strioga MM, Darinsk A, Pasukoniene V, Mlynska A, Ostapenko V, Schijns V. Xenogeneic therapeutic cancer vaccines as breakers of immune tolerance for clinical application: Tooth or not? Vaccine 2014; 32: 4015-24.]. Maturation of DL is an important step since immature cells induce immunotolerance, which is manifested by the removal of cytotoxic T cells and the expansion of regulatory T cells [Palucka K and Banchereau J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity 2013; 39: 38-48; Radford KJ, Tullett KM, Lahoud MH. Dendritic cells and cancer immunotherapy. Current Opinion in Immunology 2014; 27: 26-32], The mature, charged DL travels to lymph nodes, where it activates CTL that can eliminate cancer cells.
Terapeutinių vakcinų tyrimai, kurie atliekami jau daugiau nei 10 metų, parodė, kad DL pagrindu paruoštos vakcinos yra saugios, padidina cirkuliuojančių T ląstelių helperių ir CTL specifinių naviko antigenams kiekį [Palucka K and Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Revievvs Cancer 2012; 12: 265-77] ir yra tinkamos daugeliui navikų gydyti [Radford KJ, Tullett KM, Lahoud MH. Dendritic cells and cancer immunotherapy. Current Opinion in Immunology 2014; 27: 26-32]. Tačiau, nors tokių vakcinų efektyvumas yra įrodytas ikiklinikiniais ir klinikiniais tyrimais, gydymo rezultatai galėtų būti geresni. Todėl ypatingas dėmesys šiuo metu skiriamas pačių DL vakcinų brandinimo metodikoms tobulinti ir papildomų adjuvantų paieškai.Studies of therapeutic vaccines for more than 10 years have shown that DL-based vaccines are safe, increasing the amount of circulating T-cell helper and CTL-specific tumor antigens [Palucka K and Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Revievvs Cancer 2012; 12: 265-77] and are suitable for treating many tumors [Radford KJ, Tullett KM, Lahoud MH. Dendritic cells and cancer immunotherapy. Current Opinion in Immunology 2014; 27: 26-32]. However, although the efficacy of such vaccines has been demonstrated in preclinical and clinical studies, treatment results could be better. Therefore, special attention is currently given to improving the maturation methods of the DL vaccines themselves and to the search for additional adjuvants.
In vivo DL vakcinos, be to, kad nereikalauja manipuliacijų su organizmo ląstelėmis už jo ribų, turi ir kitą pranašumą. Ex vivo atveju DL vakcinos gamybai įprastai naudojama tik viena DL populiacija, dažniausiai kilusi iš monocitų, o in vivo yra pasitelkiami įvairūs mieloidinių ir plazmacitoidinių DL potipiai, kurie skiriasi lokalizacija, migracijos keliais, funkcijomis ir poveikiu specifiniam imuniniam atsakui [Strioga MM, Darinskas A, Pasukoniene V, Mlynska A, Ostapenko V, Schijns V. Xenogeneic therapeutic cancer vaccines as breakers of immune tolerance for clinical application: To ūse or not to ūse? Vaccine 2014; 32: 4015-24]. Pastarosios vakcinacijos metu 7In vivo DL vaccines, in addition to not requiring manipulation of cells outside the body, have another advantage. In the case of ex vivo, only one population of DL, usually derived from monocytes, is commonly used for the production of DL vaccine, and various subtypes of myeloid and plasmacitoid DL that are differentiated by localization, migration pathways, functions and effects on specific immune response are used in vivo [Strioga MM, Darinskas A, Pancreatic V, Mlynska A, Ostapenko V, Schijns V. Xenogeneic therapeutic cancer vaccines as breakers of immune tolerance for clinical application: Is it a tick or not? Vaccine 2014; 32: 4015-24]. During the last vaccination 7
LT 6263 B antigenai yra tiesiogiai pateikiami DL in vivo. Antigenų šaltiniais gali būti apšvitintos vėžinės ląstelės, naviko lizatas, DNR plazmidės su naviko antigenais ir kiti [Strioga MM, Schijns V, Powell DJ, Pasukoniene V, Dobrovolskiene NT, Michalek J. Dendritic cells and their role in tumor immunosurveillance. Innate Immunity 2013; 19 (1): 98-111]. Toks specifinių antigenų pateikimas dendritinėms ląstelėms sukelia stiprų CD4+ ir CD8+ ląstelių atsaką. Yra svarbu ir tai, kad be DL brendimo signalų tokia vakcinacija sukelia toleranciją [Palucka K and Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Revievvs Cancer 2012; 12: 265-77], kadangi pagrindinė DL funkcija yra tolerancijos palaikymas, kuris yra būtinas, nes ne visos autoreaktyvios T ląstelės yra sunaikinamos selekcijos metu. O pažeidus audinį ar vykstant uždegiminei reakcijai, DL vienu metu pateikia tiek savus, tiek svetimus antigenus, todėl tolerancijos palaikymas prieš savus baltymus leidžia T ląstelėms susitelkti kovai tik prieš svetimus, tuo pačiu išvengiant autoimuninių ligų [Havviger D, Inaba K, Dorsett Y, Guo M, Mahnke K, Rivera M, Ravetch JV, Steinman RM, Nussenzvveig MC. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady statė conditions in vivo. Journal of Experimental Medicine 2001; 194: 769-80].LT 6263 B antigens are provided directly in DL in vivo. Antigen sources may include irradiated cancer cells, tumor lysate, DNA plasmids with tumor antigens and others [Strioga MM, Schijns V, Powell DJ, Pasukoniene V, Dobrovolskiene NT, Michalek J. Dendritic cells and their role in tumor immunosurveillance. Innate Immunity 2013; 19 (1): 98-111]. Such specific antigen delivery to dendritic cells results in a strong response from CD4 + and CD8 + cells. It is also important that without DL maturation signals, such vaccination induces tolerance [Palucka K and Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Revievvs Cancer 2012; 12: 265-77], since the primary function of DL is to maintain tolerance, which is necessary because not all autoreactive T cells are destroyed during selection. And if the tissue or inflammatory response breaks, DL simultaneously delivers both its own and foreign antigens, so tolerance to its own proteins allows T cells to focus on fighting against aliens, while avoiding autoimmune diseases [Havviger D, Inaba K, Dorsett Y, Guo M, Mahnke K, Rivera M, Ravetch JV, Steinman RM, Nussenzvveig MC. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady static conditions in vivo. Journal of Experimental Medicine 2001; 194: 769-80].
Priešvėžinių vakcinų efektyvumo didinimui labai svarbūs yra tam tikri komponentai, kurie papildomai aktyvina imuninį atsaką. Dažniausia tam naudojami bakterijų fregmentai, baltymai ar kt. produktai, nes būtent prieš bakterinius antigenus vystosi greičiausias bei aktyviausias atsakas. Adjuvantai - tai medžiagos, sustiprinančios antigenams specifinį imuninį atsaką. Jie yra svarbūs terapeutinių vakcinų komponentai, kadangi padidina silpnų antigenų imunogeniškumą ir taip pat padeda įveikti naviko imunosupresinę aplinką ir sužadinti CTL atsaką [Dubensky TW and Reed SG. Adjuvants for cancer vaccines. Seminars in Immunology 2010; 22:155-61]. Adjuvantai gali būti naudojami skirtingiems tikslams pasiekti [Petrovsky N and Aguilar JC. Vaccine adjuvants: Current statė and future trends. Immunology and Cell Biology 2004; 82: 488-96]: padidinti antigenų imunogeniškumą, kadangi „negyvų“ vakcinų antigenai yra silpnai imunogeniški; sumažinti antigenų kiekį ar imunizacijų skaičių, reikalingų sukelti tinkamą imuninį atsaką; pagerinti vakcinų efektyvumą pacientuose su nusilpusia imunine sistema; pristatyti antigenus.Certain components that additionally activate the immune response are very important to increase the effectiveness of anticancer vaccines. The most common bacterial frigments, proteins, etc. are used. products, because precisely the bacterial antigens develop the fastest and most active response. Adjuvants are substances that enhance the antigen-specific immune response. They are important components of therapeutic vaccines because they increase the immunogenicity of weak antigens and also help overcome the immunosuppressive environment of the tumor and trigger the CTL response [Dubensky TW and Reed SG. Adjuvants for cancer vaccines. Seminars in Immunology 2010; 22: 155-61]. Adjuvants can be used for different purposes [Petrovsky N and Aguilar JC. Vaccine adjuvants: Current statė and future trends. Immunology and Cell Biology 2004; 82: 488-96]: Increase the immunogenicity of antigens, since "dead" vaccine antigens are poorly immunogenic; reducing the amount of antigens or the number of immunizations required to produce an adequate immune response; improve the effectiveness of vaccines in patients with weakened immune systems; deliver antigens.
Medžiagos, išskirtos iš bakterijų dėl savo imunostimuliacinių savybių, gali būti naudojamos kaip adjuvantai. Gramneigiamų bakterijų lipopolisacharidas, leidžiamas kartu su antigenais, sukelia imuninį atsaką nepaisant to, kad pats LPS nėra 8Substances isolated from bacteria due to their immunostimulatory properties can be used as adjuvants. Lipopolysaccharide of Gram-negative bacteria, co-administered with antigens, induces an immune response despite the absence of FPS itself 8
LT 6263 B labai imunogeniškas. Toks adjuvantas, aktyvuodamas TLR receptorius, kurie palaiko pavojaus signalus, aktyvina imuninę sistemą. LPS nėra plačiai naudojamas žmonių gydyme dėl savo pirogeninio poveikio [Petrovsky N and Aguilar JC. Vaccine adjuvants: Current statė and future trends. Immunology and Cell Biology 2004; 82: 488-96]. Taip pat adjuvantais gali būti ir kitos medžiagos/antigenai, kurios pagal savo kilmę gali aktyvuoti skirtingus TLR receptorius: TLR-1: bakteriniai lipoproteinai ir peptidogliukanai TLR-2: bakteriniai peptidogliukanai TLR-3: dvigrandė RNR (virusai) TLR-4: lipopolisacharidai TLR-5: bakterijų žiuželiai TLR-6: bakterijų lipoproteinaiLT 6263 B is highly immunogenic. Such an adjuvant activates the immune system by activating TLR receptors that support alarms. The FTA is not widely used in human treatment due to its pyrogenic effect [Petrovsky N and Aguilar JC. Vaccine adjuvants: Current statė and future trends. Immunology and Cell Biology 2004; 82: 488-96]. Also adjuvants may include other substances / antigens that, according to their origin, can activate different TLR receptors: TLR-1: bacterial lipoproteins and peptidoglycans TLR-2: bacterial peptidoglycans TLR-3: double-stranded RNA (viruses) TLR-4: lipopolysaccharides TLR -5: bacterial scabs TLR-6: bacterial lipoproteins
TLR-7: viengrandė RNR TLR-8: viengrandė RNR turtinga G sekaTLR-7: Single RNR TLR-8: Uniform RNA Rich G Sequence
TLR-9: CpG ir DNR TLR-10: nežinomaTLR-9: CpG and DNA TLR-10: Unknown
TRUMPAS IŠRADIMO APRAŠYMASBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Skirtingai nuo analogų, kuriuose kalbama apie klasikinius dendritinių ląstelių išgavimo ir brandinimo metodus, mūsų išradimas pasižymi greita (trys dienos) monocitų tranzicija į nesubrendusias dendritines ląsteles ir greitu (šešios valandos) jų subrandinimu, naudojant specialų brandinimo mišinį ir sąlygas.Unlike analogues that refer to the classic methods of dendritic cell extraction and maturation, our invention is characterized by the rapid (three-day) monocyte transit to immature dendritic cells and rapid (six hours) maturation, using a special maturing mixture and conditions.
Periferinis kraujas arba kraujo aferezatas arba kaulų čiulpų aspiratas yra separuojamas, išskiriant tik mononuklearinių ląstelių frakciją, ši frakcija yra išsėjama ląstelių auginimo terpėje ant ląstelių kultūrų flakonų ir inkubuojama dvi valandas. Po inkubacijos flakonai plaunami druskos tirpalu (PBS arba fiziologiniu), neprilipusios ląstelės yra pašalinamos, prilipusios ląstelės su jau esamais flakonais yra toliau kultivuojamos specialioje terpėje. Po trijų dienų flakone yra keičiama nuo pusės iki 85 % terpės nauja DL brandinimo terpe su antigenais ir adjuvantais. Ląstelės kultivuojamos šešias valandas ir vykdomas jų nuėmimas specialiai tam skirtais 9Peripheral blood or blood apherate or bone marrow aspirate is separated by separating only the mononuclear cell fraction, this fraction is inoculated in cell culture medium on cell culture vials and incubated for two hours. After incubation, the vials are washed with saline (PBS or physiological), the stuck cells are removed, the adherent cells with the existing vials are further cultured in a special medium. Three days later, the vial is replaced by half to 85% of the medium with new antigen and antigenic maturation medium for DL. The cells are cultivated for six hours and removed for a specific purpose 9
LT 6263 B standartiniais tirpalais. Ląstelės plaunamos, filtruojamos per 100 pm filtrą ir šaldomos dozėmis po 5 milijonus ląstelių šaldymo terpėje su autologiniu paciento serumu. Atliekamas sterilumo tyrimas ir kiti privalomi tyrimai.EN 6263 B with standard solutions. The cells are washed, filtered through a 100 µm filter and frozen at 5 million cells in the cooling medium with autologous patient serum. Performing a sterility test and other mandatory tests.
IŠSAMUS IŠRADIMO APRAŠYMAS I. Mononukleariniu ląstelių išskyrimas iš kraujo, aferezato. kaulu čiulpu aspiratoDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION I. Isolation of mononuclear cells from blood, apherate. bone marrow aspirate
Kraujas skiedžiamas hidroetilkrakmolo tirpalu, skirtu infuzijoms kaip plazmos pakaitalas, skiedžiama santykiu 1:1. Sumaišytas tirpalas paliekamas nusistovėti kambario temperatūroje 20-40 min., per tiek laiko paprastai išsiskiria du sluoksniai: apatinis, turtingas eritrocitais, ir viršutinis, kuriame yra eritrocitų, plazmos bei branduolinių kraujo elementų. Viršutinis sluoksnis yra surenkamas j centrifūginius mėgintuvėlius ir centrifuguojamas prie 1000-1500G 5-15 min. kambario temperatūroje, po centrifugavimo supernatantas yra nupilamas, o nuosėdos suspenduojamos druskos tirpale arba likusiame viršutiniame kraujo/hidroksietilkrakmolo tirpalo mišinyje. Paprastai, esant 150-300 ml kraujo, centrifugatas yra skiedžiamas iki 40 ml baigtinio tūrio. Jeigu kraujo yra daugiau, atitinkamai proporcingai yra skiedžiamas ir centrifugatas. Tuomet į 15 arba 50 ml mėgintuvėlius yra pripilama fikolo arba perkolo tirpalo, kurio tankis yra nuo 1,0 iki 1,12 g/ml. Tirpalo pilama ne daugiau kaip 1/3 mėgintuvėlio tūrio. Ant šio tirpalo pipete iš lėto, palenkus mėgintuvėlį, kuo gulsčiau atsargiai pilamas skiestas ląstelių centrifugatas iki mėgintuvėlio viršaus. Mėgintuvėliai centrifuguojami prie 1100-1500 G 10-20 min. kambario temperatūroje, stabdis nenaudojamas. Po centrifugavimo mėgintuvėliuose matomos trys frakcijos: apačioje -eritrocitų frakcija, virš eritrocitų - mononuklearų sluoksnis, plaukiojantis aukščiau fikolo skaidraus sluoksnio, virš mononuklearų skluoksnio - trombocitai kartu su praskiesta hidroksietilkramolu plazma. Pipete atsargiai yra surenkamas mononuklearų sluoksnis ir supilamas į naujus mėgintuvėlius, kuriuose yra įpilta druskos tirpalo arba ląstelių auginimo terpės. Vyksta ląstelių plovimo nuo gradiento medžiagos (fikolo arba perkolo) etapas. Ląstelės gerai išmaišomos ir centrifuguojamos prie 500-850 G 10-20 min. kambario temperatūroje. Stabdis nenaudojamas. Procedūra gali būti kartojama kelis kartus. Po plovimo ląstelės suskaičiuojamos ir išsėjamos į ląstelių auginimo flakonus 10The blood is diluted with a solution of hydroethyl starch for infusion as a plasma substitute, diluted 1: 1. The mixed solution is left to stand at room temperature for 20-40 minutes, usually two layers are released for a period of time: the lower, rich in red blood cells, and the upper with red blood cells, plasma and nuclear blood cells. The top layer is collected in centrifuge tubes and centrifuged at 1000-1500G for 5-15 min. at room temperature, the supernatant is centrifuged after centrifugation and the precipitate is suspended in saline or in the remaining upper mixture of blood / hydroxyethyl starch solution. Typically, at 150-300 ml of blood, the centrifuge is diluted to 40 ml of finite volume. If there is more blood, the centrifuge is diluted proportionally accordingly. The vials of 15 or 50 ml are then filled with a solution of ficol or percol at a density of 1.0 to 1.12 g / ml. The solution is filled with up to 1/3 of the volume of the tube. Pipette slowly from this solution by tilting the tube as carefully as possible by gently pouring the diluted cell centrifuge to the top of the tube. Centrifuge tubes at 1100-1500 G for 10-20 min. at room temperature, the brake is not used. Three centrifuges are seen in the tubes after centrifugation: the bottom is a fraction of red blood cells, the monoclonal layer above the erythrocytes floating above the clear layer of the ficol, and the platelets together with the diluted hydroxyethylramramol plasma above the mononuclear layer. The pipette carefully collects the mononuclear layer and is poured into new tubes containing brine or culture medium. The stage of cell washing from the gradient material (ficol or percol) is underway. The cells are well mixed and centrifuged at 500-850 G for 10-20 min. at room temperature. The brake is not used. The procedure can be repeated several times. After washing, the cells are counted and dispensed into cell culture vials 10
LT 6263 B tokiu santykiu 175 cm2 ploto / 100-120 milijonų ląstelių ir 10 ml terpės, skirtos T limfocitams arba dendritinėms ląstelėms auginti. Flakonai yra inkubuojami ląstelių kultūroms skirtuose inkubatoriuose 37 °C temperatūroje ir 5-15 % CO2 aplinkoje 2 valandas. Po inkubacijos flakonai yra plaunami tris kartus PBS arba druskos tirpalu, pašalinamos neprilipusios ląstelės. Jos yra išsėjamos atskirai tam, kad vėliau būtų galima atlikti MLR testą (jis nėra šio patento dalis). Ląstelės, likusios flakonuose, užpilamos 20 ml specialia monocitų diferenciacijos terpe, kuri sudaryta iš Interferono alfa (60 000 IU) (5μΙ iš darbinio tirpalo, kuris daromas iš 6 mln. interferono alfa, skiedžiant 0,5 ml terpės) ir 200 pi GM-CSF 1000 U/ml (darbinis tirpalas 100 000 U/ml) bei 1 % autologinio paciento serumo. II. Monocitu diferenciaciją i dendritines ląsteles Užpylus diferenciacinės terpės, flakonai yra kultivuojami tris dienas. Yra įmanoma papildomos dienos funkcija, bet tuomet antrą kultivavimo dieną turi būti pripilama 30 % naujos diferenciacinės terpės. Flakonuose esančios ląstelės tokiose auginimo sąlygose yra nuo 50-75 % dendritinės ląstelės. III. Dendritiniu ląstelių brandinimas, antigeno pateikimasLT 6263 B in a ratio of 175 cm2 / 100-120 million cells and 10 ml medium for T lymphocytes or dendritic cells. The vials are incubated in cell cultures at 37 ° C and 5-15% CO2 for 2 hours. After incubation, the flasks are washed three times with PBS or saline, and the adherent cells are removed. They are sown separately so that the MLR test can be performed later (it is not part of this patent). Cells remaining in the vials are filled with 20 ml of a special monocyte differentiation medium consisting of Interferon alpha (60,000 IU) (5μΙ of working solution from 6 million interferon alpha diluted in 0.5 ml medium) and 200 µl of GM- CSF 1000 U / ml (working solution 100,000 U / ml) and 1% autologous patient serum. II. Monocyte differentiation into dendritic cells After addition of differentiation media, the vials are cultured for three days. An additional day function is possible, but then 30% of the new differential medium should be added on the second day of cultivation. The cells in the vials in such cultivation conditions are 50-75% dendritic cells. III. Maturation of dendritic cells, presentation of antigen
Trečią arba ketvirtą kultivavimo diena atliekamas DL brandinimas bei antigeno užkrovimas. į flakoną yra pilama 10-18 pg/ml antigeno pagal baltymo koncentraciją, kartu yra ruošiamas diferenciacijos kokteilis ir antigenas baigtiniam užkrovimui. 10-18 pg/ml koncentracijos antigenas yra sumaišomas su adjuvantu (100-200 U LPS ir 50-100 U CpG arba Poly l:C, arba ampligeno, arba Poly ApU). Mišinys inkubuojamas vieną valandą 37°C temperatūroje maišant/vartant. Paruošiama antigeno užkrovimo ir brandinimo terpė. Sudėtis ir kiekiai vienam flakonui: 10 ml terpės, 200 μΙ GM-CSF (2000 U/ml), 5 μΙ IFN-alfa (6000 U/ml), 1000 U/ml IFN-gamma, 1 % autologinės plazmos arba serumo. Po valandinės inkubacijos antigenas su adjuvantu yra sumaišomas su antigeno užkrovimo ir brandinimo terpe, terpė, esanti flakonuose, yra surenkama, ląstelės centrifuguojamos ir, palikus iki 10 % senos terpės, ląstelės yra suspenduojamos antigeno užkrovimo ir brandinimo terpėje (jau sumaišius su antigenu ir adjuvantais). Viskas yra išsėjama atgal į auginimo flakonus, ląstelės yra dar 6 11The third or fourth day of cultivation involves maturation of DL and antigen loading. the vial is filled with 10-18 pg / ml of antigen at the concentration of the protein, together with a differentiation cocktail and an antigen for finite loading. The antigen at 10-18 pg / ml is mixed with the adjuvant (100-200 U LPS and 50-100 U CpG or Poly l: C, or ampligen, or Poly ApU). The mixture is incubated for one hour at 37 ° C with stirring. Prepare antigen loading and maturation medium. Composition and contents per vial: 10 ml medium, 200 μΙ GM-CSF (2000 U / ml), 5 μΙ IFN-alpha (6000 U / ml), 1000 U / ml IFN-gamma, 1% autologous plasma or serum. After an hour of incubation, the antigen with the adjuvant is mixed with the antigen loading and maturation medium, the medium in the vials is collected, the cells are centrifuged, and the cells are suspended in antigen loading and maturation (already mixed with antigen and adjuvants) after leaving up to 10% of the medium. . Everything is poured back into growing bottles, the cells are still 6 11
LT 6263 B valandas laikomos inkubatoriuje. Po inkubacijos laiko yra stebima ženkli ląstelių morfologijos kaita, jos tampa pailgos, išsidriekusios. Tai byloja apie sėkmingą antigeno opsonizaciją ir DL aktyvaciją į imunogeniškas ląsteles. IV. DL nuėmimas ir šaldymasLT 6263 B hours are stored in the incubator. After incubation time, a significant change in cell morphology is observed, becoming oblong, elongated. This indicates successful antigen opsonization and activation of DL into immunogenic cells. IV. DL removal and cooling
Po 6 valandų inkubavimo su antigenu ir antigeno užkrovimo ir brandinimo terpe ląstelės yra nuimamos ir šaldomos.After 6 hours of incubation with antigen and antigen loading and maturation, the cells are removed and frozen.
Terpė surenkama į mėgintuvėlius, ant flakonų yra užpilama PBS/EDTA tirpalo (PBS standartas EDTA koncentracija nuo 0,02-4 %). Laikoma šiltai iki 15 min. arba šaltai +4 °C temperatūroje iki 2 vai. Ląstelės surenkamos, flakonai praskalaujami 2 kartus PBS arba druskos tirpalu, viskas surenkama į mėgintuvėlius ir centrifuguojama 450-800 G 10 min. +4°C temperatūroje. Nucentrifuguotos ląstelės prakošiamos per 100 pm nailoninį filtrą ir skaičiuojamos. Ląstelės šaldomos koncentracijoje nuo 5-10 min. ląstelių/ml. Šaldymo terpė sudaryta iš 10 % DMSO (dimetilsulfoksidas) autologinio paciento serumo arba plazmos. DMSO niekada nėra įmaišomas kaip grynas tirpalas į ląstelių suspensiją, jis maišomas tik praskiestas su serumu. Tirpalai maišant su DMSO kaista. Su šaldymo terpe sumaišytos ląstelės yra išpilstomos į šaldymo mėgintuvėlius, kurie dedami į šaldymo dėžutę ir šaldomi pagal standartinį protokolą patalpinant juos į -80 °C temperatūrą porai valandų. V. DL atšildvmas ir suleidimas Užšaldytas mėgintuvėlis ištraukiamas iš šaldymo vietos ir nedelsiant yra patalpinamas į indą su šiltu +37 °C temperatūros vandeniu. Atšildoma iki kol ledas visiškai ištirps ir pripilamas toks pats tūris fiziologinio skysčio arba autologinio serumo. Vakcinos sutraukimui į švirkštą naudojama ne plonesnė nei 28G, geriausiai - 21G adata, vakcnos suleidimui į paodį - 27-29G adata. DL taikymo indikacijos ir avdvmo pavyzdžiaiThe medium is collected in tubes, the vials are filled with PBS / EDTA solution (PBS standard EDTA concentration 0.02-4%). Keep warm for 15 minutes. or cold at +4 ° C to 2 or. The cells are harvested, the flasks are rinsed twice with PBS or saline, collected in tubes and centrifuged at 450-800 G for 10 min. At + 4 ° C. The centrifuged cells are passed through a 100 µm nylon filter and counted. The cells are frozen at a concentration of 5-10 min. cells / ml. The cooling medium consists of 10% DMSO (dimethylsulfoxide) in serum or plasma of an autologous patient. DMSO is never added as a pure solution to the cell suspension, it is only mixed with diluted serum. Mixing with DMSO heat. The cells mixed with the refrigerant medium are packed into refrigerated tubes which are placed in a freezer and cooled in a standard protocol by placing them at -80 ° C for a couple of hours. V. DL thawing and injection Frozen tube is withdrawn from the refrigeration room and immediately placed in a container with warm water at + 37 ° C. Defrost until the ice is completely dissolved and the same volume of physiological fluid or autologous serum is added. The use of a 27-29G needle to inject the vaccine into the subcutaneous vaccine should be used to contract the vaccine into a syringe, preferably 21G, preferably 21G. Indications for use of DL and examples of avdvmo
Indikacijos procedūrai atlikti: 12For the indication procedure: 12
LT 6263 B a) Visų tipų ir stadijų onkologiniai susirgimai; b) Autoimuniniai susirgimai (išsėtinė sklerozė, reumatoidinis artritas, raudonoji vilkligė, psoriazė).EN 6263 B a) Oncological diseases of all types and stages; b) Autoimmune diseases (multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, psoriasis).
Ligoniams taikyto gydymo dendritinėmis ląstelėmis pavyzdžiai ir jų rezultataiExamples of dendritic cell therapy for patients and their results
Ligonė R.N. IV stadijos metastazuojanti melanoma, gydymas chemoterapija netaikomas, paciento išgyvenamumo prognozė - 2-3 mėn. Taikytas gydymas autologinėmis DL nuo 2013 metų. Atlikti trys DL kursai po septynias vakcinas, iš viso pacientas per du metus gavo 21 DL vakciną. Pacientas yra stabilioje būsenoje, liga neprogresuoja.Patient R.N. Stage IV metastatic melanoma, no chemotherapy treatment, patient survival prognosis - 2-3 months. Autologous DL treatment applied since 2013. Three DL courses were conducted in seven vaccines, and the patient received a total of 21 DL of vaccine over two years. The patient is in a stable state, the disease does not progress.
Ligonė E.R., 2009 m. diagnozuotas krūties vėžys, taikytas chirurginis gydymas, chemoterapija, 2011 metais navikas metastazavo į plaučius ir kepenis, prognozė skurdi, 2012 metais pradėta taikyti autologinė DL vakcinacija (trys kursai po 5 vakcinas), pacientės liga stabilizavosi, sustojo metastazavimo procesas, metastazės kalcinavosi (inaktyvacija). Pacientė išlieka stabili.Ligonė E.R., 2009 diagnosed breast cancer, surgical treatment, chemotherapy, tumor metastasized to lungs and liver, prognosis poor, autologous DL vaccination started in 2012 (three courses of 5 vaccines), patient's disease stabilized, metastasis stopped, metastasis stopped (inactivation), metastasis stopped . The patient remains stable.
Ligonė T.K., 2009 metais diagnozuotas kiaušidžių vėžys, IV stadija su metastazėmis į pilvaplėvę. Taikytas operacinis gydymas, pašalinant pilvaplėvės audinius su metastazėmis, taikyta chemoterapija. 2011 metais taikytas gydymas autologinė DL vakcina, atliktas vienas vakcinacijos kursas, iš viso - 8 vakcinos. Liga neprogresuoja, pacientės būklė išlieka stabili.Patient T.K., diagnosed ovarian cancer in 2009, stage IV with metastases in the peritoneum. Operational treatment was applied to remove metastases of peritoneal tissue, chemotherapy. In 2011, an autologous DL vaccine was used, one vaccination course, and a total of 8 vaccines. The disease does not progress, the patient's condition remains stable.
Ligonis J.S, 2010 metais diagnozuota inkstų karcinoma, IVstadija, metastazės plaučiuose ir kepenyse. Taikytas gydymas chemoterapija, pabaigus du iš šešių chemoterapijos kursų dėl paciento netolerancijos šiam gydymui buvo skirtas gydymas autologinė DL vakcina, nuo 2011 metų atlikti keturi vakcinacijos kursai po šešias vakcinas, leidžiant pagal standartinę schemą. Paciento pirminis navikas ir metastazės yra išnykę, pacientas laikomas pilnai pasveikusiu.Patient J.S., in 2010 kidney carcinoma was diagnosed, IVstasis, lung and liver metastases. Applied chemotherapy treatment, after two of the six chemotherapy courses due to the patient's intolerance, was treated with an autologous DL vaccine, four vaccination courses per six vaccines have been conducted since 2011, with a standard schedule. The patient's primary tumor and metastasis have disappeared, the patient is considered to be fully recovered.
Claims (7)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LT2015506A LT6263B (en) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | Obtaining method of dendritic cells (ld) from peripheral blood, bone marrow or apherasis product and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LT2015506A LT6263B (en) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | Obtaining method of dendritic cells (ld) from peripheral blood, bone marrow or apherasis product and use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
LT2015506A LT2015506A (en) | 2016-03-25 |
LT6263B true LT6263B (en) | 2016-04-25 |
Family
ID=55532066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
LT2015506A LT6263B (en) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | Obtaining method of dendritic cells (ld) from peripheral blood, bone marrow or apherasis product and use thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
LT (1) | LT6263B (en) |
-
2015
- 2015-09-16 LT LT2015506A patent/LT6263B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
LT2015506A (en) | 2016-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230248812A1 (en) | Tumor vaccination in combination with hematopoietic cell transplantation for cancer therapy | |
EP1879601B1 (en) | Disease therapy using dying or dead cells | |
KR102367009B1 (en) | Method for preparing an immunogenic lysate, the lysate obtained, dendritic cells loaded with such lysate and a pharmaceutical composition comprising the lysate or the dendritic cells | |
US20120082687A1 (en) | Use of cell adhesion inhibitor for the mobilization of antigen presenting cells and immune cells in a cell mixture (AIM) from the peripheral blood and methods of use | |
ES2862433T3 (en) | Use of allogeneic bone marrow infiltrating lymphocytes treated with post-transplantation cyclophosphamide to increase antitumor immunity | |
EA030061B1 (en) | Pharmaceutical compositions and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure and dendritic cells | |
JP6773788B2 (en) | A method for enhancing immune cell activity in vitro (Ex vivo) for cancer immunotherapy using a small molecule ablation compound | |
CA2955445A1 (en) | Manufacturing of multi-dose injection ready dendritic cell vaccines and combination therapy for blocking her2 and her3 | |
KR20140035102A (en) | A METHOD FOR EXPANDING NK CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD BELOW 100ml | |
WO2017147894A1 (en) | Composition for enhancing capacity to kill abnormal cells and use thereof | |
RU2573940C1 (en) | Cell line of human kidney cancer ibgvat r 6 | |
AU2016323066B2 (en) | Methods relating to activated dendritic cell compositions and immunotherapeutic treatments for subjects with advanced cancers | |
Voss et al. | Extending the horizon for cell-based immunotherapy by understanding the mechanisms of action of photopheresis | |
US9488644B2 (en) | Assays for determining the effect of an immune cell on a cell from an infectious or neoplastic disease | |
US20150064217A1 (en) | Pluripotent germ layer origin antigen presenting cancer vaccine | |
RU2573938C1 (en) | Cell line of human kidney cancer ibgvat r 27 | |
KR20030081056A (en) | Activated lymphocytes by HLA-coincided others for prevention and treatment of tumors, infection symptoms and autoimmune diseases, treatment method using the lymphocytes, formulation containing the lymphocytes as main component, method of manufacturing the formulation, and kit for preparing the formulation | |
US20160008446A1 (en) | Autologous Tumor Lysate-loaded Dendritic Cell Vaccine for Treatment of Liver Cancer | |
LT6263B (en) | Obtaining method of dendritic cells (ld) from peripheral blood, bone marrow or apherasis product and use thereof | |
KR20180022949A (en) | Optimally activated dendritic cells that induce an enhanced or increased anti-tumor immune response | |
CN115279887A (en) | Method for treating high-activity NK cells | |
CN112294949A (en) | Use of a semi-fluid comprising blood cells, a vaccine comprising the semi-fluid and a method for the preparation of the vaccine | |
US20180369336A1 (en) | B cell-based cancer immunotherapy | |
WO2012101109A1 (en) | Native dendritic cells | |
LT6677B (en) | Method of production of cytokine induced/activated killer cells from peripherial blood, bone marrow or apheresis product and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB1A | Patent application published |
Effective date: 20160325 |
|
FG9A | Patent granted |
Effective date: 20160425 |
|
QB9A | Licensing |
Effective date: 20170803 |